EP3113625A1 - Zusammensetzung für die enzymatische ölentschleimung - Google Patents

Zusammensetzung für die enzymatische ölentschleimung

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Publication number
EP3113625A1
EP3113625A1 EP15705030.3A EP15705030A EP3113625A1 EP 3113625 A1 EP3113625 A1 EP 3113625A1 EP 15705030 A EP15705030 A EP 15705030A EP 3113625 A1 EP3113625 A1 EP 3113625A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oil
enzyme
composition
phospholipase
triglyceride
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15705030.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Sohling
Kirstin Suck
Paul Bubenheim
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Clariant Produkte Deutschland GmbH
Original Assignee
Clariant Produkte Deutschland GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Clariant Produkte Deutschland GmbH filed Critical Clariant Produkte Deutschland GmbH
Publication of EP3113625A1 publication Critical patent/EP3113625A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12Y304/19—Omega peptidases (3.4.19)
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    • C12Y304/23—Aspartic endopeptidases (3.4.23)
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    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
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    • C12Y301/01003—Triacylglycerol lipase (3.1.1.3)
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    • C12Y301/00—Hydrolases acting on ester bonds (3.1)
    • C12Y301/04—Phosphoric diester hydrolases (3.1.4)
    • C12Y301/04004—Phospholipase D (3.1.4.4)

Definitions

  • the invention relates to a composition
  • a composition comprising
  • the invention relates to a method for degumming of triglyceride-containing compositions using the inventive composition and the use of the composition according to the invention for
  • the chemical refining consists of the
  • the degumming of the oils can be carried out by extraction of the phospholipids with water or an aqueous solution of an acid that complexes Ca 2+ and Mg 2+ ions, such as citric acid or phosphoric acid. Frequently, an aqueous, so-called pre-degumming is first carried out by means of which the water-soluble phospholipids are removed. This is called hydratable phospholipids.
  • the subject of the hydratable and non-hydratable phospholipids is described, for example, in Nielsen, K., Composition of difficultly extractable soybean phosphatides, J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 and A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2010, 112, 1178-1189. These are in particular phosphatidylcholine and phosphatidylinositol. Treatment with
  • dilute aqueous calcium and magnesium complexing acids e.g. Citric acid or phosphoric acid results in the prior art to be non-hydratable
  • Phospholipids are converted into hydratable phospholipids. Reduction of phosphorus content to 10 or less ppm of phosphorus in the oil must be regularly demonstrated for food applications (as determined by ICP / AES analysis of the oil in the art). For oils that
  • the phosphorus content of the biodiesel is limited to 5 ppm and it is expedient to use the
  • a disadvantage of conventional oil degumming processes is that both aqueous pre-degumming and aqueous acid treatment result in oil losses caused by the phospholipids transferred to the water being emulsifiers emulsifying a portion of the vegetable oil in the aqueous phase, whereby vegetable oil is lost. These losses can be in the range of less percentages relative to the original
  • Phosphatidyl such as phosphatidyl choline (starting from lecithin), which is very soluble in water.
  • phosphatidyl choline starting from lecithin
  • Dijkstra's review article on Enzymatic Degumming states that the drawback of this system is that it does not metabolize all phospholipids, but only phosphatidylcholine and phosphatidyl inositol, while leaving the difficultly hydratable ethanolamines and phosphatidic acids untouched led that in subsequent developments, the phospholipase C either with phospholipases A or with
  • Lipidacyltransferasen was combined.
  • a combination of phospholipases A with phospholipases C for oil degumming is described in WO 08/094847. In this patent it is stated that the mixture of phospholipase A and
  • phospholipase C leads to a synergistic effect on the oil yield, on the other hand, it allows very low phosphorus contents in the oil to be set with acceptable reaction times.
  • enzymatic oil degumming is the enzymatic treatment of the separated gum phase after the oil is removed by conventional methods such as e.g. was degummed with water and / or citric acid. By this treatment, it is possible to recover part of the vegetable oil emulsified in the slime phase. This process is for example also in the review article A.J. Dijkstra,
  • PCT / EP2013 / 053199 describes a process in which crude oil with an enzyme combination of a
  • Another method of the prior Technique described in EP 13166529.1 uses a phosphatase as part of an enzymatic degumming.
  • the conventional degumming process has been converted to a process with phospholipase A, and in which 266,000 t of soybean oil are cleaned each year, it has been shown that it can save 120,000 GJ of energy and 12,000 t C0 2 equivalents per year.
  • the saved C0 2 equivalents correspond to the
  • Triglyceride-containing compositions in particular of
  • Enzyme activity is defined in the context of the present invention as a chemical reaction catalyzed by one or more catalytic proteins (enzymes).
  • an enzyme substrate is converted to one or more products.
  • Certain enzymes or enzyme compositions possess one or even more enzyme activities.
  • a pure enzyme can, for. B. catalyze more than one reaction (conversion from a substrate to product (s)), therefore, has more than one
  • Enzyme activities The enzyme activity is related to the reaction rate. It indicates how much active enzyme is in an enzyme composition. The
  • Units of enzyme activity are Unit (U), where 1 U
  • first enzyme component comprising at least one phospholipid-cleaving enzyme and a second enzyme component
  • Enzyme component comprising at least one protease
  • composition of the invention is preferably a phospholipid-cleaving enzyme
  • Phospholipase which is capable of either one
  • the "phospholipid-cleaving enzyme” is preferably an acyltransferase, in which the cleavage of the fatty acid residue with a transfer of this residue, followed by a
  • Phospholipases are enzymes belonging to the group of hydrolases and the ester linkage of phospholipids
  • Phospholipases AI Phospholipases AI (PLA1), which cleave the fatty acid in the snI position to form the 2-lysophospholipid.
  • Phospholipases A2 Phospholipases A2 (PLA2), which cleave the fatty acid in the sn2 position to form the 1-lysophospholipid.
  • Phospholipases C which cleave a phosphoric acid monoester.
  • Phospholipases D which split or exchange the head group.
  • Phospholipases B which cleave the fatty acid at both the snl and sn2 positions to form a 1,2-lysophospholipid.
  • an enzyme containing acyl groups for. B.
  • the present invention relates to a composition in which the first
  • Enzyme component is selected from the group consisting of phospholipase AI, phospholipase A2, phospholipase C,
  • Phospholipase B Phospholipase B, phospholipase D, acyltransferase and mixtures thereof.
  • the enzymes can be from any
  • Organism for example also isolated from a thermophilic
  • the Enzymes may be of animal origin, for example from the pancreas, of plant origin or of microbial origin, eg. B. from yeast, fungi, algae or bacteria.
  • microbial origin eg. B. from yeast, fungi, algae or bacteria.
  • enzymes of the same type it is also possible for enzymes of the same type to be used in each case within the enzyme components, but these originate from different sources or species. Also included are recombinantly produced chimeric fusion proteins from two or more different species having enzymatic activity.
  • phospholipase AI phospholipase A2
  • phospholipase C phospholipase B
  • porcine pancreas preferably used from the following species: porcine pancreas, bovine pancreas, snake venom, bee venom, Aspergillus,
  • Proteus Pseudomonas, Providencia, Rhizomucor, Rhizopus,
  • phospholipase AI phospholipase A2
  • phospholipase C phospholipase B
  • phospholipase D phospholipase D
  • Bacillus atrophaeus Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii,
  • Bacillus pumilus Bacillus sphaericus, Bacillus
  • Citrobacter braakii Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter gillenii, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae,
  • Dictyostelium mucoroides Dictyostelium polycephalum
  • Edwardsieila hoshinae Edwardsieila ictaluri
  • Edwardsieila tarda Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes
  • Enterobacter cloacae Enterobacter gergoviae, Enterobacter intermedius, Enterobacter pyrinus, Escherichia albertii,
  • Fusarium culmorum Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium
  • Klebsiella singaporensis Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana , Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora gaiapagosensis,
  • Neurospora intermedia Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri, Pichia
  • Pichia nakasei Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris ( Komagataella pastoris), Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola,
  • Proteus penneri Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia stuartii,
  • Rhizomucor endophyticus Rhizomucor miehei, Rhizomucor
  • Rhizomucor variabilis Rhizopus arrhizus, Rhizopus
  • Rhizopus circinans Rhizopus japonicus
  • Rhizopus microsporus Rhizopus nigricans
  • Rhizopus oligosporus azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus,
  • Rhizopus oryzae Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis
  • Rhizopus stolonifer Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Sclerotinia borealis, Sclerotinia homoeocarpa, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia
  • Serratia symbiotica Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens,
  • Streptomyces lincolnensis Streptomyces natalensis, Streptomyces nodosus, Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini,
  • Trichoderma harzianum Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum,
  • Trichophyton raubitschekii Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton simii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton
  • Phospholipase C and / or phospholipase D which consist of Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus,
  • Serratia liquefaciens Sclerotinia libertiana, Shigella flexneri, Streptomyces violaceoruber, Trichophyton rubrum, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei,
  • the at least one enzyme of the first enzyme component may originate from the same or different sources, preferably from one or more of the abovementioned organisms, more preferably from Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporium, Naja
  • Trichoderma reesei porcine pancreas or bovine pancreas.
  • protea is understood to mean one or more enzymes or enzyme compositions from the enzyme class 3.4 (peptide hydrolases). This includes the terms peptidases and or proteinases. Proteases catalyze the hydrolysis of peptide bonds.
  • the enzymes may be of animal origin, e.g. out
  • Gastric mucosa of plant origin or of microbial origin, e.g. B. from yeast, fungi, algae or bacteria.
  • it may preferably be one or more enzymes of the following protease enzyme classes: aminopeptidases, aspartate dopeptidases, dipeptidases,
  • Metallocarboxypeptidases cysteine carboxypeptidases, omega-peptidases, serine endopeptidases, cysteine endopeptidases, asparagine endopeptidases, metalloendopeptidases, threonine endopeptidases, endopeptidases, with particular preference Aspartate endopeptidases, serine endopeptidases or
  • Metalloendopeptidases are used.
