EP3784375A1 - Verdünnen, mischen und/oder aliquotieren von zwei flüssigkeiten in einem mikrofluidisches system - Google Patents

Verdünnen, mischen und/oder aliquotieren von zwei flüssigkeiten in einem mikrofluidisches system

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Publication number
EP3784375A1
EP3784375A1 EP19717285.1A EP19717285A EP3784375A1 EP 3784375 A1 EP3784375 A1 EP 3784375A1 EP 19717285 A EP19717285 A EP 19717285A EP 3784375 A1 EP3784375 A1 EP 3784375A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
liquid
channel
chamber
pumping
chambers
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP19717285.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jochen Hoffmann
Tino Frank
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Robert Bosch GmbH
Original Assignee
Robert Bosch GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Robert Bosch GmbH filed Critical Robert Bosch GmbH
Publication of EP3784375A1 publication Critical patent/EP3784375A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F23/00—Mixing according to the phases to be mixed, e.g. dispersing or emulsifying
    • B01F23/40—Mixing liquids with liquids; Emulsifying
    • B01F23/45—Mixing liquids with liquids; Emulsifying using flow mixing
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F25/00—Flow mixers; Mixers for falling materials, e.g. solid particles
    • B01F25/50—Circulation mixers, e.g. wherein at least part of the mixture is discharged from and reintroduced into a receptacle
    • B01F25/51—Circulation mixers, e.g. wherein at least part of the mixture is discharged from and reintroduced into a receptacle in which the mixture is circulated through a set of tubes, e.g. with gradual introduction of a component into the circulating flow
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
    • B01F33/00—Other mixers; Mixing plants; Combinations of mixers
    • B01F33/30—Micromixers
    • B01F33/3035—Micromixers using surface tension to mix, move or hold the fluids
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    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
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    • B01F35/88—Forming a predetermined ratio of the substances to be mixed by feeding the materials batchwise
    • B01F35/882—Forming a predetermined ratio of the substances to be mixed by feeding the materials batchwise using measuring chambers, e.g. volumetric pumps, for feeding the substances
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
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    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
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    • B01L3/502715—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by interfacing components, e.g. fluidic, electrical, optical or mechanical interfaces
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
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    • B01L3/50273—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip characterised by the means or forces applied to move the fluids
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    • B01L2400/00—Moving or stopping fluids
    • B01L2400/04—Moving fluids with specific forces or mechanical means
    • B01L2400/0475—Moving fluids with specific forces or mechanical means specific mechanical means and fluid pressure

Definitions

  • the present invention relates to a method of dilution, mixing
  • microfluidic system having at least two sample chambers and at least one channel.
  • microfluidic devices or systems such as microfluidic chips
  • microfluidic chips are used.
  • Such, usually made of plastic, fluidic devices can be used.
  • Microfluidic systems allow automation and parallelization of the executed process steps.
  • the microfluidic systems can be any type of microfluidic systems.
  • the laboratory processes can be carried out directly at the point of care at the treatment site (point-of-care).
  • the invention also relates to a method for diluting, mixing and / or aliquoting two liquids using a microfluidic system comprising at least two pumping chambers interconnected by at least one microfluidic channel (hereinafter referred to as "channel" for short).
  • the pumping chambers each have an inlet and a drain, via which the pumping chambers can be filled or emptied with liquid, wherein the outlet of the one pumping chamber is connected via the microfluidic channel to the inlet of a further pumping chamber.
  • At least one of the pumping chambers is arranged to pump a first fluid, with which this chamber has been filled, through the at least one channel into another chamber.
  • the pumping chamber (hereinafter referred to as "chamber” called) have a membrane which is deflected during pumping and displaces the liquid from the chamber.
  • the first liquid is in particular an aqueous solution with an analyte to be examined.
  • a first step at least one of the chambers is filled with a first liquid.
  • the first liquid is in particular a sample solution to be investigated.
  • the first liquid is pumped through the channel to another chamber. Due to the design of the channel, a part of the first liquid remains in the channel.
  • the channel is completely filled with the first liquid after pumping.
  • the remaining part of the first liquid in the channel is dependent on the design of the channel, in particular its geometry, shape and length. By choosing the channel, the volume of the part of the first liquid remaining in the channel can be specified. The part of the first liquid remaining in the channel becomes
  • This determination can be realized purely in principle by additional components.
  • the known geometry, shape and length of the channel are preferably used for this purpose, and from this the volume of the part of the first liquid remaining in the channel
  • the same channel, in which the part of the first liquid is located, is flushed with a second liquid, so that the first liquid and the second liquid mix.
  • Rinse means in this context, that the second liquid flows through the microfluidic system and in particular through the channel.
  • the second liquid can be kept in one of the other chambers and then pumped into the system.
  • closed circuits are particularly suitable in which the sequence of each of the chambers is connected to an inlet of one of the further chamber. This is called cyclic mixing.
  • mixing of the two liquids can be achieved by alternately pumping between the two chambers.
  • the second fluid can be supplied from the outside via an inlet to the microfluidic system.
  • an external device for example an external pump, can be used which is outside the described
  • Microfluidic system is arranged.
  • the volume of the purged second liquid can be adjusted.
  • the second liquid is also an aqueous solution.
  • mixing and / or dilution of the two liquids with a defined and controllable volume of the first liquid and a volume of the second liquid which can be set during rinsing can be realized in a simple manner.
  • a particularly simple passive separation or removal of a partial volume of the first fluid from the total volume can be realized.
  • the dynamic mixture allows adjustment of the reaction mixture and / or the dilution stage during the experiment. This allows the
  • Dilution stage can be selected depending on the initially existing total volume of the first liquid.
  • the method may also be used for a microfluidic network formed of a plurality of pumping chambers and a plurality of channels through which the chambers are interconnected. For this purpose, the above steps can be repeated.
  • the above described two pumping chambers and the channel connecting the two may be considered as a module of the microfluidic network.
  • the microfluidic network describes a superordinate structure of the
  • the microfluidic network comprises a plurality of the modules described above.
  • the individual modules can be designed differently and
  • microfluidic network can also have other modules, chambers and / or channels. The modules described above can be incorporated into existing microfluidic networks.
  • first liquid and second liquid should only serve to distinguish the two liquids.
  • the same or different liquids can be chosen as new “first” or “second” liquids and the invention is not limited to two types of liquids.
  • the first liquid with which at least one of the chambers is filled is selected according to the following options: Firstly, the first liquid corresponds to the initial first liquid which has been transferred by pumping into this chamber (s) minus the part of the first liquid which remained in the canal.
  • Liquid produced after one pass of the process will be considered a new first liquid when the process is repeated.
  • the second liquid may correspond to the initial second liquid or another second liquid may be selected.
  • another channel can be selected through which the first liquid is pumped. As already described, the channels may be different and thus have a different volume in the
  • the main effects are the surface tension of the (first) liquid itself and the interfacial tension between the (first) liquid and to call the (first) liquid in contact surface of the channel.
  • the surface effects preferably lead to a capillary effect of the (first) liquid in the channel.
  • aqueous first fluid can be equated with water, making it easy to handle.
  • the at least one channel is configured such that the desired part of the liquid remains in the channel after pumping due to the surface effects.
  • the ratio between the volume of the pumping chamber, therefore the chamber from which the first liquid is pumped into the connecting channel, and the volume of the channel is in a range between 1: 2 and 1: 10,000, more preferably in a range between 1: 5 and 1: 1000. These ratios are particularly well suited for leaving some of the first liquid in the channel.
  • the volume of the pumping chamber is preferably in a range between 1 pl and 500 pl, more preferably in a range between 10 ml and 50 ml. These volumes of the pumping chambers are particularly well suited for typical investigations, for example in molecular diagnostics.
  • the part of the first liquid remaining in the channel is determined.
