EP3743377A1 - Encapsulation de substances actives et/ou de microorganismes dans un materiau lamellaire - Google Patents

Encapsulation de substances actives et/ou de microorganismes dans un materiau lamellaire

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EP3743377A1
EP3743377A1 EP19709998.9A EP19709998A EP3743377A1 EP 3743377 A1 EP3743377 A1 EP 3743377A1 EP 19709998 A EP19709998 A EP 19709998A EP 3743377 A1 EP3743377 A1 EP 3743377A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
compound
advantageously
group
microorganism
encapsulated
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP19709998.9A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Sylvain K. PLUCHON
Jean-Claude Yvin
Jocelyne Brendle
Lionel Limousy
Patrick DUTOURNIE
Anne MAILLARD
Marion BRUNEAU
Simona BENNICI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Haute Alsace
Agro Innovation International SAS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite de Haute Alsace
Agro Innovation International SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite de Haute Alsace, Agro Innovation International SAS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3743377A1 publication Critical patent/EP3743377A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C01—INORGANIC CHEMISTRY
    • C01B—NON-METALLIC ELEMENTS; COMPOUNDS THEREOF; METALLOIDS OR COMPOUNDS THEREOF NOT COVERED BY SUBCLASS C01C
    • C01B33/00—Silicon; Compounds thereof
    • C01B33/20—Silicates
    • C01B33/22—Magnesium silicates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G5/00—Fertilisers characterised by their form
    • C05G5/30—Layered or coated, e.g. dust-preventing coatings
    • C05G5/35—Capsules, e.g. core-shell
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05D—INORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C; FERTILISERS PRODUCING CARBON DIOXIDE
    • C05D9/00—Other inorganic fertilisers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05D—INORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C; FERTILISERS PRODUCING CARBON DIOXIDE
    • C05D9/00—Other inorganic fertilisers
    • C05D9/02—Other inorganic fertilisers containing trace elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/08—Organic fertilisers containing added bacterial cultures, mycelia or the like
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05F—ORGANIC FERTILISERS NOT COVERED BY SUBCLASSES C05B, C05C, e.g. FERTILISERS FROM WASTE OR REFUSE
    • C05F11/00—Other organic fertilisers
    • C05F11/10—Fertilisers containing plant vitamins or hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/60—Biocides or preservatives, e.g. disinfectants, pesticides or herbicides; Pest repellants or attractants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C05—FERTILISERS; MANUFACTURE THEREOF
    • C05G—MIXTURES OF FERTILISERS COVERED INDIVIDUALLY BY DIFFERENT SUBCLASSES OF CLASS C05; MIXTURES OF ONE OR MORE FERTILISERS WITH MATERIALS NOT HAVING A SPECIFIC FERTILISING ACTIVITY, e.g. PESTICIDES, SOIL-CONDITIONERS, WETTING AGENTS; FERTILISERS CHARACTERISED BY THEIR FORM
    • C05G3/00—Mixtures of one or more fertilisers with additives not having a specially fertilising activity
    • C05G3/80—Soil conditioners

Definitions

  • the present invention relates to the encapsulation in lamellar materials of active substances and / or microorganisms for the growth or treatment of plants.
  • the inventors have surprisingly discovered that it is possible to encapsulate such microorganisms and / or active substances in talc or saponite-type synthetic clay during the synthesis of these clays. that is to say in one step, while maintaining the activity of the active substances and microorganisms.
  • the present invention therefore relates to a method of encapsulation of a compound selected from the group consisting of at least one active substance, at least one microorganism and their mixtures in an organic-inorganic hybrid material of lamellar structure of type 2: 1, said material having the following general formula I:
  • x is a number such that 0 ⁇ x ⁇ 1, 2 and R represents a C 1 -C 30 alkyl group, an aryl group, a C 1 -C 3 alkyl aryl group or an O-C 1 -C 30 alkyl group; the alkyl group may be substituted by a group selected from a phenyl, vinyl, aminopropyl or mercaptopropyl group,
  • the present invention thus relates to a method of encapsulation in an organic-inorganic hybrid material of lamellar structure of type 2: 1, said material having the following general formula I:
  • x is a number such that 0 ⁇ x ⁇ 1, 2 and
  • R is alkyl Cl-C30 / preferably n-hexadecyl group or a methyl group, especially a n-hexadecyl; an aryl group, advantageously a phenyl group; a (C 1 -C 3 ) alkyl aryl group, advantageously an ethylphenyl group; or a C 1 -C 3 O-alkyl group, advantageously an ethoxy group; the alkyl group may be substituted with a group selected from phenyl, vinyl, aminopropyl or mercaptopropyl.
  • C 1 -C 30 alkyl group means any linear or branched saturated alkyl group having from 1 to 30 carbon atoms, such as the methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-butyl group.
  • it is methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or n-hexadecyl, even more preferably methyl, ethyl, or n-hexadecyl, more particularly the ethyl or n-hexadecyl group.
  • aryl group in the sense of the present invention one or more aromatic rings having 5 to 20 carbon atoms, which can be contiguous or fused.
  • the aryl groups can be monocyclic, bicyclic or polycyclic groups.
  • it is phenyl, bi-phenyl, naphthyl, anthracenyl, phenanthrenyl, tetracenyl, chrysenyl, triphenylenyl, pyrenyl, benzofluorenyl, benzopyrenyl.
  • it is a phenyl group.
  • the source of silicon necessary for the synthesis of the material of formula I is advantageously an organoalkoxysilane or a mixture of organoalkoxysilanes of the following general formula II: RSi (OR 3 (II) in which
  • R is as defined above and
  • R ' is a methoxy or ethoxy group.
  • the silicon source is chosen from the group consisting of:
  • PhenylTMS phenyltrimethoxysilane
  • TEOS tetraethylorthosilicate or tetraethylsilane
  • MTES methyltriethoxysilane
  • methyltriethoxysilane methyltriethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, tetraethylorthosilicate, hexadecyltrimethoxysilane, triethoxyphenylsilane and their mixtures, more particularly in the group consisting of phenyltrimethoxysilane, tetraethylorthosilicate, triethoxyphenylsilane and hexadecyltrimethoxysilane, and mixtures thereof.
  • phenyltrimethoxysilane tetraethylorthosilicate, hexadecyltrimethoxysilane and mixtures thereof.
  • it may be in particular a mixture between tetraethylorthosilicate and phenyltrimethoxysilane or between tetraethylorthosilicate and hexadecyltrimethoxysilane or between triethoxyphenylsilane and hexadecyltrimethoxysilane, advantageously it is a mixture between tetraethylorthosilicate and hexadecyltrimethoxysilane or between triethoxyphenylsilane and hexadecyltrimethoxysilane, still more advantageously between tetraethylorthosilicate and hexadecyltrimethoxysilane.
  • the compound will therefore be encapsulated within the material of formula I and in particular if its size allows it (of the order of Angstrom) within the interfoliar space of the material (this is the case of tryptophan and folic acid).
  • the compound according to the invention is chosen from the group consisting of at least one active substance, at least one microorganism and their mixtures.
  • the term "active substance” is intended to mean any organic substance that is biologically active, that is to say any organic substance capable of reacting with living organisms, in particular plants, and therefore having a specific role in metabolism. for example, by acting directly on the plant, or by acting on the soil or the cultivation substrate, or by acting on pests or on the contrary on beneficial organisms.
  • This type of substance can thus allow fertilization, nutrition, growth stimulation and / or plant prophylaxis and / or the improvement of the physical, chemical and / or biological properties of the soil or the substrate for growing plants.
  • the active substance may be a molecule, but also a plant extract, an algae extract, a humic extract or any other type of extract or co-product.
  • the active substance is chosen from the group consisting of an amino acid, in particular tryptophan, a vitamin, in particular folic acid, an essential oil and mixtures thereof, more advantageously in the group consisting of an amino acid, in particular tryptophan, an essential oil and their mixtures advantageously it is tryptophan.
  • the compound according to the invention is therefore an active substance. It can also be a mixture of 2, 3 or 4 active substances, in particular of 2 or 3 active substances.
  • a single active substance is encapsulated, such as, for example, tryptophan or folic acid.
  • the source of silicon necessary for the synthesis of the material of formula I is advantageously phenyltrimethoxysilane or a mixture of organoalkoxysilanes of general formula II, advantageously a mixture of phenyltrimethoxysilane (a) and tetraethylorthosilicate (b).
  • the mixture comprises less than 80 mol% of tetraethylorthosilicate and more than 20 mol% of phenyltrimethoxysilane, more preferably less than 60 mol% of tetraethylorthosilicate and more than 40 mol% of phenyltrimethoxysilane, still more advantageously less than 50 mol%. mol% of tetraethylorthosilicate and more than 50 mol% of phenyltrimethoxysilane, relative to the total number of mol of the mixture.
  • the mixture comprises between 20 and 60 mol% of tetraethylorthosilicate and between 40 and 80 mol% of phenyltrimethoxysilane, in particular between 20 and 40 mol% of tetraethylorthosilicate and between 60 and 80 mol% of phenyltrimethoxysilane, more particularly 20 mol% of tetraethylorthosilicate and 80 mol% of phenyltrimethoxysilane, relative to the total number of mol of the mixture.
  • step a) comprises the following successive steps:
  • a source of magnesium advantageously magnesium nitrate hexahydrate, of the active substance, of the silicon source, in the case where x10, of the aluminum source, advantageously aluminum acetylacetonate, and a possible solvent;
  • the solvent of step a1) may be a polar solvent such as water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl- 5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay), propylene carbonate or mixtures thereof, advantageously water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) or their mixtures, more particularly water, alcohol (in particular ethanol or glycerol) or their mixtures.
  • a polar solvent such as water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl- 5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay), propylene carbon
  • It may be a biobased and / or biodegradable solvent such as glycerol, propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) , propylene carbonate or their mixtures, in particular glycerol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean sold by Solvay) or mixtures thereof. It can also be a mixture of alcohol and oil.
  • glycerol propylene glycol
  • methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay
  • propylene carbonate or their mixtures
  • glycerol methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate
  • the solvent of step a1) may not be present.
  • the solvent of step a1) must be present.
  • Step a3) can be carried out at a temperature between room temperature and the boiling temperature of the solvent, preferably at room temperature.
  • Step a4) may be carried out by any method well known to those skilled in the art, such as by filtration or centrifugation, in particular by centrifugation.
  • Step a5) can be carried out in an oven, for example at a temperature of 40 ° C, or by air drying or lyophilization.
  • An intermediate step a4) bis can be added between steps a4) and a5) which consists of washing the solid phase of the gel obtained in step a4) with the solvent of step a1).
  • the compound according to the invention is therefore at least one microorganism.
  • the microorganism is chosen from the group consisting of a bacterium such as Bacillus subtilis (for example accessible under the number CIP 52.62 from the Pasteur Institute), a microalga such as spirulina (for example cyanobacterium Arthrospira platensis sold under the name SPIRULINA NATURAL by the company EARTHRISE®), a fungus such as Piriformospora indica (for example accessible under the number DSM 11827 at the Max-Planck-Institut für terresthari Mikrobiologie), and their mixtures, advantageously the microorganism is in vegetative form, in encysted form or in spore form, in particular in vegetative form, more particularly it is a bacterium such as Bacillus subtilis, still more particularly in vegetative form, or a fungus such as Piriformospora indica, more particularly a bacterium such as Bacillus subtilis
  • the compound according to the invention may therefore consist of a single type of microorganism such as Bacillus subtilis bacteria. It may also consist of a mixture of 2, 3 or 4 different types of microorganisms, in particular of 2 or 3 types of microorganisms. different. In an advantageous embodiment, it consists of a single type of microorganism.
  • the source of silicon necessary for the synthesis of the material of formula I is advantageously chosen from the group consisting of methyltriethoxysilane, phenyltrimethoxysilane, triethoxyphenylsilane and hexadecyltrimethoxysilane, and their mixtures, more advantageously the phenyltrimethoxysilane, triethoxyphenylsilane, hexadecyltrimethoxysilane and mixtures thereof, more advantageously it is hexadecyltrimethoxysilane or a mixture of triethoxyphenylsilane and hexadecyltrimethoxysilane, in particular it is hexadecyltrimethoxysilane.
  • step a) comprises the following successive steps:
  • a source of magnesium advantageously magnesium nitrate hexahydrate, the microorganism, a solvent, a source silicon and in the case where x10, the aluminum source, preferably aluminum acetylacetonate;
  • the method according to the invention may further comprise the following successive steps after step a3) of:
  • step a5) drying of the solid phase of the gel obtained in step a4), advantageously by freeze-drying.
  • the solvent of step a1) may be a polar solvent such as water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl- 5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay), propylene carbonate or mixtures thereof, advantageously water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), propylene glycol, methyl-5 - (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) or their mixtures, more particularly water, alcohol (in particular ethanol or glycerol), methyl- 5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean sold by Solvay) or mixtures thereof, more particularly water, alcohol (in particular ethanol or glycerol) or their mixtures.
  • It may be a biobased and / or biodegradable solvent such as glycerol, propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) propylene carbonate or mixtures thereof, in particular glycerol, propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) or their mixtures, more particularly glycerol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5 oxopentanoate (such as RHODISOLV® Polarclean marketed by Solvay) or their mixtures. It can also be a mixture of alcohol and oil.
  • glycerol propylene glycol, methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (such as
  • the microorganism of step a1) is in the form of a preculture of said microorganism, advantageously having a microorganism content of between 10 3 and 10 10.