  • proteases mentioned are preferably used from the following species:
  • the protease and mixtures thereof are more preferably selected from Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger.
  • Bacillus amyloliquefaciens Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus
  • Citrobacter murliniae Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae,
  • Dictyostelium mucoroides Dictyostelium polycephalum
  • Edwardsieila hoshinae Edwardsieila ictaluri
  • Edwardsieila tarda Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes
  • Fusarium culmorum Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium
  • Klebsiella singaporensis Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana , Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora gaiapagosensis,
  • Neurospora intermedia Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri , Pichia
  • Pichia nakasei Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris, Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia stuartii, Rhizomucor endophyticus,
  • Rhizomucor miehei Rhizomucor pakistanicus
  • Rhizomucor miehei Rhizomucor pakistanicus
  • Rhizomucor tauricus Rhizomucor variabilis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis, Rhizopus stolonifer, Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium,
  • Serratia symbiotica Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens,
  • Streptomyces nodosus Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini,
  • Trichoderma harzianum Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum,
  • Proteases from the following species used Proteases from gastric mucosa of a mammal, porcine pancreas,
  • Bacillus licheniformis Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Escherichia coli Clostridium perfringens, Pichia pastoris ( Komagataella pastoris),
  • Rhizomucor pusillus Rhizopus arrhizus
  • Rhizopus japonicus Rhizopus stolonifer
  • Salmonella Pseudomonas species, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Rhizopus stolonifer, Salmonella
  • the at least one protease of the second enzyme component may originate from the same or from different sources, preferably from one or more of the abovementioned organisms.
  • the amount of enzyme (s) of the first enzyme component will be in the range of from 1 ppm to 1000 ppm, more preferably from 1 to 250 ppm preferably in the range of 5 to 200 ppm in terms of
  • the enzyme activity of the second enzyme component is in the range from 1 ppm to 1000 ppm, more preferably from 1 to 250 ppm,
  • Range of 0.01 to 10 units / g of oil more preferably in the range of 0.1 to 5 units / g of oil, more preferably in the range
  • the enzyme activity of the second enzyme component in the range of 0.01 to 10 units / g of oil, preferably 0.1 to 5 units / g of oil, and more preferably in the range of 0.2 to 3 units / g of oil, and most preferably selected in the range of 0.3 to 2 units / g of oil.
  • compositions in which the ratio of the enzyme activity of the first enzyme component to the enzyme activity of the second enzyme component is in the range from 0.001: 20 to 20: 0.001, preferably in the range from 0.1: 10 to 10: 0 , 1, more preferably in the range of 0.25: 7.5 to 7.5: 0.25, more preferably from 0.5: 5 to 5: 0.5, and most preferably in the range of 1: 1 to 1 : 5.
  • Enzyme component can reduce the volume of the mucus phase on. This means an increase in the oil yield.
  • the enzymes of the first and / or second enzyme component can be, for example, freeze-dried and in a corresponding
  • Enzyme buffers (standard buffers for each enzyme are in the
  • Literature may be used in solution, e.g.
  • the enzymes are dissolved in
  • Enzyme buffer was added and added to the crude oil. To better solubility of enzymes - especially in the
  • Phospholipase-containing compositions of the invention - to achieve is also the addition of organic
  • Solvents possible are used, e.g. in the separation of phospholipids and are described in the literature.
  • nonpolar organic solvents such as e.g. Hexane or acetone or mixtures, preferably in an amount of 1 to 30 wt .-% (examples of possible solvents are described in EP 1531182 A2).
  • first and / or second enzyme component is in supported form
  • Support materials which are preferred in the context of the present invention are inorganic support materials, such as e.g. Silica gels, precipitated silicas, silicates or
  • Aluminosilicates, and organic support materials e.g.
  • the composition according to the invention comprises one or more further constituents, particularly preferably selected from the group consisting of citrate buffer and acetate buffer.
  • the inventors of the present composition have surprisingly found that a combination of the
  • composition according to the invention can be used particularly advantageously for the degumming of triglyceride-containing compositions, such as crude vegetable oil or vegetable oil slime.
  • the present invention therefore relates, in a further aspect, to a process for degumming triglyceride-containing compositions comprising the steps of a) contacting the triglyceride-containing compounds
  • composition with the composition according to the invention as defined above; b) separating the mucilages from the triglyceride-containing composition.
  • the inventive method to further reduce the phospholipid content of the triglyceride-containing composition compared to the pure use of phospholipid-cleaving enzyme to increase the oil yield, to increase the reaction rate in the enzymatic degumming, to reduce the mucus volume and / or to improve the separability of the formed slime phase.
  • the phosphorus value is lowered to below 20 ppm, particularly preferably below 10 ppm, very particularly preferably below 4 ppm of phosphorus.
  • the calcium and magnesium content of the triglyceride-containing composition in particular crude vegetable oil to less than 20 ppm, more preferably less than 15 ppm, most preferably less than 10 ppm, also preferably less than 8 ppm and most preferably less than 4 ppm.
  • the calcium and magnesium content is reduced below 3 ppm.
  • the method of the present invention is particularly advantageous because the use of the protease, the effect of the phospholipid-cleaving enzyme is improved.
  • the use of the protease reduces the viscosity of the oil slime phase and increases the mobility of the phospholipids. Also, the accessibility of the phospholipid molecules to the phospholipid-cleaving enzyme is increased, which are at the mucus phase / oil interface.
  • At least one phospholipid-cleaving enzyme with at least one protease according to the invention, it is also possible to increase the dosage of the phospholipid-cleaving enzymes, e.g. the phospholipase AI or A2 optionally combined with phospholipase C, and thus to save costs in addition to the above-mentioned advantages for the process.
  • the phospholipid-cleaving enzymes e.g. the phospholipase AI or A2 optionally combined with phospholipase C
  • compositions according to the present invention include vegetable or animal fats and oils, and mixtures thereof both with each other and with synthetic or
  • modified fats and oils are defined in more detail below.
  • vegetable oil in the context of the present invention means any oil of plant origin.
  • Preferred particularly suitable oils are soybean oil, rapeseed oil,
  • Canola oil sunflower oil, olive oil, palm oil, jatropha oil,
  • Deodorizing step was subjected. It is also possible in the context of the method according to the invention that a mixture of several crude oils is used or pretreated, e.g.
  • pre-degummed and / or preconditioned oils are treated with the enzymes.
  • "slime phase”, “mucilages”, “vegetable oil slime” are all substances which precipitate as heavy phase after treatment with an acidic and / or aqueous solution of the triglyceride-containing composition (Michael Bokisch: Fats and Oils
  • Vegetable oil slime as a starting material is particularly important for the recovery of lecithin, since lecithin is an essential component of vegetable oil slime.
  • pre-degumming or "wet degumming” is understood as meaning a treatment of the crude oil with water or an aqueous acid solution in order to remove water-soluble phospholipids as far as possible from the oil.
  • pre-degumming and
  • Weight degumming are used interchangeably in the context of the present invention. Also, during an on ⁇ Nassentschleimung or after the acid addition, if necessary, an addition of alkali to neutralize the acid. Before the enzyme addition, the separation of the aqueous phase takes place. After pre-degumming, the phosphorus content in the crude oil is reduced from approx. 500-1500 ppm, eg for soybean and rapeseed to below 200 ppm, in the pre-degummed oil. By pre-degumming, for example, lecithin can be obtained from the resulting slime phase or the slime phase can be worked up as feed. However, the disadvantage of separating the aqueous phase or lowering the phosphorus content is a
  • preconditioning of the oil is understood as meaning the addition of water or an aqueous acid solution to the untreated oil.
  • alkali for example, sodium hydroxide
  • a pH at which the following enzymatic reaction takes place the one for the
  • Enzyme reaction optimal pH adjusted from 3.5 to 7.
  • Simplification of the process is because the separation step before enzyme addition is omitted.
  • Step a) of the process according to the invention - apart from any existing emulsifiers, such as lecithin - no additional emulsifiers, such as sodium docecyl sulfate (SDS) added.
  • the process according to the invention preferably proceeds without the addition of salts, such as, for example, calcium chloride (CaCl 2 ).
  • salts such as, for example, calcium chloride (CaCl 2 ).
  • Sunflower oil is in particular a combination of
  • Thermolipase AI from Thermomyces lanuginosus or Fusarium oxysporium and / or phospholipase A2 from porcine pancreas or bovine pancreas or Trichoderma reesei or Streptomyces violaceoruber or Aspergillus niger and / or Phospholipase C from Pichia pastoris with a protease from stomach or Bacillus amyloliquifaciens or Bacillus subtilis or Bacillus
  • step a) The process of the invention is a mixing of the triglyceride-containing composition and the composition according to the invention. After contacting the triglyceride-containing
  • the mixture of the triglyceride-containing composition and the composition of the invention is preferably stirred, more preferably with a paddle at 200 to 800 rev / min, preferably 250 to 600 rev / min and on most preferably at 300 to 500 rpm.
  • the temperature of the mixture during contacting in step a) of the process according to the invention is preferably in the range from 15 to 99.degree. C., more preferably in the range from 20 to 95.degree. C., more preferably from 22 to 75.degree from 25 to 65 ° C, more preferably from 30 to 60 ° C, and most preferably from 32 to 55 ° C.
  • the temperature of the mixture must always be chosen so that the denaturation temperature of the enzymes is not exceeded, preferably the temperature of the mixture is at least 5 ° C below the denaturation temperature of the enzymes or The duration of the contacting in step a) of
  • the process according to the invention is preferably in the range from 1 minute to 12 hours, more preferably from 5 minutes to 10 hours, also preferably from 10 minutes to 6 hours, more preferably from 10 minutes to 3 hours.