  • the volume of the channel from the known geometry, shape and length of the channel can be calculated and deduced therefrom to the volume of remaining in the channel portion of the first liquid.
  • the volume of the part of the first liquid remaining in the channel corresponds exactly to the volume of the channel.
  • the volume of the channel is usually known, for example predetermined during production or determined by measurement, which is why in this case the volume of the channel and the volume of the part of the first liquid remaining in the channel,
  • a camera can be used together with the evaluation unit, in order to determine the volume of the remaining part of the first liquid in the channel, taking into account the geometry, shape and length of the channel, for which purpose the degree of filling can be determined.
  • the dilution stage of the liquid can be determined with the aid of the camera described above together with the evaluation unit.
  • the determined data therefore, the volume and / or mass of the portion of the first liquid may be used to monitor the achievement of a desired mixing ratio and / or dilution level.
  • the determined data may be used to determine the volume of the second liquid needed to produce the desired one
  • the chambers are deflated after the pumping chamber has pumped the first liquid into the other chamber. It is provided that the first liquid is also after the chambers have been emptied, remains in the at least one channel. Subsequently, the second liquid can be introduced through the now empty chambers in the microfluidic system. This makes it particularly easy to realize the mixture or the dilution of the first liquid with the second liquid. After emptying, only the first liquid remaining in the channel, the volume of which is known, is present in the microfluidic system. In other words, during rinsing, the second liquid can only mix with the known first liquid in the channel, since after emptying and before rinsing, no further liquid is present in the considered microfluidic system.
  • the computer program is set up to perform each step of the method, in particular when it is performed on a computing device or controller. It allows the implementation of the method in a conventional electronic control unit without having to make any structural changes. For this it is on the machine-readable
  • Electronic control unit for controlling the microfluidic system the electronic control unit is achieved, which is set up using of the microfluidic system to dilute, mix and / or aliquot the two fluids.
  • the electronic control unit may be part of a lab-on-chip, also called chip laboratory, comprising the above-described microfluidic system.
  • the lab-on-chip also includes components for controlling fluid flow, components for performing laboratory processes, and
  • the lab-on-chip a camera, which detects the at least one channel, and an evaluation, which evaluates signals from the camera.
  • the camera detects the liquid in the channel and, for example, records the fluorescence and / or the turbidity of the liquid and forwards its signals to the evaluation unit.
  • the evaluation unit determines from the camera signals, i. H. for example, from the fluorescence and / or the turbidity of the dilution stage of the liquid. Thereby, the achievement of the desired mixing ratio and / or the desired dilution stage can be monitored.
  • Dilution stage is a feedback system (feedback system) given, over which the mixing or dilution of the liquid (s) can be controlled or regulated.
  • the evaluation unit can also determine the volume of the remaining part of the first liquid in the channel.
  • Figures 1 a-d show schematic representations of a first embodiment of the invention.
  • Figures 2 a-f show schematic representations of a second embodiment of the invention.
  • Figures 3 ai show schematic representations of a third embodiment of the invention.
  • Figures 4 ag show schematic representations of a fourth embodiment of the invention.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of a lab-on chip on which an embodiment of the method according to the invention can proceed.
  • FIGS 1 a-d show schematic representations of a microfluidic system.
  • the basic concept of the microfluidic system will be explained below, which serves as an independent module for use in a
  • Microfluidic network can be considered.
  • the subfigures 1 ac each represent a step of a first embodiment of the method according to the invention.
  • the microfluidic system has a first pumping chamber 1 and a second pumping chamber 2, which are both of the same design in this embodiment and each have a membrane, not shown, which during pumping is deflected and displaced a liquid from the respective chamber.
  • the first pumping chamber 1 and a second pumping chamber 2 which are both of the same design in this embodiment and each have a membrane, not shown, which during pumping is deflected and displaced a liquid from the respective chamber.
  • the first pumping chamber 1 and a second pumping chamber 2 which are both of the same design in this embodiment and each have a membrane, not shown, which during pumping is deflected and displaced a liquid from the respective chamber.
  • the first pumping chamber 1 and a second pumping chamber 2 which are both of the same design in this embodiment and each have a membrane, not shown, which during pumping
  • Pumping chamber 1 and the second pumping chamber in structure, function, volume and the components included differ.
  • the two chambers 1, 2 are interconnected via a microfluidic channel 3, wherein the microfluidic channel 3 connects an outlet 11 of the first chamber 1 with an inlet 20 of the second chamber 2.
  • the volume of the pumping chambers 1, 2 is
  • Pumping chambers 1, 2 and the volume of the channel is 1: 100.
  • the first chamber 1 has been filled via its inlet 10 with a first liquid Fi, which has an analyte to be examined and is based on water.
  • the second chamber 2 and the channel 3 are filled with a second liquid F 2 .
  • the membrane of the first chamber 1 is deflected and thereby the first liquid Fi is pumped through the channel 3 into the second chamber 2, thereby displacing the second liquid F 2 from the second chamber 2 and the channel 3.
  • the channel 3 is designed such that at least a portion of the first liquid Fi remains in the channel 3 after pumping.
  • surface effects such. B. the surface tension of the first liquid Fi itself and the interfacial tension between the first liquid Fi and the surface of the channel 3 in contact with the first liquid Fi, on the first liquid Fi and lead to a capillary effect of the first liquid Fi in the channel 3, whereby it is retained in the channel 3.
  • the surface effects mentioned are dependent on the geometry, shape and length of the channel 3, the material of the surface of the channel 3 and the liquid Fi itself.
  • the channel 3 is completely filled with the first liquid Fi after pumping.
  • the second chamber 2 is emptied via its outlet 21, the first liquid Fi remaining in the channel 3, even after emptying, owing to the design of the channel 3 and the effective surface effects.
  • a second liquid F 2 with which the first liquid Fi is to be mixed or diluted, introduced via the inlet 10 of the first chamber 1 in the microfluidic system and rinsed through the channel 3.
  • the first liquid Fi and the second liquid F 2 mix to form a first mixture Mi and the first liquid Fi is diluted with the second liquid F 2 .
  • the geometry, shape and length of the channel 3 is known and this was completely filled with the first liquid Fi, it can be used to determine the volume of the first liquid, so that the mixing ratio or the dilution stage can be controlled.
  • the aliquoting ie a proportional determination of the first liquid Fi or of the analyte, is provided.
  • FIGS. 1-4 do not show valves for controlling the fluid flow.
  • first chamber and second chamber refer to their filling with a first liquid Fi and / or a second liquid F 2 .
  • Figures 2 af show schematic representations of a microfluidic system in which the outlet 11 of the first chamber 1 and the outlet 21 of the second chamber 2 are connected via a microfluidic channel 3 and the inlet 10 of the first chamber 1 and the inlet 20 of the second chamber 2 via a further microfluidic channel 3 ', which is formed in analogy to the microfluidic channel 3, so that the microfluidic System forms a closed microfluidic circuit.
  • the channel 3 is connected to a common outlet 30.
  • the module described above can be incorporated into a microfluidic network.
  • the chambers 1, 2, inlets 10, 20 and the common outlet 30 can be controlled individually.
  • the subfigures 2 af each represent a step of a second embodiment of the method according to the invention.
  • the first chamber 1 is filled with a first liquid Fi and a second liquid F 2 is held in the second chamber 2.
  • the first liquid Fi is pumped out of the first chamber 1 into the channel 3 'and out through the outlet 30. As described above, part of the first liquid Fi remains in the channel 3.
  • the two chambers 1, 2 are alternately opened and closed under pumping, so that the second liquid F 2 moves through the channels 3, 3 'in a closed circuit and with the first liquid Fi, which has remained in the channel 3, mixed. This process is called cyclic mixing.