  • ufc / ml in particular between 10 6 and 10 9 cfu / ml, advantageously 10 8 cfu / ml.
  • the method according to the invention may also comprise a preliminary step prior to step a) of preparing the microorganism preculture.
  • This step can be carried out by methods that are well known to those skilled in the art. It includes in particular the seeding of the microorganism in a nutrient medium and the incubation for a period sufficient to obtain the desired microorganism concentration.
  • Step a3) can be carried out at room temperature.
  • Step a4) may be carried out by any method well known to those skilled in the art, such as by filtration or centrifugation, in particular by centrifugation.
  • An intermediate step a4) bis can be added between steps a4) and a5) which consists of washing the solid phase of the gel obtained in step a4) with the solvent of step a1).
  • step a4) ter can also be added between steps a4) or a4) bis and a5) which consists in the freezing of the solid phase of the gel obtained in step a4) or step a4) bis, if the latter is implemented.
  • Step a5) can be carried out in an oven, for example at a temperature of 40 ° C, or by air drying or lyophilization, Advantageously it is carried out by lyophilization.
  • the process according to the invention can be implemented in a bio-reactor.
  • the present invention further relates to a compound encapsulated in an organic-inorganic hybrid material of lamellar structure type 2: 1, said material having the general formula I as described above, the encapsulated compound being selected from the group consisting of at least one active substance, at least one microorganism and mixtures thereof.
  • the material, the active substance and the microorganism are as described above.
  • the encapsulated compound is obtainable, in particular obtained, by the process according to the invention as described above.
  • the encapsulation rate is advantageously at least 20 mg of compound / g of material, more preferably at least 30 mg of compound / g of material, more advantageously at least 40 mg of compound / g of material, in particular at least 50 mg compound / g material, more particularly at least 60 mg compound / g material, more particularly at least 65 mg compound / g material.
  • the encapsulated microorganism can be revived by methods well known to those skilled in the art, such as for example by seeding on solid nutrient medium (petri dish) or liquid (bioreactor).
  • petri dish solid nutrient medium
  • bioreactor liquid
  • the encapsulated compound can be stored between 0 and 12 months at a temperature between 4 ° C and room temperature.
  • the compound When the compound is a microorganism or comprises a microorganism, it must be stored at a temperature of 4 ° C.
  • the present invention furthermore relates to a composition, in particular a phytopharmaceutical composition, advantageously intended for fertilization, nutrition, growth stimulation and / or plant prophylaxis and / or the improvement of the physical, chemical and / or biological properties of the plant.
  • soil or plant culture substrate comprising the compound encapsulated in a hybrid organic-inorganic material of lamellar structure type 2: 1 according to the invention.
  • composition comprises any excipient suitable for administration to a plant or soil or plant culture substrate, for example by foliar application, root, field or above ground. It is in particular a phytopharmaceutically acceptable excipient.
  • phytopharmaceutically acceptable which is acceptable for use on plants or soil, that is to say non-polluting for the environment and non-toxic to humans ( users).
  • nutrients advantageously chosen from the group consisting of nitrogen, phosphorus, potassium, calcium, magnesium, silicon, trace elements and their mixtures, organic raw materials and / or mineral raw materials, pesticides, fungicides, herbicides, nematicides, hormones, humic substances, seaweed extracts , amino acids, plant extracts, salicylic acid and
  • This composition can therefore be in the form of a fertilizer or a biostimulant.
  • It can be in solid form, in particular in the form of powder, granules or microgranules, in liquid form or in gel form.
  • it may for example be in solid form of the powder type, granulated, microgranulated in fertilizers or culture media for nutrition or stimulation of plants for use in full or localized.
  • It can also be in the form of a liquid or gel of fertilizers or biostimulants for use in foliar or root application.
  • It can also be in the form of a water-soluble fertilizer for use in fertigation field or above ground.
  • It can also be in a solid or liquid form of amendment for the improvement of the physical, chemical or biological properties of the soil or the growing medium.
  • It can be a phytosanitary type composition or a biocontrol composition, PNPP (natural preparations of low concern), SDN (stimulation of natural defenses), SDP (stimulation of plant defenses), in the case of plant prophylaxis .
  • PNPP natural preparations of low concern
  • SDN stimulation of natural defenses
  • SDP stimulation of plant defenses
  • compositions according to the invention can therefore be used:
  • compositions may further be introduced into the water irrigation system and / or into fertilizer formulations.
  • compositions to be used depends on the nature of the plant to be treated, the nature of the encapsulated compound and the intended mode of administration.
  • compositions can be used in a single application or in sequential application.
  • the present invention finally relates to the use of the compound according to the present invention or of the composition according to the present invention for the fertilization, the nutrition, the stimulation of the growth and / or the prophylaxis of the plants and / or the improvement of the physical properties , chemical and / or biological soil or plant growth substrate, preferably cultivated plants or agronomic interest.
  • Bacillus subtilis bacterium stimulates plant growth and protects against biotic (pathogenic) and abiotic (lack of water) stresses. It makes it possible to solubilize in the water phosphate forms insoluble in the water of the phosphorus.
  • the fungus Piriformospora indica improves the ability of plants to tolerate environmental stress, stimulates plant growth and promotes the absorption of nutrients. Tryptophan is a precursor to the production of auxin, a hormone that regulates root development in particular.
  • the essential oil especially thyme is a stimulator of natural defenses.
  • Spirulina is a producer of chemical compounds with a biological activated on plants.
  • Folic acid inhibits primary root development and increased development and secondary root maturation (horizontal stretching) by redistribution of auxin (growth hormone) in primary roots.
  • FIG. 1 represents the follow-up in time (in days) of the population (in cfu / ml) of Bacillus subtils CIP 52.62 encapsulated (compound according to the invention) and not encapsulated in the presence of phosphorus under the conditions of example 3 .
  • FIG. 2 represents the evolution of the pH of the culture medium as a function of time (in days) in the presence of Bacillus subtilis Cl. 52.62 encapsulated (compound according to the invention) and not encapsulated and in the presence of phosphorus under the conditions of Example 3.
  • FIG. 3 represents the concentration difference between the solubilized phosphorus and the phosphorus immobilized by the bacterial flora as a function of time (in days) in the presence of encapsulated Bacillus subtilis CIP 52.62 (compound according to the invention) and not encapsulated under the conditions of Example 3
  • Comparative Example 1 Effect of Different Biodegradable Solvents and Ethanol on the Chemical Synthesis of Lamellar-Inorganic Oral-Inorganic Compounds
  • magnesium nitrate hexahydrate MgNu 3 , 6H 2 O
  • biodegradable solvent glycerol (Quaron> 99.5%) or propylene glycol (VWR)
  • glycerol Quaron> 99.5%
  • VWR propylene glycol
  • methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate RHODISOLV® Polarclean sold by Solvay
  • propylene carbonate Quaron> 99.7%
  • the X-ray diffractogram of the sample shows several diffraction peaks in the angular domains 2-10 ° 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-652 theta. These peaks respectively correspond to reflections on the lattice planes (001), (020; 110), (130; 220) and (060: 330), characteristic of the presence of a lamellar phase.
  • the value of the do6o periodicity is 0.156 nm, a characteristic value for a phase Lamellar organic-inorganic hybrid type talc type structure of the formula Mg 3 (RSi) 40 8 (0H) 2 wherein R is phenyl.
  • the periodicity of the invention is of the order of 1.32 nm.
  • the amount of tryptophan in the compound was determined by UV spectrophotometry at a wavelength of 280 nm.
  • the compound contains 63.4 mg of tryptophan per g of material.
  • the thermogravimetric analysis carried out under air between 30 and 800 ° C at a rate of rise in temperature of 5 ° C / min shows that the most significant loss of mass (decomposition of the products) begins only from 300 ° C, which confirms that tryptophan has been encapsulated within the material (Table 2).
  • the X-ray diffractogram of the sample shows several diffraction peaks in the angular domains 2-10 ° 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-652 theta. These peaks respectively correspond to reflections on the lattice planes (001), (020; 110), (130; 220) and (060: 330), characteristic of the presence of a lamellar phase.
  • the value of the periodicity d 0 06 is 0.156 nm, a characteristic value for an organic-inorganic hybrid lamellar phase of talc type structure of formula Mg 3 (RSi) 408 (OH) 2 in which R represents a mixture of phenyl group and O-ethyl group.
  • the periodicity is equal to 1.4 nm.
  • the amount of tryptophan in the compound was determined by UV spectrophotometry at a wavelength of 280 nm, the compound comprises 68.7 mg of tryptophan per g of material.
  • thermogravimetric analysis carried out under air between 30 and 800 ° C at a rate of rise in temperature of 5 ° C / min shows that the most significant loss of mass (decomposition of the products) begins only from 300 ° C, which confirms that tryptophan has been encapsulated within the material (Table 3).
  • MTES compounds TRYPTO, CI 6 TMS TRYPTO, TEOS TRYPTO, 20PH-80TEOS TRYPTO, 40Ph-60TEOS TRYPTO and 60Ph-40TEOS TRYPTO
  • Phenyl TRYPTO By a method identical to that used to prepare the compound 100% Phenyl TRYPTO other compounds according to the invention were prepared by replacing phenyltrimethoxysilane as a silicon source with methyltriethoxysilane (MTES) or hexadecyltrimethoxysilane (CI 6 TMS) or tetraethylsilane (TEOS). The compounds obtained were named respectively MTES TRYPTO, CI 6 TMS TRYPTO and TEOS TRYPTO.
  • MTES methyltriethoxysilane
  • CI 6 TMS hexadecyltrimethoxysilane
  • TEOS tetraethylsilane
  • the X-ray diffractogram of the samples of each of the compounds exhibited several diffraction peaks in the angular domains 2-10 ° 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-652 theta. These peaks respectively correspond to reflections on the lattice planes (001), (020; 110), (130; 220) and (060: 330), characteristic of the presence of a lamellar phase.
  • the value of the periodicity d 0 06 is 0.156 nm, a characteristic value for an organic-inorganic hybrid lamellar phase of talc type structure of formula Mg 3 (RSi) 4 0 8 (OH) 2 .
  • the periodicity is equal to 1.4 nm.
  • tryptophan encapsulated in an organic-inorganic hybrid material of lamellar structure of type 2: 1 having the formula Mg 3 (RSi) 4 O 8 (OH) 2 is obtained.
  • the silicon source is a mixture between TEOS and PhenylTMS
  • the amount of encapsulated tryptophan is 0. % (100% Phenyl TRYPTO compound).
  • the value of the periodicity d 06 o is 0.156 nm, a characteristic value for a lamellar phase of organic-inorganic hybrid type of talc type structure.
  • the periodicities dooi are of the order of 1.4 nm. It should be noted that the intensity of the diffraction peaks decreases with the oil content in the mixture.
  • the thermogravimetric analysis carried out under air between 30 and 800 ° C at a rate of rise in temperature of 5 ° C / min shows that the most significant loss of mass (decomposition of the products) begins only from 300 ° C, which confirms that the oil has been encapsulated within the material (Table 5).
  • the solid After 24h stirring at room temperature, the solid is separated from the solution by centrifugation (speed of 10,000 rpm for 10 min). The solid is dried in an oven at 60 ° C for 24 hours. The compound obtained (2.1 g) is then milled in an agate mortar before being characterized and is noted Eth-Ph 200AF in situ.
  • the X-ray diffractogram of the sample shows several diffraction peaks in the angular domains 2-10 ° 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-65 ° 2 theta. These peaks respectively correspond to reflections on the lattice planes (001), (020; 110), (130; 220) and (060; 330), characteristic of the presence of a lamellar phase.
  • the value of the periodicity d 0 6o is 0.156 nm, a characteristic value for a lamellar phase of the organic-inorganic hybrid type of talc-type structure of formula Mg 3 (RSi) 40 8 (OH) 2 in which R represents a phenyl group .
  • the periodicity d 0 oi is of the order of 1.14 nm.
  • the amount of folic acid in the compound was determined by UV spectrophotometry at a wavelength of 280 nm, the compound comprises 108.3 mg of folic acid per g of material.
  • the thermogravimetric analysis carried out under air between 30 and 800 ° C at a rate of rise in temperature of 5 ° C / min shows that the most significant loss of mass (decomposition of the products) begins only from 300 ° C, which confirms that the folic acid has been encapsulated within the material (Table 6).
  • the solid After 24h stirring at room temperature, the solid is separated from the solution by centrifugation (speed of 10,000 rpm for 10 min). The solid is washed four times with deionized water before being dried in an oven at 60 ° C for 24 hours. The compound obtained (2.2 g) is then milled in an agate mortar before being characterized and is noted Gly-Ph 200AF in situ.
  • the X-ray diffractogram of the sample shows several diffraction peaks in the angular domains 2-10 ° 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-65 ° 2 theta. These peaks respectively correspond to reflections on the lattice planes (001), (020; 110), (130; 220) and (060; 330), characteristic of the presence of a lamellar phase.
  • the value of the periodicity do6o is 0.155 nm, a characteristic value for a lamellar phase organic-inorganic hybrid type talc type structure of the formula Mg 3 (RSi) 40 8 (0H) 2 wherein R is phenyl.
  • the periodicity d 0 oi is of the order of 1.24 nm.
  • the amount of folic acid in the compound was determined by UV spectrophotometry at a wavelength of 280 nm, the compound comprises 56.66 mg of folic acid per g of material.
  • the thermogravimetric analysis carried out under air between 30 and 800 ° C at a rate of rise in temperature of 5 ° C / min shows that the most significant loss of mass (decomposition of the products) begins only from 300 ° C, which confirms that the folic acid has been encapsulated within the material (Table 7).
