WO2021260087A1

WO2021260087A1 - Procédé de culture de microorganismes pour l'accumulation de lipides

Info

Publication number: WO2021260087A1
Application number: PCT/EP2021/067279
Authority: WO
Inventors: Saïd IHAMMOUINE; François GODART
Original assignee: Fermentalg
Priority date: 2020-06-24
Filing date: 2021-06-24
Publication date: 2021-12-30
Also published as: US20230235371A1; FR3111912A1

Abstract

La présente invention concerne la culture industrielle de protistes pour la production de lipides contenant des acides gras polyinsaturés (PUFA), en particulier l'acide eicosapentaénoïque (EPA) et l'acide arachidonique (ARA).

Description

PROCÉDÉ DE CULTURE DE MICROORGANISMES POUR L’ACCUMULATION DE

LIPIDES

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne la culture industrielle de protistes pour la production de lipides contenant des acides gras polyinsaturés (PUFA), en particulier l’acide eicosapentaénoïque (EPA) et l’acide arachidonique (ARA).

ETAT DE LA TECHNIQUE

Les protistes du genre Pythium sont des microorganismes filamenteux appartenant à la classe des Oomycetes ayant des similitudes avec les champignons. Pythium présente la particularité de synthétiser et d’accumuler des lipides de réserve contenant des Acides Gras Poly-lnsaturés (AGPI ou PUFA) comme l’Acide Eicosapentaénoïque (EPA) et l’Acide Arachidonique (ARA). L’intérêt de ce protiste réside dans l’accumulation majoritaire d’EPA parmi les autres PUFA, en particulier l’ARA.

Certains ont donc envisagé d’employer Pythium comme souche industrielle pour la production d’huile riche en EPA (EP 1 001 034 ; WO 2014/137894 ; Lio J, Wang T. (2013); Liang Y, Zhao X, Strait M, Wen Z. (2012) ; Athalye SK, Garcia RA, Wen Z. (2009) ; Stinson EE, Kwoczak R, Kurantz MJ. (1991) ; Gandhi SR, Weete JD. (1991)).

Pythium est un microorganisme non photosynthétique qui se développe en milieu aqueux ou dans le sol, souvent comme parasite de végétaux sauvages ou de culture (céréales et cultures potagères). La culture de Pythium est réalisée en hétérotrophie, c’est à dire en absence de lumière. C’est d’ailleurs l’un des avantages identifiés dans l’état de la technique de ne pas avoir à dépendre de la lumière (WO 2009/143007).

Toutefois, la teneur en matière grasse dans les souches cultivées par ces méthodes de culture, inférieure à 30% de la matière sèche, reste trop faible pour une exploitation industrielle.

La présente invention permet de résoudre ce problème avec un nouveau procédé de culture qui permet d’augmenter la teneur de matière grasse à des niveaux de pourcentages de la matière sèche compatibles avec une exploitation industrielle.

EXPOSE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un procédé de préparation d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, et (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, l’étape de culture comprenant une phase d’éclairage.

L’invention concerne également un procédé de préparation de compositions lipidiques riches en PUFA qui comprend la culture à partir d’une a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.

L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (d) la formulation d’une composition par addition de la biomasse récupérée en (b) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.

L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une composition lipidique riche en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée et (d) la formulation d’une composition par addition de la composition lipidique extraite en (c) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage.

L’invention concerne aussi une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, la teneur en lipides étant d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS), de préférence d’au moins 50% MS, plus préférentiellement, d’au moins 55% MS, en particulier au moins 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64 ou 65 % MS.

Les protistes du genre Pythium sont avantageusement des protistes de l’espèce Pythium irregulare.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION i. Définitions

Par « biomasse », on entend un ensemble de cellules de protistes du genre Pythium produits par leur culture et séparée du milieu de culture (également appelé jus de fermentation). Les cellules peuvent avoir conservé ou non leur intégrité physique. On comprend donc que ladite biomasse peut comprendre une quantité de cellules de protistes dégradées allant de 0% à 100%. Par "dégradée" on entend que l’intégrité physique desdites cellules de microorganismes a pu être altérée comme par exemple des microorganismes lysés, résultant par exemple d’un procédé d’homogénéisation ou lyse enzymatique. Une fois produite, cette biomasse pourra être brute, juste séparée de son milieu de culture, séchée ou non, dégradée ou non. Une biomasse brute extraite du milieu de culture peut avoir un taux d’humidité de 70% à 90 %, généralement 80% à 85 %.

Une biomasse séchée ou « biomasse sèche » présente un taux d’humidité de 1% à 10%, généralement de 2% à 7%.

Par « protistes du genre Pythium », on entend l’ensemble des protistes désignées sous la classe des Oomycetes et du Genre Pythium, producteur d’EPA, et capables d’être cultivées de manière industrielle. Cela inclus également les souches aux performances améliorées obtenues par mutagénèse et sélection, ou par modification du génome. Cet ensemble des protistes désignés comprend notamment les espèces Pythium insidiuosum, Pythium irregulare, Pythium intermedium, Pythium splendens, Pythium ultimum. Selon une alternative préférée de l’invention, les protistes du genre Pythium sont de l’espèce Pythium irregulare.

Par « industriel(le) », « culture industrielle » ou « cultivée de manière industrielle », on entend une culture des protistes dans un milieu de culture approprié à leur croissance et à la production de PU FA et dans un volume approprié pour la production des quantités suffisantes pour adresser un marché. Ces cultures industrielles sont réalisées par fermentation en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu. Les fermenteurs ont des volumes qui peuvent aller de 1000 L à plus de 200 m³.

