EP3250705A1 - Procede d'obtention d'un isolat peptidique issu de la biomasse de microalgues enrichies en proteines - Google Patents

Procede d'obtention d'un isolat peptidique issu de la biomasse de microalgues enrichies en proteines

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EP3250705A1
EP3250705A1 EP16705228.1A EP16705228A EP3250705A1 EP 3250705 A1 EP3250705 A1 EP 3250705A1 EP 16705228 A EP16705228 A EP 16705228A EP 3250705 A1 EP3250705 A1 EP 3250705A1
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EP
European Patent Office
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biomass
arginine
microalgae
isolate
glutamic acid
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16705228.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marilyne GUILLEMANT
Samuel PATINIER
Philippe Looten
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Corbion Biotech Inc
Original Assignee
Roquette Freres SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres SA filed Critical Roquette Freres SA
Publication of EP3250705A1 publication Critical patent/EP3250705A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A23J—PROTEIN COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS; WORKING-UP PROTEINS FOR FOODSTUFFS; PHOSPHATIDE COMPOSITIONS FOR FOODSTUFFS
    • A23J1/00—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites
    • A23J1/009—Obtaining protein compositions for foodstuffs; Bulk opening of eggs and separation of yolks from whites from unicellular algae
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/36—Extraction; Separation; Purification by a combination of two or more processes of different types

Definitions

  • the present invention relates to a peptide isolate derived from a biomass of microalgae rich in proteins, microalgae of the genus Chlorella, more particularly of the species Chlorella protothecoides.
  • the algae, macro and micro have a richness largely unexplored. Their exploitation for food, chemical or bioenergetic purposes is still very marginal. However, they contain components of great value, wealth and abundance.
  • Microalgae are indeed sources of vitamins, lipids, proteins, sugars, pigments and antioxidants.
  • Algae and microalgae are thus of interest to the industrial sector that uses them for the manufacture of food supplements, functional foods, cosmetics, medicines or for aquaculture.
  • Microalgae are primarily photosynthetic microorganisms that colonize all biotopes exposed to light.
  • microalgae Some species of microalgae are indeed able to grow in the absence of light: Chlorella, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.
  • the pigments (chlorophyll a, b and c, ⁇ -carotene, astaxanthin, lutein, phycocyanin, xanthophylls, phycoerythrin, etc.) whose demand is increasing, both for their remarkable antioxidant properties and for their contribution of natural colors in the 'food, lipids, in order to optimize their fatty acid content (up to 60% or even 80% by weight of their dry matter), in particular for:
  • PUFAs called "essential” (i.e. brought by the diet because are not naturally produced by the man or the animal), or
  • proteins in order to optimize their nutritional qualities or, for example, to promote the supply of amino acids of interest by means of the preparation of peptide-rich fractions.
  • Peptide fractions can be promoted as functional agents or dietary supplements in many fields.
  • Arginine is an amino acid that has many functions in the animal kingdom.
  • Arginine can be degraded and thus serve as a source of energy, carbon and nitrogen to the cell that assimilates it.
  • arginine is decomposed into ornithine and urea.
  • the latter is a nitrogen molecule that can be eliminated (by excretion in the urine) so as to regulate the amount of nitrogen compounds present in the cells of animal organisms.
  • Arginine is used to synthesize nitric oxide (NO) with NO synthase, thereby mediating arterial vasodilatation, which reduces the rigidity of blood vessels, increases blood flow, and improves the functioning of blood vessels.
  • NO nitric oxide
  • Dietary supplements that contain arginine are recommended to promote heart health, vascular function, to prevent "platelet aggregation" (risk of blood clots) and to lower blood pressure.
  • arginine in wound healing is related to its role in the formation of proline, another important amino acid for collagen synthesis.
  • Arginine is also a component frequently used, especially by athletes, in energy drinks.
  • Glutamic acid is not only one of the building blocks used for protein synthesis, but it is also the excitatory neurotransmitter more prevalent in the central nervous system (brain + spinal cord) and is a precursor of GABA in GABAergic neurons.
  • glutamate is used as a food flavor enhancer. It is added to food preparations to enhance their taste.
  • the Codex Alimentarius has also recognized as flavor enhancers its salts of sodium (E621), potassium (E622), calcium (E623), ammonium (E624) and magnesium (E625).
  • Glutamate (or its salts) is often present in ready-made dishes (soups, sauces, chips, ready meals). It is also commonly used in Asian cooking.
  • kitchen auxiliaries cubic broths, sauces, sauces, etc.
  • these peptides must be extracted from the microalgae with the required compositions, in terms of:
  • the present invention relates to a peptide isolate derived from a biomass of microalgae rich in proteins, microalgae of the genus Chlorella, more particularly of the species Chlorella protothecoides.
  • the present invention relates to a microalgae isolate characterized by its remarkably high content of arginine and glutamic acid.
  • the present invention also relates to the biomass of microalgae rich in proteins as such, biomass particularly suitable for the preparation of said peptide isolate.
  • the present invention also relates to the process for enriching and depigmenting the biomass of microalgae, more particularly of the genus Chlorella, more particularly of the species Chlorella protothecoides.
  • the present invention finally relates to the process for preparing this peptide isolate from the biomass of microalgae rich in proteins and depigmented.
  • the term "essentially composed of arginine and glutamic acid” means a richness in arginine and glutamic acid that can be understood as an arginine and glutamic acid content of more than 80, 85, 90 or 95% by weight expressed relative to the total amino acids.
  • these two amino acids represent 85 to 99% relative to the total amino acids, preferably between 90 and 98% relative to the total amino acids, and in particular between 95 and 98%.
  • the term "essentially composed of arginine and glutamic acid” means a richness in arginine and glutamic acid that can be understood as containing:
  • arginine in particular between 40% and 60%, preferably around 50%;
  • At least 40% glutamic acid in particular between 40% and 60%, preferably about 50%
  • amino acid content other than arginine and glutamic acid is less than 10%, preferably less than 5%, especially less than 3%.
  • the content of the isolate is as follows:
  • This isolate of peptides can be prepared from a biomass of microalgae of the genus Chlorella, more particularly of the species Chlorella protothecoides, microalgae discolored and having a protein content, expressed in N 6.25 greater than 60%, for example more than 65%.
  • the preferred method of microalgae fermentation is a two-step process comprising:
  • the residual salt content of the soluble fraction of the fermentation must does not exceed 6 g / l.