  • the pH of the mixture during the contacting according to step a) of the method according to the invention is preferably in the range of pH 3 to pH 7.5, more preferably in the range of pH 4 to pH 6 and particularly preferably in the range of pH 4, 0 to pH 5.5.
  • the bringing into contact according to step a) of the process according to the invention of the triglyceride-containing composition with the first and the second enzyme component of the composition according to the invention can be carried out simultaneously or else
  • Composition is first brought into contact with the second enzyme component.
  • the triglyceride-containing composition is contacted first with the second enzyme component and then with the first enzyme component, it is particularly preferred that after addition of the one component, the mixture for 30 to 300 minutes, preferably 60 to 240 minutes , is preferably stirred for from 70 to 120 minutes before adding the other component
  • step b) of the process according to the invention can be carried out in any manner known to the person skilled in the art as suitable for the purpose according to the invention, however, the separation preferably takes place via any separators, such as centrifuges or
  • inventive methods are nozzle separators
  • Plate separators solid plate separators, two-phase decanters, three-phase decanters, three-column centrifuges,
  • the treated vegetable oil, mucilage and enzyme composition are in separate phases that can be easily separated.
  • the phase containing the mucilages and the phase containing the composition of the invention is separated from the treated oil. It is particularly preferred if
  • the first and / or second enzyme component is separated.
  • the enzymes can be regenerated after the separation or
  • EntSchleimungsvon be used. If necessary, the enzymes can be regenerated via an adsorbent or via a corresponding column chromatographic method. Another possibility is to part of the separated heavy phase in a further oil degumming of the
  • the invention also relates to a method as above
  • step c) re-contacting the triglyceride-containing composition according to step b) with the first and / or second enzyme component.
  • the process according to the invention preferably takes place under the same conditions as described above for step a) of the process according to the invention.
  • the first and / or second enzyme component prior to re-contacting regeneration are particularly preferred.
  • Triglyceride-containing composition prior to contacting in step c) subjected to a preconditioning as defined above.
  • the bringing into contact according to step c) is as already defined above in relation to the contacting according to step a) of the method according to the invention
  • the present invention in a further aspect relates to the use of the composition according to the invention as defined in more detail above for the degumming of triglyceride-containing compositions.
  • Embodiment A prior to step a) of the process, a so-called preconditioning is carried out by mixing the crude oil in a separate process step with an amount of from 1.5 to 3 ml / L of organic acid oil, preferably citric acid.
  • the temperature of the mixture is in this case preferably set to 35 to 60 ° C., more preferably to 48 ° C. After a reaction time of 30 minutes to 2
  • the mixture by adding a stoichiometric amount of alkali, preferably sodium hydroxide, in an amount of preferably 0.5 to 2 mol / 1, particularly preferred 1 mol / l, adjusted to a pH of 5. Only then is the process according to the invention proceeded according to step a).
  • alkali preferably sodium hydroxide
  • Embodiment B it is particularly preferred that the enzymes of the first and / or second enzyme component in an aqueous phase (buffer preferably in the range of pH 4.0 to 5.5, particularly preferably pH 4.0-5.0) in a concentration from 0.05 to 5% w / v.
  • the contacting in step a) is preferably carried out at a temperature of 22 to 70 ° C, more preferably 25 to 65 ° C.
  • Step b)) performed.
  • the temperature of the mixture is in this case preferably set at 35 to 60 ° C, particularly preferably 48 ° C.
  • the mixture by addition of an alkali, preferably sodium hydroxide, in a concentration of preferably 0.5 to 2 mol / 1, particularly preferably 1 mol / 1, to a pH of 5 set.
  • composition selected from vegetable oil slime having a composition comprising a first
  • Enzyme component comprising at least one enzyme selected from the group consisting of phospholipase AI, phospholipase A2 and phospholipase C and a second enzyme component having at least one enzyme selected from the group of proteases, preferably endo-proteases, it being particularly preferred if the at least one enzyme the first enzyme component is immobilized on a support; b) separating the mucilages from the triglyceride-containing composition by centrifugation.
  • a composition selected from crude soybean oil and / or crude rapeseed oil having a composition comprising a first enzyme component comprising at least one enzyme selected from the group consisting of phospholipase AI, phospholipase A2 and phospholipase C and a second enzyme component comprising at least one enzyme selected from the group of proteases, preferably endo-proteases, wherein it is particularly preferred if the at least one enzyme of the first enzyme component is immobilized on a support;
  • Embodiment D it is particularly preferred that before
  • organic acid preferably 100-1200 ppm citric acid
  • the temperature of the mixture is in this case preferably set to 40 to 90 ° C, more preferably 45-85 ° C. After a reaction time of 5 minutes to 2
  • any phosphatidic acids still dissolved in the triglyceride-containing composition and not cleaved by the phospholipases can be further reduced by reducing the Ca and / or Mg content of the oil treated according to the process of the present invention. Therefore, the above-mentioned, preferred embodiments A) to D) of the method according to the invention can advantageously still by a Subsequent step are supplemented, in which by repeated addition of complexing agents such as citric acid or
  • the content of free fatty acids is determined by the consumption of sodium hydroxide or potassium hydroxide over a
  • the amount of crude to be treated 400 to 600 g, is poured into a Duran reactor DN120 1000 mL and samples for analysis are taken.
  • the oil in the Duran reactor is heated with the aid of a hot plate to a temperature of 40 to 85 ° C, in particular 48 to 80 ° C. After the temperature is reached, the preconditioning is started. This is a defined, dependent on the amount of oil
  • Citric acid (e.g., 1000 ppm) to the oil.
  • Sampling takes place at defined time intervals.
  • the sample is removed with the aid of a pipette, filled into a temperature-controlled spin-on glass (temperature of the reaction mixture) and heated for at least 4 minutes at 3000 rpm to separate the slime phase from the oil.
  • aqueous phase enzyme buffer, pH 4-5
  • the reaction is carried out at a temperature of between 20 and 70 ° C., more preferably between 40 and 65 ° C.
  • the phase separation is awaited, the solids settle or can be removed by a standard method known to those skilled in the art, e.g. be removed by centrifugation or filtration.
  • the oil may be diluted with dilute acid (e.g.
  • Citric acid or lye according to a person skilled in the art
  • the slime phase which is obtained according to a method known to the skilled person as “degumming”, is added in addition to phospholipases, further enzymes, which may be dissolved in an aqueous phase or suspended in an organic solvent
  • the batch is ideally heated to a temperature between 20 up to 70 ° C
  • the batch is mixed until the process is complete. This can be checked by viscosity measurements or visually, by dissolving the otherwise solid slime phase. By centrifugation can be a phase separation
  • the individual phases can be separated.
  • the upper phase consists of the recovered oil
  • the middle phase of the phospholipids and the lower phase is an aqueous phase and contains the enzymes.
  • the aqueous phase allows the enzymes to be recycled and reused.
  • the oil or the water phase containing the enzyme can be purified by the addition of complexing agents prior to further use of the ions.
  • PLA1 0.3 unit / g oil and the enzyme pepsin 1 unit / g oil, 3% total water content
  • reaction variant 1 a crude rapeseed oil with the following starting contents was used: phosphorus 1200 ppm, calcium
  • PLA1 from Thermomyces lanuginosus
  • pepsin from Porcine gastric mucosa
  • Table 1 lists the associated analytical data: the phosphorus content dropped from 247 ppm to 14 ppm after 240 minutes; the
  • FIG. 3 shows the volume of the slime phase of a preconditioned crude oil treated with PLA1 and additionally with pepsin. It is evident from the associated analytical data from Table 3 that, surprisingly, a reduced mucus volume of 4.2% is achieved already after 120 minutes, compared to the slime volume of 5.0% when using the PLA1 alone (Table 2). In addition, the ion values (Table 3) are comparable to those of the reaction with the PLA1 alone, see Table 2. The content of free
  • Another enzyme comes to a greater reduction of the mucus phase and thus the Olausbeute the reaction is increased.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend mindestens ein Phospholipid-spaltendes Enzym und mindestens eine Protease. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Entschleimung von Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur Entschleimung von Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen.

Description

ZUSAMMENSETZUNG FÜR DIE ENZYMATIS CHE OLENT SCHLEIMUNG
Die Erfindung betrifft eine Zusammensetzung umfassend
mindestens ein Phospholipid-spaltendes Enzym und mindestens eine Protease. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Entschleimung von Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung sowie die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung zur
Entschleimung von Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen.
Triglyceride, die aus pflanzlichen Rohstoffen gewonnen werden, insbesondere rohe Pflanzenöle, enthalten Phosphatide, eiweiß- und kohlenhydrathaltige Stoffe, pflanzliche Schleimstoffe sowie kolloidale Verbindungen, die die Haltbarkeit des Öls stark herabsetzen und die Ausbeute des aufgereinigten Öles verringern. Diese Stoffe müssen daher entfernt werden.
Bei der Raffination von Pflanzenölen werden die unerwünschten BegleitStoffe entfernt, die das Öl unbrauchbar machen würden. Man unterscheidet zwischen chemischer und physikalischer
Raffination. Die chemische Raffination besteht aus den
Prozessen 1. Entschleimung, bei der Phospholipide und
Metallionen aus dem Öl entfernt werden, 2. Neutralisation mit Lauge, bei der die Fettsäuren extrahiert werden, 3. Bleichung zur Entfernung von Farbstoffen, weiterer Metallionen und restlichen Schleimstoffen, 4. Desodorierung, eine
Wasserdampfdestillation, bei der weitere Verbindungen entfernt werden, die den Geruch- und den Geschmack des Öls
beeinträchtigen. Bei der physikalischen Raffination wird die Entsäuerung zusammen mit der Desodorierung am Ende des
Raffinationsprozesses durchgeführt . Die Entschleimung der Öle kann durch Extraktion der Phospholipide mit Wasser oder einer wässrigen Lösung einer Säure erfolgen, die Ca2+- und Mg2+-Ionen komplexiert, wie z.B. Zitronensäure oder Phosphorsäure. Häufig führt man hierbei zunächst eine wässrige, sogenannte Vorentschleimung durch, mit der die wasserlöslichen Phospholipide entfernt werden. Man spricht hierbei von hydratisierbaren Phospholipiden .
