EP3899026A1 - IN-VITRO-VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON MINDESTENS EINER NUKLEINSÄURE, DIE SICH BEI EINEM LEBEWESEN IM VOLLBLUT AUßERHALB DER BLUTZELLEN BEFINDET UND VOR-RICHTUNG UND KIT HIERZU - Google Patents

IN-VITRO-VERFAHREN ZUM NACHWEIS VON MINDESTENS EINER NUKLEINSÄURE, DIE SICH BEI EINEM LEBEWESEN IM VOLLBLUT AUßERHALB DER BLUTZELLEN BEFINDET UND VOR-RICHTUNG UND KIT HIERZU

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EP3899026A1
EP3899026A1 EP19831685.3A EP19831685A EP3899026A1 EP 3899026 A1 EP3899026 A1 EP 3899026A1 EP 19831685 A EP19831685 A EP 19831685A EP 3899026 A1 EP3899026 A1 EP 3899026A1
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EP
European Patent Office
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dna
detection
whole blood
living
reaction mixture
Prior art date
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Pending
Application number
EP19831685.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ralf Himmelreich
Perikles Simon
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Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Publication date
Application filed by Johannes Gutenberg Universitaet Mainz, Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Johannes Gutenberg Universitaet Mainz
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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
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    • G—PHYSICS
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    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54366—Apparatus specially adapted for solid-phase testing
    • G01N33/54386—Analytical elements
    • G01N33/54387—Immunochromatographic test strips
    • G01N33/54388—Immunochromatographic test strips based on lateral flow

Definitions

  • nucleic acid In whole blood of living beings there can be a nucleic acid (eg DNA and / or RNA) which is outside the blood cells or not enclosed in a biological double membrane in the whole blood and thus circulates "free" in the blood of living beings, so to speak.
  • cell-free Nucleic acid which can be, for example, cell-free DNA (“cfDNA” for short)
  • cfDNA cell-free DNA
  • cfDNA is double-stranded and predominantly has a size in the range of approx. 60 to 300 base pairs (abbreviation for "Base pairs” in the following: "bp"). Often cfDNA has a length of 140 bp, because this corresponds approximately to the DNA portion of a nucleosome.
  • Free-circulating DNA is currently the focus of many oncological questions. Increased concentrations in the blood (blood plasma or blood serum) correlate with the clinical stages in the acute phase of cancer development.
  • the somatic cfDNA then also contains a portion of tumor-generated cfDNA, which is also referred to as “ctDNA”.
  • a simple and fast method for the quantification of cell-free nucleic acid, e.g. cfDNA, from a blood sample would be very interesting and helpful for various medical questions. In the event of an unclear finding, such a procedure could provide an indication of the direction in which further diagnostic test procedures make sense.
  • cell-free nucleic acid such as cell-free DNA
  • PCR polymerase chain reaction
  • Detection reaction of the cfDNA is started.
  • blood plasma is first obtained from whole blood in a time-consuming manner, i.e. the blood cells in the whole blood are separated from the cell-free whole blood. This is followed either by nucleic acid purification or a dilution step.
  • Nucleic acid purification is very time consuming.
  • the alternative of diluting the blood plasma is faster, but due to the dilution of the sample it is inevitably associated with a deterioration in the detection limit (ie a lower detection sensitivity to be expected).
  • Prior art methods also use PCR for the amplification of the cfDNA, which takes a very long time from start to finish (often a few hours) and requires a relatively large amount of knowledge and patience in sample preparation.
  • the known detection methods are therefore all time-consuming and a large number of devices are required for the detection (for example a centrifuge and a PCR device). Some of the devices (eg the PCR device) can only be operated by trained persons.
  • the object of the present invention to provide a device and a device and a kit for carrying out the method which does not have the above-mentioned disadvantages from the prior art.
  • the method, the device and the kit should be the detection of at least one nucleic acid (e.g. DNA and / or RNA), which is located in a living being in whole blood outside of the blood cells, with less work, less equipment, a higher detection accuracy (detection accuracy ) and enable the highest possible detection sensitivity.
  • nucleic acid e.g. DNA and / or RNA
  • a // i-wiro method is provided for the detection of at least one nucleic acid (preferably DNA and / or RNA, particularly preferably DNA) which is found outside the blood cells of a living being in whole blood.
  • the process includes the steps
  • reaction mixture which is suitable together with at least one pair of primers for carrying out an isothermal amplification reaction, the reaction mixture containing at least one pair of primers which is particularly preferred for the amplification of at least one nucleic acid present in whole blood (preferably DNA and / or RNA) DNA) is suitable or at least one such pair of primers is added to the reaction mixture;
  • step c) detection of DNA using at least one detection reagent, the detection being carried out during step c) or after step c);
  • reaction mixture is suitable for preventing lysis of blood cells contained in the animal in whole blood.
  • nucleic acid is preferably understood to mean DNA and / or RNA, particularly preferably DNA. Consequently, the nucleic acid to be detected or the nucleic acid to be amplified can be, for example, DNA and / or RNA.
  • RNA-DNA hybrids are also preferably included. Such RNA-DNA hybrids are, for example, single, short DNA and RNA strands (in particular strands 20-22 nucleotides in length) which have attached to one another.
  • the reaction mixture preferably contains an enzyme or an enzyme is added to it, which can copy RNA into DNA (eg the enzyme reverse transcriptase).
  • the reaction mixture can contain proteins from the group of nucleic acid ligases (for example a T7 RNA polymerase) or proteins from the group of nucleic acid ligases can be added to it.
  • RNAse H reverse transcriptase
  • SD polymerase reverse transcriptase
  • T7 RNA polymerase T7 RNA polymerase
  • an isothermal amplification of free RNA or an RNA located in an RNA-DNA hybrid can be achieved via a modification of the NASBA method, which is referred to as "linker ligation" - NASBA method
  • RNA is amplified by the interaction of the enzymes poly (A) polymerase, RNAse H and T7 RNA polymerase in the reaction mixture even at constant temperature (eg room temperature, 25 ° C.) (using at least one primer which contains a T7 promoter sequence)
  • constant temperature eg room temperature, 25 ° C.
  • the reaction mixture contains these enzymes and at least one primer with a T7 promoter sequence, or that these enzymes and this primer are added to it.
  • NASBA procedure can also be carried out in combination with an RPA procedure.
  • DNA present in whole blood is first converted into RNA (NASBA amplicon) by the RPA method, the RNA then being amplified using the NASBA method.
  • the method according to the invention can be used to detect at least one nucleic acid (for example DNA and / or RNA) which is found in whole blood outside the blood cells in the case of a living being (so-called “cell-free DNA” in the case of DNA as nucleic acid or "cfDNA” for short), even if a purified blood sample is not used, as is customary in the prior art.
  • whole blood is used directly, ie without pretreatment. The prerequisite for this is that the reaction mixture is suitable for preventing lysis of blood cells which are contained in the whole being in the living being.
  • nucleic acids eg DNA and / or RNA
  • cell nuclei eg leukocytes
  • the reaction mixture is generally suitable for preventing lysis of nucleic acid-containing, lipid double membrane-enclosed compartments which are contained in whole blood in the living being.
  • nucleic acid-containing, lipid double membrane-enclosed compartments is widely understood according to the invention, ie it includes all conceivable nucleic acid-containing compartments which are surrounded by a biological lipid double membrane. These include, for example, mitochondria, extracellular vesicles (Exosomes and microparticles), peroxisomes, viruses, unicellular organisms and bacteria.
  • the advantage of the method according to the invention compared to known methods is that sample preparation, i.e. there is no need to purify the whole blood.
  • the method according to the invention therefore requires fewer method steps and can be carried out more quickly.
  • the method according to the invention is thus outstandingly suitable for being carried out outside a laboratory.
  • a patient can determine on an outpatient basis (e.g. at home with a suitable device or a suitable kit for performing the method) whether there is at least one cell-free nucleic acid (e.g. cfDNA) in his blood (Use of non-specific primers) or whether there is at least one certain cell-free nucleic acid (eg a certain cfDNA) in his blood (use of specific primers).
  • a patient can determine on an outpatient basis (e.g. at home with a suitable device or a suitable kit for performing the method) whether there is at least one cell-free nucleic acid (e.g. cfDNA) in his blood (Use of non-specific primers) or whether there is at least one certain cell-free nucleic acid (eg a certain cfDNA) in his blood (use of specific primers).
  • cell-free nucleic acid e.g. cfDNA
  • At the person tested can be an athlete and / or a patient such as an accident or emergency patient, who can be examined directly on the spot immediately after exercising or immediately after an accident or medical emergency, whether there is at least one (certain) nucleic acid (e.g. cfDNA), or an increased amount of at least one (certain) nucleic acid (e.g. cfDNA) in his bloodstream.
  • the information received can be a decisive advantage for promptly arranging adequate treatment for a patient.
  • the nucleic acid to be detected for example DNA
  • the nucleic acid to be detected is lost (for example DNA and / or RNA can adsorb onto certain surfaces). and therefore can no longer be detected in the actual detection method.
  • the consequence is a low detection sensitivity or false negative results.
  • the risk of losing nucleic acids to be detected (e.g. DNA and / or RNA) on the way to detection is reduced with the method according to the invention, since whole blood is used directly. As a result, the detection sensitivity and detection accuracy are higher than in the known methods.
  • the method according to the invention is suitable for detecting genes in the whole blood with a low copy number genes or even with a copy number of only one (single copy number genes).
  • the process according to the invention can be characterized in that the reaction mixture forms a liquid mixture with the whole blood, which is essentially isotonic with blood cells.
  • the reaction mixture with the whole blood can form a liquid mixture which has an osmolarity which essentially corresponds to the osmolarity of blood cells, preferably an osmolarity in the range from 230 to 350 mosmol / kg, preferably 260 to 320 mosmol / kg, particularly preferably 270 up to 310 mosmol / kg, in particular 280 to 300 mosmol / kg.
  • the reaction mixture contains no surfactants in concentrations which are suitable for causing a lysis of blood cells, preferably no substances or mixtures of substances which are suitable for causing a lysis of blood cells.
  • concentrations which are suitable for causing a lysis of blood cells preferably no substances or mixtures of substances which are suitable for causing a lysis of blood cells.
  • This is understood in particular to mean that the reaction mixture contains no surfactants, or no substances or substance mixtures, in a concentration which is suitable for causing a lysis of blood cells.
  • This feature optionally relates not only to blood cells but also to nucleic acid-containing, lipid double-membrane-enclosed compartments which are contained in whole blood in the living being.
  • nucleic acid-containing, lipid double membrane-enclosed compartments is widely understood here, ie it encompasses all conceivable nucleic acids which are surrounded by a biological double membrane. These include, for example, mitochondria, exosomes, single-celled organisms and bacteria .