  • Table 7 Result of thermogravimetric analyzes carried out under air
  • a preculture of Bacillus subtilis (accessible under the number CIP 52.62 of the Pasteur Institute) is prepared from cryotubes containing 400 ⁇ l of a suspension of Bacillus subtilis maintained at -20 ° C. in 1.6 ml of glycerol.
  • the nutrient medium in which the contents of the cryotube are incorporated is an LB broth (lysogeny broth). It is composed of 10 g of tryptone (pancreatic hydrolyzate casein type peptone), 5 g of yeast extract and 10 g of NaCl for 1 liter of demineralized water.
  • the yeast extract is obtained from yeast autolysates. This is suspended yeast biomass driven to autolysis by passage at 50 ° C for several hours, the liquid phase of which is recovered.
  • This medium is prepared directly in the Erlenmeyer flasks and then autoclaved for 20 minutes at 121 ° C. The seeding is then carried out with the flame to avoid any contamination. An enumeration in the middle solid on petri dish (90 mm diameter) is performed after 18 hours of incubation at 37 ° C to determine the initial concentration of bacteria that is added during the synthesis.
  • the synthesis is carried out in a bioreactor.
  • the first step is to clean the bioreactor with absolute ethanol.
  • the preculture is introduced into the bioreactor (at 10% of the final volume, ie 200 ml of LB medium containing the bacteria at a level of 10 3 cfu / ml).
  • 97g of magnesium nitrate (99%, Sigma Aldrich) are dissolved in one liter of absolute ethanol (99.9%, Carlo Erba).
  • 100 g of phenyltrimethoxysilane (PhenylTMS) (98%, ABCR) are then added to this solution and the whole is poured into the bioreactor.
  • Characterization of the sample by X-ray diffraction indicates the formation of an organic-inorganic type lamellar phase of talc type structure of formula Mg 3 (RSi) 4 0 8 (OH) 2 in which R represents a phenyl group (presence of the characteristic reflections of the lattice planes (001), (020, 110), (130.220) and (060)) with a periodicity d 001 equal to 1.3 nm.
  • CieTMS BS compound A preculture of Bacillus subtilis (accessible under the number CIP 52.62 of the Pasteur Institute) is prepared from cryotubes containing 400 ⁇ l of a suspension of Bacillus subtilis maintained at -20 ° C. in 1.6 ml of glycerol.
  • the nutrient medium in which the contents of the cryotube are incorporated is an LB broth (lysogeny broth) as described above. This medium is prepared directly in the Erlenmeyer flasks and then autoclaved for 20 minutes at 121 ° C. The seeding is then carried out with the flame to avoid any contamination.
  • the synthesis is carried out in a bioreactor.
  • the first step is to clean the bioreactor with absolute ethanol.
  • the preculture is introduced into the bioreactor (at 10% of the final volume, ie 200 ml of LB medium containing the bacteria).
  • 55.65 g of magnesium nitrate hexahydrate (99%, Sigma Aldrich) are dissolved in one liter of absolute ethanol (99.9%, Carlo Erba).
  • 100 g of hexadecyltrimethoxysilane ( C16 TMS) (> 85%, Sigma) are then added to this solution and the whole is poured into the bioreactor.
  • Characterization of the sample by X-ray diffraction indicates the formation of a lamellar phase of organic-inorganic type of talc type structure of formula Mg 3 (RSi) 4 0 8 (OH) 2 in which R represents a CH 3 (CH 2) 4 CH 2 ((presence of characteristic reflections of the lattice planes (001), (020, 110), (130.220 ) and (060) with a periodicity d 00i equal to 1.5 nm.
  • a petri dish (90 mm diameter) is made at 37 ° C in the dark with 60% relative humidity to determine the concentration of microorganisms at To (No), To + 24h (N 24h ) and To + 14 days (N i4j ) after synthesis.
  • the results are shown in Table 8 below.
  • Table 8 concentration of microorganisms at To (No), To + 24h (N 24h ) and To + 14 days (NMJ) after synthesis according to the solvent used for the synthesis
  • the viability of the microorganisms is maintained at least 14 days after synthesis with glycerol, propylene glycol or Polarclean as solvent. This result confirms that biodegradable solvents can be used for the encapsulation of Bacillus subtilis.
  • BaciHus subtilis culture medium (accessible under the CIP 52.62 number from the Pasteur Institute) at 6.50 ⁇ 10 7 cfu / ml (the culture medium was prepared in a 3L bioreactor by seeding BaciHus subtilized in 20 mL of BHI medium (OXOID) and incubated 18-24 h at 30 ° C, 200 rpm).
  • Table 9 concentration of microorganisms at To (N 0 ), To + 24h (N 24h ) and To + 15 days (Nisj) after synthesis according to the solvent used for the synthesis and the storage temperature.
  • Example 2.1c2 The synthesis is identical to that of Example 2.1c2 with glycerol (Quaron> 99.5%) or methyl-5- (dimethylamino) -2-methyl-5-oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean) as solvent.
  • 2 samples of 500mL of the mixture are made. In the dark, 45 samples of 9mL are taken.
  • 3 batches of 15 samples are made and respectively placed in an oven (30% relative humidity) at + 40 ° C, + 60 ° C and + 80 ° C ⁇ 2 ° C.
  • 3 batches of 15 samples of non-encapsulated microorganisms are also constituted and respectively placed in an oven (20% relative humidity) at + 60 ° C. and + 80 ° C.
  • Table 10 concentration of microorganisms to To (Name / nX To + 2min (N 2min) / To + 5min (Nsmin) and To + 10 min (N 10mi n) after heat treatment depending on the solvent used for your synthesis and ia temperature of the heat treatment.
  • the fungus Piriformospora indica (P. indica) (accessible under the number DSM 11827 from Max-Planck-Institut für Terresthari Mikrobiologie) is initially placed in an incubator (box 140 mm in diameter) for 72 hours at 28 ⁇ 1 ° C, with YCG agar to obtain a fresh culture.
  • the mycelium is collected using a sterile spatula and introduced into an Erlenmeyer flask containing 0.5% tween 80 solution and beads. After stirring for 2 minutes, an enumeration in a solid medium is carried out in order to determine the starting concentration (N0, in cfu / ml).
  • sample of reference CI 6 TMS PI For comparison, a sample is prepared under the same conditions in the absence of P. Indica.
  • X-ray diffraction analysis indicates that in both cases a lamellar phase is obtained with a periodicity of 1.53 nm for the sample CI 6 TMS PI and at 1.60 nm for the compound without P. Indica. .
  • the SEM images of the CI 6 TMS PI sample show the presence of shapes very similar to the hyphae observed with the only Hyphes mushroom (about 2 ⁇ m wide) covered with particles of material. The fungus is thus encapsulated in its vegetative form (hyphae + conidiophores) in the material of formula I according to the invention,
  • magnesium nitrate hexahydrate (MgNC, 6H 2 O) (99%, Sigma Aldrich) and 100 ml of biodegradable solvent (Glycerol (Quaron> 99.5%)) were added with stirring. at 55 ° C at 220 rpm for 15 minutes. Add with stirring for 15 minutes of 7.71 g of triethoxyphenylsilane (97%, Sigma Aldrich) and 2.29 g of hexadecyltrimethoxysilane (> 85%, Sigma).
  • Table 11 concentration of microorganisms at To (N 0 ), To + 24h (N 2 4h) and To + 14 days (Ni) after synthesis
  • a solid medium count on petri dish (90 mm in diameter) is carried out at 37 ° C to determine the concentration of mushrooms at To (N 0 ), To + 24h (N24 h ), To + 15j (Ni3 ⁇ 4) and To + 30j (N 30j ). The results are shown in Table 12 below.
  • Table 12 concentration of microorganisms at To (No), To + 24h (N 2 4h), To + 15 days (N 15 J) and To + 30j (N30j) after synthesis as a function of the storage temperature.
  • Example 2.2b2 The synthesis is identical to that of Example 2.2b2. 2 samples of 500mL of the mixture are made. In the dark, 45 samples of 9mL are taken. 3 batches of 15 samples are made and respectively placed in an oven (30% relative humidity) at + 40 ° C, + 60 ° C and + 80 ° C ⁇ 2 ° C. In addition to darkness, 3 batches of 15 samples of non-encapsulated microorganisms are also constituted and respectively placed in an oven (20% relative humidity) at + 40 ° C, + 60 ° C and + 80 ° C ⁇ 2 ° C . The setpoint temperature increases are calibrated over a period of 30 minutes whereby the tubes are held for 2min, 5min and 10 minutes at the core setpoint before removal of the count tubes.
  • Table 13 microorganism concentration at To (Nomin), To + 2 min (N 2 min) To + 5 min (N 5 mm) and To-h 10 min (N 10 min) after heat treatment as a function of the temperature of the heat treatment.
  • the treatments reveal the lower thermal sensitivity of piriformospora indica encapsulated compared to non-encapsulated Piriformospora indica (at 60 ° C./2 min, 4.40 ⁇ 10 4 cfu / ml against 7.10 ⁇ 10 3 cfu / ml; C / 5min 4.55xl0 4 cfu / ml against 9.06xl0 3 cfu / ml, at 60 ° C / 10min l, 95xl0 4 cfu / ml against 1.31xl0 2 cfu / ml, at 80 ° C / 2min, 1, 50x1o 1 cfu / ml against 0.00x100 cfu / ml).
  • the thermal protection provided by the encapsulation is confirmed.
  • X-ray diffraction analysis indicates that in both cases a lamellar phase of talc type structure is obtained with a periodicity of 1.6 nm in both cases (presence of diffraction peaks in the angular domains 2-10). 2 theta, 15-25 ° 2 theta, 30-40 ° 2 theta and 55-65 ° 2 theta corresponding respectively to reflections on the (001), (020; 110), (130; 220) and ( 060: 330)).
  • the presence of spirulina does not inhibit the formation of the material.
  • the presence of Spirulina does not induce increase of the periodicity of 0 oi ⁇ Spirulina is therefore encapsulated in its vegetative form (twisted structure) in the material according to the invention.
  • a liquid culture medium (glucose, 10g / L, MgCl 2 .6H 2 O, 5g / L, MgSO 4 .7H 2 O, 0.25g / L, KCl, 0.2g / L; (NH 4 ) 2 S0 4.0 ( g / L) pH 7.0, supplemented with an insoluble phosphorus source in an aqueous medium (NH 4 MgPO 4 • 6H 2 O 8.9g / Erlenmeyer) is prepared.
  • Each Erlenmeyer flask is then inoculated with 1 ml of a preculture of Bacillus subtHis CIP 52.62 (Institut Pasteur) at a concentration of 6.5 ⁇ 10 4 cfu / ml (free) or 382.3 ml of a preculture of Bacillus subtilis CIP. 52.62 at the concentration of 1.7 ⁇ 10 5 cfu / ml (compound according to the invention 100% Phenyl BS: encapsulated bacterium prepared according to Example 3a).
  • the Erlenmeyer flasks are kept in an oven with stirring.
  • a colony count is made every 2 days as well as a measurement of the pH and concentration of solubilized phosphorus and phosphorus immobilized by the bacterial flora (measurement of total phosphorus by ICP and measurement of inorganic phosphate in solution by HPIC).
  • the results are shown in FIGS. 1 to 3.
  • the developmental comparison of Bacillus subtilis indicates a better solubilization capacity of the water insoluble phosphorus (FIG. 1).
  • the comparison of development of Bacillus subtilis indicates a drop in the pH of the solution to be correlated with solubilization of bacterial origin of phosphorus (FIG. 2).
  • the comparison of the phosphorus concentration indicates a greater bacterial solubilization than its immobilization by the bacterial flora (FIG. 3).

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'encapsulation d'un composé choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1, ledit matériau ayant la formule générale I suivante : Nax[(Mg3)(Alx(RSi)4-x)08+x(OH)2] (I) le procédé comprenant : a) la synthèse par voie sol-gel du matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2 :1 en présence du composé; b) la récupération du composé encapsulé dans le matériau de formule générale I. Elle concerne en outre le composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 de formule générale I, une composition le comprenant et son utilisation pour la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux.

Description

ENCAPSULATION DE SUBSTANCES ACTIVES ET/OU DE
MICROORGANISMES DANS UN MATERIAU LAMELLAIRE
La présente invention concerne l'encapsulation dans des matériaux lamellaires de substances actives et/ou de microorganismes destinés à la croissance ou au traitement des plantes.
L'encapsulation de substances actives dans des argiles telles que des argiles de synthèse est déjà connue (US 2009/0233107). Toutefois une telle encapsulation a lieu après la synthèse de l'argile, ce qui nécessite donc l'utilisation d'un procédé en 2 étapes.
En outre il n'existe aucun document mentionnant l'encapsulation de microorganismes au sein d'une argile, qu'elle soit naturelle ou de synthèse.
Or les inventeurs ont découvert de façon surprenante qu'il était possible d'encapsuler de tels microorganismes et/ou des substances actives au sein d'argile de synthèse de type talc ou saponite au cours de la synthèse de ces argiles, c'est-à-dire en une seule étape, tout en maintenant l'activité des substances actives et des microorganismes.
La présente invention concerne donc un procédé d'encapsulation d'un composé choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1, ledit matériau ayant la formule générale I suivante :
Nax[(Mg3)(Alx(RSi)4-x)08+x(0H)2] (I)
dans laquelle
x est un nombre tel que 0<x<l,2 et R représente un groupe alkyle en Ci-C30, un groupe aryle, un groupe (alkyle en Ci-C3o)aryle ou un groupe O-alkyle en Ci-C30/ le groupe alkyle pouvant être substitué par un groupe choisi parmi un groupe phényle, vinyle, aminopropyle ou mercaptopropyle,
le procédé comprenant :
a) la synthèse par voie sol-gel du matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2 :1 en présence du composé ;
b) la récupération du composé encapsulé dans le matériau de formule générale I.