Die Thematik der hydratisierbaren und nicht-hydratisierbaren Phospholipide ist beispielsweise beschrieben in Nielsen, K., Composition of difficultly extractable soy bean Phosphatides, J. Am. Oil. Chem. Soc. 1960, 37, 217-219 und A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2010, 112, 1178-1189. Dabei handelt es sich insbesondere um Phosphatidyl- Cholin und Phosphatidyl-Inositol . Die Behandlung mit
verdünnten wässrigen Calcium- und Magnesium-komplexierenden Säuren, wie z.B. Zitronensäure oder Phosphorsäure, führt nach dem Stand der Technik dazu, dass nicht-hydratisierbare
Phospholipide in hydratisierbare Phospholipide überführt werden. Eine Reduktion des Phosphorgehaltes auf 10 oder weniger ppm Phosphor im Öl muss für Nahrungsmittelanwendungen regelmäßig nachgewiesen werden (nach dem Stand der Technik bestimmt durch ICP/AES-Analyse des Öls) . Für Öle, die
beispielsweise zur Herstellung von Biodiesel eingesetzt werden, werden sogar noch strengere Anforderungen gestellt. Dort ist nach der EU-Norm der Phosphorgehalt des Biodiesels auf 5 ppm begrenzt und es ist zweckmäßig, die
Phosphorreduktion bereits ölseitig durchzuführen.
Ein Nachteil der konventionellen Ölentschleimungsprozesse liegt darin, dass sowohl die wässrige Vorentschleimung als auch die Behandlung mit wässrigen Säuren zu Ölverlusten führen, die dadurch verursacht sind, dass die in das Wasser überführten Phospholipide Emulgatoren darstellen, die einen Teil des Pflanzenöls in der wässrigen Phase emulgieren, wodurch Pflanzenöl verloren geht. Diese Verluste können im Bereich weniger Prozente bezogen auf das ursprünglich
eingesetzte Rohöl liegen. Als Faustregel gilt, dass mit je zwei Molekülen Phospholipid etwa ein Triglyceridmolekül emulgiert wird (beschrieben in WO 08/094847) .
Die sogenannte enzymatische Entschleimung vermeidet mehrere Nachteile der bestehenden Verfahren bzw. verbessert die
Extraktionsverfahren .
Die Verwendung von Phospholipasen, vor allem Phospholipase A, zur Entschleimung von Rohölen ist beispielsweise in der EP 0513709 Bl (sogenannter Enzymax®-Prozess der Firma Lurgi, Frankfurt) beschrieben. Es wird davon ausgegangen, dass die Abspaltung einer Fettsäure zu einem Lysolecithin führt, welches eine wesentlich geringere Emulgierkapazität für Öl hat und auch eine wesentlich höhere Wasserlöslichkeit besitzt. Dadurch wird sowohl die Ölausbeute erhöht als auch die
Wasserlöslichkeit der schwer hydratisierbaren Phospholipide verbessert. Der aktuelle Stand der Technik zur enzymatischen Ölentschleimung ist zusammengefasst in den beiden Artikeln von A.J. Dijkstra, Recent developments in edible oil processing, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2009, 111, 857-864, und dem
Artikel von A.J. Dijkstra, Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2010, 112, 1178-1189. Dort werden die Vor- und Nachteile der einzelnen Phospholipasen für die enzymatische Ölentschleimung diskutiert und auch die Vorbehandlungsmethoden mit unterschiedlichen Säuren angeführt.
Vom Standpunkt der Ölausbeute aus wäre es am günstigsten für die enzymatische Entschleimung, eine hochwirksame
Phospholipase C einzusetzen, die als Produkt ein Diglycerid liefert, welches im Öl löslich ist, und einen
Phosphatidylrest , wie z.B. Phosphatidyl-Cholin (ausgehend von Lecithin), welcher sehr gut wasserlöslich ist. Solche Enzyme hat die Firma Verenium in der US 7,226,771 beschrieben. Im Review-Artikel von Dijkstra zum Thema „Enzymatic degumming" wird als Nachteil dieses Systems angeführt, dass es nicht alle Phospholipide umsetzt, sondern lediglich Phosphatidyl-Cholin und Phosphatidyl-Inositol , während die schwer hydratisierbaren Ethanolamine und Phosphatidsäuren unangetastet bleiben. Dieser Nachteil hat dazu geführt, dass in Folgeentwicklungen die Phospholipase C entweder mit Phospholipasen A oder mit
Lipidacyltransferasen kombiniert wurde. Eine Kombination von Phospholipasen A mit Phospholipasen C zur Ölentschleimung ist in der WO 08/094847 beschrieben. In dieser Patentschrift wird angeführt, dass die Mischung von Phospholipase A und
Phospholipase C einerseits zu einem Synergistischen Effekt bei der Ölausbeute führt, andererseits sich damit sehr niedrige Phosphorgehalte im Öl mit verträglichen Reaktionszeiten einstellen lassen.
Die Kombination von Phospholipase C mit Lipidacyltransferasen ist in der WO 2009/081094 beschrieben. Auch hier wird
angeführt, dass die Kombination der Acyltransferase mit der Phospholipase C zu einer Erhöhung der Ölausbeute führt.
Eine weitere Variante der enzymatischen Ölentschleimung stellt die enzymatische Behandlung der abgetrennten Schleimphase dar, nachdem das Öl nach konventionellen Verfahren wie z.B. mit Wasser und/oder Zitronensäure entschleimt wurde. Durch diese Behandlung ist es möglich, einen Teil des in der Schleimphase emulgierten Pflanzenöles wiederzugewinnen. Dieser Prozess ist beispielsweise auch in dem Review-Artikel A.J. Dijkstra,
Enzymatic degumming, Eur. J. Lipid Sei. Technol. 2010, 112, 1178-1189 S. 1184 diskutiert.
Des Weiteren beschreibt die PCT/EP2013/053199 ein Verfahren, bei dem Rohöl mit einer Enzymkombination aus einem
Phospholipid-spaltenden Enzym und einer Glykosidase
entschleimt wird. Ein weiteres Verfahren des Standes der Technik, das in der EP 13166529.1 beschrieben wird, setzt im Rahmen einer enzymatischen Entschleimung eine Phosphatase ein.
Der Aspekt der Nachhaltigkeit des Einsatzes von Phospholipasen gegenüber anderen Entschleimungsmethoden ist schließlich im Artikel L. De Maria & J. Vind & K. M. Oxenboll & A. Svendsen & S. Patkar, Phospholipases and their industrial applications, Appl Microbiol Biotechnol (2007) 74:290-300 S. 96 und 97 beschrieben. Am Beispiel einer Ölmühle, die von einem
konventionellen Entschleimungsprozess auf einen Prozess mit Phospholipase A umgestellt wurde und in der pro Jahr 266 000 t Sojaöl aufgereinigt werden, wurde gezeigt, dass dort pro Jahr 120000 GJ Energie und 12000 t C02 Äquivalente eingespart werden können. Die eingesparten C02-Äquivalente entsprechen den
Emissionen von 1600 durchschnittlichen Erdbewohnern.
Aufgrund der weltweiten Zunahme des Verbrauchs an Speiseöl und der immer stärker werdenden Nutzung von Pflanzenölen als
Rohstoffe für die chemische Industrie und als Treibstoff besteht ständig weiterer Bedarf, die Entschleimung von
Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen, insbesondere von
Pflanzenölen und/oder Pflanzenölschleimen, zu verbessern.
Die Erfinder der vorliegenden Anmeldung haben sich daher die Aufgabe gestellt, ein alternatives enzymatisches Verfahren zu den aus dem Stand der Technik bekannten Verfahren zur
Entschleimung von Triglycerid-haltigen Zusammensetzungen, insbesondere rohen Pflanzenölen zu entwickeln, mit denen der Phosphorgehalt des zu entschleimenden Triglycerids bzw. der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung weiter verringert, die Ölausbeute erhöht und/oder die Reaktionsgeschwindigkeit der enzymatischen Entschleimung erhöht wird. Gleichzeitig soll dieses Verfahren eine wirtschaftliche Durchführung im
großtechnischen Maßstab ermöglichen. Enzymaktivität wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung als eine chemische Reaktion definiert, die von einem oder mehreren katalytischen Proteinen (Enzymen) katalysiert wird. Dabei wird ein Enzymsubstrat zu einem oder mehreren Produkten umgesetzt. Bestimmte Enzyme oder Enzymzusammensetzungen besitzen eine oder sogar mehrere Enzymaktivitäten. Ein reines Enzym kann z. B. mehr als eine Reaktion katalysieren (Umsetzung von einem Substrat zu Produkt (en) ) , hat daher mehr als eine
Enzymaktivität. Viele Enzymzusammensetzungen sind keine biochemisch reinen Produkte und haben somit mehrere
Enzymaktivitäten. Die Enzymaktivität steht im Zusammenhang mit der Reaktionsgeschwindigkeit. Sie gibt an, wie viel aktives Enzym sich in einer Enzymzusammensetzung befindet. Die
Einheiten der Enzymaktivität sind Unit (U) , wobei 1 U
definiert ist als diejenige Menge Enzym, welche unter
angegebenen Bedingungen ein Mikromol Substrat pro Minute umsetzt: 1 U = 1 pmol/min.