Par« milieu de culture » on entend une composition aqueuse comprenant les nutriments nécessaires à la croissance des protistes du genre Pythium, en particulier une source de carbone, une source d’azote, une source de phosphore, mais aussi des sels minéraux, et/ou des vitamines, oligoéléments, etc. bien connus de l’homme du métier.

Le milieu de culture peut être un milieu chimiquement défini, de composition connue et reproductible, dans lequel la teneur de chaque élément est connue et ne comprenant pas de matières organiques et/ou minérales riches ou complexes.

Le milieu de culture peut alternativement comprendre des composants de composition variable, comme des matières organiques et/ou minérales riches ou complexes.

Par matières organiques riches ou complexes on entend des matières organiques non purifiées, se présentant sous la forme de mélanges pour lesquels la composition exacte et les concentrations des divers composants du mélange ne sont pas connues avec exactitude, pas maîtrisées, et peuvent présenter une variabilité significative d’un lot à un autre. Comme exemple de matière organique riche ou complexe, on peut citer les extraits de levure ou les peptones qui sont des produits d'une réaction d'hydrolyse de protéines ou encore les infusions de végétaux comme la pomme de terre ou les matières minérales riches comme par exemple les sels minéraux marins ou autres agents de croissance complexes, n’ayant pas de concentration fixe de chacun de leurs composants.

La composition du milieu de culture peut varier dans le temps avec la consommation des nutriments par les souches de protistes du genre Pythium. Selon le mode de culture choisi, il est possible de compléter le milieu de culture au cours de la culture en l’alimentant avec un ou plusieurs milieux de culture complémentaire qui contiennent tout ou une partie des nutriments présents dans le milieu de culture initial.

Par « source de carbone » on entend plus particulièrement une source de carbone complexe qui n’est pas le C02, en particulier choisie parmi les sucres, les acides organiques ou les polyols, comme du glucose, des dérivés de cellulose, du lactate, de l’amidon, du lactose, du saccharose, de l’acétate, du glycérol, du fructose, du xylose, tout produit ou coproduit riche en un ou plusieurs des composés susmentionnés et leurs mélanges.

Les « PUFA », abréviation de « Poly Unsaturated Fatty Acide » ou Acides Gras Poly Insaturés, sont des acides gras polyinsaturés comprenant au moins 16 atomes de carbones et au moins 2 insaturations, en particulier les acides gras identifiés par les signes co3 et co6, comme l’acide a-linolénique (ALA ou C18:3n3), l’acide g-linolénique (AGA ou (C18 :3n3), l’acide arachidonique (ARA ou C20:4n6), l’acide eicosapentaénoïque (EPA ou C20:5n3), l’acide docosahexaénoïque (DHA ou C22:6n3) ou l’acide acide docosapentanoïque (DPA ou C22:5n6).

Par « lipides riches en PUFA », on entend une huile riche en PUFA comprenant au moins 10 % de PUFA choisis parmi IΈRA et l’ARA par rapport à la masse totale de lipides, préférentiellement au moins 15 %. La masse totale de lipides représente au moins 50% de la biomasse sèche, de manière avantageuse au moins 60%, de manière plus avantageuse au moins 65%,

Les huiles riches en PUFA selon l’invention sont essentiellement sous la forme de triglycérides. Les triglycérides représentent au moins 80% de la masse totale de matière grasse, de manière avantageuse au moins 90%, de manière plus avantageuse au moins 93% de la masse totale de matière grasse. La teneur en triglycérides est par exemple analysée par chromatographie sur couche mince (Jouet et al., 2003). Ces caractéristiques de l’huile selon l’invention concernent tant l’huile telle que présente dans la biomasse de microorganismes que dans l’huile extraite de cette biomasse, qu’elle soit brute ou purifiée.

Une huile dite « brute » est une huile extraite de la biomasse après séparation des lipides de la phase aqueuse et des insolubles, en particulier des protéines. Les méthodes d’extraction des lipides à partir d’une biomasse sont bien connues de l’homme du métier, décrites notamment WO 2020/053375, WO 2001/053512, WO 2011/153246, US 2014/350222, WO 2015/095694, WO 01/53512, WO 2010/096002.

Une huile dite « raffinée » est une huile purifiée obtenue après purification de l’huile brute, notamment raffinée en fonction de sa destination d’usage. Les méthodes de raffinage des compositions lipidiques brutes sont bien connues de l’homme du métier, décrites notamment par Manjula et al. (2006), GB 2 031 290, US 5,310,487 ou US 4,971,660. Par « huile modifiée », on entend une huile brute ou raffinée dont la composition en acides gras a été modifiée. Cette modification peut comprendre une concentration en PU FA, par élimination d’autres acides gras saturés ou insaturés, ou encore une dilution par ajout d’huiles de profil lipidique différent.

Par « composition lipidique », on entend un mélange de lipides comprenant au moins une huile riche en PUFA selon l’invention, extraite de la biomasse, brute, raffinée et/ou modifiée.

Sauf indications contraires, les pourcentages sont donnés en masse. ii. Culture de la biomasse

La culture de protistes du genre Pythium en hétérotrophie sur un milieu de culture comprenant une source de carbone est bien connue de l’homme du métier. Ces cultures peuvent être en mode en mode discontinu dit "batch", en mode semi-continu dit "fed batch" ou en mode continu.