  • the reaction mixture used in the process can contain at least one of the following substances or at least one of the following substances can be added to the reaction mixture:
  • nucleotide triphosphates preferably dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, GTP; and or
  • a magnesium salt preferably magnesium acetate
  • reaction mixture can contain at least one of the following proteins or at least one of the following proteins can be added to the reaction mixture:
  • a strand-displacing polymerase preferably selected from the group consisting of Sau DNA polymerase, Bsu DNA polymerase, Klenow fragment, phi29 and combinations thereof; and or
  • a recombinase preferably RecA recombinase and / or T 4 UvsX; and or
  • a single strand binding protein preferably SSB and / or T 4 gp32; and or
  • exonuclease preferably exonuclease III and / or exonuclease IV.
  • the detection reagent used in the method is not suitable for passing through the cell membrane of blood cells that are contained in whole blood.
  • this feature can apply not only to blood cells, but generally to compartments containing lipid double membranes containing nucleic acid.
  • amplified nucleic acid eg DNA
  • the advantage of this embodiment is that the detection of amplified nucleic acid (eg DNA) can also be carried out without prior separation of cells containing DNA or the above-mentioned compartments, since there is no risk of binding the detection reagent to DNA within the cells or the above-mentioned compartments to obtain false positive results.
  • the method can therefore be carried out more easily and quickly (e.g. no step is required to allow the reaction mixture to flow from a reaction space via a partition to a separate detection space).
  • the detection reagent can be suitable for the detection of single-stranded and / or double-stranded DNA and can be used for this.
  • the detection reagent can be selected from the group consisting of probe with fluorophore, DNA-binding dye molecule, reagent for the detection of pyrophosphate and combinations thereof.
  • the fluorophore probe can contain or consist of an oligonucleotide which contains or consists of a quencher, a fluorophore and a DNA sequence located between the quencher and the fluorophore, the DNA sequence (by an internal modification) is suitable for being cleaved by an endonuclease or exonuclease and is preferably a DHF or AP DNA sequence.
  • the DNA-binding dye molecule can be selected from the group consisting of EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes and combinations thereof. Dye molecules which have an absorption and an emission spectrum which differ (preferably clearly) from the corresponding spectra of a whole blood sample are preferred for the particularly sensitive detection.
  • an absorption spectrum of less than 525 nm, one of between 545 nm and 570 nm or one of more than 590 nm is particularly advantageous since there are relative local absorption minima of the whole blood.
  • the dye should not (strongly) absorb at a wavelength of 525 nm to 545 and / or a wavelength of 570 to 590 nm.
  • the reagent for the detection of pyrophosphate can be a magnesium salt.
  • the detection of DNA takes place via a detection unit, the detection unit preferably being selected from the group consisting of an absorption measuring device, fluorescence measuring device, turbidimeter, camera, mobile phone (for example internal camera of the mobile phone, possibly in conjunction with evaluation software on the mobile phone), and combinations thereof.
  • the detection unit preferably being selected from the group consisting of an absorption measuring device, fluorescence measuring device, turbidimeter, camera, mobile phone (for example internal camera of the mobile phone, possibly in conjunction with evaluation software on the mobile phone), and combinations thereof.
  • the amount of amplified DNA can be quantified in the method via an evaluation unit, the evaluation unit preferably being communicatively connected to a detection unit (preferably a detection unit mentioned above).
  • At least one primer can have a length of 20 to 45 bp, particularly preferably 25 to 40 bp, in particular 30 to 35 bp.
  • At least one primer of the primer pair can be suitable for linking to a repetitive DNA sequence in the To bind DNA of the living being, preferably to a repetitive sequence selected from the group consisting of LINE sequence, SINE sequence and ALU sequence.
  • primers or pairs of primers that bind to repetitive sequences are suitable for non-specific amplification of all conceivable unknown DNAs that contain occurrences and repetitive DNA sequences in the whole blood of living beings. Since practically every DNA or DNA fragment of a certain length has repetitive DNA sequences, it is possible to use such primers or pairs of primers to amplify any conceivable DNA that is in whole blood. In other words, the sequence of the DNA to be amplified need not be known before the amplification reaction. In principle, the method can provide evidence of whether there is any free DNA in the blood of the living being.
  • the method actually detects free DNA in whole blood, this can of course be sequenced using standard methods. If the specific sequence of the free DNA (or the free DNAs) in the blood of a certain living being (eg a certain patient) is known, the method according to the invention can of course also be carried out with primer pairs which are specifically for the detection of the known DNA (see ) are suitable. The method according to the invention can thus also be used to monitor specific free DNAs in a patient's whole blood over a certain period of time (e.g. minutes, hours, days and / or months).
  • a primer of the primer pair may be suitable for attaching to a DNA sequence in the DNA of the living being, which is at the beginning, during or after an illness and / or at the beginning, during, or after excessive muscle strain in the living being in the bloodstream of the living being.
  • the living being can be a human or an animal.
  • the isothermal DNA amplification reaction used in the method can be carried out at a temperature in the range from 20 ° C. to 44 ° C., preferably 25 ° C. to 42 ° C., particularly preferably 30 ° C. to 41 ° C., in particular 35 ° C. to 40 ° C, be performed.
  • the temperature required for this can be generated or set via a temperature control unit.
  • the reaction can either take place at room temperature or the required reaction temperature can be generated via body heat (from a human or an animal).
  • body heat from a human or an animal. The latter is possible, for example, by bringing the reaction mixture of the device so close to a human or animal body that heat transfer from the body to the reaction mixture is possible.
  • the isothermal DNA amplification reaction can be a semi-quantitative isothermal DNA amplification reaction or a quantitative isothermal DNA amplification reaction.
  • the isothermal DNA amplification reaction can be an amplification reaction which is selected from the group consisting of recombinase polymerase amplification reaction, Siba HDA, NASBA and SDA amplification reaction, optionally it is selected from the group consisting of recombinase polymerase amplification reaction, Siba and SDA amplification reaction. It is preferably a recombinase polymerase amplification reaction.
  • the reaction mixture optionally contains a helicase for the amplification reaction.
  • a preferred temperature for the amplification is 37 ° C, i.e. the reaction mixture is preferably heated to a temperature of 37 ° C.
  • step d) of the method according to the invention in the case of (detected) amplified DNA, the presence of a disease and / or excessive muscle strain can be concluded.
  • the disease is particularly selected from the group consisting of inflammation, cancer, autoimmune disease, heart attack, stroke, sepsis, chromosomal aberration, gene copy number change, gene mutation, and combinations thereof.
  • the reaction mixture used can contain several pairs of primers, optionally at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 pairs of primers, each for Amplification of at least one nucleic acid in the whole blood (eg DNA) are suitable.
  • several such primer pairs can be added to the reaction mixture, the respective primer pairs preferably being suitable for amplifying a different nucleic acid (for example DNA), preferably a nucleic acid (for example DNA) which is associated with excessive muscle strain and / or an illness selected from the group consisting of inflammation, cancer, autoimmune disease, heart attack, stroke, sepsis, chromosomal aberration, change in the number of copies of genes, gene mutation, and combinations thereof, is present in the whole blood of a living being.
  • reaction mixture and the detection reagent are contained in a lateral flow strip.
  • a device and / or kit which is suitable for the // iv / fro detection of at least one nucleic acid (preferably DNA and / or RNA, particularly preferably DNA) which is outside of a whole being in whole blood the blood cells.
  • the device and / or the kit contains
  • a reaction mixture which, together with at least one pair of primers, is suitable for carrying out an isothermal amplification reaction at a temperature in the range of ⁇ 45 ° C.
  • At least one pair of primers which is suitable for the amplification of at least one nucleic acid present in whole blood (preferably DNA and / or RNA, particularly preferably DNA), the at least one pair of primers optionally being present in the reaction mixture;
  • reaction mixture is suitable for preventing the lysis of blood cells which are contained in a living being in whole blood.
  • the advantages mentioned above in connection with the method according to the invention apply to the device according to the invention and the invention. appropriate kit accordingly.
  • the device according to the invention can have the features mentioned above in connection with the method according to the invention or can be configured to carry them out.
  • the reaction mixture preferably contains an enzyme that can copy RNA into DNA (e.g. the enzyme reverse transcriptase).
  • the reaction mixture can contain proteins from the group of nucleic acid ligases (e.g. a T7 RNA polymerase).
  • nucleic acid ligases e.g. a T7 RNA polymerase
  • the reaction mixture preferably contains RNAse H, reverse transcriptase, SD polymerase, T7 RNA polymerase and at least one primer with a T7 promoter sequence.
  • the reaction mixture can also preferably contain the enzymes poly (A) polymerase, RNAse H, T7 RNA polymerase and at least one primer with a T7 promoter sequence.
  • the reaction mixture contained in the device and / or the kit may be suitable for forming a liquid mixture with whole blood which is essentially isotonic with blood cells.
  • the reaction mixture can be suitable for forming a liquid mixture with whole blood which has an osmolarity which essentially corresponds to the osmolarity of blood cells, preferably an osmolarity in the range from 230 to 350 mosmol / kg, preferably 260 to 320 mosmol / kg, be particularly preferably 270 to 310 mosmol / kg, in particular 280 to 300 mosmol / kg.
  • the device and / or the kit does not contain any surfactants which are suitable for causing a lysis of blood cells, preferably does not contain any substances or mixtures which are suitable for lysing To cause blood cells.
  • the reaction mixture has no surfactants, or no substances or substance mixtures, in one concentration contains, which is suitable for lysing blood cells.
  • This feature optionally relates not only to blood cells, but also to compartments which contain nucleic acid and contain lipid double membranes and which are contained in whole blood in the living being.
  • nucleic acid-containing, lipid double membrane-enclosed compartments is widely understood here, ie it encompasses all conceivable nucleic acids which are surrounded by a biological double membrane. These include, for example, mitochondria, exosomes, unicellular organisms and bacteria.
  • the reaction mixture can contain at least one of the following substances:
  • nucleotide triphosphates preferably dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, GTP; and or
  • a magnesium salt preferably magnesium acetate
  • the reaction mixture can also contain at least one of the following proteins:
  • a strand-displacing polymerase preferably selected from the group consisting of Sou DNA polymerase, ⁇ su DNA polymerase, Klenow fragment, phi29 and combinations thereof; and or
  • a recombinase preferably RecA recombinase and / or T 4 UvsX; and or
  • a single strand binding protein preferably SSB and / or T 4 gp32; and or
  • exonuclease preferably exonuclease III and / or exonuclease IV.
  • the detection reagent contained in the device and / or the kit is not suitable for passing through the cell membrane of blood cells which are contained in whole blood.
  • this feature can apply not only to blood cells, but generally to the lipid double membrane containing nucleic acid, lipid double membrane around closed compartments.
  • the advantage of this embodiment is that the detection of amplified DNA can also be carried out without prior separation of DNA-containing cells or the above-mentioned compartments can be carried out since there is no risk of obtaining false-positive results by binding the detection reagent to DNA within the cells or the above-mentioned compartments.
  • the device and / or the kit can therefore be kept simpler and in a smaller size (for example, no reaction space and separate detection space with a partition in between is necessary).
  • the detection reagent can be suitable for the detection of single-stranded and / or double-stranded DNA.
