EP3119872A1 - Procédé de perméabilisation thermique d'une biomasse de microalgues - Google Patents

Procédé de perméabilisation thermique d'une biomasse de microalgues

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EP3119872A1
EP3119872A1 EP15718966.3A EP15718966A EP3119872A1 EP 3119872 A1 EP3119872 A1 EP 3119872A1 EP 15718966 A EP15718966 A EP 15718966A EP 3119872 A1 EP3119872 A1 EP 3119872A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
temperature
biomass
microalgae
chlorella
heat treatment
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP15718966.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Damien Passe
Samuel PATINIER
Marilyne GUILLEMANT
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Corbion Biotech Inc
Original Assignee
Roquette Freres SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Roquette Freres SA filed Critical Roquette Freres SA
Publication of EP3119872A1 publication Critical patent/EP3119872A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms
    • C12N1/066—Lysis of microorganisms by physical processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/12—Unicellular algae; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H3/00—Compounds containing only hydrogen atoms and saccharide radicals having only carbon, hydrogen, and oxygen atoms
    • C07H3/06—Oligosaccharides, i.e. having three to five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/06—Lysis of microorganisms

Definitions

  • the present invention relates to a method for thermal permeabilization of a biomass of microalgae, this treatment making it possible to release the soluble intracellular content thereof, in particular the peptides and polypeptides.
  • This method of thermal permeabilization is not accompanied by cell disintegration, which also allows the easy separation of the intracellular content thus released from the residual biomass, by any solid-liquid separation method known in itself from man of the art, for example frontal or tangential filtration, centrifugation and / or flocculation.
  • the method of the invention makes it possible to conserve the lipid fraction of interest in the residual biomass.
  • the present invention finally relates to the recovery and fractionation of the intracellular content of microalgae in aqueous solution, intracellular content composed of soluble peptides and polypeptides, pigments, free fatty acids, oligo- and polysaccharides ... It is well known to the human Chlorella is a potential source of food because it is rich in protein and other essential nutrients.
  • Chlorella biomass oil fraction which consists mainly of monounsaturated oils, provides nutritional and health benefits over saturated, hydrogenated and polyunsaturated oils often found in conventional food products.
  • the protein fraction can be valued as a functional agent in the food, cosmetics and even pharmaceutical industries, for its foaming, emulsifying properties.
  • Chlorellae are therefore conventionally used for human or animal nutrition, either in the form of whole biomass or in the form of flour, obtained by drying the biomass of chlorella whose cell wall has been broken by mechanical means.
  • Microalgae flour also provides other benefits, such as micronutrients, dietary fiber (soluble and insoluble carbohydrates), phospholipids, glycoproteins, phytosterols, tocopherols, tocotrienols, and selenium.
  • the biomass is concentrated, or harvested, from the culture medium (culture carried out by light autotrophy in photobioreactors, or in heterotrophy, in the dark in the presence of a carbon source assimilated by the Chlorella).
  • the biomass At the time of harvesting the biomass of microalgae from the fermentation medium, the biomass comprises intact cells essentially suspended in an aqueous culture medium.
  • a solid-liquid separation step is then carried out, by frontal and / or tangential filtration, by centrifugation, or by any other means known to those skilled in the art.
  • microalgae biomass can be directly processed in order to produce vacuum-packed cakes, microalgae flakes, microalgae homogenates, intact microalgae powder, ground microalgae flour, or coconut oil. microalgae.
  • microalgae biomass is also dried in order to facilitate the subsequent treatment or use of the biomass in its various applications, particularly food applications.
  • microalgae have been used mainly for the production of high value-added products, but at low volume.
  • an efficient cell disruption process must maximize not only the yield but also the quality of the extracted products. In other words, this optimized disintegration process must avoid chemical contamination or degradation of the targeted products.
  • microalgae disintegration procedures have been studied, for example chemical, mechanical, enzymatic or even electrical (pulsed field).
  • microalgae cells have very strong membrane walls, which makes the cell disintegration and the extraction of the products of interest very difficult and very expensive in energy.
  • a pressure disruptor can be used to pump a suspension containing the cells through a restricted orifice to lyse the cells.
  • High pressure minimum of 1500 bar
  • the breaking of the cells can be achieved by three different mechanisms: encroachment on the valve, high shear of the liquid in the orifice, and sudden pressure drop at the outlet, causing an explosion of the cell.
  • the method releases intracellular molecules, mixed with cell debris.
  • a NIRO Homogenizer Niro homogenizer (GEA NIRO SOAVI - or any other high pressure homogenizer) can be used to treat cells with a size predominantly between 0.2 and 5 microns. This treatment of algal biomass under high pressure generally lyses more than 90% of the cells and reduces the size to less than 5 microns.
  • a ball mill may also be used.
  • the cells are agitated in suspension with small spherical particles.
  • the breaking of the cells is caused by shear forces, grinding between the balls, and collisions with beads.
  • the description of a suitable ball mill is for example made in US Patent 5,330,913. These beads break the cells to release the cell contents.