  • the biomass thus prepared is then washed in order to purify it from its interstitial solubles (in particular soluble salts), brought to a solids content of between 15 and 30%, preferably to a solids content of between 20 and 30%, and then is heat-treated. at a temperature between 50 and 150 ° C, for a period of between 5 seconds and 5 minutes.
  • interstitial solubles in particular soluble salts
  • the residual biomass is removed, and the recovered soluble fraction is then clarified, precipitated, concentrated and then dried to form the peptide isolate according to the invention.
  • the present invention thus relates to an isolate obtained or obtainable from a protein rich microalgae biomass prepared by a fermentative method described herein. It also relates to an isolate obtained or obtainable from the biomass of high protein microalgae by a method of treating biomass as described herein. Detailed description of the invention
  • the invention relates to a peptide isolate prepared from a biomass of microalgae grown so as to enrich it with proteins, microalgae of the genus Chlorella, more particularly Chlorella protothecoides.
  • the peptide isolate according to the invention obtained from this protein-rich biomass, is characterized in that it comprises:
  • the term “comprises” means that the isolate consists essentially of these peptides but may comprise other minority components.
  • “essentially constituted” means at least 90, 95 or 99% by dry weight of the isolate.
  • the molecular weight of said peptides is measured by chromatography according to the following method:
  • the sample is dissolved in 0.5% water in HPLC grade water.
  • The% of the different fractions is then calculated on the basis of the retention times of each control.
  • the measurement of the protein content is conventionally determined by the measurement of N.6.25, known in general
  • amino acid composition is determined according to NF EN ISO 13903 (November 2005).
  • arginine and glutamic acid contents of the isolate are as specified hereinabove.
  • the high content of arginine and glutamic acid is understood here for example by a content:
  • the peptide isolate comprises less than 3% of total sugars (carbohydrates).
  • the peptide isolate according to the invention can be prepared from a biomass of microalgae of the genus Chlorella, more particularly of the species Chlorella protothecoides, microalgae discolored and having a protein content, expressed in N.6, 25 greater than 60%.
  • a person skilled in the art chooses to control the growth of microalgae by controlling the fermentation conditions (Tp, pH, etc.), or by the regulated feeding into nutritional components (nitrogen or carbon sources) of the fermentation medium. , under semi-continuous conditions called "fed-batch".
  • Chlorella protothecoides is justly recognized as one of the best oil-producing microalgae.
  • the C / N ratio is here decisive, and it is accepted that the best results are obtained by acting directly on the nitrogen content, the glucose content not being limiting.
  • Chlorella protothecoides can also be used for its ability to produce proteins.
  • the heterotrophic culture process of said microalgae developed by the Applicant Company to increase the protein content of the biomass then comprises:
  • a so-called "batch" fermentation phase characterized, after the fermenter has been inoculated, with the addition of a quantity of glucose of between 15 and 25 g / l, preferably of the order of 20 g / l, in one go;
  • the NH 3 contribution remarkably rapidly induces an increase in the level of proteins synthesized in the cell, which results in an increase in the intracellular N 6,25 level to a value exceeding the 60%.
  • a complete analysis of the amino acids present in the biomass was then performed on a sample taken just before the change of pH regulation, and on several other samples taken after said change.
  • the content of glutamic acid and arginine on total amino acids is more than 45%
  • N.6, 25 is therefore directly correlated with the increase in the synthesis of glutamic acid and arginine.
  • This biomass is particularly well suited to the preparation of the peptic isolate according to the invention, by implementing the following method:
  • washing the biomass so as to eliminate the interstitial soluble compounds optionally, washing the biomass so as to eliminate the interstitial soluble compounds
  • thermal permeabilization of the biomass at a temperature of between 50 and 150 ° C., preferably between approximately 80 and 150 ° C., for a duration of between approximately 10 seconds and approximately 5 minutes, preferably for a duration of between approximately 10 seconds and approximately 1 minute, elimination of the biomass thus permeabilized by a solid-liquid separation technique, preferably chosen from the group consisting of frontal or tangential filtration, flocculation and centrifugation, more particularly multi-stage centrifugation, to obtain a soluble fraction,
  • the biomass is collected by solid-liquid separation, by frontal or tangential filtration or by any means known to those skilled in the art.
  • the Applicant Company recommends washing the biomass so as to eliminate the interstitial soluble compounds by a succession of concentration (by centrifugation) / dilution of the biomass.
  • interstitial soluble compounds means all the soluble organic contaminants of the fermentation medium, for example the water-soluble compounds such as soluble salts, residual glucose, oligosaccharides of degree of polymerization (or DP) 2 or 3 or the peptides.
  • This biomass thus purified of its interstitial soluble compounds is then adjusted preferably to a solids content of between 15 and 30% by weight, preferably at a solids content of between 20 and 30%.
  • the heat treatment is then carried out at a temperature of between 50 and
  • 150 ° C preferably between about 80 and 150 ° C, for a period of time between about
  • the heat treatment is carried out at a temperature of about 140 ° C for a period of about 10 seconds.
  • the heat treatment is carried out at a temperature of about 85 ° C for a period of about 1 minute.
  • This treatment makes it possible to allow the intracellular components to diffuse into the reaction medium.
  • the biomass is cooled to a temperature below 40 ° C, preferably cooled to a temperature of the order of 4 ° C.
  • the applicant company considers that the heat treatment, carried out under these operating conditions, could act thus as a membrane embrittlement process that allows the spontaneous release of soluble components of the intracellular compartment, or even the extracellular matrix.
  • organic substances such as carbohydrates (predominantly DP1 and DP2), peptides and polypeptides are drained out of the cell.
  • the process according to the invention therefore does not lead to the formation of an emulsion, but to an aqueous suspension.
  • a lag time may be necessary to allow sufficient diffusion after the heat treatment which permeabilizes the membrane.
  • reaction time between 5 seconds and 5 minutes.
  • the method of the invention advantageously exploits the thermal permeabilization phenomenon to extract the solubilized peptide fraction of the residual biomass.
  • the residual biomass is then removed by a solid-liquid separation technique by frontal or tangential filtration, by flocculation, by centrifugation, or by any other means known to those skilled in the art, which makes it easy to recover the fraction. soluble free of microalgae cells.
  • the yield and quality of this separation step can be improved by diluting the permeabilized cells (for example by multi-stage dilution / centrifugation).
  • the soluble fraction thus obtained may be clarified by microfiltration so as to rid it of the residual insolubles and according to its dry matter, a concentration by evaporation or by any means known to those skilled in the art may be carried out before purification which follows.
