EP3510406A1 - Identifizierung von unbekannten transformationsprodukten ohne referenzstandards durch vergleich von massenspektren mit vorher- gesagten massenverschiebungen mittels ms/ms - Google Patents

Identifizierung von unbekannten transformationsprodukten ohne referenzstandards durch vergleich von massenspektren mit vorher- gesagten massenverschiebungen mittels ms/ms

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Publication number
EP3510406A1
EP3510406A1 EP17757463.9A EP17757463A EP3510406A1 EP 3510406 A1 EP3510406 A1 EP 3510406A1 EP 17757463 A EP17757463 A EP 17757463A EP 3510406 A1 EP3510406 A1 EP 3510406A1
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EP
European Patent Office
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mass
productions
unknown
unknown transformation
transformation product
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17757463.9A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marius Majewsky
Harald Horn
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Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Original Assignee
Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
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Filing date
Publication date
Application filed by Karlsruher Institut fuer Technologie KIT filed Critical Karlsruher Institut fuer Technologie KIT
Publication of EP3510406A1 publication Critical patent/EP3510406A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G01N33/6851—Methods of protein analysis involving laser desorption ionisation mass spectrometry

Definitions

  • the present invention relates to a method for the identification of unknown transformation products of a starting substance (also called metabolites) without reference standards by means of tandem mass spectrometry (MS / MS), in particular coupled liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • MS / MS tandem mass spectrometry
  • LC-MS / MS coupled liquid chromatography tandem mass spectrometry
  • the method according to the invention can be used in organic chemical analysis and is used in particular in medical and pharmaceutical analytics, in forensics and in doping, environmental and food analysis.
  • MS / MS tandem mass spectrometry
  • the intensity of the fragments is secondary to the qualitative determination. Decisive are the matching m / z of the question marks in the spectrum.
  • Mass spectrometers capable of measuring accurate mass / accuracy m / z (e.g., LC-QToF devices) provide additional safety. Due to the high accuracy of the measurement of the m / z, which is 1 to 2 ppm according to the current state of the art, the agreement of the measured mass spectrum or of the selected fragments with the reference spectrum can be determined with a very high degree of certainty. From the so-called exact (also: accurate) masses, the elemental composition of the compound can be strongly limited, since only a few combinations of elements result in this exact mass due to the natural mass defect of the elements in small molecules (approximately in the range ⁇ 1000 Da) , Databases with MS / MS reference mass spectra are also partly available free of charge.
  • the invention is therefore based on the object to provide a method which allows reliable identification of unknown transformation products of a starting substance, even if no reference standards exist for these transformation products.
  • the present invention provides a method for the identification of unknown transformation products of a starting substance without reference standards by means of tandem mass spectrometry (MS / MS), comprising the following steps:
  • the present invention also does not predict the production of the metabolite mass spectra per se, but calculates predicted metabolite mass spectra based on the experimentally determined mass spectra of the starting substance, thus experimentally involving the characteristic fragmentation pattern of the starting substance.
  • the method according to the invention offers significantly more security in the identification of metabolites.
  • a chromatographic separation process is performed to isolate the unknown transformation product from a sample to be assayed.
  • the chromatographic separation method is not particularly limited and may be selected depending on the sample to be examined.
  • the MS / MS of the unknown transformation product can be coupled with liquid chromatography, gas chromatography, ion exchange chromatography, supercritical liquid chromatography or else with multidimensional chromatographic methods of the mentioned methods.
  • the chromatographic separation method is selected from the group consisting of liquid chromatography and gas chromatography.
  • the sample to be examined can be examined by coupled liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS / MS).
  • the method according to the invention may preferably further comprise a further step, wherein the mass-to-charge ratio of possible transformation products m / ⁇ is calculated by adding or subtracting mass shifts of possible transformation reactions to or from the mass-to-charge ratio of the starting substance m / ZA , Based on the mass-to-charge ratio of the starting substance m / ZA, corresponding values for m / ⁇ can be obtained (also called assumed metabolite m / z), which can be compared with the measured mass-to-mass ratio. Charge ratio of the unknown metabolite can be compared. In this case, a first restriction of the possible metabolites can take place, whereby the efficiency of the identification procedure is increased.
  • the identification method according to the invention comprises a further step of storing in a database the predicted productions of the unknown transformation product and the known productions of the starting substance m / zpA. That is, the predicted productions of the unknown transformation product (fragments) are preferably stored independently of experimental work in a database, which can be used to compare with measured data. Accordingly, suspected metabolites can be tested by the user against the database for consistency, which additionally increases the reliability of the method according to the invention.
  • the molecular weight of the starting substance is less than 1000 Da.
  • the identification method of the invention is not limited to small molecules and can also be used to identify molecules larger than 1000 Da.
  • theoretical fragments are generated for the positive and negative electrospray ionization mode for suspected metabolites, which in a further step checks the number of matches with the measured productions of the unknown transformation product m / ⁇ become.
  • this may be done as follows. In a first step, starting from the starting substance, its metabolites to be informed, an accurate MS / MS mass spectrum was recorded. Alternatively, this can also be obtained from an existing database. The exact mass and m / z of the precursor (precursor ion) of the starting material are known by the elemental composition.
  • an accurate MS / MS mass spectrum of the starting substance is determined experimentally, thereby eliminating potential features inherent in the particular MS devices that can lead to potential complications in comparison step (iv).
  • the accurate MS / MS mass spectrum of the starting substance is recorded with the same mass spectrometer used to measure the accurate MS / MS mass spectrum of the unknown transformation product.
  • a mass shift is added or subtracted.