  • a suspension of particles of smaller size than the original cells is then obtained in the form of an "oil-in-water" emulsion. This emulsion is then atomized and the water is removed, leaving a dry powder containing however a heterogeneous mixture composed of cellular debris, interstitial soluble compounds and oil.
  • the difficulty to solve in the use of these cell disruption technologies is the isolation of the only intracellular content (excluding membrane debris and fat) and the preservation, in particular, of the quality of the protein charge.
  • the energy used to break the rigidity of the microalga can indeed cause irreversible degradation or denaturation of the intracellular molecules of interest.
  • This rupture of the membrane then facilitates the release of the cellular contents and, when using a complementary solvent extraction technique, also facilitates the penetration of the solvent into the cell.
  • the Applicant Company has found that this need could be satisfied by a process of thermal permeabilization of the microalgae cells.
  • the recovery of the molecules can be easily achieved by any solid-liquid separation technology known to those skilled in the art, since the heat treatment developed by the applicant company does not lead to the disintegration of the cell wall. Finally, the recovery of this soluble fraction opens the fractionation of its content, for example by membrane separation techniques known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a method for thermal permeabilization of the microalgae biomass of the Chlorella genus so as to recover soluble fractions enriched in particular peptides and polypeptides and oligosaccharides.
  • This process comprises the following steps:
  • stepwise heat treatment at a temperature of 60 to 130 ° C, preferably 60 to 90 ° C, for 1 to 5 minutes,
  • This method preferably comprises the following steps:
  • microalgae of the genus Chlorella are selected from the group consisting of Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana and Chlorella protothecoides, and are more particularly Chlorella protothecoides.
  • the strain is Chlorella protothecoides (strain UTEX 250 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA).
  • the strain is Chlorella sorokiniana (strain UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA). Cultivation in heterotrophic conditions and in the absence of light conventionally leads to the production of a biomass of chlorella having a protein content (evaluated by measurement of the nitrogen content N x 6.25) of 45 to 70% by weight. dry cell weight.
  • this culture is carried out in two stages:
  • the biomass is then collected by solid-liquid separation, by frontal or tangential filtration, by centrifugation, or by any means known to those skilled in the art.
  • the Applicant Company then recommends washing the biomass so as to eliminate the interstitial soluble compounds by a succession of concentration (by centrifugation) / dilution of the biomass.
  • interstitial soluble compounds means all the soluble organic contaminants of the fermentation medium, for example the water-soluble compounds such as salts, residual glucose, oligosaccharides of degree of polymerization (or DP) 2 or 3, the peptides ...
  • This biomass thus purified of its interstitial solubles is then adjusted preferably to a solids content of between 5 and 35% by weight, preferably to a solids content of between 10 and 20% with deionized water.
  • the heat treatment is then carried out in stages at a temperature of between 60 ° and 130 ° C., preferably 60 ° and 90 ° C., for 1 to 5 minutes.
  • This treatment can include 2 to 6 temperature steps. For example, it may comprise several incremental temperature steps and then, optionally, several decreasing temperature steps.
  • the temperature steps may be 10 to 40 ° C, for example about 10, 20, 30 or 40 ° C.
  • a first step may allow the biomass to be brought to a temperature of about 60-70 ° C. By “about” is meant + or - 10%, preferably + or - 5%.
  • Intermediate bearings can be made between 60 ° C and the maximum applied temperature, for example between about 90 and 130 ° C.
  • Each step can last between about 10 seconds and 4 minutes, preferably between 30 seconds and 3 minutes.
  • the treatment may comprise a first stage allowing the biomass to be brought to a temperature of approximately 60-70 ° C., one or more bearings allowing achieve a maximum applied temperature of about 90 to 130 ° C, and optionally one or more bearings to reduce the temperature.
  • the treatment can be carried out in three phases: raising the temperature of the ambient temperature to 60 ° C. in 30 seconds; - temperature rise from 60 ° to 90 ° C for another 30 seconds;
  • the method comprises the following steps: raising the temperature from 28 ° C. to 60 ° C. for 30 seconds,
  • This treatment makes it possible to allow the intracellular components to diffuse into the reaction medium.
  • the Applicant Company has thus found that the heat treatment, performed under these operating conditions, thus acts as a membrane embrittlement process which allows the spontaneous release of the soluble components of the intracellular compartment.
  • organic substances such as carbohydrates (predominantly DP1 and DP2), peptides and polypeptides are drained out of the cell.
  • the process according to the invention therefore does not lead to the formation of an emulsion, but to an aqueous suspension.
  • a lag time may be necessary to allow sufficient diffusion after the heat treatment which permeabilizes the membrane.
  • reaction time between 30 minutes and 3 hours additional can be implemented to optimize the diffusion of soluble compounds of the cell compartment.
  • the residual biomass is then removed by a solid-liquid separation technique by frontal or tangential filtration, by flocculation, by centrifugation, or by any other means known to those skilled in the art, which makes it possible to easily recover the freed soluble fraction. microalgae cells.