  • the resulting soluble fraction is ultimately composed essentially of proteins (50-80% w / w) and carbohydrates (10-25% w / w).
  • the conventional processes for recovering soluble proteins generally rely on a step of precipitating said proteins with trichloroacetic acid (10% w / v) or with ammonium sulphate.
  • the method of the invention then leads to the isolation of the proteins of interest, by precipitation by modulating the properties of the medium.
  • the cooling temperature is below 10 ° C, preferably below 4 ° C.
  • the pH in addition to the temperature, the pH must be between 2.5 and 6.5 and preferably be close to pHi, ie between 3 and 5.
  • the ionic strength of the medium can be adapted to promote precipitation.
  • Salting-in the phenomenon of salts
  • solubility of the proteins by reducing the solvation layer.
  • a demineralization operation prior to precipitation can be added. This is carried out on cationic and anionic resins, dialysis, filtration or by any means known to those skilled in the art.
  • the polarity of the medium can be decreased (with dehydration of the medium) by adding an ethanol-type solvent which will generate a more quantitative precipitation of the protein fraction by greatly reducing its solubility.
  • the separation of the precipitated fraction is carried out by simple decantation and recovery of the heavy phase or optionally by centrifugation under optimum temperature conditions.
  • the pH may be readjusted before drying.
  • the drying is carried out by atomization, lyophilization or by any means known to those skilled in the art.
  • a soluble protein isolate greater than 90% by weight, rich in arginine and glutamic acid, is then obtained.
  • Example 1 Preparation of a biomass of C. protothecoides rich in proteins with a high content of glutamic acid and arginine
  • strain CCAP21 1 / 8D The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK.
  • composition of the medium 40 g / l of glucose + 10 g / l of yeast extract.
  • This fermentation line makes it possible to obtain a biomass having more than 65% of proteins expressed in N, 6.25.
  • the biomass obtained according to Example 1 is harvested at a dry cell solids content of 105 g / L with a purity of 80% (purity defined by the ratio between the dry matter of the biomass on total dry matter).
  • the pH is adjusted to 7 with potassium hydroxide and the biomass is thermally treated with UHT with preheating at 70 ° C. and then direct steam injection on a scale of about ten seconds at 140 ° C. and cooling at 40 ° C. by vacuum flotation.
  • the heat treatment is pushed to a high scale in order to maximize the partial solubilization of the biomass which sees its purity decrease to 53%.
  • composition of the biomass is as follows:
  • a slight dilution [0.5: 1] (VeauVmout) is performed online on the second stage (on a configuration with two Alfa Laval FEUX 510 centrifuges in series) with recycling. from the supernatant of the second stage to the first.
  • the supernatant of the first stage is thus recovered and concentrates the clarified solubles.
  • the pH of the crude solubles is adjusted to 4.5 with phosphoric acid.
  • the heavy phase is then extracted by simple phase separation into a separating funnel with a mass yield of 26% and has a solids content of 36.3%.
  • This extract is lyophilized to a dry matter content of 97%.
  • composition of this isolate is as follows:
  • the isolate is characterized by a richness of the order of 95% in amino acids consisting essentially of arginine and glutamic acid (based on the analysis of the distribution of total amino acids).
  • the molecular weight of this fraction is essentially between 1 kDa and 20 kDa.

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Abstract

L'invention se rapporte à un isolat peptidique isolé à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines, caractérisé en ce qu'il comprend : - des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 k Da, - une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, - essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique.

Description

PROCEDE D'OBTENTION D'UN ISOLAT PEPTIDIQUE ISSU DE LA BIOMASSE DE MICROALGUES ENRICHIES EN PROTEINES
La présente invention se rapporte à un isolât peptidique issu d'une biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides.
Les algues, macro et micro, ont une richesse spécifique en grande partie inexplorée. Leur exploitation à des fins alimentaire, chimique ou bioénergétique est encore très marginale. Elles recèlent cependant des composants de grande valeur, en richesse comme en abondance.
Les microalgues sont en effet des sources de vitamines, lipides, protéines, sucres, pigments et antioxydants.
Les algues et microalgues intéressent ainsi le secteur industriel qui les utilise pour la fabrication de compléments alimentaires, d'aliments fonctionnels, de cosmétiques, de médicaments ou pour l'aquaculture.
Les microalgues sont avant tout des microorganismes photosynthétiques qui colonisent tous les biotopes exposés à la lumière.
A l'échelle industrielle, leur culture monoclonale est réalisée dans des photobioréacteurs (conditions autotrophiques : à la lumière avec du C02) ou pour certaines d'entre elles, également dans des fermenteurs (conditions hétérotrophiques : à l'obscurité en présence d'une source carbonée).
Quelques espèces de microalgues sont en effet capables de pousser en absence de lumière : Chlorella, Nitzschia, Cyclotella, Tetraselmis, Crypthecodinium, Schizochytrium.
II est d'ailleurs estimé que la culture en conditions hétérotrophiques coûte 10 fois moins chère qu'en conditions phototrophiques car, pour l'Homme du métier, ces conditions hétérotrophiques autorisent :
- l'utilisation de fermenteurs identiques à ceux utilisés pour les bactéries et les levures et permettent le contrôle de tous les paramètres de culture.
- la production de biomasses en quantité bien plus élevée que ce qui est obtenu par culture basée sur la lumière.
L'exploitation rentable des microalgues nécessite généralement la maîtrise des conditions de fermentation permettant d'accumuler ses composants d'intérêt, tels que :
- les pigments (chlorophylle a, b et c, β-carotène, astaxanthine, lutéine, phycocyanine, xanthophylles, phycoérythrine...) dont la demande est croissante, tant pour leurs remarquables propriétés antioxydantes, que pour leur apport de couleurs naturelles dans l'alimentation, - les lipides, ceci afin d'optimiser leur contenu en acides gras (jusqu'à 60 %, voire 80 % en poids de leur matière sèche) notamment pour :
• les applications biocarburants, mais aussi
• les applications en Alimentation humaine ou animale, lorsque les microalgues sélectionnées produisent des acides gras polyinsaturés ou
PUFAs dits "essentiels" (i.e. apportés par l'alimentation car ne sont pas naturellement produits par l'homme ou l'animal), ou
- les protéines, ceci afin d'en optimiser les qualités nutritives ou par exemple de favoriser l'apport en acides aminés d'intérêt par le biais de la préparation de fractions riches en peptides.