  • the detection reagent of the device and / or the kit can be selected from the group consisting of a probe with fluorophore, DNA-binding dye molecule, reagent for the detection of pyrophosphate and combinations thereof.
  • the fluorophore probe may contain or consist of an oligonucleotide which contains or consists of a quencher, a fluorophore and a DNA sequence located between the quencher and the fluorophore, the DNA sequence being suitable for being cleaved by an endonuclease or exonuclease and is preferably a DHF or AP DNA sequence.
  • the DNA-binding dye molecule can be selected from the group consisting of EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes and combinations here of.
  • Dye molecules which have an absorption and an emission spectrum which differ (preferably clearly) from the corresponding spectra of a whole blood sample are preferably used for the particularly sensitive detection.
  • an absorption spectrum of less than 525 nm, one between 545 nm and 570 nm or one above 590 nm is particularly advantageous, since there are relative local absorption minima of the whole blood in these areas.
  • the dye should not (strongly) absorb at a wavelength of 525 nm to 545 and / or a wavelength of 570 to 590 nm.
  • An emission spectrum between 580 nm and 610 nm, in particular 590 nm to 610 nm, is particularly advantageous for the emission.
  • the reagent for the detection of pyrophosphate can be a magnesium salt.
  • the device and / or the kit contains a detection unit for the detection of DNA, the detection unit preferably being selected from the group consisting of an absorption measuring device, fluorescence measuring device, turbidimeter, camera, mobile phone (for example internal camera of the mobile phone, possibly in connection with evaluation software on the mobile phone), and combinations thereof.
  • a detection unit for the detection of DNA the detection unit preferably being selected from the group consisting of an absorption measuring device, fluorescence measuring device, turbidimeter, camera, mobile phone (for example internal camera of the mobile phone, possibly in connection with evaluation software on the mobile phone), and combinations thereof.
  • the device and / or the kit can contain an evaluation unit for quantifying a quantity of amplified DNA, the evaluation unit preferably being communicatively connected to a detection unit.
  • At least one primer of the primer pair can have a length of 20 to 45 bp, particularly preferably 25 to 40 bp, in particular 30 to 35 bp.
  • a primer of the primer pair can be suitable for binding to a repetitive DNA sequence in the DNA of the living being, preferably to a repetitive sequence selected from the group consisting of LINE sequence, SINE sequence and ALU sequence.
  • At least one primer of the primer pair may be suitable for attaching to a DNA sequence in the DNA of the living being that is present at the beginning, during or after an illness and / or at the beginning, during or after an excessive Muscle stress of the living being is present in the bloodstream of the living being to bind.
  • the living being can be a human or an animal.
  • the device and / or the kit can contain a temperature control unit that is configured to temperature control the reaction mixture to a temperature in the range of ⁇ 45 ° C., preferably to a temperature in the range from 20 ° C. to 44 ° C., particularly preferably 25 ° C to 42 ° C, very particularly preferably 30 ° C to 41 ° C, in particular 35 ° C to 40 ° C.
  • the temperature control unit is preferably supplied with energy from a voltage source which has a voltage in the range from 1 to 12 V.
  • the device and / or the kit do not contain a temperature control unit.
  • the reaction can then either take place at room temperature or be generated by body heat (from a human or a animal). The latter is possible, for example, by bringing the reaction mixture of the device so close to a body of a human or animal that heat transfer from the body to the reaction mixture is possible.
  • the isothermal DNA amplification reaction can be a semi-quantitative isothermal DNA amplification reaction or a quantitative isothermal DNA amplification reaction.
  • the isothermal DNA amplification reaction can be an amplification reaction which is selected from the group consisting of recombinase polymerase amplification reaction, Siba, HDA, NASBA and SDA amplification reaction, optionally it is selected from the group consisting of recombinase polymerase amplification reaction , Siba and SDA amplification reaction. It is preferably a recombinase polymerase amplification reaction.
  • the reaction mixture optionally contains a helicase for the amplification reaction.
  • a preferred temperature for the amplification is 37 ° C, i.e. the reaction mixture is preferably heated to a temperature of 37 ° C.
  • the device and / or kit can be configured to indicate the presence of a disease and / or excessive muscle strain in the event of a detection of DNA by the detection reagent, optionally via a limitation of the device that is transparent to visible light.
  • the disease is selected from the group consisting of inflammation, cancer, autoimmune disease, heart attack, stroke, sepsis, chromosomal aberration, change in the number of copies of genes, gene mutation, and combinations thereof.
  • the device and / or the kit contains several pairs of primers, optionally at least 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or 10 pairs of primers, each pair of primers for the amplification of at least one nucleic acid in the whole blood (eg DNA) is suitable and the respective primer pairs are preferably suitable for amplifying a different nucleic acid (eg DNA), preferably a nucleic acid (eg DNA) which is selected from in the event of excessive muscle strain and / or an illness the group consisting of inflammation, cancer, autoimmune disease, heart attack, stroke, sepsis, chromosomal aberration, change in the number of copies of genes, gene mutation, and combinations thereof, is present in the whole blood of a living being.
  • a nucleic acid eg DNA
  • the device is preferably a lateral flow strip.
  • the kit is preferably characterized in that it has a lateral flow strip which contains the reaction mixture; or contains the reaction mixture and the detection reagent.
  • the device according to the invention and / or the kit according to the invention for the direct, semi-quantitative or quantitative detection of at least one nucleic acid (eg DNA and / or RNA) in whole blood, preferably for the detection of at least one nucleic acid (eg DNA and / or RNA), which is present in a living being's disease in the whole blood of the living being outside of the blood cells in the event of a disease of a living being and / or an excessive muscle strain on the living being.
  • at least one nucleic acid eg DNA and / or RNA
  • FIG. 1 shows the result of a quantitative isothermal amplification reaction of a certain cfDNA via a probe using direct whole blood (see example 2).
  • the amplification plot shows that the detection with the probe also works when direct (not purified) whole blood is used. It also becomes clear that an increase in cfDNA can be demonstrated in the subject from whom the whole blood originates from training.
  • FIG. 2 shows the result of a quantitative isothermal amplification reaction of a specific cfDNA via a DNA-intercalating fluorescent dye using whole blood directly (see Example 4).
  • the amplification plot shows that the detection with the fluorescent dye also works when direct (non-purified) whole blood is used. It also becomes clear that an increase in cfDNA can be demonstrated in the subject from whom the whole blood originates from training.
  • FIG. 3 shows the result of a quantitative isothermal amplification reaction of a specific cfDNA via a probe using human gDNA which was contaminated with different amounts of hemolysate (see Example 3).
  • the amplification plot shows that hemolysate has a significant inhibitory influence on the amplification reaction, which disappears only after a strong dilution of 1: 10000 (v: v) with water.
  • Example 1 Detection of a cell-free DNA by probe using direct whole blood
  • An isothermal amplification reaction was carried out at a temperature of 40 ° C. to amplify at least one specific cell-free DNA using a sample of whole blood that contains cell-free DNA (so-called cfDNA).
  • the amplified DNA was detected using a probe.
  • FIG. 1 The result is shown in FIG. 1. It can be clearly seen that the detection method according to the invention works with a probe as a detection reagent and a direct use of (not purified) whole blood.
  • concentration of cfDNA in the whole blood of the test subject before training is lower than after training (see signal at 1).
  • the control plasma sample from a mouse shows no amplification of the target cfDNA (see signal at 3), which demonstrates the specificity of the amplification reaction presented here for human cfDNA.
  • An isothermal amplification reaction was carried out at a temperature of 40 ° C. to amplify at least one specific cell-free DNA using a sample of whole blood that contains cell-free DNA (so-called cfDNA).
  • the amp lifi graced DNA was detected via a fluorescent dye ( "EvaGreen ® Dye” Biotium Inc., Fremont, USA). The following protocol was used:
  • the detection method according to the invention works with an intercalating fluorescent dye as a detection reagent and a direct use of (not purified) whole blood.
  • concentration of cfDNA in whole blood the test subject before training is less than after training (see signal at 1).
  • the control plasma sample from a mouse shows no amplification of the target cfDNA (see signal at 3), which demonstrates a specificity of the amplification reaction shown here for human cfDNA.
  • a hemolysate is first prepared by treating mouse blood through several defrosting and freezing cycles, which leads to the lysis of the blood cells.
  • Primer Forward primer ("301" primer) and reverse primer ("302" -
  • the result is shown in FIG. 3 and shown in Table 1.
  • the sample with 1 ml of human gDNA (50 ng / ml) and 1 ml of water can be seen at 1.
  • the samples with 1 ml of human gDNA (50 ng / ml) and a different amount of hemolysate can be seen at 2, 3, 4, 5 and 6.

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Abstract

Es wird ein in-vitro-V erfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet, bereitgestellt. Der Vorteil an dem erfindungsgemäßen Verfahren ist, dass die Durchführung des Verfahrens weniger Zeitaufwand und apparativen Aufwand benötigt als bekannte Verfahren aus dem Stand der Technik und dass das Kontaminationsrisiko und Verlustrisiko an zu amplifizierender zellfreien Nukleinsäure (z.B. zellfreie DNA) minimiert ist. Das Verfahren ist daher ökonomischer und weist eine höhere Detektionsrichtigkeit als bekannte Nachweisverfahren für zellfreie Nukleinsäuren (wie- z.B. zellfreie DNA) auf. Ferner ist die Detektionssensitivität vor allem gegenüber Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik erhöht, die auf einer Verdünnung von Vollblut basieren. Es wird ferner eine Verwendung der bereitgestellten Vorrichtung und des bereitgestellten Kits vorgeschlagen.

Description

In-vitro-Ve rfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet und Vor richtung und Kit hierzu Es wird ein in-vitro-M erfahren, eine Vorrichtung und ein Kit zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blut zellen befindet, bereitgestellt. Der Vorteil an dem erfindungsgemäßen Verfah ren ist, dass die Durchführung des Verfahrens weniger Zeitaufwand und appa- rativen Aufwand benötigt als bekannte Verfahren aus dem Stand der Technik und dass das Kontaminationsrisiko und Verlustrisiko an zu amplifizierender zellfreien Nukleinsäure (z.B. zellfreie DNA) minimiert ist. Das Verfahren ist daher ökonomischer und weist eine höhere Detektionsrichtigkeit als bekannte Nachweisverfahren für zellfreie Nukleinsäuren (wie- z.B. zellfreie DNA) auf. Ferner ist die Detektionssensitivität vor allem gegenüber Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik erhöht, die auf einer Verdünnung von Vollblut basieren. Es wird ferner eine Verwendung der bereitgestellten Vorrichtung und des bereitgestellten Kits vorgeschlagen.