  • These mass shifts are accurate mass differences of molecular transformation reactions leading to possible metabolites of the starting substance. If, for example, the starting substance is hydroxylated, ie an oxygen atom is added to the total element composition, the mass shift is + 15.99491 Da (exact monoisotopic mass of the oxygen). With a MS / MS device that can not accurately measure the mass, this would be a mass shift of 16 Da. This mass shift is thus applied according to the measurement accuracy of the MS / MS spectrometer used. The measurement accuracy of the mass spectrometers used is not particularly limited.
  • This mass shift from the starting substance to the metabolite should not only be observable in the precursors, but also in different productions in the MS / MS spectrum. However, not every production shifts by the mass shift of the respective presumed transformation reaction, since it usually occurs only on one part of the molecule, but the rest remains unchanged. Since the location of the transformation is usually unknown at first, it can not be predicted on which fragments the mass shift takes place. Therefore, the invention applies the following screening method for finding the productions: All measured fragments of the MS / MS mass spectrum of the starting substance are respectively added or subtracted by the assumed exact mass shift of the possible list of transformations. These are referred to as predicted fragments or as predicted productions of the unknown transformation product. Each of the fragments predicted in this way is aligned with all in the measured MS / MS mass spectrum of the possible metabolite. The matches are counted for given mass accuracy.
  • the process is repeated by aligning each of the fragments of the starting substance with all fragments in the measured MS / MS mass spectrum of the possible metabolite.
  • the matches are counted for given mass accuracy and represent the fragments without mass shift.
  • An evaluation routine then compares predicted and measured MS / MS spectra to determine the number of matches.
  • the evaluation routine is not particularly limited and may, for example, be supported by software.
  • the indicator of identification of the metabolite is the number of matches found by both searches.
  • the probability of identifying the desired metabolite in small molecules with a molecular mass of less than 1000 Da is very high from 3 to 4 exactly matching productions (meaning with a high mass accuracy). According to the invention, it is assumed that there is a match for mass accuracies of ⁇ 5 ppm (parts per million).
  • the unknown transformation product is considered to be identified if there are preferably 4 or more matches between the predicted productions of the unknown transformation product including the known product m / zpA starting product and the unknown transformation product m / ⁇ production product.
  • the predicted fragments can be stored independently of experimental work in a database, which can be used to compare with measured data.
  • the predicted MS / MS mass spectra for the database include, according to the method described above, i) the productions predicted by addition / subtraction of the mass shifts, and ii) the productions of the parent substance as possible productions without mass shift. Suspected metabolites can then be checked for compliance by the user against the database. As described above, predicted MS / MS mass spectra are compared to measured MS / MS spectra for presumed user-defined metabolites.
  • the presented invention aims at the systematic identification by means of predicted productions. At a high number By matching, this method provides significantly more security in identification compared to known methods when no reference substances are present.
  • the present invention will be further described with reference to Figures 1 to 3 and the following non-limiting example.
  • FIG. 1 shows a schematic summary of a preferred embodiment of the present invention
  • Figure 2 shows an MS / MS mass spectrum of the known starting material used in the embodiment
  • FIG. 3 shows an MS / MS mass spectrum of the suspected metabolite (transformation: acetylation).
  • the precursor of this drug with the mass / charge ratio m / z 251, 060269037.
  • Transformation reaction element change mass shift calculated precursor of the
  • Agilent was used in LC-QTOF (LC-QTOF 6550 in combination with a 1290 Infinity HPLC). Eluents were acetonitrile and ultrapure water. As a test substance Sulfadiazine was used (CAS 68-35-9), purchased from Dr. med. Ehrentstatter, Augsburg.
  • a mass scan is performed without fragmentation of the sample to be examined.
  • the presumed metabolite m / z of Table 1, column 4 is compared with the results of the mass scan of the sample for agreement at a given mass accuracy.
  • the matches then record MS / MS spectra.
  • the masses or m / z of the individual productions should either have a) shifted by the mass shift of the transformation or b) have remained the same as in the starting material, if the Transformation did not take place at this part of the molecule.
  • the productions predicted in column 3 are stored in a database. Since it is generally unknown at which point on the molecule the transformation takes place, it can not be said which of the productions remain the same and which show a mass shift. Therefore, each of the productions of the measured MS / MS spectra of the putative metabolites (such as one shown in Figure 3) is sequentially associated with each of the predicted productions (Table 2, 3rd column) a user-specified mass accuracy that depends on the device. Each match is counted and used as a criterion for identification. A match of> 3 to 4 productions is a clear indication that it is the suspected metabolite.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten einer Ausgangssubstanz ohne Referenzstandards mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), welches in der organischen chemischen Analytik, insbesondere in der medizinischen und pharmazeutischen Analytik, in der Forensik sowie in der Doping-, Umwelt- und Lebensmittelanalytik angewendet werden kann.

Description

Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten ohne Referenzstandards durch Vergleich von Massenspektren mit vorher-gesagten Massenverschiebungen mittels MS/MS
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten einer Ausgangssubstanz (auch Metaboliten genannt) ohne Referenzstandards mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS), insbesondere ge-koppelter Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS ). Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der organischen chemischen Analytik an-gewendet werden und findet insbesondere in der medizinischen und pharmazeuti-schen Analytik, in der Forensik sowie in der Doping-, Umwelt- und Lebensmittelanalytik Anwendung.
