EP3642323A1 - Procede de conservation d'un echantillon de bacteries - Google Patents

Procede de conservation d'un echantillon de bacteries

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EP3642323A1
EP3642323A1 EP18725288.7A EP18725288A EP3642323A1 EP 3642323 A1 EP3642323 A1 EP 3642323A1 EP 18725288 A EP18725288 A EP 18725288A EP 3642323 A1 EP3642323 A1 EP 3642323A1
Authority
EP
European Patent Office
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bacteria
sample
medium
aerobic
protective agents
Prior art date
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EP18725288.7A
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German (de)
English (en)
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EP3642323C0 (fr
EP3642323B1 (fr
Inventor
Jean-Christophe LAGIER
Didier Raoult
Sara BELLALI
Saber KHELAIFIA
Camille GOUIRAN
Eric Chabriere
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Assistance Publique Hopitaux de Marseille APHM
Fondation Mediterranee Infection
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/04—Preserving or maintaining viable microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for preserving a sample of a set of aerobic and anaerobic bacteria other than lactic acid bacteria, in particular bacteria of the intestinal microbiota, more particularly a sample of human faeces, and a lyophilisate obtained.
  • Human stools are characterized by the presence of an intestinal microbiota including all the microorganisms of the human digestive tract including aerobic bacteria and strict anaerobic bacteria and archaea methanogens such as Methanobrevibacter smithii the latter being the most difficult to keep.
  • Lyophilization is intended to remove the water contained in a product by freezing followed by sublimation to facilitate preservation.
  • the frozen products are thus dried under vacuum, without thawing.
  • Lyophilization of human stools allows preservation in conditions avoiding the cold chain and allowing their gelatinization to be administered for therapeutic use, particularly in the context of probiotic treatments or intestinal microbiota transplants by which microbes are absorbed.
  • an autologous faecal sample is taken from the patient before medical treatment, for example before an operation or risk situation. The sample is kept. If the patient develops a C. difficile infection, then the sample is extracted into saline and filtered. The filtrate is lyophilized.
  • the resulting lyophilisate (powder) is formulated as enteric-coated capsules (resistant to stomach acid stomach) to restore the patient's anterior colonic flora by competing with C. difficile. This procedure avoids the risk of introducing another pathogen from a donor who is not the patient. It also avoids the problem of administration by nasal probe to reach the duodenum of the patient.
  • Lyophilization leads to the destruction or decrease of the viability of a considerable number of bacteria with a bacterial mortality that ranges from 90% to 99.99% depending on their aerotolerant or aerololating nature.
  • Lyophilization is a cold drying process generally used only for bacterial samples of highly heat-sensitive bacteria such as lactic acid bacteria.
  • the viability of freeze-dried lactic acid bacteria is improved by adding to the sample before freeze-drying protective agents comprising:
  • a compound increasing the glass transition temperature of the lyophilizate namely glycerol or a carbohydrate such as lactose, galactose, maltose, sucrose and glucose.
  • the object of the present invention is to provide a method for maintaining the maximum viability of intestinal microbiota bacteria in human stools.
  • common unique lyophilization conditions have been found to multiply by at least 100 the number of aerobic bacteria as well as viable anaerobic bacteria present in a sample of a set of said aerobic and anaerobic bacteria other than lactic acid bacteria, in particular a sample of human stool after lyophilization in comparison with the standard lyophilization process.
  • freeze-drying conditions consist of:
  • rapidly frozen cells generally have a lower survival rate than slowly frozen cells
  • rapid freezing in nitrogen (-196 ° C) makes it possible to increase the survival rate of said bacteria, in particular the microbiota of human stool by a factor of at least 100 compared with a slow freezing at -80 ° C. before lyophilization.
  • the present invention provides a method of preserving a sample of a set of aerobic and anaerobic bacteria other than lactic acid bacteria, including bacteria of the gut microbiota, comprising the following successive steps in which: a) is prepared a said sample of a set of said bacteria by dilution in an aqueous storage medium comprising a combination of protective agents comprising (a1) at least one antioxidant compound and (a2) at least one sugar, and preferably (a3) milk protein, and b) freezing said sample recovered in step a) in liquid nitrogen at about -196 ° C for no more than 2 minutes, preferably not more than 1 minute, especially during 30 minutes. at 50 seconds, and c) freeze-drying said sample thus frozen to obtain a lyophilisate.
  • step b) said sample recovered in step a) is frozen in a container by immersing the container containing said sample in liquid nitrogen.
  • milk proteins is used here to mean the proteins chosen from mainly caseins and whey proteins such as lactalbumin and lactoglobulins.
  • step c) the freeze-drying involves a sublimation consisting of dehydration of the frozen product by vacuum desiccation of the ice without melting the ice, the water is sublimated that is to say it passes directly from solid to gaseous state.
  • This step therefore essentially consists in establishing a high vacuum. More particularly, in step c) the frozen sample is deposited in a freeze dryer for at least 12 hours at a temperature of at least 0 ° C and at a vacuum pressure of not more than 1mbar.
  • a said sample is prepared which is a clinical stool sample by diluting said stool in an aqueous preservation medium, and the dispersion obtained is filtered to remove at least the larger size debris. at 2mm.
  • said sample is diluted in an aqueous preservation medium comprising at least the triple combination (a1) of at least one antioxidant compound, preferably at least two antioxidant compounds, and (a2) at least two different sugars, and (a3) milk proteins.
  • the milk proteins are in the form of whole milk, preferably at a weight concentration in said preservation medium of at least 5%, preferably 10%.
  • said protective agents comprise a combination of antioxidant compounds selected from ascorbic acid, uric acid and glutathione.
  • the said protective agents comprise a combination of antioxidant compounds consisting of ascorbic acid at a concentration of 1 g / l, uric acid at a concentration of 0.4 g / l and glutathione at a concentration of 0, lg / L.
  • said protective agents comprise at least one sugar chosen from sucrose (hereinafter referred to as "sucrose”) and trehalose.
  • said protective agents comprise sucrose at a weight concentration in said preservation medium of at least 5%, preferably 10%.
  • the said preservation medium is a buffering medium at pH 7 to 7.5 comprising in water the salts KCL, CaCl 2 , MgCl 2 , KH 2 PO 4 , Na 2 HPO 4 , NaCl and KOH as well as at least one said protective agent.
  • the said conservation medium comprises:
  • said sample comprises at least the following aerobic bacteria and anaerobic bacteria: Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agalactiae, Serratia marcescens, P rote us mirabilis, Staphylococcus epidermidis, Bacillus circula ns, Streptococcus pneumoniae , Staphylococcus hominis and Acinetobacter baumanii.
  • said sample comprises at least the following strict anaerobic bacteria: Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massilioamazoniensis, Clostridium beijerinckii, Clostridium irregular Finegoldia magna, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Haemophilus influenzae.