Les fractions peptidiques peuvent être valorisées comme agents fonctionnels ou compléments alimentaires dans de nombreux domaines.
Dans le cadre de l'apport en acides aminés d'intérêt, il peut être en effet avantageux de disposer de sources de peptides riches en arginine et en acide glutamique.
L'arginine est un acide aminé qui présente de nombreuses fonctions dans le règne animal.
L'arginine peut être dégradée et ainsi servir de source d'énergie, de carbone et d'azote à la cellule qui l'assimile.
Chez divers animaux, dont les mammifères, l'arginine est décomposée en ornithine et en urée. Cette dernière est une molécule azotée qui peut être éliminée (par excrétion dans les urines) de manière à réguler la quantité de composés azotés présente dans les cellules des organismes animaux.
L'arginine permet la synthèse du monoxyde d'azote (NO) par la NO synthétase, intervenant ainsi dans la vasodilatation des artères, ce qui réduit la rigidité des vaisseaux sanguins, augmente le flux sanguin et améliore ainsi le fonctionnement des vaisseaux sanguins.
Les compléments alimentaires qui contiennent l'arginine sont recommandés pour promouvoir la santé du cœur, la fonction vasculaire, pour prévenir « l'agrégation des plaquettes » (risque de formation de caillots sanguins) et pour abaisser la pression artérielle.
L'implication de l'arginine dans la cicatrisation des plaies est liée à son rôle dans la formation de la proline, un autre acide aminé important pour la synthèse de collagène.
L'arginine est enfin un composant fréquemment utilisé, notamment par les sportifs, dans les boissons énergisantes.
L'acide glutamique quant à lui n'est pas seulement l'une des briques élémentaires utilisées pour la synthèse des protéines, mais est aussi le neurotransmetteur excitateur le plus répandu dans le système nerveux central (encéphale + moelle épinière) et est un précurseur du GABA dans les neurones GABAergiques.
Sous le code de « E620 », le glutamate est utilisé comme exhausteur de goût des aliments. Il est additionné aux préparations alimentaires pour renforcer leur goût.
Outre le glutamate, le Codex Alimentarius a reconnu aussi comme exhausteurs de goût ses sels de sodium (E621 ), de potassium (E622), calcium (E623), ammonium (E624) et magnésium (E625).
Le glutamate (ou ses sels) est souvent présent dans les plats tout prêts (soupes, sauces, chips, plats cuisinés). Il est aussi couramment utilisé en cuisine asiatique.
II est actuellement fréquemment utilisé en combinaison avec des arômes dans les apéritifs (goût bacon, goût fromage). Cela permet de rehausser le goût de bacon, du fromage, etc. Il est rare de trouver un apéritif qui n'en contienne pas.
On en trouve aussi dans certaines capsules de médicaments mais pas pour ses fonctions gustatives.
Enfin, il est le composant majoritaire des auxiliaires de cuisine (bouillons cubes, fonds de sauces, sauces, etc.).
Cependant, les développements en applications alimentaires des fractions peptidiques de microalgues n'ont pas été significatifs à cause de la présence dans lesdites fractions de composés indésirables (pigments...). Ces composés conduisent à des changements non souhaités de couleur, goût et structure des compositions alimentaires en contenant.
Pour augmenter leur potentialité en applications alimentaires et pour augmenter également leur valeur commerciale, ces peptides doivent donc être extraits des microalgues présentant les compositions requises, en termes de :
- richesse en azote,
- richesse en acides aminés d'intérêt,
- faible teneur en pigments Objet de l'invention
La présente invention se rapporte à un isolât peptidique issu d'une biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un isolât de microalgues caractérisé par sa teneur remarquablement élevée en arginine et en acide glutamique. La présente invention se rapporte également à la biomasse de microalgues riches en protéines en tant que telle, biomasse particulièrement adaptée à la préparation dudit isolât peptidique.
La présente invention est également relative au procédé d'enrichissement et de dépigmentation de la biomasse de microalgues, plus particulièrement du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides.
La présente invention concerne enfin le procédé de préparation de cet isolât peptidique à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines et dépigmentées.
En effet, pour parvenir à exploiter les richesses métaboliques des microalgues, et plus particulièrement leurs fractions peptidiques, la société Demanderesse propose de mettre à disposition un isolât peptidique présentant :
- des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa,
- d'une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %,
- essentiellement de T'arginine et de l'acide glutamique.
On entend au sens de l'invention par « essentiellement composés d'arginine et d'acide glutamique », une richesse en arginine et acide glutamique pouvant s'entendre par une teneur en arginine et acide glutamique de plus de 80, 85, 90 ou 95 % en poids exprimée par rapport aux acides aminés totaux. En particulier, ces deux acides aminés représentent 85 à 99 % rapport aux acides aminés totaux, de préférence entre 90 entre 98 % rapport aux acides aminés totaux, et en particulier entre 95 et 98 %.
Plus précisément, entend au sens de l'invention par « essentiellement composés d'arginine et d'acide glutamique », une richesse en arginine et acide glutamique pouvant s'entendre par une teneur :
- d'au moins 40% d'arginine, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 % ; et
- d'au moins 40% d'acide glutamique, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 %
exprimée sur acides aminés totaux.
En particulier, la teneur en acides aminés autres qu'arginine et acide glutamique est de moins de 10 %, de préférence de moins de 5 %, notamment de moins de 3 %.
Dans un mode de réalisation spécifique, la teneur de l'isolât est la suivante :
- une teneur comprise entre 47 et 48 % d'arginine ;
- une teneur comprise entre 49 à 50 % d'acide glutamique ;
exprimée sur acides aminés totaux, ce qui se traduit par une teneur en acides aminés autres qu'arginine et acide glutamique de moins de 3 %. Par « environ » est entendu une gamme de valeur comprenant + ou - 10 % de la valeur indiquée, de préférence + ou - 5 % de celle-ci. Par exemple, environ 10 signifie entre 9 et 1 1 , de préférence entre 9,5 et 10,5.
Cet isolât de peptides peut être préparé à partir d'une biomasse de microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides, microalgues décolorées et présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 %, par exemple de plus de 65%.
Le procédé préféré de fermentation des microalgues est un procédé en deux étapes, comprenant :
- une première étape de fermentation, carencée en azote, où la régulation du pH est réalisée par un mélange ΝΗ3/ΚΟΗ puis,
- une deuxième étape de levée de cette carence en azote par une régulation du pH assurée par du NH3 seul.