Die qualitative Messung und Identifizierung von chemischen Verbindungen mit Tan- dem-Massenspektrometrie-Systemen (MS/MS) basiert auf Massenspektren. Zum Erhalt dieser charakteristischen Massenspektren muss die gesuchte Zielsubstanz als Reinsubstanz vorliegen. Im Tandem-Massenspektrometer wird das MS/MS Massenspektrum nach Fragmentierung aufgenommen, welches spezifisch für eine Verbin-dung ist. Dabei wird im ersten MS nur das Masse-zu-Ladungsverhältnis (m/z) der Zielsubstanz (Precursor) im positiven oder negativen lonisationsmodus der Elektro-sprayionisierung gefiltert und anschließend mit einer gegebenen Kollisionsenergie fragmentiert. Im zweiten MS werden die m/z der entstehenden und für diese Verbin-dung charakteristischen Produktionen, welche auch als Fragmente bezeichnet werden, gemessen. Dieses Fragmentspektrum bzw. Produktionenspektrum dient als Referenz-spektrum.
In einer Probe unbekannter Zusammensetzung und mit unbekannten Inhaltsstoffen aus den oben genannten Anwendungsbereichen wird das m/z der Zielverbindung im
BESTÄTIGUNGSKOPIE ersten MS und das Massenspektrum im zweiten MS gemessen. Zeigt dieses Massenspektrum Übereinstimmung mit dem zuvor gemessenen Referenzspektrum, gilt die Substanz als sicher identifiziert. Die Intensität der Fragmente ist dabei für die qualitative Bestimmung sekundär. Entscheidend sind die übereinstimmenden m/z der Frag- mentionen im Spektrum.
In der Praxis mit Triple-Quadropole Systemen wird üblicherweise ein Kriterium von zwei Fragmentübereinstimmungen bei gegebener Massengenauigkeit von etwa 0,7 Da zu Grunde gelegt. Das bedeutet, dass in der gängigen Praxis, der sogenannten Target-Analytik, eine Substanz als identifiziert gilt, wenn zwei zuvor festgelegte charakteristische Fragmente gefunden werden.
Massenspektrometer, die die akkurate Masse bzw. das akkurate m/z messen können (z.B. LC-QToF Geräte), bieten zusätzliche Sicherheit. Durch die hohe Genauigkeit der Messung des m/z, welche nach derzeitigem Stand der Technik 1 bis 2 ppm beträgt, lassen sich die Übereinstimmung des gemessenen Massenspektrums bzw. der gewählten Fragmente mit dem Referenzspektrum mit sehr hoher Sicherheit bestimmen. Aus den sogenannten exakten (auch: akkuraten) Massen lässt sich die Elementzusammensetzung der Verbindung stark eingrenzen, da durch den natürlichen Massen- defekt der Elemente bei kleinen Molekülen (ca. im Bereich < 1000 Da) nur noch wenige Kombinationen an Elementen diese exakte Masse ergeben. Datenbanken mit MS/MS Referenzmassenspektren stehen auch zum Teil kostenlos zur Verfügung.
Allerdings können diese Referenzspektren nur für bekannte Substanzen aufgenom- men werden, die als Reinsubstanz zu Verfügung stehen, beispielsweise käuflich erhältlich sind, selbst synthetisiert oder aus Mischungen mit hoher Reinheit isoliert wurden. Für bis dato unbekannte Substanzen stehen die MS/MS Referenzmassenspektren daher nicht zur Verfügung, was die eindeutige Identifizierung über Referenzspektren unbekannter Substanzen verhindert, bis diese als Reinstoff vorliegen und so das charakteristische MS/MS Massenspektrum aufgenommen werden kann. In letzter Zeit gab es dennoch Bemühungen, unbekannte Metaboliten ohne Referenzstandards durch Vergleich von Massenspektren mit vorhergesagten Massenverschiebungen mittels LC-QTOF zu identifizieren. Wie beispielsweise in M. Majewsky et al., Anal. Bioanal. Chem., 407 (19), 5707-5714, beschrieben, sollen unbekannte Metabo- liten von Sulfonamid-Antibiotika identifiziert werden, indem potentielle Transformationsprodukte von Sulfonamid-Antibiotika auf Basis gängiger Transformations- oder Spaltungsreaktionen vorhergesagt werden. Obwohl die Precursormassen sehr genau bestimmt werden können, besteht ein Nachteil dieser Methodik darin, dass auch eine exakte Masse eines Precursors keinen eindeutigen Rückschluss bzw. keine eindeutige Zuordnung zulässt, falls Referenzspektren nicht existieren, da immer noch eine Vielzahl von möglichen Substanzen, auch komplett fremde Elementzusammensetzungen, eine entsprechende Masse aufweisen können.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren bereitzustellen, wel- ches eine zuverlässige Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten einer Ausgangssubstanz erlaubt, selbst wenn für diese Transformationsprodukte keine Referenzstandards existieren.
Diese Aufgabe wird durch die in den Ansprüchen gekennzeichneten Ausführungsfor- men der vorliegenden Erfindung gelöst.
Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten einer Ausgangssubstanz ohne Referenzstandards mittels Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) bereit, umfassend die folgenden Schritte:
(i) das Bereitstellen eines tatsächlich gemessenen, akkuraten MS/MS Massenspektrums mit allen Produktionen der Ausgangssubstanz, um das Masse-zu-La- dungsverhältnis der Ausgangssubstanz ITI/ZA und die Masse-zu-Ladungsverhält- nisse der Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA zu erhalten;
(ii) das Vorhersagen von Masse-zu-Ladungsverhältnissen der Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes durch a) addieren oder subtrahieren der Massenverschiebungen möglicher Transformationsreaktionen zu bzw. von allen Masse-zu-Ladungsverhältnissen der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA und b) Berücksichtigung von Produktionen ohne Massenveränderung, um einen Datensatz von vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes zu erhalten;
(iii) das experimentelle Erstellen eines akkuraten MS/MS Massenspektrums des unbekannten Transformationsproduktes, um das Masse-zu-Ladungsverhältnis des unbekannten Transformationsproduktes m/ζτ und die Masse-zu-Ladungsverhält- nisse der Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/ζρτ zu erhalten; und
(iv) das quantitative Vergleichen der vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes sowie der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA mit den Produktionen des unbekannten Transformatiorisproduktes m/zPT auf Übereinstimmungen und Zählen derselbigen. Die vorliegende Erfindung basiert auf der Erkenntnis, dass durch Vergleich vorhergesagter Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes sowie der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA mit den Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/ζρτ eine systematische und zuverlässigere Identifizierung unbekannter Transformationsprodukte erzielt werden kann. Erfindungsgemäß kann somit eine Identifizierung unbekannter Metaboliten, von welchen keine Referenzstandards bzw. MS/MS Referenzmassenspektren vorliegen, mit hoher Sicherheit erfolgen. In der vorliegenden Erfindung werden als Referenzstandards experimentell gemessene MS/MS Massenspektren von bekannten Reinsubstanzen verstanden. Es ist davon auszugehen, dass im Stand der Technik bislang kein systematischer Ansatz vorliegt, der die Produktionen im MS/MS zur Identifizierung unbekannter Transformationsprodukte bzw. Metaboliten durch quantitative Erfassung der Übereinstimmung von vorhergesagten und experimentellen MS/MS Spektren heranzieht. Insbesondere werden im Stand der Technik nur die Precursor zur Identifizierung unbekann- ter Metaboliten berücksichtigt. Der Grund hierfür ist möglicherweise, dass die theoretische Vorhersage der Produktionen per se kaum umsetzbar ist, da das Fragmentieren der chemischen Bindungen eines Moleküls sich als sehr komplex darstellt. Das wird möglicherweise auch als Hürde für die Vorhersage von Metaboliten angesehen. Die vorliegende Erfindung sagt auch nicht die Produktionen der Metabolit-Massenspektren per se voraus, sondern berechnet vorhergesagte Metabolit-Massenspektren auf Grundlage der experimentell bestimmten Massenspektren der Ausgangssubstanz, wodurch das charakteristische Fragmentierungsmuster der Ausgangssubstanz somit experimentell miteinbezogen wird. Dadurch bietet das erfindungsgemäße Verfahren deutlich mehr Sicherheit bei der Identifizierung von Metaboliten.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird vor dem Schritt (iii) des experimentellen Erstellens eines akkuraten MS/MS Massenspektrums des unbekannten Transformationsproduktes (Metaboliten) ein chromatographisches Trennverfahren durchgeführt, um das unbekannte Transformationsprodukt aus einer zu untersuchenden Probe zu isolieren. Das chromatographische Trennverfahren ist nicht besonders beschränkt und kann in Abhängigkeit von der zu untersuchenden Probe ausgewählt sein. Beispielsweise kann das MS/MS des unbekannten Transformationsproduktes mit einer Flüssigchromatographie, Gaschromatographie, lonenaus- tauschchromatographie, superkritische Flüssigkeitschromatographie oder auch mit multidimensionalen Chromatographiemethoden der genannten Methoden gekoppelt sein.
Vorzugsweise ist das chromatographische Trennverfahren aus der Gruppe, bestehend aus Flüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie, ausgewählt. Insbesondere kann die zu untersuchende Probe mittels gekoppelter Flüssigkeitschromatogra- phie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) untersucht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann vorzugsweise ferner einen weiteren Schritt umfassen, wobei das Masse-zu-Ladungsverhältnis möglicher Transformationsprodukte m/ζτρ durch addieren oder subtrahieren von Massenverschiebungen möglicher Transformationsreaktionen zu bzw. von dem Masse-zu-Ladungsverhältnis der Aus- gangssubstanz m/ZA berechnet wird. Ausgehend vom Masse-zu-Ladungsverhältnis der Ausgangssubstanz m/ZA können somit entsprechende Werte für m/ζτρ erhalten werden (auch vermutete Metabolit m/z genannt), die mit dem gemessenen Masse-zu- Ladungsverhältnis des unbekannten Metaboliten verglichen werden können. Dabei kann eine erste Einschränkung der möglichen Metaboliten erfolgen, wodurch die Effizienz des Identifizierungsverfahrens erhöht wird. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Identifizierungsverfahren einen weiteren Schritt des Speicherns der vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes und der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA in einer Datenbank. D.h. die vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes (Fragmente) werden vorzugs- weise unabhängig experimenteller Arbeiten in einer Datenbank gespeichert, die zum Abgleich mit gemessenen Daten herangezogen werden kann. Dementsprechend können vermutete Metaboliten vom Anwender gegen die Datenbank auf Übereinstimmung geprüft werden, was zusätzlich die Verlässlichkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens erhöht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Molekülmasse der Ausgangssubstanz weniger als 1000 Da. Bei größeren Molekülen besteht die Möglichkeit, dass sich das Fragmentierungsverhalten des möglichen Metaboliten im Vergleich zur Ausgangsubstanz verändert, wodurch der Vergleich zu den Fragmenten der Aus- gangsubstanz erschwert wird. Allerdings ist das erfindungsgemäße Identifizierungsverfahren nicht auf kleine Moleküle beschränkt und kann ebenso zur Identifizierung von Molekülen größer 1000 Da angewendet werden.