In Vollblut von Lebewesen kann sich eine Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA) finden, die sich außerhalb der Blutzellen bzw. nicht in einer biologischen Doppelmembran eingeschlossen im Vollblut befindet und damit sozusagen „frei" im Blut der Lebewesen zirkuliert. Diese sog. zellfreie Nukleinsäure (engl „cell-free nucleic acid), bei der es sich beispielsweise um zellfreie DNA (engl „cell-free DNA", kurz:„cfDNA") handeln kann, hat eine variable Konzentration im Blutplasma von ca. 1 - 1500 ng/ml. Sie entsteht durch absterbende Zellen, aber auch Tumorzellen und fötale Zellen geben beispielsweise cfDNA ab (z.B. über die Plazenta bei fötalen Zellen). cfDNA ist doppelsträngig und weist überwiegend eine Größe im Bereich von ca. 60 bis 300 Basenpaaren (Abkür zung für„Basenpaare" im Folgenden:„bp") auf. Häufig weist cfDNA eine Län ge von 140 bp auf, weil das in etwa dem DNA-Anteil eines Nukleosoms ent spricht.
Frei-zirkulierende DNA steht derzeit im Fokus vieler onkologischer Fragestel lungen. Erhöhte Konzentrationen im Blut (Blutplasma bzw. Blutserum) korre lieren mit den klinischen Stadien in der akuten Phase der Krebsentwicklung. Die somatische cfDNA enthält dann noch einen Anteil an tumorgenerierter cfDNA, die auch als„ctDNA" bezeichnet wird.
Die Bestimmung der ctDNA bei Krebspatienten im Rahmen einer sog.„Liquid Biopsy" ermöglicht die Überwachung der Therapie („Monitoring") und erlaubt in der Zukunft gezielte therapeutische Maßnahmen (sog.„Precision Medici- ne").
Eine erhöhte Menge an frei zirkulierender DNA im Blutplasma tritt auch bei einer Vielzahl von Erkrankungen (z.B. bei Autoimmunerkrankungen, Herzin farkt, Schlaganfall und Sepsis) auf und lässt sich auch bei einer übermäßigen Muskelbelastung beobachten. Da die unter körperlicher Belastung akut frei gesetzte cfDNA hochgradig mit pro-inflammatorischen Immunmarkern korre liert und überwiegend aus Immunzellen selber stammt, ist die cfDNA ein we sentlicher pro-inflammatorischer Marker der sogenannten aseptischen Inflammation, welche unter körperlicher Belastung entsteht. Dabei ist die Menge an freigesetzter cfDNA sowohl bei körperlicher Belastung, als auch bei einer Entzündungsreaktion, welche unterschiedliche Erkrankungen begleitet, ein Marker für das Ausmaß der Inflammation.
Ein einfaches und schnelles Verfahren zur Quantifizierung von zellfreie Nukle insäure, wie z.B. cfDNA, aus einer Blutprobe wäre bei diversen medizinischen Fragestellungen sehr interessant und hilfreich. So könnte ein solches Verfah ren bei unklarem Befund einen Hinweis darüber geben, in welcher Richtung weitere diagnostische Testverfahren sinnvoll sind.
Der Nachweis von zellfreier Nukleinsäure, wie zellfreier DNA, aus Blut erfolgt bisher entweder über eine Gewinnung von Blutplasma aus einer Vollblutpro be, einer anschließenden Nukleinsäure-Reinigung und schließlich einer Nukle insäure-Amplifikation mittels der Polymerase-Kettenreaktion (engl „polymerase chain reaction", kurz:„PCR"). Alternativ wird zunächst Blutplas ma aus einer Vollblutprobe gewonnen, das Blutplasma verdünnt und schließ lich eine Direktamplifikation mittels PCR durchgeführt.
Diese im Stand der Technik bekannten Nachweisverfahren haben den Nach teil, dass sie aufwändige Präparationsschritte zur Aufbereitung des Vollbluts umfassen, bevor die eigentliche Amplifikationsreaktion, d.h. Nachweisreakti on der cfDNA, gestartet wird. Beispielsweise wird in den bekannten Verfahren zunächst auf zeitintensive Art und Weise aus Vollblut Blutplasma gewonnen, d.h. die im Vollblut befindlichen Blutzellen werden vom zellfreien Vollblut abgetrennt. Daran schließt sich entweder eine Nukleinsäure-Reinigung oder ein Verdünnungsschritt an.
Die Nukleinsäure-Reinigung ist sehr zeitintensiv. Die Alternative der Verdün nung des Blutplasmas ist zwar schneller, aber aufgrund der Verdünnung der Probe zwangsweise mit einer Verschlechterung der Nachweisgrenze (d.h. ei ner niedrigeren zu erwartenden Detektionssensitivität) behaftet. Verfahren aus dem Stand der Technik verwenden für die Amplifikation der cfDNA zudem die PCR, die sehr lange vom Start bis zum Ende benötigt (oft einige Stunden) und verhältnismäßig viel Wissen und Geduld bei der Probenvorbereitung be nötigt. Die bekannten Nachweisverfahren sind daher allesamt mit einem hohen Zeit aufwand verbunden und es ist eine Vielzahl von Geräten für den Nachweis erforderlich (z.B. eine Zentrifuge und ein PCR-Gerät). Einige der Geräte (z.B. das PCR-Gerät) können nur von geschulten Personen bedient werden. Ferner kann bei den Nachweisverfahren aus dem Stand der Technik bei jedem der erforderlichen Verarbeitungsschritte ein Materialverlust auftreten und durch die Vielzahl und Dauer der Schritte steigt die Wahrscheinlichkeit, dass die Probe mit Fremd-DNA kontaminiert wird und beim Nachweisverfahren falsch positive Ergebnisse erhalten werden. Zudem kann sogar beim Schritt der Ge winnung von Blutplasma aus der Vollblutprobe eine Lyse von Blutzellen nicht ausgeschlossen werden. Die Folge ist, dass auch ein Risiko einer Kontaminati on der Probe mit Eigen-DNA, die vor der Probenentnahme (in vivo) innerhalb der Blutzellen und nicht außerhalb der Blutzellen im Blut vorhanden war, be steht und in diesem Fall die Eigen-DNA falsch-positive Ergebnisse beim Mess verfahren verursacht.
Insgesamt zeichnen sich die im Stand der Technik bekannten Verfahren durch einen hohen Arbeits- und Geräteaufwand und eine niedrige Detektionsrich tigkeit (aufgrund der erhöhten Kontaminationsgefahr) aus. Bei Verfahren, die auf einer Verdünnung der Probe basieren, ist zwangsweise eine geringe De- tektionssensitivität gegeben.
Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Ver fahren und eine Vorrichtung und einen Kit zur Durchführung des Verfahrens bereitzustellen, das/die/der die oben genannten Nachteile aus dem Stand der Technik nicht aufweist. Insbesondere sollte das Verfahren, die Vorrichtung und der Kit den Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blut zellen befindet, mit geringerem Arbeitsaufwand, geringerem Geräteaufwand, einer höheren Detektionsgenauigkeit (Detektionsrichtigkeit) und einer mög lichst hohen Detektionssensitivität ermöglichen.
Die Aufgabe wird gelöst durch das Verfahren mit den Merkmalen von An spruch 1, der Vorrichtung und/oder dem Kit gemäß Anspruch 12 und der Ver wendung gemäß Anspruch 24. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Ausgestaltungen auf. Erfindungsgemäß wird ein //i-wiro-Verfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA), die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen be findet, bereitgestellt. Das Verfahren umfasst die Schritte
a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsre aktion geeignet ist, wobei die Reaktionsmischung mindestens ein Primerpaar enthält, das zur Amplifikation von mindestens einer im Voll blut befindlichen Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA) geeignet ist oder mindestens ein solches Primerpaar der Reaktionsmischung zugegeben wird;
b) Zugabe von Vollblut eines Lebewesens zu der Reaktionsmischung;
c) Durchführen einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Tempe ratur im Bereich von < 45 °C; und
d) Detektion von DNA mithilfe von mindestens einem Detektionsreagenz, wobei die Detektion während Schritt c) oder nach Schritt c) durchgeführt wird;
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern.
Erfindungsgemäß wird unter dem Begriff „Nukleinsäure" bevorzugt DNA und/oder RNA verstanden, besonders bevorzugt DNA. Folglich kann es sich bei der nachzuweisenden Nukleinsäure bzw. der zu amplifizierenden Nuklein säure beispielsweise um DNA und/oder RNA handeln. Unter dem Begriff „Nukleinsäure" werden bevorzugt auch RNA-DNA-Hybride umfasst. Solche RNA-DNA-Hybride sind beispielsweise einzelne, kurze DNA- und RNA-Stränge (insbesondere Stränge einer Länge von 20-22 Nukleotiden), die sich aneinan der angelagert haben.
Enthält die nachzuweisende Nukleinsäure RNA oder besteht daraus, enthält die Reaktionsmischung bevorzugt ein Enzym oder ihr wird ein Enzym zugege ben wird, das RNA in DNA kopieren kann (z.B. das Enzym Reverse Transcriptase). Die Reaktionsmischung kann Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure- Ligasen enthalten (z.B. eine T7-RNA-Polymerase) oder es können ihr Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure-Ligasen zugegeben werden.
Eine isothermale Amplifikation von freier RNA oder sich innerhalb eines RNA- DNA-Hybrids befindlichen RNA kann beispielsweise über ein NASBA-Verfahren erreicht werden. Hierbei wird die RNA über ein Zusammenwirken der Enzyme RNAse H, Reverse Transkriptase, SD Polymerase und T7 RNA Polymerase auch bei konstanter Temperatur (z.B. Raumtemperatur, 25 °C) in der Reaktionsmi schung amplifiziert (mithilfe mindestens eines Primers, der eine T7- Promotorsequenz enthält). Folglich ist es bevorzugt, dass die Reaktionsmi schung diese Enzyme und mindestens einen Primer mit T7-Promotorsequenz enthält oder ihr diese Enzyme und dieser Primer zugegeben werden.
Alternativ oder zusätzlich kann eine isothermale Amplifikation von freier RNA oder einer sich in einem RNA-DNA-Hybrid befindlichen RNA über eine Ab wandlung des NASBA-Verfahrens erreicht werden, die als„Linker-Ligation"- NASBA-Verfahren bezeichnet wird. Hierbei wird die RNA über ein Zusam menwirken der Enzyme Poly(A)-Polymerase, RNAse H und T7 RNA Polymerase auch bei konstanter Temperatur (z.B. Raumtemperatur, 25 °C) in der Reakti onsmischung amplifiziert (mithilfe mindestens eines Primers, der eine T7- Promotorsequenz enthält). Bei dieser Abwandlung ist es bevorzugt, dass die Reaktionsmischung diese Enzyme und mindestens einen Primer mit T7- Promotorsequenz enthält oder ihr diese Enzyme und dieser Primer zugegeben werden.
Das oben genannte NASBA-Verfahren kann auch in Kombination mit einem RPA-Verfahren durchgeführt werden. Hierbei wird im Vollblut vorhandene DNA zunächst durch das RPA-Verfahren in RNA (NASBA-Amplikon) umgewan delt, wobei die RNA dann über das NASBA-Verfahren amplifiziert wird.