Ces conditions opératoires permettent ainsi d'obtenir rapidement une biomasse présentant une teneur en protéines supérieure à 60 % en N.6,25, de l'ordre de ou d'environ 65 % en N.6,25, et une faible coloration. Le rendement est de 45 à 50 % en poids de matière sèche, et la concentration finale en biomasse est comprise entre 80 et 120 g/l.
Par ailleurs, le teneur en sels résiduels de la fraction soluble du moût de fermentation ne dépasse pas 6 g/l.
La biomasse ainsi préparée est ensuite lavée pour la purifier de ses solubles interstitiels (notamment des sels solubles), amenée à une matière sèche comprise entre 15 et 30 %, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %, puis est traitée thermiquement à une température comprise entre 50 et 150°C, pendant une durée comprise entre 5 secondes et 5 minutes.
A l'issu de ce traitement, qui perméabilise la membrane cellulaire et permet le relargage des composants solubles du compartiment intracellulaire par diffusion libre, la biomasse résiduelle est éliminée, et la fraction soluble récupérée est alors clarifiée, précipitée, concentrée puis séchée pour constituer l'isolât peptidique conforme à l'invention.
La présente invention concerne donc un isolât obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines préparée par un procédé fermentaire décrit dans le présent document. Elle est également relative à un isolât obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines par un procédé de traitement de la biomasse tel que décrit dans le présent document. Description détaillée de l'invention
Caractérisation de l'isolât peptidique selon l'invention L'invention porte sur un isolât peptidique préparé à partir d'une biomasse de microalgues cultivées de manière à l'enrichir en protéines, microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement Chlorella protothecoides.
L'isolât peptidique conforme à l'invention, obtenu à partir de cette biomasse riche en protéines est caractérisé en ce qu'il comprend :
- des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa,
- une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %,
- essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique.
Dans ce contexte de définition de l'isolât, le terme « comprend » signifie que l'isolât est essentiellement constitué par ces peptides mais peu comprendre d'autres composants minoritaires. Ainsi, « essentiellement constitué » signifie au moins 90, 95 ou 99 % en poids sec de l'isolât.
Le poids moléculaires desdits peptides est mesuré par chromatographie selon la méthode suivante :
Conditions chromatographiques :
- 2 colonnes montées en série : Colonne SUPERDEX® 200HR10/30 avec une Colonne SUPERDEX® Peptide HR10/30 (de Pharmacia Biotech)
- Débit : 0,3 ml/min
Détecteur UV à 214 nm
- Eluant : NaCI 0,05 M
Temps d'analyse : 240 min
L'échantillon est mis en solution à 0,5% dans l'eau de qualité HPLC.
Les colonnes sont calibrées avec un mélange témoin Biorad ref 151 -1901 composé de :
- Thyroglubuline : Mw = 670 KDa
- Globuline bovine: Mw = 158 KDa
Ovalbumine : Mw = 44 KDa
- Myoglobine : Mw = 17 KDa
- Vitamine B12 : Mw = 1 .35 KDa
Le % des différentes fractions est alors calculé sur la base des temps de rétention de chaque témoin.
La mesure de la teneur en protéines est classiquement déterminée par la mesure du N.6.25, connue en toute généralité
Enfin la composition en acides aminés est déterminée selon la NF EN ISO 13903 (novembre 2005).
Les teneurs en arginine et acide glutamique de l'isolât sont telles que précisées plus haut dans ce document. La teneur élevée en arginine et acide glutamique s'entend par exemple ici par une teneur :
- comprise entre 47 et 48 % d'arginine
- comprise entre 49 à 50 % d'acide glutamique
exprimée sur acides aminés totaux, ce qui se traduit par une teneur en acides aminés autres qu'arginine et acide glutamique de moins de 3 %.
Facultativement, l'isolât peptidique comprend moins de 3 % de sucres totaux (hydrates de carbones). Procédé de préparation de l'isolât peptidique conforme à l'invention
L'isolât de peptides conforme à l'invention peut être préparé à partir d'une biomasse de microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides, microalgues décolorées et présentant une teneur en protéines, exprimée en N.6,25 supérieure à 60 %.
Pour obtenir des rendements et productivités maximales en protéines, la société demanderesse a mis en œuvre un procédé original qu'elle a par ailleurs protégé dans une de ses demandes de brevet récemment déposée.
Dans l'état de l'art, de premiers procédés de fermentation permettant d'obtenir de hautes densités cellulaires (acronyme anglais : HCD pour High-Cell-Density) avaient été beaucoup travaillés.
L'objectif de ces cultures HCD était l'obtention de la concentration la plus élevée possible du produit souhaité dans le laps de temps le plus court.
Cependant, le fait de maintenir la croissance à son taux maximal (μ, en h 1) n'est pas toujours corrélé avec la production élevée du produit d'intérêt.
De ce fait, dans les cas où la formation des produits n'est pas corrélée avec une croissance cellulaire élevée ou maximale, il est judicieux de maîtriser le taux de croissance cellulaire.
En général, l'homme du métier choisit de contrôler la croissance des microalgues par la maîtrise des conditions de fermentation (Tp, pH...), ou par l'alimentation régulée en composants nutritionnels (sources azotées ou carbonées) du milieu de fermentation, dans des conditions semi continues dites « fed-batch ».
Chlorella protothecoides est justement reconnue comme une des meilleures microalgues productrices d'huile.
En conditions hétérotrophiques, elle transforme rapidement les hydrates de carbone en triglycérides (plus de 50 % de sa matière sèche). Pour optimiser cette production en triglycérides, l'homme du métier est amené à optimiser le flux carboné vers la production d'huile, en agissant sur l'environnement nutritionnel du milieu de fermentation.
Il est ainsi connu que l'accumulation en huile se produit lors d'un apport carboné suffisant, mais dans des conditions de carence en azote.
Le rapport C/N est donc ici déterminant, et il est admis que les meilleurs résultats sont obtenus en agissant directement sur la teneur en azote, la teneur en glucose n'étant pas limitante.
Mais Chlorella protothecoides peut être également utilisée pour sa capacité à produire des protéines.
Pour la production de biomasses riches en protéines, l'homme du métier est donc amené à prendre l'opposé du contrôle métabolique permettant à la microalgue de produire naturellement des lipides de réserve, c'est-à-dire travailler les conditions de fermentation en favorisant plutôt un rapport C/N faible, et ainsi :
- réaliser un apport important en source d'azote au milieu de fermentation, tout en maintenant constant la charge en source carbonée qui sera convertie en protéines, et
stimuler la croissance de la microalgue.