La présente invention concerne donc un procédé d'encapsulation dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2: 1, ledit matériau ayant la formule générale I suivante :
Nax[(Mg3)(Alx(RSi)4-x)08+x(0H)2] (I)
dans laquelle
x est un nombre tel que 0<x<l,2 et
R représente un groupe alkyle en Ci-C30/ avantageusement un groupe n- hexadécyle ou un groupe méthyle, en particulier un groupe n-hexadécyle ; un groupe aryle, avantageusement un groupe phényle ; un groupe (alkyle en Ci-C3o)aryle, avantageusement un groupe éthylphényle ; ou un groupe O-alkyle en Ci-C3o, avantageusement un groupe éthoxy ; le groupe alkyle pouvant être substitué par un groupe choisi parmi un groupe phényle, vinyle, aminopropyle ou mercaptopropyle.
On entend au sens de la présente invention par « groupe alkyle en Cr C30 », tout groupe alkyle saturé linéaire ou ramifié ayant de 1 à 30 atomes de carbone tel que le groupe méthyle, éthyle, n-propyle, isopropyle, n- butyle, isobutyle, sec-butyle, tert-butyle, n-pentyle, isopentyle, sec-pentyl, sec-isopentyle, néopentyle, n-hexyle, 2-méthylpentyle, 3-méthylpentyle, 2,2-diméthylbutyle, 2,3-diméthylbutyle, n-heptyle, n-octyle, n-nonyle, n- décyle, n-undécyle, n-dodécyle, n-pentadécyle, n-hexadécyle, n-icosyle et n-triacontyle. Avantageusement il s'agit du groupe méthyle, éthyle, n- propyle, isopropyle ou n-hexadécyle, encore plus avantageusement du groupe méthyle, éthyle, ou n-hexadécyle, plus particulièrement du groupe éthyle ou n-hexadécyle.
Par le terme « groupe aryle », on entend au sens de la présente invention un ou plusieurs cycles aromatiques ayant 5 à 20 atomes de carbones, pouvant être accolés ou fusionnés. En particulier, les groupes aryles peuvent être des groupes monocycliques, bicycliques ou polycycliques. De préférence il s'agit du groupe phényle, bi-phényle, naphthyle, anthracényle, phénanthrényle, tétracényle, chrysényle, tryphénylènyle, pyrényle, benzofluorényle, benzopyrényle. Avantageusement il s'agit d'un groupe phényle.
Le matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire est de type 2:1. Il s'agit donc de silicates formés par des empilements de feuillets qui sont constitués par une couche octaédrique entourée de part et d'autre par deux couches tétraédriques. Les atomes de Si et Al (s'il est présent) se trouvent dans la couche tétraédrique et l'atome Mg dans la couche octaédrique. L'atome de Na, s'il est présent, se trouve dans l'espace interfoliaire. Le matériau peut donc être soit de type talc (lorsque x=0) ou de type saponite (x¹0).
De façon avantageuse, il est de type talc c'est à dire que x=0.
La source de silicium nécessaire à la synthèse du matériau de formule I est avantageusement un organoalcoxysilane ou un mélange d'organoalcoxysilanes de formule générale II suivante : RSi(OR 3 (II) dans laquelle
R est tel que défini ci-dessus et
R' est un groupe méthoxy ou éthoxy. De façon avantageuse la source de silicium est choisie dans le groupe constitué par :
- le phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) de formule (a) suivante :
Phényl-Si(OCH3)3 (a) ;
- le tétraéthylorthosilicate ou tétraéthylsilane (TEOS) de formule (b) suivante : Si(OC2H5)4 (b) ;
- l'hexadécyltriméthoxysilane (CI6TMS) de formule (c) suivante :
CH3(CH2)i4CH2-Si(OCH3)3 (c)
- le méthyltriéthoxysilane (MTES) de formule (d) suivante :
CH3-Si(OCH3)3 (c)
- le phenéthyltriméthoxysilane de formule (e) suivante :
Phényl-(CH2)2Si(OCH3)3 (e)
- le triéthoxyphénylsilane de formule (f) suivante :
Phényl-Si(OC2H5)3 (f) ;
et leurs mélanges.
En particulier elle est choisie dans le groupe constitué par le méthyltriéthoxysilane, le phényltriméthoxysilane, le tétraéthylorthosilicate, l'hexadécyltriméthoxysilane, le triéthoxyphénylsilane et leurs mélanges, plus particulièrement dans le groupe constitué par le phényltriméthoxysilane, le tétraéthylorthosilicate, le triéthoxyphénylsilane l'hexadécyltriméthoxysilane et leurs mélanges, encore plus avantageusement dans le groupe constitué par le phényltriméthoxysilane, le tétraéthylorthosilicate, l'hexadécyltriméthoxysilane et leurs mélanges. Dans le cas des mélanges, il peut s'agir en particulier d'un mélange entre le tétraéthylorthosilicate et le phényltriméthoxysilane ou entre le tétraéthylorthosilicate et l'hexadécyltriméthoxysilane ou encore entre le triéthoxyphénylsilane et l'hexadécyltriméthoxysilane, avantageusement il s'agit d'un mélange entre le tétraéthylorthosilicate et l'hexadécyltriméthoxysilane ou entre le triéthoxyphénylsilane et hexadécyltriméthoxysilane, encore plus avantageusement entre le tétraéthylorthosilicate et rhexadécyltriméthoxysilane.
Ces mélanges peuvent être réalisés en toute proportion.
Le composé va donc être encapsulé au sein du matériau de formule I et en particulier si sa taille le permet (de l'ordre de l'Angstrom) au sein de l'espace interfoliaire du matériau (c'est ainsi le cas du tryptophane et de l'acide folique). Le composé selon l'invention est choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges.
On entend au sens de la présente invention par « substance active » toute substance organique biologiquement active, c'est-à-dire toute substance organique capable de réagir avec les organismes vivants, en particulier les plantes et donc jouant un rôle spécifique dans le métabolisme par exemple soit en agissant directement sur la plante, soit en agissant sur le sol ou le substrat de culture, soit encore en agissant sur les nuisibles ou au contraire sur les organismes utiles. Ce type de substance peut ainsi permettre la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux. La substance active peut être une molécule, mais aussi un extrait de plantes, un extrait d'algues, un extrait humique ou tout autre type d'extraits ou co-produits. Elle peut être d'origine naturelle ou synthétique, telle qu'une hormone, une protéine, un oligosaccharide, un lipide tel qu'une huile essentielle, une enzyme, un acide aminé tel que le tryptophane, une vitamine telle que l'acide folique ou la substance active d'un médicament ou d'un produit phytopharmaceutique tel qu'un pesticide, fongicide, herbicide, nématicide. Dans un mode de réalisation avantageux, la substance active est choisie dans le groupe constitué par un acide aminé, en particulier le tryptophane, une vitamine en particulier l'acide folique, une huile essentielle et leurs mélanges, plus avantageusement dans le groupe constitué par un acide aminé, en particulier le tryptophane, une huile essentielle et leurs mélanges de façon avantageuse, il s'agit du tryptophane.
Dans un mode de réalisation particulier, le composé selon l'invention est donc une substance active. Il peut également s'agir d'un mélange de 2, 3 ou 4 substances actives, en particulier de 2 ou 3 substances actives.
Dans un mode de réalisation avantageux, une seule substance active est encapsulée, telle que par exemple le tryptophane ou l'acide folique.
Dans le cas où le composé encapsulé est une substance active, la source de silicium nécessaire à la synthèse du matériau de formule I est avantageusement le phényltriméthoxysilane ou un mélange d'organoalcoxysilanes de formule générale II, avantageusement un mélange entre le phényltriméthoxysilane (a) et le tétraéthylorthosilicate (b). De façon avantageuse le mélange comprend moins de 80% en mol de tétraéthylorthosilicate et plus de 20% en mol de phényltriméthoxysilane, plus avantageusement moins de 60% en mol de tétraéthylorthosilicate et plus de 40% en mol de phényltriméthoxysilane, encore plus avantageusement moins de 50% en mol de tétraéthylorthosilicate et plus de 50% en mol de phényltriméthoxysilane, par rapport au nombre de mol total du mélange.
Dans un mode de réalisation avantageux, le mélange comprend entre 20 et 60 % en mol de tétraéthylorthosilicate et entre 40 et 80% en mol de phényltriméthoxysilane, en particulier entre 20 et 40% en mol de tétraéthylorthosilicate et entre 60 et 80% en mol de phényltriméthoxysilane, plus particulièrement 20% en mol de tétraéthylorthosilicate et 80% en mol de phényltriméthoxysilane, par rapport au nombre de mol total du mélange.
Dans le cas où le composé encapsulé est une substance active, l'étape a) comprend les étapes successives suivantes :
al) Ajout d'une source de magnésium, avantageusement du nitrate de magnésium hexahydraté, de la substance active, de la source de silicium, dans le cas où x¹0, de la source d'aluminium, avantageusement de l'acétylacétonate d'aluminium, et d'un éventuel solvant ;
a2) ajustement du pH à entre 8 et 14, avantageusement entre 9 et 12, en particulier à 10, par exemple à l'aide d'une solution aqueuse de NaOH ; a3) agitation du mélange, avantageusement pendant une durée comprise entre 1 et 24 heures, en particulier entre 12 et 24 heures, plus particulièrement au moins 2 heures, encore plus particulièrement au moins 12 heures, de façon à obtenir un gel ;
a4) récupération de la phase solide du gel obtenu à l'étape a3) ;
a5) séchage de la phase solide du gel obtenu à l'étape a4).
Le solvant de l'étape al) peut être un solvant polaire tel que l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol), le propylène glycol, le méthyl-5- (diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay), le carbonate de propylène ou leurs mélanges, avantageusement l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol), le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges, plus particulièrement l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol) ou leurs mélanges. Il peut s'agir d'un solvant biosourcé et/ou biodégradable tel que le glycérol, le propylène glycol, le méthyl-5- (diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay), le carbonate de propylène ou leurs mélanges, en particulier le glycérol, le méthyl-5-(diméthylamino)-2- méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges. Il peut également s'agir d'un mélange d'alcool et d'huile.
Dans le cas où la substance organique comprend une huile ou est sous forme liquide, le solvant de l'étape al) peut ne pas être présent.
En revanche, dans le cas où la substance active est un solide, le solvant de l'étape al) doit être présent.
L'étape a3) peut être mise en oeuvre à une température comprise entre la température ambiante et la température d'ébullition du solvant, avantageusement à température ambiante.
L'étape a4) peut être mise en œuvre par toute méthode bien connue de l'homme du métier, tel que par filtration ou centrifugation, en particulier par centrifugation.
L'étape a5) peut être mise en œuvre dans une étuve, par exemple à une température de 40°C, ou par séchage à l'air ou par lyophilisation.
Une étape intermédiaire a4) bis peut être rajoutée entre les étapes a4) et a5) qui consiste en le lavage de la phase solide du gel obtenue à l'étape a4) avec le solvant de l'étape al).
Dans un autre mode de réalisation particulier, le composé selon l'invention est donc au moins un microorganisme. Avantageusement le microorganisme est choisi dans le groupe constitué par une bactérie telle que Bacillus subtilis (par exemple accessible sous le numéro CIP 52.62 de l'institut Pasteur), une microalgue telle que la spiruline (par exemple la cyanobacterium Arthrospira platensis commercialisée sous la dénomination SPIRULINA NATURAL par la société EARTHRISE®), un champignon tel que le Piriformospora indica (par exemple accessible sous le numéro DSM 11827 au Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie), et leurs mélanges, de façon avantageuse le microorganisme est sous forme végétative, sous forme enkystée ou sous forme sporulée, en particulier sous forme végétative, plus particulièrement il s'agit d'une bactérie telle que Bacillus subtilis, encore plus particulièrement sous forme végétative, ou d'un champignon tel que le Piriformospora indica, encore plus particulièrement une bactérie telle que Bacillus subtilis.
Le composé selon l'invention peut donc consister en un seul de type de microorganisme tel que la bactérie Bacillus subtilis, Il peut également consister en un mélange de 2, 3 ou 4 types de microorganismes différents, en particulier de 2 ou 3 types de microorganismes différents. Dans un mode de réalisation avantageux, il consiste en un seul de type de microorganisme.
Dans le cas où le composé encapsulé est un microorganisme, la source de silicium nécessaire à la synthèse du matériau de formule I est avantageusement choisie dans le groupe constitué par le méthyltriéthoxysilane, le phényltriméthoxysilane, le triéthoxyphénylsilane l'hexadécyltriméthoxysilane et leurs mélanges, plus avantageusement le phényltriméthoxysilane, le triéthoxyphénylsilane, l'hexadécyltriméthoxysilane et leurs mélanges, encore plus avantageusement il s'agit de l'hexadécyltriméthoxysilane ou d'un mélange de le triéthoxyphénylsilane et d'hexadécyltriméthoxysilane, en particulier il s'agit de l'hexadécyltriméthoxysilane.