Le procédé selon l’invention est avantageusement mis en œuvre pour une production industrielle de biomasse.

Que ce soit en mode discontinu, semi-continu ou continu, l’étape (a) de culture consiste à produire un moût de fermentation comprenant le jus de fermentation et la biomasse, avec une densité d’au moins 20 g/L de Matière sèche. Avantageusement la culture sera menée de manière à atteindre une densité d’au moins 30 g/L, de manière avantageuse d’au moins 40 g/L.

Une fois la densité de culture recherchée atteinte, la biomasse est récupérée du milieu de culture, séparée du jus de fermentation.

La culture des protistes du genre Pythium est bien connue de l’homme du métier qui saura déterminer les conditions de mise en œuvre de ces cultures en mode aérobie pour obtenir la densité recherchée. On citera en particulier les méthodes de cultures décrites dans Stinson et al. (1991), US2014256973, que l’homme du métier pourra adapter à une culture industrielle.

Les inocula utilisés pour la culture de Pythium peuvent être obtenue par deux méthodes.

La première consiste à la réalisation d’une culture sur gélose favorable à la production de spores, par exemple le milieu PDA (Potato Dextrose Agar) ou Czapek Dox agar. Après un temps de croissance adapté, les spores sont récoltées en milieu liquide selon une méthode connue de l’homme de métier. Par exemple, de l’eau ou un milieu salin adapté est utilisé pour inonder la partie aérienne du mycélium qui s’est développé sur la gélose. Le liquide chargé de spores est ensuite récupéré et les spores dénombrées.

L’inoculation a lieu dans une culture liquide en fiole de type d’Erlenmeyer bafflée contenant un milieu approprié à la croissance comme le PDB (Potato Dextrose Broth) ou Czapek Dox. De 100 à 10000 spores par millilitre de milieu sont ajoutés au milieu de culture. L’inoculation avec un nombre de spores adapté permet de limiter la croissance sous forme de pelotes qui est une caractéristique de la croissance des microorganismes filamenteux.

Une deuxième méthode consiste à la récupération de la biomasse humide d’une culture en fiole puis homogénéisation de cette biomasse. Cette biomasse peut se présenter sous forme de pelotes. L’homogénéisation se pratique dans un dispositif de type blender ou autre homogénéisateur. 5 à 15% de cet homogénat est utilisé pour inoculer une culture en fiole de type d’Erlenmeyer bafflée et dans un milieu adapté à la croissance comme le PDB (Potato Dextrose Broth) ou le Czapek Dox. L’homogénéisation permet de limiter la formation de pelotes lors de la culture ainsi inoculée.

La croissance est réalisée dans un incubateur agitant à une température allant généralement de 20 à 30°C. L’agitation orbitale est paramétrée entre 100 et 200 tours par minutes. Après un temps de croissance de l’ordre de 5 à 15 jours, généralement 7 jours, la biomasse peut être récupérée pour inoculer une autre culture d’un volume plus grand, comme un fermenteur, ou être récoltée ou analysée.

L’invention consiste à éclairer la culture pensant tout ou partie de l’étape de culture (mixotrophie).

Habituellement, la culture de Pythium est réalisée en hétérotrophie, c’est-à-dire sans source de lumière, puisque ce microorganisme n’est pas photosynthétique et n’en a donc pas besoin pour sa croissance. De telles cultures en conditions hétérotrophes sont décrites notamment dans les références citées précédemment et dans WO 2009/143007, par Cheng & al (1999) ou encore par Stinson & al (1991). Les inventeurs ont constaté de manière inattendue que l’éclairage de la culture permettait d’augmenter la teneur en lipides dans les cellules de protistes du genre Pythium par rapport à une culture hétérotrophe décrite dans l’état de la technique.

Cet éclairage consiste à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m²/sec. En ce sens, il s’agit bien d’un éclairage particulier, généralement par des moyens d’éclairage appropriés pour éclairer le milieu de culture et motivé pour favoriser la production de PUFA qui se distingue d’un éventuel éclairage indirect qui proviendrait de la lumière employée pour éclairer le lieux où est mise en œuvre l’étape de culture, tel qu’un laboratoire, qu’elle soit naturelle ou artificielle.

Les longueurs d’ondes adaptées à l’éclairage des cultures de Pythium selon l’invention sont de préférence dans un spectre qui va de l’UV jusqu’au proche infra-rouge via le visible, généralement comprises entre 300 nm et 750 nm. Il peut s’agir d’une lumière dite « blanche » dont le spectre de rayonnement va généralement de 400 à 750 nm, d’un rayonnement Ultra- Violet (UV) dont le spectre de rayonnement est compris entre 300 et 430 nm, d’une lumière dite « bleue » dont le spectre de rayonnement va généralement de 430 à 500 nm, d’une lumière dite « verte » dont le spectre de rayonnement va généralement de 500 à 570 nm, d’une lumière dite « jaune » dont le spectre de rayonnement va généralement de 570 à 590 nm, ou encore de lumière dite « rouge » dont le spectre de rayonnement va généralement de 590 à 750 nm.