Diese Aufgabe wurde durch eine Zusammensetzung gelöst
umfassend eine erste Enzymkomponente, umfassend mindestens ein Phospholipid-spaltendes Enzym, sowie eine zweite
Enzymkomponente umfassend mindestens eine Protease
("erfindungsgemäße Zusammensetzung") . Im Rahmen der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem „Phospholipid-spaltenden Enzym" bevorzugt um eine
Phospholipase, die in der Lage ist, entweder einen
Fettsäurerest oder einen Phosphatidylrest oder eine Kopfgruppe von einem Phospholipid abzuspalten. Des Weiteren handelt es sich bei dem „Phospholipid-spaltenden Enzym" bevorzugt um eine Acyltransferase, bei der die Abspaltung des Fettsäurerests mit einer Übertragung dieses Restes, gefolgt von einer
Esterbildung, mit einem freien Sterol in der Ölphase verbunden ist . Phospholipasen sind Enzyme, die zur Gruppe der Hydrolasen gehören und die die Esterbindung von Phospholipiden
hydrolysieren . Phospholipasen werden nach ihrer
Regioselektivität bei Phospholipiden in 5 Gruppen eingeteilt:
Phospholipasen AI (PLA1), die die Fettsäure in der snl- Position unter Bildung des 2-Lysophospholipids abspalten.
Phospholipasen A2 (PLA2), die die Fettsäure in der sn2- Position unter Bildung des 1-Lysophospholipids abspalten.
Phospholipasen C (PLC) , die einen Phosphorsäuremonoester abspalten . Phospholipasen D (PLD) , die die Kopfgruppe abspalten oder austauschen .
Phospholipasen B (PLB) , die die Fettsäure sowohl in der snl- Position als auch in der sn2-Position unter Bildung eines 1,2- Lysophospholipids abspalten.
Unter einer Acyltransferase versteht man im Rahmen der
vorliegenden Erfindung ein Enzym, das Acylgruppen, z. B.
Fettsäuren aus einem Phospholipid, auf einen geeigneten
Akzeptor, z. B. ein Sterol, unter Bildung eines Esters überträgt .
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung, bei der die erste
Enzymkomponente ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2, Phospholipase C,
Phospholipase B, Phospholipase D, Acyltransferase und deren Mischungen. Die Enzyme können dabei von einem beliebigen
Organismus (z.B. auch isoliert aus einem thermophilen
Organismus) oder einer synthetischen Quelle stammen. Die Enzyme können dabei tierischen Ursprungs, z.B. aus dem Pankreas, pflanzlichen Ursprungs oder mikrobiellen Ursprungs sein, z. B. aus Hefe, Pilzen, Algen oder Bakterien stammen. Es ist im Rahmen der vorliegenden Erfindung auch möglich, dass innerhalb der Enzymkomponenten jeweils Enzyme gleicher Art eingesetzt werden, die jedoch aus unterschiedlichen Quellen bzw. Spezies stammen. Ebenso sind rekombinant hergestellte, Chimäre Fusionsproteine aus zwei oder mehreren verschiedenen Spezies mit enzymatischer Aktivität umfasst.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung werden Phospholipase AI, Phospholipase A2, Phospholipase C, Phospholipase B,
Phospholipase D, Acyltransferase und deren Mischungen
bevorzugt aus folgenden Spezies eingesetzt: Schweinepankreas , Rinderpankreas , Schlangengift, Bienengift, Aspergillus,
Bacillus, Citrobacter, Clostridium, Dictyostelium,
Edwardsieila, Enterobacter, Escherichia, Erwinia, Fusarium, Klebsiella, Listeria, Mucor, Naja, Neurospora, Pichia,
Proteus, Pseudomonas, Providencia, Rhizomucor, Rhizopus,
Salmonella, Sclerotinia, Serratia, Shigella, Streptomyces ,
Thermomyces, Trichoderma, Trichophyton, Whetzelinia, Yersinia.
Besonders bevorzugt werden Phospholipase AI, Phospholipase A2, Phospholipase C, Phospholipase B, Phospholipase D,
Acyltransferase und deren Mischungen aus Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus alvei, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus anthracis,
Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii,
Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus
sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus pseudoanthracis, Citrobacter amalonaticus,
Citrobacter braakii, Citrobacter farmeri, Citrobacter freundii, Citrobacter gillenii, Citrobacter koseri, Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae,
Clostridium perfringens, Dictyostelium discoideum,
Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium polycephalum,
Edwardsieila hoshinae, Edwardsieila ictaluri, Edwardsieila tarda, Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes,
Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, Enterobacter intermedius, Enterobacter pyrinus, Escherichia albertii,
Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia senegalensis, Escherichia vulneris, Erwinia amylovora, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia oleae, Erwinia mallotivora, Erwinia papayae, Erwinia
persicina, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia rhapontici, Erwinia tasmaniensis, Erwinia toletana, Erwinia tracheiphila, Fusarium avenaceum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, Fusarium coeruleum,
Fusarium culmorum, Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium
napiforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium
sporotrichiella, Fusarium tricinctum, Fusarium proliferatum, Fusarium sacchari, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium tabacinum, Fusarium
verticillioides, Klebsiella oxytoca, Klebsiella mobilis,
Klebsiella singaporensis, Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana, Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora gaiapagosensis,
Neurospora intermedia, Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri, Pichia
kudriavzevii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens,
Pichia nakasei, Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola,
Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens,
Proteus penneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia Stuartii,
Rhizomucor endophyticus, Rhizomucor miehei, Rhizomucor
pakistanicus, Rhizomucor pusillus, Rhizomucor tauricus,
Rhizomucor variabilis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus
azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus,
Rhizopus oryzae, Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis,
Rhizopus stolonifer, Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium, Sclerotinia borealis, Sclerotinia homoeocarpa, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia
sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia
trifoliorum, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia quinivorans, Serratia rubidaea,
Serratia symbiotica, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces avermitilis, Streptomyces carcinostaticus,
Streptomyces cervinus, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces coeruleorubidus, Streptomyces
davawensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus,
Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lavendulae,
Streptomyces lincolnensis, Streptomyces natalensis, Streptomyces nodosus, Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini,
Streptomyces venezuelae, Streptomyces violaceoniger,
Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosa,
Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum,
Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton gourvilii, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii,
Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme,
Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton simii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton
violaceum, Trichophyton yaoundei, Whetzelinia sclerotiorum, Yersinia aldovae, Yersinia aleksiciae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia massiliensis, Yersinia mollaretii, Yersinia pestis, Yersinia
pseudotuberculosis, Yersinia rohdei, Yersinia ruckeri,
Yersinia similis eingesetzt.
In einer besonders bevorzugen Ausführungsform werden
Phospholipase Ai, Phospholipase A2, Phospholipase B,
Phospholipase C und/oder Phospholipase D eingesetzt, die aus Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Bacillus cereus,
Bacillus megaterium, Bacillus subtilis, Citrobacter freundii, Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae, Edwardsieila tarda, Erwinia herbicola, Escherichia coli Clostridium
perfringens, Dictyostelium discoideum, Fusarium oxysporium, Klebsiella pneumoniae, Listeria monocytogenes, Mucor
javanicus, Mucor mucedo, Mucor subtilissimus, Naja mossambica, Neurospora crassa, Pichia pastoris (Komagataella pastoris), Pseudomonas spezies, Proteus vulgaris, Providencia Stuartii, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Rhizopus stolonifer Salmonella typhimurium, Serratia
marcescens, Serratia liquefaciens, Sclerotinia libertiana, Shigella flexneri, Streptomyces violaceoruber, Trichophyton rubrum, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei,
Whetzelinia sclerotiorum, Yersinia enterocolitica,
Schweinepankreas , Rinderpankreas , Schlangengift oder
Bienengift stammen. Das mindestens eine Enzym der ersten Enzymkomponente kann dabei aus der gleichen oder aus unterschiedlichen Quellen stammen, bevorzugt aus einem oder aber auch aus mehreren der vorgenannten Organismen, besonders bevorzugt aus Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Fusarium oxysporium, Naja
mossambica, Pichia pastoris (Komagataella pastoris) ,
Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosus,
Trichoderma reesei, Schweinepankreas oder Rinderpankreas.
Unter dem Begriff "Protease" werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung ein oder mehrere Enzyme oder Enzymzusammensetzungen aus der Enzymklasse 3.4 (Peptidhydrolasen) verstanden. Dies schließt die Begriffe Peptidasen und oder Proteinasen mit ein. Proteasen katalysieren die Hydrolyse von Peptidbindungen . Die Enzyme können dabei tierischen Ursprungs, z.B. aus
Magenschleimhaut, pflanzlichen Ursprungs oder mikrobiellen Ursprungs, z. B. aus Hefe, Pilzen, Algen oder Bakterien stammen. Insbesondere kann es sich bevorzugt um ein oder mehrere Enzyme der folgenden Protease-Enzymklassen handeln: Aminopeptidasen, Aspartatendopeptidasen, Dipeptidasen,
Dipeptidylpeptidasen, Tripeptidylpeptidasen,
Peptidyldipeptidasen, Carboxypeptidase des Typs Serin,
Metallocarboxypeptidasen, Carboxypeptidasen des Typs Cystein, Omegapeptidasen, Serin-Endopeptidasen, Cystein-Endopeptidasen, Asparagin-Endopeptidasen, Metalloendopeptidasen, Threonin- Endopeptidasen, Endopeptidasen, wobei besonders bevorzugt Aspartatendopeptidasen, Serin-Endopeptidasen oder
Metalloendopeptidasen eingesetzt werden.
Bevorzugt werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung die genannten Proteasen aus folgenden Spezies eingesetzt:
Magenschleimhaut aus dem Säugetier, Schweinepankreas,
Rinderpankreas , Aspergillus, Bacillus, Citrobacter,
Clostridium, Dictyostelium, Edwardsieila, Enterobacter, Escherichia, Erwinia, Fusarium, Klebsiella, Listeria, Mucor, Naja, Neurospora, Pichia, Proteus, Pseudomonas, Providencia, Rhizomucor, Rhizopus, Salmonella, Sclerotinia, Serratia, Shigella, Streptomyces , Thermomyces, Trichoderma,
Trichophyton, Whetzelinia, Yersinia.