Es wurde gefunden, dass über das erfindungsgemäße Verfahren der Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die sich bei ei nem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet (bei DNA als Nukleinsäure sog. „cell-free DNA" oder kurz „cfDNA"), auch dann gelingt, wenn nicht wie im Stand der Technik üblich eine aufgereinigte Blutprobe ein- gesetzt wird, sondern Vollblut direkt, d.h. ohne Vorbehandlung, eingesetzt wird. Voraussetzung hierfür ist, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern. Durch eine Verwendung einer solchen Reaktionsmischung kann verhindert werden, dass Nukleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA), die sich in zellkernhaltigen Blutzellen (z.B. Leukozyten) befindet, das Nachweisverfahren negativ beeinflussen, d.h. falsch-positive Ergebnisse liefern.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Reaktionsmischung generell dazu geeignet, eine Lyse von Nukleinsäure enthaltenden, Lipid-Doppelmembran-umschlossenen Kompartimenten, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern. Der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Komparti mente" wird erfindungsgemäß weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkba ren Nukleinsäure-enthaltenden Kompartimente, die von einer biologischen Lipid-Doppelmembran umgeben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mito- chondrien, extrazelluläre Vesikel (Exosomen und Mikropartikel), Peroxisomen, Viren, Einzeller und Bakterien.
Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens im Vergleich zu bekannten Verfahren ist, dass eine Probenvorbereitung, d.h. eine Aufreinigung des Voll bluts entfällt. Das erfindungsgemäße Verfahren kommt daher mit weniger Verfahrensschritten aus und ist schneller durchführbar.
Ferner entfällt der bei bekannten Verfahren nötige apparative Aufwand für die Aufreinigung des Vollbluts, d.h. für die Vorbereitung der Probe. Es besteht somit ein deutlicher Kostenvorteil gegenüber bekannten Verfahren.
Zudem eignet sich das erfindungsgemäße Verfahren damit hervorragend für eine Durchführung außerhalb eines Labors. Dies bedeutet, dass beispielsweise ein Patient ambulant (z.B. bei sich zu Hause mit einer hierzu geeigneten Vor richtung bzw. einem hierzu geeigneten Kit zur Durchführung des Verfahrens) bestimmen kann, ob sich in seinem Blut grundsätzlich mindestens eine zell freie Nukleinsäure (z.B. cfDNA) befindet (Verwendung unspezifischer Primer) oder ob sich in seinem Blut mindestens eine bestimmte zellfreie Nukleinsäure (z.B. eine bestimmte cfDNA) befindet (Verwendung spezifischer Primer). Bei der getesteten Person kann es sich um einen Sportler und/oder einen Patien ten wie einen Unfall-, oder Notfallpatienten handeln, der unmittelbar nach dem Sport bzw. unmittelbar nach einem Unfall, oder medizinischen Notfall, direkt an Ort und Stelle dahingehend untersucht werden kann, ob sich min destens eine (bestimmte) Nukleinsäure (z.B. cfDNA), oder eine erhöhte Men ge von mindestens einer (bestimmten) Nukleinsäure (z.B. cfDNA) in seinem Blutkreislauf befindet. Die erhaltenden Informationen können einen entschei denden Vorteil darstellen, um zügig eine adäquate Behandlung eines Patien ten zu veranlassen.
Ferner besteht generell in jedem Verfahrensschritt, also auch in den im Stand der Technik üblichen Verfahrensschritten zur Aufreinigung der Vollblut-Probe, die Gefahr, dass zu detektierende Nukleinsäure (z.B. DNA) verloren geht (z.B. kann DNA und/oder RNA an bestimmte Oberflächen adsorbieren) und damit in dem eigentlichen Detektionsverfahren nicht mehr erfasst werden kann. Die Konsequenz sind eine niedrige Detektionssensitivität bzw. falsch-negative Ergebnisse. Das Risiko, zu detektierende Nukleinsäuren (z.B. DNA und/oder RNA) auf dem Weg zur Detektion zu verlieren, ist mit dem erfindungsgemä ßen Verfahren reduziert, da direkt Vollblut eingesetzt wird. Folglich ist die Detektionssensitivität und Detektionsgenauigkeit höher als bei den bekannten Verfahren. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich dafür, Gene mit einer niedrigen Kopienzahl (sog.„low copy number genes") oder sogar mit einer Kopienzahl von lediglich eins (sog.„single copy number genes") im Vollblut nachzuweisen.
Anders als durch die Schritte zur Aufreinigung der Vollblut-Probe bei den be kannten Verfahren aus dem Stand der Technik besteht beim erfindungsgemä ßen Verfahren auch keine Gefahr, dass während einem dieser Schritte die Probe durch Fremd-Nukleinsäuren (z.B. DNA der Person, die das Verfahren durchführt oder bakterielle DNA) kontaminiert wird. Es wird daher durch das erfindungsgemäße Verfahren auch die Gefahr falsch-positiver Signale einge dämmt, wodurch die Detektionsgenauigkeit gegenüber den bekannten Ver fahren weiter erhöht ist. Das erfindungsgemäße Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die Reaktionsmischung mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die im We sentlichen isotonisch mit Blutzellen ist.
Ferner kann die Reaktionsmischung mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Reaktionsmischung keine Tenside in Konzentrationen, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Hierunter wird insbesondere ver standen, dass die Reaktionsmischung keine Tenside, bzw. keine Stoffe oder Stoffgemische, in einer Konzentration enthält, die dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Optional betrifft dieses Merkmal nicht nur Blutzel len, sondern auch generell Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran- umschlossene Kompartimente, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind. Wie bereits oben erwähnt wird der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran-umschlossene Kompartimente" hier weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkbaren Nukleinsäuren, die von einer biologischen Doppelmembran umgeben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mitochond- rien, Exosomen, Einzeller und Bakterien.
Die im Verfahren eingesetzte Reaktionsmischung kann mindestens einen der folgenden Stoffe enthalten oder der Reaktionsmischung mindestens einer der folgenden Stoffe zugegeben werden:
i) Nukleotidtriphosphate, bevorzugt dATP, dCTP, dGTP ,dTTP, ATP, GTP; und/oder
ii) Kreatinkinase und Phosphokreatin; und/oder
iii) ein Magnesiumsalz, bevorzugt Magnesiumacetat; und/oder
iv) Polyethylenglycol. Ferner kann die Reaktionsmischung mindestens eines der folgenden Proteine enthalten oder mindestens eines der folgenden Proteine der Reaktionsmi schung zugegeben werden:
i) eine strangversetzende Polymerase, bevorzugt ausgewählt aus der Grup pe bestehend aus Sau-DNA-Polymerase, Bsu-DNA-Polymerase, Klenow- Fragment, phi29 und Kombinationen hiervon; und/oder
ii) eine Rekombinase, bevorzugt RecA-Rekombinase und/oder T4 UvsX; und/oder
iii) ein Einzelstrang-bindendes Protein, bevorzugt SSB und/oder T4 gp32; und/oder
iv) eine Exonuklease, bevorzugt Exonuklease III und/oder Exonuklease IV.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das im Verfahren eingesetzte De tektionsreagenz nicht dazu geeignet, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren. Insbesondere kann dieses Merkmal nicht nur für Blutzellen, sondern generell für die Membran Nukleinsäure enthaltender, Lipid-Doppelmembran umschlossener Kompartimente gelten. Vorteil an dieser Ausführungsform ist, dass die Detektion amplifizierter Nukle insäure (z.B. DNA) auch ohne vorherige Abtrennung von DNA-aufweisenden Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente durchgeführt werden kann, da kein Risiko besteht, durch ein Binden des Detektionsreagenzes an DNA innerhalb der Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente falsch-positive Ergebnisse zu erhalten. Das Verfahren kann daher einfacher und schneller durchgeführt werden (z.B. ist kein Schritt nötig, um das Reaktionsgemisch von einem Reaktionsraum über eine Trennwand zu einem separaten Detektions raum strömen zu lassen).
Das Detektionsreagenz kann zum Nachweis von einzelsträngiger und/oder doppelsträngiger DNA geeignet sein und hierfür eingesetzt werden.
Das Detektionsreagenz kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detek tion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon.
Die Sonde mit Fluorophor kann ein Oligonukleotid enthalten oder daraus be stehen, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz (durch eine interne Modifikation) dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist. Das DNA-bindende Farbstoffmolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto- Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon. Bevorzugt werden zur beson ders sensitiven Detektion Farbstoffmoleküle, welche ein Absorptions- und ein Emissionsspektrum aufweisen, welches sich (bevorzugt deutlich) von den ent sprechenden Spektren einer Vollblutprobe unterscheiden. Bezüglich des Ab sorptionsspektrums des eingesetzten Farbstoffmoleküls ist ein Absorptions spektrum von unter 525 nm, eines zwischen 545 nm und 570 nm oder eines über 590 nm besonders vorteilhaft, da sich in diesen Bereichen relative lokale Absorptionsminima des Vollblutes befinden. Anders ausgedrückt sollte der Farbstoff nicht (stark) bei einer Wellenlänge von 525 nm bis 545 und/oder einer Wellenlänge von 570 bis 590 nm absorbieren. Für die Emission ist ein Emissionsspektrum zwischen 580 nm und 610 nm, insbesondere 590 nm bis 610 nm, besonders vorteilhaft. Das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat kann ein Magnesiumsalz sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens erfolgt die Detektion von DNA über eine Detektionseinheit, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluores zenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon (z.B. interne Kame ra des Mobiltelefons, ggf. in Verbindung mit Auswertesoftware auf dem Mo biltelefon), und Kombinationen hiervon.
Ferner kann in dem Verfahren eine Quantifizierung der Menge an amplifizier- ter DNA über eine Auswerteeinheit erfolgen, wobei die Auswerteeinheit be vorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit (bevorzugt einer oben ge nannten Detektionseinheit) verbunden ist.
In dem Verfahren kann mindestens ein Primer, optional beide Primer des Primerpaars, eine Länge von 20 bis 45 bp, besonders bevorzugt 25 bis 40 bp, insbesondere 30 bis 35 bp, aufweisen.
Zudem kann mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU- Sequenz.
Der Vorteil an der Verwendung von Primern bzw. Primerpaaren, die an repeti tive Sequenzen binden, ist, dass sie zur unspezifischen Amplifikation aller denkbaren unbekannten DNAs geeignet sind, die im Vollblut von Lebewesen Vorkommen und repetitive DNA-Sequenzen enthalten. Da praktisch jede DNA bzw. jedes DNA-Fragment gewisser Länge repetitive DNA-Sequenzen aufweist, ist es über solche Primer bzw. Primerpaare möglich, jede denkbare DNA, die sich im Vollblut befindet, zu amplifizieren. Anders ausgedrückt muss die Se quenz der zu amplifizierenden DNA vor der Amplifikationsreaktion nicht be kannt sein. Das Verfahren kann also grundsätzlich den Nachweis liefern, ob überhaupt freie DNA im Blut des Lebewesens vorhanden ist.