L’intensité lumineuse peut être comprise entre 20 et 5000 pmoles/photons/secondes, préférentiellement entre 50 et 3000 pmoles/photons/secondes, plus préférentiellement entre 50 et 2000 pmoles/photons/secondes. En particulier, l’intensité lumineuse peut être d’au moins 200 pmoles/photons/secondes, de 200 à 1000 pmoles/photons/secondes, en particulier d’environ 500 pmoles/photons/secondes.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière dite « blanche » est avantageusement comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m²/sec.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage UV est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m²/sec.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière bleue est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m²/sec.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière verte est avantageusement comprise entre 50 et 500 pmoles de photons/m²/sec.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière jaune est avantageusement comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m²/sec.

L’intensité lumineuse utilisée pour un éclairage en lumière rouge est avantageusement comprise entre 50 et 1000 pmoles de photons/m²/sec.

La composition du spectre lumineux dépendra notamment des lampes employées pour l’éclairage des cultures. Il s’agit en particulier de lampes de type tubes fluorescents ou néons, de type lampe à sodium ou encore de type LED, de préférence de type LED.

Pour un éclairage en lumière dite « blanche » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 400 et 750 nm. Ces sources de type LED de couleur blanche ont généralement un pic d’émission principal dans le bleu vers 470 nm et une émission secondaire plus diffuse entre 500 et 700 nm.

Pour un éclairage en lumière dite « UV » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 380 et 400 nm.

Pour un éclairage en lumière dite « bleue » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 450 et 500 nm. Pour un éclairage en lumière dite « verte » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 500 et 570 nm.

Pour un éclairage en lumière dite « jaune » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission est compris entre 570 et 590 nm.

Pour un éclairage en lumière dite « rouge » on emploiera avantageusement des lampes de type LED, dont le spectre d’émission compris entre 590 et 750 nm.

L’éclairage peut être mise en œuvre pendant toute la durée de l’étape (a) de culture, ou bien partiellement. L’homme du métier saura déterminer quand débuter l’éclairage et quand l’arrêter en fin de culture avant l’étape (b) de récupération de la biomasse.

La durée de l’éclairage peut aller de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture, préférentiellement entre 30 et 100%, plus préférentiellement entre 50 et 100%.

Un éclairage partiel peut être apporté durant une phase propice à l’accumulation de lipides, généralement à partir du milieu ou de la fin de la phase exponentielle de croissance.

L’éclairage pourra être continu, ou discontinu avec une alternance de périodes d’éclairage et de périodes d’obscurité. Les phases successives d’éclairement peuvent être comprises entre 1 secondes et 10 minutes, par exemple entre 10 secondes et 2 minutes, ou encore entre 20 secondes et 1 minute. Elles sont espacées par des phases d’obscurité d’une durée égale ou différente à la durée de chaque phase d’éclairage.

Les dispositifs industriels de culture en mixotrophie permettant de varier les éclairages, tant en longueur d’onde, qu’en intensité et en durée, sont par exemple décrits dans les demandes de brevets WO 2009/069967, US 2010/005711, WO 2014/174182 ou WO 2019/034792.

Lorsque l’intensité lumineuse à délivrer est choisie à une valeur élevée, notamment au- delà de 500 pmoles de photons/m²/sec, la consommation électrique et le dégagement de chaleur peuvent être limités en apportant la lumière sous forme de flash à haute fréquence, généralement comprise entre 0,5 et 150 kHz, avantageusement entre 1 et 100 kHz, ce qui se traduit par une alternance de phases éclairées et de phase noires dans une période comprise entre 0,001 et 0,00001 secondes. La durée de la phase éclairée peut être de 1 à 90% de chaque période, selon les diminutions de consommation électrique et de dégagement de chaleur souhaitées. L’utilisation des équipements électriques et le paramétrage de ces derniers sont connus de l’homme de métier.

Selon un mode préféré de l’invention, l’éclairage sera assuré par une source lumineuse de type LED délivrant un éclairage rouge dont le spectre d’émission sera compris entre 600 et 750 nm et dont la durée sera comprise entre 50 et 100% de l’étape de culture iii. Récupération de la biomasse

L’étape (b) de récupération de la biomasse du milieu de culture comprend la séparation de la biomasse du jus de fermentation. Les méthodes de récupération sont bien connues de l’homme du métier, en particulier par centrifugation (centrifugeuse à assiettes ou sedicanteur), ou par filtration (filtre plaque, filtre presse, filtration tangentielle céramique ou organique).

La biomasse brute récupérée peut être lavée pour éliminer certains solubles (par exemple par filtration pour éliminer le milieu de fermentation et lavage à l’eau).

La biomasse brute ou lavée peut aussi être séchée par des méthodes usuelles, notamment par atomisation ou lyophilisée.

Elle peut également être traitée par l’ajout de composants utiles à sa conservation et son stockage, comme par exemple des agents antioxydants, avant ou après le séchage, ou des sucres pour éviter un réchauffement spontané de la biomasse.

L’invention concerne aussi une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, la teneur en lipides étant d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS), de préférence d’au moins 50% MS, plus préférentiellement, d’au moins 55% MS, en particulier au moins 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 ou 65 % MS, jusqu’à 75% MS.

Les PUFA sont essentiellement constitués d’un mélange d’ARA et d’EPA. Le rapport pondéral ARA/EPA est avantageusement de 0,5 à 1, plus particulièrement de 0,6 à 0,9, en particulier d’environ 0,7.

La teneur en PUFA (ARA + EPA) est d’au moins 10% de la somme des acides gras, avantageusement d’au moins 15%, en particulier de 15 à 40 %. Selon un mode particulier, la teneur totale en ARA et en EPA est d’au moins 20%.