  • the present invention therefore also relates to a sample lyophilisate of a set of aerobic and anaerobic bacteria other than lactic acid bacteria, in particular intestinal microbiota bacteria, more particularly a human stool sample, obtained by a method according to US Pat. invention as defined above, characterized in that it comprises:
  • At least one protective agent consisting of milk proteins and preferably at least the combination of protective agents consisting of (a1) at least one antioxidant compound and (a2) at least one sugar, and (a3) milk proteins , and
  • a quantity of living gut microbiota bacteria preferably in the number of:
  • a lyophilizate according to the invention comprises said protective agents consisting of al) a combination of 3 antioxidant compounds consisting of ascorbic acid, uric acid and glutathione, and a2) at least 2 different sugars consisting of in sucrose and trehalose, and a3) milk proteins.
  • FIGS. 1A and 1B illustrate the results of differences in the amount of living bacteria detected by the differences in log CFU numbers of aerobic bacteria (FIG. 1A) and anaerobic bacteria (FIG. 1B) after various freezing protocols used P1, P2 and P3. stool samples without a protective agent in the preservation medium;
  • FIGS. 2A and 2B illustrate the results of the amount of live bacteria detected under anaerobiosis at 48 hours (FIG. 2A) and in anaerobiosis after 6 weeks storage of the lyophilizate at 4 ° C. (FIG. 2B), using the log CFU / mL, on stool samples with different conditions of preservation media:
  • A fresh stool in saline water
  • B freeze-dried in PBS medium
  • C lyophilizate with PBS medium containing antioxidants alone
  • D lyophilizate with PBS medium containing milk powder alone
  • E lyophilisate with PBS medium containing antioxidants + sucrose + milk powder
  • F free saddle freezing in PBS medium without protective agent;
  • FIGS. 3A and 3B illustrate the results of the amount of bacteria detected aerobically at 48 hours (FIG. 3A) and aerobically after 6 weeks of storage of the lyophilizate at 4 ° C. (FIG. 3B), with the log CFU / mL, on stool samples with the same media conditions A, B, C, D, E and F;
  • FIG. 4 represents graphs illustrating the results of the amount of living bacteria detected in a sample after lyophilization of a cocktail of 11 anaerobic bacteria by the log CFU / ml with the same conditions of preservation medium A, B, C, D. , E and F;
  • FIGS. 5A and 5B illustrate the results of differences in the amount of living bacteria detected by the differences in log numbers of CFU of aerobic bacteria (FIG. 5A) and anaerobic bacteria (FIG. 5B) on stool samples with different protective agents. 1 to 15 in the conservation environment;
  • FIGS. 6A and 6B illustrate the comparative results of differences in the amount of living bacteria detected by the differences in log numbers of CFU of aerobic bacteria (FIG. 6A) and anaerobic bacteria (FIG. 6B) on stool samples under 4 conditions. to 4 with different protective agents No. 14 and 15 under two different freezing conditions before lyophilization.
  • 29 bacterial strains of the digestive flora were selected from URMITE's International Collection of Microorganisms CSUR (Strain Collection of the Rickettsia Unit) (WDCM 875) (Table 1 below).
  • Bacterial strains are stored in a form suitable for subsequent freezing in tubes containing freezing broth containing glycerol porous beads called cryobeads.
  • Table 1 List of 29 reference bacterial strains
  • Bacterial strains samples are similarly stored in glass jars containing preservation medium (2ml) (Vial type, REF 223683, Wheaton Millville, New Jersey, USA). The samples were then frozen either at -80 ° C or in liquid nitrogen for 30 seconds to 2 minutes, then placed in a DELTA 1-24 LSC freeze-dryer (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, DE) for 36 h at room temperature. of 0 ° C, and at a reduced pressure of 0.63 mbar. The lyophilizates obtained were stored at room temperature.
  • preservation medium 2ml
  • the samples were then frozen either at -80 ° C or in liquid nitrogen for 30 seconds to 2 minutes, then placed in a DELTA 1-24 LSC freeze-dryer (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, DE) for 36 h at room temperature. of 0 ° C, and at a reduced pressure of 0.63 mbar.
  • the lyophilizates obtained were stored at room temperature.
  • CFU Colonial Forming Units
  • results obtained from fresh stool are used as reference and compared to those obtained from the same sample previously frozen in different preservation media and optionally freeze-dried.
  • the total number of viable microorganisms after aerobic and anaerobiosis culturing on petri dishes was evaluated before and after lyophilization.
  • the viable microorganism loss with respect to the fresh stool is expressed as a logarithmic difference in CFU lost after the various freezing protocols used throughout the experiment.
  • the colonies thus cultivated are exhaustively identified by MALDI-TOF mass spectrometry using a MICROFLEX mass spectrometer (Bruker Daltonics). Each deposit is covered with 2 ml of matrix solution ( ⁇ -saturated cyano-4-hydroxyciannamic acid in 50% acetonitrile and 2.5% trifluoroacetic acid) as described in the literature (ref.l). This analysis is performed using according to the manufacturer's recommendations. The spectra thus generated are compared with the database of the Bruker database combined with the specific database of the La Timone hospital laboratory. An isolate is considered correctly identified by MALDI-TOF if its identification score is greater than 1.9. For the unidentified colonies, after 3 passages with MALDI-TOF, 16S RNA sequencing is performed (ref.2).
  • Salt water included:
  • the milk tested was skim milk or whole milk powder.
  • the best results were obtained with whole milk powder (Reauxlait, Lyon, France) at a concentration of 10% by weight.
  • sucrose also hereinafter referred to as "sucrose”
  • trehalose Inresa Medical, Bartenheim, France
  • composition of the PBS medium was as shown in Table 3 below.
  • FIGS. 1A and 1B illustrate the log numbers of CFU of aerobic bacteria (FIG. 1A) and anaerobic bacteria respectively (FIG. 1B) lost after the various freezing protocols used on 6 stool samples without protective agents in the preservation medium:
  • FIGS. 1A-1B illustrate that the preservation of the bacterial viability after lyophilization without protective agents remains however significantly less effective than after freezing at -80 ° C. for 48 hours without freeze-drying.
  • rapid freezing in nitrogen makes it possible to increase the survival rate of said bacteria, especially microbiota of human faeces by at least a factor of 100 (2 log) compared with slow freezing at -80 ° C before lyophilization.
  • the presence of glycerol in the preservation medium does not have a positive impact on viability.
  • antioxidants and sugar alone or in combination has a positive impact but does not improve the viability compared to frozen samples without lyophilization.
  • protective agents comprising: milk + antioxidants + sucrose and / or trehalose which makes it possible to achieve a level of viability greater than or equal to that with a preservation medium with milk alone and with that for frozen stool without lyophilization.
  • FIGS. 2A and 2B illustrate the results of the amount of bacteria detected cultured anaerobically after 48 hours of storage of the lyophilizate at 4 ° C. (FIG. 2A) and anaerobiosis after 6 weeks of storage of the lyophilisate at 4 ° C. (FIG. 2B ) on 6 stool samples with 5 different media conditions:
  • A fresh sample in saline water (here fresh stool)
  • B lyophilizate in PBS medium
  • C Lyophilizate with PBS medium containing antioxidants alone
  • D Lyophilizate with PBS medium containing milk powder alone
  • E Lyophilisate with PBS medium containing antioxidants + sucrose + milk powder
  • F freezing the fresh sample in PBS medium without protective agent.
