EP3652199A1 - Verfahren zur herstellung von block-polymeren mittels verknüpfung von blöcken durch eine transpeptidase und block-polymere erhalten durch transpeptidase-verknüpfung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von block-polymeren mittels verknüpfung von blöcken durch eine transpeptidase und block-polymere erhalten durch transpeptidase-verknüpfung

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EP3652199A1
EP3652199A1 EP18740553.5A EP18740553A EP3652199A1 EP 3652199 A1 EP3652199 A1 EP 3652199A1 EP 18740553 A EP18740553 A EP 18740553A EP 3652199 A1 EP3652199 A1 EP 3652199A1
Authority
EP
European Patent Office
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block
blocks
sequence
peptidic
transpeptidase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP18740553.5A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich GLEBE
Xiaolin Dai
Alexander BÖKER
Martin Schmidt
Ulrich Schwaneberg
Felix Jakob
Diana MATE
Tayebeh Mirzaei GARAKANI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C07K14/43586—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects from silkworms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
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    • C08G69/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming a carboxylic amide link in the main chain of the macromolecule
    • C08G69/02—Polyamides derived from amino-carboxylic acids or from polyamines and polycarboxylic acids
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    • C08G69/10—Alpha-amino-carboxylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/2207—Sortase A (3.4.22.70)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12Y304/22—Cysteine endopeptidases (3.4.22)
    • C12Y304/22071—Sortase B (3.4.22.71)

Definitions

  • Block polymers are a class of substances in which several blocks which have the same or a different chemical structure or are made up of identical monomers are bonded to one another.
  • Block polymers can also be present in particular in a defined sequence. Such polymers can be synthesized either by sequential polymerization of various monomers or by linking existing blocks with corresponding reactive end groups.
  • block polymers In the case of block copolymers, in which blocks are linked with different structures, it is often not possible or very difficult to form a specific sequence of blocks.
  • block copolymers of polystyrene and poly (methyl methacrylate) can only be synthesized by anionic polymerization in the order of styrene and then methyl methacrylate. To achieve the reverse sequence of the blocks, a complex multi-step procedure had to be developed.
  • Block copolymers can also be linked by "click chemistry" reactions, such as the copper-catalyzed azide-alkyne cycloaddition and the Diels-Alder cycloaddition, in which functional groups are available Groups that are accessible to "click chemistry” can either be incorporated into existing blocks, or based on these functional groups, the blocks can be built using transition-metal catalysts, but a major disadvantage of these "click reactions” is that Unspecific double bonds can be attached to any diene (Diels-Alder reactions) or nonspecifically linked to azides and alkynes (azide-alkyne cycloaddition).
  • the present invention is a process for the preparation of block polymers, which is improved with respect to the abovementioned disadvantages. Block polymers which can be prepared by this process are the subject of further independent claims.
  • Disclosed in accordance with the invention is a process for the preparation of block polymers comprising a first and a second block with the process steps:
  • first and second blocks are independently selected from: nanoparticles, nonpeptidic
  • Such an inventive method makes it possible block polymers with different blocks of nano ⁇ particles, non-peptidic polymers, and recombinant Produce proteins in any order as long as this first and second block have the nucleophilic peptide sequence and the peptidic recognition sequence for a first transpeptidase enzyme.
  • Both the peptidic recognition sequence and the nucleophilic peptide sequence may have multiple amino acid peptide sequences or optionally also individual ones
  • Transpeptidase enzyme are.
  • the first block and the second block may be separated via the nucleophilic peptide sequence and the peptidic recognition sequence, optionally under
  • the present invention therefore provides a modular "modular system" for the targeted linking of any blocks
  • Transpeptidase enzyme provides complete control over the nature and sequence of the blocks and is as efficient as the "click reactions” known in the art, unlike the "click reactions”.
  • inventive enzyme-catalyzed process more control over the number and sequence of the blocks and in particular a synthesis of block polymers without the use of transition metal complexes such.
  • B. copper complexes the inventive allows the inventive enzyme-catalyzed process more control over the number and sequence of the blocks and in particular a synthesis of block polymers without the use of transition metal complexes such.
  • B. copper complexes the inventive allows the inventive enzyme-catalyzed process more control over the number and sequence of the blocks and in particular a synthesis of block polymers without the use of transition metal complexes such.
  • B. copper complexes such as copper complexes.
  • the inventive allows the inventive enzyme-catalyzed process more control over the number and sequence of the blocks and in particular a synthesis of block polymers without the use of transition metal complexes such.
  • B. copper complexes the inventive allows the inventive enzyme-catalyzed process more control over the number and sequence of the blocks and in particular a synthesis of block polymers without the use
  • the transpeptidase enzyme recognizes the peptide recognition sequence of the second block and forms an intermediate product between the peptidic recognition ⁇ sequence and an amino acid in the active site of the
  • Recognition sequence for example, oligopeptides or individual amino acids can be cleaved.
  • the nucleophilic peptide sequence of the first block can then regenerate the transpeptidase enzyme by means of nucleophilic attack on the intermediate product and the block polymer of the first and second block with a peptidic intermediate sequence located between the two blocks, the parts of the peptidic recognition sequence and the contains nucleophilic sequence, release.
  • the second block may be a first more
  • transpeptidase enzymes can be the same transpeptidase as the first transpeptidase enzyme already described above or can also be transpeptidases with other substrate specificities, which in particular have different peptidic recognition sequences compared to the first transpeptidase enzyme.
  • the first additional nucleophilic peptide sequence may in particular be blocked by a protective group.
  • a protecting group may include possible cross-reactivities between the first additional nucleophilic peptide sequence and the prevent nucleophilic peptide sequence already present in the first block during the linking of the first block with the second block in method step C).
  • the first further nucleophilic peptide sequence may also be suitable for the first transpeptidase enzyme, in which case the protective group particularly advantageously blocks the reaction of this first further nucleophilic peptide sequence during process step C).
  • the first additional nucleophilic peptide sequence may also be suitable for a transpeptidase enzyme different from the first transpeptidase enzyme.
  • Protecting groups are, in particular, also known compounds, such as, for example, fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) and / or tert-butyloxycarbonyl (t-Boc), which are prepared by using fluorenyloxymethyl chloride and / or di-tert-butyl dicarbonate at the amino or carboxy Groups can be generated.
  • fluorenylmethoxycarbonyl Fmoc
  • t-Boc tert-butyloxycarbonyl
  • a further variant of a method according to the invention is a method for producing a block polymer having at least three blocks, comprising the further method steps:
  • Such a method is particularly suitable for using a third block by means of the same first transpeptidase To bind enzyme.
  • removal of the protecting group of the first additional nucleophilic peptide sequence in step E) ensures that they are nucleophilic
  • Peptide sequence can be linked to the peptidic recognition sequence of the third block.
  • Method is particularly suitable in a step ⁇ wise process in which the blocks are selectively connected to each other in succession, to link the third block to an existing diblock from the first and second block.
  • the third block is added only after the process step E), the removal of the protective group to the reaction solution.
  • the first additional nucleophilic peptide sequence may also be different from the nucleophilic peptide sequence present in the first block and may in particular be used for a linkage reaction with a second, from the first
  • Transpeptidase different transpeptidase can be used.
  • the following further method steps are included:
  • the advantage is that a second transpeptidase enzyme recognizes a peptidic recognition sequence other than the first one
  • Transpeptidase enzyme is used to link the third block with the second block. The different ones
  • Substrate specificity of the second transpeptidase enzyme can prevent that in process step H) instead of the third Blocks still possibly present as impurities existing portions of the unlinked second block to the growing polymer chain.
  • Transpeptidase enzymes especially in some sortases, different sortase enzymes often have a different peptidic recognition sequence but the same nucleophilic sequence.
  • Sequence of the second block are removed, since such protecting groups also often prevent cross-reactions in different transpeptidase enzymes.
  • the process according to the invention can advantageously also be modified such that block polymers having at least four blocks, preferably at least six, are more preferred
  • At least eight blocks can be made.
  • at least one block preferably three blocks more preferably five more
  • Transpeptidase enzymes are provided and linked by means of this one or more transpeptidase enzymes and attached to the third block.
  • transpeptidase enzymes which correspond either to the first and / or second transpeptidase enzyme or to both of these
  • Transpeptidase enzymes have different substrate specificities. Even with such a method can each protective groups may again be present on the nucleophilic sequences, which prevent unwanted reactions.
  • blocks of different chemical structure can be linked to one another in a targeted manner, although the restrictions in the prior art regarding the sequence of the blocks do not exist
  • Polymer blocks such as polyethylene glycols or derivatives of
  • Polyethylene glycols and polyacrylamides or their derivatives are selectively linked together.
  • Manufacturing process can be used, completely artificial blocks, such as synthetic polymers (plastics) or small particles, such as nanoparticles
  • polymers are polymers which are composed of vinylic monomers, such as. For example: styrene and derivatives, vinylpyridines, acrylic acid and acrylic esters, methacrylic acid and methacrylic acid esters, acrylamides, N-substituted and N, disubstituted acrylamides, dienes, diacrylamides, dimethacrylates, acrylonitrile, 1-vinylimidazole and maleic anhydride.
  • biopolymers such as, for example, polyhydroxybutyrates, cellulose, chitin, Starch, polylactides and carbohydrates and combinations thereof.
  • biopolymers as blocks can also be linked particularly easily with synthetic polymers, such as plastics.
  • peptidic biopolymers in particular recombinant proteins, can also be used for the first, second and optionally present third and further blocks.
  • the peptidic biopolymers can be expressed in such cloning vectors in particular that they be ⁇ already have the peptide recognition sequence and optionally also the nucleophile sequence.
  • the peptidic recognition sequence may be present at the C-terminus of the recombinant proteins and the nucleophilic sequence at the N-terminus.
  • the peptidic biopolymers may in particular be selected from structural proteins, such as. B., elastin, fibroin, sericin, collagen and keratin and combinations thereof.
  • silk proteins such as. B.
  • Spider silk proteins which, in relation to their weight, have exceptional mechanical strength, in particular ductility and tear resistance. recombinant
  • Silk proteins such as. B. Spider silk proteins often can not be expressed in length, which in natural
  • Spider silk proteins are present, but only shortened. Since the mechanical load capacity but with the length of
  • Silk proteins increases, it is particularly advantageous by means of the inventive method blocks of recombinant silk proteins to link together and so to longer silk protein aggregates with improved mechanical
  • this process can also be used in particular for the preparation of branched block polymers.
  • At least one of the first, second and optionally present third and further blocks has at least three sequences selected from the pep ⁇ tidal recognition sequences and nucleophilic sequences for a transpeptidase enzyme to connect other blocks. Blocks with at least three sequences for the connection of
  • transpeptidase enzymes can be used, for example, for the preparation of graft polymers and graft copolymers and for the preparation of star-shaped compounds.
  • nanoparticles such as S1O 2 nanoparticles with a variety of
  • Sequences for connecting other blocks are provided so that these particles may have, for example, layers of block polymers on their surface, which were attached via transpeptidase enzymes.
  • sortases or fragments thereof such as sortase A, sortase B, sortase C, sortase D, sortase E and others can be used as transpeptidase enzymes
  • Transpeptidase enzymes such as butelase and / or trypsiligase.
  • a soluble, catalytic domain of the sortase enzyme sortase A SrtA of Staphylococcus aureus can also be expressed recombinantly (Bolscher, JG, et al. (2011) Sortase A as a tool for high-yield histatin cyclization.
  • This transpeptidase enzyme recognizes the peptidic recognition sequence -LPXTG, where amino acid X is any amino acid, e.g. Eg -LPETG or - LPATG.
  • Other variants of the sortase are, for example, the sortase B srtB of Staphylococcus aureus or Bacillus anthracis, which have a different peptidic recognition sequence -NP (Q / K) TN than srtA (Maresso, A. W. et al., J. Bacteriol.
  • Classes C, D and E with different peptidic recognition sequences are also known (Spirig, T. et al., Mol. Microbiol., 2011, 82, 1044 and Bradshaw, W.J., et al., FEBS J. 2015, 282, 2097). Sortases of class C and D have the peptidic recognition sequences - (I / L) (P / A) XTG (class C) and -QVPTG or -LPNTA (class D) and class E sortases the recognition sequence -LAXTG.
  • Sortase A can generally comprise a whole series of peptidic recognition sequences of the general sequence - (M / L / V) (P / T / A / S) X (A / L / T / S / V / I) G
  • Butelase 1 an Asn / Asp (Asx) peptide ligase can be used (GK Nguyen, et al., Nat. Chem. Biol., 2014, 10, 732-738). This transpeptidase enzyme has the peptidic
  • the peptide substrate is cleaved between Y and RH if Y is present, resulting in an intermediate sequence -YRH- between two blocks linked by the trypsiligase.
  • peptidic recognition sequences can therefore be selected independently of one another from the following sequences in methods according to the invention:
  • Amino acid is and the parameter z can be 0 or 1.
  • the recognition sequences are dependent on the classes of the transpeptidase enzymes, in particular the classes of the sortases and butelase.
  • the nucleophilic sequences may be independently selected from:
  • nucleophilic sequences can be referred to as - (X) 1-5-.
  • nucleophilic sequence is Y-RH.
  • sortase enzymes recognize different peptidic recognition sequences, but have the same nucleophilic sequence - (G) 1-5, preferably - (G) 1-3, or also - (A) 1-5.
  • the catalytic mechanism of a sortase catalyzed reaction begins by cleaving the last amino acid of the peptidic recognition sequence and linking the remaining peptidic recognition sequence to a reactive cysteine residue in the active site of the sortase enzyme.
  • the thioester-acyl intermediate can now be nucleophilically attacked by the N-terminal amino acid of a nucleophilic sequence which contains an oligoglycine or an alanine motif for most sortases and which may be any amino acid in butelase. This results in a peptide bond between the two substrates, the polymer blocks with parts of the peptidic recognition sequence and the
  • nucleophilic sequence formed as a peptidic intermediate sequence and regenerates the sortase enzyme. This peptidic
  • Intermediate sequence contains the just mentioned peptidic recognition sequence without the cleaved during the catalytic reaction amino acids, said remaining peptidic recognition sequence is attached to the nucleophilic sequence.
  • Having between 1 to 5 Glycine, and Zvi ⁇ rule 1 to 5 Alanine nucleophilic sequences are particularly suitable for nucleophilic groups of the thioester-acyl intermediates attack from the sortase enzyme, and the block having the peptide recognition sequence and so the Product of the reaction, the blocks linked by peptidic intermediate sequences and the enzyme sortase release.
  • transpeptidase enzymes in particular the sortases, catalyze an equilibrium reaction between the transpeptidation, the formation of a bond between the block with the peptidic recognition sequence and the block with the nucleophilic sequence, and the resolution of this bond to form the starting blocks, measures can be taken to the equilibrium of the reaction to move to the side of Transpepti ⁇ dation. This can be ensured in particular by the fact that during the formation of the transpeptidase enzymes, in particular the sortases, catalyze an equilibrium reaction between the transpeptidation, the formation of a bond between the block with the peptidic recognition sequence and the block with the nucleophilic sequence, and the resolution of this bond to form the starting blocks, measures can be taken to the equilibrium of the reaction to move to the side of Transpepti ⁇ dation. This can be ensured in particular by the fact that during the formation of the
  • Peptide bond between the two blocks cleaved amino acids or oligopeptides are irreversibly removed from the equilibrium ⁇ reaction.
  • a histidine can be linked behind the amino acid which is split off from the peptidic recognition sequence during the sortase reaction, which is frequently a glycine, so that the cleaved oligopeptide can then be cleaved for example by complexing with Ni 2+ , Co 2+ , Cu 2 + or Fe 2+ can be completely removed from equilibrium.
  • both the sequence of the peptidic recognition sequence and the nucleophilic sequence can be constructed in such a way that, after ligation by the transpeptidase enzyme, they together form a beta-hairpin structure which can not be attacked by the transpeptidase, so that the Balance of the reaction is shifted in the direction of transpeptidation.
  • beta-hairpin structures for example, by the
  • peptidic recognition sequence as well as in the nucleophilic sequence can be integrated.