  • FIGS. 2e and 2f show how a further mixture M 2 having a different mixing ratio is produced from the mixture Mi. Similar to the first liquid Fi, a part of the first mixture Mi remains in the channels 3, 3 '.
  • the second chamber 2 is filled via the inlet 20 again with the second liquid F 2 .
  • the first chamber 1 may be filled with the second liquid F 2 or either the first chamber 1 or the second chamber 2 may be filled with the first liquid Fi.
  • FIGS. 3 ai show schematic representations of a microfluidic network, with which dilution series with different
  • the outlet of the first chamber 1 is connected via the microfluidic channel 3 simultaneously with the inlet 20 of the second chamber 2 and an inlet 40 of a third chamber 4.
  • the outlet 21 of the second chamber 2 is connected to an outlet 41 of the third chamber 4 via a further microfluidic channel 3 ', which is designed analogously to the microfluidic channel 3.
  • the further channel 3 ' has a common outlet 30, which branches several times and thus forms a network.
  • Each branch of the common outlet 30 and the chambers 1, 2, 4 can be individually controlled by means of the valves described above.
  • a bypass not shown is arranged at the marked with reference numeral 31 point of the common outlet 30, a bypass not shown is arranged. At least the common outlet 30 can be flushed out via this bypass.
  • the subfigures 3 ai each represent a step of a third embodiment of the method according to the invention.
  • the first chamber 1 is filled with the first liquid Fi, which in FIG. 1b is pumped through the channel 3 into the third chamber 4, one part the first liquid Fi remains in the channel.
  • the chamber 1 is filled with the second liquid F 2 and this then, as shown in Figure 3c, pumped into the second chamber 2, in which case a part of the second liquid F 2 remains in the channel.
  • the second liquid F 2 is cyclically mixed with the first liquid Fi, as already explained in connection with FIG.
  • Mixture Mi with a defined mixing ratio and a defined
  • Dilution level is obtained.
  • the first mixture Mi is diverted through the outlet 30 into one of the branches and may then continue to be used.
  • the common outlet 30 is flushed via the above-mentioned bypass, so that the first mixture Mi is removed from the common outlet 30 to a negligibly small part.
  • FIG. 3f It remains a part of the first mixture Mi in the channel 3 ', which is then pumped into the second chamber 2.
  • the first chamber 1 is again filled with the first liquid Fi in analogy to FIG. 3a, and the first liquid Fi is then filled in analogy with FIG. 3b again pumped into the third chamber 4.
  • the desired mixing ratio and the dilution stage can in further
  • the second liquid F 2 may be used instead.
  • a cyclic mixing of the first mixture Mi with the first liquid Fi takes place again in order to obtain a second mixture M 2 .
  • This second mixture M 2 is then discharged through the outlet 30 into a further branch, as shown in FIG. 3 h. The above steps are repeated to obtain the dilution series of eight shown in FIG. 3 .
  • FIGS. 4 a-g show schematic representations of a microfluidic system for performing a nested PCR (nested polymerase chain reaction). Here is a pre-amplificate on two different PCR (nested polymerase chain reaction).
  • nested PCR nested polymerase chain reaction
  • first chamber 1 and second chamber 2 are each assigned a further chamber 5, 6, in which lyophilisates L, also called lyobeads, are present.
  • the chambers 1, 2, 5, 6 are interconnected via microfluidic channels 3.
  • the first chamber 1 and the second chamber 2 together form a cycle.
  • the first chamber 1 with its associated chamber 5 and the second chamber 2 with its associated chamber 6 each form a sub-circuit.
  • the first chamber 1 and the second chamber 2 may be assigned further chambers (not shown) in further exemplary embodiments, so that in each case three chambers form one unit.
  • the partial figures 4 a-g each represent a step of a fourth embodiment of the method according to the invention.
  • the first chamber 1 is filled with the reaction product of a pre-amplification as the first liquid Fi.
  • the first liquid Fi is then pumped through the circuit between the first chamber 1 and the second chamber 2 in FIG. 4b. In this case, a part of the first liquid Fi remains in the channel 3.
  • the microfluidic system is rinsed with an aqueous second liquid F 2 , as shown in Figure 4c.
  • the first liquid Fi, ie the pre-amplificate, and the second liquid F 2 , ie the buffer, are then, as shown in FIG. 4 d, mixed by circulation pumping the first chamber 1 and the second chamber 2, so that a mixture Mi is formed.
  • Dilution step can be adjusted by repeating the steps as described in connection with FIG. Was the desired
  • the mixture Mi is pumped into the chambers 5 and 6 - see Figure 4e.
  • the mixture Mi is pumped into the chambers 5 and 6 - see Figure 4e.
  • FIG. 5 shows a schematic representation of a lab-on-chip with a feedback system (feedback system) on which an embodiment of the method according to the invention can proceed.
  • the microfluidic system S is detected by a camera 7, which records the fluorescence and / or the turbidity of the liquid.
  • an evaluation unit 8 is provided, which receives the camera signals. The evaluation unit 8 determines from the
  • Evaluation unit 8 the volume of the second liquid F 2 required for the desired dilution, mixing and / or aliquoting.
  • the evaluation unit 8 can calibrate the dilution stage with previously calibrated
  • the evaluation unit 8 can be calibrated during the examination.
  • the volume of the remaining part of the first liquid Fi in the channel 3 is determined from the geometry, the shape and the length of the channel 3 and the volume of the second liquid F 2 either measured externally or also over the part remaining in the channel 3 ermitelt.
  • the evaluation unit 8 calculates the dilution stage or the mixing ratio from the two volumes of the two liquids Fi and F 2 and brings them into connection with the camera signals.
  • To the third can a
  • Reference liquid are filled with known dilution stage or mixing ratio in the second chamber 2. Then the evaluation unit 8 compares the

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verdünnen, Mischen und/oder Aliquotieren von zwei Flüssigkeiten (F1, F2) unter Verwendung eines mikrofluidischen Systems, umfassend zumindest zwei Pumpkammern (1, 2), die durch mindestens einen mikrofluidischen Kanal (3) miteinander verbunden sind. Der mindestens eine Kanal (3) ist derart ausgestaltet, dass zumindest ein Teil der ersten Flüssigkeit (F1) nach dem Pumpen im Kanal (3) verbleibt. Das Verfahren umfasst folgende Schritte: Zu Beginn wird zumindest eine der Pumpkammern (1) mit einer ersten Flüssigkeit (F1) gefüllt. Anschließend wird die erste Flüssigkeit (F1) durch den Kanal (3) gepumpt, wobei ein Teil der ersten Flüssigkeit (F1) im Kanal (3) verbleibt. Dann wird der Teil der ersten Flüssigkeit (F1), der im Kanal (3) verbleibt ermittelt. Schließlich erfolgt ein Durchspülen des Kanals (3) mit einer zweiten Flüssigkeit (F2).

Description

Beschreibung
VERDÜNNEN, MISCHEN UND/ODER ALIQUOTEREN VON ZWEI FLÜSSIGKEITEN IN EINEM MIKROFLUIDISCHES SYSTEM
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Verdünnen, Mischen
und/oder Aliquotieren von zwei Flüssigkeiten in einem mikrofluidisches System mit zumindest zwei Probekammern und zumindest einem Kanal.
Stand der Technik
Für verschiedene Anwendungsbereiche kommen mikrofluidische Vorrichtungen bzw. Systeme, wie beispielsweise Mikrofluidikchips, zum Einsatz. Derartige, in der Regel aus Kunststoff ausgebildete, fluidische Vorrichtungen können
beispielsweise für analytische, präparative oder diagnostische Anwendungen, insbesondere in der Medizin, eingesetzt werden und dienen zur Analyse von
Probelösungen mit hoher Sensitivität in miniaturisierter Form. Die
mikrofluidischen Systeme erlauben eine Automation und Parallelisierung der durchgeführten Prozessschritte. Die mikrofluidischen Systeme können
beispielsweise in Form eines sogenannten Lab-on-Chip-Systems verwendet werden, wobei die Funktionalitäten eines Labors gewissermaßen im
Scheckkartenformat zusammengefasst werden. Durch die Miniaturisierung
können die Laborprozesse direkt bei der Probenentnahme am Behandlungsort (Point-of-Care) durchgeführt werden.