  • This soluble fraction consists essentially of proteins (50 - 80% w / w) and carbohydrates (5 - 15% w / w).
  • the conventional processes for recovering soluble proteins generally rely on a step of precipitating said proteins with trichloroacetic acid (10% w / v) or with ammonium sulphate.
  • the method according to the invention makes it possible, on the contrary, to release native, intact peptides and polypeptides, all of whose functionalities can still be expressed.
  • the Applicant Company found that the size of the soluble peptides and polypeptides released varied in proportion to the processing temperature used. It is also considered that the processing time can have an impact.
  • the applicant company recommends proceeding in two stages:
  • compositions enriched in soluble proteins and in oligosaccharides from soluble fractions (freed from heat-treated microalgae) filtered on a membrane system chosen from the group consisting of microfiltration, ultrafiltration, nanofiltration and diafiltration, taken alone or in combination,
  • compositions subjecting said compositions to additional membrane fractionation treatments of reverse osmosis type in order to separate peptides and polypeptides on the one hand, and oligosaccharides on the other hand.
  • additional membrane fractionation treatments of reverse osmosis type in order to separate peptides and polypeptides on the one hand, and oligosaccharides on the other hand.
  • the strain used is Chlorella protothecoides UTEX 250
  • composition of the medium (in g / L):
  • the incubation takes place under the following conditions: duration: 72 h; temperature: 28 ° C; agitation: 1 10 rpm (Infors Multitron Incubator).
  • the middle is the following: Table 2.
  • the initial volume (Vi) of the fermenter is adjusted to 17 L after seeding. It is brought to 20 to 25 L in final.
  • the driving parameters of fermentation are as follows:
  • a glucose supply in the form of a concentrated solution at approximately 800 g / l is carried out so as to maintain the glucose content between 0 and 20 g / l in the fermenter.
  • the biomass obtained according to Example 1 is:
  • the biomass thus obtained is separated from the soluble fraction by centrifugal separation. Said soluble fraction is then microfiltered on a 0.14 m ceramic membrane at 60 ° C.
  • the transmembrane pressure is set at a value between 0.2 and 0.6 bar and the microfiltration is conducted to obtain a volume concentration factor of 2.5 (100 liters of this microfiltered soluble fraction thus generate 40 liters of retentate "R1 And 60 liters of permeate "P1").
  • the microfiltration permeate "P1" obtained at the end of Example 2 at 4% of dry matter is in particular ultrafiltered on a membrane with a cut-off threshold of 10 kDa, so as to obtain:
  • a retentate "R2" at 10% dry matter containing peptides having a molecular weight greater than or equal to 5 kDa and oligosaccharides of high DP;
  • P2 permeate at 1% dry matter, containing peptides having a molecular weight of less than 5 kDa and oligosaccharides DP less than or equal to 2.
  • This "P2" permeate can then be filtered in particular on a reverse osmosis membrane (having a NaCl rejection rate of 93%), so as to obtain:

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Abstract

L'invention est relative à un procédé de perméabilisation thermique de la biomasse de microalgues du genre Chlorella de manière à en récupérer les fractions solubles enrichies notamment en protéines et en oligosaccharides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : la fourniture d'une biomasse de microalgues; le traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60 à 130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes; le refroidissement à une température comprise entre 0° et 10°C; et la récupération, concentration et enrichissement des fractions solubles débarrassées des cellules de microalgues.

Description

PROCEDE DE PERMEABILISATION THERMIQUE
D'UNE BIOMASSE DE MICROALGUES
La présente invention concerne un procédé de perméabilisation thermique d'une biomasse de microalgues, ce traitement permettant d'en libérer le contenu intracellulaire soluble, notamment les peptides et polypeptides.
Ce procédé de perméabilisation thermique ne s'accompagne pas d'une désintégration cellulaire, ce qui permet également la séparation aisée du contenu intracellulaire ainsi libéré de la biomasse résiduelle, par toute méthode de séparation solide- liquide connue en soi par ailleurs de l'homme du métier, par exemple la filtration frontale ou tangentielle, la centrifugation et/ou la floculation.
Plus particulièrement, dans le cas où les microalgues choisies sont riches en lipides, le procédé de l'invention permet de conserver dans la biomasse résiduelle la fraction lipidique d'intérêt.
La présente invention concerne enfin la récupération et le fractionnement du contenu intracellulaire des microalgues en solution aqueuse, contenu intracellulaire composé de peptides et polypeptides solubles, pigments, acides gras libres, oligo- et polysaccharides... II est bien connu de l'homme du métier que les chlorelles sont une source potentielle de nourriture, car elles sont riches en protéines et autres nutriments essentiels.
Elles sont décrites comme renfermant 45% de protéines, 20% de matières grasses, 20% de glucides, 5% de fibres et 10% de minéraux et de vitamines.
La fraction huile de la biomasse de Chlorella, qui se compose essentiellement d'huiles monoinsaturées, fournit ainsi des avantages nutritionnel et santé par rapport aux huiles saturées, hydrogénées et polyinsaturées souvent trouvées dans les produits alimentaires conventionnels.