  • nucleophilic groups may be, for example, at the C-terminus of the peptidic
  • transpeptidase enzyme e.g. B. the sortase
  • the sortase may preferably be in soluble form, for example without a transmembrane domain and with a His tag at the N-terminus.
  • the preferred expression system is, for example, Escherichia coli, which can express proteins in high yields recombinantly.
  • the purification of the trans-peptidase enzyme can then be carried out, for example, by means of Ni 2+
  • a buffer may be employed which, to ensure the enzymatic activity of the transpeptidase enzyme, contains between 40 to 60 mM of a buffer having a pH between 6.8 and 7.8, preferably 7.5, e.g. Tris-HCl.
  • the buffer solution may further comprise between 100 to 200 mM of an alkali metal halide, e.g. NaCl, as well as about 4 to 8 mM of one
  • Alkaline earth metal halides e.g. As CaCl 2 included.
  • Reaction can be carried out at temperatures between 25-40 ° C, preferably between 28 ° C and 37 ° C.
  • DNP Dinitrophenyl
  • the starting block with which the process for preparing the block polymers is introduced, may be immobilized on a solid phase, for example beads, such as polystyrene beads, in order to make purification between the individual reaction steps particularly easy.
  • a solid phase for example beads, such as polystyrene beads
  • unlinked and unreacted blocks with the peptidic recognition sequences and / or nucleophilic sequences can be removed by purification by means of purification, so that they do not lead to undesirable side reactions in the next crosslinking step.
  • the block polymers may, for. B. linked via divinylbenzene polystyrene beads with a loading in the range 0.2-1 mmol / g of functional groups for Connection can be used. The binding of the blocks takes place z.
  • Example by an ester bond to a 4-alkoxybenzyl alcohol or by an amide bond to a 4-Alkoxybenzyl- oxycarbonylhydrazid The final block polymers can be cleaved from the polystyrene beads by trifluoroacetic acid without affecting the peptide bonds in the block polymers.
  • a peptide amide is formed upon cleavage.
  • aqueous medium protrude.
  • the subject of the present invention is furthermore a
  • AI providing a plurality of blocks with one
  • nucleophilic sequence and a peptidic recognition sequence for at least one transpeptidase enzyme
  • a "plurality of blocks” is understood to mean at least three blocks.
  • the method of the invention can be a ⁇ undesirables number of blocks are preferably connected between 3 to 50, more preferably at least three to 30 units, most preferably between 4 to 10 blocks together.
  • spider silk proteins in particular up to 5 blocks can be linked together.
  • all features already described above also apply.
  • the number of blocks linked by the methods of the invention can be reduced without substantially reducing the overall length of the resulting block polymers.
  • the nucleophilic sequence may be blocked by a protective group at least in some, preferably in all of the plurality of blocks, in which case the protecting groups are removed in step Bl) prior to linking.
  • the protecting groups block the nucleophilic ones
  • the plurality of blocks in method step B1) can be linked step-by-step block by block.
  • Such a process allows a particularly controlled synthesis of block polymers block by block and allows in particular, to produce block copolymers with a defined sequence of the blocks. Such control over the linkage of the blocks is often difficult or impossible with conventional synthetic methods for block copolymers.
  • the plurality of blocks can also be linked in a one-pot process.
  • all blocks with nucleophilic sequences and peptidic recognition sequences can be particularly easily replaced by one in the reaction solution
  • transpeptidase are linked in a reaction vessel by means of a reaction step.
  • Such a one-pot process can be particularly advantageous when block polymers are to be produced which do not have to have a defined sequence of blocks and / or which can have a size distribution without a defined size.
  • Transpeptidase enzymes are provided in the reaction solution simultaneously and preferably this
  • transpeptidase enzymes also have different nucleophilic sequences.
  • blocks having a plurality of attached peptidic recognition sequences for different transpeptidase enzymes as output ⁇ compounds can be used, then only the one in Step by means of various transpeptidases more blocks can be coupled.
  • the present invention also provides block polymers having at least a first block 1 and a second block 2 having the following structure:
  • Block 1 and Block 2 are bridging
  • peptidic cut-off sequence 1 contains a sequence or is a sequence selected from the following group:
  • SPKT (A) is, APAT (G) i- 5, APAT (A) i_ 5 and LPEC (G) 1-5,
  • LPEC (A) is, - (M / L / V) (P / T / A / S) X (A / L / T / S / V / 1) (G) 1-5 and - (M / L / V) (P / T / A / S) X (A / L / T / S / V / I) (A) i_ 5, in particular -LPXT (G) 1-5-, -LPXT (A) 1-5 -, -NPQT (G) 1-5-, -NPQT (A) 1-5-, where X is any amino acid,
  • Block 1 and Block 2 are independently selected from:
  • Nanoparticles, non-peptidic polymers, and recombinant proteins The sequence of the peptidic intermediate sequence 1 runs as usual in protein sequences from the N to the C-terminus. Intermediate sequence 1 is built up from parts of the peptidic recognition sequence, of which the C-terminus is at least an amino acid, typically glycine, is cleaved during the transpeptidase-catalyzed reaction and the remainder of the peptidic recognition sequence is joined to the nucleophilic sequence (often glycine or alanine).
  • the nucleophilic sequence often glycine or alanine
  • the above-described peptidic intermediate sequence 1 therefore builds from the N-terminus on parts of the peptidic recognition sequence connected to the nucleophilic sequence, wherein the above-described cut-to-size sequences comprise 1 part of the peptidic recognition sequences of the already known
  • Sortases A to E include.
  • the short peptidic sequence of amino acids include amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids, amino acids
  • sequences -N (X) i_ 5 -, -D (X) i_ 5 - correspond to the intermediate sequences catalyzed by a Butelase
  • Ligation can be expected when the dipeptide -HV is cleaved from the peptidic recognition sequence of butelase.
  • This peptidic intermediate sequence 1, as well as the intermediate sequences to be described below can also be part of a longer peptidic sequence between the individual blocks.
  • additional peptide sequences or other chemical groups may be present as spacers between these sequences and the blocks bridged by them.
  • Block polymers according to a further aspect of the present invention may additionally comprise a third block 3 and thus have the following structure:
  • Block 1 -peptidic cut-off sequence 1-block 2
  • SPKT (A) is, APAT (G) i- 5, APAT (A) i_ 5 and LPEC (G) 1-5, LPEC (A) i_5, M / L / V) (P / T / A / S) A (A / L / T / S / V / I) (G) 1-5 and
  • Block 1, Block 2 and Block 3 are independently selected from:
  • Nanoparticles Non-peptidic polymers, and recombinant proteins.
  • the block polymers of the present invention can be built block-by-block, with between each two blocks
  • n additional blocks are independently selected from the corresponding group already described above, and
  • n is an integer between 1 and 50, preferably between 3 and 30, most preferably between 4 and 10.
  • the blocks may be non-peptidic polymers, which for example can be selected independently of one another from poly (methyl methacrylates), polyethylene glycols, acrylamides, and the polymers already described above, which are built up from vinylic monomers, or
  • Nanoparticles In particular, it is also possible, as blocks, in each case identical or different fragments of a
  • Block polymers and block copolymers prepared by the process of this invention can be used for a variety of applications, e.g. As polymer-based actuators, as components for solar cells, as materials for medical diagnostics and drug delivery, for organic light-emitting diodes (OLEDs), in micro ⁇ electronics or as multifunctional plastic materials.
  • polymer-based actuators for example for the automotive industry, a possible block of silicone or isoprene and another block of poly (2-vinylpyridine) may be constructed.
  • a possible block of silicone or isoprene and another block of poly (2-vinylpyridine) may be constructed.
  • the molecular weight distribution of the synthesized block copolymers must be narrow, which is particularly well possible by means of the production method according to the invention.
  • blocks comprising itaconic acid polymers or polyelectrolytes, such as polyvinyl pyridine, and / or coupling means of the Inventive Glucosemethacrylatpolymere ⁇ production method according to metallic nanoparticles, whereby these polymers are conductive.
  • polymers, especially non-peptidic polymers and biopolymers to make on nanoparticles a high density of the polymer blocks per nanoparticle can be achieved.
  • the various methods of preparation according to the invention and the various variants of block polymers and block copolymers according to the invention are also distinguished by the fact that the preparation, in contrast to many conventional preparation methods without transition metal catalysts takes place and therefore the final block polymers and block copolymers produced are thus free of transition metal catalysts. In conventional manufacturing processes, these transition metal catalysts must often be removed very expensive, which is especially for biological
  • FIG. 1 shows various aspects of production methods according to the invention in which nanoparticles, non-peptidic polymers and recombinant proteins can each be linked to one another.
  • FIG. 2 shows a variant of a method according to the invention either for block-wise directed assembly or by means of a one-pot reaction of block polymers and block copolymers containing non-peptidic polymers, as well as recombinant proteins which, for example, can also mimic a naturally occurring structure (biomimetic proteins ).
  • Figure 3 shows a possible non-peptidic polymer ⁇ blocks to be provided with end groups that the peptide
  • FIG. 4 shows in detail a possibility of a stepwise block-polymer synthesis with nucleophilic peptide sequences which are provided with protective groups.
  • FIG. 5 schematically shows various possibilities for the equilibrium reaction of a transpeptidase reaction in FIG.
  • FIG. 6 shows a diagram of a MALDI-ToF mass spectrum of reaction mixtures of linking reactions between nanoparticles and polymers as blocks produced according to a method according to the invention and of MALDI-ToF mass spectra of negative controls.
  • Figure 7 shows transmission electron micrographs (TEM) of nanoparticle-polymer hybrid particles prepared as block copolymers according to a method of the invention.
  • FIG. 8 shows a MALDI-ToF mass spectrum of blocks with peptidic recognition sequences and blocks with nucleophilic sequences, wherein the blocks are each non-peptidic
  • Figure 9 shows the design of polymer peptide (left)
  • Peptide polymer (right) Building blocks for transpeptidase-mediated ligation.
  • the arrow illustrates the direction of peptide synthesis by solid-phase peptide synthesis.
  • FIG. 10 shows the strategy for the synthesis of peptide-polymer building blocks using the example of two N-terminal glycines and the polymer poly (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM).
  • the gray spheres represent the resin of the peptide synthesis.
  • FIG. 11 shows the synthesis strategy for peptide-polymer (B) building blocks based on the example of several N-terminal amino acids and the polymer poly (dimethylaminoethyl methacrylate)
  • FIG. 12 outlines the strategy for the synthesis of
  • Polymer-peptide building blocks exemplified by a possible recognition sequence and the polymer PNIPAM.
  • the gray spheres symbolize the resin of the peptide synthesis.
  • FIG. 1 schematically shows different embodiments of methods according to the invention.
  • nucleophilic peptide sequence 10A on its surface.
  • These particles comprising nanoparticles coupled to a nucleophilic peptide sequence, can now be transcribed using a transpeptidase enzyme 40 with larger nanoparticles 60B, which are peptidic
  • Detection sequences 15A were provided.
  • the peptidic recognition sequences can analogously to the small nanoparticles 60A also by means of a
  • Double bonds are provided, which are then connected to the nucleophilic peptide sequence z. B. can be coupled by means of a "thiol click reaction".
  • non-peptidic polymers 20 for example, polyethylene glycol can be modified with a nucleophilic peptide sequence 10A.
  • the non-peptidic polymer blocks are coupled to the peptide recognition sequences ⁇ with nanoparticles so that hybrid materials composed of nanoparticles and non-peptidic polymers 60B are formed 20th
  • Figure 2 shows schematically a synthesis of block polymers and block copolymers wherein the synthesis is carried out stepwise for the individual polymer blocks or in a one-pot reaction.
  • a non-peptidic polymer 5 having a peptidic recognition sequence ⁇ 15A, B can be seen.
  • Reference numeral 15A, B denotes that it may be either the peptidic recognition sequence 15A for a first transpeptidase enzyme or also the peptidic recognition sequence 15B for a second enzyme different from the first transpeptidase enzyme.
  • this polymer block 5 also has a nucleophilic peptide sequence 10A, B which can be used either as a nucleophile by a first transpeptidase enzyme as sequence 10A or by a second transpeptidase enzyme as sequence 10B.
  • a transpeptidase By means of a transpeptidase
  • this non-peptidic polymer block 5 be gradually coupled with other polymer blocks.
  • this polymer block 5 with another polymer block 20, for example, also a non-peptidic polymer block on the peptidic
  • Detection sequence 15A of block 5 are linked.
  • the polymer block 20 has a nucleophilic
  • Peptide sequence 10A for a first sortase enzyme After ligation, a peptide intermediate sequence is present 10 ⁇ ⁇ and 15 ⁇ ⁇ between the two blocks 20 and 5.
  • FIG. About the nucleophilic peptide sequence 10B for a second sortase enzyme of the
  • Polymer block 5 are also coupled to another polymer block 30 having a peptidic recognition sequence 15B for the second sortase enzyme. After ligation, there is another peptidic cut-off sequence 10 ⁇ ⁇ and 15 ⁇ ⁇ between both blocks 5 and 30.
  • non-peptidic polymer blocks 5 and 30 can also be combined with polymer blocks 50 having recombinant proteins.
  • these recombinant proteins may mimic naturally occurring functions of proteins, for example, recombinant silk proteins, such as spider silk proteins, and hence may be referred to as biomimetic molecules.
  • FIG. 2 shows that by means of the transpeptidase enzymes 40, the non-peptidic polymer blocks 5 and 30 can be combined with protein polymer blocks or, for example, block polymers can be formed which consist exclusively of protein blocks 50.
  • FIG. 1 shows that by means of the transpeptidase enzymes 40, the non-peptidic polymer blocks 5 and 30 can be combined with protein polymer blocks or, for example, block polymers can be formed which consist exclusively of protein blocks 50.
  • FIG. 3 schematically shows a possibility how non-peptidic polymer blocks at their ends can be provided with nucleophilic peptide sequences and peptidic recognition sequences for the transpeptidase enzymes.
  • the peptidic recognition sequences 15 ⁇ and the nucleophilic sequences 10 are first prepared from the C-terminus to the N-terminus using peptide synthesizers. The production is shown schematically under point "1" in Figure 3, with the protein sequences shown there running analogously to the synthesis from the C-terminus to the N-terminus. can then be attached to the peptidic recognition sequence 15 ⁇ an initiator for example, a controlled radical polymerization or so-called RAFT CTAs 70 at the peptidic
  • RAFT English reversible addition fragmentation chain transfer
  • CTA English chain transfer agent
  • Double bond 76 can be installed. This end group with a double bond can be attached to the C-terminus, in particular after the peptide synthesis. This nucleophilic peptide sequence also still contains a protecting group 80, which later during coupling with other blocks
  • CRP Polymerization
  • ATRP ATRP
  • RAFT RAFT
  • Free radical polymerization polymer blocks with narrow molecular weight distribution can be synthesized.
  • the CTA group can be converted into a -SH group 75.
  • the nucleophilic sequence 10A can be converted via a so-called “thiol-click chemistry” via a reaction of -SH group 75 with the
  • Double bond 76 of the nucleophilic peptide group via the group formed thereby 85 are connected, so that a
  • Polymer block 5 is formed, at the ends of a
  • Peptide sequence 10A with a protecting group 80 are present.
  • Polymer blocks with recombinant proteins as blocks may for example, be produced particularly simply, that the recombinant proteins are already cloned at its C-terminus and N-terminus along with the peptide recognition sequences ⁇ and nucleophilic peptide sequences and then expressed.
  • Figure 4 shows a schematic flow of a fiction, ⁇ the production method according to the formation of block copoly- mers, wherein the peptide recognition sequences and nucleophilic peptide sequences are shown in greater detail.
  • the recognition sequence and nucleophilic peptide sequence of the sortase A srtA of Staphylococcus aureus are shown.
  • step C) then both blocks are joined together, wherein the C-terminal glycine of the peptidic recognition sequence 15A is cleaved, and a
  • Thioester-acyl intermediate between the sortase and the first block 5 forms (not shown in the figure).
  • further blocks for example a third block 30, can then be connected to the already existing linked blocks 20 and 5 in method steps D) and F).
  • the linkage between the nucleophilic peptide sequence 10A of the block 5 and the peptidic recognition sequence of the new block 30 is also accomplished by the sortase A.