Wie vorstehend beschrieben, werden erfindungsgemäß theoretische Fragmente (auch: vorhergesagte Produktionen) für den positiven und negativen Elektrospray-Io- nisationsmodus für vermutete Metaboliten generiert, welche in einem weiteren Schritt mit den gemessenen Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/ζρτ auf die Anzahl der Übereinstimmungen überprüft werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann dies beispielsweise wie folgt durchgeführt werden. In einem ersten Schritt wird von der Ausgangssubstanz, deren Metaboliten aufgeklärt werden sollen, ein akkurates MS/MS Massenspektrum aufgenommen. Alternativ kann dieses auch aus einer bestehenden Datenbank bezogen werden. Die akkurate Masse und das m/z des Precursors (Vorläuferion) der Ausgangssubstanz sind durch die Elementzusammensetzung bekannt. Vorzugsweise wird ein akkurates MS/MS Massenspektrum der Ausgangssubstanz experimentell bestimmt, wodurch mögliche, den jeweiligen MS-Geräten anhaftende Merkmale ausgeschlossen werden können, die im Vergleichsschritt (iv) zu potentiellen Erschwernissen führen können. Vorteilhafterweise wird das akkurate MS/MS Massenspektrum der Ausgangssubstanz mit demselben Massenspektrometer aufgenommen, mit welchem das akkurate MS/MS Massenspektrum des unbekannten Transformations Produktes gemessen wird.
Zum Precursor der Ausgangssubstanz wird eine Massenverschiebung (mass shift) addiert bzw. subtrahiert. Diese mass shifts sind akkurate Massenunterschiede von molekularen Transformationsreaktionen, die zu möglichen Metaboliten der Ausgangssub- stanz führen. Wird beispielsweise die Ausgangssubstanz hydroxiliert, d.h. ein Sauer- stoffatom wird zur Gesamtelementzusammensetzung hinzugefügt, so beträgt der mass shift +15,99491 Da (exakte monoisotopische Moiekülmasse des Sauerstoffs). Mit einem MS/MS Gerät, das die Masse nicht akkurat bestimmen kann, entspräche dies einem mass shift von 16 Da. Dieser mass shift wird folglich entsprechend der Messgenauigkeit des verwendeten MS/MS Spektrometers angewendet. Die Messgenauigkeit der verwendeten Massenspektrometer ist nicht besonders beschränkt. Um jedoch eine möglichst exakte Identifizierung zu ermöglichen, ist es vorteilhaft, wenn die Genauigkeit des Massenspektrometers < 5 ppm (parts per million) beträgt. Mit diesem Verfahren wird nun eine beliebig lange Liste möglicher Precursor durch Addition/Subtraktion der mass shifts vorher definierter typischer Transformationsreaktionen und der Ausgangsmolekülmasse erstellt. Diese mass shifts sind dem Fachmann bekannt. Diese Transformationsreaktionen unterscheiden sich für die verschiedenen Anwendungsfelder, beispielsweise Umwelt, Humanmedizin oder chemische Industrie- anlagen. Ein Beispiel von 90 möglichen Transformationsreaktionen für ausgewählte Umwelt- und Humanmetaboliten ist im beigefügten Ausführungsbeispiel aufgezeigt, ohne auf diese beschränkt zu sein. in einer Probe, in welcher Metaboliten einer Ausgangssubstanz identifiziert werden sollen, werden von diesen so berechneten ΓΏ/ΖΤΡ, d.h. vermutete Metabolit m/z, MS/MS Massenspektren aufgenommen, sofern sie in der Probe vorhanden sind.
Diese Massenverschiebung von der Ausgangssubstanz zum Metaboliten sollte nicht nur bei den Precursoren beobachtbar sein, sondern auch bei verschiedenen Produktionen im MS/MS Spektrum. Allerdings verschiebt sich nicht jedes Produktion um den mass shift der jeweiligen vermuteten Transformationsreaktion, da diese meistens nur an einem Teil des Moleküls stattfindet, der Rest aber unverändert bleibt. Da der Ort der Transformation in der Regel anfangs unbekannt ist, kann nicht vorausgesagt werden, an welchen Fragmenten der mass shift stattfindet. Daher wendet die Erfindung zum Auffinden der Produktionen folgende Screeningmethode an: Alle gemessenen Fragmente des MS/MS Massenspektrums der Ausgangssubstanz werden jeweils um den angenommenen exakten mass shift der möglichen Liste der Transformationen addiert bzw. subtrahiert. Diese werden als vorhergesagte Fragmente bzw. als vorhergesagte Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes bezeichnet. Jedes der auf diese Weise vorhergesagten Fragmente wird mit allen im gemessenen MS/MS Massenspektrum des möglichen Metaboliten abgeglichen. Die Übereinstimmungen werden bei gegebener Massengenauigkeit gezählt.
Da, wie oben erwähnt, sich nicht alle Fragmente verschieben, wird der Vorgang wiederholt, indem jedes der Fragmente der Ausgangssubstanz mit allen Fragmenten im gemessenen MS/MS Massenspektrum des möglichen Metaboliten abgeglichen wird. Die Übereinstimmungen werden bei gegebener Massengenauigkeit gezählt und stellen die Fragmente ohne Massenverschiebung dar. Eine Auswerteroutine vergleicht anschließend vorhergesagte und gemessene MS/MS Spektren, um die Anzahl der Übereinstimmung festzustellen. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Auswerte- routine nicht besonders beschränkt und kann beispielsweise durch Software unterstützt erfolgen. Der Indikator für eine Identifizierung des Metaboliten ist die Anzahl der gefundenen Übereinstimmungen beider Suchvorgänge. Die Wahrscheinlichkeit, den gesuchten Metaboliten bei kleinen Molekülen mit einer Molekülmasse von weniger als 1000 Da zu identifizieren, ist ab 3 bis 4 exakt übereinstimmenden Produktionen (bedeutet bei einer hohen Massengenauigkeit) sehr hoch. Erfindungsgemäß wird davon ausgegangen, dass eine Übereinstimmung bei Massengenauigkeiten von < 5 ppm (parts per million) vorliegt.