La fraction protéique peut quant à elle valorisée être comme agent fonctionnel dans les industries alimentaire, cosmétique voire pharmaceutique, pour ses propriétés moussantes, émulsifiantes...
Les chlorelles sont donc classiquement exploitées en alimentation humaine ou animale, soit sous la forme de biomasse entière, soit sous la forme de farine, obtenue par séchage de la biomasse de chlorelles dont la paroi cellulaire a été rompue par des moyens notamment mécaniques.
La farine de microalgues fournit également d'autres bénéfices, comme des micronutriments, des fibres alimentaires (glucides solubles et insolubles), des phospholipides, des glycoprotéines, des phytostérols, tocophérols, tocotriénols, et du sélénium.
Pour préparer la biomasse qui entrera dans la composition des aliments, la biomasse est concentrée, ou récoltée, du milieu de culture (culture réalisée par autotrophie à la lumière en photobioréacteurs, ou en hétérotrophie, à l'obscurité en présence d'une source carbonée assimilable par les Chlorelles).
Dans le domaine technique auquel s'adresse l'invention, la croissance des Chlorelles par voie hétérotrophique est préférée (voie dite fermentaire).
Au moment de la récolte de la biomasse de microalgues du milieu de fermentation, la biomasse comprend des cellules intactes pour l'essentiel en suspension dans un milieu de culture aqueux.
Pour concentrer la biomasse, on procède alors à une étape de séparation solide- liquide, par filtration frontale et/ou tangentielle, par centrifugation, ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
Après concentration, la biomasse de microalgues peut être directement traitée afin de produire des gâteaux emballés sous vide, des paillettes de microalgues, des homogénats de microalgues, de la poudre de microalgues intactes, de la farine de microalgues broyées, ou de l'huile de microalgues.
On procède également au séchage de la biomasse de microalgues pour faciliter le traitement ultérieur ou pour une utilisation de la biomasse dans ses différentes applications, notamment alimentaires.
Cependant, jusqu'à présent, les microalgues étaient utilisées principalement pour la production de produits à forte valeur ajoutée, mais à faible volume. Parmi les raisons avancées pour expliquer cette situation, on trouve le coût prohibitif de la production à grande échelle de microalgues et surtout les difficultés associées au procédé de purification (acronyme anglo-saxon de « DSP » pour Down Stream Process) desdits produits.
Comme énoncé plus haut, de nombreux produits à haute valeur ajoutée sont stockés dans le compartiment intracellulaire des microalgues, et les procédés d'extraction de ces produits nécessitent classiquement une étape de désintégration cellulaire.
Or, un procédé de désintégration cellulaire efficace se doit de maximaliser non seulement le rendement mais aussi la qualité des produits extraits. En d'autres termes, ce procédé de désintégration optimisé doit éviter la contamination chimique ou la dégradation des produits ciblés.
Par ailleurs, pour des productions à grande échelle, il est important que le procédé choisi soit transposable à cette échelle. Enfin, l'introduction de cette étape de désintégration cellulaire dans le DSP doit être aisée et ne doit pas avoir un impact négatif sur les étapes de procédé/traitement subséquentes.
Toutes ces limitations influencent l'efficacité du procédé de désintégration et par la même sa consommation énergétique.
Différentes procédures de désintégration de microalgues ont été étudiées, par exemple chimique, mécanique, enzymatique voire même électrique (champ puisé).
Cependant, les cellules de microalgues sont dotées de parois membranaires très solides, ce qui rend la désintégration cellulaire et l'extraction des produits d'intérêt très difficiles et très coûteuses en énergie.
Par exemple, un disrupteur à pression peut être utilisé pour pomper une suspension contenant les cellules à travers un orifice restreint pour lyser les cellules. Une pression élevée (minimum de 1500 bar) est appliquée, suivie d'une expansion instantanée à travers une buse. Le cassage des cellules peut être réalisé par trois mécanismes différents : empiétement sur la vanne, cisaillement élevé du liquide dans l'orifice, et chute de pression soudaine en sortie, provoquant une explosion de la cellule. La méthode libère des molécules intracellulaires, mélangées aux débris cellulaires.
Un homogénéisateur NIRO Homogenizer Niro (GEA NIRO SOAVI - ou tout autre homogénéisateur haute pression) peut être utilisé pour traiter des cellules présentant une taille majoritairement comprise entre 0,2 et 5 microns. Ce traitement de la biomasse algale sous haute pression lyse généralement plus de 90 % des cellules et réduit la taille à moins de 5 microns.
De manière alternative, un broyeur à billes peut être également utilisé. Dans un broyeur à billes, les cellules sont agitées en suspension avec de petites particules sphériques. Le cassage des cellules est provoqué par les forces de cisaillement, le broyage entre les billes, et les collisions avec des billes. La description d'un broyeur à billes approprié est par exemple faite dans le brevet US 5.330.913. Ces billes cassent les cellules pour en libérer le contenu cellulaire. On obtient alors une suspension de particules de plus petite taille que les cellules d'origine sous la forme d'une émulsion « huile dans eau ». Cette émulsion est ensuite atomisée et l'eau est éliminée, laissant une poudre sèche contenant cependant un mélange hétérogène composé de débris cellulaires, de composés solubles interstitiels et d'huile.