  • the nucleophilic sequence of the third block 30 has a protecting group 80. This can then in another
  • FIG. 5 schematically shows a labeled "(a)" example of a sortase catalyzed linkage of two polymer ⁇ blocks 5 and 20 which have a peptidic recognition sequence 15A and a nucleophilic peptide sequence 10A.
  • the designated 40 equilibrium arrow indicates catalyzed by sortase When the two blocks 5 and 20 are linked together, an oligopeptide, 61, is also split off. Since the sortase 40 catalyzes an equilibrium reaction, the block copolymer formed from the polymer blocks 5 and 20 can also be attacked by cleavage
  • Oligopeptide 61 are cleaved as a nucleophile, wherein the starting compounds are reformed.
  • (b) is meant an alternative reaction procedure of a preparation method according to the invention in which both the peptidic recognition sequence 15A and the nucleophilic peptide sequence 10A have a spacer to the blocks 20 and 5 with the peptide sequence WTWTW- the pep- tidic cut-off sequence 15 ⁇ ⁇ , 10 ⁇ ⁇ due to the distance ⁇ holder to a beta-hairpin, which is no longer or only with difficulty accessible to a reverse reaction with the sortase.
  • polymer-polymer copolymers of polyethylene glycol (PEG) and poly (N-isopropyl acrylamide) (PNIPAM), nanoparticles which are surface-modified with PEG or nanoparticle nanoparticle conjugates are produced.
  • Nanoparticles were prepared by a sol-gel method with through ⁇ diameters of about 200 nm and 60 nm. These were 28 to 30 percent ammonia solution, distilled water and ethanol with molar concentrations of 5 mol / 1 for the water, 0.2 mol / 1 for the aqueous ammonia solution and 0.2 mol / 1 for tetraethyl orthosilicate for the nanoparticles with made of a diameter of 200 nm. For the
  • Nanoparticles with a diameter of 60 nm, 1 mol / 1 water, 0.2 mol / 1 aqueous ammonia solution and 0.2 mol / 1 tetraethyl orthosilicate were used.
  • a mixture of ethanol, Millipore water and ammonia was used.
  • the peptide synthesis of the peptide sequences with the nucleophilic sequence can be carried out with a MultiPep RSi synthesizer from INTAVIS Bioanalytical Instruments AG (Cologne) according to a
  • Standard Fmoc (fluorenylmethoxycarbonyl) protocol was either Fmoc-G preloaded or unloaded linked polystyrene and as solvent dimethylformamide (DMF).
  • the amino acids were activated with HBTU (2- (1H-benzotriazol-1-yl) -1,1,3,3-tetramethyluronium hexafluorophosphate) in DMF / NMM (N-methylmorpholine) and 2 times in 4-fold excess reacted with the peptide for 90 min.
  • the cleavage of the Fmoc protecting groups was carried out with piperidine and can be omitted as needed after the attachment of the last Fmoc-G derivative.
  • the peptides were cleaved off the resin by shaking in 2 ml of trifluoroacetic acid (TFA) / triisopropylsilane (TIPS) / water (92.5: 5: 2.5 v / v) solution. Subsequently, the peptides were washed by precipitating in 40 ml of ice-cold diethyl ether and centrifuging (2x 5000 rpm, 4 ° C) and isolated. The purification was carried out with an automated HPLC / ESI MS system. The synthesis of peptides with the peptidic
  • Recognition sequence was carried out analogously, but without a protective group.
  • NPs The 200 nm diameter nanoparticles (NPs) were probed with a peptide of the sequence H-Cys-Ile-Arg-His-Met-Gly-Phe-Pro-Leu-Arg-Glu-Phe-Leu-Pro-Glu-Thr -Gly-OH (peptide 1 to peptide recognition sequence of the sortase a) and the nano-particle- ⁇ (NP) with a diameter of 60 nm were obtained with a peptide of the sequence H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Glu- Arg Leu-Pro-Trp-Phe-Trp-Gly-Met-His-Arg-Ile-Cys-OH (peptide 2 for nucleophilic peptide sequence of sortase A) functionalized.
  • the nanoparticles and the peptides in a molar ratio of 1.1: 1 (in terms of the functional groups, in the nanoparticles so the number of double bonds on their surface) in 3 mol% 4, 4 'azobis (4- cyanovaleric acid) in water.
  • the mixture was stirred under nitrogen atmosphere for 24 hours and exposed to UV light (365 nm). Thereafter, the formed nanoparticle-peptide conjugates were washed with distilled water,
  • polyethylene glycol) methyl ether acrylate PEGMA
  • PEGMA polyethylene glycol methyl ether acrylate
  • PNIPAM maleimide terminated poly (N-isopropyl acrylamide)
  • peptides of the sequence H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp- Phe-Trp-Cys-OH peptide 3 with the nucleophilic peptide sequence for sortase A
  • peptides of the sequence H-Cys-Ile-Arg-His-Phe-Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-OH peptide 4 with peptidic recognition sequence for
  • nanoparticle-polymer conjugates or polymer-polymer conjugates typically in a reaction volume of 100 ⁇ , 30 ⁇ aqueous solution of the two substrates with an approximately 50-fold excess of the substrate with the nucleophilic peptide sequence in relation to that Substrate used with the peptidic recognition sequence.
  • FIG. 6 shows MALDI-ToF mass spectra of a reaction mixture of a linkage of nanoparticles
  • FIGS. 7a to 7d show transmission electron micrographs (TEM) of nanoparticle-polymer conjugates according to the sortase A reaction (FIGS. 7b and 7b), as well as images of nanoparticles in a negative control without polymer
  • FIG. 8 shows a MALDI-ToF mass spectrum of non-peptidic polymers, namely polyethylene glycol PEG linked to peptide 3 (curve 180), PNIPAM linked to peptide 4 (curve 160), a negative control without sortase A enzyme (reference 170), and the product of the sortase A reaction, the PEG-PNIPAM conjugate (ref 150).
  • This mass spectrum therefore clearly shows that a peptidic bond between the two polymers is attached by means of the sortase A.
  • RAFT reversible addition fragmentation chain transfer
  • CTA chain transfer agent
  • the peptide conjugates are coupled with both the binding of
  • (G) n -CTA can only be produced in two steps.
  • the synthesis pathway includes peptide synthesis, cleavage and
  • CTA chain transfer agent
  • Reaction vessel was then degassed by five freeze-evacuate-thaw cycles.
  • the reaction mixture was heated to 90 ° C using an oil bath and placed under
  • Fmoc-GG-PNIPAM was dissolved in 2 mL piperidine: dichloromethane (1: 1, v: v) and stirred for 12 h.
  • diethyl ether was added to precipitate the polymer.
  • the precipitate was washed with diethyl ether and isolated by centrifugation.

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Abstract

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren (1), umfassend einen ersten (5, 60A, 50) und einen zweiten Block (20, 60B, 50) mit den Verfahrensschritten: A) Bereitstellen eines ersten Blocks (5, 60A, 50) mit einer nukleophilen Peptidsequenz (10A, 10B) für ein erstes Transpeptidase-Enzym (40), B) Bereitstellen eines zweiten Blocks (20, 60B, 50) mit einer peptidischen Erkennungssequenz(15A, 15B) für das erste Transpeptidase-Enzym (40), C) Verknüpfen des ersten Blocks mit dem zweiten Block mittels des ersten Transpeptidase Enzyms, -wobei der erste und zweite Block unabhängig voneinander ausgewählt sindaus Nanopartikeln (60A, 60B), nicht-peptidischen Polymeren (5, 20, 30),und rekombinanten Proteinen (50). Ein derartiges Herstellungsverfahren erlaubt es besonders einfach und kontrolliert Block-Polymere aus gleichen oder unterschiedlichen Blöcken aufzubauen.

Description

Beschreibung
Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren mittels
Verknüpfung von Blöcken durch eine Transpeptidase und Block- Polymere erhalten durch Transpeptidase-Verknüpfung
Block-Polymere sind eine Substanzklasse, bei der mehrere Blöcke, die die gleiche oder auch eine unterschiedliche chemische Struktur aufweisen oder aus gleichen Monomeren aufgebaut sind, aneinandergebunden sind. Die Blöcke in den
Block-Polymeren können dabei auch insbesondere in definierter Abfolge vorliegen. Derartige Polymere können entweder durch aufeinanderfolgende Polymerisation verschiedener Monomere oder durch die Verknüpfung bestehender Blöcke mit ent- sprechend reaktiven Endgruppen synthetisiert werden. Die
Synthese von Block-Polymeren ist aber generell schwierig und es existieren nur wenige Beispiele mit einer hohen Anzahl an Blöcken . Im Falle von Block-Copolymeren, bei denen Blöcke mit unterschiedlichen Strukturen verknüpft werden, ist es häufig nicht oder nur sehr schwer möglich eine bestimmte Abfolge von Blöcken zu bilden. Beispielsweise können Block-Copolymere aus Polystyrol und Poly (methylmethacrylat ) nur durch anionische Polymerisation in der Reihenfolge von Styrol und dann Methylmethacrylat synthetisiert werden. Um die umgekehrte Abfolge der Blöcke zu erreichen, musste eine aufwändige Mehrstufen- Prozedur entwickelt werden. Block-Copolymere können auch mittels Reaktionen der „Klick- Chemie" aneinandergebunden werden. Beispielsweise stehen die Kupfer-katalysierte Azid-Alkin Cycloaddition und die Diels- Alder Cycloaddition zur Verfügung, bei denen funktionelle Gruppen, die der „Klick-Chemie" zugänglich sind, entweder in bereits bestehende Blöcke eingebaut, oder ausgehend von diesen funktionellen Gruppen die Blöcke unter Verwendung von Übergangsmetall-Katalysatoren aufgebaut werden können. Ein großer Nachteil dieser „Klick-Reaktionen" ist jedoch, dass unspezifisch Doppelbindungen an jedes Dien gebunden werden (Diels-Alder Reaktionen) bzw. unspezifisch Azide und Alkine verknüpft werden (Azid-Alkin Cycloaddition) . Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren, das bezüglich der oben genannten Nachteile verbessert ist. Block-Polymere die nach diesem Verfahren hergestellt werden können, sind Gegenstand weiterer unabhängiger Patentansprüche.
Erfindungsgemäß offenbart wird ein Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren, umfassend einen ersten und einen zweiten Block mit den Verfahrensschritten:
A) Bereitstellen eines ersten Blocks mit einer
nukleophilen Peptidsequenz für ein erstes
Transpeptidase-Enzym,
B) Bereitstellen eines zweiten Blocks mit einer
peptidischen Erkennungssequenz für das erste
Transpeptidase-Enzym,
C) Verknüpfen des ersten Blocks mit dem zweiten Block
mittels des ersten Transpeptidase-Enzyms ,
- wobei der erste und zweite Block unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: Nanopartikeln, nicht-peptidischen
Polymeren und rekombinanten Proteinen.
Ein derartiges erfindungsgemäßes Verfahren ermöglicht es, Block-Polymere mit unterschiedlichen Blöcken aus Nano¬ partikeln, nicht-peptidischen Polymeren und rekombinanten Proteinen in beliebiger Abfolge herzustellen, solange dieser erste und zweite Block die nukleophile Peptidsequenz und die peptidische Erkennungssequenz für ein erstes Transpeptidase- Enzym aufweisen. Sowohl die peptidische Erkennungssequenz als auch die nukleophile Peptidsequenz können Peptidsequenzen mit mehreren Aminosäuren oder gegebenenfalls auch einzelne
Aminosäuren sein, die geeignete Substrate für das erste
Transpeptidase-Enzym sind. Insbesondere können der erste Block und der zweite Block über die nukleophile Peptidsequenz und die peptidische Erkennungssequenz, gegebenenfalls unter
Abspaltung eines Fragments, insbesondere von der peptidischen Erkennungssequenz, miteinander verbunden werden. Die vorliegende Erfindung stellt daher ein modulares „Baukastensystem" zur gezielten Verknüpfung beliebiger Blöcke zur
Verfügung, solange die Blöcke mit den für die Transpeptidase- Ligation notwendigen peptidischen Erkennungssequenzen und nukleophilen Sequenzen versehen werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung eines
Transpeptidase-Enzyms ermöglicht eine umfassende Kontrolle über die Art und Abfolge der Blöcke und ist vergleichbar effizient wie die im Stand der Technik bekannten „Klick- Reaktionen". Im Unterschied zu den „Klick-Reaktionen"
ermöglicht das erfindungsgemäße Enzym-katalysierte Verfahren eine größere Kontrolle über die Anzahl und Abfolge der Blöcke und insbesondere auch eine Synthese von Block-Polymeren ohne Verwendung von Übergangsmetall-Komplexen, wie z. B. Kupfer- Komplexen. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße
Verfahren auch die Herstellung von Block-Polymeren aus rekombinanten Proteinen mit einer Länge, wie sie
biotechnologisch zurzeit nicht zugänglich sind. Zu Beginn des Verfahrens erkennt das Transpeptidase-Enzym die peptidische Erkennungssequenz des zweiten Blocks und bildet ein Zwischenprodukt zwischen der peptidischen Erkennungs¬ sequenz und einer Aminosäure im aktiven Zentrum des
Transpeptidase-Enzyms , wobei Teile der peptidischen
Erkennungssequenz, beispielsweise Oligopeptide oder einzelne Aminosäuren abgespalten werden können. In einem zweiten
Schritt kann dann die nukleophile Peptidsequenz des ersten Blocks mittels eines nukleophilen Angriffs auf das Zwischen- produkt das Transpeptidase-Enzym regenerieren und das Block- Polymer aus dem ersten und zweiten Block mit einer zwischen beiden Blöcken befindlichen peptidischen Zwischensequenz, die Teile der peptidischen Erkennungssequenz und der nukleophilen Sequenz enthält, freisetzen.
Gemäß einer Variante des vorliegenden erfindungsgemäßen
Verfahrens kann der zweite Block eine erste weitere
nukleophile Peptidsequenz aufweisen. Diese erste weitere nukleophile Peptidsequenz kann dazu dienen, den zweiten Block mit weiteren Blöcken mittels weiterer Transpeptidase-Enzyme zu verbinden. Diese Trans- peptidase-Enzyme können die gleiche Transpeptidase sein, wie das bereits oben beschriebene erste Transpeptidase-Enzym oder können auch Transpeptidasen mit anderen Substratspezifitäten sein, die insbesondere andere peptidische Erkennungssequenzen im Vergleich zum ersten Transpeptidase-Enzym aufweisen.
Die erste weitere nukleophile Peptidsequenz kann insbesondere durch eine Schutzgruppe blockiert sein.
Eine Schutzgruppe kann mögliche Kreuzreaktivitäten zwischen der ersten weiteren nukleophilen Peptidsequenz und der bereits im ersten Block vorhandenen nukleophilen Peptid- sequenz während des Verknüpfens des ersten Blocks mit dem zweiten Block im Verfahrensschritt C) verhindern.
Insbesondere kann die erste weitere nukleophile Peptidsequenz auch geeignet sein für das erste Transpeptidase-Enzym, wobei dann besonders vorteilhaft die Schutzgruppe die Reaktion dieser ersten weiteren nukleophilen Peptidsequenz während des Verfahrensschritts C) blockiert. Alternativ kann die erste weitere nukleophile Peptidsequenz auch für ein vom ersten Transpeptidase-Enzym unterschiedliches Transpeptidase-Enzym geeignet sein.
Als Schutzgruppen kommen insbesondere auch bereits bekannte Verbindungen, wie beispielsweise Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) und/oder tert-Butyloxycarbonyl (t-Boc) in Betracht, die unter Verwendung von Fluorenyloxymethylchlorid und/oder Di- ert-butyldicarbonat an den Amino- bzw. Carboxy-Gruppen erzeugt werden können.
Eine weitere Variante eines erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Verfahren zur Herstellung eines Block-Polymers mit zumindest drei Blöcken, umfassend die weiteren Verfahrensschritte:
D) Bereitstellen eines dritten Blocks mit einer
peptidischen Erkennungssequenz für das erste
Transpeptidase-Enzym,
E) Falls vorhanden-Entfernen der Schutzgruppe der ersten weiteren nukleophilen Peptidsequenz des zweiten Blocks,
F) Verknüpfen des dritten Blocks mit dem zweiten Block
mittels des ersten Transpeptidase-Enzyms .