  • FIGS. 3A and 3B illustrate the results of the amount of bacteria detected by aerobic culturing after 48 hours of preservation of the lyophilisate at 4 ° C. (FIG. 3A) and aerobically after 6 weeks of storage of the lyophilisate at 4 ° C. (FIG. 3B) on 6 stool samples with the same conditions of different media A, B, C, D, E and F. Nitrogen freezing was found to be more efficient in the previous chapter, all freeze-drying steps of Figs. 2A-2B and 3A-3B are preceded by a liquid nitrogen freezing step at -196 ° C. C.
  • the graphs of FIG. 4 illustrate that the ternary medium E (Lyophilisate with antioxidants + sucrose + milk powder) previously described has the best results for the lyophilization of a cocktail of 11 following anaerobic bacteria in comparison with the same other conditions of A, B, C, D and F conservation medium above: Bacteroides fragilis, Bacteroides nord, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massilioamazoniensis, Clostridium beijerinckii, Clostridium irregular Finegoldia magna, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Haemophilus influenza.
  • Bacteroides fragilis, Bacteroides nord Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massilioamazoniensis, Clostridium beijerinckii,
  • D milk alone
  • E milk + antioxidants + sugar
  • FIGS. 5A and 5B the results on two stools from two healthy donors of the following preservation media No. 1 to 15 were compared with the following protective agents:
  • Freezing was performed at -80 ° C for 5 hours.
  • Freeze-drying was carried out in the DELTA 1-24 LSC-CHRIST lyophilizer at a pressure of 0.63 mbar, and the plateau temperature at 0 ° C. for 36 hours followed by 6h at + 30 ° C. (according to the method of Staley et al., Am. Gastro 2017).
  • Anaerobes Aerobic Anaerobes; aerobic
  • FIGS. 6A and 6B illustrate the comparative viability results as a function of the conditions of freeze-up conditions before lyophilization (pre-lyophilization step). The results were compared on two stools from two healthy donors from two different lyophilization media and two different freezing modes. Both media tested included the following protective agents:
  • condition no. 1 freezing at -80 ° C. / lyophilization medium no. 14 (Milk 10% + sucrosol +% antioxidants),
  • condition # 3 freezing in the nitrogen / lyophilization medium 14 (- Milk 10% + sucrosel0% + antioxidants), and
  • Condition No. 4 freezing in nitrogen / lyophilization medium (milk 10% + sucrose 10% + trehalose 5% + antioxidants).

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Abstract

La présent e invention concerne un procédé de de conservation d'un échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies autres que des bact éries lactiques, notamment des bact éries du microbiot e int estinal, de préférence un échantillon de selles humaines, et un lyophilisat obt enu par le procédé, le dit procédé comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on prépare un dit échantillon d'un ensemble de dit es bact éries par dilution dans un milieu aqueux de conservation comprenant une combinaison d'agents prot ect eurs comprenant (a1) au moins un composé antioxydant et (a2) au moins un sucre, et de préférence (a3) des prot éines de lait, et b) on réalise une congélation dudit échantillon récupéré à l'étape b) dans de l'azote liquide à environ -196°C pendant pas plus de minute, de préférence pendant 30 à 50 secondes, et c) on réalise une lyophilisation du dit échant illon ainsi congelé pour obt enir un lyophilisat.

Description

Procédé de conservation d'un échantillon de bactéries
La présente invention concerne un procédé de conservation d'un échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies autres que des bactéries lactiques, notamment des bactéries du microbiote intestinal, plus particulièrement encore un échantillon de selles humaines, et un lyophilisât obtenu.
Les selles humaines se caractérisent par la présence d'un microbiote intestinal comprenant l'ensemble des microorganismes du tube digestif humain notamment des bactéries aérobies et bactéries anaérobies strictes et des archaea methanogènes telles que Methanobrevibacter smithii ces dernières étant les plus difficiles à conserver.
La méthode la plus efficace à ce jour de conservation d'échantillons de selles préservant la viabilité des bactéries est la congélation, mais ce mode de conservation est peu pratique et coûteux de par la nécessité de maintenir la chaîne du froid pendant le transport et stockage.
La lyophilisation vise à retirer l'eau contenue dans un produit par congélation suivi d'une sublimation pour en faciliter la conservation. Les produits congelés sont ainsi séchés sous vide, sans dégel.
La lyophilisation de selles humaines permet une conservation dans des conditions évitant la chaîne du froid et permettant leur mise en gélule pour être administrée à usage thérapeutique notamment dans le cadre de traitements probiotiques ou de greffes de microbiote intestinal par lesquelles on fait absorber les microbes d'une selle de sujet sain par un patient porteur d'une colite ou d'une infection par une bactérie multi résistante telle que Clostridium difficile. Idéalement, un échantillon fécal autologue est prélevé chez le patient avant le traitement médical, par exemple avant une opération ou une situation à risque. L'échantillon est conservé. Si le patient vient à développer une infection à C. difficile, alors l'échantillon est extrait dans une solution saline et filtré. Le filtrat est lyophilisé. Le lyophilisât (poudre) résultant est mis sous forme de gélules entérosolubles (résistantes à l'acide gastrique stomacal) pour restaurer la flore colique antérieure du patient en faisant concurrence à C. difficile. Cette procédure permet d'éviter les risques d'introduire un autre pathogène provenant d'un donneur qui n'est pas le patient. Elle permet aussi d'éviter la problématique de l'administration par sonde nasale pour atteindre le duodénum du patient.
La lyophilisation entraine toutefois la destruction ou diminution de la viabilité d'un nombre considérable de bactéries avec une mortalité bactérienne qui va de 90% à 99.99% en fonction de leur caractère aérotolérant ou aérointolérant.
On connaît des procédés de lyophilisation de bactéries visant à en améliorer la viabilité avec des agents protecteurs mais ceux-ci varient selon le type de bactéries et ne concernent pas la lyophilisation d'échantillons cliniques de selles.
La lyophilisation est un procédé de séchage à froid en général utilisé uniquement pour les échantillons bactérien de bactéries très sensibles à la chaleur comme les bactéries lactiques. Dans WO 2003/018778 on améliore la viabilité de bactéries lactiques lyophilisée en ajoutant dans l'échantillon avant lyophilisation des agents protecteurs comprenant :
- un composé antioxydant, et
- un composé augmentant la température de transition vitreuse du lyophilisât à savoir du glycérol ou un hydrate de carbone tel que lactose, galactose, maltose, saccharose et glucose.
Selon la présente invention, on a démontré que ces conditions ne sont pas suffisantes pour améliorer suffisamment la viabilité des bactéries de l'ensemble du microbiote intestinal, notamment dans des échantillons cliniques de selles humaines. Le but de la présente invention est de fournir un procédé pour conserver la viabilité maximale des bactéries du microbiote intestinale dans des selles humaines.
Selon la présente invention on a découvert des conditions uniques communes de lyophilisation pour multiplier par 100 au moins le nombre des bactéries aérobies aussi bien que bactéries anaérobies viables présentes dans un échantillon d'un ensemble de dites bactéries aérobies et anaérobies autres que des bactéries lactiques, notamment un échantillon de selles humaines après lyophilisation en comparaison au procédé standard de lyophilisation.