La teneur en ARA est d’au moins 5%, de préférence d’au moins 6%, plus préférentiellement de 7,5% ou plus de 7,5%, en particulier au moins7,7%, au moins 8% ou au moins 9%.

La teneur en EPA est de préférence d’au moins 12% de de la somme des acides gras, plus préférentiellement d’au moins 13 %, en particulier au moins 14%, au moins 15%, au moins 16% ou au moins 17%.

La teneur en acides gras dans les huiles selon l’invention, brutes ou raffinées, est avantageusement la suivante acide myristique (C14 :0) 5% à 10% acide palmitique (C16 :0) 10% à 20% acide palmitoléique (C16 :1 n-7) 6% à 10% acide oléique (C18 :1 n-9c) 15% à 25% acide linoléique (C18 :2 n-6c) 10% à 25% acide arachidonique (C20 :4 n-6) 5% à 15% acide eicosapentaémoïque (C20 :5 n-3) 7% à 20%

Plus avantageusement, la teneur en acides gras dans les huiles selon l’invention, brutes ou rafinées, est la suivante acide myristique (C14 :0) 6% à 7% acide palmitique (C16 :0) 11% à 16% acide palmitoléique (C16 :1 n-7) 6% à 8,5% acide oléique (C18 :1 n-9c) 16% à 25% acide linoléique (C18 :2 n-6c) 13% à 22% acide arachidonique (C20 :4 n-6) 6% à 10% acide eicosapentaémoïque (C20 :5 n-3) 10% à 20%

En particulier, la teneur des principaux acides gras est de l’ordre de 9% pour l’acide myristique (C14 :0) ; 12% pour l’acide palmitique (C16 :0) ; 7% pour l’acide palmitoléique (C16 :1 n-7) ; 17% pour l’acide oléique (C18 :1 n-9c) ; 20% pour l’acide linoléique (C18 :2 n- 6c) ; 9% pour l’acide arachidonique ou ARA (C20 :4 n-6) et 18% pour l’acide eicosapentaémoïque ou EPA (C20 :5 n-3).

Selon un mode particulier, la biomasse selon l’invention a été « stabilisée » pour sa conservation, son stockage et/ou son transport.

Il peut s’agir d’ajout de composants stabilisants que l’on ne trouve pas associées aux cellules de protistes dans la nature, comme des sucres (WO 2020/036814), des antioxydants comme du tocophérol, de l’extrait de romarin ou de l’acide ascorbique.

Selon un mode particulier, la biomasse n’est plus apte à se développer sur un milieu de culture, les fonctions vitales des cellules étant altérées. C’est en particulier le cas pour une biomasse dégradée, en particulier une biomasse dégradée et sèche iv. Extraction des lipides

Plusieurs méthodes industrielles d’extraction de lipides riches en PUFA à partir d’une biomasse de microalgues cultivées pour produire lesdites huiles sont décrites dans la littérature et connues de l’homme du métier. L’extraction des lipides comprend la lyse des cellules de biomasse pour libérer les huiles riches en PUFA qu’elles contiennent, puis la séparation des lipides des fractions solides et des fractions solubles dans l’eau.

La lyse peut être mécanique (pressage ou broyage) ou enzymatique avec des protéases ou des cellulases.

Les méthodes de lyse mécaniques sont bien connues, notamment par broyeur à billes, mélangeur-disperseur, homogénéisateur haute pression, broyeur à broches ou broyeur à impact, ultra-sons, champs électrique pulsés. Comme dispositifs pour la mise en œuvre de ces méthodes de lyse mécanique, on citera notamment (nom du constructeur entre parenthèses) pour le broyeur à billes : Discus-1000 (Netzsch); ECM-AP60 (WAB) ; pour l’homogénéisateur haute pression: Ariete (GEA) ; pour le mélangeur-disperseur : 700-X (Silverson), pour le broyeur à broche : Contraplex (Hosakawa); pour le broyeur à impact : Condux (Netzsch).

On connaît les enzymes susceptibles d’être employées, notamment décrites dans WO2015/095688, WO2011/153246, US6750048 et WO2015/095694, en particulier des proteases ou des cellulases telles que les enzymes commercialisées par la société Novozyme sous les appellations Alcalase 2,5 L, Alcalase 2,4 L, Alcalase 3,0 T, Novozym 37071 , Flavourzyme 1000 L, Novozym FM 2,4 L, Protamex, Viscozyme. Les conditions de mise en œuvre sont celles préconisées par le fournisseur, la température étant celle préconisée pour une activité optimale des enzymes, d’au moins 50°C et jusqu’à 70 °C, de préférence d’environ 65°C. Avantageusement la lyse enzymatique est mise en œuvre sous une atmosphère pauvre en oxygène. Généralement, la concentration en oxygène est inférieure à 1% en masse.

On citera notamment les méthodes de lyse décrites dans la demande WO 2020/053375, WO 2001/053512.

L’extraction des huiles à partir de la biomasse lysée peut se faire par différentes méthodes connues, comme l’ajout de sodium sous forme de sulfate de sodium ou bien de chlorure de sodium (WO 2011/153246), l’extraction par solvants (US 2014/350222) et/ou des températures élevées durant plusieurs heures (WO 2015/095694), ou encore par de nombreuses autres méthodes décrites dans la littérature (WO 2019/219396, WO 2019/219443, WO 2019/121752, WO 2018/122057, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2018/013670, WO 2018/011286, WO 2018/011275, WO 2015/095696, WO 2011/153246, WO 2002/010423).