Ein derartiges Verfahren ist besonders geeignet, einen dritten Block mittels des gleichen ersten Transpeptidase- Enzyms anzubinden. In diesem Fall stellt das Entfernen der Schutzgruppe der ersten weiteren nukleophilen Peptidsequenz im Verfahrensschritt E) sicher, dass diese nukleophile
Peptidsequenz mit der peptidischen Erkennungssequenz des dritten Blocks verknüpft werden kann. Ein derartiges
Verfahren ist insbesondere dazu geeignet in einem schritt¬ weisen Prozess, bei dem gezielt die Blöcke nacheinander miteinander verbunden werden, den dritten Block an einen bereits bestehenden Diblock aus dem ersten und zweiten Block anzuknüpfen. Bevorzugt wird der dritte Block erst nach dem Verfahrensschritt E) , dem Abspalten der Schutzgruppe zu der Reaktionslösung hinzugegeben.
Alternativ kann die erste weitere nukleophile Peptidsequenz auch unterschiedlich sein zu der im ersten Block vorhandenen nukleophilen Peptidsequenz und kann insbesondere für eine Verknüpfungsreaktion mit einer zweiten, von der ersten
Transpeptidase unterschiedlichen Transpeptidase verwendet werden. Bei einem derartigen Verfahren sind insbesondere die folgenden weiteren Verfahrensschritte beinhaltet:
G) Bereitstellen eines dritten Blocks mit einer
peptidischen Erkennungssequenz für das zweite
Transpeptidase-Enzym,
H) Verknüpfen des dritten Blocks mit dem zweiten Block
mittels des zweiten Transpeptidase-Enzyms .
Bei einem derartigen Verfahren besteht der Vorteil darin, dass ein zweites Transpeptidase-Enzym, das eine andere peptidische Erkennungssequenz erkennt als das erste
Transpeptidase-Enzym zum Verknüpfen des dritten Blocks mit dem zweiten Block verwendet wird. Die unterschiedliche
Substratspezifität des zweiten Transpeptidase-Enzyms kann verhindern, dass im Verfahrensschritt H) anstelle des dritten Blocks noch möglicherweise als Verunreinigungen vorhandene Anteile des noch nicht verknüpften zweiten Blocks an die wachsende Polymerkette angebunden werden. Bei einigen
Transpeptidase-Enzymen, insbesondere bei einigen Sortasen, weisen unterschiedliche Sortase-Enzyme häufig eine andere peptidische Erkennungssequenz, aber die gleiche nukleophile Sequenz auf.
Auch bei einem derartigen Verfahren kann gegebenenfalls noch eine Schutzgruppe von der ersten weiteren nukleophilen
Sequenz des zweiten Blocks entfernt werden, da derartige Schutzgruppen auch häufig Kreuzreaktionen bei unterschiedlichen Transpeptidase-Enzymen verhindern. Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorteilhaft auch derart modifiziert werden, dass Block-Polymere mit zumindest vier Blöcken, bevorzugt zumindest sechs, weiter bevorzugt
zumindest acht Blöcken hergestellt werden können. Dabei können nach den Verfahrensschritten F) bzw. H) zumindest ein Block, bevorzugt drei Blöcke weiter bevorzugt fünf weitere
Blöcke, die jeweils mit einer peptidischen Erkennungssequenz und einer nukleophilen Sequenz für ein oder mehrere
Transpeptidase-Enzyme versehen sind, bereitgestellt werden und mittels dieser einen oder mehreren Transpeptidase-Enzyme miteinander verknüpft und an den dritten Block angebunden werden .
Bei dieser Verfahrensvariante können Transpeptidase-Enzyme eingesetzt werden, die entweder dem ersten und/oder zweiten Transpeptidase-Enzym entsprechen oder von diesen beiden
Transpeptidase-Enzymen unterschiedliche Substratspezifitäten aufweisen. Auch bei einem derartigen Verfahren können jeweils an den nukleophilen Sequenzen wieder Schutzgruppen vorhanden sein, die ungewollte Reaktionen verhindern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Verfahren zur Herstellung von Block-
Copolymeren eingesetzt werden wobei für zumindest zwei Blöcke der ersten, zweiten und gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke, Blöcke mit unterschiedlicher Struktur verwendet werden.
Bei einem derartigen Verfahren können gezielt Blöcke mit unterschiedlicher chemischer Struktur miteinander verknüpft werden, wobei die im Stand der Technik vorhandenen Einschränkungen bezüglich der Abfolge der Blöcke nicht
auftreten. Beispielsweise können zwei unterschiedliche
Polymerblöcke, wie Polyethylenglykole oder Derivate von
Polyethylenglykolen und Polyacrylamide oder deren Derivate gezielt miteinander verknüpft werden. Insbesondere können die erfindungsgemäßen Varianten des
Herstellungsverfahrens dafür verwendet werden, komplett künstliche Blöcke, wie synthetische Polymere (Kunststoffe) oder kleine Partikel, wie beispielsweise Nanopartikel
miteinander zu verknüpfen. Mögliche Beispiele von Polymeren sind Polymere, die aus vinylischen Monomeren aufgebaut sind, wie z. B.: Styrol und Derivate, Vinylpyridine, Acrylsäure und Acrylsäureester, Methacrylsäure und Methacrylsäureester, Acrylamide, N-substituierte und N, -disubstituierte Acryl- amide, Diene, Diacrylamide, Dimethacrylate, Acrylnitril, 1- Vinylimidazol und Maleinsäureanhydrid.
Weiterhin ist es möglich, auch nicht-peptidische Biopolymere, wie beispielsweise Polyhydroxybutyrate, Cellulose, Chitin, Stärke, Polylactide und Kohlehydrate sowie Kombinationen davon zu verknüpfen. Derartige Biopolymere als Blöcke können auch mit synthetischen Polymeren, wie Kunststoffen besonders einfach verknüpft werden.
Für den ersten, zweiten und die gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke können aber auch peptidische Biopolymere eingesetzt werden, insbesondere rekombinante Proteine. Die peptidischen Biopolymere können insbesondere in Klonierungsvektoren derart exprimiert werden, dass sie be¬ reits die peptidische Erkennungssequenz und gegebenenfalls auch die nukleophile Sequenz aufweisen. Insbesondere kann die peptidische Erkennungssequenz am C-Terminus der rekombinanten Proteine und die nukleophile Sequenz am N-Terminus vorhanden sein.
Die peptidischen Biopolymere können insbesondere ausgewählt sein aus Strukturproteinen, wie z. B., Elastin, Fibroin, Sericin, Kollagen und Keratin sowie Kombinationen davon.
Besonders bevorzugt sind Seidenproteine, wie z. B.
Spinnenseidenproteine, die im Verhältnis zu ihrem Gewicht außergewöhnliche mechanische Belastbarkeit, insbesondere Dehnbarkeit und Reißfestigkeit aufweisen. Rekombinante
Seidenproteine, wie z. B. Spinnenseidenproteine können häufig nicht in der Länge exprimiert werden, die bei natürlichen
Spinnenseidenproteinen vorliegen, sondern lediglich verkürzt. Da die mechanische Belastbarkeit aber mit der Länge der
Seidenproteine zunimmt, ist es besonders vorteilhaft mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens Blöcke von rekombinanten Seidenproteinen miteinander zu verknüpfen und so zu längeren Seidenprotein-Aggregaten mit verbesserten mechanischen
Eigenschaften zu gelangen. Als Seidenproteine können alle rekombinant erhältlichen Fragmente oder Varianten der Seidenproteine verwendet werden. Insbesondere können auch die rekombinanten Spinnenseidenproteine miteinander verknüpft werden, die in der PCT-Patentanmeldung WO 2006/008163 A2 beschrieben werden. Auf diese PCT-Patentanmeldung wird hiermit im Bezug auf die Spinnenseidenproteine vollinhaltlich Bezug genommen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens kann dieses Verfahren insbesondere auch zur Herstellung von verzweigten Block-Polymeren eingesetzt werden. Dabei weist zumindest einer der ersten, zweiten und gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke zumindest drei Sequenzen ausgewählt aus den pep¬ tidischen Erkennungssequenzen und nukleophilen Sequenzen für ein Transpeptidase-Enzym zur Anbindung weiterer Blöcke auf. Blöcke mit zumindest drei Sequenzen zur Anbindung von
weiteren Blöcken mittels Transpeptidase-Enzymen können beispielsweise zur Herstellung von Propf-Polymeren und Propf- Copolymeren sowie zur Herstellung von sternförmigen Ver- bindungen eingesetzt werden. Ebenso können Nanopartikel , wie beispielsweise S1O2 Nanopartikel mit einer Vielzahl von
Sequenzen zur Anbindung weiterer Blöcke versehen werden, sodass diese Partikel beispielsweise Schichten von Block- Polymeren auf ihrer Oberfläche aufweisen können, die über Transpeptidase-Enzyme angebunden wurden.
Als Transpeptidase-Enzyme können insbesondere Sortasen, oder deren Fragmente verwendet werden, beispielsweise Sortase A, Sortase B, Sortase C, Sortase D, Sortase E und andere
Transpeptidase-Enzyme, wie beispielsweise die Butelase und/oder die Trypsiligase . Insbesondere kann auch eine lösliche, katalytische Domäne des Sortase-Enzyms Sortase A SrtA von Staphylococcus aureus rekombinant exprimiert werden (Bolscher, J. G., et al . (2011) Sortase A as a tool for high-yield histatin cyclization.
FASEB J. 25, 2650-2658). Dieses Transpeptidase-Enzym erkennt die peptidische Erkennungssequenz -LPXTG, wobei Aminosäure X für jede beliebige Aminosäure steht, z. B. -LPETG oder - LPATG. Andere Varianten der Sortase sind beispielsweise die Sortase B srtB von Staphylococcus aureus oder Bacillus anthracis , die eine andere peptidische Erkennungssequenz -NP (Q/K) TN als srtA aufweisen (Maresso, A. W. et al . J. Bacteriol. 2006,
188,8145-8152 und Mazmanian, S. K et al . 0. Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2002, 99, 2293-2298). Weitere Sortasen der
Klassen C, D und E mit unterschiedlichen peptidischen Erkennungssequenzen sind ebenfalls bekannt (Spirig, T. et al . Mol. Microbiol. 2011, 82, 1044 und Bradshaw, W. J.; et al . FEBS J. 2015, 282, 2097) . Sortasen der Klasse C und D weisen die peptidischen Erkennungssequenzen -(I/L) (P/A)XTG (Klasse C) und -QVPTG oder -LPNTA (Klasse D) und Sortasen der Klasse E die Erkennungssequenz -LAXTG auf. Sortase A kann allgemein eine ganze Reihe von peptidischen Erkennungssequenzen der allgemeinen Sequenz - (M/L/V) (P/T/A/S) X (A/L/T/S/V/I) G
erkennen, wobei X wieder für jede Aminosäure, insbesondere A steht (Ning Li et al . , Biochem Biophys Res Commun, 2017, 486 (2), 257-263). Andere von Sortasen erkannte peptidische
Erkennungssequenzen sind IPKTG, APKTG, DPKTG, SPKTG, APATG und LPECG (John M. Antos et al . , Curr. Opin. Struct. Biol.; 2016, 38 : 111-118) .
Anstelle oder zusätzlich zu den Sortasen kann auch die
Butelase 1, eine Asn/Asp (Asx) -Peptid-Ligase verwendet werden (G. K. . Nguyen, et al . Nat . Chem. Biol., 2014, 10, 732- 738). Dieses Transpeptidase-Enzym hat die peptidische
Erkennungssequenz -NHV oder -DHV. Weiterhin kann alternativ oder zusätzlich auch Trypsiligase als Transpeptidase ver- wendet werden, die die peptidische Erkennungssequenz und die nukleophile Sequenz Y-RH aufweist, wobei Y vorhanden sein kann, aber nicht vorhanden sein muss. Bei der Bildung des Zwischenprodukts zwischen der Transpeptidase und dem
Peptidsubstrat wird dabei zwischen Y und RH gespalten, falls Y vorhanden ist, so dass eine Zwischensequenz -YRH- zwischen zwei mittels der Trypsiligase verbunden Blöcken resultiert.
Die peptidischen Erkennungssequenzen können daher bei erfindungsgemäßen Verfahren unabhängig voneinander ausgewählt sein aus folgenden Sequenzen:
-LPXTG, - LPXTA, -NPQTN, -QVPTG, -LAXTG, LPXSG, -NHV, -DHV, - (Y)ZRH und - (M/L/V) (P/T/A/S) X (A/L/T/S/V/I) G, IPKTG, APKTG, DPKTG, SPKTG, APATG und LPECG, wobei X jede mögliche
Aminosäure ist und der Parameter z 0 oder 1 sein kann.
Die Erkennungssequenzen sind abhängig von den Klassen der Transpeptidase-Enzyme, insbesondere den Klassen der Sortasen und Butelase.
Die nukleophilen Sequenzen können unabhängig voneinander ausgewählt sein aus:
-(G) i-5, bevorzugt -(G) i_3, und -(A) i_5.
Dabei ist zu beachten, dass die Butelase beliebige
Aminosäuren als nukleophile Sequenzen erkennen kann, und somit deren nukleophile Sequenz als - (X) 1-5- bezeichnet werden kann. Bei der Trypsiligase ist die nukleophile Sequenz Y-RH. Die verschiedenen Klassen der Sortase Enzyme erkennen unterschiedliche peptidische Erkennungssequenzen, weisen aber die gleiche nukleophile Sequenz -(G) 1-5, bevorzugt -(G) 1-3, oder auch - (A) 1-5 auf .
Der katalytische Mechanismus einer Sortase katalysierten Reaktion beginnt mit dem Abspalten der letzten Aminosäure der peptidischen Erkennungssequenz und dem Verknüpfen der restlichen peptidischen Erkennungssequenz an einen reaktiven Cystein-Rest im aktiven Zentrum des Sortase-Enzyms . Das
Thioester-Acyl Zwischenprodukt kann nun nukleophil von der N- terminalen Aminosäure einer nukleophilen Sequenz, die für die meisten Sortasen ein Oligoglycin- oder ein Alanin-Motiv enthält und die bei der Butelase eine beliebige Aminosäure sein kann, angegriffen werden. Dadurch wird eine Peptid- bindung zwischen den beiden Substraten, den Polymer-Blöcken mit Teilen der peptidischen Erkennungssequenz und der
nukleophilen Sequenz als peptidische Zwischensequenz gebildet und das Sortase-Enzym regeneriert. Diese peptidische
Zwischensequenz enthält dabei die gerade genannte peptidische Erkennungssequenz ohne die während der katalytischen Reaktion abgespaltenen Aminosäuren, wobei diese restliche peptidische Erkennungssequenz an die nukleophile Sequenz angebunden ist. Nukleophile Sequenzen die zwischen 1 bis 5 Glycine, und zwi¬ schen 1 bis 5 Alanine aufweisen sind dabei besonders dafür geeignet als nukleophile Gruppen die Thioester-Acyl-Zwischen- produkte aus dem Sortase-Enzym und dem Block mit der peptidischen Erkennungssequenz anzugreifen und so das Produkt der Reaktion, die mittels peptidischer Zwischensequenzen verknüpften Blöcke und das Enzym Sortase, freizusetzen. Da die Transpeptidase-Enzyme, insbesondere die Sortasen, eine Gleichgewichtsreaktion zwischen der Transpeptidierung, der Bildung einer Bindung zwischen dem Block mit der peptidischen Erkennungssequenz und dem Block mit der nukleophilen Sequenz, und der Auflösung dieser Bindung unter Bildung der Ausgangsblöcke katalysieren, können Maßnahmen getroffen werden um das Gleichgewicht der Reaktion auf die Seite der Transpepti¬ dierung zu verschieben. Dies kann insbesondere dadurch gewährleistet werden, dass die während der Bildung der
Peptidbindung zwischen beiden Blöcken abgespaltenen Aminosäuren oder Oligopeptide irreversibel aus der Gleichgewichts¬ reaktion entfernt werden. Beispielsweise kann hinter der Aminosäure, die von der peptidischen Erkennungssequenz während der Sortase Reaktion abgespalten wird, die häufig ein Glycin ist, ein Histidin angebunden werden, sodass das abgespaltene Oligopeptid dann beispielsweise durch Kom- plexierung mit Ni2+, Co2+, Cu2+ oder Fe2+ vollständig aus dem Gleichgewicht entfernt werden kann. Alternativ oder zusätzlich können sowohl die Sequenz der peptidischen Erkennungssequenz als auch der nukleophilen Sequenz derart aufgebaut sein, dass sie nach der Ligation durch das Transpeptidase Enzym zusammen eine Beta-Hairpin- Struktur bilden, die durch die Transpeptidase nicht ange- griffen werden kann, sodass das Gleichgewicht der Reaktion in Richtung der Transpeptidierung verschoben wird. Derartige Beta-Hairpin-Strukturen können beispielsweise durch die
Sequenz -WTWTW- gebildet werden, die sowohl in die
peptidische Erkennungssequenz als auch in die nukleophile Sequenz integriert werden kann.