Plus précisément, selon la présente invention ces conditions de lyophilisation consistent à :
- d'une part, diluer les échantillons bactériens, notamment échantillon de selles dans un milieu aqueux de conservation comprenant une combinaison spécifique d'agent(s) protecteur(s), et
- d'autre part, mettre en œuvre une étape initiale de congélation très rapide dans l'azote liquide à -196°C environ avant de réaliser le procédé de lyophilisation. Le procédé de lyophilisation impliquant une congélation suivie d'une étape de déshydratation par sublimation. Ces conditions ont permis d'obtenir les meilleurs résultats de viabilité comparés aux méthodes connues de conservation par congélation à - 80°C ou de lyophilisation par simple ajout d'agent lyoprotecteurs conventionnels.
Alors que les cellules congelées rapidement ont généralement un taux de survie plus faible que les cellules congelées lentement, selon la présente invention, on a découvert de façon surprenante que -sous réserve de respecter un milieu de conservation spécifique visé ci- dessus, la congélation rapide dans l'azote (-196°C) permet d'augmenter le taux de survie des dites bactéries, notamment du microbiote de selles humaines d'un facteur 100 au moins par rapport à une congélation lente à -80°C avant lyophilisation. Pour ce faire, la présente invention fournit un procédé de conservation d'un échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies autres que des bactéries lactiques, notamment des bactéries du microbiote intestinal, comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on prépare un dit échantillon d'un ensemble de dites bactéries par dilution dans un milieu aqueux de conservation comprenant une combinaison d'agents protecteurs comprenant (al) au moins un composé antioxydant et (a2) au moins un sucre, et de préférence (a3) des protéines de lait, et b) on réalise une congélation dudit échantillon récupéré à l'étape a) dans de l'azote liquide à environ -196°C pendant pas plus de 2 minutes, de préférence pas plus de 1 minute, notamment pendant 30 à 50 secondes, et c) on réalise une lyophilisation du dit échantillon ainsi congelé pour obtenir un lyophilisât.
A l'étape b), on réalise une congélation dudit échantillon récupéré à l'étape a) dans un récipient, par immersion du récipient contenant ledit échantillon dans de l'azote liquide. On entend ici par « protéines de lait », les protéines choisies parmi principalement des caséines et les protéines lactosériques comme la lactalbumine et les lactoglobulines.
A l'étape c), la lyophilisation implique une sublimation consistant en une déshydratation du produit congelé par dessiccation sous vide à froid de la glace sans le faire fondre, l'eau se sublime c'est-à-dire qu'elle passe directement de l'état solide à gazeux. Cette étape consiste donc essentiellement ici en l'établissement d'un vide poussé. Plus particulièrement, à l'étape c) l'échantillon congelé est déposé dans un lyophilisateur pendant au moins 12h à une température d'au moins 0°C et à une pression de vide poussé de pas plus de lmbar.
Plus particulièrement, à l'étape a), on prépare un dit échantillon qui est un échantillon clinique de selles par dilution desdites selles dans undit milieu aqueux de conservation, et on filtre la dispersion obtenue à pour en retirer au moins les débris de tailles supérieures à 2mm.
De préférence, à l'étape a), on dilue ledit échantillon dans un milieu aqueux de conservation comprenant au moins la triple combinaison (al) d'au moins un composé antioxydant de préférence au moins deux composés antioxydants et (a2) au moins deux sucres différents, et (a3) des protéines de lait.
Plus particulièrement, les protéines de lait sont sous forme de lait entier, de préférence à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation d'au moins 5%, de préférence 10%.
Plus particulièrement encore, les dits agents protecteurs comprennent une combinaison de composés antioxydants choisi parmi l'acide ascorbique, l'acide urique et le glutathion.
Plus particulièrement encore, les dits agents protecteurs comprennent une combinaison de composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique à une concentration de lg/L, de l'acide urique à une concentration de 0,4g/L et du glutathion à une concentration de 0,lg/L.
Plus particulièrement encore, les dits agents protecteurs comprennent au moins un sucre choisi parmi le saccharose (aussi dénommé ci-après « sucrose ») et le tréhalose.
Plus particulièrement encore, dits agents protecteurs comprennent du saccharose à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation d'au moins 5%, de préférence 10%. Plus particulièrement encore, le dit milieu de conservation est un milieu tampon à PH de 7 à 7.5 comprenant dans de l'eau les sels KCL, CaCI2, MgCI2, KH2P04, Na2HP04, NaCL et KOH ainsi qu'au moins un dit agent protecteur. Plus particulièrement encore, le dit milieu de conservation comprend :
(al) une combinaison de composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique à une concentration de lg/L, de l'acide urique à une concentration de 0,4g/L et du glutathion à une concentration de 0,lg/L, et
(a2) du saccharose à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation de 5%, et du tréhalose à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation de 10%, et
(a3) des protéines de lait à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation de 10%.
Plus particulièrement encore, le dit échantillon comprend au moins les bactéries aérobies et bactéries anaérobies suivantes : Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agalactiae, Serratia marcescens, P rote us mirabilis, Staphylococcus epidermidis, Bacillus circula ns, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus hominis et Acinetobacter baumanii.
Plus particulièrement encore, le dit échantillon comprend au moins les bactéries anaérobies strictes suivantes : Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massilioamazoniensis, Clostridium beijerinckii, Clostridium irregular Finegoldia magna, Propionibacterium acnes, Propionibacterium avidum, Haemophilus influenzae. La présente invention a donc également pour objet un lyophilisât d'échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies autres que des bactéries lactiques, notamment des bactéries du microbiote intestinal, plus particulièrement encore un échantillon de selles humaines, obtenu par un procédé selon l'invention tel que défini ci- dessus, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins un agent protecteur consistant dans des protéines de lait et de préférence au moins la combinaison d'agents protecteurs consistant dans (al) au moins un composé antioxydant et (a2) au moins un sucre, et (a3) des protéines de lait, et
- une quantité de bactéries du microbiote intestinal vivantes de préférence au nombre de :
- au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mises en culture après 48h de conservation à 4°C, et
- au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mise en culture après 6 semaines de conservation à 4°C.