Falls über das Verfahren tatsächlich freie DNA im Vollblut detektiert wird, kann diese natürlich über gängige Methoden sequenziert werden. Ist die spe zifische Sequenz der freien DNA (bzw. der freien DNAs) im Blut eines be stimmten Lebewesens (z.B. eines bestimmten Patienten) bekannt, kann das erfindungsgemäße Verfahren natürlich auch mit Primerpaaren durchgeführt werden, die gezielt für den Nachweis der bekannten DNA(s) geeignet sind. Es kann somit mit dem erfindungsgemäßen Verfahren auch ein Monitoring spezi fischer freier DNAs im Vollblut eines Patienten über einen bestimmten Zeit raum (z.B. Minuten, Stunden, Tage und/oder Monate) durchgeführt werden.
Ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, kann/können dazu geeignet sein, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebe wesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Be ginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Le bewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Das Lebewesen kann ein Mensch oder ein Tier sein.
Die in dem Verfahren verwendete isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann bei einer Temperatur im Bereich von 20 °C bis 44 °C, bevorzugt 25 °C bis 42 °C, besonders bevorzugt 30 °C bis 41 °C, insbesondere 35 °C bis 40 °C, durchgeführt werden. Die hierfür erforderliche Temperatur kann über eine Temperiereinheit erzeugt bzw. eingestellt werden.
Falls in dem Verfahren keine Temperiereinheit eingesetzt wird kann die Reak tion entweder bei Raumtemperatur stattfinden oder die nötige Reaktions temperatur über Körperwärme (eines Menschen oder eines Tieres) erzeugt werden. Letzteres ist beispielsweise möglich, indem die Reaktionsmischung der Vorrichtung so nah in die Nähe eines Körpers eines Menschen oder Tieres gebracht wird, dass eine Wärmeübertragung vom Körper auf die Reaktionsmi schung möglich ist.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine semiquantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein oder eine quantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine Amplifikationsreaktion sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase- Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba HDA, NASBA und SDA- Amplifikationsreaktion, optional ist sie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba und SDA- Amplifikationsreaktion. Bevorzugt ist sie eine Rekombinase-Polymerase- Amplifikationsreaktion. Optional enthält die Reaktionsmischung für die Ampli fikationsreaktion eine Helicase. Eine bevorzugte Temperatur für die Amplifika tion ist 37°C, d.h. die Reaktionsmischung wird bevorzugt auf eine Temperatur von 37°C temperiert.
Während oder nach Schritt d) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann, im Falle von (detektierter) amplifizierter DNA, auf das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung geschlossen werden. Die Krankheit ist insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe beste hend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlagan fall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Ge nen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
Die eingesetzte Reaktionsmischung kann mehrere Primerpaare, optional min destens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthalten, die jeweils zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (z.B. DNA) geeignet sind. Alternativ oder zusätzlich können mehrere solcher Primerpaare der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäu re (z.B. DNA) zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure (z.B. DNA), die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkran kung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Verände rung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz, optional die Reaktionsmischung, das Primerpaar und das Detektionsreagenz, von einem Lateral-Flow-Strip enthalten.
Ferner wird erfindungsgemäß eine Vorrichtung und/oder Kit bereitgestellt, die/der zum //i-v/fro-Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, besonders bevorzugt DNA) geeignet ist, die sich bei ei nem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen befindet. Die Vorrich tung und/oder der Kit enthält
a) eine Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von < 45 °C geeignet ist,
b) mindestens ein Primerpaar, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (bevorzugt DNA und/oder RNA, be sonders bevorzugt DNA) geeignet ist, wobei das mindestens eine Primerpaar optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;
c) mindestens ein Detektionsreagenz zur Detektion von DNA, wobei das mindestens eine Detektionsreagenz optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei einem Lebewesen im Vollblut enthalten sind, zu verhindern.
Die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genann ten Vorteile gelten für die erfindungsgemäße Vorrichtung und den erfin- dungsgemäßen Kit entsprechend. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann die oben im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Verfahren genannten Merkmale aufweisen bzw. zu deren Durchführung konfiguriert sein.
Enthält die nachzuweisende Nukleinsäure RNA oder besteht daraus, enthält die Reaktionsmischung bevorzugt ein Enzym, das RNA in DNA kopieren kann (z.B. das Enzym Reverse Transcriptase).
Die Reaktionsmischung kann Proteine aus der Gruppe der Nukleinsäure- Ligasen enthalten (z.B. eine T7-RNA-Polymerase).
Bevorzugt enthält die Reaktionsmischung RNAse H, Reverse Transkriptase, SD Polymerase, T7 RNA Polymerase und mindestens einen Primer mit T7- Promotorsequenz.
Die Reaktionsmischung kann auch bevorzugt die Enzyme Poly(A)-Polymerase, RNAse H, T7 RNA Polymerase und mindestens einen Primer mit T7- Promotorsequenz enthalten.
Die in der Vorrichtung und/oder dem Kit enthaltene Reaktionsmischung kann dazu geeignet sein, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die im We sentlichen isotonisch mit Blutzellen ist.
Ferner kann die Reaktionsmischung dazu geeignet sein, mit Vollblut eine flüs sige Mischung zu bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentli chen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, be sonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform der Vorrichtung und/oder des Kits enthält die Vorrichtung und/oder der Kit keine Tenside, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoff gemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewir ken. Hierunter wird insbesondere verstanden, dass die Reaktionsmischung keine Tenside, bzw. keine Stoffe oder Stoffgemische, in einer Konzentration enthält, die dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen zu bewirken. Optional betrifft dieses Merkmal nicht nur Blutzellen, sondern auch generell Nuklein- säure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran umschlossene Kompartimente, die bei dem Lebewesen im Vollblut enthalten sind. Wie bereits oben erwähnt wird der Begriff „Nukleinsäure-enthaltende, Lipid-Doppelmembran- umschlossene Kompartimente" hier weit verstanden, d.h. er umfasst alle denkbaren Nukleinsäuren, die von einer biologischen Doppelmembran umge ben sind. Hierunter fallen beispielsweise Mitochondrien, Exosomen, Einzeller und Bakterien.
Die Reaktionsmischung kann mindestens einen der folgenden Stoffe enthal ten:
i) Nukleotidtriphosphate, bevorzugt dATP, dCTP, dGTP ,dTTP, ATP, GTP; und/oder
ii) Kreatinkinase und Phosphokreatin; und/oder
iii) ein Magnesiumsalz, bevorzugt Magnesiumacetat; und/oder
iv) Polyethylenglycol.
Ferner kann die Reaktionsmischung mindestens einen der folgenden Proteine enthalten:
i) eine strangversetzende Polymerase, bevorzugt ausgewählt aus der Grup pe bestehend aus Sou-DNA-Polymerase, ßsu-DNA-Polymerase, Klenow- Fragment, phi29 und Kombinationen hiervon; und/oder
ii) eine Rekombinase, bevorzugt RecA-Rekombinase und/oder T4 UvsX; und/oder
iii) ein Einzelstrang-bindendes Protein, bevorzugt SSB und/oder T4 gp32; und/oder
iv) eine Exonuklease, bevorzugt Exonuklease III und/oder Exonuklease IV.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform ist das in der Vorrichtung und/oder dem Kit enthaltene Detektionsreagenz nicht dazu geeignet, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren. Insbesondere kann dieses Merkmal nicht nur für Blutzellen, sondern generell für die Lipid- Doppelmembran Nukleinsäure-enthaltender, Lipid-Doppelmembran um schlossener Kompartimente gelten. Vorteil an dieser Ausführungsform ist, dass die Detektion amplifizierter DNA auch ohne vorherige Abtrennung von DNA-aufweisenden Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente durchge führt werden kann, da kein Risiko besteht, durch ein Binden des Detektionsreagenzes an DNA innerhalb der Zellen bzw. der oben genannten Kompartimente falsch-positive Ergebnisse zu erhalten. Die Vorrichtung und/oder der Kit kann daher einfacher und in kleinerer Baugröße gehalten werden (z.B. ist kein Reaktionsraum und separater Detektionsraum mit einer dazwischen liegenden Trennwand nötig).
Das Detektionsreagenz kann zum Nachweis einzelsträngiger und/oder doppelsträngiger DNA geeignet sein.
Ferner kann das Detektionsreagenz der Vorrichtung und/oder des Kits ausge wählt sein aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombinationen hiervon.
Die Sonde mit Fluorophor kann ein Oligonukleotid enthalten oder daraus be stehen, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von einer Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und bevorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist. Das DNA-bindende Farbstoffmolekül kann ausgewählt sein aus der Gruppe beste hend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hier von. Bevorzugt werden zur besonders sensitiven Detektion Farbstoffmoleküle eingesetzt, welche ein Absorptions- und ein Emissionsspektrum aufweisen, welches sich (bevorzugt deutlich) von den entsprechenden Spektren einer Vollblutprobe unterscheiden. Bezüglich des Absorptionsspektrums des einge setzten Farbstoffmoleküls ist ein Absorptionsspektrum von unter 525 nm, eines zwischen 545 nm und 570 nm oder eines über 590 nm besonders vor teilhaft, da sich in diesen Bereichen relative lokale Absorptionsminima des Vollblutes befinden. Anders ausgedrückt sollte der Farbstoff nicht (stark) bei einer Wellenlänge von 525 nm bis 545 und/oder einer Wellenlänge von 570 bis 590 nm absorbieren. Für die Emission ist ein Emissionsspektrum zwischen 580 nm und 610 nm, insbesondere 590 nm bis 610 nm, besonders vorteilhaft. Das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat kann ein Magnesiumsalz sein. In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält die Vorrichtung und/oder der Kit eine Detektionseinheit zur Detektion von DNA, wobei die Detektions einheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptions messgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon (z.B. interne Kamera des Mobiltelefons, ggf. in Verbindung mit Auswertesoft ware auf dem Mobiltelefon), und Kombinationen hiervon.
Ferner kann die Vorrichtung und/oder der Kit eine Auswerteeinheit zur Quan tifizierung einer Menge an amplifizierter DNA enthalten, wobei die Auswerte einheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
Mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, kann/können eine Länge von 20 bis 45 bp, besonders bevorzugt 25 bis 40 bp, insbesondere 30 bis 35 bp, aufweisen.
Ferner kann ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU- Sequenz.
Zudem kann mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet sein, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
Das Lebewesen kann ein Mensch oder ein Tier sein.
Die Vorrichtung und/oder der Kit kann eine Temperiereinheit enthalten, die dazu konfiguriert ist, die Reaktionsmischung auf eine Temperatur im Bereich von < 45 °C zu temperieren, bevorzugt auf eine Temperatur im Bereich von 20 °C bis 44 °C, besonders bevorzugt 25 °C bis 42 °C, ganz besonders bevorzugt 30 °C bis 41 °C, insbesondere 35 °C bis 40 °C. Die Temperiereinheit wird be vorzugt von einer Spannungsquelle mit Energie versorgt wird, die eine Span nung im Bereich von 1 bis 12 V aufweist. Es ist jedoch auch denkbar, dass die Vorrichtung und/oder der Kit keine Temperiereinheit enthalten. Die Reaktion kann dann entweder bei Raumtem peratur stattfinden oder über Körperwärme (eines Menschen oder eines Tie res) erzeugt werden. Letzteres ist beispielsweise möglich, indem die Reakti onsmischung der Vorrichtung so nah in die Nähe eines Körpers eines Men schen oder Tieres gebracht wird, dass eine Wärmeübertragung vom Körper auf die Reaktionsmischung möglich ist.