Eine andere Möglichkeit besteht darin, die während der
Ligation abgespaltenen Aminosäurereste der peptidischen Erkennungssequenz als schwaches Nukleophil auszugestalten, sodass die Rückreaktion, die Spaltung der beiden Blöcke, ebenfalls nicht begünstigt ist. Derartige nukleophile Gruppen können beispielsweise am C-Terminus der peptidischen
Erkennungssequenz vorhanden sein, sodass sie nach der
Abspaltung ein schwaches Nukleophil bilden (siehe z. B. Fig. 5) .
Die Expression des Transpeptidase-Enzyms , z. B. der Sortase, kann bevorzugt in löslicher Form, beispielsweise ohne eine Transmembran-Domäne und mit einem His-Tag am N-Terminus, erfolgen. Als bevorzugtes Expressionssystem bietet sich zum Beispiel Escherichia coli an, das Proteine in hohen Ausbeuten rekombinant exprimieren kann. Die Reinigung des Trans- peptidase-Enzyms kann dann beispielsweise mittels Ni2+
Affinitätschromatographie über den His-tags erfolgen.
Die Verknüpfung der einzelnen Blöcke mit den peptidischen Erkennungssequenzen und den nukleophilen Sequenzen mittels von Transpeptidase-Enzymen kann dann in vitro in einem Reaktionsgefäß in gepufferter Lösung erfolgen. Beispielsweise kann ein Puffer eingesetzt werden, der zur Sicherstellung der enzymatischen Aktivität des Transpeptidase-Enzyms zwischen 40 bis 60 mM eines Puffers mit einem pH zwischen 6,8 und 7,8, bevorzugt 7,5 enthält, z. B. Tris-HCl. Die Pufferlösung kann weiterhin zwischen 100 bis 200 mM eines Alkalimetall- halogenids, z.B. NaCl, sowie etwa 4 bis 8 mM eines
Erdalkalimetallhalogenids , z. B. CaCl2, enthalten. Die
Reaktion kann bei Temperaturen zwischen 25-40 °C, bevorzugt zwischen 28 °C und 37 °C, durchgeführt werden. Für eine
Verknüpfungsreaktion zwischen einem Block mit einer
peptidischen Erkennungssequenz und einem Block mit einer nukleophilen Sequenz können beide Blöcke z. B. in äquimolaren Mengen eingesetzt werden. Ein Reaktionspartner kann aber auch im molaren Überschuss eingesetzt werden, z. B. um das Gleichgewicht der Verknüpfungsreaktion stark in Richtung der
Verknüpfungsreaktion zu verschieben. Dazu kann insbesondere der Block mit der nukleophilen Sequenz im molaren Überschuss von z. B. bis zu 50:1 gegenüber dem Block mit der peptidischen Erkennungssequenz eingesetzt werden. Was die
katalytische Aktivität der Transpeptidase-Enzyme angeht, so können im Fall von Sortase A Sortasen mit einer katalytischen Effizienz im Bereich von kcat / Km [Abz-LPETGK (Dnp) -CONH2] = (100 - 50 000) M"1 s_1, und speziell bevorzugt zwischen kcat / Km [Abz-LPETGK (Dnp) -CONH2] = (180 - 35 000) M"1 s"1 verwendet werden, wobei die Aktivitäten an einem Substrat Abz-LPETGK (Dnp) -CONH2 gemessen wurden, das das Fluorophor 2- Aminobenzoesäure (Abz) am N-Terminus und am Lysin 2,4-
Dinitrophenyl (DNP) als Marker aufweist. Die katalytischen Effizienzen von anderen Sortase-Enzymen können dabei
niedriger sein als die Effizienzen für Sortase A oder
vergleichbar .
Weiterhin kann der Startblock, mit dem das Verfahren zur Herstellung der Block-Polymere eingeleitet wird an einer festen Phase immobilisiert sein, beispielsweise Kügelchen, wie Polystyrol-Kügelchen, um eine Reinigung zwischen den einzelnen Reaktionsschritten besonders einfach zu ermöglichen. Durch die Reinigung können insbesondere nicht verknüpfte und nicht reagierte Blöcke mit den peptidischen Erkennungssequenzen und/oder nukleophilen Sequenzen mittels Reinigung entfernt werden, sodass sie beim nächsten Ver- knüpfungsschritt nicht zu ungewünschten Nebenreaktionen führen. Bei der Herstellung der Block-Polymere können z. B. über Divinylbenzol verlinkte Polystyrol Kügelchen mit einer Beladung im Bereich 0,2-1 mmol/g an funktionellen Gruppen zur Anbindung verwendet werden. Die Bindung der Blöcke erfolgt z. B. durch eine Esterbindung an einem 4-Alkoxybenzylalkohol oder durch eine Amidbindung an einem 4-Alkoxybenzyl- oxycarbonylhydrazid . Die fertigen Block-Polymere könne durch Trifluoressigsäure von den Polystyrol Kügelchen abgespalten werden, ohne die Peptidbindungen in den Block-Polymeren zu beeinflussen. Bei der zweiten genannten Gruppe wird beim Abspalten ein Peptid-Amid gebildet.
Mittels der erfindungsgemäßen Verfahren können insbesondere auch Block-Copolymere hergestellt werden, die hydrophile Blöcke neben hydrophoben Blöcken, bzw. hydrophobe neben hydrophilen Bereichen aufweisen. Dadurch können beispielsweise auch sogenannte „crew-cut" Micellen hergestellt werden, bei denen im Kern der Micellen hydrophobe Blockbereiche, z. B. Proteinbereiche vorliegen und nach außen hin die
hydrophilen Bereiche der Blöcke, in ein hydrophiles,
beispielsweise wässriges Medium, hineinragen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein
Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren mit den
Verfahrensschritten :
AI) Bereitstellen einer Vielzahl von Blöcken mit einer
nukleophilen Sequenz und einer peptidischen Erkennungssequenz für zumindest ein Transpeptidase-Enzym,
Bl) Verknüpfen der Vielzahl von Blöcken durch das zumindest eine Transpeptidase-Enzym,
- wobei die Vielzahl der Blöcke unabhängig voneinander
ausgewählt ist aus: Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, und rekombinanten Proteinen. Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden unter einer „Vielzahl von Blöcken" zumindest drei Blöcke verstanden.
Mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens können eine be¬ liebige Anzahl von Blöcken, bevorzugt zwischen 3 bis 50, weiter bevorzugt mindestens drei bis 30 Blöcke, am meisten bevorzugt zwischen 4 bis 10 Blöcke miteinander verknüpft werden. Bei Spinnenseidenproteinen können insbesondere auch bis zu 5 Blöcke miteinander verknüpft werden. Im Bezug auf diese erfindungsgemäße Verfahrensvariante gelten alle bereits oben beschriebenen Merkmale ebenfalls. Bei Verwendung von Strukturproteinen als Blöcke, die Wiederholeinheiten von Proteinsequenzen enthalten, können mit zunehmender Anzahl von Wiederholeinheiten je Block die Anzahl der Blöcke, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren verknüpft werden, reduziert werden, ohne die Gesamtlänge der resultierenden Block- Polymere wesentlich zu verringern.
Insbesondere kann bei einer derartigen Verfahrensvariante zumindest bei einigen, bevorzugt bei allen der Vielzahl von Blöcken die nukleophile Sequenz durch eine Schutzgruppe blockiert sein, wobei dann im Verfahrensschritt Bl) vor dem Verknüpfen die Schutzgruppen entfernt werden.
Die Schutzgruppen blockieren dabei die nukleophilen
Sequenzen, die im jeweiligen Verknüpfungsschritt noch nicht reagieren sollen, wie bereits weiter oben beschrieben.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens können die Vielzahl von Blöcken im Verfahrens- schritt Bl) schrittweise Block für Block verknüpft werden.
Ein derartiges Verfahren erlaubt eine besonders kontrollierte Synthese von Block-Polymeren Block für Block und ermöglicht es insbesondere auch Block-Copolymere mit definierter Abfolge der Blöcke herzustellen. Eine derartige Kontrolle über die Verknüpfung der Blöcke ist bei herkömmlichen Synthesemethoden für Block-Copolymere häufig nicht oder nur sehr schwer möglich.
Alternativ können im Verfahrensschritt Bl) die Vielzahl der Blöcke auch im Eintopf-Verfahren verknüpft werden. Bei einem derartigen Verfahren können besonders einfach alle Blöcke mit nukleophilen Sequenzen und peptidischen Erkennungssequenzen durch eine in der Reaktionslösung
vorhandene Transpeptidase in einem Reaktionsgefäß mittels eines Reaktionsschrittes verknüpft werden. Ein derartiges Eintopf-Verfahren kann insbesondere dann vorteilhaft sein, wenn Block-Polymere hergestellt werden sollen, die keine definierte Abfolge von Blöcken aufweisen müssen und/oder die eine Größenverteilung ohne eine definierte Größe aufweisen können .
Bei allen erfindungsgemäßen Verfahren ist es auch besonders einfach möglich, Blöcke mit unterschiedlichen peptidischen Erkennungssequenzen für unterschiedliche Transpeptidase- Enzyme gleichzeitig in nur einem Verfahrensschritt zu
verknüpfen, solange die dafür notwendigen verschiedenen
Transpeptidase-Enzyme in der Reaktionslösung gleichzeitig zur Verfügung gestellt werden und solange bevorzugt diese
verschiedenen Transpeptidase-Enzyme auch unterschiedliche nukleophile Sequenzen aufweisen. Beispielsweise können Blöcke mit mehreren angebundenen peptidischen Erkennungssequenzen für unterschiedliche Transpeptidase-Enzyme als Ausgangs¬ verbindungen verwendet werden, an die dann in einem einzigen Schritt mittels verschiedener Transpeptidasen weitere Blöcke angekoppelt werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind auch Block- Polymere mit zumindest einem ersten Block 1 und einem zweiten Block 2 mit folgender Struktur:
Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2 wobei die Block 1 und Block 2 verbrückende
peptidische Zwischensequenz 1 eine Sequenz enthält oder eine Sequenz ist, ausgewählt aus folgender Gruppe :
- (I/L) (P/A)XT (G) !_5-, - (I/L) (P/A)XT(A) i-5-, - NP(Q/K)T(G) i-5-, -NP(Q/K)T(A) i-5-, -QVPT (G) i_5-, - QVPT(A) !_5-, -LAXT(G) i-5-, -LAXT (A) i_5-, -LPXS (G) i_5-, -LPXS (A) !_5-, -N(X) i-s-, -D(X) i-5-,-LPNT(G) i-5-, - LPNT(A) !_5-, IPKT(G) i_5, IPKT (A) 1-5, APKT (G) 1-5,
APKT(A) !_5, DPKT(G) i_5, DPKT (A) i_5 , SPKT (G) 1-5,
SPKT(A) i-s, APAT(G) i-5, APAT (A) i_5 und LPEC (G) 1-5,
LPEC(A) i-s, -(M/L/V) ( P/T/A/S ) X (A/L/T/S /V/ 1 ) (G) 1-5 und - (M/L/V) (P/T/A/S)X(A/L/T/S/V/I) (A) i_5, insbesondere -LPXT (G) 1-5- , -LPXT (A) 1-5- , -NPQT (G) 1-5- , -NPQT (A) 1-5- , wobei X jede mögliche Aminosäure ist,
und wobei Block 1 und Block 2 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, und rekombinanten Proteinen. Die Sequenz der peptidischen Zwischensequenz 1 läuft dabei wie bei Proteinsequenzen üblich vom N-zum C-Terminus. Die Zwischensequenz 1 baut sich dabei aus Teilen der peptidischen Erkennungssequenz auf, wobei von deren C-Terminus mindestens eine Aminosäure, in der Regel Glycin, während der Transpeptidase katalysierten Reaktion abgespalten wird und der Rest der peptidischen Erkennungssequenz mit der nukleo- philen Sequenz (häufig Glycine oder Alanine) verbunden wird. Die oben beschriebene peptidische Zwischensequenz 1 baut sich daher vom N-Terminus ausgehend aus Teilen der peptidischen Erkennungssequenz verbunden mit der nukleophilen Sequenz auf, wobei die oben beschriebenen Zwischensequenzen 1 Teile der peptidischen Erkennungssequenzen der bereits bekannten
Sortasen A bis E beinhalten. Die kurzen peptidischen
Zwischensequenzen -N(X) i_5-, -D (X) i_5- entsprechen dabei den Zwischensequenzen, die von einer Butelase katalysierten
Ligation zu erwarten sind, wenn das Dipeptid -HV von der peptidischen Erkennungssequenz der Butelase abgespalten wird.
Diese peptidische Zwischensequenz 1, wie auch die weiter unten noch zu beschreibenden Zwischensequenzen können dabei auch Bestandteil einer längeren peptidischen Sequenz zwischen den einzelnen Blöcken sein. Insbesondere können zwischen diesen Sequenzen und den durch sie verbrückten Blöcken weitere Peptidsequenzen oder andere chemische Gruppen als Abstandshalter vorhanden sein.
Block-Polymere nach einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung können zusätzlich einen dritten Block 3 umfassen und somit folgende Struktur aufweisen:
Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2
peptidische Zwischensequenz 2-Block 3 wobei die peptidische Zwischensequenz 2 unabhängig von der peptidischen Zwischensequenz 1 eine Sequenz enthält oder eine Sequenz ist, ausgewählt aus folgender Gruppe:
- (I/L) (P/A)XT (G) !_5-, - (I/L) (P/A)XT( A) i-5 - , -
NP (Q/K) T (G) !_5-, -NP (Q/K) T (A) !_5-, -QVPT (G) 1-5- , - QVPT(A) !_5-, -LAXT (G) !-5-, -LAXT ( A) 1-5-, -LPXS (G) 1-5-, -LPXS (A) 1-5- , -N(X) i-s-, -D(X) i-5-,-LPNT(G) i-5-, - LPNT(A) !_5-, IPKT(G) i_5, IPKT (A) 1-5, APKT (G) 1-5,
APKT(A) !_5, DPKT(G) i_5, DPKT (A) i_5 , SPKT (G) 1-5,
SPKT( A) i-s, APAT(G) i-5 , APAT (A) i_5 und LPEC (G) 1-5, LPEC( A) i_5, M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (G) 1-5 und
- (M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (A) i_5 , insbesondere -LPXT (G) !-5-, -LPXT (A) !_5-, -NPQT (G) 1-5-, und -
NPQT (A) !_5-,
- und wobei Block 1, Block 2 und Block 3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
- Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, und rekombinanten Proteinen.
Durch weitere Transpeptidase katalysierte Reaktionen können die Block-Polymere der vorliegenden Erfindung Block für Block aufgebaut werden, wobei zwischen jeweils zwei Blöcken
unterschiedliche oder gleiche Zwischensequenzen vorhanden sein können, je nachdem welches Transpeptidase-Enzym für die jeweilige Verknüpfung eingesetzt wurde.