Plus particulièrement, un lyophilisât selon l'invention comprend des dits agents protecteurs consistant dans al) une combinaison de 3 composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique, de l'acide urique et du glutathion, et a2) au moins 2 sucres différents consistant dans du saccharose et du tréhalose, et a3) des protéines de lait. D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention ressortiront mieux à la lecture de la description détaillée qui va suivre, faite de manière illustrative et non limitative, en référence aux dessins annexés sur lesquels : - les figures 1A et 1B illustrent les résultats de différences de quantité de bactéries vivantes détectées par les différences de nombres de log de CFU de bactéries aérobies (figure 1A) et bactéries anaérobies (figure 1B) après différents protocoles de congélation utilisés P1,P2 etP3 sur des échantillons de selles sans agent protecteur dans le milieu de conservation ;
- les figures 2A et 2B illustrent les résultats de quantité de bactéries vivantes détectées en anaérobiose à 48 heures (figure 2A) et en anaérobiose après 6 semaines de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 2B) , par le log CFU/mL, sur des échantillons de selles avec différents conditions de milieux de conservations : A= selles fraîches dans eau saline, B= lyophilisât dans milieu PBS, C= Lyophilisât avec milieu PBS contenant des antioxydants seuls, D= Lyophilisât avec milieu PBS contenant du lait en poudre seul, E= Lyophilisât avec milieu PBS contenant antioxydants + saccharose + lait en poudre , F= congélation de selle fraîches dans milieu PBS sans agent protecteur;
- les figures 3A et 3B illustrent les résultats de quantité de bactéries détectées en aérobiose à 48 heures (figure 3A) et en aérobiose après 6 semaines de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 3B), par le log CFU/mL, sur des échantillons de selles avec les mêmes 5 conditions de milieux A, B, C, D, E et F ;
- la figure 4 représente des graphes illustrent les résultats de quantité de bactéries vivantes détectées dans un échantillon après lyophilisation d'un cocktail de 11 bactéries anaérobies par le log CFU/mL avec les mêmes conditions de milieu de conservation A,B, C ,D, E et F ;
- les figures 5A et 5B illustrent les résultats de différences de quantité de bactéries vivantes détectées par les différences de nombres de log de CFU de bactéries aérobies (figure 5A) et bactéries anaérobies (figure 5B) sur des échantillons de selles avec différents agents protecteurs n°l à 15 dans le milieu de conservation ; - les figures 6A et 6B illustrent les résultats comparatifs de différences de quantité de bactéries vivantes détectées par les différences de nombres de log de CFU de bactéries aérobies (figure 6A) et bactéries anaérobies (figure 6B) sur des échantillons de selles dans 4 conditions 1 à 4 avec différents agents protecteurs n°14 et 15 selon deux conditions différentes de congélation avant lyophilisation.
Sur les figures 5A-5B et 6A-6B, les cas « 0 » en abscisse correspondent aux résultats sur des selles fraîches.
A) MATERIELS ET METHODES
1-Échantillons bactériens testés
Des échantillons de fèces ont été collectés à partir de donneurs sains, c'est-à-dire d'individus ne souffrant pas d'infection, n'ayant pas pris d'antibiotique le mois précédent l'échantillonnage, et ne souffrant pas de pathologie gastro-intestinale connue.
En parallèle, 29 souches bactériennes de la flore digestive ont été sélectionnées issues de la collection internationale de microorganismes CSUR (Collection de Souches de l'Unité des Rickettsies) de l'URMITE (WDCM 875) (Tableau 1 ci-après).
Les souches de bactéries sont stockées sous une forme adaptée à une congélation ultérieure dans des de tubes contenant dan bouillon de congélation contenant du glycérol des perles poreuses appelées cryobilles.
Tableau 1: liste des 29 Souches bactériennes de références
Bactérie Atmosphère N° CSUR
Bacteroides nordii Anaérobie PI 040
Propionibacterium avidum Anaérobie P872
Clostridum irregular Anaérobie P1913
Clostridum massilioamazoniensis Anaérobie P1360 Clostridum butyricum Anaérobie P607
Clostridum beijerinckii Anaérobie P883
Bacteroides thetaiotaomicron Anaérobie P766
Propionibacterium acnes Anaérobie P742
Finegoldia magna Anaérobie P588
Haemophilus influenzae Anaérobie P1075
Bacteroides fragilis Anaérobie P863
Staphylococcus aureus Aérobie P749
Enterobacter aerogenes Aérobie P989
Escherichia coli Aérobie P729
Klebsiella oxytoca Aérobie P992
Streptococcus agalactiae Aérobie P1030
Serratia marcescens Aérobie P833
Enterococcus faecalis Aérobie P720
Proteus mirabilis Aérobie P2049
Pseudomonas aeruginosa Aérobie P211
Streptococcus mitis Aérobie P1123
Staphylococcus epidermidis Aérobie P748
Morganella morganii Aérobie P752
Citrobacter freundii Aérobie P731
Enterobacter cloacae Aérobie P713
Bacillus circulans Aérobie P655
Streptococcus pneumoniae Aérobie P825
Staphylococcus hominis Aérobie P842
Acinetobacter baumanii Aérobie P981 2- Protocole expérimental de congélation/lyophilisation
50 g. de selles dans 150cm3 dans un milieu liquide aqueux de conservation grâce à un mixeur (appareil BOSCH Ultracompact 400W) pendant 10 minutes. Cet échantillon est ensuite tamisé en utilisant un tamis alimentaires dédié (avec des pores de 2mm) afin d'éliminer les débris alimentaires et le filtrat est récolté dans des fioles en verre contenant du milieu de conservation (2ml_) (shell vial type, REF 223683, Wheaton Millville, New Jersey, USA).
Les échantillons de souches bactériennes sont pareillement stockés dans des fioles en verre contenant du milieu de conservation (2ml_) (shell vial type, REF 223683, Wheaton Millville, New Jersey, USA). Les échantillons ont ensuite été congelés soit pendant 5à -80°C soit dans l'azote liquide pendant 30sec à 2 min., puis déposés dans un lyophilisateur DELTA 1-24 LSC (Martin Christ Gefriertrocknungsanlagen GmbH, DE) pendant 36h, à une température de 0°C, et à une pression réduite de 0,63 mbar. Les lyophilisats obtenus ont été conservés à température ambiante.
3- Protocole d'études de viabilité 3.1 Dénombrement La viabilité des microorganismes a été estimée par la méthode des
Unités Formant Colonies (UFC) après dilutions décimales et étalement des échantillons de selles et échantillons de souches bactériennes testées sur des géloses au sang Columbia agar COS (BioMerieux, Craponne France). La dilution est exprimée en UFC/mL. Pour chaque dilution, trois boites de Pétri sont ensemencées et les boîtes sont incubées à 37°C pendant 48 heures dans deux conditions: aérobie et anaérobie (enceintes anaérobie ou générateurs d'anaérobie).
Ce travail a été réalisé à partir des:
- Echantillons bactériens frais et échantillons de selles fraîches, et - Des lyophil isats réhydratés dans du tampon diphosphate sodique (PBS) à 25°C.
Les résultats obtenus à partir de selles fraîches (JO de l'émission) sont utilisés comme référence et comparés à ceux obtenus à partir du même échantillon préalablement congelé dans différents milieux de conservation puis le cas échéant lyophilisé.
On a évalué le nombre total de microorganismes viables après mise en culture en aérobiose et en anaérobiose sur boites de pétri, avant et après lyophilisation. La perte en microorganismes viable par rapport à la selle fraîche est exprimée en différence logarithmique de CFU perdues après les différents protocoles de congélation utilisés tout au long de l'expérimentation.
3.2 Identification des bactéries
Afin d'identifier les bactéries ayant survécu au processus de lyophilisation, les colonies ainsi cultivées sont identifiées de façon exhaustive par spectrométrie de masse MALDI-TOF à l'aide d'un spectromètre de masse MICROFLEX (Bruker Daltonics). Chaque dépôt est recouvert avec 2 ml de solution de matrice (acide α-saturé cyano-4- hydroxyciannamic dans 50% d'acétonitrile et d'acide trifluoroacetique 2,5%) comme décrit dans la littérature (ref.l). Cette analyse est effectuée en utilisant selon les recommandations du fabricant. Les spectres ainsi générés sont comparés avec la base de données de la base Bruker conjuguée à la base spécifique du laboratoire de l'hôpital de La Timone. Un isolât est considéré correctement identifié par MALDI- TOF si son score d'identification est supérieur à 1,9. Pour les colonies non identifiées, après 3 passages au MALDI-TOF, un séquençage de l'ARN 16S est réalisé (ref.2).