Um verschiedene Prozesse durchführen zu können, ist es oftmals vorgesehen, Flüssigkeiten zu verdünnen, zu mischen und/oder zu aliquotieren sowie auf verschiedene Volumina aufzuteilen. Herkömmlicherweise werden die
Verdünnung, das Mischen und/oder die Aliquotierung d. h. die anteilsmäßige
Ermittlung, mittels einer festen Geometrie des mikrofluidischen Systems
realisiert. Offenbarung der Erfindung
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Verdünnen, Mischen und/oder Aliquotieren von zwei Flüssigkeiten unter Verwendung eines mikrofluidischen Systems, welches zumindest zwei Pumpkammern, die durch mindestens einen mikrofluidischen Kanal (im Folgenden kurz„Kanal“ genannt) miteinander verbunden sind, umfasst. Die Pumpkammern weisen jeweils einen Zulauf und einen Ablauf auf, über welche die Pumpkammern mit Flüssigkeit befüllt oder entleert werden können, wobei der Ablauf der einen Pumpkammer über den mikrofluidischen Kanal mit dem Zulauf einer weiteren Pumpkammer verbunden ist. Zumindest eine der Pumpkammern ist eingerichtet, eine erste Flüssigkeit, mit der diese Kammer gefüllt wurde, durch den mindestens einen Kanal in eine andere Kammer zu pumpen. Hierfür kann die Pumpkammer (im Folgenden kurz „Kammer“ genannt) eine Membran aufweisen, die beim Pumpen ausgelenkt wird und die Flüssigkeit aus der Kammer verdrängt. Die erste Flüssigkeit ist insbesondere eine wässrige Lösung mit einem zu untersuchenden Analyt.
In einem ersten Schritt wird zumindest eine der Kammern mit einer ersten Flüssigkeit gefüllt. Die erste Flüssigkeit ist insbesondere eine zu untersuchende Probelösung. Im Anschluss wird die erste Flüssigkeit durch den Kanal zu einer weiteren Kammer gepumpt. Aufgrund der Ausgestaltung des Kanals verbleibt ein Teil der ersten Flüssigkeit im Kanal. Bevorzugt ist der Kanal nach dem Pumpen vollständig mit der ersten Flüssigkeit befüllt. Der im Kanal verbleibende Teil der ersten Flüssigkeit ist abhängig von der Ausgestaltung des Kanals, insbesondere von dessen Geometrie, Form und Länge. Durch die Wahl des Kanals kann das Volumen des Teils der ersten Flüssigkeit, der im Kanal verbleibt, vorgegeben werden. Der Teil, der ersten Flüssigkeit, der im Kanal verbleibt, wird
anschließend ermittelt. Diese Ermittlung kann rein prinzipiell durch zusätzliche Komponenten realisiert werden. Vorzugsweise wird hierzu allerdings die bekannten Geometrie, Form und Länge des Kanals verwendet und daraus auf das Volumen des im Kanal verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit
geschlossen.
Derselbe Kanal, in dem sich der Teil der ersten Flüssigkeit befindet, wird mit einer zweiten Flüssigkeit durchspült, sodass sich die erste Flüssigkeit und die zweite Flüssigkeit mischen. (Durch-)Spülen bedeutet in diesem Zusammenhang, dass die zweite Flüssigkeit durch das mikrofluidische System und dabei insbesondere durch den Kanal strömt. Dabei kann die zweite Flüssigkeit in einer der weiteren Kammern vorgehalten werden und dann in das System eingepumpt werden. Hierfür sind geschlossene Kreisläufe besonders geeignet, bei denen der Ablauf jeder der Kammern mit einem Zulauf einer der weiteren Kammer verbunden ist. Dies wird als zyklisches Mischen bezeichnet. Das bedeutet, dass ein Vermischen der beiden Flüssigkeiten durch ein alternierendes Pumpen zwischen den beiden Kammern hin und her erreicht werden kann. Alternativ kann die zweite Flüssigkeit von außen über einen Zulauf dem mikrofluidischen System zugeführt werden. Hierfür kann eine externe Vorrichtung, beispielsweise eine externe Pumpe, verwendet werden, die außerhalb des beschriebenen
mikrofluidischen Systems angeordnet ist. Das Volumen der eingespülten zweiten Flüssigkeit kann eingestellt werden. Die zweite Flüssigkeit ist insbesondere ebenfalls eine wässrige Lösung. Als Resultat lässt sich auf einfache Weise eine Mischung und/oder Verdünnung der beiden Flüssigkeiten mit einem definierten und kontrollierbaren Volumen der ersten Flüssigkeit und einem beim Spülen einstellbaren Volumen der zweiten Flüssigkeit realisieren. Optional kann im Anschluss noch ein Aliquotieren, d. h. eine anteilsmäßige Ermittlung, der Mischung durchgeführt werden. Es lässt sich also eine besonders einfache passive Abtrennung bzw. Entnahme eines Teilvolumens der ersten Flüssigkeit aus dem Gesamtvolumen realisieren. Besonders von Vorteil ist dabei, dass die dynamische Mischung eine Einstellung der Reaktionsmischung und/oder der Verdünnungsstufe während des Experiments erlaubt. Dadurch kann die
Verdünnungsstufe abhängig vom anfangs insgesamt vorhandenen Volumen der ersten Flüssigkeit gewählt werden.
Das Verfahren kann auch für ein mikrofluidisches Netzwerk verwendet werden, welches aus einer Mehrzahl von Pumpkammern und eine Mehrzahl von Kanälen, durch welche die Kammern miteinander verbunden sind, gebildet ist. Hierfür können die oben genannten Schritte wiederholt werden. Die vorstehend beschriebenen zwei Pumpkammern und der Kanal, der die beiden verbindet kann als ein Modul des mikrofluidischen Netzwerkes aufgefasst werden. Das mikrofluidische Netzwerk beschreibt eine übergeordnete Struktur der
Pumpenkammern und der Kanäle und kann als Teil des mikrofluidischen
Systems angesehen werden. Gemäß dem vorliegenden Aspekt weist das mikrofluidische Netzwerk eine Mehrzahl der eingangs beschriebenen Module auf. Die einzelnen Module können unterschiedlich ausgestaltet sein und
insbesondere unterschiedliche ausgestaltete Kanäle aufweisen, in denen dann verschieden große Volumina der ersten Flüssigkeit verbleiben. Dadurch lässt lassen sich verschiedene Mischverhältnisse und/oder Verdünnungsstufen in einem gegebenen mikrofluidischen Netzwerk hersteilen. Dies hat den Vorteil, dass gewünschte Verdünnungen definiert hergestellt werden können. Das mikrofluidische Netzwerk kann zudem auch andere Module, Kammern und/oder Kanäle aufweisen. Die vorstehend beschriebenen Module können in bereits bestehende mikrofluidische Netzwerke eingefügt werden.
Die Bezeichnungen„erste“ Flüssigkeit und„zweite“ Flüssigkeit soll dabei nur zur Unterscheidung der beiden Flüssigkeiten dienen. Bei jeder Wiederholung des Verfahrens können dieselben oder andere Flüssigkeiten als neue„erste“ oder „zweite“ Flüssigkeiten gewählt werden und die Erfindung ist nicht auf zwei Typen von Flüssigkeiten beschränkt. Je nach Anwendung wird die erste Flüssigkeit mit der zumindest eine der Kammern gefüllt wird entsprechend der nachfolgenden Möglichkeiten gewählt: Zum einen entspricht die erste Flüssigkeit der anfänglichen ersten Flüssigkeit, die durch Pumpen in diese Kammer(n) überführt wurde, abzüglich des Teils der ersten Flüssigkeit die im Kanal verblieben ist.