Die vorstehend beschriebenen Verfahrensschritte sind schematisch auch in Figur 1 dargestellt. Erfindungsgemäß gilt das unbekannte Transformationsprodukt als identifiziert, wenn vorzugsweise 4 oder mehr Übereinstimmungen zwischen den vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes einschließlich der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA und den Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/ζρτ vorliegen.
Vorzugsweise können die vorhergesagten Fragmente unabhängig experimenteller Arbeiten in einer Datenbank gespeichert werden, die zum Abgleich mit gemessenen Daten herangezogen werden kann. Die vorhergesagten MS/MS Massenspektren für die Datenbank beinhalten nach dem oben beschriebenen Verfahren i) die durch Addi- tion/Subtraktion der mass shifts vorhergesagten Produktionen sowie ii) die Produktionen der Ausgangssubstanz als mögliche Produktionen ohne Massenverschiebung. Vermutete Metaboliten können dann vom Anwender gegen die Datenbank auf Übereinstimmung geprüft werden. Wie vorstehend beschrieben werden erfindungsgemäß vorhergesagte MS/MS Massenspektren mit gemessenen MS/MS Spektren für vorher vom Anwender definierte vermutete Metaboliten verglichen. Im Vergleich zu den im Stand der Technik bekannten Ansätzen zur Identifizierung unbekannter Metaboliten über die Elementzusammensetzung der Precursor mit akkurater Massenspektrometrie, welche immer noch Raum für mehrere Substanzen lässt, zielt die vorgestellte Erfindung auf die systematische Identifizierung mittels vorhergesagter Produktionen ab. Bei einer hohen Anzahl von Übereinstimmungen bietet diese Methode deutlich mehr Sicherheit bei der Identifizierung im Vergleich zu bekannten Methoden, wenn keine Referenzsubstanzen vorhanden sind. Die vorliegende Erfindung wird anhand der Figuren 1 bis 3 und des folgenden, nicht einschränkenden Beispiels näher erläutert.
Figur 1 zeigt eine schematische Zusammenfassung einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung,
Figur 2 zeigt ein MS/MS Massenspektrum der im Ausführungsbeispiel verwendeten bekannten Ausgangsubstanz, und
Figur 3 zeigt ein MS/MS Massenspektrum des vermuteten Metaboliten (Transforma- tion: Acetylierung).
Beispiel
Als Ausführungsbeispiel sollen Metaboliten eines Medikaments mit der molekularen Masse M = 250,052444 Da gesucht werden. Im positiven lonisationsmodus entsteht der Precursor dieses Medikaments mit dem Masse/Ladung-Vehältnis m/z = 251 ,060269037.
Es wurden 90 mögliche Umweltreaktionen und deren mass shifts definiert. Damit werden die Precursor von 90 möglichen Metaboliten berechnet wie dies in Tabelle 1 zusammengestellt ist. Tabelle 1 :
Transformationsreaktion Elementänderung mass shift berechneter Precursor des
Metaboliten ·
Debenzylierung -CH2C6H4 -90,04695 161,01332
eduktive Debromierung -Br -78,91833 172,14194
Trifluormethyl-Abspaltung -CF3+H -67,98738 183,07289
2 x reduktive Dechlorierung -CI2+2H -67,92205 183,13822
Desulfönierung -S02 -63,96189 187,09838
Oxidative Debromierung -Br+OH -61,9156 189,1446
Tert-butyl-Dealkylierung -C4H8 -56,0626 194,99767
Hydrolyse von Nitratester (Abspal-N02+H -44,98508 206,07519
tung der N02 Gruppe)
Decarboxylierung -COO -43,98982 207,07045
Isopropyl- Dealkylierung -C3H6 -42,04695 209,01332
Tert-butyl zu Alkohol -C4H8+0 -40,06769 210,99258
Propylketon zu Säure -C4H8+0 -40,06768 210, 99259
2 x reduktive Defluorierung -F2+H2 -35,98115 215,07912
Reduktive Dechlorierung -Cl+H -33,96103 217,09924
Hydroxymethyienabspaltung -CH20 -30,01056 221,04971
Nitroreduktion -02+H2 -29,97417 221,0861
Propylether zu Säure -C3H8+0 -28,06769 222,99258
Deethylierung -C2H4 -28,0313 223,02897
Decarboxylierung -CO -27,99491 223,06536
Ethylketon zu Säure -C3H6+0 -26,05204 225,00823
Isopropyl zu Alkohol -G3H6+0 -26,05204 225,00823
Alkoholdehydrierung -H20 -18,01056 233,04971
Dehydrierung von Oxime -H20 -18,01056 233,04971
Reduktive Defluorierung -F+H -17,99058 233,06969