Dans le cas où le composé encapsulé est un microorganisme, l'étape a) comprend les étapes successives suivantes :
al) ajout d'une source de magnésium, avantageusement du nitrate de magnésium hexahydraté, du microorganisme, d'un solvant, d'une source de silicium et dans le cas où x¹0, de la source d'aluminium, avantageusement de l'acétylacétonate d'aluminium;
a2) ajustement du pH à entre 8 et 14, avantageusement entre 9 et 12, en particulier à 10, par exemple à l'aide d'une solution aqueuse de NaOH ; a3) agitation du mélange, avantageusement pendant une durée comprise entre 1 et 24 heures, en particulier entre 12 et 24 heures, plus particulièrement au moins 2 heures, encore plus particulièrement au moins 12 heures, avantageusement 24 heures, de façon à obtenir un gel.
Le procédé selon l'invention peut en outre comprendre les étapes successives suivantes après l'étape a3) de :
a4) récupération de la phase solide du gel obtenu à l'étape a3) ;
a5) séchage de la phase solide du gel obtenu à l'étape a4), avantageusement par lyophilisation.
Le solvant de l'étape al) peut être un solvant polaire tel que l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol), le propylène glycol, le méthyl-5- (diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay), le carbonate de propylène ou leurs mélanges, avantageusement l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol), le propylène glycol, le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5- oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges, plus particulièrement l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol), le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl- 5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges, encore plus particulièrement l'eau, l'alcool (en particulier l'éthanol ou le glycérol) ou leurs mélanges. Il peut s'agir d'un solvant biosourcé et/ou biodégradable tel que le glycérol, le propylène glycol, le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay), le carbonate de propylène ou leurs mélanges, en particulier le glycérol, le propylène glycol, le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges, plus particulièrement le glycérol, le méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5- oxopentanoate (tel que le RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou leurs mélanges. Il peut également s'agir d'un mélange d'alcool et d'huile.
Dans un mode de réalisation avantageux et en particulier lorsque le microorganisme est sous forme végétative, le microorganisme de l'étape al) se trouve sous la forme d'une préculture dudit microorganisme, avantageusement ayant une teneur en microorganisme comprise entre 103 et 1010 ufc/ml, en particulier entre 106 et 109 ufc/ml avantageusement 108 ufc/ml.
Dans ce cas, le procédé selon l'invention peut également comprendre une étape préalable avant l'étape a) de préparation de la préculture de microorganisme. Cette étape peut être mise en oeuvre par des méthodes bien connues de l'homme du métier. Elle comprend en particulier l'ensemencement du microorganisme dans un milieu nutritif et l'incubation pendant une période suffisante pour obtenir la concentration en microorganisme voulue.
L'étape a3) peut être mise en oeuvre à température ambiante.
L'étape a4) peut être mise en œuvre par toute méthode bien connue de l'homme du métier, telle que par filtration ou centrifugation, en particulier par centrifugation.
Une étape intermédiaire a4)bis peut être rajoutée entre les étapes a4) et a5) qui consiste en le lavage de la phase solide du gel obtenue à l'étape a4) avec le solvant de l'étape al).
Une autre étape a4)ter peut également être rajoutée entre les étapes a4) ou a4)bis et a5) qui consiste en la surgélation de la phase solide du gel obtenue à l'étape a4) ou à l'étape a4)bis, si cette dernière est mise en œuvre.
L'étape a5) peut être mise en œuvre dans une étuve, par exemple à une température de 40°C, ou par séchage à l'air ou par lyophilisation, Avantageusement elle est mise en œuvre par lyophilisation.
Le procédé selon l'invention peut être mis en œuvre dans un bio réacteur.
La présente invention concerne en outre un composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1, ledit matériau ayant la formule générale I telle que décrite ci-dessus, le composé encapsulé étant choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges.
Le matériau, la substance active et le microorganisme sont tels que décrits ci-dessus.
Avantageusement le composé encapsulé est susceptible d'être obtenu, en particulier obtenu, par le procédé selon l'invention tel que décrit ci-dessus. Le taux d'encapsulation est avantageusement d'au moins 20mg de composé/ g de matériau, plus avantageusement d'au moins 30mg de composé/ g de matériau, encore plus avantageusement d'au moins 40mg de composé/ g de matériau, en particulier d'au moins 50mg de composé/ g de matériau, plus particulièrement d'au moins 60mg de composé/ g de matériau, encore plus particulièrement d'au moins 65mg de composé/ g de matériau.
Le microorganisme encapsulé peut être revivifié par des méthodes bien connues de l'homme du métier, tel que par exemple par ensemencement sur milieu nutritif solide (boite de Pétri) ou liquide (bioréacteur).
Le composé encapsulé peut être stocké entre 0 et 12 mois à une température comprise entre 4°C et la température ambiante. Lorsque le composé est un microorganisme ou comprend un microorganisme, il doit être stocké à une température de 4°C.
La présente invention concerne de plus une composition, en particulier phytopharmaceutique, avantageusement destinée à la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux, comprenant le composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 selon l'invention.
Cette composition comprend tout excipient approprié pour l'administration à un végétal ou au sol ou substrat de culture des végétaux, que ce soit par exemple par application foliaire, racinaire, plein champ ou hors-sol. Il s'agit en particulier d'un excipient phytopharmaceutiquement acceptable. Au sens de la présente invention, on en entend par « phytopharmaceutiquement acceptable », qui est acceptable pour l'utilisation sur les plantes ou le sol, c'est-à-dire non polluant pour l'environnement et non toxique pour les hommes (utilisateurs).
Elle peut en outre comprendre d'autres composés actifs ayant une action synergique ou complémentaire sur le végétal ou le sol ou substrat de culture des végétaux, tel que par exemples des nutriments avantageusement choisis dans le groupe constitué par l'azote, le phosphore, le potassium, le calcium, le magnésium, le silicium, les oligoéléments et leurs mélanges, des matières premières organiques et/ou des matières premières minérales, des pesticides, fongicides, herbicides, nématicides, les hormones, les substances humiques, les extraits d'algues, les acides aminés, les extraits de plantes, l'acide salicylique et les précurseurs ou analogues d'acide salicylique, l'oxyde nitrique et les précurseurs ou analogues d'oxyde nitrique, les nucléotides cycliques et leurs mélanges.
Cette composition peut donc avoir la forme d'un engrais ou d'un biostimulant.
Elle peut se trouver sous forme solide, en particulier sous forme de poudre, de granulés ou de microgranulés, sous forme liquide ou sous forme de gel.
Ainsi, elle peut par exemple se trouver sous forme solide de type poudre, granulé, microgranulé dans des engrais ou des supports de culture pour la nutrition ou la stimulation des plantes pour un usage en plein ou en localisé.
Elle peut également se trouver sous la forme liquide ou gel d'engrais ou de biostimulants pour un usage en application foliaire ou racinaire.
Elle peut en outre se trouver sous la forme d'un engrais hydrosoluble pour un usage en fertirrigation plein champ ou hors-sol.
Elle peut par ailleurs se trouver sous une forme solide ou liquide d'amendement pour l'amélioration des propriétés physiques, chimiques ou biologiques du sol ou du substrat de culture.
Il peut s'agir de composition de type phytosanitaire ou de composition de type biocontrôle, PNPP (préparations naturelles peu préoccupantes), SDN (stimulation des défenses naturelles), SDP (stimulation des défenses des plantes), dans le cas de la prophylaxie des végétaux.
Les compositions selon l'invention peuvent donc être utilisées :
par application directe sur un sol, sur toute la surface du sol ou, de préférence, de façon localisée dans la région des racines des plantes à traiter ; ou
par application au niveau des feuilles et/ou des plantes à traiter, par tous moyens de distribution appropriés, comme par exemple par pulvérisation dans le cas d'une formulation liquide. Ces compositions peuvent en outre être introduites dans le système d'irrigation en eau et/ou dans des formulations d'engrais.
D'une manière générale, la quantité de composition à utiliser dépend de la nature de la plante à traiter, de la nature du composé encapsulé et du mode d'administration envisagé.
L'homme du métier saura adapter les quantités à utiliser en fonction du mode d'application choisi. En particulier, des quantités relativement plus faibles sont utilisées lorsque la composition est appliquée dans la région racinaire alors que des quantités relativement plus importantes sont utilisées lorsque la composition est appliquée sur toute la surface du sol. Ces compositions peuvent être utilisées en une seule application ou bien en application séquentielle.
La présente invention concerne enfin l'utilisation du composé selon la présente invention ou de la composition selon la présente invention pour la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux, avantageusement des plantes cultivées ou d'intérêt agronomiques.
En particulier cette utilisation peut être mise en œuvre par application foliaire, racinaire, plein champ ou hors-sol.
En effet, la bactérie Bacillus subtilis permet de stimuler la croissance des végétaux et les protège contre les stress biotiques (pathogènes) et abiotiques (manque d'eau). Elle permet de solubiliser dans l'eau des formes phosphatées insolubles dans l'eau du Phosphore.
Le champignon Piriformospora indica améliore la capacité des végétaux à tolérer le stress environnementaux, stimule la croissance des végétaux et favorise l'absorption des nutriments. Le tryptophane est quant à lui un précurseur à la production d'auxine, hormone régulant le développement racinaire notamment.
L'huile essentielle en particulier de thym est un stimulateur des défenses naturelles.
La spiruline est un producteur de composés chimiques ayant une activé biologique sur les plantes.
L'acide folique permet une inhibition du développement des racines primaires et un développement accru ainsi qu'une maturation des racines secondaires (élongation horizontale) par redistribution de l'auxine (hormone de croissance) dans les racines primaires.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture de la description des dessins et des exemples qui suivent qui sont donnés à titre indicatif non limitatif.
La figure 1 représente le suivi dans le temps (en jours) de la population (en ufc/ml) de Bacillus subtiHs CIP 52.62 encapsulée (composé selon l'invention) et non encapsulée en présence de phosphore dans les conditions de l'exemple 3.
La figure 2 représente l'évolution du pH du milieu de culture en fonction du temps (en jours) en présence de Bacillus subtilis Cl? 52.62 encapsulée (composé selon l'invention) et non encapsulée et en présence de phosphore dans les conditions de l'exemple 3.
La figure 3 représente la différence de concentration entre le phosphore solubilisé et le phosphore immobilisé par la flore bactérienne en fonction du temps (en jours) en présence de Bacillus subtilis CIP 52.62 encapsulée (composé selon l'invention) et non encapsulée dans les conditions de l'exemple 3. Exemple Comparatif 1 : Effet de différents solvants biodégradables et de l'éthanol sur la synthèse chimique de composés oraaniaues-inoraaniaues de type lamellaire
Dans un bêcher de lOOOmL, ajout de 19,44g de nitrate de magnésium hexahydraté (MgNÜ3, 6H2O) (99%, Sigma) et de 200mL de solvant biodégradable (Glycérol (Quaron > 99,5%) ou Propylène glycol (VWR) ou méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) ou Carbonate de propylène (Quaron >99,7%)) ou d'éthanol sous agitation à 55°C à 220 tours par min pendant 15 minutes. Ajout sous agitation pendant 15 minutes de 4,58g de triéthoxyphénylsilane (97%, Sigma) et de 15,42g d'hexadécyltriméthoxysilane (CI6TMS) (>85%, Sigma). Ajout de lOOmL de NaOH (97 %, Sigma) IM et mise sous agitation 24h. Après 15 jours de stockage à température et humidité relative ambiante, dans l'obscurité, chaque synthèse est contrôlée pour valider la bonne formation des composés et certaines propriétés physico-chimiques (pH, viscosité, apparence, volume, stabilité) (Tableau 1). Un produit est considéré comme stable s'il n'y pas de changement apparent d'aspect et de viscosité et s'il n'y a pas de séparation de phases ou de décantation.
Tableau 1 : propriétés physico-chimiques des matériaux lamellaires
Au vu des résultats, l'utilisation de solvants biodégradables ou d'éthanol lors des synthèses n'impacte donc pas négativement la formation des composés. La substitution de l'éthanol est possible au moyen du glycérol, du propylène glycol, du carbonate de propylène ou du méthyl-5- (diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay).
Exemple 1 : encapsulation d'une molécule active
Exemple 1.1 : encapsulation du tryptophane
a) composé 100%Phényl TRYPTO
1,944g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 mL d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba), le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 200 mg de L- tryptophane (>98 %, Sigma Aldrich) sont introduits sous agitation puis 2g de phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) (98%, ABCR) sont ajoutés. L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition de 15 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min). Le solide est lavé à trois reprises avec de l'éthanol avant d'être séché dans une étuve à 40°C durant 48h. Le composé obtenu est ensuite broyé dans un mortier en agate avant d'être caractérisé. On récupère 1,35 g de composé dénommé 100%phényl TRYPTO.
Le diffractogramme de rayons X de l'échantillon présente plusieurs pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30- 40°2 thêta et 55-652 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 :330), caractéristiques de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité do6o est de 0,156 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2 dans laquelle R représente un groupe phényle. La périodicité dooi est de l'ordre de 1,32 nm.
La quantité de tryptophane dans le composé (taux d'encapsulation) a été déterminée par en spectrophotométrie UV à une longueur d'onde de 280 nm. Le composé comporte 63,4 mg de tryptophane par g de matériau. L'analyse par thermogravimétrie réalisée sous air entre 30 et 800°C à une vitesse de montée en température de 5°C/min montre que la perte de masse la plus importante (décomposition des produits) ne commence qu'à partir de 300°C, ce qui confirme que le tryptophane a bien été encapsulé au sein du matériau (tableau 2).