Allgemein können zusätzliche Wiederholungseinheiten der allgemeinen Struktur: [ -[peptidische Zwischensequenz|-|Block|] mit der Anzahl n mittels erfindungsgemäßer Verfahren
miteinander verknüpft werden, sodass Block-Polymere mit der folgenden allgemeinen Struktur resultieren: Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2 peptidische Zwischensequenz 2-Block 3- [peptidische
|Zwischensequenz|-|Block|] n,
- wobei die n zusätzlichen peptidischen
Zwischensequenzen unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der bereits oben beschriebenen entsprechenden Gruppe, und
- wobei die n zusätzlichen Böcke unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der bereits oben beschriebenen entsprechenden Gruppe, und
- wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 50, bevorzugt zwischen 3 und 30, am meisten bevorzugt zwischen 4 bis 10 ist.
Mittels der erfindungsgemäßen Verfahren können Block-Polymere und bei Vorliegen von Blöcken unterschiedlicher chemischer Struktur auch Block-Copolymere mit großen, definierten Längen hergestellt werden. Insbesondere können die Blöcke, wie bereits oben beschrieben, nicht-peptidische Polymere, die beispielsweise unabhängig voneinander ausgewählt sein können aus Poly (methylmethacrylaten) , Polyethylenglykolen, Acryl- amiden, und den bereits oben beschriebenen Polymeren, die aus vinylischen Monomeren aufgebaut sind, sein, oder auch
ausgewählt sein aus rekombinanten Proteinen oder
Nanopartikeln . Insbesondere ist es auch möglich, als Blöcke jeweils gleiche oder unterschiedliche Fragmente eines
rekombinanten Spinnenseidenproteins hintereinander zu
koppeln, um eine besonders hohe mechanische Stabilität zu erreichen .
Mittels erfindungsgemäßer Verfahren hergestellte Block- Polymere und Block-Copolymere können für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden, z. B. als Polymer-basierte Aktuatoren, als Komponenten für Solarzellen, als Materialien für medizinische Diagnostik und Wirkstofftransport, für organische lichtemittierende Dioden (OLEDs) , in der Mikro¬ elektronik oder als multifunktionelle Plastikmaterialien. Beispielsweise können im Fall von Polymer-basierten Aktua- toren, zum Beispiel für den Automobilbau ein möglicher Block aus Silikon oder Isopren und ein weiterer Block aus Poly(2- Vinylpyridin) aufgebaut sein. Um einen ausreichenden
dielektrischen Effekt zu erzielen muss dabei die Molekular- gewichtsverteilung der synthetisierten Block-Copolymere eng sein, was mittels der erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren besonders gut möglich ist.
Beispielsweise lassen sich auch Blöcke, umfassend Itacon- säurepolymere, oder Polyelektrolyte, wie Polyvinylpyridin, und/oder Glucosemethacrylatpolymere mittels der erfindungs¬ gemäßen Herstellungsverfahren an metallische Nanopartikel koppeln, wodurch diese Polymere leitfähig werden. Durch die Möglichkeit mittels verschiedener Varianten von erfindungsgemäßen Verfahren Polymere, insbesondere auch nicht-peptidische Polymere und Biopolymere an Nanopartikel an zu knüpfen, kann eine hohe Dichte an den Polymerblöcken je Nanopartikel erreicht werden. Gleichzeitig können die
anzubietenden Blöcke bei den erfindungsgemäßen
Herstellungsverfahren sowohl was Struktur als auch die Länge betrifft, individuell bereitgestellt werden.
Die verschiedenen, erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren sowie die verschiedenen Varianten erfindungsgemäßer Block- Polymere und Block-Copolymere zeichnen sich auch dadurch aus, dass die Herstellung im Gegensatz zu vielen herkömmlichen Herstellungsmethoden ohne Übergangsmetall-Katalysatoren erfolgt und daher die hergestellten finalen Block-Polymere und Block-Copolymere somit frei sind von Übergangsmetall- Katalysatoren. Bei herkömmlichen Herstellungsverfahren müssen diese Übergangsmetall-Katalysatoren häufig sehr aufwendig entfernt werden, was vor allen Dingen für biologische
Polymere sehr anspruchsvoll ist.
Im Folgenden sollen Aspekte der vorliegenden Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen und Figuren noch näher erläutert werden:
Figur 1 zeigt verschiedene Aspekte von erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren bei denen Nanopartikel , nicht- peptidische Polymere und rekombinante Proteine jeweils miteinander verknüpft werden können.
Figur 2 zeigt eine Variante eines erfindungsgemäßen Verfahrens entweder zum blockweisen gezielten Aufbau oder mittels einer Eintopfreaktion von Block-Polymeren und Block- Copolymeren, enthaltend nicht-peptidische Polymere, sowie rekombinante Proteine, die beispielsweise auch eine in der Natur vorkommende Struktur imitieren können (biomimetische Proteine) . Figur 3 zeigt eine Möglichkeit nicht-peptidische Polymer¬ blöcke mit Endgruppen zu versehen, die die peptidischen
Erkennungssequenzen und nukleophilen Sequenzen für die
Transpeptidase-Enzyme aufweisen. Figur 4 zeigt im Detail eine Möglichkeit einer schrittweisen Block-Polymer-Synthese mit nukleophilen Peptidsequenzen, die mit Schutzgruppen versehen sind. Figur 5 zeigt schematisch verschiedenste Möglichkeiten die Gleichgewichtsreaktion einer Transpeptidase-Reaktion in
Richtung der Verknüpfung von Blöcken zu verschieben. Figur 6 zeigt ein Diagramm eines MALDI-ToF Massenspektrums von Reaktionsmischungen von Verknüpfungsreaktionen zwischen Nanopartikeln und Polymeren als Blöcken, die gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden und von MALDI- ToF Massenspektren von Negativkontrollen.
Figur 7 zeigt Transmissionselektronenmikroskopie-Aufnahmen (TEM) von Nanopartikel-Polymer Hybrid-Partikeln, die als Block-Copolymere gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden.
Figur 8 zeigt ein MALDI-ToF Massenspektrum von Blöcken mit peptidischen Erkennungssequenzen und Blöcken mit nukleophilen Sequenzen, wobei die Blöcke jeweils nicht-peptidische
Polymere sind. Weiterhin wird auch das Massenspektrum des Reaktionsproduktes, des Block-Copolymeren, gezeigt.
Figur 9 zeigt das Design von Polymer-Peptid (links) und
Peptid-Polymer (rechts) Bausteinen für die Transpeptidase- vermittelte Ligation. Der Pfeil verdeutlicht die Richtung der Peptidsynthese mittels Festphasenpeptidsynthese .
Figur 10 zeigt die Strategie für die Synthese von Peptid- Polymer Bausteinen am Beispiel von zwei N-terminalen Glycinen und dem Polymer Poly (N-isopropyl acrylamid) (PNIPAM) . Die grauen Kugeln repräsentieren das Harz der Peptidsynthese.
Figur 11 zeigt die Synthesestrategie für Peptid-Polymer (B) Bausteine am Beispiel von mehreren N-terminalen Aminosäuren und dem Polymer Poly (dimethylaminoethylmethacrylat )
(PDMAEMA) . Die grauen Kugeln symbolisieren das Harz der
Peptidsynthese . Die Fmoc-Schutzgruppe am N-Terminus sind hier nicht gezeigt.
Figur 12 skizziert die Strategie für die Synthese von
Polymer-Peptid Bausteinen am Beispiel von einer möglichen Erkennungssequenz und dem Polymer PNIPAM. Die grauen Kugeln symbolisieren das Harz der Peptidsynthese.
In Figur 13 ist die Synthesestrategie für Polymer-Peptid (A) Bausteine beispielhaft dargestellt mit einer möglichen
Erkennungssequenz, ergänzt um Aminosäuren für die Ausbildung einer ß-hairpin Struktur, und dem Polymer PNIPAM. Die grauen Kugeln symbolisieren das Harz der Peptidsynthese.
Figur 1 zeigt schematisch unterschiedliche Ausführungsformen von erfindungsgemäßen Verfahren. Im oberen Bereich ist dargestellt, wie kleine Nanopartikel 60A, beispielsweise mit einem Durchmesser von 60 nm über eine Funktionalisierungs- Reaktion mit C=C Doppelbindungen versehen werden und
anschließend mit einer nukleophilen Peptidsequenz 10A auf deren Oberfläche versehen werden. Diese Partikel, umfassend Nanopartikel gekoppelt an eine nukleophile Peptidsequenz, können nun mithilfe eines Transpeptidase-Enzyms 40 mit größeren Nanopartikeln 60B, die mit peptidischen
Erkennungssequenzen 15A versehen wurden, gekoppelt werden. Die peptidischen Erkennungssequenzen können analog zu dem kleinen Nanopartikel 60A ebenfalls mittels einer
Funktionalisierung der Nanopartikel-Oberfläche mit C=C
Doppelbindungen versehen werden, die anschließend mit der nukleophilen Peptidsequenz z. B. mittels einer „Thiol-Klick- Reaktion" koppeln können. Weiterhin können beispielsweise nicht-peptidische Polymere 20, zum Beispiel Polyethylenglykol mit einer nukleophilen Peptidsequenz 10A modifiziert werden. Analog lassen sich auch andere nicht-peptidische Polymere 30, beispielsweise
Poly (methylmethacrylate) mit peptidischen Erkennungssequenzen 15A versehen. Diese nicht-peptidischen Polymere können anschließend mittels einer durch eine Sortase 40
katalysierten Reaktion miteinander verknüpft werden und ein Block-Copolymer mit den Polymerblöcken 20 und 30 bilden, wobei eine peptidische Zwischensequenz 10Αλ, 15Αλ zwischen beiden Polymerblöcken gebildet wird. Analog können die nicht- peptidischen Polymerblöcke mit den peptidischen Erkennungs¬ sequenzen auch mit Nanopartikeln gekoppelt werden, sodass Hybrid-Materialien aus Nanopartikeln und nicht-peptidischen Polymeren 60B,20 gebildet werden.
Figur 2 zeigt schematisch eine Synthese von Block-Polymeren und Block-Copolymeren, wobei die Synthese schrittweise für die einzelnen Polymer-Blöcke oder in einer Eintopfreaktion durchgeführt wird. Im oberen Bereich der Figur ist ein nicht- peptidisches Polymer 5 mit einer peptidischen Erkennungs¬ sequenz 15A,B zu sehen. Dabei bezeichnet das Bezugszeichen 15A,B dass es sich sowohl um die peptidische Erkennungs- sequenz 15A für ein erstes Transpeptidase-Enzym oder auch um die peptidische Erkennungssequenz 15B für ein zweites, vom ersten Transpeptidase-Enzym unterschiedliches Enzym handeln kann. Weiterhin weist dieser Polymerblock 5 auch noch eine nukleophile Peptidsequenz 10A,B auf, die entweder von einem ersten Transpeptidase-Enzym als Sequenz 10A oder von einem zweiten Transpeptidase-Enzym als Sequenz 10B als Nukleophil eingesetzt werden kann. Mittels einer Transpeptidase
(Sortase) kann dieser nicht-peptidische Polymerblock 5 schrittweise mit weiteren Polymerblöcken gekoppelt werden. Beispielsweise kann dieser Polymerblock 5 mit einem weiteren Polymerblock 20, beispielsweise ebenfalls einen nicht- peptidischen Polymerblock über die peptidische
Erkennungssequenz 15A des Blocks 5 verknüpft werden. In diesem Fall weist der Polymerblock 20 eine nukleophile
Peptidsequenz 10A für ein erstes Sortase Enzym auf. Nach der Ligation liegt eine peptidische Zwischensequenz 10Αλ und 15Αλ zwischen beiden Blöcken 20 und 5 vor. Über die nukleophile Peptidsequenz 10B für ein zweites Sortase-Enzym kann der
Polymerblock 5 auch noch mit einem weiteren Polymerblock 30 gekoppelt werden, der eine peptidische Erkennungssequenz 15B für das zweite Sortase Enzym aufweist. Nach der Ligation liegt eine weitere peptidische Zwischensequenz 10Βλ und 15Βλ zwischen beiden Blöcken 5 und 30 vor.
Im mittleren und unteren Bereich der Figur 2 wird gezeigt, wie die nicht-peptidischen Polymerblöcke 5 und 30 auch mit Polymerblöcken 50 kombiniert werden können, die rekombinante Proteine aufweisen. Diese rekombinanten Proteine können beispielsweise natürlich vorkommende Funktionen von Proteinen imitieren, beispielsweise rekombinante Seidenproteine, wie Spinnenseidenproteine und daher als biomimetische Moleküle bezeichnet werden. Figur 2 zeigt dabei, dass mittels der Transpeptidase-Enzyme 40 die nicht-peptidischen Polymerblöcke 5 und 30 mit Protein-Polymerblöcken kombiniert werden können oder beispielsweise Block-Polymere gebildet werden können, die ausschließlich aus Proteinblöcken 50 bestehen. In der Figur 3 ist schematisch eine Möglichkeit gezeigt, wie nicht-peptidische Polymerblöcke an deren Enden mit nukleo- philen Peptidsequenzen und peptidischen Erkennungssequenzen für die Transpeptidase-Enzyme versehen werden können. Dazu werden zuerst die peptidischen Erkennungssequenzen 15 λ und die nukleophilen Sequenzen 10 vom C-Terminus zum N- Terminus hin mithilfe von Peptid-Synthetisierern hergestellt. Die Herstellung ist schematisch unter Punkt „1·" in Figur 3 gezeigt, wobei die dort dargestellten Proteinsequenzen analog zur Synthese vom C-Terminus zum N-Terminus laufen. In einem 2. Schritt bezeichnet mit „2." kann dann an der peptidischen Erkennungssequenz 15 λ ein Initiator für beispielsweise eine kontrollierte radikalische Polymerisation angebracht werden oder auch sogenannte RAFT CTAs 70 an der peptidischen
Erkennungssequenz erzeugt werden (RAFT Englisch: reversible addition fragmentation chain transfer, CTA Englisch: chain transfer agent) . Wie unter Punkt „2." gezeigt kann die nukleophile Peptidsequenz 10 λ auf einem Peptid-Synthetisierer separat hergestellt werden, wobei als Endgruppe eine
Doppelbindung 76 eingebaut werden kann. Diese Endgruppe mit einer Doppelbindung kann insbesondere nach der Peptidsynthese häufig am C-Terminus angebunden werden. Diese nukleophile Peptidsequenz enthält weiterhin noch eine Schutzgruppe 80, die später während der Kopplung mit anderen Blöcken
ungewollte Reaktionen der nukleophilen Sequenz blockieren soll . Ausgehend von dieser Gruppe mit der Doppelbindung kann beispielsweise durch kontrollierte radikalische
Polymerisation (CRP) eine wachsende Polymerkette an der peptidischen Erkennungssequenz erzeugt werden, wie unter Punkt „3." gezeigt. Diese Polymerisation kann zum Beispiel mittels der ATRP (ATRP Englisch: atom transfer radical polymerization) und RAFT Techniken erfolgen, bei denen ein Großteil der wachsenden Radikalkette in eine „schlafende" Form überführt wird und somit Kettenabbruchreaktionen minimiert werden können. Durch die Kontrolle über die
radikalische Polymerisation können Polymerblöcke mit enger Molekulargewichtsverteilung synthetisiert werden. Am Ende der Polymerkette kann die CTA-Gruppe in eine -SH Gruppe 75 überführt werden. Wie unter Punkt „4." gezeigt, kann über eine sogenannte „Thiol-Klick-Chemie" die nukleophile Sequenz 10A über eine Reaktion der -SH Gruppe 75 mit der
Doppelbindung 76 der nukleophilen Peptidgruppe über die dabei gebildete Gruppe 85 angebunden werden, sodass ein
Polymerblock 5 gebildet wird, an dessen Enden eine
peptidische Erkennungssequenz 15A und eine nukleophile
Peptidsequenz 10A mit einer Schutzgruppe 80 vorhanden sind. Polymerblöcke mit rekombinanten Proteinen als Blöcken können beispielsweise dadurch besonders einfach hergestellt werden, dass die rekombinanten Proteine an ihren C-Terminus und N- Terminus bereits zusammen mit den peptidischen Erkennungs¬ sequenzen und nukleophilen Peptidsequenzen kloniert und dann exprimiert werden. Figur 4 zeigt einen schematischen Ablauf eines erfindungs¬ gemäßen Herstellungsverfahrens zur Bildung von Block-Copoly- meren, wobei die peptidischen Erkennungssequenzen und nukleophilen Peptidsequenzen im größeren Detail gezeigt werden. Als Beispiel werden dabei die Erkennungssequenz und nukleophile Peptidsequenz der Sortase A srtA von Staphylococcus aureus gezeigt .