De préférence, l’extraction des huiles à partir de biomasse lysée est mise en œuvre par séparation mécanique, également bien connue de l’homme du métier, comme une séparation gravitaire, notamment par centrifugation comme décrite dans la demande de brevet WO 01/53512. On peut aussi employer une séparation continue, en particulier par séparateur centrifuge à assiettes. De tels séparateurs sont connus pour extraire en continu des huiles de milieux complexes comprenant des résidus solides et de l’eau, tels que décrits dans la demande de brevet WO 2010/096002, notamment commercialisés par les sociétés Alfa Laval, Flottweg ou GEA Westfalia, notamment. Cette étape de séparation continue est préférée dans le procédé employé pour obtenir l’huile selon l’invention.

Dans certains cas, les étapes de lyse et d’extraction sont simultanées, sous une action mécanique, généralement par une ou plusieurs centrifugations (WO 2019/032880) notamment avec les dispositifs de centrifugation décrit plus haut.

L’extraction de l’huile à partir de la biomasse peut favoriser l’extraction de ces PU FA par rapport aux acides gras saturés de plus bas poids moléculaire. Avantageusement, cette concentration ne modifie pas de manière substantielle les propriétés intrinsèques de l’huile contenue dans la biomasse, notamment la teneur en triglycérides. Préférentiellement, l’huile selon l’invention est une huile qui n’a pas subi de modifications substantielles de sa teneur en acides gras par l’ajout de PU FA, par exemple sous forme d’esters, par concentration et/ou par l’élimination d’acides gras saturés comme l’acide palmitique.

L’huile obtenue est généralement une huile appelée huile brute, qui peut être employée telle quelle ou faire l’objet d’un raffinage, notamment pour faciliter sa conservation, en évitant qu’elle ne rancisse, ou pour modifier sa couleur ou son odeur de manière à la rendre plus acceptable pour un consommateur. Ces étapes de purification et raffinage sont bien connues de l’homme du métier, décrites dans des demandes de brevets (WO 2002/010322, WO 2017/035403), notamment des étapes de dégommage, de neutralisation des acides gras libres, de décoloration et de désodorisation. Elles permettent d’éliminer (tout ou bien en partie) les phospholipides, les pigments, les volatiles et les acides gras libres. De fait, ces méthodes ne viennent pas modifier substantiellement la teneur relative en acides gras, saturés ou insaturés, ni la teneur en triglycérides de l’huile raffinée obtenue par rapport à l’huile purifiée.

Le procédé selon l’invention peut aussi comprendre une étape de modification des huiles obtenues précédemment et décrites plus haut, qu’elles soient brutes, purifiées ou raffinées.

Certains procédés de l’état de la technique présentent une étape dite de « winterisation » mise en œuvre sur les huiles brutes ou purifiées, notamment pour éliminer les acides gras saturés, avec pour effet d’augmenter la teneur en PUFA (WO 02/10322). Les huiles extraites selon l’invention, brutes ou raffinées, ne nécessitent a priori pas de « winterization » pour être exploitées. Toutefois, l’homme du métier pourra choisir d’ajouter une telle étape de « winteriation » s’il y trouve un quelconque avantage commercial pour son produit final.

Certains procédés comprennent une modification des huiles récupérées de la biomasse, par exemple pour en modifier la composition en certains acides gras saturés ou insaturés, notamment pour favoriser la concentration en PUFA. De telles méthodes connues de l’homme du métier comprennent notamment des traitements enzymatiques par des enzymes telles que les lipases (CN 105349587, WO 2019/219904, WO 2019/219903).

D’autres composants peuvent être ajoutés aux huiles brutes, purifiées ou raffinées selon l’invention, comme des agents antioxydants, notamment ceux décrits dans les demandes WO 2019/185942, WO 2019/185940, WO 2019/185939, WO 2019/185910, WO 2019/185894, WO 2019/185889 et WO 2019/185888.

Les huiles brutes ou raffinées, ou les huiles de composition modifiée peuvent aussi être diluées pour leur usage ultérieur. Les huiles employées pour diluer l’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention sont généralement et de préférence des huiles végétales adaptées à une consommation alimentaire humaine ou animale. On citera en particulier les huiles de tournesol, de colza, de soja, de noix, de sésame, de chanvre, de noisette, d’argan, d’olive, de lin, ou de toute autre huile adaptée à un usage alimentaire. L’huile ajoutée peut aussi être une huile comprenant d’autres PUFA, en particulier du DHA, en particulier d’autres huiles d’origine microbienne ou encore des huiles de poisson.

Le procédé selon l’invention peut comprendre en outre une telle étape de dilution d’une huile brute ou raffinée obtenue précédemment.

L’invention concerne aussi une huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute ou raffinée ou susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’invention.

La composition de l’huile selon l’invention, notamment la teneur en PUFA et en autres acides gras est donnée plus haut pour la composition de l’huile contenue dans la biomasse v. Compositions

L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture et (d) la formulation d’une composition par addition de la biomasse récupérée en (b) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage telle que définie auparavant.

L’invention concerne aussi un procédé de préparation d’une composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire comprenant une composiiton lipidique riche en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée et (d) la formulation d’une composition par addition de la composition lipidique extraite en (c) à des composants usuels des compositions pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, l’étape (a) de culture comprenant une phase d’éclairage telle que définie auparavant.