Zum anderen kann die Mischung der ersten Flüssigkeit mit der zweiten
Flüssigkeit, die nach einem Durchlauf des Verfahrens entstanden ist, bei der Wiederholung des Verfahrens als neue erste Flüssigkeit angesehen werden. Dadurch lassen sich weitere Mischungen bzw. Verdünnungen erreichen. In beiden Möglichkeiten kann bei der Wiederholung des Verfahrens die zweite Flüssigkeit der anfänglichen zweiten Flüssigkeit entsprechen oder eine andere zweite Flüssigkeit gewählt werden. Darüber hinaus kann bei der Wiederholdung des Verfahrens ein anderer Kanal ausgewählt werden, durch den die erste Flüssigkeit gepumpt wird. Wie bereits beschrieben, können die Kanäle verschieden sein und folglich ein unterschiedliches Volumen in den
verschiedenen Kanälen verbleiben. Durch die Wahl des Kanals können verschiedene Mischverhältnisse bzw. Verdünnungsstufen erreicht werden.
Es sind hauptsächlich Oberflächeneffekte der ersten Flüssigkeit und des Kanals dafür verantwortlich, dass der Teil der ersten Flüssigkeit nach dem Pumpen im Kanal verbleibt. Als hauptsächliche Effekte sind hierbei die Oberflächenspannung der (ersten) Flüssigkeit selbst und die Grenzflächenspannung zwischen der (ersten) Flüssigkeit und die mit der (ersten) Flüssigkeit in Kontakt stehende Oberfläche des Kanals zu nennen. Die Oberflächeneffekte führen vorzugsweise zu einem Kapillareffekt der (ersten) Flüssigkeit im Kanal. Die genannten
Oberflächeneffekte sind abhängig von der Geometrie, Form und Länge des Kanals, des Materials der Oberfläche des Kanals und der Flüssigkeit selbst. Hinsichtlich der Oberflächeneffekte kann die wässrige erste Flüssigkeit mit Wasser gleichgesetzt werden, sodass sich diese leicht handhaben lassen.
Gemäß vorliegendem Aspekt ist der mindestens eine Kanal derart ausgestaltet, dass der gewünschte Teil der Flüssigkeit nach dem Pumpen aufgrund der Oberflächeneffekte im Kanal verbleibt. Bevorzugt liegt das Verhältnis zwischen dem Volumen der pumpenden Kammer, daher der Kammer aus der die erste Flüssigkeit in den Verbindungskanal gepumpt wird, und dem Volumen des Kanals in einem Bereich zwischen 1:2 und 1:10.000, besonders bevorzugt in einem Bereich zwischen 1:5 und 1:1000. Diese Verhältnisse sind besonders gut dafür geeignet, dass ein Teil der ersten Flüssigkeit im Kanal verbleibt. Das Volumen der Pumpkammer liegt bevorzugt in einem Bereich zwischen 1 pl und 500 pl, besonders bevorzugt in einem Bereich zwischen 10 mI und 50 mI. Diese Volumina der Pumpkammern sind für typische Untersuchungen, beispielsweise in der Molekulardiagnostik, besonders gut geeignet.
Wie bereits beschrieben wird der Teil der ersten Flüssigkeit, der im Kanal verblieben ist, ermittelt. Hierfür kann einerseits das Volumen des Kanals aus der bekannten Geometrie, Form und Länge des Kanals berechnet werden und daraus auf das Volumen des im Kanal verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit geschlossen werden. Im Falle einer vollständigen Befüllung des Kanals mit der ersten Flüssigkeit entspricht das Volumen des im Kanal verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit gerade dem Volumen des Kanals. Das Volumen des Kanals ist meist bekannt, beispielsweise bei der Herstellung vorgegeben oder durch Messung ermittelt, weswegen in diesem Fall das Volumen des Kanals und das Volumen des Teils der ersten Flüssigkeit, der im Kanal verblieben ist,
gleichgesetzt werden. Alternativ kann eine Kamera mitsamt Auswerteeinheit verwendet werden, um unter Berücksichtigung der Geometrie, Form und Länge des Kanals das Volumen des im Kanal verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit zu ermitteln, wobei hierfür der Befüllungsgrad ermittelt werden kann. Zudem kann mit Hilfe der vorstehend beschrieben Kamera mitsamt der Auswerteeinheit die Verdünnungsstufe der Flüssigkeit ermittelt werden. Die ermittelten Daten, daher das Volumen und/oder die Masse des Teils der ersten Flüssigkeit, können verwendet werden, um das Erreichen eines gewünschten Mischverhältnis und/oder einer gewünschten Verdünnungsstufe zu überwachen. Alternativ oder zusätzlich können die ermittelten Daten verwendet werden, um das Volumen der zweiten Flüssigkeit zu ermitteln, das benötigt wird, um die gewünschte
Verdünnung, Mischung und/oder Aliquotierung zu erreichen.
Gemäß einem Aspekt werden die Kammern entleert, nachdem die pumpende Kammer die erste Flüssigkeit in die andere Kammer gepumpt hat. Dabei ist vorgesehen, dass die erste Flüssigkeit auch nachdem die Kammern entleert wurden, in dem zumindest einen Kanal verbleibt. Im Anschluss kann die zweite Flüssigkeit durch die nun entleerten Kammern in das mikrofluidische System eingebracht werden. Dadurch lässt sich die Mischung bzw. das Verdünnen der ersten Flüssigkeit mit der zweiten Flüssigkeit besonders einfach realisieren. Nach dem Entleeren ist lediglich die im Kanal verbliebene erste Flüssigkeit, deren Volumen bekannt ist, im mikrofluidischen System vorhanden. Mit anderen Worten kann sich die zweite Flüssigkeit beim Spülen lediglich mit der bekannten ersten Flüssigkeit im Kanal vermischen, da nach dem Entleeren und vor dem Spülen keine weitere Flüssigkeit im betrachteten mikrofluidischen System vorhanden ist. Es gilt hier anzumerken, dass im Zusammenhang mit einem vorstehend beschriebenen mikrofluidischen Netzwerk nicht alle Pumpkammern gleichzeitig entleert werden müssen und nichtsdestotrotz weitere Flüssigkeit im mikrofluidischen Netzwerk - auch außerhalb der Kanäle, insbesondere auch in den Kammern - vorhanden sein kann.
Das Computerprogramm ist eingerichtet, jeden Schritt des Verfahrens durchzuführen, insbesondere, wenn es auf einem Rechengerät oder Steuergerät durchgeführt wird. Es ermöglicht die Implementierung des Verfahrens in einem herkömmlichen elektronischen Steuergerät, ohne hieran bauliche Veränderungen vornehmen zu müssen. Hierzu ist es auf dem maschinenlesbaren
Speichermedium gespeichert.
Durch Aufspielen des Computerprogramms auf ein herkömmliches
elektronisches Steuergerät zum Steuern der mikrofluidischen Systems, wird das elektronische Steuergerät erhalten, welches eingerichtet ist, unter Verwendung des mikrofluidischen Systems die zwei Flüssigkeiten zu verdünnen, zu mischen und/oder zu aliquotieren.