Die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion kann eine semiquantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein oder eine quantitative isothermale DNA-Amplifikationsreaktion sein.
Ferner kann die isothermale DNA-Amplifikationsreaktion eine Amplifikations reaktion sein, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase- Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba, HDA, NASBA und SDA- Amplifikationsreaktion, optional ist sie ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Rekombinase-Polymerase-Amplifikationsreaktion, Siba und SDA- Amplifikationsreaktion. Bevorzugt ist sie eine Rekombinase-Polymerase- Amplifikationsreaktion. Optional enthält die Reaktionsmischung für die Ampli fikationsreaktion eine Helicase. Eine bevorzugte Temperatur für die Amplifika tion ist 37°C, d.h. die Reaktionsmischung wird bevorzugt auf eine Temperatur von 37°C temperiert.
Die Vorrichtung und/oder Kit kann dazu konfiguriert sein, im Falle einer De tektion von DNA durch das Detektionsreagenz das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung anzuzeigen, optional über eine für sichtbares Licht transparente Begrenzung der Vorrich tung. Insbesondere ist die Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sep sis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Gen mutation, und Kombinationen hiervon.
In einer bevorzugten Ausgestaltungsform enthält die Vorrichtung und/oder der Kit mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, wobei jedes Primerpaar zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure (z.B. DNA) geeignet ist und wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure (z.B. DNA) zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure (z.B. DNA), die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Au toimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberra tion, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinatio nen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
Die Vorrichtung ist bevorzugt ein Lateral-Flow-Strip.
Der Kit ist bevorzugt dadurch gekennzeichnet, dass er einen Lateral-Flow-Strip aufweist, der die Reaktionsmischung enthält; oder die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz enthält.
Es wird zudem die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung und/oder des erfindungsgemäßen Kits zum direkten, semiquantitativen oder quantitativen, Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA) in Vollblut vorgeschlagen, bevorzugt zum Nachweis von min destens einer Nukleinsäure (z.B. DNA und/oder RNA), die bei einer Krankheit eines Lebewesens und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Vollblut des Lebewesens außerhalb der Blutzellen vorhanden ist.
Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten spezifischen Ausführungsformen einschränken zu wollen.
Figur 1 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsre aktion einer bestimmten cfDNA über eine Sonde unter direktem Einsatz von Vollblut (siehe Beispiel 2). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass der Nachweis mit der Sonde auch beim direkten Einsatz von (nicht aufgereinigtem) Vollblut funktioniert. Ferner wird deutlich, dass sich bei der Versuchsperson, von der das Vollblut stammt, trainingsbedingt ein Anstieg der cfDNA nachweisen lässt. Figur 2 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsre aktion einer bestimmten cfDNA über einen DNA-interkalierenden Fluores zenzfarbstoff unter direktem Einsatz von Vollblut (siehe Beispiel 4). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass der Nachweis mit dem Fluoreszenzfarb stoff auch beim direkten Einsatz von (nicht aufgereinigtem) Vollblut funktio niert. Ferner wird deutlich, dass sich bei der Versuchsperson, von der das Vollblut stammt, trainingsbedingt ein Anstieg der cfDNA nachweisen lässt.
Figur 3 zeigt das Ergebnis einer quantitativen isothermalen Amplifikationsre aktion einer bestimmten cfDNA über eine Sonde unter direktem Einsatz von humaner gDNA, die mit unterschiedlichen Mengen an Hämolysat kontami niert wurde (siehe Beispiel 3). Aus dem Amplifikationsplot geht hervor, dass Hämolysat einen signifikant inhibierenden Einfluss auf die Amplifikationsreak tion ausübt, der erst ab einer starken Verdünnung von 1:10000 (v:v) mit Was ser verschwindet.
Beispiel 1 - Nachweis einer zellfreien DNA über Sonde unter direktem Einsatz von Vollblut
Mit einer Probe aus Vollblut, die zellfreie DNA (sog. cfDNA) enthält wurde eine isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur von 40°C zur Amp lifikation mindestens einer bestimmten zellfreien DNA durchgeführt. Die amp- lifizierte DNA wurde über eine Sonde nachgewiesen.
Folgendes Protokoll wurde verwendet:
■ Ansetzen des Rehydrationgemisches (Gesamtvolumen: 63,08 pl)
6,72 mI Primer Gemisch aus Forward-Primer (,,301"-Primer) und Reverse- Primer (,,302"-Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt (je 10 mM);
0,96 mI Sonde (10 mM);
47.2 mI Rehydrationspuffer (aus "TwistAmp® exo"-Kit, TwistDX Inc., Cambridge, USA), enthaltend Tris-Puffer, Kaliumacetat und PEG 35000, bevorzugt 25 mM Tris-Puffer, 100 mM Kaliumacetat und 5.46% (w/v) PEG 35000 (siehe z.B. Absatz [0054] in WO 2010/141940 Al);
8.2 mI H20. ■ Vermischen;
■ Resuspendieren und Lösen eines gefriergetrockneten Pellets eines „TwistAmp® exo"-Kits (TwistDX Inc., Cambridge, USA) mit 63 pl Rehydrationsgemisch (durch auf- und abpipettieren);
■ Vermischen;
■ Jeweils 19,6 mI des gelösten Pellets in ein 0,5 ml Eppendorf-Cup überfüh ren;
■ In eines der Eppendorf-Cups 1 mI Mausplasma als Kontrolle zugeben und in die anderen Eppendorf-Cups jeweils 1 mI EDTA-Vollblut als Probe zuge ben;
■ Vermischen;
■ Jeweils 6,4 mI Magnesiumacetatlösung (Konzentration: 80 mM) dazuge ben;
■ Vermischen;
■ Zugabe von jeweils 7 mI aus jedem Eppendorf-Cup auf eine PCR-Wellplate;
■ PCR-Wellplate vermischen;
■ PCR-Wellplate im CFX-Thermo-Cycler bei 40°C inkubieren (mit offenem Deckel, d.h.„LidOff").
Das Ergebnis ist in Figur 1 dargestellt. Es ist deutlich erkennbar, dass das er findungsgemäße Nachweisverfahren mit einer Sonde als Nachweisreagenz und einem direkten Einsatz von (nicht aufgereinigten) Vollblut funktioniert. Die Konzentration von cfDNA im Vollblut der Versuchsperson vor dem Trai ning (siehe Signal bei 2) ist geringer ist als nach dem Training (siehe Signal bei 1). Die Kontrollplasma-Probe von einer Maus (NTC-Plasma) zeigt keine Ampli fikation der Ziel-cfDNA (siehe Signal bei 3), was eine Spezifizität der hier dar gestellten Amplifikationsreaktion für humane cfDNA belegt.
Beispiel 2 - Nachweis einer zellfreien DNA über Fluoreszenzfarbstoff unter direktem Einsatz von Vollblut
Mit einer Probe aus Vollblut, die zellfreie DNA (sog. cfDNA) enthält wurde eine isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur von 40°C zur Amp lifikation mindestens einer bestimmten zellfreien DNA durchgeführt. Die amp- lifizierte DNA wurde über einen Fluoreszenzfarbstoff („EvaGreen® Dye", Biotium Inc., Fremont, USA) nachgewiesen. Folgendes Protokoll wurde verwendet:
■ Ansetzen des Rehydrationgemisches (Gesamtvolumen: 63,52 mI)
6,72 mI Primer Gemisch aus Forward-Primer (,,63"-Primer) und Reverse- Primer (,,66"-Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt (je 10 mM);
4 mI EvaGreen® Dye (20x) (Biotium Inc., Fremont, USA);
47,2 mI Rehydrationspuffer (aus "TwistAmp® exo"-Kit, TwistDX Inc., Cambridge, USA), enthaltend Tris-Puffer, Kaliumacetat und PEG 35000, bevorzugt 25 mM Tris-Puffer, 100 mM Kaliumacetat und 5.46% (w/v) PEG 35000 (siehe z.B. Absatz [0054] in WO 2010/141940 Al);
5,6 mI H20.
■ Vermischen;
■ Resuspendieren und Lösen eines gefriergetrockneten Pellets eines „TwistAmp® exo"-Kits (TwistDX Inc., Cambridge, USA) mit 63 mI Rehydrationsgemisch (durch auf- und abpipettieren);
■ Vermischen;
■ Jeweils 19,6 mI des gelösten Pellets in ein 0,5 ml Eppendorf-Cup überfüh ren;
■ In eines der Eppendorf-Cups 1 mI Mausplasma als Kontrolle zugeben und in die anderen Eppendorf-Cups jeweils 1 mI EDTA-Vollblut als Probe zuge ben;
■ Vermischen;
■ Jeweils 6,4 mI Magnesiumacetatlösung (Konzentration: 80 mM) dazuge ben;
■ Vermischen;
■ Zugabe von jeweils 7 mI aus jedem Eppendorf-Cup auf eine PCR-Wellplate;
■ PCR-Wellplate vermischen;
■ PCR-Wellplate im CFX-Thermo-Cycler bei 40°C inkubieren (mit offenem Deckel, d.h.„LidOff").
Das Ergebnis ist in Figur 2 dargestellt. Es ist deutlich erkennbar, dass das er findungsgemäße Nachweisverfahren mit einem interkalierenden Fluoreszenz farbstoff als Nachweisreagenz und einem direkten Einsatz von (nicht aufgereinigten) Vollblut funktioniert. Die Konzentration von cfDNA im Vollblut der Versuchsperson vor dem Training (siehe Signal bei 2) ist geringer ist als nach dem Training (siehe Signal bei 1). Die Kontrollplasma Probe von einer Maus (NTC-Plasma) zeigt keine Amplifikation der Ziel-cfDNA (siehe Signal bei 3), was eine Spezifizität der hier dargestellten Amplifikationsreaktion für hu mane cfDNA belegt.
Beispiel 3 - Nachweis einer fehlenden Lyse von Vollblut während der isothermalen Amplifikationsreaktion
Es wird zunächst ein Hämolysats hergestellt, indem Mausblut durch mehrere Auftau- und Gefrierzyklen behandelt wird, wodurch es zur Lyse der Bluzellen kommt.
Ansatz: RPA-Sonden für Vollblut
Primer: Forward-Primer (,,301"-Primer) und Reverse-Primer („302"-
Primer) zum Nachweis von cfDNA, die bei Muskelbelastung in den Blutkreislauf gelangt
Template: 1 pl humane gDNA (50 ng/ml) mit 1 mI Wasser bzw. mit 1 mI unverdünntem Hämolysat oder einer Mischung aus einer un terschiedlichen Menge an lysiertem Vollblut (Hämolysat) mit Wasser. Für die Mischung von Hämolysat mit Wasser wurde Hämolysat jeweils 1:10 (v:v), 1:100 (v:v), 1:1000 (v:v) und 1:10000 (v:v) mit Wasser verdünnt.