Besonders bevorzugt werden die Protease und deren Mischungen aus Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus fumigatus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger,
Aspergillus oryzae, Aspergillus sojae, Bacillus alvei,
Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus anthracis, Bacillus atrophaeus, Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus coagulans, Bacillus larvae, Bacillus laterosporus, Bacillus megaterium, Bacillus natto, Bacillus pasteurii, Bacillus pumilus, Bacillus sphaericus, Bacillus sporothermodurans, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Bacillus
pseudoanthracis, Bacillus polymyxa, Citrobacter amalonaticus, Citrobacter braakii, Citrobacter farmeri, Citrobacter
freundii, Citrobacter gillenii, Citrobacter koseri,
Citrobacter murliniae, Citrobacter rodentium, Citrobacter sedlakii, Citrobacter werkmanii, Citrobacter youngae,
Clostridium perfringens, Dictyostelium discoideum,
Dictyostelium mucoroides, Dictyostelium polycephalum,
Edwardsieila hoshinae, Edwardsieila ictaluri, Edwardsieila tarda, Enterobacter amnigenus, Enterobacter aerogenes,
Enterobacter cloacae, Enterobacter gergoviae, Enterobacter intermedius, Enterobacter pyrinus, Escherichia albertii, Escherichia blattae, Escherichia coli, Escherichia fergusonii, Escherichia hermannii, Escherichia senegaiensis, Escherichia vulneris, Erwinia amylovora, Erwinia aphidicola, Erwinia billingiae, Erwinia carotovora, Erwinia herbicola, Erwinia oleae, Erwinia mallotivora, Erwinia papayae, Erwinia
persicina, Erwinia piriflorinigrans, Erwinia psidii, Erwinia pyrifoliae, Erwinia rhapontici, Erwinia tasmaniensis, Erwinia toletana, Erwinia tracheiphila, Fusarium avenaceum, Fusarium avenaceum, Fusarium chlamydosporum, Fusarium coeruleum,
Fusarium culmorum, Fusarium dimerum, Fusarium incarnatum, Fusarium heterosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium
napiforme, Fusarium oxysporum, Fusarium poae, Fusarium
sporotrichiella, Fusarium tricinctum, Fusarium proliferatum, Fusarium sacchari, Fusarium solani, Fusarium sporotrichioides, Fusarium subglutinans, Fusarium tabacinum, Fusarium
verticillioides, Klebsiella oxytoca, Klebsiella mobilis,
Klebsiella singaporensis, Klebsiella granulomatis, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella variicola, Listeria monocytogenes, Mucor amphibiorum, Mucor circinelloides, Mucor hiemalis, Mucor indicus, Mucor javanicus, Mucor mucedo, Mucor paronychius, Mucor piriformis, Mucor subtilissimus, Mucor racemosus, Naja mossambica, Neurospora Africana, Neurospora crassa, Neurospora discrete, Neurospora dodgei, Neurospora gaiapagosensis,
Neurospora intermedia, Neurospora lineolata, Neurospora pannonica, Neurospora sitophila, Neurospora sublineolata, Neurospora terricola, Neurospora tetrasperma, Pichia barkeri, Pichia cactophila, Pichia cecembensis, Pichia cephalocereana, Pichia deserticola, Pichia eremophilia, Pichia exigua, Pichia fermentans, Pichia heedii, Pichia kluyveri, Pichia
kudriavzevii, Pichia manshurica, Pichia membranifaciens,
Pichia nakasei, Pichia norvegensis, Pichia orientalis, Pichia pastoris, Pichia pseudocactophila, Pichia scutulata, Pichia sporocuriosa, Pichia terricola, Proteus hauseri, Proteus mirabilis, Proteus myxofaciens, Proteus penneri, Proteus vulgaris, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Pseudomonas syringae, Providencia rettgeri, Providencia Stuartii, Rhizomucor endophyticus,
Rhizomucor miehei, Rhizomucor pakistanicus, Rhizomucor
pusillus, Rhizomucor tauricus, Rhizomucor variabilis, Rhizopus arrhizus, Rhizopus azygosporus, Rhizopus circinans, Rhizopus japonicus, Rhizopus microsporus, Rhizopus nigricans, Rhizopus oligosporus, Rhizopus oryzae, Rhizopus schipperae, Rhizopus sexualis, Rhizopus stolonifer, Rhizopus artocarpi, Salmonella bongori, Salmonella enterica, Salmonella typhimurium,
Sclerotinia borealis, Sclerotinia homoeocarpa, Sclerotinia libertiana, Sclerotinia minor, Sclerotinia ricini, Sclerotinia sclerotiorum, Sclerotinia spermophila, Sclerotinia
trifoliorum, Serratia entomophila, Serratia ficaria, Serratia fonticola, Serratia grimesii, Serratia liquefaciens, Serratia marcescens, Serratia odorifera, Serratia plymuthica, Serratia proteamaculans, Serratia quinivorans, Serratia rubidaea,
Serratia symbiotica, Shigella dysenteriae, Shigella flexneri, Shigella boydii, Shigella sonnei, Streptomyces achromogenes, Streptomyces ambofaciens, Streptomyces aureofaciens,
Streptomyces avermitilis, Streptomyces carcinostaticus,
Streptomyces cervinus, Streptomyces clavuligerus, Streptomyces coelicolor, Streptomyces coeruleorubidus, Streptomyces
davawensis, Streptomyces fradiae, Streptomyces griseus,
Streptomyces hygroscopicus, Streptomyces lavendulae,
Streptomyces lincolnensis, Streptomyces natalensis,
Streptomyces nodosus, Streptomyces noursei, Streptomyces peuceticus, Streptomyces platensis, Streptomyces rimosus, Streptomyces spectabilis, Streptomyces toxytricini,
Streptomyces venezuelae, Streptomyces violaceoniger,
Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosa,
Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma pseudokoningii, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, Trichophyton concentricum,
Trichophyton eboreum, Trichophyton equinum, Trichophyton gourvilii, Trichophyton kanei, Trichophyton megninii, Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton raubitschekii, Trichophyton rubrum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton simii, Trichophyton soudanense, Trichophyton terrestre, Trichophyton tonsurans, Trichophyton vanbreuseghemii, Trichophyton verrucosum, Trichophyton violaceum, Trichophyton yaoundei, Whetzelinia sclerotiorum, Yersinia aldovae, Yersinia aleksiciae, Yersinia bercovieri, Yersinia enterocolitica, Yersinia frederiksenii, Yersinia intermedia, Yersinia kristensenii, Yersinia massiliensis, Yersinia mollaretii, Yersinia pestis, Yersinia
pseudotuberculosis, Yersinia rohdei, Yersinia ruckeri,
Yersinia similis eingesetzt.
Bevorzugt werden im Rahmen der vorliegenden Erfindung
Proteasen aus folgenden Spezies eingesetzt: Proteasen aus Magenschleimhaut eines Säugetiers, Schweinepankreas ,
Rinderpankreas, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae,
Aspergillus saitoi, Aspergillus sojae, Bacillus cereus,
Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus polymyxa, Bacillus subtilis, Escherichia coli Clostridium perfringens, Pichia pastoris (Komagataella pastoris),
Pseudomonas spezies, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Rhizopus japonicus, Rhizopus stolonifer, Salmonella
typhimurium, Serratia marcescens, Serratia liquefaciens, Streptomyces griseus, Streptomyces violaceoruber, Thermomyces lanuginosus, Trichoderma reesei, Yersinia enterocolitica .
Die mindestens eine Protease der zweiten Enzymkomponente kann dabei aus der gleichen oder aus unterschiedlichen Quellen stammen, bevorzugt aus einem oder aber auch aus mehreren der vorgenannten Organismen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Menge des/der Enzyms/der Enzyme der ersten Enzymkomponente im Bereich von 1 ppm bis 1000 ppm, bevorzugter von 1 bis 250 ppm, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 200 ppm in Bezug auf die
Ölmenge gewählt. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität der zweiten Enzymkomponente im Bereich von 1 ppm bis 1000 ppm, bevorzugter von 1 bis 250 ppm,
besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 200 ppm in Bezug auf die Ölmenge gewählt .
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität des/der Enzyms/der Enzyme der ersten Enzymkomponente im
Bereich von 0,01 bis 10 units/g Öl gewählt, bevorzugter im Bereich von 0,1 bis 5 units/g Öl, besonders bevorzugt im
Bereich von 0,2 bis 3 units/g Öl und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 2 units/g Öl. In einer weiteren
bevorzugten Ausführungsform wird die Enzymaktivität der zweiten Enzymkomponente im Bereich von 0,01 bis 10 units/g Öl, bevorzugt 0,1 bis 5 units/g Öl, und besonders bevorzugt im Bereich von 0,2 bis 3 units/g Öl, und am meisten bevorzugt im Bereich von 0,3 bis 2 units/g Öl gewählt. (Unit:
Internationale Einheit für Enzymaktivität; 1 Unit entspricht dem Substratumsatz von 1 pmol/min) .
Besonders bevorzugt sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen, bei denen das Verhältnis der Enzymaktivität der ersten Enzymkomponente zu der Enzymaktivität der zweiten Enzymkomponente im Bereich von 0,001 : 20 bis 20 : 0,001 liegt, bevorzugt im Bereich von 0,1 : 10 bis 10 : 0,1, weiter bevorzugt im Bereich von 0,25 : 7,5 bis 7,5 : 0,25, weiter bevorzugt von 0,5 : 5 bis 5 : 0,5 und am meisten bevorzugt im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 5.