In den ganz oben in der Figur 4 gezeigten Verfahrensschritten A) und B) werden ein erster Block 5 mit einer peptidischen Erkennungssequenz 15A und einer nukleophilen Peptidsequenz
10A mit einer Schutzgruppe 80, sowie ein zweiter Block 20 mit einer nukleophilen Peptidsequenz 10A für die Sortase A bereitgestellt . Im Verfahrensschritt C) werden dann beide Blöcke miteinander verbunden, wobei das C-terminale Glycin der peptidischen Erkennungssequenz 15A abgespalten wird, und sich ein
Thioester-Acyl-Zwischenprodukt zwischen der Sortase und dem ersten Block 5 bildet (nicht in der Figur gezeigt) .
Prinzipiell ist es auch möglich in die peptidische Er¬ kennungssequenz an deren C-Terminus weitere Aminosäuren einzubauen, die später bei der Ligation abgespalten werden. Durch anschließenden nukleophilen Angriff der nukleophilen
Sequenz 10A auf dieses Zwischenprodukt werden beide Blöcke 5 und 20 über die dann gebildete peptidische Zwischensequenz 16 miteinander verknüpft. In einem Verfahrensschritt E) wird dann die Schutzgruppe 80 abgespalten, so dass nun auch die nukleophile Peptidsequenz 10A an Block 5 für eine weitere Kupplungs-Reaktion zur
Verfügung steht. Mittels weiterer Ligations-Reaktionen können dann in den Verfahrensschritten D) und F) an die bereits bestehenden verknüpften Blöcke 20 und 5 weitere Blöcke, beispielsweise ein dritter Block 30 angebunden werden. Im vorliegenden Fall wird die Verknüpfung zwischen der nukleophilen Peptidsequenz 10A des Blocks 5 und der peptidischen Erkennungssequenz des neuen Blocks 30 ebenfalls durch die Sortase A bewerkstelligt. Die nukleophile Sequenz des dritten Blocks 30 weist eine Schutzgruppe 80 auf. Diese kann dann in einem weiteren
Schritt, bezeichnet mit dem Bezugszeichen 90 wieder
abgespalten werden, sodass dann weitere Blöcke an die
wachsende Block-Copolymerkette angebunden werden können. Figur 5 zeigt schematisch ein mit „(a)" bezeichnetes Beispiel für eine Sortase katalysierte Verknüpfung von zwei Polymer¬ blöcken 5 und 20, die eine peptidische Erkennungssequenz 15A und eine nukleophile Peptidsequenz 10A aufweisen. Der mit 40 bezeichnete Gleichgewichtspfeil kennzeichnet die durch die Sortase katalysierte Gleichgewichtsreaktion. Bei der Verknüpfung beider Blöcke 5 und 20 wird auch ein Oligopeptid, 61 abgespalten. Da die Sortase 40 eine Gleichgewichtsreaktion katalysiert kann auch das gebildete Block-Copolymer aus den Polymerblöcken 5 und 20 durch Angriff des abgespaltenen
Oligopeptids 61 als Nukleophil wieder gespalten werden, wobei die Ausgangsverbindungen rückgebildet werden.
Mit „ (b) " wird eine alternative Reaktionsführung eines erfindungsgemäßen Herstellungsverfahrens bezeichnet, bei dem sowohl die peptidische Erkennungssequenz 15A als auch die nukleophile Peptidsequenz 10A einen Abstandshalter zu den Blöcken 20 und 5 mit der Peptidsequenz- WTWTW- aufweisen. Nach Bildung des Reaktionsproduktes faltet sich die pep- tidische Zwischensequenz 15Αλ,10Αλ aufgrund der Abstands¬ halter zu einem Beta-Hairpin, das einer Rückreaktion mit der Sortase nicht mehr oder nur noch schwer zugänglich ist.
Weitere Möglichkeiten die Gleichgewichtsreaktion in Richtung der Bildung des Produkts, den verknüpften Blöcken 5 und 20 zu verschieben sind in Figur 5 mit „(c)" bezeichnet. Dabei werden jeweils am C-terminalen Ende der peptidischen Erkennungssequenz chemische Gruppen 17A angekoppelt, die nach Bildung des Produkts als schwache Nukleophile 17B nicht oder nur mehr schwer in der Lage sind das gebildete Produkt aus den Blöcken 5 und 20 wieder zu spalten. Im Folgenden wird die Herstellung von Block-Copolymeren mittels erfindungsgemäßer Verfahren beschrieben. Dabei können Blöcke, enthaltend nicht-peptidische Polymere, insbesondere Kunststoffe als komplett artifizielle Blöcke mit weiteren artifiziellen nicht-peptidischen Polymeren oder mit künstlich erzeugten Nanopartikeln verknüpft werden. Im Einzelnen werden dabei Polymer-Polymer Copolymere aus Polyethylenglykol (PEG) und Poly (N-isopropyl acrylamid) (PNIPAM) , Nanopartikel die mit PEG oberflächenmodifiziert sind oder Nanopartikel- Nanopartikel-Konj ugate hergestellt.
Bildung von Nanopartikel-Polymer Block-Polymeren und - Copolymeren und Polymer-Polymer-Block-Copolymeren : Nanopartikel wurden mittels einer Sol-Gel-Methode mit Durch¬ messern von ungefähr 200 nm und 60 nm hergestellt. Dazu wurden 28 bis 30-prozentige Ammoniaklösung, destilliertes Wasser und Ethanol mit molaren Konzentrationen von 5 Mol/1 für das Wasser, 0,2 Mol/1 für die wässrige Ammoniaklösung und 0,2 Mol/1 für Tetraethyl-Orthosilikat für die Nanopartikel mit einem Durchmesser von 200 nm hergestellt. Für die
Nanopartikel mit einem Durchmesser von 60 nm wurden 1 Mol/1 Wasser, 0,2 Mol/1 wässrige Ammoniaklösung und 0,2 Mol/1 Tetraethyl-Orthosilikat eingesetzt. Zuerst wurde dazu eine Mischung aus Ethanol, Millipore Wasser und Ammoniak
zubereitet und nach 30 Minuten Aquilibrierung Tetraethyl- orthosilikat in den angegebenen Mengen hinzugegeben. Die Mischungen wurden mit einem Gesamtvolumen von 50 ml Ethanol für 24 Stunden bei Raumtemperatur gehalten.
Nach Bildung der Dispersion wurde 3- (Trimethoxysilyl) propyl- methacrylat zur Funktionalisierung der Oberflächen der Nanopartikel bei Raumtemperatur hinzugegeben, wobei sich an der Oberfläche der Nanopartikel eine Beschichtung mit C=C
Doppelbindungen bildet. Nach 12 Stunden Rühren wurde die Mischung für 1 Stunde im Rückfluss erhitzt, um ein kovalentes Binden zu gewährleisten.
Die Peptidsynthese der Peptidsequenzen mit der nukleophilen Sequenz kann mit einem MultiPep RSi Synthetisierer der Firma INTAVIS Bioanalytical Instruments AG (Köln) nach einem
Standard Fmoc (Fluorenylmethoxycarbonyl) Protokoll erfolgen. Als Harz wurde entweder Fmoc-G vorbeladenes oder unbeladenes verlinktes Polystyrol und als Lösungsmittel Dimethylformamid (DMF) verwendet. Die Aminosäuren wurden mit HBTU (2-(lH- Benzotriazol-l-yl) -1,1,3, 3-tetramethyluronium-hexa- fluorophosphat ) in DMF/NMM (N-Methylmorpholin) aktiviert und 2 mal in je 4 fächern Überschuss mit dem Peptid für 90 min umgesetzt. Die Abspaltung der Fmoc-Schutzgruppen erfolgte mit Piperidin und kann je nach Bedarf nach dem Anbinden des letzten Fmoc-G Derivats unterbleiben.
Die Peptide wurden durch Schütteln in 2 ml Trifluoressigsäure (TFA) / Triisopropylsilan (TIPS) / Wasser (92.5:5:2.5 V/V) Lösung von dem Harz abgespalten. Anschließend wurden die Peptide durch Fällen in 40 ml eiskaltem Diethylether und Zentrifugieren (2x 5000 rpm, 4 °C) gewaschen und isoliert. Die Reinigung erfolgte mit einem automatisierten HPLC/ESI MS System. Die Synthese der Peptide mit der peptidischen
Erkennungssequenz erfolgte analog, aber ohne Schutzgruppe.
Die Nanopartikel (NP) mit einem Durchmesser von 200 nm wurden mit einem Peptid der Sequenz H-Cys-Ile-Arg-His-Met-Gly-Phe- Pro-Leu-Arg-Glu-Phe-Leu-Pro-Glu-Thr-Gly-OH (Peptid 1 für peptidische Erkennungssequenz der Sortase A) und die Nano¬ partikel (NP) mit einem Durchmesser von 60 nm wurden mit einem Peptid der Sequenz H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Phe-Glu-Arg- Leu-Pro-Trp-Phe-Trp-Gly-Met-His-Arg-Ile-Cys-OH (Peptid 2 für nukleophile Peptidsequenz der Sortase A) funktionalisiert . Dazu wurden die Nanopartikel und die Peptide in einem Molaren Verhältnis von 1,1:1 (in Bezug auf die funktionellen Gruppen, bei den Nanopartikeln also die Anzahl der Doppelbindungen auf ihrer Oberfläche) in 3 Mol% 4, 4' -Azobis (4-cyanovaleriansäure) in Wasser gemischt. Die Mischung wurde unter Stickstoff- atmosphäre für 24 Stunden und unter Belichtung mit UV-Licht (365 nm) gerührt. Danach wurden die gebildeten Nanopartikel- Peptid-Konj ugate mit destilliertem Wasser gewaschen,
zentrifugiert und über Ultraschall gereinigt.
Zur Bildung der Polymer-Peptid Konjugate wurden Polyethylen glycol ) methyl-etheracrylat (PEGMA) und Maleinimid termi- niertes Poly (N-isopropyl acrylamid) (PNIPAM) mit Peptiden der Sequenz H-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Trp-Phe-Trp-Cys-OH (Peptid 3 mit der nukleophilen Peptidsequenz für Sortase A) bzw. mit Peptiden der Sequenz H-Cys-Ile-Arg-His-Phe-Leu-Pro-Glu-Thr- Gly-OH (Peptid 4 mit peptidischer Erkennungssequenz für
Sortase A) gekoppelt. Dazu wurden die Polymere und die
Peptide in einem Molverhältnis von 1,1:1 in einer Pufferlösung pH 7,4 unter Stickstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 24 Stunden gerührt. Die erhaltenen Produkte wurden zweimal gegen Millipore Wasser für 24 Stunden dialysiert, wobei eine Dialysemembran mit einem MWCO von 2 KDa verwendet wurde .
Zur Bildung der Nanopartikel-Polymer-Konj ugate oder Polymer- Polymer-Konj ugate wurden typischerweise in einem Reaktions- volumen von 100 μΐ 30 μΐ wässrige Lösung der beiden Substrate mit einem ungefähr 50-fachen Überschuss des Substrats mit der nukleophilen Peptidsequenz im Verhältnis zu dem Substrat mit der peptidischen Erkennungssequenz eingesetzt. Weiterhin wurden 20 μΐ Sortase A (7,95 mg/ml), 20 μΐ 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 750 mM NaCl, 20 μΐ 25 mM CaCl2, 10 μΐ Millipore Wasser entweder bei 28 °C (PEG-PNIPAM Konjugate) oder 37 °C (NP-PEG Konjugate, NP-NP Konjugate) in einem Thermomixer für 24 Stunden gemischt.
Figur 6 zeigt MALDI-ToF Massenspektren eines Reaktionsgemisches einer Verknüpfung von Nanopartikeln mit
Kunststoffen mit Sortase A und von Negativkontrollen. Die mit dem Bezugszeichen 110 versehene Kurve zeigt dabei nur
unmodifiziertes freies Polymer aus dem Reaktionsgemisch, das nicht an die Nanopartikel angebunden werden kann, da es weder eine peptidische Erkennungssequenz noch eine nukleophile Sequenz aufweist. Im Massenspektrum wird weiterhin noch eine negative Kontrolle ohne Sortase A eingeblendet, die sowohl unmodifiziertes freies Polymer als auch das Peptid-Polymer Konjugat (100) zeigt. Die Kurve mit Bezugszeichen 120 zeigt eine negative Kontrolle mit Nanopartikeln und Sortase, aber ohne Polymer.
Figuren 7a bis 7d zeigen Transmissionselektronenmikroskop- Aufnahmen (TEM) von Nanopartikel-Polymer-Konj ugaten nach der Sortase A Reaktion (Figuren 7b und 7b) , sowie Aufnahmen von Nanopartikeln in einer negativen Kontrolle ohne Polymer
(Figur 7c) bzw. einer negativen Kontrolle ohne Sortase A
(Figur 7d) . Dabei sind deutlich die Nanopartikel 130, sowie die Polymerbeschichtung 140 auf den Nanopartikeln in den Figuren 7a und 7b zu erkennen. Im Gegensatz dazu zeigen die negativen Kontrollen in den Figuren 7c und 7d keine
Polymerbeschichtung 140.
Figur 8 zeigt ein MALDI-ToF Massenspektrum von nicht- peptidischen Polymeren, nämlich Polyethylenglykol PEG verknüpft mit Peptid 3 (Kurve mit Bezugszeichen 180), PNIPAM verknüpft mit Peptid 4 (Kurve mit Bezugszeichen 160), einer negativen Kontrolle ohne Sortase A Enzym (Bezugszeichen 170), sowie dem Produkt der Sortase A Reaktion, dem PEG-PNIPAM Konjugat (Bezugszeichen 150). Dieses Massenspektrum zeigt daher eindeutig, dass mittels der Sortase A eine peptidische Bindung zwischen beiden Polymeren geknüpft wird.
Synthese von Polymer-Blöcken mit nukleophilen Peptidsequenzen und peptidischen Erkennungssequenzen über RAFT- Polymerisation :
Die Synthese von Polymer-Bausteinen, die über ein Peptidmotiv für Sortase-vermittelte Ligation verfügen, ist im Folgenden näher erläutert. Als Polymerisationstechnik wurde in diesem Fall die „reversible addition fragmentation chain transfer" (RAFT) Polymerisation gewählt, die die Synthese jeglicher Polymer-Bausteine für eine Transpeptidase-vermittelte
Ligation, z. B. mittels einer Sortase erlaubt, bei denen die Polymere durch RAFT Polymerisation synthetisiert werden können. Damit können sowohl verschiedene Monomere
polymerisiert als auch das Molekulargewicht der Polymere variiert werden. Für diese Polymerisationsmethode wird ein chain transfer agent (CTA) an einen Peptid-Terminus gebunden und anschließend die Polymerisation durchgeführt. Die kurzen Peptidsequenzen sind auch in einigen organischen Solventien löslich und verfügen über keine entscheidende Sekundär- oder Tertiärstruktur, so dass die Polymerisationen in einer
Vielzahl an Lösungsmitteln erfolgen können.
Die Peptid-Konj ugate werden sowohl mit Anbindung der
Polymerblöcke an C- als auch N-Terminus der Peptide benötigt (Figur 9) . Dazu müssen zwei Synthesewege unterschieden werden. Bei der nukleophilen Peptidsequenz , (G)n mit n = 1-5, muss das Polymer an den C-Terminus des Peptids gebunden sein und bei der peptidischen Erkennungssequenz an den N-Terminus. Die Peptidsequenzen können mit einem Peptid-Synthetisierer hergestellt werden. Die Festphasen-Peptidsynthese erfolgt von C- zu N-Terminus.
(G)n-CTA kann nur in zwei Schritten hergestellt werden. Der Syntheseweg umfasst die Peptidsynthese, Abspaltung und
Reinigung des Peptids und Anbinden von RAFT-CTA zur
anschließenden Polymerisationsreaktion (Figur 10 und Figur 11) .