Il s'agit de modifier le flux carboné vers la production de protéines (et donc de biomasses), au détriment de la production des lipides de réserve.
Dans le cadre de l'invention, la société Demanderesse a au contraire choisi d'explorer une voie originale en proposant des solutions alternatives à celles classiquement envisagées par l'homme du métier.
Le procédé de culture hétérotrophique desdites microalgues mis au point par la société Demanderesse pour augmenter la teneur en protéines de la biomasse comporte alors :
- une phase dite de fermentation « batch » caractérisée après ensemencement du fermenteur, par l'apport en une seule fois d'une quantité de glucose comprise entre 15 et 25 g/l, de préférence de l'ordre de 20 g/l
- une phase de fed batch exponentiel durant laquelle le glucose est apporté progressivement et la régulation de pH faite initialement par le mélange NH3/KOH est remplacée par une régulation avec NH3 seul.
Comme il sera exemplifié ci-après, l'apport en NH3 induit de manière remarquablement rapide une élévation du taux de protéines synthétisées dans la cellule, ce qui se traduit par une élévation du taux de N.6,25 intracellulaire à une valeur dépassant les 60 %. Une analyse complète des acides aminés présents dans la biomasse a été ensuite réalisée sur un échantillon prélevé juste avant le changement de régulation de pH, et sur plusieurs autres échantillons prélevés après ledit changement.
Il est observé que, avant le changement, la somme des acides aminés est faible (de l'ordre de 15 à 25 %) et qu'il n'y a pas de prédominance parmi les différents acides aminés.
Après le changement de régulation, on note que :
- la somme des acides aminés dépasse les 40 %,
- au total, la teneur en acide glutamique et arginine sur acides aminés totaux est de plus de 45 %,
- l'acide aminé qui connaît l'augmentation la plus forte est l'acide glutamique, suivi de l'arginine. Le taux des autres aminés augmente également, mais de manière beaucoup plus faible.
L'augmentation du N.6,25 est donc directement corrélé avec l'augmentation de la synthèse d'acide glutamique et d'arginine.
Par ailleurs, ce mode de régulation du pH permet :
- de limiter l'apport en sels du milieu de fermentation, et
- d'influer sur la couleur de la biomasse, qui sera d'autant plus jaune que la teneur en NH3 aura été limitée initialement.
En conclusion, la biomasse de microalgues riches en protéines, microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement encore de l'espèce Chlorella protothecoides présente :
- une concentration de 80 à 90 g/1,
- une teneur en N.6,25 de plus de 60 %,
- une quantité de sels inférieure à 6 g/1 dans son surnageant de culture,
- une coloration faible, et
- une teneur en acide aminé et glutamine de plus de 45 % en poids sur acides aminés totaux.
Cette biomasse est particulièrement bien adaptée à la préparation de l'isolât peptique selon l'invention, par la mise en œuvre du procédé suivant :
- de manière optionnelle, lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels,
- perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence entre environ 80 et 150C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute, - élimination de la biomasse ainsi perméabilisée par une technique de séparation solide-liquide, de préférence choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale ou tangentielle, la floculation et la centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, pour obtenir une fraction soluble,
- de manière optionnelle, récupération et clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels,
- purification de la fraction soluble par précipitation, afin d'obtenir un isolât peptidique, et
- évaporation, pasteurisation et atomisation dudit isolât peptidique.
Après fermentation dans les conditions énoncées ci-dessus, la biomasse est collectée par séparation solide-liquide, par filtration frontale ou tangentielle ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
De manière optionnelle, la société Demanderesse recommande de laver la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels par une succession de concentration (par centrifugation) / dilution de la biomasse.
Au sens de l'invention, on entend par « composés solubles interstitiels » tous les contaminants organiques solubles du milieu de fermentation, par exemple les composés hydrosolubles tels les sels solubles, le glucose résiduel, les oligosaccharides de degré de polymérisation (ou DP) 2 ou 3 ou les peptides.
Cette biomasse ainsi purifiée de ses composés solubles interstitiels est ensuite ajustée préférentiellement à une matière sèche comprise entre 15 et 30 % en poids, de préférence à une matière sèche comprise entre 20 et 30 %.
On réalise alors le traitement thermique à une température comprise entre 50 et
150 °C, de préférence entre environ 80 et 150°C, peidant une durée comprise entre environ
5 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ
10 secondes et environ 1 minute. De préférence, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 140 °C, pendant une durée d'erviron 10 secondes. Dans une autre alternative préférée, le traitement thermique est réalisé à une température d'environ 85°C, pendant une durée d'environ 1 minute.
Ce traitement permet de laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel.
Enfin, au terme de ces étapes, la biomasse est refroidie à une température inférieure à 40 °C, de préférence réfrigérée à une température de l'ordre de 4°C.
Sans être liée par une quelconque théorie, la société Demanderesse considère que le traitement thermique, réalisé dans ces conditions opératoires, pourrait agir ainsi comme un procédé de fragilisation membranaire qui autorise le relargage spontané des composants solubles du compartiment intracellulaire, voire de la matrice extracellulaire.
En plus des substances ioniques, des substances organiques tels que les hydrates de carbone (majoritairement DP1 et DP2), les peptides et les polypeptides sont drainés hors de la cellule.
Au contraire, les lipides et composés organiques hydrophobes restent dans les cellules, ce qui démontre bien que les cellules sont perméabilisées et non lysées ou détruites.
Le procédé selon l'invention ne conduit donc pas à la formation d'une émulsion, mais bien à une suspension aqueuse.
Le relargage de toutes ces substances solubles à travers la membrane perméabilisée s'apparente à un procédé de diffusion libre de type dialyse.
Par voie de conséquence, un temps de latence peut être nécessaire pour permettre une diffusion suffisante après le traitement thermique qui perméabilise la membrane.
Dans la littérature, le procédé de perméabilisation par champ puisé des membranes de levures pour en extraire les protéines demande de 4 h à 6 h (Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84).
Selon l'invention, un temps de réaction beaucoup plus court est mis en œuvre, compris entre 5 secondes et 5 minutes.
L'élévation du barème (temps /température) conduit alors à une augmentation du taux de solubilisation et du rendement d'extraction des solubles.
Le procédé de l'invention exploite avantageusement le phénomène de perméabilisation thermique pour extraire la fraction peptidique ainsi solubilisée de la biomasse résiduelle.