Das elektronische Steuergerät kann Teil eines Lab-on-Chip, auch Chiplabor genannt, das das vorstehend beschriebene mikrofluidische System umfasst, sein. Das Lab-on-Chip weist außerdem Komponenten zur Steuerung des Fluidflusses, Komponenten zur Ausführung von Laborprozessen und
Komponenten zur Auswertung in einer kompakten Bauweise auf. Durch diese integrierte Bauweise kann eine Probelösung vollständig im Lab-on-Chip untersucht werden. Optional kann das Lab-on-Chip eine Kamera, welche den zumindest einen Kanal erfasst, und eine Auswerteeinheit, welche Signale der Kamera auswertet, aufweisen. Die Kamera erfasst die Flüssigkeit im Kanal und nimmt beispielsweise die Fluoreszenz und/oder die Trübung der Flüssigkeit auf und leitet ihre Signale an die Auswerteeinheit weiter. Die Auswerteeinheit ermittelt aus den Kamerasignalen, d. h. beispielsweise aus der Fluoreszenz und/oder der Trübung die Verdünnungsstufe der Flüssigkeit. Dadurch kann das Erreichen des gewünschten Mischverhältnisses und/oder der gewünschten Verdünnungsstufe überwacht werden. Durch die Überwachung der
Verdünnungsstufe ist ein Rückkopplungssystem (Feedbacksystem) gegeben, über das die Mischung bzw. Verdünnung der Flüssigkeit(en) gesteuert bzw. geregelt werden kann. Daneben kann die Auswerteeinheit auch das Volumen des im Kanal verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit ermitteln.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Zeichnungen dargestellt und in der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
Figuren 1 a-d zeigen schematische Darstellungen einer ersten Ausführungsform der Erfindung.
Figuren 2 a-f zeigen schematische Darstellungen einer zweiten Ausführungsform der Erfindung.
Figuren 3 a-i zeigen schematische Darstellungen einer dritten Ausführungsform der Erfindung. Figuren 4 a-g zeigen schematische Darstellungen einer vierten Ausführungsform der Erfindung.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Lab-on-Chips auf dem eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ablaufen kann.
Ausführungsbeispiele der Erfindung
Die Figuren 1 a-d zeigen schematische Darstellungen eines mikrofluidischen Systems. Nachfolgend wird das Grundkonzept des mikrofluidischen Systems erläutert, welches als eigenständiges Modul für den Einsatz in einem
mikrofluidischen Netzwerk angesehen werden kann. Die Teilfiguren 1 a-c stellen jeweils einen Schritt einer ersten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Das mikrofluidische System weist eine erste Pumpkammer 1 und eine zweite Pumpkammer 2 auf, die in diesem Ausführungsbeispiel beide gleich aufgebaut sind und jeweils eine nicht gezeigte Membran aufweisen, welche beim Pumpen ausgelenkt wird und eine Flüssigkeit aus der jeweiligen Kammer verdrängt. In weiteren Ausführungsbeispielen können sich die erste
Pumpkammer 1 und die zweite Pumpkammer in Aufbau, Funktion, Volumen und den umfassten Komponenten unterscheiden. Die beiden Kammern 1 , 2 sind über einen mikrofluidischen Kanal 3 miteinander verbunden, wobei der mikrofluidische Kanal 3 einen Auslass 11 der ersten Kammer 1 mit einem Einlass 20 der zweiten Kammer 2 verbindet. Das Volumen der Pumpkammern 1 , 2 beträgt
beispielsweise 30 pl und das Verhältnis zwischen dem Volumen der
Pumpkammern 1 , 2 und dem Volumen des Kanals beträgt 1 :100. In Figur 1 a wurde die erste Kammer 1 über ihren Einlass 10 mit einer ersten Flüssigkeit Fi gefüllt, die ein zu untersuchendes Analyt aufweist und auf Wasser basiert. Die zweite Kammer 2 und der Kanal 3 sind mit einer zweiten Flüssigkeit F2 gefüllt.
In Figur 1 b wird die Membran der ersten Kammer 1 ausgelenkt und dadurch die erste Flüssigkeit Fi durch den Kanal 3 in die zweite Kammer 2 gepumpt und dabei die zweite Flüssigkeit F2 aus der zweiten Kammer 2 und dem Kanal 3 verdrängt. Der Kanal 3 ist derart ausgestaltet, dass zumindest ein Teil der ersten Flüssigkeit Fi nach dem Pumpen im Kanal 3 verbleibt. Dabei wirken vor allem Oberflächeneffekte, wie z. B. die Oberflächenspannung der ersten Flüssigkeit Fi selbst und die Grenzflächenspannung zwischen der ersten Flüssigkeit Fi und der mit der ersten Flüssigkeit Fi in Kontakt stehenden Oberfläche des Kanals 3, auf die erste Flüssigkeit Fi und führen zu einem Kapillareffekt der ersten Flüssigkeit Fi im Kanal 3, wodurch diese im Kanal 3 zurückgehalten wird. Die genannten Oberflächeneffekte sind abhängig von der Geometrie, Form und Länge des Kanals 3, des Materials der Oberfläche des Kanals 3 und der Flüssigkeit Fi selbst. In diesem Ausführungsbeispiel ist der Kanal 3 nach dem Pumpen vollständig mit der ersten Flüssigkeit Fi gefüllt.
In Figur lc wird die zweite Kammer 2 über ihren Auslass 21 entleert, wobei die erste Flüssigkeit Fi aufgrund der Ausgestaltung des Kanals 3 und der wirkenden Oberflächeneffekte auch nach dem Entleeren weiterhin im Kanal 3 verbleibt. Anschließend wird eine zweite Flüssigkeit F2, mit der die erste Flüssigkeit Fi gemischt bzw. verdünnt werden soll, über den Einlass 10 der ersten Kammer 1 in das mikrofluidische System eingebracht und durch den Kanal 3 gespült. In Figur ld mischen sich die erste Flüssigkeit Fi und die zweite Flüssigkeit F2 zu einer ersten Mischung Mi und die erste Flüssigkeit Fi wird mit der zweiten Flüssigkeit F2 verdünnt. Da die Geometrie, Form und Länge des Kanals 3 bekannt ist und dieser vollständig mit der ersten Flüssigkeit Fi gefüllt war, lässt sich daraus das Volumen der ersten Flüssigkeit ermitteln, sodass das Mischungsverhältnis bzw. die Verdünnungsstufe kontrolliert werden kann. Zudem ist eine die Aliquotierung d. h. eine anteilsmäßige Ermittlung der ersten Flüssigkeit Fi bzw. des Analyts, vorgesehen.
In den Figuren 1 - 4 wird aus Gründen der Übersicht auf die Darstellung von Ventilen zur Steuerung des Flüssigkeitsflusses verzichtet. Im Folgenden sind gleiche Komponenten mit gleichen Bezugszeichen gekennzeichnet, sodass auf deren erneute Beschreibung verzichtet wird. Die Bezeichnungen„erste Kammer“ und„zweite Kammer“ beziehen sich dabei auf ihre Befüllung mit einer ersten Flüssigkeit Fi und bzw. einer zweiten Flüssigkeit F2. Innerhalb der Teilfiguren sind zur besseren Übersicht Bezugszeichen von festen Komponenten nur bei den jeweiligen Teilfiguren a eingetragen und können auf die weiteren Teilfiguren übertragen werden.
Die Figuren 2 a-f zeigen schematische Darstellungen eines mikrofluidischen Systems, bei dem der Auslass 11 der ersten Kammer 1 und der Auslass 21 der zweiten Kammer 2 über einen mikrofluidischen Kanal 3 verbunden sind und der Einlass 10 der ersten Kammer 1 und der Einlass 20 der zweiten Kammer 2 über einen weiteren mikrofluidischen Kanal 3‘, der in Analogie zum mikrofluidischen Kanal 3 ausgebildet ist, verbunden sind, sodass das mikrofluidische System einen geschlossenen mikrofluidischen Kreislauf bildet. Der Kanal 3 ist mit einem gemeinsamen Auslass 30 verbunden. Über die Einlässe 10, 20 und den gemeinsamen Auslass 30 kann das vorstehend beschriebene Modul in ein mikrofluidisches Netzwerk eingebunden werden. Die Kammern 1, 2, Einlässe 10, 20 und der gemeinsame Auslass 30 können einzeln angesteuert werden.