Die Synthese kann auf GGWTWTW-Polymer Konjugate ausgeweitet werden (Figur 11) . Die Figuren 12 und 13 zeigen die Synthese nur mit GG und danach mit GGWTWTW für die Beta-Hairpin
Strukturen .
Bei der Synthese von Polymer-WTWTWLPETGGRR Konjugaten kann als letzter Schritt der Peptidsynthese direkt in dem
Synthetisierer eine Funktionalität an den N-Terminus gebunden werden (Figuren 12 und 13) . Hier soll ein geeignetes RAFT- Agens an die SrtA Erkennungssequenz gebunden werden. Die Figuren 12 und 13 zeigen die Synthese nur mit LPETG und danach mit WTWTWLPETG für die Beta-Hairpin Strukturen.
Im Folgenden wird die Synthese eines an ein chain transfer agent (CTA) gebundenen GG-Peptids mit einer Fmoc-Schutzgruppe und die anschließende Synthese eines Peptid-Polymer Blocks beschrieben:
Synthesevorschrift für Fmoc-GG-CTA: N-Fmoc-L-glycylglycin (720 mg, 2.04 mmol), 2 Hydroxyethyl 2- ( ( (butylthio) carbonothioyl) thio) -2-methylpropanoat (60 mg, 0.20 mmol) und N, N' -dicyclohexylcarbodiimide (DCC) (618 mg, 3.0 mmol) wurden in einem Kolben in 6 mL THF gelöst. Die Mischung wurde gerührt und 5 min vor der Zugabe von 4-
(Dimethylamino) pyridin (DMAP) (72 mg, 0.6 mmol) mit einem Eisbad gekühlt. Der Kolben verblieb noch 1 h in dem Eisbad und die Reaktionsmischung wurde anschließend bei RT über Nacht gerührt. Die Lösung wurde in ca. 20 mL Diethylether gegeben, filtriert, mit 5% Natriumhydrogencarbonat Lösung (3- mal, 20 mL) und Wasser (2-mal, 20 mL) gewaschen. Die
organische Phase wurde über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und das Lösungsmittel im Vakuum
entfernt. Das Produkt wurde durch Säulenchromatographie mit Silicagel und Ethylacetat : Pentan (1:1, v/v) als
Elutionsmittel isoliert und in 43 % Ausbeute (56 mg)
erhalten. 1H-NMR (500 MHz, CDC13, 298 K) δ: 7.77 (d, J = 7.5 Hz, 2H, Ar-H) , 7.60 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ar-H) , 7.41 (m, 2H, Ar-H) , 7.32 (m, 2H, Ar-H), 4.46 (m, 2H, -CH2-), 4.33 (s, 2H, -CH2-), 4.23 (t, J = 6.8 Hz, 1H, -CH-), 4.06 (d, 2H, -CH2-), 3.94 (s, 2H, -CH2-), 3.26 (t, J = 7.4 Hz, 2H, -CH2-),1.69 (s, 6H, -(CH3)2), 1.54 (m, 2H, -CH2-), 1.42 (m, 2H, -CH2-), 1.25 (s, 2H,-CH2-), 0.92 (t, 3H, -CH3) . Synthesevorschrift für Fmoc-GG-PNIPAM:
Polymerisation von NIPAM von Fmoc-GG-CTA (mit einem
anvisierten Polymerisationsgrad von 130): 174.5 mg NIPAM (1.54 mmol), 7.5 mg Fmoc-GG-CTA (0.012 mmol), 5 mL Dioxan und 0.6 mg ABCVA (2.14 ymol) wurden zusammen mit einem
Rührstäbchen in einen Schlenkkolben gegeben. Das
Reaktionsgefäß wurde anschließend durch fünf Einfrieren- Evakuieren-Auftauen Zyklen entgast. Das Reaktionsgemisch wurde mithilfe eines Ölbads auf 90 °C erhitzt und unter
Stickstoff-Atmosphäre für 6 h gerührt. Anschließend wurde der Kolben in flüssigen Stickstoff gehalten, um die Reaktion zu beenden. Die Mischung wurde in ein Zentrifugenröhrchen überführt und ein Überschuss Diethylether zugegeben, um das PNIPAM auszufällen. Das Polymer wurde 2-mal mit Diethylether gewaschen und im Vakuum getrocknet.
Synthesevorschrift für GG-PNIPAM:
Abspalten von Fmoc: Fmoc-GG-PNIPAM wurde in 2 mL Piperidin : Dichlormethan (1:1, v: v) gelöst und für 12 h gerührt.
Anschließend wurde Diethylether hinzugegeben, um das Polymer auszufällen. Das Präzipitat wurde mit Diethylether gewaschen und durch Zentrifugation isoliert.
Die Erfindung ist nicht durch die Beschreibung anhand der Ausführungsbeispiele beschränkt. Vielmehr umfasst die
Erfindung jedes neue Merkmal sowie jede Kombination von
Merkmalen, was insbesondere jede Kombination von Merkmalen in den Patentansprüchen beinhaltet, auch wenn dieses Merkmal oder diese Kombination selbst nicht explizit in den
Patentansprüchen oder Ausführungsbeispielen angegeben ist.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren (1),
umfassend einen ersten (5, 60A, 50) und einen zweiten Block (20, 60B, 50) mit den Verfahrensschritten:
A) Bereitstellen eines ersten Blocks (5, 60A, 50) mit einer nukleophilen Peptidsequenz (10A, 10B) für ein erstes Transpeptidase-Enzym (40),
B) Bereitstellen eines zweiten Blocks (20, 60B, 50) mit einer peptidischen Erkennungssequenz (15A, 15B) für das erste Transpeptidase-Enzym (40),
C) Verknüpfen des ersten Blocks mit dem zweiten Block mittels des ersten Transpeptidase Enzyms,
- wobei der erste und zweite Block unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Nanopartikeln
(60A, 60B) , nicht-peptidischen Polymeren (5, 20, 30), und rekombinanten Proteinen (50).
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der zweite Block eine erste weitere nukleophile Peptidsequenz aufweist.
3. Verfahren nach dem vorhergehenden Patentanspruch,
- wobei die erste weitere nukleophile Peptidsequenz durch eine Schutzgruppe blockiert ist.
4. Verfahren nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei die erste weitere nukleophile Peptidsequenz für das erste Transpeptidase-Enzym ist. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche
2 bis 4, zur Herstellung eines Block-Polymeren mit zumindest drei Blöcken, umfassend die weiteren
Verfahrensschritte : D) Bereitstellen eines dritten Blocks mit einer
peptidischen Erkennungssequenz für das erste Trans- peptidase-Enzym,
E) Falls vorhanden- Entfernen der Schutzgruppe der
ersten weiteren nukleophilen Peptidsequenz des zweiten Blocks,
F) Verknüpfen des dritten Blocks mit dem zweiten Block mittels des ersten Transpeptidase-Enzyms .
Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 2 oder 3,
- wobei die erste weitere nukleophile Peptidsequenz für eine zweite von der ersten Transpeptidase unterschiedliche Transpeptidase ist.
Verfahren nach dem vorherigen Patentanspruch, zur Herstellung eines Block-Polymeren mit zumindest drei Blöcken, umfassend die weiteren Verfahrensschritte:
G) Bereitstellen eines dritten Blocks mit einer
peptidischen Erkennungssequenz für das zweite Transpeptidase-Enzym,
H) Verknüpfen des dritten Blocks mit dem zweiten Block mittels des zweiten Transpeptidase-Enzyms.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche 5 bis 7, wobei der dritte Block eine nukleophile
Sequenz für eine Transpeptidase aufweist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche 5 bis 8 zur Herstellung von Block-Polymeren mit zumindest vier Blöcken, bevorzugt zumindest 6, weiter bevorzugt zumindest 8 Blöcken, wobei nach den
Verfahrensschritten F) bzw. H) zumindest eine, bevorzugt 3, weiter bevorzugt 5 weitere Blöcke jeweils mit einer nukleophilen und einer peptidischen
Erkennungssequenz für ein oder mehrere Transpeptidase- Enzyme bereitgestellt werden und mittels dieser einen oder mehreren Transpeptidase-Enzyme miteinander
verknüpft und an den dritten Block angebunden werden.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche zur Herstellung von Block-Copolymeren, wobei für zumindest zwei Blöcke von den ersten, zweiten und den gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren
Blöcken, Blöcke mit unterschiedlicher Struktur
verwendet werden. 11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei für den ersten, zweiten und die gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke synthetische Polymere verwendet werden. 12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei für den ersten, zweiten und die gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke nicht-peptidische Biopolymere, unabhängig voneinander ausgewählt insbesondere aus Polyhydroxybutyraten,
Cellulose, Chitin, Stärke, Polylactiden und
Kohlenhydraten sowie Kombinationen davon verwendet werden .
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patent- ansprüche, wobei für den ersten, zweiten und die gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke peptidische Biopolymere, unabhängig voneinander
ausgewählt insbesondere aus Spinnenseidenproteinen, Kollagen und Keratin sowie Kombinationen davon
verwendet werden.
14. Verfahren nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei für den ersten, zweiten und die gegebenenfalls
vorhandenen dritten und weiteren Blöcke
Spinnenseidenproteine verwendet werden.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche zur Herstellung von verzweigten Block-Polymeren, wobei zumindest einer der ersten, zweiten und gegebenenfalls vorhandenen dritten und weiteren Blöcke zumindest drei Sequenzen, ausgewählt aus peptidischen Erkennungs¬ sequenzen und nukleophilen Sequenzen für ein
Transpeptidase-Enzym zur Anbindung weiterer Blöcke aufweist .
Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die peptidischen Erkennungssequenzen unabhängig voneinander ausgewählt sind aus folgenden Sequenzen :
LPXTG, - LPXTA, -NPQTN, -QVPTG, -LAXTG, LPXSG, NHV, -DHV, - (Y) ZRH, -
(M/L/V) (P/T/A/S) X (A/L/T/S/V/I) G, IPKTG, APKTG, DPKTG, SPKTG, APATG und LPECG, wobei X jede mögliche Aminosäure ist und der Parameter z 0 1 sein kann.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Patentansprüche, wobei die nukleophilen Sequenzen unabhängig voneinander ausgewählt sind aus -(G) 1-5, bevorzugt - (G) 1- 3, - (X) i-5- und -(A) 1-5, wobei X jede beliebige
Aminosäure ist.
18. Verfahren nach einem der vorherigen Patentansprüche, wobei das oder die Transpeptidase-Enzyme unabhängig voneinander ausgewählt sind aus: Sortasen, oder
Fragmenten davon, insbesondere Sortase A, Sortase B, Sortase C, Sortase D, Sortase E, und Butelase sowie Kombinationen davon.
19. Verfahren zur Herstellung von Block-Polymeren mit den Verfahrensschritten :
AI) Bereitstellen einer Vielzahl von Blöcken mit einer nukleophilen Sequenz und einer peptidischen Erkennungssequenz für zumindest ein Transpeptidase-Enzym,
Bl) Verknüpfen der Vielzahl von Blöcken durch das zumindest eine Transpeptidase-Enzym,
- wobei die Vielzahl der Blöcke unabhängig
voneinander ausgewählt ist aus: Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, und rekombinanten Proteinen .
20. Verfahren nach dem vorhergehenden Patentanspruch, wobei bei zumindest einigen, bevorzugt allen der Vielzahl von
Blöcken die nukleophile Sequenz durch eine Schutzgruppe blockiert ist, und im Verfahrensschritt Bl) vor dem Verknüpfen die Schutzgruppen entfernt werden.
21. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche 19 oder 20, wobei die Vielzahl von Blöcken im Verfahrensschritt Bl) schrittweise Block für Block verknüpft werden.
22. Verfahren nach Anspruch 19, wobei im Verfahrensschritt Bl) die Vielzahl der Blöcke im Eintopf-Verfahren verknüpft werden.
23. Block-Polymer mit zumindest einem ersten Block 1 und einem zweiten Block 2 umfassend folgende Struktur:
Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2
- wobei die Block 1 und Block 2 verbrückende
peptidische Zwischensequenz 1 eine Sequenz enthält oder eine Sequenz ist, ausgewählt aus folgender Gruppe :
- (I/L) (P/A)XT (G) !_5-, - (I/L) (P/A)XT(A) i-5-, - NP(Q/K)T(G) i-5-, -NP(Q/K)T(A) i-5-, -QVPT (G) i_5-, - QVPT(A) !_5-, -LAXT (G) !-5-, -LAXT (A) 1-5- , -LPXS (G) 1-5-, -LPXS (A) 1-5- , -N(X) i-s-, -D(X) i-5-,-LPNT(G) i-5-, - LPNT(A) !_5-, IPKT(G) i-5, IPKT (A) 1-5, APKT (G) 1-5, APKT(A) !_5, DPKT(G) i-s, DPKT (A) i_5 , SPKT (G) 1-5, SPKT(A) i_5, APAT(G) i-5, APAT (A) i_5 und LPEC (G) 1-5,
LPEC(A) i_5, M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (G) 1-5 und
- (M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (A) !-5, wobei X jede mögliche Aminosäure ist,
- und wobei Block 1 und Block 2 unabhängig
voneinander ausgewählt sind aus:
Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, rekombinanten Proteinen.
Block-Polymer nach dem vorhergehenden Patentanspruch mit folgender Struktur, zusätzlich umfassend zumindest einen dritten Block 3:
Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2
peptidische Zwischensequenz 2-Block 3 - wobei die peptidische Zwischensequenz 2 unabhängig von der peptidischen Zwischensequenz 1 eine Sequenz enthält oder eine Sequenz ist, ausgewählt aus folgender Gruppe:
- - (I/L) (P/A)XT (G) !_5-, - (I/L) (P/A)XT(A) i-5-, - NP(Q/K)T(G) i-5-, -NP(Q/K)T(A) i-5-, -QVPT (G) i_5-, - QVPT(A)!_5-, -LAXT (G) !-5-, -LAXT (A) 1-5- , -LPXS (G) 1-5-, -LPXS (A) 1-5- , -N(X) i-s-, -D(X) i-5-,-LPNT(G) i-5-,- LPNT(A)!_5-, IPKT(G) i_5, IPKT (A) 1-5, APKT (G) 1-5, APKT(A)!_5, DPKT(G) i_5, DPKT (A) i_5 , SPKT (G) 1-5, SPKT(A) i-s, APAT(G) i-5, APAT (A) i_5 und LPEC (G) 1-5,
LPEC(A) i_5, M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (G) 1-5 und -(M/L/V) (P/T/A/S) A(A/L/T/S/V/I) (A) 1-5, und
- und wobei Block 1, Block 2 und Block 3 unabhängig voneinander ausgewählt sind aus:
- Nanopartikeln, nicht-peptidischen Polymeren, und rekombinanten Proteinen.
25. Block-Polymer nach einem der vorherigen Ansprüche 23 oder 24, mit n zusätzlichen Wiederholungseinheiten der allgemeinen Struktur : [ -peptidische Zwischensequenz
Block] mit der allgemeinen Struktur:
Block 1 -peptidische Zwischensequenz 1-Block 2
peptidische Zwischensequenz 2-Block 3- [peptidische
Zwischensequenz -Block ]
wobei die n zusätzlichen peptidischen
Zwischensequenzen unabhängig voneinander
ausgewählt sind aus der entsprechenden Gruppe wie in Anspruch 23 beansprucht, und
wobei die n zusätzlichen Blöcke unabhängig voneinander ausgewählt sind aus der entsprechenden Gruppe wie in Anspruch 23 beansprucht, und - wobei n eine ganze Zahl zwischen 1 und 50, bevorzugt zwischen 3 und 30, am meisten bevorzugt zwischen 4 bis 10 ist.
26. Block-Polymer nach einem der vorherigen Ansprüche 23 bis 25, wobei die nicht-peptidischen Polymere
unabhängig voneinander ausgewählt sind aus
Polymethylmethacrylaten, Polyethylenglykolen,
Polyacrylamiden und weiteren Polymeren, die aus vinylischen Monomeren aufgebaut sind.
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