Ainsi, la biomasse résiduelle est ensuite éliminée par une technique de séparation solide-liquide par filtration frontale ou tangentielle, par floculation, par centrifugation, ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier, ce qui permet de récupérer aisément la fraction soluble débarrassée des cellules de microalgues.
Le rendement et la qualité de cette étape de séparation peut être amélioré en procédant à une dilution des cellules perméabilisées (par exemple par dilution/centrifugation multiétagée).
Si nécessaire, la fraction soluble ainsi obtenue peut être clarifiée par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels et selon sa matière sèche, une concentration par évaporation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier peut être réalisée avant la purification qui s'en suit. La fraction soluble résultante est finalement composée essentiellement de protéines (50 - 80 % p/p) et d'hydrates de carbone (10 - 25 % p/p).
Les procédés classiques de récupération des protéines solubles reposent généralement sur une étape de précipitation desdites protéines par l'acide trichloracétique (10 % poids/volume) ou au sulfate d'ammonium.
Cependant, ces isolements par précipitation font suite à des procédés de cassage cellulaire très destructeurs (le plus souvent par sonication ou homogénéisation) qui, s'ils permettent en effet d'augmenter les rendements d'extraction, conduisent surtout à des protéines de faible solubilité et dénaturées.
Leur refonctionnalisation ne peut alors être envisagée que par le biais de leur produit d'hydrolyse (en peptides) par des moyens chimiques (lyse à la soude), physiques (traitement à haute température) ou enzymatiques (enzymes protéolytiques).
Le procédé de l'invention conduit ensuite à l'isolement des protéines d'intérêt, par précipitation en modulant les propriétés du milieu.
La société Demanderesse recommande ainsi de procéder comme suit :
- favoriser la précipitation de tout ou partie de la fraction protéique en modulant les propriétés physico-chimiques du milieu.
Le refroidissement des solubles bruts, obtenus comme décrit dans les étapes précédentes, enclenche un phénomène de précipitation d'une partie des peptides solubles. Il est observé que la précipitation est plutôt sélective sur les plus hauts poids moléculaires. La température de refroidissement est inférieure à 10°C, de préférence, inférieure à 4°C.
Certaines conditions opératoires permettent de favoriser ce phénomène : outre la température, le pH doit être situé entre 2,5 et 6,5 et de préférence être proche du pHi, soit entre 3 et 5.
De la même manière la force ionique du milieu peut être adaptée pour favoriser la précipitation. Ainsi, en diminuant fortement la force ionique, on peut atténuer le phénomène de prise en sels (terme anglais de « Salting-in ») et ainsi diminuer la solubilité des protéines (par diminution de la couche de solvatation). Ainsi, une opération de déminéralisation préalable à la précipitation peut être ajoutée. Celle-ci est réalisée sur résines cationiques et anioniques, dialyse, filtration ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
Inversement, en augmentant fortement la force ionique, l'eau disponible diminue par le phénomène de relargage (terme anglais de « Salting out »), de cette manière les protéines ont tendance à précipiter. Ce mode n'est pas préféré puisqu'une déminéralisation prononcée serait ensuite nécessaire sur l'isolât protéique ainsi extrait.
Dans la même optique de modulation de la couche de solvatation, la polarité du milieu peut être diminuée (avec déshydratation du milieu) par ajout d'un solvant de type éthanol qui permettra de générer une précipitation plus quantitative de la fraction protéique en diminuant fortement sa solubilité.
- en récupérant la fraction précipitée qui est ensuite éventuellement concentrée avant séchage.
La séparation de la fraction précipitée est réalisée par simple décantation et récupération de la phase lourde ou éventuellement par centrifugation dans les conditions de température optimales.
Le pH peut éventuellement être réajusté avant séchage.
Le séchage est effectuée par atomisation, lyophilisation ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
Préalablement au séchage, l'incorporation d'une étape de concentration par évaporation peut permettre d'optimiser énergétiquement l'opération. Elle peut être notamment justifiée si un solvant du type éthanol est utilisé pour permettre son recyclage.
L'exploitation de ces voies permet de purifier une fraction à haute teneur en peptides et polypeptides des sels et sucres résiduels.
On obtient alors un isolât de protéines solubles supérieur à 90 % en poids, riches en arginine et acide glutamique.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs.
Exemples
Exemple 1 : Préparation d'une biomasse de C. protothecoides riche en protéines à haute teneur en acide glutamique et arginine
La souche utilisée est une Chlorella protothecoides (souche CCAP21 1/8D - The Culture Collection of Algae and Protozoa, Scotland, UK).
Préculture :
- 150 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 500 mL ;
- Composition du milieu : 40 g/L de glucose + 10 g/L d'extrait de levure.
L'incubation se déroule dans les conditions suivantes :
- durée : 72 h ; - température : 28 °C ;
- agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).
Culture en mode batch puis fed batch
Préparation et milieu batch initial
- préparer et filtrer un mélange KOH à 400 g/l (41 %) / NH3 à 20 % v/v (59 %) ;
- stériliser fermenteur 20 L à 121 °C/ 20 min ;
- inoculer avec 2 erlenmeyers de préculture de 500 ml (DOeoo nm de 15) ;
- mise au pH de 4,5 avec NH3 20% v/v ;
- agitation de 300 rpm départ ;
- aération : 20 L/min d'air ;
- régulation p02 à 30 % ;
Alimentation
- glucose : 500 g/l
- sulfate d'ammonium : 5 g/l
- phosphate de diammonium : 20 g/l
- acide phosphorique : 16 g/l
- sulfate de magnésium heptahydrate : 12 g/l
- sulfate de fer : 170 mg/l
- calcium nitrate : 610 mg/l
solution d'oligoéléments : 45 ml/l
solution de vitamines : 4,5 ml/l
Il est important de noter que la charge en sels d'ammonium, sels de magnésium et acide phosphorique a été élaborée de manière à limiter la teneur en sels du milieu de fermentation et a été optimisée de manière à maintenir la teneur en N.6,25 de la biomasse finale décolorée.
Calcium panthothenate 0,4
Acide p-aminobenzoïque 0,8
Conduite de la fermentation
- apporter l'équivalent de 20 g/1 avant inoculation
- quand la concentration en glucose est = 0 g/1, démarrer l'alimentation en profil exponentiel (μ = 0,07 h 1) ;
- régulation du pH à 5,2 avec le mélange 41 % KOH / 59 % NH3
- quand 2 kg de glucose sont consommés par la microalgue, on passe en régulation du pH par NH3 seul
Résultats :
Cette conduite de fermentation permet d'obtenir une biomasse présentant plus de 65 % de protéines exprimées en N.6,25.