Tableau 2 : résultat des analyses thermogravimétriques réalisées sous azote et sous air
La comparaison entre le spectre de RMN du solide du 13C du tryptophane seul et du composé 100%Phényl TRYPTO indique la présence d'une résonance large à environ 111 ppm, attribuée à la présence de tryptophane. La mobilité de ce dernier est fortement réduite, ce qui montre que le tryptophane est présent dans l'espace interfoliaire. On obtient donc bien du tryptophane encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 de formule Mg3(RSi)408(0H)2.
b) composé 80Ph-20TEOS TRYPTO
2 g de nitrate de magnésium hexahydraté(99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 ml_ d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba), le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 200mg de L- tryptophane (>98%, Sigma Aldrich) sont ajoutés sous agitation puis un mélange constitué de 1,646 g de phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) (98%, ABCR) et de 0,432g tétraéthylsilane (TEOS) (98%, ABCR) est ajouté (mélange en masse de 79,2% de PhénylTMS et 20,8% de TEOS qui représente 80% de PhénylTMS et 20% de TEOS en mol). L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition de 15 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97%, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min). Le solide est lavé à trois reprises avec de l'éthanol avant d'être séché dans une étuve à 40°C durant 48h. Le composé obtenu est ensuite broyé dans un mortier en agate avant d'être caractérisé. On récupère 1,43 g de composé dénommé 80Ph-20TEOS TRYPTO.
Le diffractogramme de rayons X de l'échantillon présente plusieurs pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30- 40°2 thêta et 55-652 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 :330), caractéristique de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité d006 est de 0,156 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2 dans laquelle R représente un mélange de groupe phényle et de groupe O-éthyle. La périodicité dooi est égale à 1,4 nm.
La quantité de tryptophane dans le composé (taux d'encapsulation) a été déterminée par spectrophotométrie UV à une longueur d'onde de 280 nm, le composé comporte 68,7 mg de tryptophane par g de matériau.
L'analyse par thermogravimétrie réalisée sous air entre 30 et 800°C à une vitesse de montée en température de 5°C/min montre que la perte de masse la plus importante (décomposition des produits) ne commence qu'à partir de 300°C, ce qui confirme que le tryptophane a bien été encapsulé au sein du matériau (tableau 3).
Tableau 3 : résultat des analyses thermogravimétriques réalisées sous azote et sous air
La comparaison entre le spectre de RMN du solide du 13C du tryptophane seul et du composé 80Ph-20TEOS TRYPTO indique la présence d'une résonance large à environ 111 ppm, attribuée à la présence de tryptophane. La mobilité de ce dernier est fortement réduite, signe que le tryptophane est présent dans l'espace interfoliaire. On obtient donc bien du tryptophane encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 de formule Mg3(RSi)408(0H)2.
c) composés MTES TRYPTO, CI6TMS TRYPTO, TEOS TRYPTO, 20PH-80TEOS TRYPTO, 40Ph-60TEOS TRYPTO et 60Ph-40TEOS TRYPTO
Par un procédé identique à celui utilisé pour préparer le composé 100%Phényl TRYPTO d'autres composés selon l'invention ont été préparés en remplaçant le phényltriméthoxysilane comme source de silicium par du méthyltriéthoxysilane (MTES) ou de l'hexadécyltriméthoxysilane (CI6TMS) ou du tétraéthylsilane (TEOS). Les composés obtenus ont été nommés respectivement MTES TRYPTO, CI6TMS TRYPTO et TEOS TRYPTO.
Par un procédé identique à celui utilisé pour préparer le composé 80Ph- 20TEOS TRYPTO d'autres composés selon l'invention ont été préparés en remplaçant le mélange 20% TEOS et 80% PhénylTMS comme source de silicium par un mélange 80% TEOS et 20% PhénylTMS en mol, un mélange 60% TEOS et 40% PhénylTMS en mol et un mélange 40% TEOS et 60% PhénylTMS en mol. Les composés obtenus ont été nommés respectivement 20Ph-80TEOS TRYPTO, 40Ph-60TEOS TRYPTO et 60Ph- 40TEOS TRYPTO.
La quantité de composés récupérés et les taux d'encapsulation déterminés par spectrophotométrie UV à une longueur d'onde de 280 nm sont rassemblés dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
Le diffractogramme de rayons X des échantillons de chacun des composés présente plusieurs pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30-40°2 thêta et 55-652 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 :330), caractéristique de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité d006 est de 0,156 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2. La périodicité dooi est égale à 1,4 nm.
La comparaison entre le spectre de RMN du solide du 13C du tryptophane seul et des composés selon l'invention indique la présence d'une résonance large à environ 111 ppm, attribuée à la présence de tryptophane. La mobilité de ce dernier est fortement réduite, signe que le tryptophane est présent dans l'espace interfoliaire.
On obtient donc bien pour chaque composé selon l'invention du tryptophane encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2: 1 de formule Mg3(RSi)408(0H)2.
Dans le cas où la source de silicium est un mélange entre le TEOS et le PhénylTMS, on observe une corrélation linéaire entre la quantité de tryptophane encapsulée et le % de TEOS utilisé, à l'exception du cas où la teneur en TEOS est de 0% (composé 100%Phényl TRYPTO).
Exemple 1.2 : encapsulation d'une huile essentielle
2 g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 mL d'un mélange composé à d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba) et d'huile (Greenfix 3000) dans des proportions égale à 0%, 25%, 75% ou 100 % en volume d'huile. Le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 1,646 g de phényltriméthoxysilane (98%, ABCR) et 0,432g de tétraéthylsilane (98%, ABCR) sont ensuite ajoutés (mélange en masse de 79,2% de PhénylTMS et 20,8% de TEOS qui représente 80% de PhénylTMS et 20% de TEOS en mol). L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition de 15 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min). Les solides sont lavés à trois reprises avec de l'éthanol avant d'être séchés dans une étuve à 40°C durant 48h. Les composés obtenus sont ensuite broyés dans un mortier en agate avant d'être caractérisés et sont dénommés SHE5 (25% d'huile), SHE15 (75% d'huile), SH20 (100% d'huile) et 80%P-20%T (0% d'huile). Les quantités obtenues pour les différents échantillons sont respectivement de 2,24g, 2,62g, 0,12g et 1,43g.
La comparaison entre les diffractogrammes de rayons X des échantillons SHE5 (25% d'huile), SHE15 (75% d'huile), SH20 (100% d'huile) et 80%P- 20%T (0% d'huile) montre la présence de pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30-40°2 thêta et 55- 65°2 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 :330), caractéristiques de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité d06o est de 0,156 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc. Les périodicités dooi sont de l'ordre de 1,4 nm. Il est à noter que l'intensité des pics de diffraction diminue avec la teneur en huile dans le mélange. L'analyse par thermogravimétrie réalisée sous air entre 30 et 800°C à une vitesse de montée en température de 5°C/min montre que la perte de masse la plus importante (décomposition des produits) ne commence qu'à partir de 300°C, ce qui confirme que l'huile a bien été encapsulée au sein du matériau (tableau 5).
Tableau 5 : résultat des analyses thermogravimétriques réalisées sous azote et sous air
Exemple 1.3 : encapsulation de l'acide folique
a) avec de l'éthanol comme solvant
1,60g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 mL d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba), le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 200 mg d'acide folique (>97 %, Sigma Aldrich) sont introduits sous agitation puis 2 g de phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) (98%, Sigma Aldrich) sont ajoutés. L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition de 10 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min). Le solide est séché dans une étuve à 60°C durant 24h. Le composé obtenu (2,1g) est ensuite broyé dans un mortier en agate avant d'être caractérisé et est noté Eth-Ph 200AF in situ.
Le diffractogramme de rayons X de l'échantillon présente plusieurs pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30- 40°2 thêta et 55-65°2 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 ; 330), caractéristique de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité d06o est de 0,156 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2 dans laquelle R représente un groupe phényle. La périodicité d0oi est de l'ordre de 1,14 nm. La quantité d'acide folique dans le composé (taux d'encapsulation) a été déterminée par spectrophotométrie UV à une longueur d'onde de 280 nm, le composé comporte 108,3 mg d'acide folique par g de matériau. L'analyse par thermogravimétrie réalisée sous air entre 30 et 800°C à une vitesse de montée en température de 5°C/min montre que la perte de masse la plus importante (décomposition des produits) ne commence qu'à partir de 300°C, ce qui confirme que l'acide folique a bien été encapsulé au sein du matériau (tableau 6).
Tableau 6 : résultat des analyses thermogravimétriques réalisées sous azote et sous air
La comparaison entre le spectre de RMN du solide du 13C de l'acide folique seul et du composé de référence Eth-Ph 200AF in situ indique la présence de résonances larges à environ 46, 97, 112, 150 et 166 ppm, attribuées à la présence de l'acide folique. La mobilité de ce dernier est fortement réduite, signe que l'acide folique est présent dans l'espace interfoliaire. On obtient donc bien de l'acide folique encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2: 1 de formule Mg3(RSi)408(OH)2.
b) avec du glycérol comme solvant
1,60g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 mL de glycérol (87%, Fluka), le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 200 mg d'acide folique (>97 %, Sigma Aldrich) sont introduits sous agitation puis 2 g de phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) (98%, Sigma Aldrich) sont ajoutés. L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition de 10 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min). Le solide est lavé à quatre reprises avec de l'eau déminéralisée avant d'être séché dans une étuve à 60°C durant 24h. Le composé obtenu (2,2g) est ensuite broyé dans un mortier en agate avant d'être caractérisé et est noté Gly-Ph 200AF in situ.
Le diffractogramme de rayons X de l'échantillon présente plusieurs pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30- 40°2 thêta et 55-65°2 thêta. Ces pics correspondent respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 ; 330), caractéristique de la présence d'une phase lamellaire. La valeur de la périodicité do6o est de 0,155 nm, valeur caractéristique pour une phase lamellaire de type hybride organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2 dans laquelle R représente un groupe phényle. La périodicité d0oi est de l'ordre de 1,24 nm.
La quantité d'acide folique dans le composé (taux d'encapsulation) a été déterminée par spectrophotométrie UV à une longueur d'onde de 280 nm, le composé comporte 56,66 mg d'acide folique par g de matériau. L'analyse par thermogravimétrie réalisée sous air entre 30 et 800°C à une vitesse de montée en température de 5°C/min montre que la perte de masse la plus importante (décomposition des produits) ne commence qu'à partir de 300°C, ce qui confirme que l'acide folique a bien été encapsulé au sein du matériau (tableau 7). Tableau 7: résultat des analyses thermogravimétriques réalisées sous air
La comparaison entre le spectre de RMN du solide du 13C de l'acide folique seul et du composé de référence Gly-Ph 200AF in situ indique la présence d'une résonance large à environ 46, 97, 112, 150 et 166 ppm, attribué à la présence de l'acide folique. La mobilité de ce dernier est fortement réduite, signe que l'acide folique est présent dans l'espace interfoliaire. On obtient donc bien de l'acide folique encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 de formule Mg3(RSi)408(OH)2.
Exemple 2 : encapsulation d'un microoraanisme
Exemple 2.1 : encapsulation de Bacillus subtilis
a) composé 100%Phényl BS
Une préculture de Bacillus subtilis (accessible sous le numéro CIP 52.62 de l'institut Pasteur) est préparée à partir de cryotubes contenant 400 pL d'une suspension de Bacillus subtilis maintenue à -20°C dans 1,6 mL de glycérol. Le milieu nutritif dans lequel est incorporé le contenu du cryotube est un bouillon LB (lysogeny broth). Il est composé de 10 g de tryptone (peptone de type hydrolysat pancréatique de caséine), 5 g d'extrait de levure et 10 g de NaCI pour un litre d'eau déminéralisée. L'extrait de levure est obtenu à partir d'autolysats de levures. Il s'agit de biomasse de levures en suspension conduites à l’autolyse par passage à 50°C pendant plusieurs heures, dont on récupère la phase liquide. Ce milieu est préparé directement dans les erlenmeyers puis est autoclavé pendant 20 minutes à 121°C. L'ensemencement s'effectue ensuite à la flamme pour éviter toute contamination. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé après 18h d'incubation à 37°C afin de déterminer la concentration initiale en bactérie qui est ajoutée lors de la synthèse.
La synthèse est réalisée dans un bioréacteur. La première étape consiste à nettoyer le bioréacteur avec de l'éthanol absolu. La préculture est introduite dans le bioréacteur (à 10% du volume final soit 200 mL de milieu LB contenant les bactéries en une teneur de 103 ufc/ml). Dans une bouteille de 2L, 97g de nitrate de magnésium (99%, Sigma Aldrich) sont dissouts dans un litre d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba). 100g de phényltriméthoxysilane (PhénylTMS) (98%, ABCR) sont ensuite ajoutés à cette solution puis l'ensemble est versé dans le bioréacteur. Une partie de la soude est rapidement introduite manuellement, jusqu'à pH = 9.5 environ puis le reste est ajouté progressivement par l'intermédiaire de la pompe jusqu'à atteindre un pH = 10 (volume de solution aqueuse de soude IM : 750 mL). Après 24h d'agitation le gel est centrifugé durant 10 minutes à une vitesse de 9500 tours par min, lavé trois fois à l'eau déminéralisée puis le culot est surgelé avant d'être lyophilisé. L'échantillon ainsi préparé est dénommé 100%Phényl BS et contient la même quantité de bactérie qu'au départ.
La caractérisation de l'échantillon par diffraction de rayons X indique la formation d'une phase lamellaire de type organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(0H)2 dans laquelle R représente un groupe phényle (présence des réflexions caractéristiques des plans réticulaires (001), (020,110), (130,220) et (060)) avec une périodicité d00l égale à 1,3 nm.