Das Ergebnis ist in Figur 3 dargestellt und in Tabelle 1 dargestellt. Die Probe mit 1 mI humaner gDNA (50 ng/ml) und 1 mI Wasser ist bei 1 zu sehen. Die Proben mit 1 mI humaner gDNA (50 ng/ml) und einer unterschiedlichen Men ge an Hämolysat sind bei 2, 3, 4, 5 und 6 zu sehen. Hierbei ist das Signal für Hämolysat:Wasser = 1:10000 (v:v) bei 2 dargestellt, für Hämolysat:Wasser = 1:1000 (v:v) bei 3 dargestellt, für Hämolysat:Wasser = 1:100 (v:v) bei 4 darge stellt, für Hämolysat:Wasser = 1:10 (v:v) bei 5 dargestellt und für unverdünn tes Hämolysat bei 6 dargestellt. Es ist in Figur 3 deutlich erkennbar, dass eine zunehmende Menge an Hämolysat in dem Reaktionsgemisch während der isothermalen Amplifikationsreaktion die Amplifikationsreaktion von Ziel- cfDNA inhibiert. Bereits Hämolysat-Anteile in einer l:10000-Verdünnung be einträchtigen die Reaktionskinetik signifikant (vgl. Signale bei 1 und 2). Die Reaktionskinetik, die in Abwesenheit von Hämolysat erhalten wurde ist ver gleichbar mit der Reaktionskinetik in den erfindungsgemäßen Verfahren mit Vollblut der Beispiele 1 und 2. Die jeweils erhaltenen Werte des Fluoreszenz schwellenzyklus sind in der Tabelle 1 zusammengefasst (siehe Tabelle 1).
Tabelle 1. n.b. = nicht bestimmbar
Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass während der isothermalen Amplifikationsreaktion in dem erfindungsgemäßen Verfahren die Blutzellen im Vollblut nicht zerstört werden und somit keine Substanzen während der Amplifikationsreaktion freigesetzt werden, welche diese inhibie ren. Folglich kann durch das erfindungsgemäße Verfahren auch beim Einsatz von Vollblut eine hohe Detektionssensitivität und Detektionsgenauigkeit si chergestellt werden.

Claims

Patentansprüche
1. tn-vitro-M erfahren zum Nachweis von mindestens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut außerhalb der Blutzellen be findet, umfassend die Schritte
a) Bereitstellen einer Reaktionsmischung, die zusammen mit mindes tens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amp lifikationsreaktion geeignet ist, wobei die Reaktionsmischung min destens ein Primerpaar enthält, das zur Amplifikation von mindes tens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist oder mindestens ein solches Primerpaar der Reaktionsmischung zuge geben wird;
b) Zugabe von Vollblut eines Lebewesens zu der Reaktionsmischung; c) Durchführen einer isothermalen Amplifikationsreaktion bei einer Temperatur im Bereich von < 45 °C; und
d) Detektion von DNA mithilfe von mindestens einem Detektionsrea genz, wobei die Detektion während Schritt c) oder nach Schritt c) durchgeführt wird;
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei dem Lebewesen im Vollblut ent halten sind, zu verhindern.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Reak tionsmischung
i) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die im Wesentli chen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder
ii) mit dem Vollblut eine flüssige Mischung bildet, die eine
Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis BIO mosmol/kg, insbesondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder
iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blut zellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewir ken.
3. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu geeignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passie ren.
4. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farb stoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kombina tionen hiervon, wobei bevorzugt
i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von ei ner Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und be vorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Grup pe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder
iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.
5. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Detektion von DNA über eine Detektionseinheit erfolgt, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Photoapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hier von.
6. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass eine Quantifizierung der Menge an amplifizierter DNA über eine Auswerteeinheit erfolgt, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommunikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
7. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetiti- ve DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevorzugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ll- NE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
8. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA- Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreislauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
9. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass während oder nach Schritt d) im Falle von amplifi zierter DNA auf das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung geschlossen wird, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
10. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Reaktionsmischung mehrere Primerpaare, op tional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10 Primerpaare, enthält, die jeweils zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet sind, oder mehrere solcher Primerpaare der Reaktionsmischung zugegeben werden, wobei die jeweiligen
Primerpaare bevorzugt dazu geeignet sind, eine unterschiedliche Nuk leinsäure zu amplifizieren, bevorzugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspruchung und/oder einer Krankheit ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmun erkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberrati on, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombi nationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
11. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch ge kennzeichnet, dass die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz, optional die Reaktionsmischung, das Primerpaar und das Detektions reagenz, von einem Lateral-Flow-Strip enthalten sind.
12. Vorrichtung und/oder Kit, geeignet zum //i-v/fro-Nachweis von mindes tens einer Nukleinsäure, die sich bei einem Lebewesen im Vollblut au ßerhalb der Blutzellen befindet, enthaltend
a) eine Reaktionsmischung, die zusammen mit mindestens einem Primerpaar zur Durchführung einer isothermalen Amplifikations reaktion bei einer Temperatur im Bereich von < 45 °C geeignet ist, b) mindestens ein Primerpaar, das zur Amplifikation von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure geeignet ist, wobei das mindestens eine Primerpaar optional in der Reaktionsmischung enthalten ist;
c) mindestens ein Detektionsreagenz zur Detektion von DNA, wobei das mindestens eine Detektionsreagenz optional in der Reakti onsmischung enthalten ist;
dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktionsmischung dazu geeignet ist, eine Lyse von Blutzellen, die bei einem Lebewesen im Vollblut ent halten sind, zu verhindern.
13. Vorrichtung und/oder Kit gemäß Anspruch 12, dadurch gekennzeich net, dass die Reaktionsmischung i) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die im Wesentlichen isotonisch mit Blutzellen ist; und/oder ii) dazu geeignet ist, mit Vollblut eine flüssige Mischung zu bilden, die eine Osmolarität aufweist, welche im Wesentlichen der Osmolarität von Blutzellen entspricht, bevorzugt eine Osmolarität im Bereich von 230 bis 350 mosmol/kg, bevorzugt 260 bis 320 mosmol/kg, besonders bevorzugt 270 bis 310 mosmol/kg, insbe sondere 280 bis 300 mosmol/kg; und/oder
iii) keine Tenside enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blut zellen zu bewirken, bevorzugt keine Stoffe oder Stoffgemische enthält, die dazu geeignet sind, eine Lyse von Blutzellen zu bewir ken.
14. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz nicht dazu ge eignet ist, die Zellmembran von Blutzellen, die im Vollblut enthalten sind, zu passieren.
15. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 14, da durch gekennzeichnet, dass das Detektionsreagenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Sonde mit Fluorophor, DNA-bindendes Farbstoffmolekül, Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat und Kom binationen hiervon, wobei bevorzugt
i) die Sonde mit Fluorophor ein Oligonukleotid enthält oder daraus besteht, das einen Quencher, ein Fluorophor und eine zwischen Quencher und Fluorophor befindliche DNA-Sequenz enthält oder daraus besteht,, wobei die DNA-Sequenz dazu geeignet ist, von ei ner Endonuklease oder Exonuklease gespalten zu werden und be vorzugt eine DHF- oder AP-DNA-Sequenz ist; und/oder ii) das DNA-bindende Farbstoffmolekül ausgewählt ist aus der Grup pe bestehend EVAGreen, SYBR-Green, Syto-Dyes, TOPO-Dyes und Kombinationen hiervon; und/oder
iii) das Reagenz zur Detektion von Pyrophosphat ein Magnesiumsalz ist.
16. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 15, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine De tektionseinheit zur Detektion von DNA enthält/enthalten, wobei die Detektionseinheit bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Absorptionsmessgerät, Fluoreszenzmessgerät, Turbidimeter, Pho toapparat, Mobiltelefon, und Kombinationen hiervon.
17. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 16, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit eine Auswerteeinheit zur Quantifizierung einer Menge an amplifizierter DNA enthält/enthalten, wobei die Auswerteeinheit bevorzugt kommu nikativ mit einer Detektionseinheit verbunden ist.
18. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 17, da durch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine repetitive DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens zu binden, bevor zugt an eine repetitive Sequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus LINE-Sequenz, SINE-Sequenz und ALU-Sequenz.
19. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 18, da durch gekennzeichnet, dass mindestens ein Primer des Primerpaars, optional beide Primer des Primerpaars, dazu geeignet ist/sind, an eine DNA-Sequenz in der DNA des Lebewesens, die zu Beginn, während oder nach einer Krankheit und/oder zu Beginn, während, oder nach ei ner übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Blutkreis lauf des Lebewesens vorhanden ist, zu binden.
20. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 19, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit dazu konfiguriert ist, im Falle einer Detektion von DNA durch das Detekti onsreagenz das Vorhandensein einer Krankheit und/oder einer über mäßigen Muskelbeanspruchung anzuzeigen, optional über eine für sichtbares Licht transparente Begrenzung der Vorrichtung, wobei die Krankheit insbesondere ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon.
21. Vorrichtung und/oder Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 20, da durch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung und/oder der Kit mehrere Primerpaare, optional mindestens 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 oder 10
Primerpaare, enthält/enthalten, wobei jedes Primerpaar zur Amplifika tion von mindestens einer im Vollblut befindlichen Nukleinsäure ge eignet ist und wobei die jeweiligen Primerpaare bevorzugt dazu geeig net sind, eine unterschiedliche Nukleinsäure zu amplifizieren, bevor zugt eine Nukleinsäure, die bei einer übermäßigen Muskelbeanspru chung und/oder einer Krankheit ausgewählt aus der Gruppe beste hend aus Entzündung, Krebs, Autoimmunerkrankung, Herzinfarkt, Schlaganfall, Sepsis, chromosomale Aberration, Veränderung der Kopienzahl bei Genen, Genmutation, und Kombinationen hiervon, im Vollblut eines Lebewesens vorhanden ist.
22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekenn zeichnet, dass die Vorrichtung ein Lateral-Flow-Strip ist.
23. Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass der Kit einen Lateral-Flow-Strip aufweist, der
i) die Reaktionsmischung enthält; oder
ii) die Reaktionsmischung und das Detektionsreagenz enthält.
24. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 12 bis 22, oder einem Kit gemäß einem der Ansprüche 12 bis 21 oder 23, zum di rekten, semiquantitativen oder quantitativen, Nachweis von mindes tens einer Nukleinsäure in Vollblut, bevorzugt zum Nachweis von min destens einer Nukleinsäure, die bei einer Krankheit eines Lebewesens und/oder einer übermäßigen Muskelbeanspruchung des Lebewesens im Vollblut des Lebewesens außerhalb der Blutzellen vorhanden ist.
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