Exemple 2 : Procédé de perméabilisation thermique de la biomasse enrichie en protéines et récupération de solubles « bruts »
La biomasse obtenue selon l'exemple 1 est récoltée à une matière sèche cellulaire de 105g/L avec une pureté de 80% (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale).
Elle est alors :
- lavée et concentrée par dilution en ligne [1 :1 ] (VeauVmoût),
- centrifugée sur centrifugeuse à assiette Alfa Laval FEUX 510 et amenée à une matière sèche de 220 g/l et à une pureté de 93 % (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale).
Le pH est ajusté à 7 à la potasse et la biomasse est traitée thermiquement par UHT avec préchauffage à 70 °C puis injection vapeurdirect sur un barème d'une dizaine de secondes à 140° C et refroidissement à 40°C par flafci au vide.
Le traitement thermique est poussé à un barème élevé afin de maximiser la solubilisation partielle de la biomasse qui voit sa pureté diminuer à 53%.
Par définition, le relargage de solubles dans le milieu extracellulaire entraine une diminution de la fraction de matière sèche cellulaire par rapport à la matière sèche totale.
A ce stade, la composition de la biomasse est la suivante :
- Acides aminés totaux : 48,4 %
- Sucres totaux : 27,2 %
- Acides gras totaux : 15,1 %
- Cendres : 2,5 %
- Autres résidus : 6,8 %. La séparation des solubles issus du relargage par perméabilisation thermique de biomasse est effectuée par séparation centrifuge.
Afin d'optimiser le rendement et la qualité de la séparation, une légère dilution [0,5 :1 ] (VeauVmoût) est effectuée en ligne sur le deuxième étage (sur une configuration à deux centrifugeuses Alfa Laval FEUX 510 en série) avec recyclage du surnageant du deuxième étage vers le premier.
Le surnageant du premier étage est ainsi récupéré et concentre les solubles clarifiés.
Ces solubles « brut » ont la composition suivante :
- Acides aminés totaux : 77,3 %
- Sucres totaux : 17,6 %
- Cendres : 4,3 %
- Autres résidus : 0,8 %.
Exemple 3 : Purification et obtention de l'isolât protéique
Afin de précipiter sélectivement la fraction protéique, 5kg de solubles brut à une matière sèche de 1 1 ,4% sont placés dans un réacteur double enveloppe sous agitation.
Le pH des solubles bruts est ajusté à 4,5 à l'acide phosphorique.
Après arrêt de l'agitation, la température est abaissée à 4°C.
Ces conditions sont maintenues pendant 8h.
Ainsi s'opère la décantation de la phase lourde enrichie en peptides de plus haut poids moléculaire.
La phase lourde est alors extraite par simple séparation de phase en ampoule à décanter avec un rendement massique de 26% et présente une matière sèche de 36,3%.
Cet extrait est lyophilisé à une matière sèche de 97%.
La composition de cet isolât est la suivante :
- acides aminés totaux : 95 ,9 %
- sucres totaux : 2,44 %
- cendres : 1 ,66 %
L'analyse de la répartition en acides aminés dans les acides aminés totaux est la suivante :
- acide glutamique : 49,78 %
- arginine : 47,21 %
- autres acides aminés : 3,01 % L'isolât est caractérisé par une richesse de l'ordre de 95% en acides aminés essentiellement constitué d'arginine et d'acide glutamique (sur la base de l'analyse de répartition des acides aminés totaux).
Le poids moléculaire de cette fraction est essentiellement compris entre 1 kDa et 20kDa.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Isolât peptidique isolé à partir d'une biomasse de microalgues riches protéines, caractérisé en ce qu'il présente :
des peptides solubles d'un poids moléculaire compris entre 1 et 20 kDa, une teneur en protéines exprimée en N.6,25 de plus de 95 %, essentiellement de l'arginine et de l'acide glutamique.
2. Isolât selon la revendication 1 , caractérisé en ce que les microalgues sont des microalgues du genre Chlorella, plus particulièrement Chlorella protothecoides.
3. Isolât selon l'une ou l'autre des revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est de plus de 80, 85, 90 ou 95 % en poids exprimée par rapport aux acides aminés totaux.
4. Isolât selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est
d'au moins 40% d'arginine, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 % ; et
d'au moins 40% d'acide glutamique, notamment comprise entre 40% et 60 %, de préférence d'environ 50 %
exprimée sur acides aminés totaux.
5. Isolât selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que la teneur en arginine et acide glutamique est :
- comprise entre 47 et 48 % pour l'arginine
- comprise entre 49 à 50 % pour l'acide glutamique
exprimée sur acides aminés totaux.
6. Isolât selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir d'une biomasse de microalgues riches en protéines préparée par un procédé fermentaire qui comporte :
- une phase dite de fermentation « batch » caractérisée après ensemencement du fermenteur, par l'apport en une seule fois d'une quantité de glucose comprise entre 15 et 25 g/l, de préférence de l'ordre de 20 g/l
- une phase de fed batch exponentiel durant laquelle le glucose est apporté progressivement et la régulation de pH faite initialement par le mélange NH3/KOH est remplacée par une régulation avec NH3 seul.
7. Isolât selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est obtenu ou susceptible d'être obtenu à partir de la biomasse de microalgues riches en protéines par un procédé qui comporte :
- de manière optionnelle, le lavage de la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels,
- la perméabilisation thermique de la biomasse à une température comprise entre 50 et 150°C, de préférence environ 80 et 150 C, pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 5 minutes, de préférence pendant une durée comprise entre environ 10 secondes et environ 1 minute,
- l'élimination de la biomasse ainsi perméabilisée par une technique de séparation solide-liquide de préférence choisie dans le groupe constitué de la filtration frontale ou tangentielle, la floculation et la centrifugation, plus particulièrement la centrifugation multi-étagée, pour obtenir une fraction soluble,
- de manière optionnelle, la récupération et la clarification de la fraction soluble ainsi obtenue par microfiltration de manière à la débarrasser des insolubles résiduels,
- purification de la fraction soluble par précipitation, afin d'obtenir un isolât peptidique, et
- l'évaporation, la pasteurisation et l'atomisation dudit isolât protéique.
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