(ref.l) : Seng P, Drancourt M, Gouriet F, La Scola B, Fournier P-E, Rolain JM, et al. Ongoing révolution in bacteriology: routine identification of bacteria by matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Clin Infect Dis Off Publ Infect Dis Soc Am. 2009 Aug 15;49(4):543-51.
(réf.2) :Morel AS, Dubourg G, Edouard S, Prudent E, Gouriet F, Casalta J et al. 2014. Complementarity between targeted real-time spécifie PCR and conventional broad-range 16S rDNA PCR in the syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 34: 561-570.
4) Milieux de conservation
Plusieurs milieux aqueux de conservation de pré-lyophilisation ont été testés permet d'augmenter la survie des micro-organismes au cours du séchage. Différentes combinaisons d'agents protecteurs ont été utilisées (Tableau 2 ci-après). Les échantillons dilués dans le milieu de conservation sont alors congelés durant 12H, puis lyophilisés.
Diverses combinaisons d'agents protecteurs suivantes ont été testées :
- glycérol seul,
- antioxydants seuls,
- lait seul,
- des combinaisons binaires : sucre + antioxydants, lait + sucre, lait + antioxydants, antioxydants + glycérol, sucre + glycérol,
- la combinaison ternaire : lait+ antioxydants + sucre.
Après différents essais comparatifs, les composés antioxydants les plus efficaces retenus comprenaient la combinaison ternaire suivante :
- 0,4g/L d'acide urique (5/g7773-Aldrich,Lyon, France), - lg /Ld'acide ascorbique (Inresa Médical, Bartenheim, France),
- 0,1g /L de L-Glutathion (5/g7773-Aldrich,l_yon, France), Les agents protecteurs ont été mis en œuvre dans de l'eau saline ou de l'eau saline + tampon diphosphate sodique PBS (voir tableau 3 ci- après).
L'eau saline comprenait :
- 0.3/0.6g KOH (BDH LABORATORY SUPPLIES, Poole, Royaume- Uni),
- 0.1g CaCI2 (Inresa Médical, Bartenheim, France),
- 0.1g MgCI2 (Inresa Médical, Bartenheim, France)
Le lait testé était du lait écrémé ou du lait entier en poudre. Les meilleurs résultats étaient obtenus avec du Lait entier en poudre (Régilait, Lyon, France) à une concentration pondérale de 10%.
Différents sucres ont été testés (lactose, glucose, tréhalose et saccharose) à différents concentrations. Les meilleurs résultats ont été obtenus avec du saccharose (aussi dénommé ci-après « sucrose ») et/ou tréhalose (Inresa Médical, Bartenheim, France) à une concentration en poids de 5 à 10%.
Tableau 2: composition des milieux de conservation testés
Milieu Composition
de
conservation
1 150 mL eau saline
2 150 mL PBS +
3 150 mL PBS + antioxydants
4 150 mL PBS + sucre
5 150 mL PBS+ antioxydants + glycérol 6 150 mL PBS+ sucre + antioxydants
7 150 mL PBS + g lycérol + sucre
8 150 mL eau saline + Lait
9 150 mL PBS + antioxydants + Lait
10 150 mL PBS + sucre + Lait
11 150 mL PBS + antioxydants + Lait + sucre
La composition du milieu PBS était comme indiqué au tableau 3 ci- après.
Tableau 3 : Milieu de conservation
Concentration dans 1 litre (pH 7,3 ± 0,2)
KCI 0.2g
CaCI2 O.lg
MgCI2 0.1g
KH2P04 0.2g
Na2HP04 1.15g
NaCI 3g
KOH 0.6g B) RÉSULTATS ET DISCUSSION On a évalué : i) l'influence de la méthode de congélation, à savoir congélation à -80°C comparée à azote liquide (-196°C) avant la lyophilisation et ii) l'impact des agents protecteurs dans le milieu de conservation.
1) Impact de la congélation
Tant pour les échantillons de bactéries pris séparément que pour les échantillons de selles, les résultats comparatifs quel que soit le milieu de conservation sont toujours meilleurs avec une congélation rapide dans l'azote liquide puis lyophilisation en comparaison à une congélation à -80°C pendant 12 H puis lyophilisation. La congélation rapide dans l'azote liquide puis lyophilisation permet une perte de CFU moins importante.
Les Figures 1A et 1B illustrent les nombres de log de CFU de bactéries aérobies (figure 1A) et respectivement bactéries anaérobies (figure 1B) perdus après les différents protocoles de congélation utilisés sur 6 échantillons de selles sans agents protecteurs dans le milieu de conservation :
- Pl= congélation à -80°C pendant 12 H puis lyophilisation, - P2= congélation rapide dans l'azote liquide puis lyophilisation,
- P3= congélation sans lyophilisation (selles fraîches).
Les figures 1A-1B illustrent que la préservation de la viabilité bactérienne après lyophilisation sans agents protecteurs demeure cependant significativement moins efficace qu'après congélation à -80°C durant 48H sans lyophilisation.
En revanche, la congélation rapide dans l'azote (-196°C) permet d'augmenter le taux de survie des dites bactéries, notamment du microbiote de selles humaines d'un facteur 100 (2 log) au moins par rapport à une congélation lente à -80°C avant lyophilisation.
2) Impact des agents protecteurs testés.
La présence de glycérol dans le milieu de conservation n'a pas d'impact positif sur la viabilité.
La présence d'antioxydants et de sucre seuls ou en combinaison binaires présente un impact positif mais qui ne permet pas d'améliorer la viabilité par rapport aux échantillons congelés sans lyophilisation.
En revanche, tant pour les échantillons de bactéries prises séparément que pour les échantillons des selles c'est à dire contenant tout le microbiote de la flore intestinale, il apparaît globalement une synergie pour le milieu de conservation comprenant du lait et un milieu de composition ternaire d'agents protecteurs comprenant : lait + antioxydants+ saccharose et/ou tréhalose qui permet d'atteindre un niveau de viabilité supérieur ou égal à celui avec un milieu de conservation avec du Lait seul et avec celui pour les selles congelées sans lyophilisation.
Les figures 2A et 2B illustrent les résultats de quantité de bactéries détectées mis en culture en anaérobiose après 48 heures de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 2A) et en anaérobiose après 6 semaines de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 2B) sur 6 échantillons de selles avec 5 conditions de milieu différentes: A= échantillon frais dans eau saline (ici selles fraîches), B= lyophilisât dans milieu PBS, C= Lyophilisât avec milieu PBS contenant des antioxydants seuls, D= Lyophilisât avec milieu PBS contenant du lait en poudre seul, E= Lyophilisât avec milieu PBS contenant antioxydants + saccharose + lait en poudre, F= congélation de l'échantillon frais dans milieu PBS sans agent protecteur.