Peu de bactéries isolées sont observables sur les clichés de microscopie électrique à balayage. Ces dernières sont emprisonnées dans les agglomérats.
b) composé CieTMS BS Une préculture de Bacillus subtilis (accessible sous le numéro CIP 52.62 de l'institut Pasteur) est préparée à partir de cryotubes contenant 400 pL d'une suspension de Bacillus subtilis maintenue à -20°C dans 1,6 mL de glycérol. Le milieu nutritif dans lequel est incorporé le contenu du cryotube est un bouillon LB (lysogeny broth) tel que décrit ci-dessus. Ce milieu est préparé directement dans les erlenmeyers puis est autoclavé pendant 20 minutes à 121°C. L'ensemencement s'effectue ensuite à la flamme pour éviter toute contamination. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé après 18h d'incubation à 37°C afin de déterminer la concentration initiale en bactérie qui est ajoutée lors de la synthèse (103 ufc/ml).
La synthèse est réalisée dans un bioréacteur. La première étape consiste à nettoyer le bioréacteur avec de l'éthanol absolu. La préculture est introduite dans le bioréacteur (à 10% du volume final soit 200 mL de milieu LB contenant les bactéries). Dans une bouteille de 2L, 55,65 g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont dissouts dans un litre d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba). 100g d'hexadécyltriméthoxysilane (CI6TMS) (>85%, Sigma) sont ensuite ajoutés à cette solution puis l'ensemble est versé dans le bioréacteur. Une partie de la soude est rapidement introduite manuellement, jusqu'à pH = 9.5 environ puis le reste est ajouté progressivement par l'intermédiaire de la pompe jusqu'à atteindre un pH = 10 (volume de solution de soude IM : 450 mL). Une fois ce pH atteint, la pompe est arrêtée. Après 24h d'agitation le gel est centrifugé durant 10 minutes à une vitesse de 9500 tours par min , lavé trois fois à l'eau déminéralisée puis le culot est surgelé avant d'être lyophilisé. L'échantillon ainsi préparé a pour référence CIÔTMS BS. La quantité de bactérie présente dans l'échantillon est de 102 ufc/ml.
La caractérisation de l'échantillon par diffraction de rayons X indique la formation d'une phase lamellaire de type organique-inorganique de structure de type talc de formule Mg3(RSi)408(OH)2 dans laquelle R représente un groupe CH3(CH2)i4CH2 ((présence des réflexions caractéristiques des plans réticulaires (001), (020,110), (130,220) et (060)) avec une périodicité d00i égale à 1,5 nm.
Peu de bactéries sont observables sur les clichés de microscopie électrique à balayage ces dernières sont emprisonnées dans les agglomérats,
c) composé CieTMS -triéthoxyphénylsilane
cl ) Effet de différents solvants biodégradables en substitution de l'éthanol sur la viabilité de Bacillus subtilis après synthèse
Dans un bêcher de 500mL, ajout de 9,72 g de nitrate de magnésium hexahydraté (MgN03, 6H20) (99%, Sigma Aldrich) et de lOOmL de solvant biodégradable (Glycérol (Quaron > 99,5%) ou Propylène glycol (VWR) ou méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean commercialisé par Solvay) sous agitation à 55°C à 220 tours par min pendant 15 minutes. Ajout sous agitation pendant 15 minutes de 7,71 g de triéthoxyphénylsilane (97%, Sigma Aldrich) et de 2,29 g d'hexadécyltriméthoxysiiane (>85%, Sigma). Ajout de 20 ml_ de milieu de culture de Bacillus subtilis (accessible sous le numéro CIP 52.62 de l'institut Pasteur) à 6,50xl07 ufc/ml (le milieu de culture a été préparé dans un bioréacteur de 3L par ensemencement de Bacillus subtilis dans 20 mL de milieu de BHI (OXOID) puis incubation 18-24 h à 30 °C, 200 tours par minute). Ajout de 70 mL de NaOH IM (>97 %, Sigma Aldrich) (pH 10) et mise sous agitation 24h. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C dans l'obscurité avec 60% d'humidité relative afin de déterminer la concentration en microorganismes à To (No), To+24h (N24h) et To+14jrs (Ni4j) après synthèse. Les résultats sont présentés dans le tableau 8 ci-dessous. Tableau 8 : concentration en microorganismes à To (No), To+24h (N24h) et To+14jrs (NMJ) après synthèse en fonction du solvant utilisé pour ia synthèse
La viabilité des microorganismes est maintenue au moins 14 jours après synthèse avec le glycérol, le propylène glycol ou le Polarclean comme solvant. Ce résultat confirme que des solvants biodégradables peuvent être utilisés pour l'encapsulation de BaciHus subti/is.
c2) Effet de différents solvants biodégradables en substitution de l'éthanol sur ia viabilité de BaciHus subti/is après synthèse et conservation à 4°C et 22° C pendant 15 jours
Dans un bêcher de 2000mL, ajout de 97,2 g de nitrate de magnésium hexahydraté (MgN03, 6H20) (99%, Sigma Aldrich) et de lOOOmL de solvant biodégradable (Glycérol (Quaron > 99,5%) ou méthyl-5- (diméthylamino)-2-méthyl-5-oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean)) sous agitation à 55°C à 220 tours par min pendant 15 minutes. Ajout sous agitation pendant 15 minutes de 77,1 g de triéthoxyphénylsilane (97%, Sigma Aldrich) et de 22,9 g d'hexadécyltriméthoxysilane (>85%, Sigma). Ajout de 200 mL milieu de culture de BaciHus subti/is (accessible sous le numéro CIP 52.62 de l'institut Pasteur)à 6,50xl07 ufc/ml (le milieu de culture a été préparé dans un bioréacteur de 3L par ensemencement de BaciHus subtiiis dans 20 mL de milieu de BHI (OXOID) puis incubation 18- 24 h à 30 °C, 200 tours par minute). Ajout de 700 mL de NaOH IM (97 %, Sigma Aldrich) (pH 10) et mise sous agitation 24h. 2 échantillons de 500 mL du mélange sont réalisés. A l'obscurité, un échantillon est maintenu en étuve à +22°C ± 2°C avec une humidité relative de 30%, l'autre est placé à +4 ±2 °C avec une humidité relative de 65% pendant 15 jours. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C afin de déterminer la concentration en bactéries à To (N0), To+24h (N24h) et To+15j (Nisj). Les résultats sont présentés dans le tableau 9 ci-dessous.
Tableau 9 : concentration en microorganismes à To (N0), To+24h (N24h) et To+15jrs (Nisj) après synthèse en fonction du solvant utilisé pour ta synthèse et de ia température de conservation.
La viabilité de Baciiius subtiiis est main enue à +4°C et +22°C au moins 15 jours après synthèse avec le glycérol ou le Polarclean comme solvant. Ce résultat confirme que des solvants biodégradables peuvent être utilisés pour l'encapsulation de Baciiius subtiiis.
c3) Effet de l'encapsulation (synthèse par solvants biodégradables en substitution de l'éthanol) sur la viabilité de Baciiius subtiiis après traitement thermique
La synthèse est identique à celle de l'exemple 2.1c2 avec du Glycérol (Quaron > 99,5%) ou du méthyl-5-(diméthylamino)-2-méthyl-5- oxopentanoate (RHODISOLV® Polarclean) comme solvant. 2 échantillons de 500mL du mélange sont réalisés. A l'obscurité, 45 échantillons de 9mL sont prélevés. 3 lots de 15 échantillons sont constitués et placés respectivement en étuve (30% d'humidité relative) à +40°C, +60°C et +80°C ±2°C. Parallèlement à l'obscurité, 3 lots de 15 échantillons de microorganismes non encapsulés sont également constitués et placés respectivement en étuve (20% d'humidité relative) à +60°C et +80°C ±2°C. Les montées aux températures de consignes sont calibrées sur une durée de 30 minutes aux termes desquelles, les tubes sont maintenus 2min, 5min et 10 minutes à température de consigne à cœur avant retrait des tubes pour dénombrement. 3 tubes sont ainsi prélevés pour chaque modalité de microorganismes et de température. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C afin de déterminer la concentration en bactéries à To (Nomin), To+2min (N2min), To+5min (N5min) et To+10 min (Niomin)· Les résultats sont présentés dans le tableau 10 ci-dessous.
Tableau 10 : concentration en microorganismes à To (Nom/nX To+2min (N 2min)/ To+5min (Nsmin) et To+10 min (N10min) après traitement thermique en fonction du solvant utilisé pour ta synthèse et de ia température du traitement thermique.
Pour les synthèses au glycérol et au Polarclean, les traitements révèlent une quasi insensibilité thermique de BaciHus subtiiis encapsulée comparativement à BaciHus subtiiis non encapsulée (à 10min, respectivement 2,00xl06 ufc/mL et 4,80xl06 ufc/ml) alors que la concentration en BaciHus subtiiis non encapsulée décroit fortement (4, 24xio4 ufc/ml à 2min). A la lecture des résultats, la protection thermique apportée par l'encapsulation est confirmée. Exemple 2.2 : encapsulation de Piriformospora indica
a) composé CI6TMS PI
Le champignon Piriformospora indica (P. indica) (accessible sous le numéro DSM 11827 du Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie) est dans un premier temps placé dans un incubateur (boîte de 140 mm de diamètre) pendant 72h à 28 ± 1°C, avec une gélose YCG afin d'obtenir une culture fraîche. Le mycélium est recueilli à l'aide d'une spatule stérile puis introduit dans un erlenmeyer contenant une solution de tween 80 à 0,5% ainsi que des billes. Après 2 minutes d'agitation, un dénombrement en milieu solide est réalisé afin de déterminer la concentration de départ (N0, en ufc/mL).
5,56 g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont dispersés dans 100 mL d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba). Le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 10g d'hexadécyltriméthoxysilane (Cl6TMS) (>85%, Sigma) sont ensuite ajoutés L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. La formulation est ensuite ensemencée à 10 % avec une préculture de P. Indica . Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 9000 tours par min durant 10 min), lavé trois fois à l'eau distillée avant d'être surgelé et lyophilisé durant 48h (échantillon de référence CI6TMS PI). A titre de comparaison, un échantillon est préparé dans les mêmes conditions en l'absence de P. Indica .
L'analyse par diffraction de rayons X indique que dans les deux cas une phase lamellaire est obtenue avec une périodicité dooi égale à 1,53 nm pour l'échantillon CI6TMS PI et à 1,60 nm pour le composé sans P. Indica . Les clichés MEB de l'échantillon CI6TMS PI montre la présence de formes très proches des hyphes observés avec le champignon seul Hyphes (large d'environ 2pm) recouverts de particules de matériau. Le champignon est donc encapsulé sous sa forme végétative (hyphes + conidiophores) dans le matériau de formule I selon l'invention,
b) composé CI6TMS -triéthoxyphénylsilane
bl) Effet du alvcérol en substitution de l'éthanol sur ia viabilité de
Piriformospora indica après synthèse
Dans un bêcher de 500mL, ajout de 9,72 g de nitrate de magnésium hexahydraté (MgNC , 6H20) (99%, Sigma Aldrich) et de lOOmL de solvant biodégradable (Glycérol (Quaron > 99,5%)) sous agitation à 55°C à 220 tours par min pendant 15 minutes. Ajout sous agitation pendant 15 minutes de 7,71 g de triéthoxyphénylsilane (97%, Sigma Aldrich) et de 2,29 g d'hexadécyltriméthoxysilane (>85%, Sigma). Ajout de 20 mL de milieu de culture de Piriformospora indica (accessible sous le numéro DSM 11827 du Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie) à 3,00xl07 ufc/ml. Ajout de 70 mL de NaOH IM (>97 %, Sigma Aldrich) et mise sous agitation 24h. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C dans l'obscurité avec 60% d'humidité relative afin de déterminer la concentration en microorganismes à To (N0), To+24h (N24h) et To+14jrs (NHJ) après synthèse. Les résultats sont présentés dans le tableau 11 ci-dessous.
Tableau 11 : concentration en microorganismes à To (N0), To+24h (N24h) et To+14jrs (Ni ) après synthèse
La viabilité des microorganismes est maintenue au moins 14 jours après synthèse avec le glycérol comme solvant. Ce résultat confirme que des solvants biodégradables peuvent être utilisés pour l'encapsulation de Piriformospora indica.
b2) Effet du alvcérol en substitution de l'éthanol sur fa viabilité de Piriformospora indica après synthèse et conservation à 4°C et 22°C pendant 30 jours
Dans un bêcher de 2000mL, ajout de 97,2 g de nitrate de magnésium hexahydraté (MgN03, 6H2O) (99%, Sigma Aldrich) et de lOOOmL de solvant biodégradable (Glycérol (Quaron > 99,5%)) sous agitation à 55°C à 220 tours par min pendant 15 minutes. Ajout sous agitation pendant 15 minutes de 77,1 g de triéthoxyphénylsilane (97%, Sigma Aldrich) et de 22,9 g d'hexadécyltriméthoxysilane (>85%, Sigma). Ajout de 200 mL milieu de culture de Piriformospora indica (accessible sous le numéro DSM 11827 du Max-Planck-Institut für terrestrische Mikrobiologie) à 3,00xl07 ufc/ml. Ajout de 700 mL de NaOH IM (97 %, Sigma Aldrich)et mise sous agitation 24h. 2 échantillons de 500 mL du mélange sont réalisés. A l'obscurité, un échantillon est maintenu en étuve à +22°C ± 2°C avec une humidité relative de 30%, l'autre est placé à +4 ±2 °C avec une humidité relative de 65% pendant 30 jours. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C afin de déterminer la concentration en champignons à To (N0), To+24h (N24h), To+15j (Ni¾) et To+30j (N30j). Les résultats sont présentés dans le tableau 12 ci- dessous.