Die Teilfiguren 2 a-f stellen jeweils einen Schritt einer zweiten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. In Figur 2a ist die erste Kammer 1 mit einer ersten Flüssigkeit Fi gefüllt und in der zweiten Kammer 2 wird eine zweite Flüssigkeit F2 vorgehalten. In Figur 2b wird die erste Flüssigkeit Fi aus der ersten Kammer 1 heraus in den Kanal 3‘ und durch den Auslass 30 hinaus gepumpt. Dabei bleibt wie vorstehend beschrieben ein Teil der ersten Flüssigkeit Fi im Kanal 3 zurück. In Figur 2c werden die beiden Kammern 1, 2 unter Pumpen abwechselnd geöffnet und geschlossen, sodass sich die zweite Flüssigkeit F2 durch die Kanäle 3, 3‘ im geschlossenen Kreislauf bewegt und sich mit der ersten Flüssigkeit Fi, die im Kanal 3 verblieben ist, vermischt. Dieser Vorgang wird als zyklisches Mischen bezeichnet. Nach einer definierten Zyklenanzahl sind die beiden Flüssigkeiten Fi und F2, wie in Figur 2d gezeigt, vollständig zu einer Mischung Mi mit einem definierten Mischungsverhältnis vermischt und die Kammern 1, 2 werden geschlossen. Die Mischung Mi kann nun zu weiteren Untersuchungszwecken verwendet werden. In den Figuren 2e und 2f wird gezeigt, wie eine weitere Mischung M2 mit einem anderen Mischungsverhältnis aus der Mischung Mi erzeugt wird. Ähnlich zu der ersten Flüssigkeit Fi verbleibt auch ein Teil der ersten Mischung Mi in den Kanälen 3, 3‘. Die zweite Kammer 2 wird über den Einlass 20 wieder mit der zweiten Flüssigkeit F2 befüllt. In anderen Ausführungsbeispielen kann, abhängig vom gewünschten Mischungsverhältnis, stattdessen die erste Kammer 1 mit der zweiten Flüssigkeit F2 befüllt werden oder entweder die erste Kammer 1 oder die zweite Kammer 2 mit der ersten Flüssigkeit Fi befüllt werden. Anschließend erfolgt wiederum die zyklische Mischung der zweiten Flüssigkeit F2 mit der ersten Mischung Mi, die nach einer definierten Zyklenanzahl in Figur 2f vollständig zur zweiten Mischung M2 vermischt wurden. Die Figuren 3 a-i zeigen schematische Darstellungen eines mikrofluidischen Netzwerks, mit dem sich Verdünnungsreihen mit unterschiedlichen
Verdünnungsstufen und Mischverhältnissen realisieren lassen. Der Auslass der ersten Kammer 1 ist über den mikrofluidischen Kanal 3 gleichzeitig mit dem Einlass 20 der zweiten Kammer 2 und einem Einlass 40 einer dritten Kammer 4 verbunden. Der Auslass 21 der zweiten Kammer 2 ist über einen weiteren mikrofluidischen Kanal 3‘, der in Analogie zum mikrofluidischen Kanal 3 ausgebildet ist, mit einem Auslass 41 der dritten Kammer 4 verbunden. Der weitere Kanal 3‘ weist einen gemeinsamen Auslass 30 auf, der sich mehrmals verzweigt und so ein Netzwerk bildet. Jede Verzweigung des gemeinsamen Auslasses 30 sowie die Kammern 1, 2, 4 können mittels den eingangs beschriebenen Ventilen einzeln angesteuert werden. An der mit Bezugszeichen 31 gekennzeichneten Stelle des gemeinsamen Auslasses 30 ist ein nicht näher dargestellter Bypass angeordnet. Über diesen Bypass kann zumindest der gemeinsame Auslass 30 ausgespült werden.
Die Teilfiguren 3 a-i stellen jeweils einen Schritt einer dritten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. In Figur 3a ist die erste Kammer 1 mit der ersten Flüssigkeit Fi befüllt, die in Figur lb durch den Kanal 3 in die dritte Kammer 4 gepumpt wird, wobei ein Teil der ersten Flüssigkeit Fi im Kanal verbleibt. Die Kammer 1 wird mit der zweiten Flüssigkeit F2 befüllt und diese anschließend, wie in Figur 3c gezeigt, in die zweite Kammer 2 gepumpt, wobei auch hier ein Teil der zweiten Flüssigkeit F2 im Kanal verbleibt. In Figur 3d erfolgt ein zyklisches Mischen der zweiten Flüssigkeit F2 mit der ersten Flüssigkeit Fi, wie bereits in Zusammenhang mit Figur 2c erläutert, wodurch eine erste
Mischung Mi mit einem definierten Mischverhältnis und einer definierten
Verdünnungsstufe erhalten wird. Die erste Mischung Mi wird, wie in Figur 3e gezeigt, durch den Auslass 30 in eine der Verzweigungen abgeleitet und kann dann weiterverwendet werden. Anschließend wird der gemeinsame Auslass 30 über den oben genannten Bypass gespült, sodass die erste Mischung Mi bis auf einen vernachlässigbar kleinen Teil aus dem gemeinsamen Auslass 30 entfernt wird. In Figur 3f sind mehrere Schritte zusammengefasst. Es verbleibt dabei ein Teil der ersten Mischung Mi im Kanal 3‘, der dann in die zweite Kammer 2 gepumpt wird. Zudem wird die erste Kammer 1 in Analogie zu Figur 3a erneut mit der ersten Flüssigkeit Fi gefüllt und die erste Flüssigkeit Fi dann in Analogie zu Figur 3b erneut in die dritte Kammer 4 gepumpt. Abhängig vom gewünschten Mischungsverhältnis und der Verdünnungsstufe kann in weiteren
Ausführungsbeispielen stattdessen die zweite Flüssigkeit F2 verwendet werden. In Figur 3g erfolgt erneut ein zyklisches Mischen der ersten Mischung Mi mit der ersten Flüssigkeit Fi, um eine zweite Mischung M2 zu erhalten. Diese zweite Mischung M2 wird dann wie in Figur 3h gezeigt durch den Auslass 30 in eine weitere Verzweigung abgeleitet. Die vorstehend genannten Schritte werden wiederholt, um die in Figur 3i gezeigte Verdünnungsreihe mit acht
unterschiedlichen Mischungen Mi,... Me zu erhalten, die jeweils ein
unterschiedliches Mischungsverhältnis und unterschiedliche Verdünnungsstufen aufweisen.
Die Figuren 4 a-g zeigen schematische Darstellungen eines mikrofluidischen Systems zur Durchführung einer Nested-PCR (verschachtelten Polymerase- Kettenreaktion). Dabei soll ein Prä-Amplifikat auf zwei verschiedene
Reaktionsstränge aufgeteilt werden und Primer der Prä-Amplifikation so stark verdünnt werden, dass diese in einer zweiten PCR nicht mehr aktiv sind. Der bereits beschriebenen ersten Kammer 1 und zweiten Kammer 2 sind jeweils eine weitere Kammer 5, 6 zugeordnet, in denen Lyophilisate L, auch Lyobeads genannt, vorhanden sind. Die Kammern 1, 2, 5, 6 sind über mikrofluidische Kanäle 3 untereinander verbunden. Dabei bilden die erste Kammer 1 und die zweite Kammer 2 zusammen einen Kreislauf. Des Weiteren bilden die erste Kammer 1 mit ihrer zugehörigen Kammer 5 sowie die zweite Kammer 2 mit ihrer zugehörigen Kammer 6 jeweils einen Unterkreislauf. Um ein sogenanntes Shuttle-PCR zu realisieren können der ersten Kammer 1 und der zweiten Kammer 2 in weiteren Ausführungsbeispielen nicht gezeigte weitere Kammern zugeordnet sein, sodass jeweils drei Kammern eine Einheit bilden.