La difficulté à résoudre dans l'emploi de ces technologies de désintégration cellulaire est l'isolement du seul contenu intracellulaire (à l'exclusion des débris membranaires et des matières grasses) et la préservation, notamment, de la qualité de la charge protéique. L'énergie mise en œuvre pour rompre la rigidité de la microalgue peut en effet occasionner une dégradation ou dénaturation irréversible des molécules intracellulaires d'intérêt.
Des solutions alternatives ont été proposées, comme le traitement électrique à champ puisé. L'exposition des cellules biologiques à champ électrique puisé de haute intensité peut en effet altérer la structure de la membrane cellulaire. Le champ externe provoque le chargement de la membrane. A une tension transmembranaire suffisante (0,5-1 V), l'arrangement moléculaire des phospholipides change, ce qui conduit à faire perdre à la membrane sont rôle de barrière, la rendant perméable. En fonction des conditions mises en œuvre, cette perméabilisation membranaire peut être réversible ou irréversible.
Pour une extraction efficace des composés intracellulaires, il reste cependant conseillé à l'homme du métier de provoquer une perméabilisation irréversible de la membrane, ce qui conduit à sa désintégration.
Cette rupture de la membrane facilite alors la libération du contenu cellulaire et, en cas d'utilisation d'une technique complémentaire d'extraction par solvant, facilite également la pénétration du solvant dans la cellule.
Cette technique, quoique prometteuse, n'est malheureusement pas extrapolable à une échelle industrielle pour traiter une biomasse produite en réacteur de 1 à 200 m3.
Par ailleurs, elle produit également des débris membranaires contaminant qu'il faudra séparer des molécules d'intérêt du compartiment intracellulaire.
Il résulte qu'il demeure un besoin non satisfait de disposer d'une technologie de fragilisation des parois des microalgues apte à libérer le contenu intracellulaire sans désintégrer la cellule ni altérer la qualité de ses composants.
La société Demanderesse a trouvé que ce besoin pouvait être satisfait par un procédé de perméabilisation thermique des cellules de microalgues.
La société Demanderesse va ainsi à rencontre d'un préjugé technique qui veut que les méthodes thermiques de disruption cellulaire, tout comme les forces de cisaillement provoqués par la désintégration mécanique, soient des technologies plutôt mises en œuvre pour dégrader ou dénaturer les produits issus des microalgues (Richmond, 1986, Handbook of Microalgal Mass Culture. CRC Press, Inc - Molina Grima et al., 2003, Recovery of microalgal biomass and metabolites: process options and économies, Biotechnol. Adv. 20:491-515).
Par ailleurs, une fois libérées du compartiment intracellulaire, la récupération des molécules peut être réalisée aisément par toute technologie de séparation solide-liquide connue de l'homme du métier, étant donné que le traitement thermique développé par la société Demanderesse ne conduit pas à la désintégration de la paroi cellulaire. Enfin, la récupération de cette fraction soluble ouvre la voie du fractionnement de son contenu, par exemple par des techniques de séparation membranaire connues de l'homme du métier.
La présente invention est relative à un procédé de perméabilisation thermique de la biomasse de microalgues du genre Chlorella de manière à en récupérer les fractions solubles enrichies notamment en peptides et polypeptides et en oligosaccharides.
Ce procédé comprend les étapes suivantes :
fourniture d'une biomasse de microalgues ;
traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60 à 130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes,
refroidissement à une température comprise entre 0° et 10°C, et
récupération, concentration et enrichissement des fractions solubles débarrassées des cellules de microalgues.
Ce procédé comprend de préférence les étapes suivantes :
1 ) culture des microalgues par fermentation en conditions hétérotrophiques et en absence de lumière,
2) collecte de la biomasse,
3) optionnellement, lavage de la biomasse pour éliminer les résidus du liquide interstitiel issus de la fermentation,
4) traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60 à
130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes,
5) de manière optionnelle, refroidissement à température ambiante et maintien à cette température pendant 30 minutes à 3 heures, de manière à laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel,
6) refroidissement à une température comprise entre 0° et 10°C, de préférence à une température de l'ordre de 4°C,
7) élimination de la biomasse résiduelle par une technique de séparation solide- liquide,
8) récupération, concentration et enrichissement des fractions solubles débarrassées des cellules de microalgues.
De préférence, les microalgues du genre Chlorella sont choisies dans le groupe constitué de Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorella protothecoides. Dans un mode de réalisation particulier, la souche est Chlorella protothecoides (souche UTEX 250 - The Culture Collection ofAlgae at the University of Texas at Austin - USA). Dans un autre mode de réalisation particulier, la souche est Chlorella sorokiniana (souche UTEX 1663 - The Culture Collection of Algae at the University of Texas at Austin - USA). La culture en conditions hétérotrophiques et en l'absence de lumière conduit classiquement à la production d'une biomasse de chlorelles présentant une teneur en protéines (évaluée par la mesure du taux d'azote N x 6,25) de 45 à 70 % en poids de cellules sèches.