Les figures 3A et 3B illustrent les résultats de quantité de bactéries détectées par mise en culture en aérobiose après 48 heures de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 3A) et en aérobiose après 6 semaines de conservation du lyophilisât à 4°C (figure 3B) sur 6 échantillons de selles avec les mêmes 5 conditions de milieux différentes A, B, C, D, E et F. La congélation à l'azote s'étant révélée plus efficace dans le chapitre précédent, toutes les étapes de lyophilisation des figures 2A-2B et 3A-3B sont précédés d'une étape de congélation par azote liquide à - 196°C.
Les résultats des tableaux 3A et 3B suivant quantifiés en Log CFU/mL montrent que le milieu de conservation pour la technique de lyophilisation le plus performant pour les selles demeure également le meilleur pour la conservation des échantillons de bactéries non lactiques pris séparément tant pour les bactéries aérobies (figure 3A) qu'anaérobies (figure 3B).
Tableau 3A : BACTERIES AEROBIES (LOG CFU/mL)
baumanii 9 7,289 8,041 8 8,544 8
Tableau 3B
Anaérobies (Log CFU/mL)
A B C D E F
Bacteroides nord// 8 0 5 4,699 7 6,633
Propionibacterium 10 7,889 8,977 9,698 9, 176 9,477 a vidum
Clostridum irregular 8 6,875 6,368 5,301 7,65 7,699
Clostridum 6 3,8 4,202 5,875 5,414 5 massilioamazoniensis
Clostridum 9 7,699 7,477 8,621 8, 155 7 butyricum
Clostridum 9 7,588 8,602 8,085 8,7 8, 199 beijerinckii
Bacteroides 9 0 0 3 4 5,7 thetaiotaomicron
Propionibacterium 9 6,796 8,301 8,041 8,544 8,729 acnés
Finegoldia magna 9 6, 103 7,666 8, 155 8,653 8,478
Bacteroides fragilis 9 2 4 5,951 6,5 7,801 Enfin, les graphes de la figure 4 illustrent que le milieu ternaire E (Lyophilisât avec antioxydants + saccharose + lait en poudre) précédemment décrit présente les meilleurs résultats pour la lyophilisation d'un cocktail de 11 bactéries anaérobies suivantes en comparaison aux mêmes autres conditions de milieu de conservation A,B, C ,D et F ci-dessus : Bacteroides fragilis, Bacteroides nord//, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massilioamazoniensis, Clostridium beijerinckii, Clostridium irregular Finegoldia magna, Propionibacterium acnés, Propionibacterium avidum, Haemophilus influenza.
Dans tous les cas on observe que l'on obtient avec les milieux D (Lait seul) ou de préférence E (lait+antioxydants + sucre) des lyophilisats comprenant :
- au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mises en culture après 48h de conservation à 4°C, et
- au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mise en culture après 6 semaines de conservation à 4°C, et - plus généralement, la congélation rapide dans l'azote (-196°C) permet d'augmenter le taux de survie des dites bactéries du microbiote intestinal d'un facteur 100 au moins par rapport à une congélation lente à -80°C avant lyophilisation.
Sur les figures 5A et 5B, on a comparé les résultats sur deux selles issues de deux donneurs sains des 15 milieux de conservation n°l à 15 suivants avec les agents protecteurs suivants :
1- sucrose 10%
2- tréhalose 5%
3- lait 10% 4- antioxydants
5- lait 10% + antioxydants
6- lait 10%+ tréhalose 5%
7- lait 10%+ sucrose 10%
8- tréhalose 5% + sucrose 10%
9- tréhalose 5% + antioxydants
10- sucrose 10%+ antioxydants
11- sucrose 10%+ tréhalose5% + antioxydants
12- lait 10% + tréhalose 5% + sucrosel0%
13- lait 10% + tréhalose 5%+ antioxydants
14- lait 10%+ sucrosel0% +antioxydants
15- lait 10% + sucrose 10% + tréhalose 5 % +antioxydants
La congélation était effectué à -80°C pendant 5 heures.
La Lyophilisation était effectuée dans le lyophilisateur DELTA 1-24 LSC-CHRIST à pression de 0.63 mbar, et température du plateau à 0 °C pendant 36 heures suivi de 6h à +30 °C (selon la méthode de Staley et al. Am J Gastro 2017).
Les résultats de viabilité sont rapportés dans les figures 5A et 5B et tableau 4 suivant (valeurs moyennes).
Tableau 4 : Pourcentage de viabilité bactérienne après lyophilisation
j Selle 1 Selle 2
; Anaérobies : Aérobies Anaérobies ; Aérobies
: (%viabilité) j (% viabilité) (%viabilité) : (%viabilité) j i 1-Sucrose 10%
! 91,18 \ 87,16 91.43 \ 78,37
% +antioxydants 97,34 98,34 97,37 89,31
Tableau 5: composition des milieux de conservation testés
Solution 1 Solution 3
Solution 4
Solution 5
Solution 6 Solution 7
Solution 8
Solution 9 Solution 11
Solution 12
Solution 13
Sucrose 10% 100g Réf 57501-1, Inresa Médical, Bartenheim,
France
CaCI2 0.1q Réf 10035,Inresa Médical, Bartenheim, France
MqCI2 O.lq Réf 77911,Inresa Médical, Bartenheim, France
KOH 0.3/0.6g Réf 102105W,BDH LABORATORY SUPPLIES,
Poole, Royaume-Uni
Acide ascorbique lq Réf 50817,Inresa Médical, Bartenheim, France
Acide urique 0.4q Réf U2625,Siqma-Aldrich,Lyon, France
Glutathion O.lq Réf G4251,Siqma-Aldrich,Lyon, France
Solution 15
Les résultats de viabilité ont montré que la présence de chacun des agents cryoprotecteurs seuls (lait ; tréhalose ; sucrose) ou avec des antioxydants améliore fortement la survie des bactéries après lyophilisation. Cependant la conservation est maximale en présence des 3 agents cryoprotecteurs plus les antioxydants (milieu n°15). Le milieu n° 15 a permis une meilleure protection des bactéries après lyophilisation que ce soit en anaérobiose (~ 97%) ou en aérobiose (>90%).
Les figures 6A et 6B illustrent les résultats comparatifs de viabilité en fonction des conditions de conditions de congélation avant lyophilisation (étape de pré-lyophilisation). On a comparé les résultats sur deux selles issues de deux donneurs sains à partir de 2 milieux de lyophilisation différents et selon deux modes de congélation différents. Les deux milieux testés comprenaient les agents protecteurs suivants :
1- Lait 10%+ sucrosel0% + antioxydants
2- Lait 10% + sucrose 10% + tréhalose 5 % + antioxydants.
Les deux modes de congélations comprenaient :
- une congélation à -80°C pendant 5 heures, et
- une congélation rapide dans l'azote (-195,79 °C) pendant 1-2 min. La lyophilisation subséquente était identique dans tous les cas à savoir à pression de 0.63 mbar, et température du plateau à 0 °C pendant 36 heures suivi de 6h à +30 °C dans le lyophilisateur DELTA 1- 24 LSC-CHRIST.