Oxidative Dechlorierung -CI+OH -17,96612 233,09415
Sulfoxid zu Thioether -0 -15,99491 235,06536
Thioharnstoff zu Harnstoff -S+O -15,97716 235,08311
Deaminierung -NH -15,0109 236,04937
Ethylether zu Säure -C2H6+0 -14,05204 237,00823
Demethylierung -CH2 -14,01565 237,04462
Tert-butyl zu Säure -C3H8+20 -12,07278 238,98749
Methylketon zu Säure -C2H4+0 -12,03639 239,02388
Ethyl zu Alkohol -C2H4+0 -12,03639 239,02388
2 sequentielle Desaturierungen -H4 -4,0313 247,02897
Hydroxyiierung und Dehydrierung -H2 -2,01565 249,04462
primärer oder sekundärer Alkohol -H2 -2,01565 249,04462
zu Aldehyd oder Keton
Desaturierung -H2 -2,01565 249,04462
1,4 Dihydro-Pyridin zu Pyridin -H2 -2,01565 249,04462
Oxidative Fluorierung -F+OH -1,99567 249,0646
Oxidative Deaminierung zu Keton -H3N+0 -1,03163 250,02864
Demethylierung und Methylen zu -CH4+0 -0,0365 251,02377
Keton 2-Ethoxyl zu Säure -CH4+0 -0,03639 251,02388 ipso-Hydroxylierung +OH-NH2 0,98402 252,04429
Isopropyl zu Säure -C2H6+02 1,94287 253,00314
Demethylierung und Hydroxylierung -CH2+0 1,97926 253,03953
Keton zu Alkohol +H2 2,01565 253,07592
Nitrosierung +0-H2 13,97926 265,03953
Methylen zu Keton -H2+0 13,97926 265,03953
Hydroxylierung und Oesaturierung -H2+0 13,97926 265,03953
Alken zu Epoxid -H2+0 13,97926 265,03953
(0, N,.S) Methyl ierung +CH2 14,01565 265,07592
Ethyl zu Carboxylsäure -CH4+02 15,95852 267,01879
Hydroxylierung +0 15,99491 267,05518
Sekundäres oder tertiäres Amin zu +0 15,99491 267,05518
Hydroxylamin / N-oxid
Thioether zu Sulfoxid, Sulfoxid zu +0 15,99491 267,05518
Suifön
Aromatischer Ring zu Arenoxid +0 15,99491 267,05518
Ipso-Hydroxylierung, x-Dihydroxy- +02H2-NH2 16,97893 268,0392 lierung
Demethylierung und 2 x Hydroxy-CH2+02 17,97417 269,03444 lierung
Hydratation, (interne) Hydrolyse +OH2 18,01056 269,07083
Hydrolyse aromatischer Nitrile +OH2 18,01056 . 269,07083
Formylierung +CO 27,99491 279,05518
Hydrolylierung und Ketonbildung +02-H2 29,97417 281,03444
Quinonbildung +02-H2 29,97417 281,03444
Demethylierung zu Carboxylsäure +02-H2 29,97417 281,03444
Nitrierung +02-H2 29,97418 281,03445
Hydroxylierung und Methylierung +C0H2 30,01056 281,07083
Dihydroxyiierung +02 31,98982 283,05009
Thioether zu Sulfon +02 31,98982 283,05009
Alken zu Dihydrodiol +02H2 34,00547 285,06574
Acetylierung +C2H20 42,01056 293,07083
3 x Hydroxylierung +03 47,98474 299,04501
Aromatisches Thiol zu Sulfonsäure +03 47,98474 299,04501
Glycin-Konjugation +C2H30N 57,02146 308,08173
Acetylierung und Hydroxylierung +C2H202 58,00548 309,06575
Sulfat-Konjugation +S03 79,95681 331,01708
Hydroxylierung und Sulfatierung +S04 95,95172 347,01199
Cystein-Konjugation +C3H50NS 103,00918 354,06945
Taurin-Konjugation +C2H502NS 107,00409 358,06436
S-Cystein-Konjugation +SH5C302N 119,00409 370,06436
Decarboxylierung und Glucuroni- -C0+C6H806 148,03717 399,09744 dierung
N-Acetylcysteine-Konjugation +SC5H703N 161,01466 412,07493
Glycosidierung +C6H10O5 162,0582 413,11847
Glucuronidierung +C6H806 176,03208 427,09235
2 x Sulfat-Konjugation +2(S03) 191,90345 442,96372
Hydroxylierung und Glucuronid +C6H807 192,027 443,08727 GSH- onjugation +C10H15N3O6S 289,07324 540,13351
Desaturierung und S-GSH- -H2+C10H15N3O6S 303,0525 554,11277
Konjugation
S-GSH-Konjugation +C10H15N3O6S 305,06815 556,12842
Epoxidierung und S-GSH- +C10H15N307S 321,06307 572,12334
Konjugation
2 x Glucuronid-Konjugation +2(C6H806) 325,06417 576,12444
Anschließend wird das MS/MS Spektrum der Ausgangssubstanz (m/z = 251 ,060269037), welche im vorliegenden Fall käuflich "als Reinsubstanz erhältlich ist, aufgenommen. Das erhaltene MS/MS Massenspektrum dieser Ausgangssubstanz ist in Fig. 2 dargestellt.
Dafür wurde in LC-QTOF der Firma Agilent verwendet (LC-QTOF 6550 in Kombination mit einer 1290 Infinity HPLC). Eluenten waren Acetonitril und Reinstwasser. Als Testsubstanz wurde Sulfadiazine verwendet (CAS 68-35-9), gekauft bei Dr. Ehrent- storfer, Augsburg.