Comme il sera exemplifié ci-après, Cette culture est réalisée en deux étapes :
- préculture dans un milieu contenant du glucose et de l'extrait de levures pendant 72 h à 28°C sous agitation,
- culture pour production de la biomasse proprement dite en glucose et extrait de levure pendant plus de 36 h à 28°C, sous agitation et à pH 6,5 régulé à l'ammoniaque,
ce qui conduit à environ 80 g/L de biomasse à une teneur en protéines (évalué par le N 6,25) de l'ordre de 52 % en poids de cellules sèches.
La biomasse est ensuite collectée par séparation solide-liquide, par filtration frontale ou tangentielle, par centrifugation, ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier.
De manière avantageuse, la société Demanderesse recommande ensuite de laver la biomasse de manière à éliminer les composés solubles interstitiels par une succession de concentration (par centrifugation) / dilution de la biomasse.
Au sens de l'invention, on entend par « composés solubles interstitiels » tous les contaminants organiques solubles du milieu de fermentation, par exemple les composés hydrosolubles tels les sels, le glucose résiduel, les oligosaccharides de degré de polymérisation (ou DP) 2 ou 3, les peptides...
Cette biomasse ainsi purifiée de ses solubles interstitiels est ensuite ajustée préférentiellement à une matière sèche comprise entre 5 et 35 % en poids, de préférence à une matière sèche comprise entre 10 et 20 % avec de l'eau déminéralisée.
On réalise alors le traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60° et 130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes. Ce traitement peut comprendre 2 à 6 paliers de température. Par exemple, il peut comprendre plusieurs paliers de températures croissantes et ensuite, facultativement plusieurs paliers de températures décroissantes. Les paliers de température peuvent être de 10 à 40 °C, par exemple d'environ 10, 20, 30 ou 40°C.Un premier palier peut permettre de porter la biomasse à une température d'environ 60-70 °C. Par « environ » est entendu + ou - 10 %, de préférence + ou - 5 %. Des paliers intermédiaires peuvent être faits entre 60°C et la température maximale appliquée, par exemple entre environ 90 et 130°C. Chaque palier peut durer entre environ 10 secondes et 4 minutes, de préférence entre 30 secondes et 3 minutes.
Ainsi, le traitement peut être comprendre un premier palier permettant de porter la biomasse à une température d'environ 60-70 °C, un ou plusieurs paliers permettant d'atteindre une température maximale appliquée d'environ 90 à 130°C, et facultativement un ou plusieurs paliers permettant de réduire la température.
Comme il sera exemplifié ci-après, le traitement peut être réalisé en trois phases : montée en température de la température ambiante à 60°C en 30 secondes ; - montée en température de 60° à 90°C pendant encore 30 secondes ;
maintien de la température à 90°C pendant 3 minutes.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé comprend les étapes suivantes : o élévation de la température de 28°C à 60°C pendant 30 secondes,
o élévation de la température de 60°C à 90 °C pendant 30 secondes,
o maintien de la température à 90°C pendant 1 minute,
o refroidissement de 90 à 60°C pendant 30 secondes,
o refroidissement de 60°C à 4°C, de préférence pendant 1 minute.
Ce traitement permet de laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel.
De manière à amplifier ce phénomène de diffusion libre, on peut laisser refroidir à température ambiante et maintenir à cette température pendant 30 minutes à 3 heures.
Enfin, au terme de ces étapes, on laisse refroidir à une température finale comprise entre 0° et 10°C, de préférence à une température de l'ordre de 4°C.
La société Demanderesse a ainsi trouvé que le traitement thermique, réalisé dans ces conditions opératoires, agit ainsi comme un procédé de fragilisation membranaire qui autorise le relargage spontané des composants solubles du compartiment intracellulaire.
En plus des substances ioniques, des substances organiques tels que les hydrates de carbone (majoritairement DP1 et DP2), les peptides et les polypeptides sont drainés hors de la cellule.
Au contraire, les lipides et composés organiques hydrophobes restent dans les cellules, ce qui démontre bien que les cellules sont perméabilisées et non lysées/détruites.
Le procédé selon l'invention ne conduit donc pas à la formation d'une émulsion, mais bien d'une suspension aqueuse.
Le relargage de toutes ces substances solubles à travers la membrane perméabilisée s'apparente à un procédé de diffusion libre de type dialyse.
Par voie de conséquence, un temps de latence peut être nécessaire pour permettre une diffusion suffisante après le traitement thermique qui perméabilise la membrane.
Dans la littérature, le procédé de perméabilisation par champ puisé des membranes de levures pour en extraire les protéines demande de 4 h à 6 h (Ganeva et al., 2003, Analytical Biochemistry, 315, 77-84). Selon l'invention, un temps de réaction beaucoup plus court est mis en œuvre, compris entre 1 à 5 minutes.