Sur les figures 6A et 6B et le tableau 5(valeurs moyennes) sont rapportés les résultats de viabilité pour les 4 conditions n°l à 4(en abscisses) suivantes :
- condition n°l= congélation à -80°C / lyophilisation milieu n°14 (Lait 10%+ sucrosel0% +antioxydants),
- condition n°2= congélation à -80°C / lyophilisation milieu n° 15 (Lait 10%+ sucrose 10% + tréhalose 5 % +antioxydants),
- condition n°3= congélation dans l'azote / lyophilisation milieu 14 (- Lait 10%+ sucrosel0% +antioxydants), et
- condition n°4= congélation dans l'azote / lyophilisation milieu 15 (Lait 10%+ sucrose 10% + tréhalose 5 % +antioxydants).
Tableau 6 : Pourcentage de viabilité bactérienne après lyophilisation. % de Conditions
viabilité 1 2 3 4
% Anaérobies I 86,20 94,52 92,48 94,07
Selle3
% Aérobies ! 95,53 97,56 96,89 98,92
% Anaérobies ! 91,27 93,55 94,64 95,24
Selle4
% Aérobies ! 93,5 94,03 92,69 92,91
Les résultats de cette étude ont montré qu'entre (a) la congélation à -80°C pendant 5 H puis lyophilisation et (b) la congélation rapide dans l'azote liquide puis lyophilisation directe, la congélation dans l'azote liquide permet une perte de CFU moins importante. On a comparé les résultats de viabilité de bactéries aérobies et anaérobies sur deux selles issues de deux donneurs sains à partir d'un même milieu de lyophilisation (milieu n°15= Lait 10%+ sucrose 10% + tréhalose 5 % +antioxydants) congelé par congélation rapide dans l'azote (-195,79 °C) pendant 1-2 min. dans les deux cas mais avec deux conditions de lyophilisation différentes dans le Lyophilisateur DELTA 1- 24 LSC-CHRIST. Les deux conditions de lyophilisation étaient :
1) pression de 0.63 mbar, et température du plateau à 0°C pendant 12 heures ; et
2) pression de 0.63 mbar et température du plateau à 0°C pendant 36 heures suivi de 6h à +30 °C (selon la méthode de Staley et al. Am J Gastro 2017).
Les résultats ne montrent pas de différence entre les deux méthodes de lyophilisation.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de conservation d'un échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies autres que des bactéries lactiques, notamment des bactéries du microbiote intestinal, comprenant les étapes successives suivantes dans lesquelles : a) on prépare un dit échantillon d'un ensemble de dites bactéries par dilution dans un milieu aqueux de conservation comprenant une combinaison d'agents protecteurs comprenant (al) au moins un composé antioxydant et (a2) au moins un sucre, et de préférence (a3) des protéines de lait, et b) on réalise une congélation dudit échantillon récupéré à l'étape a) dans de l'azote liquide à environ -196°C pendant pas plus de 2 minute, de préférence pendant 30 à 50 secondes, et c) on réalise une lyophilisation du dit échantillon ainsi congelé pour obtenir un lyophilisât.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'à l'étape a), on prépare un dit échantillon qui est un échantillon clinique de selles par dilution desdites selles dans un milieu aqueux de conservation, et on filtre la dispersion obtenue à pour en retirer au moins les débris de tailles supérieures à 2mm.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape a), on dilue ledit échantillon dans un milieu aqueux de conservation comprenant au moins la combinaison d'agents protecteurs comprenant (al) au moins un composé antioxydant, de préférence au moins deux composés antioxydants et (a2) au moins deux sucres différents, et (a3) des protéines de lait.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que les protéines de lait sont sous forme de lait entier, de préférence à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation d'au moins 5%, de préférence 10%.
5. Procédé selon l'une des revendications 3 ou 4, caractérisé en ce que les dits agents protecteurs comprennent une combinaison de composés antioxydants choisi parmi l'acide ascorbique, l'acide urique et le glutathion.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que les dits agents protecteurs comprennent une combinaison de composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique à une concentration de lg/L, de l'acide urique à une concentration de 0,4g/L et du glutathion à une concentration de 0,lg/L.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les dits agents protecteurs comprennent au moins un sucre choisi parmi le saccharose et le tréhalose.
8 Procédé selon l'une des revendications 1 à 7 caractérisé en ce que les dits agents protecteurs comprennent au moins un dit sucre à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation d'au moins 5%, de préférence 10%.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le dit milieu de conservation est un milieu tampon à PH de 7 à 7.5 comprenant dans de l'eau les sels KCL, CaCI2, MgCI2,KH2P04, Na2HP04, NaCL et KOH ainsi qu'au moins un dit agent protecteur.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le dit milieu de conservation comprend :
(al) une combinaison de composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique à une concentration de lg/L, de l'acide urique à une concentration de 0,4g/L et du glutathion à une concentration de 0,lg/L, et
(a2) du saccharose à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation de 5%, et du tréhalose à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation del0%, et (a3) des protéines de lait à une concentration pondérale dans le dit milieu de conservation de 10%.
11. Procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le dit échantillon comprend au moins les bactéries aérobies et bactéries anaérobies suivantes : Staphylococcus aureus, Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Klebsiella oxytoca, Streptococcus agalactiae, Serra tia marcescens, P rote us mirabilis, Staphylococcus epidermidis, Bacillus circulans, Streptococcus pneumoniae, Staphylococcus hominis et Acinetobacter baumanii.
12. Procédé l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que le dit échantillon comprend au moins les bactéries anaérobies strictes suivantes : Bacteroides fragilis, Bacteroides nordii, Bacteroides thetaiotaomicron, Clostidium butyricum, Clostridium massi/ioamazoniensis, Clostridium beijerinckii, Clostridium irregular Finegoldia magna, Propionibacterium acnés, Propionibacterium avidum, Haemophilus influenzae.
13. Procédé l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que à l'étape c) l'échantillon congelé est déposé dans un lyophilisateur pendant au moins 12h à une température d'au moins 0°C et à une pression de vide poussé de pas plus de lmbar.
14. Lyophilisât d'échantillon d'un ensemble de bactéries aérobies et anaérobies du microbiote intestinal autres que des bactéries lactiques, obtenu par un procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend : - au moins un agent protecteur consistant dans au moins la combinaison d'agents protecteurs consistant dans (al) au moins un composé antioxydant et (a2) au moins un sucre, et (a3) des protéines de lait, et
- une quantité de bactéries vivantes, de préférence au nombre de : - au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mises en culture après 48h de conservation à 4°C, et
- au moins 108 CFU/mL bactéries de chacune des catégories des bactéries aérobies et respectivement bactéries anaérobies mise en culture après 6 semaines de conservation à 4°C.
15. Lyophilisât selon la revendication 14 caractérisé en ce que le dit échantillon est un échantillon clinique de selles humaines, les dits agents protecteurs consistant dans al) une combinaison de 3 composés antioxydants consistant dans de l'acide ascorbique, de l'acide urique et du glutathion, et a2) au moins 2 sucres différents consistant dans du saccharose et du tréhalose, et a3) des protéines de lait.
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