Mit der Einhaltung des erfindungsgemäß bevorzugten
Verhältnisses der ersten Enzymkomponente zur zweiten
Enzymkomponente lässt sich das Volumen der Schleimphase weiter reduzieren. Dies bedeutet eine Steigerung der Ölausbeute. Die Enzyme der ersten und/oder zweiten Enzymkomponente können beispielsweise gefriergetrocknet und in entsprechendem
Enzympuffer (Standardpuffer für jedes Enzym sind in der
Literatur beschrieben) gelöst verwendet werden, z.B.
Citratpuffer 0,1 M, pH 5 oder Acetatpuffer 0,1 M, pH 5. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Enzyme in
Enzympuffer aufgenommen und dem Rohöl zugesetzt. Um eine bessere Löslichkeit der Enzyme - insbesondere in den
Phospholipase-enthaltenden erfindungsgemäßen Zusammensetzungen - zu erreichen, ist auch der Zusatz von organischen
Lösungsmitteln möglich. Diese finden Anwendung z.B. in der Auftrennung der Phospholipide und sind in der Literatur beschrieben. Bevorzugt verwendet werden unpolare organische Lösungsmittel wie z.B. Hexan oder Aceton oder Mischungen, bevorzugt in einer Menge von 1 bis 30 Gew.-% (Beispiele möglicher Lösungsmittel sind beschrieben in der EP 1531182 A2) .
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die erste und/oder zweite Enzymkomponente in geträgerter Form
eingesetzt. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bevorzugte Trägermaterialien sind anorganische Trägermaterialien, wie z.B. Kieselgele, Fällungskieselsäuren, Silikate oder
Alumosilikate, und organische Trägermaterialien, wie z.B.
Methacrylate oder Ionentauscherharze . Die Trägermaterialien erleichtern die Wiederverwertbarkeit der Enzyme aus der Öl- Wasser-Emulsion in einem folgenden Verfahrensschritt und tragen zur Wirtschaftlichkeit des Verfahrens bei. In einer ebenfalls bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Zusammensetzung ein oder mehrere weitere Bestandteile, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Citratpuffer und Acetatpuffer. Die Erfinder der vorliegenden Zusammensetzung haben überraschend herausgefunden, dass eine Kombination der
vorstehend definierten Enzymkomponenten (erste und zweite Enzymkomponente) besonders wirkungsvoll und effektiv die
Emulgierbarkeit von Triglyceriden in wässrigen Phasen
verringert. Daher kann die erfindungsgemäße Zusammensetzung besonders vorteilhaft für die Entschleimung von Triglycerid- haltigen Zusammensetzungen wie rohem Pflanzenöl oder auch von Pflanzenölschleim eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft daher in einem weiteren Aspekt ein Verfahren zur Entschleimung von Triglycerid- haltigen Zusammensetzungen umfassend die Schritte a) in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wie vorstehend definiert; b) Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung.
Erstaunlicherweise wurde hierbei gefunden, dass es durch das erfindungsgemäße Verfahren gelingt, den Phospholipidgehalt der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung gegenüber dem reinen Einsatz von Phospholipid-spaltendem Enzym weiter abzusenken, die Ölausbeute zu erhöhen, die Reaktionsgeschwindigkeit bei der enzymatischen Entschleimung zu erhöhen, das Schleimvolumen zu erniedrigen und/oder die Abtrennbarkeit der gebildeten Schleimphase zu verbessern. Dabei wird der Phosphorwert auf unter 20 ppm gesenkt, besonders bevorzugt auf unter 10 ppm, ganz besonders bevorzugt auf unter 4 ppm Phosphor.
Weiterhin ist es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren möglich, den Calcium- und Magnesiumgehalt der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung, insbesondere rohen Pflanzenöls, auf unter 20 ppm zu senken, besonders bevorzugt auf unter 15 ppm, ganz besonders bevorzugt auf unter 10 ppm, ebenfalls bevorzugt auf unter 8 ppm und am meisten bevorzugt auf unter 4 ppm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Calcium- und Magnesiumgehalt auf unter 3 ppm gesenkt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist dabei besonders vorteilhaft, da durch den Einsatz der Protease die Wirkung des Phospholipid-spaltenden Enzyms verbessert wird. Durch den Einsatz der Protease erfolgt eine Erniedrigung der Viskosität der Ölschleimphase sowie eine Erhöhung der Beweglichkeit der Phospholipide . Auch wird die Zugänglichkeit der Phospholipid- Moleküle für das Phospholipid-spaltende Enzym erhöht, die sich an der Grenzfläche Schleimphase/Öl befinden.
Durch das erfindungsgemäße Kombinieren von mindestens einem Phospholipid-spaltenden Enzym mit mindestens einer Protease ist es zudem möglich, die Dosierung der Phospholipid- spaltenden Enzyme, wie z.B. der Phospholipase AI oder A2 gegebenenfalls kombiniert mit Phospholipase C, zu verringern und so neben den oben angeführten Vorteilen für den Prozess auch Kosten zu sparen.
Unter dem Begriff „Triglyceride" werden im Rahmen der
vorliegenden Erfindung dreifache Ester des Glycerins mit
Fettsäuren verstanden, die den Hauptbestandteil von
natürlichen Fetten und Ölen darstellen, sei es pflanzlichen oder tierischen Ursprungs. Triglycerid-haltige
Zusammensetzungen im Sinne der vorliegenden Erfindung umfassen pflanzliche oder tierische Fette und Öle, und deren Mischungen sowohl untereinander als auch mit synthetischen bzw.
modifizierten Fetten und Ölen. Die Begriffe werden nachfolgend näher definiert. Unter dem Begriff „Pflanzenöl" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes Öl pflanzlichen Ursprungs verstanden.
Bevorzugte besonders geeignete Öle sind Sojaöl, Rapsöl,
Canolaöl, Sonnenblumenöl, Olivenöl, Palmöl, Jatrophaöl,
Leindotteröl , Baumwollsaatöl und deren Mischungen. Besonders geeignet sind „rohe Pflanzenöle". Die Bezeichnung „roh" bezieht sich dabei darauf, dass das Öl noch keinem
Entschleimungs-, Neutralisations-, Bleichungs- und/oder
Desodorierungsschritt unterzogen wurde. Es ist im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens auch möglich, dass eine Mischung mehrerer Rohöle eingesetzt wird oder vorbehandelte, z.B.
vorentschleimte und/oder vorkonditionierte Öle mit den Enzymen behandelt werden. Unter „Schleimphase", „Schleimstoffe", „Pflanzenölschleim" versteht man im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle Stoffe, die nach Behandlung mit einer säurehaltigen und/oder wässrigen Lösung aus der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung als schwere Phase ausfallen (Michael Bokisch: Fats and Oils
Handbook, AOCS Press, Champaign, Illinois, 1998, Seite 428- 444. Die Begriffe „Schleimphase", „Schleimstoffe",
„Pflanzenölschleim" werden dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Die Verwendung dieses
Pflanzenölschleims als Ausgangsmaterial ist insbesondere für die Gewinnung von Lecithin von Bedeutung, da Lecithin ein wesentlicher Bestandteil des Pflanzenölschleims ist.
Unter dem Begriff "Vorentschleimung" bzw. "Nassentschleimung" wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung eine Behandlung des Rohöls mit Wasser oder einer wässrigen Säurelösung verstanden, um wasserlösliche Phospholipide weitestgehend aus dem Öl zu entfernen. Die Begriffe "Vorentschleimung" und
"Nassentschleimung" werden dabei im Rahmen der vorliegenden Erfindung synonym verwendet. Auch kann im Rahmen einer Vor¬ bzw. Nassentschleimung nach der Säurezugabe ggf. eine Zugabe von Alkali erfolgen, um die Säure zu neutralisieren. Vor der Enzymzugabe erfolgt die Abtrennung der wässrigen Phase. Nach einer Vorentschleimung wird der Phosphorgehalt im Rohöl von ca. 500-1500 ppm, z.B. für Soja und Raps auf unter 200 ppm im vorentschleimten Öl gesenkt. Durch die Vorentschleimung kann z.B. Lecithin aus der entstandenen Schleimphase gewonnen werden bzw. die Schleimphase als Futtermittel aufgearbeitet werden. Der Nachteil der Abtrennung der wässrigen Phase bzw. der Senkung des Phosphorgehaltes ist jedoch ein
Ausbeuteverlust bezüglich des Öls. Die in die wässrige Phase übergehenden Phosphatide wirken emulgierend und führen dazu, dass ein Teil des Öls in der wässrigen Phase emulgiert und mit dieser abgetrennt wird. Anschließend kann das Öl enzymatisch weiterbehandelt werden.
Unter dem Begriff "Vorkonditionierung" des Öls wird im Rahmen der vorliegenden Erfindung die Zugabe von Wasser bzw. einer wässrigen Säurelösung zu dem unbehandelten Öl verstanden.
Anschließend wird durch Zugabe von Alkali, z. B. Natronlauge, ein pH-Wert eingestellt, bei dem die folgende enzymatische Reaktion stattfindet. Idealerweise wird der für die
Enzymreaktion optimale pH-Wert von 3,5 bis 7 eingestellt.
Anschließend erfolgt jedoch keine Abtrennung der wässrigen Phase, sondern unmittelbar die Zugabe der Enzyme. Die
vorhandenen Schleimstoffe verbleiben also vorerst im Öl bzw. in der Emulsion. Die Abtrennung der wässrigen Phase und damit der Enzyme erfolgt erst nach Einwirkung der Enzyme auf das (ggfs. vorkonditionierte) Rohöl. In einer bevorzugten Ausführungsform kann eine Zugabe von
Wasser bzw. einer wässrigen Säurelösung und ggf. von Alkali zur Neutralisierung der Säure zum Rohöl im Sinne einer
Vorkonditionierung erfolgen, jedoch unterbleibt die Abtrennung der wässrigen Phase vor der Zugabe der Enzyme. Durch den
Verzicht auf den Abtrennungsschritt vor der Zugabe der Enzyme ist eine weitere Steigerung der Ölausbeute möglich. Eine
Steigerung der Ölausbeute um einen Prozentpunkt hat eine enorme wirtschaftliche Bedeutung, da dieses Prozent ca.