De manière avantageuse, un temps de réaction entre 30 minutes et 3 heures supplémentaire peut-être mis en œuvre pour optimiser la diffusion des composés solubles du compartiment cellulaire.
La biomasse résiduelle est ensuite éliminée par une technique de séparation solide-liquide par filtration frontale ou tangentielle, par floculation, par centrifugation, ou par tout moyen connu par ailleurs de l'homme du métier, ce qui permet de récupérer aisément la fraction soluble débarrassée des cellules de microalgues.
Cette fraction soluble est composée essentiellement de protéines (50 - 80 % p/p) et d'hydrates de carbone (5 - 15 % p/p).
Les procédés classiques de récupération des protéines solubles reposent généralement sur une étape de précipitation desdites protéines par l'acide trichloracétique (10 % poids/volume) ou au sulfate d'ammonium.
Cependant, ces isolements par précipitation font suite à des procédés de cassage cellulaire très destructeurs (le plus souvent par sonication ou homogénéisation) qui, s'ils permettent en effet d'augmenter les rendements d'extraction, conduisent surtout à des protéines de faible solubilité et dénaturées.
Leur refonctionnalisation ne peut alors être envisagée que par le biais de leur produit d'hydrolyse (en peptides) par des moyens chimiques (lyse à la soude), physiques (traitement à haute température) ou enzymatiques (enzymes protéolytiques).
Le procédé selon l'invention permet bien au contraire de libérer des peptides et polypeptides natifs, intacts, dont toutes les fonctionnalités peuvent toujours s'exprimer.
Par ailleurs, la société Demanderesse a trouvé que la taille des peptides et polypeptides solubles libérées variait proportionnellement à la température de traitement mise en œuvre. Il est également considéré que le temps de traitement peut avoir un impact.
Il est par ailleurs proposé par la société Demanderesse des procédés de fractionnement afin d'isoler les protéines ou les oligosaccharides d'intérêt, procédés de fractionnement principalement membranaire.
La société Demanderesse recommande ainsi de procéder en deux étapes :
- préparer des compositions enrichies en protéines solubles et en oligosaccharides à partir des fractions solubles (débarrassées des microalgues traitées thermiquement) filtrées sur système membranaire choisi dans le groupe constitué de la microfiltration, l'ultrafiltration, la nanofiltration et la diafiltration, prise seule ou en combinaison,
- soumettre lesdites compositions à des traitements de fractionnement membranaire supplémentaires de type osmose inverse afin de séparer peptides et polypeptides d'une part, et oligosaccharides d'autre part. L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples qui suivent, lesquels se veulent illustratifs et non limitatifs.
EXEMPLES
Exemple 1 : Production de Chlorella protothecoides en fermentation de type fed-batch
La souche utilisée est Chlorella protothecoides UTEX 250
Pré-culture :
500 mL de milieu dans un Erlenmeyer de 2L ;
Composition du milieu (en g/L) :
Tableau 1 .
L'incubation se déroule dans les conditions suivantes : durée : 72 h ; température : 28°C ; agitation : 1 10 rpm (Incubateur Infors Multitron).
La pré-culture est ensuite transférée dans un fermenteur de 30L de type Sartorius. Culture pour production de biomasse :
Le milieu est le suivant : Tableau 2.
Le volume initial (Vi) du fermenteur est ajusté à 17 L après ensemencement. Il est porté à 20 à 25 L environ en final.
Les paramètres de conduite de la fermentation sont les suivants :
Tableau 3.
Lorsque la concentration résiduelle en glucose tombe en dessous de 10 g/L, un apport de glucose sous forme d'une solution concentrée à 800 g/L environ est réalisé de façon à maintenir la teneur en glucose entre 0 et 20 g/L dans le fermenteur.
Résultats
En 40h, on obtient 80 g/L de biomasse contenant 52 % de protéines. Exemple 2. Perméabilisation thermique de la biomasse de Chlorella protothecoides et récupération de la fraction soluble
La biomasse obtenue selon l'exemple 1 est :
- centrifugée et lavée de manière à être amenée à une matière sèche de 150 g/l et à une pureté de plus 90 % (pureté définie par le rapport entre la matière sèche de la biomasse sur matière sèche totale), puis
traitée thermiquement de la manière suivante :
o élévation de la température de 28°C à 60°C pendant 30 secondes, o élévation de la température de 60°C à 90 °C pendant 30 secondes, o maintien de la température à 90°C pendant 1 minute
o refroidissement de 90 à 60°C pendant 30 secondes,
o refroidissement de 60°C à 4°C, de préférence pendant 1 minute. La biomasse ainsi obtenue est séparée de la fraction soluble par séparation centrifuge. Ladite fraction soluble est ensuite microfiltrée sur membrane céramique de 0,14 m à 60°C.
La pression transmembranaire est fixée à une valeur comprise entre 0,2 et 0,6 bar et la microfiltration est conduite pour obtenir un facteur de concentration volumique de 2,5 (100 litres de cette fraction soluble microfiltrée génèrent ainsi 40 litres de rétentat « R1 » et 60 litres de perméat « P1 »).