Die Teilfiguren 4 a-g stellen jeweils einen Schritt einer vierten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens dar. Zu Beginn wird in Figur 4a die erste Kammer 1 beispielsweise mit dem Reaktionsprodukt einer Prä-Amplifikation als erster Flüssigkeit Fi befüllt. Die erste Flüssigkeit Fi wird dann in Figur 4b durch den Kreislauf zwischen der ersten Kammer 1 und der zweiten Kammer 2 gepumpt. Dabei verbleibt ein Teil der ersten Flüssigkeit Fi im Kanal 3.
Anschließend wird das mikrofluidische System mit einer wässrigen zweiten Flüssigkeit F2, wie in Figur 4c dargestellt, gespült. Die erste Flüssigkeit Fi, d. h. das Prä-Amplifikat, und die zweite Flüssigkeit F2, d. h. der Puffer, werden dann, wie in Figur 4d gezeigt, durch Kreispumpen der ersten Kammer 1 und der zweiten Kammer 2 vermischt, sodass eine Mischung Mi entsteht. Die
Verdünnungsstufe kann durch Wiederholen der Schritte, wie in Zusammenhang mit Figur 3 beschrieben, eingestellt werden. Wurde die gewünschte
Verdünnungsstufe erreicht, wird die Mischung Mi in die Kammern 5 und 6 gepumpt - siehe Figur 4e. Durch Pumpen der Mischung Mi im Unterkreislauf zwischen der ersten Kammer 1 und der zugehörigen Kammer 5 sowie im
Unterkreislauf zwischen der zweiten Kammer 2 und der zugehörigen Kammer 6 werden die darin befindlichen Lyophilisate L in der Mischung Mi gelöst - siehe Figur 4f. Das erhaltene Mischprodukt wird dann, wie in Figur 4g gezeigt, in die erste Kammer 1 sowie in die zweite Kammer gepumpt. Anschließend wird die zweite, spezifische PCR gestartet.
Figur 5 zeigt eine schematische Darstellung eines Lab-on-Chips mit einem Feedbacksystem (Rückkopplungssystem) auf dem eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ablaufen kann. Das mikrofluidische System S wird von einer Kamera 7 erfasst, welche die Fluoreszenz und/oder die Trübung der Flüssigkeit aufnimmt. Zudem ist eine Auswerteeinheit 8 vorgesehen, welche die Kamerasignale erhält. Die Auswerteeinheit 8 ermittelt aus den
Kamerasignalen algorithmisch die Verdünnungsstufe und/der das
Mischverhältnis der Flüssigkeiten Fi, F2. Die vorstehend beschriebenen Schritte zur Änderung der Verdünnungsstufe werden solange wiederholt, bis die gewünschte Verdünnung bzw. das gewünschte Mischverhältnis erreicht wurde und von der Auswerteeinheit 8 erkannt wurde. Dann gibt die Auswerteeinheit 7 ein Freigabesignal an eine pneumatische Kontrolleinheit 9 weiter, die das mikrofluidische System S steuert und weiterführende Schritte einleitet, wie z. B. das Weiterleiten der erhaltenen Mischung. Darüber hinaus ermittelt die
Auswerteeinheit 8 das für die gewünschte Verdünnung, Mischung und/oder Aliquotierung benötige Volumen der zweiten Flüssigkeit F2. Zum einen kann die Auswerteeinheit 8 die Verdünnungsstufe mit vorher kalibrierten
Verdünnungsstufen vergleichen. Zum zweiten kann die Auswerteeinheit 8 während der Untersuchung kalibriert werden. Das Volumen des im Kanal 3 verbliebenen Teils der ersten Flüssigkeit Fi wird aus der Geometrie, der Form und der Länge des Kanals 3 ermittelt und das Volumen der zweiten Flüssigkeit F2 entweder extern gemessen oder ebenfalls über den im Kanal 3 verbliebenen Teil ermitelt. Die Auswerteeinheit 8 berechnet aus den beiden Volumina der beiden Flüssigkeiten Fi und F2 die Verdünnungsstufe bzw. das Mischverhältnis und bringt sie mit den Kamerasignalen in Verbindung. Zum driten kann eine
Referenzflüssigkeit mit bekannter Verdünnungsstufe bzw. Mischverhältnis in die zweite Kammer 2 eingefüllt werden. Dann vergleicht die Auswerteeinheit 8 die
Mischung der beiden Flüssigkeiten Fi und F2 mit der Referenzflüssigkeit. Darüber hinaus kann die Auswerteeinheit 8 die Verdünnungsstufen bzw. die
Mischverhältnisse aufzeichnen, welche dann in einen Analysealgorithmus eines entsprechenden Assays einfließen können.

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Verdünnen, Mischen und/oder Aliquotieren von zwei Flüssigkeiten (Fi, F2) unter Verwendung eines mikrofluidischen Systems (S), umfassend zumindest zwei Pumpkammern (1, 2), die durch mindestens einen mikrofluidischen Kanal (3) miteinander verbunden sind, wobei der mindestens eine Kanal (3) derart ausgestaltet ist, dass zumindest ein Teil der ersten Flüssigkeit (Fi) nach dem Pumpen im Kanal (3) verbleibt, gekennzeichnet, durch folgende Schritte:
Füllen zumindest einer der Pumpkammern (1) mit einer ersten Flüssigkeit (Fi);
Pumpen der ersten Flüssigkeit (Fi) durch den Kanal (3), wobei ein Teil der ersten Flüssigkeit (Fi) im Kanal (3) verbleibt;
Ermitteln des Teils der ersten Flüssigkeit (Fi), der im Kanal (3) verbleibt;
Durchspülen des Kanals (3) mit einer zweiten Flüssigkeit (F2).
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der ersten Flüssigkeit (Fi), der im Kanal (3) verblieben ist, ermittelt wird, um das Erreichen eines gewünschten Mischverhältnis und/oder einer gewünschten Verdünnungsstufe zu überwachen
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der ersten Flüssigkeit (Fi), der im Kanal (3) verblieben ist, ermittelt wird, um das für die gewünschte Verdünnung, Mischung und/oder Aliquotierung benötige Volumen der zweiten Flüssigkeit (F2) zu ermitteln.
4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Teil der ersten Flüssigkeit (Fi), der im Kanal (3) verbleibt, anhand des Volumens des Kanals ermittelt wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Teil der ersten Flüssigkeit (Fi), der im Kanal (3) verbleibt, mittels Signalen einer Kamera, die den Kanal (3) erfasst, ermittelt wird.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass der Kanal (3) nach dem Pumpen vollständig mit der ersten Flüssigkeit (Fi) gefüllt ist.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, dass die Kammern (1, 2) entleert werden, bevor der Kanal (3) mit der zweiten Flüssigkeit (F2) durchspült wird, wobei die erste Flüssigkeit (Fi) auch nachdem die Kammern (1, 2) entleert wurden, im Kanal (3) verbleibt.
8. Computerprogramm, welches eingerichtet ist, jeden Schritt des
Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 durchzuführen.
9. Maschinenlesbares Speichermedium, auf welchem ein
Computerprogramm nach Anspruch 8 gespeichert ist.
10. Elektronisches Steuergerät, welches eingerichtet ist, um unter
Verwendung eines mikrofluidischen Systems mittels eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zwei Flüssigkeiten (Fi, F2) zu verdünnen, zu mischen und/oder zu aliquotieren.
EP19717285.1A 2018-04-26 2019-04-09 Verdünnen, mischen und/oder aliquotieren von zwei flüssigkeiten in einem mikrofluidisches system Withdrawn EP3784375A1 (de)

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