Tableau 12 : concentration en microorganismes à To (No), To+24h (N24h), To+15jrs (N15J) et To+30j (N30j) après synthèse en fonction de la température de conservation.
La viabilité de Piriformospora indica est maintenue à +4°C et +22°C au moins 15 jours après synthèse avec le glycérol comme solvant. Ce résultat confirme que le glycérol peut être utilisé pour l'encapsulation de Piriformospora indica.
b3) Effet de l'encapsulation (synthèse par le alvcérol en substitution de l'éthanol) sur la viabilité de Piriformospora indica après traitement thermique
La synthèse est identique à celle de l'exemple 2.2b2. 2 échantillons de 500mL du mélange sont réalisés. A l'obscurité, 45 échantillons de 9mL sont prélevés. 3 lots de 15 échantillons sont constitués et placés respectivement en étuve (30% d'humidité relative) à +40°C, +60°C et +80°C ±2°C. Parallèlement à l'obscurité, 3 lots de 15 échantillons de microorganismes non encapsulés sont également constitués et placés respectivement en étuve (20% d'humidité relative) à +40°C, +60°C et +80°C ±2°C. Les montées aux températures de consignes sont calibrées sur une durée de 30 minutes aux termes desquelles, les tubes sont maintenus 2min, 5min et 10 minutes à température de consigne à cœur avant retrait des tubes pour dénombrement. 3 tubes sont ainsi prélevés pour chaque modalité de microorganismes et de température. Un dénombrement en milieu solide sur boite de pétri (90 mm de diamètre) est réalisé à 37°C afin de déterminer la concentration en champignons à To (Nomin), To+2min (N2min), To+5min (N5min) et To+10 min (Ni0min). Les résultats sont présentés dans le tableau 13 ci-dessous.
Tableau 13 : concentration en microorganismes à To (Nomin), To+2min (N2min) To+5min (N 5mm) et To-hlO min (N10min) après traitement thermique en fonction de ia température du traitement thermique.
Pour les synthèses au glycérol, les traitements révèlent la moindre sensibilité thermique de Piriformospora indica encapsulée comparativement à Piriformospora indica non encapsulée (à 60°C/2min, 4,40xl04 ufc/mL contre 7,10xl03 ufc/ml ; à 60°C/5min 4,55xl04 ufc/mL contre 9,06xl03 ufc/ml ; à 60°C/10min l,95xl04 ufc/mL contre l,31xl02 ufc/ml ; à 80°C/2min , 1,50x1o1 ufc/ml_ contre 0,00x100 ufc/ml). A la lecture des résultats, la protection thermique apportée par l'encapsulation est confirmée.
Exemple 2.3; encapsulation de spiruline
a) composé C-16 algue
2 g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont dispersés dans 20 mL d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba). Le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. Ig de spiruline {cyanobacterium Arthrospira platensis commercialisée sous la dénomination SPIRULINA NATURAL par la société EARTHRISE®) est introduit dans le milieu puis 1,111 g d'hexadécyltriméthoxysilane (CI6TMS) (>85%, Sigma) sont ensuite ajoutés à chaque mélange. L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 9 par addition de 9 mL d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, le solide est séparé de la solution par centrifugation (vitesse de 10000 tours par min durant 10 min), lavé à trois reprises avec de l'éthanol avant d'être séché dans une étuve à 40°C durant 48h. Le composé obtenu est ensuite broyé dans un mortier en agate avant d'être caractérisé et dénommé C-16 algue. A titre de comparaison, un échantillon a également été préparé en l'absence de spiruline (échantillon de référence Talc classique).
L'analyse par diffraction de rayons X indique que dans les deux cas une phase lamellaire de structure de type talc est obtenue avec une périodicité dooi égale à l,6nm dans les deux cas (présence de pics de diffraction dans les domaines angulaires 2-10°2 thêta, 15-25°2 thêta, 30-40°2 thêta et 55- 65°2 thêta correspondant respectivement à des réflexions sur les plans réticulaires (001), (020 ; 110), (130 ; 220) et (060 :330)). La présence de spiruline n'inhibe pas la formation du matériau. La présence de spiruline n'induit pas d'augmentation de la périodicité d0oi· La spiruline est donc bien encapsulée sous sa forme végétative (structure torsadée) dans le matériau selon l'invention.
Exemple 3 : Evaluation de la capacité de solubilisation d'un phosphate non soluble dans l'eau à l'aide d'un composé selon l'invention
a) Préparation de la bactérie encapsulée :
10 g de nitrate de magnésium hexahydraté (99%, Sigma Aldrich) sont ajoutés à 20 mL d'éthanol absolu (99,9%, Carlo Erba). Le mélange est maintenu sous agitation jusqu'à dissolution complète. 10 g de phényltriméthoxysilane (98%, ABCR) sont ensuite ajoutés sous agitation. Sous agitation, le mélange est ensemencé à 10 % v/v d'une préculture de Bacillus subti/is CIP 52.62 de concentration 108 ufc/mL. L'ensemble est laissé sous agitation puis le pH de la solution est porté à une valeur de 10 par addition d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium (>97 %, Sigma Aldrich) de concentration IM. Après 24h d'agitation à température ambiante, un dénombrement bactérien est réalisé sur l'ensemble ensemencé définissant la concentration bactérienne à 1,7 x 105 ufc/ml. b) Test de solubilisation :
Dans des erlenmeyers de 200mL, un milieu de culture liquide (glucose, lOg/L ; MgCI2.6H20, 5g/L ; MgS04.7H20, 0,25g/L ; KCI, 0,2g/L ; (NH4)2S04, 0,lg/L) de pH 7,0, additionné d'une source de phosphore insoluble en milieu aqueux (NH4MgP04«6H20, 8,9g/erlenmeyer) est préparé.
Chaque erlenmeyer est ensuite ensemencé de lmL d'une préculture de Bacillus subtHis CIP 52.62 (Institut Pasteur) à la concentration de 6,5xl04 ufc/mL (libre) ou de 382,3 m!_ d'une préculture de Bacillus subtilis CIP 52.62 à la concentration de 1,7 x 105 ufc/ml (composé selon l'invention 100%Phényl BS : bactérie encapsulée préparée selon l'exemple 3a). Les erlenmeyers sont maintenus en étuve sous agitation. Un dénombrement des colonies est réalisé tous les 2 jours ainsi qu'une mesure du pH et de la concentration en phosphore solubilisé et en phosphore immobilisé par la flore bactérienne (mesure du Phosphore total par ICP et mesure du phosphate inorganique en solution par HPIC). Les résultats sont présentés dans les figures 1 à 3. La comparaison de développement de Bacillus subtilis indique une meilleure capacité de solubilisation du phosphore non soluble eau (figure 1). La comparaison de développement de Bacillus subtilis indique une baisse du pH de la solution à corréler à la solubilisation d'origine bactérienne du phosphore (figure 2). La comparaison de la concentration en phosphore indique une solubilisation bactérienne plus importante que son immobilisation par la flore bactérienne (figure 3). On constate donc une meilleure croissance des bactéries encapsulées selon l'invention et une meilleure solubilisation du phosphore lorsque de telles bactéries sont utilisées.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'encapsulation d'un composé choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1, ledit matériau ayant la formule générale I suivante :
Nax[(Mg3)(Alx(RSi)4-x)08+x(0H)2] (I)
dans laquelle
x est un nombre tel que 0<x<l,2 et
R représente un groupe alkyle en C1-C30, un groupe aryle, un groupe (alkyle en Ci-C3o)aryle ou un groupe O-alkyle en C1-C30, le groupe alkyle pouvant être substitué par un groupe choisi parmi un groupe phényle, vinyle, aminopropyle ou mercaptopropyle.
le procédé comprenant :
a) la synthèse par voie sol-gel du matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2 :1 en présence du composé ;
b) la récupération du composé encapsulé dans le matériau de formule générale I.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que x=0 ;
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé est une substance active, avantageusement choisie dans le groupe constitué par un acide aminé, en particulier le tryptophane, une huile essentielle et leurs mélanges, de façon avantageuse, il s'agit du tryptophane.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé est un microorganisme, avantageusement choisi dans le groupe constitué par une bactérie telle que Bacillus subtiüs, une microalgue telle que la spiruline, un champignon tel que le Piriformospora indica, et leurs mélanges, de façon avantageuse, le microorganisme est sous forme végétative, plus particulièrement il s'agit d'une bactérie.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la source de silicium nécessaire à la synthèse du matériau de formule I de l'étape a) est un organoalcoxysilane ou un mélange d'organoalcoxysilanes de formule générale II suivante : RSi(OR')3 (II) dans laquelle
R est tel que défini dans la revendication 1 et
R' est un groupe méthoxy ou éthoxy.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la source de silicium est choisie dans le groupe constitué par le phényltriméthoxysilane de formule (a) suivante : Phényl-Si(OCH3)3 (a), le tétraéthylorthosilicate de formule (b) suivante : Si(OC2H5)4 (b), l'hexadécyltriméthoxysilane de formule (c) suivante : CH3(CH2)i CH2-Si(OCH3)3 (c) et leurs mélanges.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé encapsulé est une substance active et en ce que la source de silicium est un mélange d'organoalcoxysilanes de formule générale II, avantageusement un mélange entre le phényltriméthoxysilane (a) et le tétraéthylorthosilicate (b), de façon avantageuse le mélange comprend 20% en mol de tétraéthylorthosilicate et 80% en mol de phényltriméthoxysilane par rapport au nombre de mol total du mélange.
8. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé encapsulé est un microorganisme et en ce que la source de silicium est choisie dans le groupe constitué par la phényltriméthoxysilane (a) et rhexadécyltriméthoxysilane (c).
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 et 5 à 7, caractérisé en ce que le composé encapsulé est une substance active et en ce que l'étape a) comprend les étapes successives suivantes :
al) Ajout d'une source de magnésium, avantageusement du nitrate de magnésium hexahydraté, de la substance active, de la source de silicium, dans le cas où x¹0, de la source d'aluminium, avantageusement de l'acétylacétonate d'aluminium et d'un éventuel solvant;
a2) ajustement du pH à entre 8 et 14, avantageusement à 10 ;
a3) agitation du mélange, avantageusement pendant une durée comprise entre 1 et 24 heures, en particulier au moins 12 heures, de façon à obtenir un gel ;
a4) récupération de la phase solide du gel obtenu à l'étape a3) ;
a5) séchage de la phase solide du gel obtenu à l'étape a4).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1, 2, 4 à 6 et 8, caractérisé en ce que le composé encapsulé est un microorganisme et en ce que l'étape a) comprend les étapes successives suivantes :
al) ajout d'une source de magnésium, avantageusement du nitrate de magnésium hexahydraté, du microorganisme, d'un solvant, d'une source de silicium et dans le cas où x¹0, de la source d'aluminium, avantageusement de l'acétylacétonate d'aluminium ;
a2) ajustement du pH à entre 8 et 14, avantageusement à 10 ; a3) agitation du mélange, avantageusement pendant une durée comprise entre 1 et 24 heures, en particulier au moins 12 heures, de façon à obtenir un gel.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes successives suivantes après l'étape a3) de :
a4) récupération de la phase solide du gel obtenu à l'étape a3) ;
a5) séchage de la phase solide du gel obtenu à l'étape a4).
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisé en ce que le microorganisme se trouve sous la forme d'une préculture dudit microorganisme, avantageusement ayant une teneur en microorganisme comprise entre 103 et 1010 ufc/ml, et en ce qu'il comprend une étape préalable avant l'étape a) de préparation de la préculture de microorganisme.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications 11 ou 12, caractérisé en ce que l'étape de séchage a5) consiste en une lyophilisation.
14. Composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1, ledit matériau ayant la formule générale I suivante :
Nax[(Mg3)(Alx(RSi)4-x)08+x(0H)2] (I)
dans laquelle
x est un nombre tel que 0<x<l,2 et
R représente un groupe alkyle en C1-C30, un groupe aryle, un groupe (alkyle en Ci-C3o)aryle ou un groupe O-alkyle en C1-C30, le groupe alkyle pouvant être substitué par un groupe choisi parmi un groupe phényle, vinyle, aminopropyle ou mercaptopropyle.
le composé encapsulé étant choisi dans le groupe constitué par au moins une substance active, au moins un microorganisme et leurs mélanges.
15. Composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13.
16. Composition, avantageusement destinée à la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux, comprenant le composé encapsulé dans un matériau hybride organique-inorganique de structure lamellaire de type 2:1 selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 et un excipient approprié.
17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce qu'elle se trouve sous forme solide, en particulier sous forme de poudre, de granulés ou de microgranulés, sous forme liquide ou sous forme de gel.
18. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 ou 17, caractérisée en ce qu'elle comprend en outre des nutriments avantageusement choisis dans le groupe constitué par l'azote, le phosphore, le potassium, le calcium, le magnésium, le silicium, les oligoéléments et leurs mélanges, des matières premières organiques et/ou des matières premières minérales.
19. Utilisation du composé selon l'une quelconque des revendications 14 ou 15 ou de la composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18 pour la fertilisation, la nutrition, la stimulation de la croissance et/ou la prophylaxie des végétaux et/ou l'amélioration des propriétés physiques, chimiques et/ ou biologiques du sol ou du substrat de culture des végétaux.
20. Utilisation selon la revendication 19 par application foliaire, racinaire, plein champ ou hors-sol.
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