Im nächsten Schritt wird ein Massenscan ohne Fragmentierung der zu untersuchenden Probe durchgeführt. Dann werden die vermuteten Metabolit m/z aus Tabelle 1 , Spalte 4, mit den Ergebnissen des Massenscans der Probe auf Übereinstimmung bei gegebener Massengenauigkeit abgeglichen. Von den Übereinstimmungen werden anschließend MS/MS Spektren aufgenommen. Ein (!) Beispiel dafür ist in Fig. 3 dargestellt für den Precursor (m/z = 293,07083). Vorausgesetzt das Fragmentierungsverhalten des Metaboliten ändert sich nicht im Vergleich zur Ausgangssubstanz, so sollten sich die Massen bzw. m/z der einzelnen Produktionen entweder a) um den mass shift der Transformation verschoben haben oder b) gleich geblieben sein wie bei der Ausgangssubstanz, wenn die Transformation nicht an diesem Molekülteil stattgefunden hat. Daraus folgend werden die möglichen Produktionen nach folgenden zwei Schemata für alle definierten Reaktionen vorhergesagt. Das Beispiel der einen (!) ausgewählten Reaktion ist in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 2: Generelle Berechnung der vorhergesagten Produktionen und vorhergesagte Produktionen für den vermuteten acetylierten Metaboliten
Die in Spalte 3 vorhergesagten Produktionen werden in eine Datenbank gespeichert. Da es generell unbekannt ist, an welcher Stelle am Molekül die Transformation stattfindet, kann nicht gesagt werden, welche der Produktionen gleich bleiben und welche eine Massenverschiebung aufzeigen. Daher wird jedes der Produktionen der gemessenen MS/MS Spektren der vermuteten Metaboliten (wie eines dargestellt in Figur 3) der Reihe nach mit jedem der vorhergesagten Produktionen (Tabelle 2, 3. Spalte) bei einer vom Anwender bestimmten Massengenauigkeit, die vom Gerät abhängt, abgeglichen. Jede Übereinstimmung wird gezählt und als Kriterium zur Identifizierung genutzt. Eine Übereinstimmung von > 3 bis 4 Produktionen ist ein eindeutiger Hinweis, dass es sich um den vermuteten Metaboliten handelt.
Im vorliegenden Beispiel des vermuteten acetylierten Metaboliten ergaben sich folgende Übereinstimmungen: a) Prüfung gegen die Produktionen, die eine Massenverschiebung aufweisen bei einer Massengenauigkeit von m/z = 0.001 (die hochgestellten Zahlen zeigen die Übereinstimmungen)
Gemessen Vorhergesagt Treffer
65,0384 107,0491
93,0330 134.06031 X
96,0553 136.07502 X
108,0439 138,0660
134,05991 150.05493 X
136.07542 198,02174 X
150,05413 200,0117
156,0104 227,0923s X
158,0013
185,0817
198,02 74
227,09205
293,0697
Summe der Treffer: 5 b) Prüfung gegen die Produktionen, die keine Massenversehiebung aufweisen bei einer Massengenauigkeit von in diesem Fall m/z = 0,001 (die hochgestellten Zahlen zeigen die Übereinstimmungen)
Insgesamt konnten 10 Übereinstimmungen zwischen vorhergesagten und gemessenen Produktionen gefunden werden, was de facto eine Identifizierung des Metaboliten ohne Referenzstandard darstellt.

Claims

Patentansprüche
Verfahren zur Identifizierung von unbekannten Transformationsprodukten einer Ausgangssubstanz ohne Referenzstandards mittels Tandem-Massen- spektrometrie (MS/MS), umfassend die folgenden Schritte:
(i) das Bereitstellen eines tatsächlich gemessenen, akkuraten MS/MS Massenspektrums mit allen Produktionen der Ausgangssubstanz, um das Masse-zu-Ladungsverhältnis der Ausgangssubstanz m/ZA und die Masse-zu-Ladungsverhältnisse der Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA zu erhalten;
(ii) das Vorhersagen von Masse-zu-Ladungsverhältnissen der Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes durch a) addieren oder subtrahieren der Massenverschiebungen möglicher Transformationsreaktionen zu bzw. von allen Masse-zu-Ladungsverhältnissen der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA und b) Berücksichtigung von Produktionen ohne Massenveränderung, um einen Datensatz von vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes zu erhalten;
(iii) das experimentelle Erstellen eines akkuraten MS/MS Massenspektrums des unbekannten Transformationsproduktes, um das Masse-zu-Ladungsverhältnis des unbekannten Transformationsproduktes m/ζτ und die Masse-zu-Ladungsverhältnisse der Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/zpr zu erhalten; und
(iv) das quantitative Vergleichen der vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes sowie der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA mit den Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/ζρτ auf Übereinstimmungen und Zählen derselbigen.
Verfahren nach Anspruch 1 , wobei vor dem Schritt (iii) des experimentellen Erstellens eines akkuraten MS/MS Massenspektrums des unbekannten Transformationsproduktes ein chromatographisches Trennverfahren durchgeführt wird, um das unbekannte Transformationsprodukt aus einer zu untersuchenden Probe zu isolieren.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei das chromatographische Trennverfahren aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Flüssigkeitschromatographie und Gaschromatographie.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, ferner umfassend den Schritt des Berechnens des Masse-zu-Ladungsverhältnisses möglicher Transformationsprodukte m/zip durch addieren oder subtrahieren von Massen Verschiebungen möglicher Transformationsreaktionen zu bzw. von dem Masse-zu-La- dungsverhältnis der Ausgangssubstanz ITI/ZA.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, ferner umfassend den Schritt des Speicherns der vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes und der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz m/zpA in einer Datenbank.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Molekülmasse der Ausgangssubstanz weniger als 1000 Da beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei 4 oder mehr Übereinstimmungen zwischen den vorhergesagten Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes einschließlich der bekannten Produktionen der Ausgangssubstanz ITI/ZPA und den Produktionen des unbekannten Transformationsproduktes m/zpT als Identifizierung gilt.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der organischen chemischen Analytik.
9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 in der medizinischen oder pharmazeutischen Analytik, in der Forensik oder in der Doping-, Umwelt- oder Lebensmittelanalytik.
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