Ce perméat « P1 » de microfiltration présente une matière sèche de 4 % et titre entre 60 et 80% de protéines solubles exprimées en N 6x25. Exemple 3. Fractionnement des composantes protéiques et saccharidiques du contenu intracellulaire de la biomasse de Chlorella protothecoides perméabilisée
Pour obtenir les fractions riches en protéines solubles et en saccharides, le perméat de microfiltration « P1 » obtenu au terme de l'exemple 2 à 4 % de matière sèche est notamment ultrafiltré sur membrane de seuil de coupure 10 kDa, de manière à obtenir :
o un rétentat « R2 » à 10 % de matière sèche, contenant des peptides présentant un poids moléculaire supérieur ou égal à 5 kDa et des oligosaccharides de hauts DP ;
o un perméat « P2 » à 1 % de matière sèche, contenant des peptides présentant un poids moléculaire inférieur à 5 kDa et des oligosaccharides DP inférieure ou égal à 2. Ce perméat « P2 » peut alors être notamment filtré sur membrane d'osmose inverse (présentant un taux de réjection en NaCI de 93 %), de manière à obtenir :
o un rétentat « R3 » à 10% de matière sèche contenant des peptides présentant un poids moléculaire inférieur à 5 kDa et des oligosaccharides de DP 2, tel le saccharose ;
o un perméat « R3 » à 0,1 % de matière sèche contenant des oligosaccharides de DP1 , des sels, des acides aminés libres et des acides organiques.

Claims

REVENDICATIONS
1 . Procédé de perméabilisation thermique de la biomasse de microalgues du genre Chlorella de manière à en récupérer les fractions solubles enrichies notamment en protéines et en oligosaccharides, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
fourniture d'une biomasse de microalgues ;
traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60 à 130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes,
refroidissement à une température comprise entre 0° et 10°C, et
- récupération, concentration et enrichissement des fractions solubles débarrassées des cellules de microalgues.
2. Procédé de perméabilisation thermique selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
1 ) culture des microalgues par fermentation en conditions hétérotrophiques et en absence de lumière,
2) collecte de la biomasse,
3) optionnellement, lavage de la biomasse pour éliminer les résidus du liquide interstitiel issus de la fermentation,
4) traitement thermique par paliers à une température comprise entre 60 à 130°C, de préférence 60 et 90°C, pendant 1 à 5 minutes,
5) de manière optionnelle, refroidissement à température ambiante et maintien à cette température pendant 30 minutes à 3 heures, de manière à laisser diffuser les composants intracellulaires dans le milieu réactionnel,
6) refroidissement à une température comprise entre 0° et 10°C, de préférence à une température de l'ordre de 4°C,
7) élimination de la biomasse résiduelle par une technique de séparation solide- liquide,
8) récupération, concentration et enrichissement des fractions solubles débarrassées des cellules de microalgues.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que les microalgues du genre Chlorella sont choisies dans le groupe constitué de Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana et Chlorella protothecoides, et sont plus particulièrement Chlorella protothecoides
4. Procédé selon l'une ou l'autre des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que la biomasse est collectée par séparation solide-liquide, par filtration frontale ou tangentielle, ou par centrifugation.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le traitement thermique comprend plusieurs paliers de températures croissantes et ensuite, facultativement plusieurs paliers de températures décroissantes, chaque palier étant de de 10 à 40 °C.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le traitement thermique comprend un premier palier permettant de porter la biomasse à une température d'environ 60-70 °C, un ou plusieurs paliers permettant d'atteinder une température maximale appliquée d'environ 90 à 130°C, et facultativement un ou plusieurs paliers permettant de réduire la température.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que le traitement thermique comprend les phases suivantes :
montée en température de la température ambiante à 60°C en 30 secondes ; montée en température de 60° à 90°C pendant encore 30 secondes ; - maintien de la température à 90°C pendant 3 minutes.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que le traitement thermique comprend les phases suivantes :
o élévation de la température de 28°C à 60°C pendant 30 secondes,
o élévation de la température de 60°C à 90 °C pendant 30 secondes,
o maintien de la température à 90°C pendant 1 minute,
o refroidissement de 90 à 60°C pendant 30 secondes,
o refroidissement de 60°C à 4°C, de préférence pendant 1 minute.
9. Procédé de préparation de compositions enrichies en peptides et polypeptides solubles et en oligosaccharides issues de microalgues du genre Chlorella, caractérisé en ce que les fractions solubles obtenues par la mise en œuvre du procédé de l'une quelconque des revendications 1 à 8 sont filtrées sur système de séparation membranaire choisi dans le groupe constitué de la microfiltration, l'ultrafiltration, la nanofiltration et la diafiltration, prise seule ou en combinaison.
10. Procédé de fractionnement des compositions enrichies en peptides et polypeptides solubles et en oligosaccharides obtenues selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'on met en œuvre des membranes de type osmose inverse.
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