L’invention concerne aussi une composition qui comprend une biomasse ou une huile riche en PUFA susceptibles d’être obtenues par le procédé selon l’invention telles que décrites plus haut.

Une composition selon l'invention peut comprendre un ou plusieurs excipients. Un excipient est un composant, ou mélange de composants, qui est utilisé dans la présente invention pour donner des caractéristiques souhaitables à la composition pour sa conservation et son usage, y compris des aliments et des compositions pharmaceutiques, cosmétiques et industrielles. Un excipient peut être décrit comme un excipient "pharmaceutiquement acceptable" lorsqu'il est ajouté à une composition pharmaceutique dont les propriétés sont connues de la pharmacopée pour être employés au contact des tissus humains et animaux sans toxicité excessive, irritation, réaction allergique ou autres complications. Différents excipients peuvent être utilisés comme une base organique ou minérale, un acide organique ou minéral, un tampon de pH, un stabilisant, un antioxydant, un agent d'adhésion, un agent de séparation, un agent de revêtement, un composant de phase extérieure, un composant à libération contrôlée, un agent tensioactif, un humectant, une charge, un émollient ou des combinaisons de ceux-ci.

Selon leur destination, les compositions selon l’invention sont en particulier des compositions pharmaceutiques, cosmétiques, neutraceutiques ou des aliments.

Les aliments sont destinés tant aux humains qu’aux animaux et comprennent des compositions solides, pâteuses ou liquides. On citera en particulier les aliments courants, les produits liquides, y compris laits, boissons, boissons thérapeutiques et boissons nutritionnelles, les aliments fonctionnels, les suppléments, les neutraceutiques, les préparations pour nourrissons, y compris les préparations pour nourrissons prématurés, les aliments pour femmes enceintes ou allaitantes, les aliments pour adultes, les aliments gériatriques et aliments pour animaux.

L’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, qu’elle soit brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient peut être utilisée directement comme ou ajouté en tant qu'additif dans une huile, une pâte à tartiner, un autre ingrédient gras, une boisson, une sauce à base de soya ou à base de soja, des produits laitiers (lait, yaourt, fromage, crème glacée), des produits de boulangerie, des produits nutritionnels, par exemple sous forme de complément nutritionnel (sous forme de gélule ou de comprimé), des suppléments vitaminiques, des compléments alimentaires, des poudres à diluer pour boissons, comme des boissons énergétiques ou des poudres de laits pour des formulations infantiles, des produits alimentaires en poudre fini ou semi-fini, etc., selon les usages connus de l’homme du métier.

Les aliments pour animaux sont également connus de l’homme du métier. Ils sont en particulier destinés aux animaux d’élevage, comme les vaches, cochons, poulets, moutons, chèvres ou dans la pisciculture pour les crustacés ou les poissons d’élevage.

Les compositions pharmaceutiques comprenant une huile riche en PUFA sont également connues de l’homme du métier, l’huile étant employée seule ou en combinaison avec d’autres médicaments.

L’huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute ou raffinée ou la biomasse qui la contient, peut être formulée sous la forme de compositions unidoses, notamment sous forme de comprimés, de gélules, de capsules, de poudres, de granulés, adaptés à une administration per os.

L’invention concerne également l’utilisation d’une huile riche en PUFA obtenue par le procédé selon l’invention, brute, raffinée ou diluée, pour l’alimentation humaine ou animale, en particulier pour l’alimentation des nouveaux nés, des enfants, ou des femmes enceintes ou allaitantes.

De tels usages sont bien connus de l’homme du métier, notamment décrits dans la demande de brevet WO 2010/107415 et sur le site Web de la société DSM (https://www.dsm.com/markets/foodandbeverages/en_US/products/nutritional-lipids/life- dha.html)

EXEMPLES

Exemple 1

La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 30346 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre de 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C et avec une agitation magnétique par un barreau aimanté à 150 tours par minute. La lumière est apportée par le dessous via un dispositif comprenant plusieurs LED de nature identique et ce en continu pendant toute la durée de l’étape de culture. Chacun des postes de culture par agitation magnétique peut être équipé avec un dispositif d’éclairage de nature différente. L’intensité de l’éclairage est fixée à 200 pmoles de photons/m²/sec. Un témoin de croissance en hétérotrophie est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales hormis la lumière qui est absente. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.

Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 1. Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras

Selon la lumière employée, on observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport à une culture en hétérotrophie (sans lumière) de l’état de la technique une production en ARA par rapport à la matière sèche multipliée par un facteur d’au moins 1,5, en moyenne d’un facteur d’environ 2,4, jusqu’à un facteur d’environ 3,7.

La production en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 2,5, en moyenne d’un facteur d’environ 3,6, jusqu’à un facteur d’environ 4,7.

La production totale en ARA et en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 2,1 , en moyenne d’un facteur d’environ 3,1, jusqu’à un facteur d’environ 4,2.

Exemple 2

La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 100109 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre d’environ 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C et avec une agitation magnétique par un barreau aimanté à 150 tours par minute. La lumière est apportée par le dessous via un dispositif comprenant plusieurs LED ayant un pic d’émission à 660 nm et ce en continu pendant toute la durée de l’étape de culture. L’intensité de l’éclairage est fixé à 200, 500 ou 2000 pmoles de photons/m²/sec. Un témoin de croissance en hétérotrophie est réalisé dans les mêmes conditions expérimentales hormis la lumière qui est absente. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée au bout des 7 jours par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.

Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 2.

Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras

Selon l’intensité lumineuse, on observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport à une culture en hétérotrophie (sans lumière) de l’état de la technique une production en ARA par rapport à la matière sèche multipliée par un facteur d’au moins 3,4, en moyenne d’un facteur d’environ 3,9, jusqu’à un facteur d’environ 4.

La production en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 3,3, en moyenne d’un facteur d’environ 3,7, jusqu’à un facteur d’environ 4,3.

La production totale en ARA et en EPA par rapport à la matière sèche est multipliée par un facteur d’au moins 3,3, en moyenne d’un facteur d’environ 3,8, jusqu’à un facteur d’environ 4,2.

Exemple 3

La souche Pythium irregulare provenant de la collection NBRC n° 100109 est cultivée en fiole d’Erlenmeyer bafflée de 250 mL dans 50 mL du milieu de culture PDB (Potato Dextrose Broth) composé de 200 g d’infusion de pomme de terre et 20 g de dextrose. La biomasse humide est récupérée par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes puis homogénéisée au vortex en présence de billes de verre d’un diamètre d’environ 1 mm et une quantité représentant un volume de 1 à 2 mL. 5 mL de cet homogénat sont utilisés pour inoculer une fiole de 250 mL contenant 45 mL de milieu PDB. Les fioles sont incubées à une température de 26°C dans un incubateur dont l’agitation est réglée à 140 tours par minute. La lumière est apportée par une série de tubes fluorescent de type lumière du jour à 6000°K. L’intensité de l’éclairage est de l’ordre de 50 pmoles de photons/m²/sec. Les cultures sont incubées dans ces conditions pendant 7 jours. La biomasse est récoltée au bout des 7 jours par centrifugation à 10000 g pendant 5 minutes et le surnageant écarté. Après lavage de la biomasse à l’eau distillée, cette dernière est lyophilisée. Le contenu lipidique de la biomasse est analysé par GC-FID après une étape de transestérification sur un aliquot d’environ 2 mg de cette biomasse lyophilisée.

Les résultats de l’analyse lipidique sont présentés dans le Tableau 3. Les pourcentages en acides gras sont donnés par rapport à la masse totale d’acide gras.

On observe avec la méthode de culture selon l’invention par rapport aux cultures en hétérotrophie (sans lumière) généralement constatées une nette augmentation de la teneur en lipide dans la biomasse sèche. On observe, par rapport à la matière sèche, une augmentation de plus de 60% des PUFA en comparaison avec les valeurs généralement constatées en culture hétérotrophe.

REFERENCES

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Claims

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant (a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone, et (b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, caractérisé en ce que l’étape de culture comprend une phase d’éclairage, ladite phase consistant à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m²/sec.

2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les protistes du genre Pythium sont des protistes de l’espèce Pythium irregulare.

3. Procédé selon l’une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre pendant tout ou partie de l’étape (a) de culture.

4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.

5. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 50 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.

6. Procédé selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l’intensité d’éclairage est comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m²/sec.

7. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière blanche.

8. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière UV.

9. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière bleue.

10. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière verte.

11. Procédé selon l’une des revendication 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière jaune.

12. Procédé selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière rouge.

13. Procédé de préparation de PUFA à partir d’une biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA, ledit procédé comprenant

(a) la culture de protistes du genre Pythium sur un milieu de culture comprenant une source de carbone,

(b) la récupération de la biomasse du milieu de culture, et (c) l’extraction des lipides riches en PUFA de la biomasse récupérée en (b), caractérisé en ce que l’étape a) de culture comprend une phase d’éclairage, ladite phase consistant à éclairer de manière contrôlée les protistes dans le milieu de culture à une intensité d’éclairage comprise entre 50 et 2000 pmoles de photons/m²/sec.

14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que les protistes du genre Pythium sont des protistes de l’espèce Pythium irregulare.

15. Procédé selon l’une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre pendant tout ou partie de l’étape (a) de culture.

16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 10 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.

17. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que la durée de l’éclairage va de 50 à 100% du temps de mise en œuvre de l’étape (a) de culture.

18. Procédé selon l’une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que l’intensité d’éclairage est comprise entre 100 et 1000 pmoles de photons/m²/sec.

19. Procédé selon l’une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière blanche.

20. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière UV.

21. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière bleue.

22. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière verte.

23. Procédé selon l’une des revendication 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière jaune.

24. Procédé selon l’une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que la phase d’éclairage est mise en œuvre par un éclairage en lumière rouge.

25. Biomasse de protistes du genre Pythium comprenant des lipides riches en PUFA susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que la teneur en lipides est d’au moins 30% par rapport à la matière sèche (% MS) et au moins 15 % de PUFA choisis parmi IΈRA et l’ARA.

26. Huile susceptible d’être obtenue par le procédé selon l’une des revendications 13 à 24, caractérisé en ce que la teneur en PUFA est d’au moins 15% choisis parmi IΈRA et l’ARA et dont la teneur en triglycérides est supérieure à 90%.

27. Huile selon la revendication 26, caractérisée en ce qu’elle est choisie parmi les huiles brutes, raffinées et modifiées.

28. Composition pharmaceutique, cosmétique, neutraceutique ou alimentaire, caractérisée en ce qu’elle comprend une biomasse selon la revendication 25 ou une huile selon l’une des revendications 26 ou 27.