400.000 t Öl entspricht, bezogen auf die jährliche Produktion von z. B. Sojaöl. Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt somit in dieser bevorzugten Ausführungsform die unmittelbare
Verwendung von Rohölen aus Soja bzw. Raps mit Phosphorgehalten von 100 bis 1.500 ppm Phosphor. Überdies stellt es eine
Vereinfachung des Verfahrens dar, weil der Trennschritt vor Enzymzugabe entfällt.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform werden in
Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens - abgesehen von etwaigen bereits vorhandenen Emulgatoren, wie z.B. Lecithin - keine zusätzlichen Emulgatoren, wie z.B. Natriumdocecylsulfat (SDS) , zugegeben. Ebenso kommt das erfindungsgemäße Verfahren bevorzugt ohne die Zugabe von Salzen, wie z.B. Calciumchlorid (CaCl2) aus. Für die Entschleimung von Sojaöl oder Rapsöl oder
Sonnenblumenöl ist insbesondere eine Kombination der
Phospholipase AI aus Thermomyces lanuginosus oder Fusarium oxysporium und/oder der Phospholipase A2 aus Schweinepankreas oder Rinderpankreas oder Trichoderma reesei oder Streptomyces violaceoruber oder Aspergillus niger und/oder Phospholipase C aus Pichia pastoris mit einer Protease aus Magen oder Bacillus amyloliquifaciens oder Bacillus subtilis oder Bacillus
licheniformis oder Aspergillus niger oder Aspergillus oryzae bevorzugt .
Das „in-Kontakt-Bringen" gemäß Schritt a) des
erfindungsgemäßen Verfahrens kann im Rahmen des
erfindungsgemäßen Verfahrens auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugte Art des in-Kontakt-Bringens gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens ist dabei ein Vermischen der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung und der erfindungsgemäßen Zusammensetzung . Nach dem in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Mischung aus der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung und der erfindungsgemäßen Zusammensetzung bevorzugt gerührt, besonders bevorzugt mit einem Flügelrührer bei 200 bis 800 U/min, bevorzugt 250 bis 600 U/min und am meisten bevorzugt bei 300 bis 500 U/min.
Die Temperatur der Mischung liegt während des in-Kontakt- Bringens gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt im Bereich von 15 bis 99 °C, bevorzugter im Bereich von 20 bis 95 °C, weiter bevorzugt von 22 bis 75 °C, ebenfalls bevorzugt von 25 bis 65 °C, weiter bevorzugt von 30 bis 60 °C und am meisten bevorzugt von 32 bis 55 °C. Dabei muss die Temperatur der Mischung immer so gewählt werden, dass die Denaturierungstemperatur der Enzyme nicht überschritten wird, bevorzugt liegt die Temperatur der Mischung mindestens 5 °C unter der Denaturierungstemperatur der Enzyme bzw. Die Dauer des in-Kontakt-Bringens gemäß Schritt a) des
erfindungsgemäßen Verfahrens liegt dabei bevorzugt im Bereich von 1 Minute bis 12 Stunden, bevorzugter von 5 Minuten bis 10 Stunden, ebenfalls bevorzugt von 10 Minuten bis 6 Stunden, weiter bevorzugt von 10 Minuten bis 3 Stunden.
Der pH Wert der Mischung liegt während des in-Kontakt-Bringens gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bevorzugt im Bereich von pH 3 bis pH 7,5, bevorzugter im Bereich von pH 4 bis pH 6 und besonders bevorzugt im Bereich von pH 4,0 bis pH 5,5. Das in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung mit der ersten und der zweiten Enzymkomponente der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann dabei gleichzeitig, oder auch
nacheinander erfolgen. Sofern ein in-Kontakt-Bringen
nacheinander erfolgt, ist es im Rahmen der vorliegenden
Erfindung bevorzugt, wenn die Triglycerid-haltige
Zusammensetzung zuerst mit der zweiten Enzymkomponente in Kontakt gebracht wird. In dem Fall, dass die Triglycerid- haltige Zusammensetzung zuerst mit der zweiten Enzymkomponente und dann mit der ersten Enzymkomponente in Kontakt gebracht wird, ist es besonders bevorzugt, wenn nach Zugabe der einen Komponente die Mischung für 30 bis 300 Minuten, bevorzugt 60 bis 240 Minuten, ebenfalls bevorzugt von 70 bis 120 Minuten gerührt wird, bevor eine Zugabe der anderen Komponente
erfolgt .
Das „Abtrennen" der Schleimstoffe gemäß Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf jede Weise erfolgen, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung jedoch über jegliche Separatoren, wie z. B. Zentrifugen oder
Filtrationseinheiten. Bevorzugte Separatoren für das
erfindungsgemäße Verfahren sind Düsenseparatoren,
PreßSchneckenSeparatoren, KammerSeparatoren,
Tellerseparatoren, Vollmanteltellerseparatoren, Zweiphasen- Dekanter, Dreiphasen-Dekanter, Dreisäulenzentrifugen,
EinpufferZentrifugen, GleitSchwingzentrifugen,
Schwingzentrifugen, Vollmantel-Schälzentrifugen, Vollmantel- Schneckenzentrifugen, Röhrenzentrifugen, Siebtrommel- Schälzentrifugen, Schubzentrifugen, Siebschneckenzentrifugen, Spänezentrifugen, Stülpfilterzentrifugen und
Universalzentrifugen. Bei der Zentrifugation erfolgt eine Phasentrennung der der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung, sodass beispielsweise in der bevorzugten Ausführungsform, in der rohes Pflanzenöl als Triglycerid-haltige Zusammensetzung eingesetzt wird, das behandelte Pflanzenöl, die Schleimstoffe und die Enzymzusammensetzung in separaten Phasen vorliegen, die leicht voneinander getrennt werden können.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird dabei die Phase enthaltend die Schleimstoffe sowie die Phase enthaltend die erfindungsgemäße Zusammensetzung von dem behandelten Öl abgetrennt. Besonders bevorzugt ist es dabei, wenn
gleichzeitig mit den Schleimstoffen die erste und/oder zweite Enzymkomponente abgetrennt wird.
Die Enzyme können nach der Abtrennung regeneriert bzw.
gereinigt und beispielsweise in einem neuen
EntSchleimungsverfahren eingesetzt werden. Die Enzyme können ggfs. über ein Adsorptionsmittel oder über eine entsprechende Säulenchromatographische Methode regeneriert werden. Eine weitere Möglichkeit ist, von der abgetrennten schweren Phase einen Teil in einer weiteren Ölentschleimung des
erfindungsgemäßen Verfahrens einzusetzen.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden
Erfindung betrifft zudem ein Verfahren wie vorstehend
beschrieben, weiter umfassend den Schritt c) erneutes in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung gemäß Schritt b) mit der ersten und/oder zweiten Enzymkomponente.
Das „in-Kontakt-Bringen" gemäß Schritt c) des
erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt dabei bevorzugt unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend für Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben. Dabei wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform die erste und/oder zweite Enzymkomponente vor dem erneuten in-Kontakt-Bringen einer Regeneration unterzogen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die
Triglycerid-haltige Zusammensetzung vor dem in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt c) einer Vorkonditionierung wie vorstehend definiert unterzogen.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt das in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt c) wie vorstehend bereits in Bezug auf das in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens definiert
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem weiteren Aspekt die Verwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung wie vorstehend näher definiert zur Entschleimung von Triglycerid- haltigen Zusammensetzungen.
Nachfolgend sind besonders bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben, die jedoch den Rahmen der vorliegenden Erfindung in keiner Weise beschränken sondern lediglich der weiteren Veranschaulichung dienen:
Bevorzugte Ausführungsform A)
in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung ausgewählt aus rohem Sojaöl, Rapsöl und/oder Sonnenblumenöl mit einer Zusammensetzung umfassend eine erste Enzymkomponente umfassend mindestens einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2 und Phospholipase C und eine zweite Enzymkomponente umfassend mindestens einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Endo-Proteasen;
Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung durch Zentrifugation .
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der bevorzugten
Ausführungsform A) wird vor Schritt a) des Verfahrens eine sogenannte Vorkonditionierung durchgeführt, indem das rohe Öl in einem eigenen Verfahrensschritt mit einer Menge von 1,5 bis 3 ml/L Öl an organischer Säure, bevorzugt Zitronensäure, vermischt wird. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 35 bis 60 °C eingestellt, besonders bevorzugt auf 48 °C. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bis 2
Stunden, bevorzugt 1 Stunde, wird die Mischung durch Zugabe einer stöchiometrischen Menge Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Menge von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/1, besonders bevorzugt 1 Mol/1, auf einen pH von 5 eingestellt. Erst danach wird gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verfahren .
Bevorzugte Ausführungsform B)
a) in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung ausgewählt aus rohem Sojaöl und/oder Rapsöl mit einer Zusammensetzung umfassend eine erste Enzymkomponente umfassend mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2 und Phospholipase C und eine zweite Enzymkomponente mit mindestens einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Endo-Proteasen, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn das mindestens eine Enzym der ersten Enzymkomponente auf einem Träger
immobilisiert vorliegt; b) Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung durch Zentrifugation .
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der bevorzugten
Ausführungsform B) ist es besonders bevorzugt, dass die Enzyme der ersten und/oder zweiten Enzymkomponente in einer wässrigen Phase (Puffer bevorzugt im Bereich pH 4,0 bis 5,5, besonders bevorzugt pH 4,0-5,0) in einer Konzentration von 0,05 bis 5 % w/v eingesetzt werden. Das in-Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) erfolgt dabei bevorzugt bei einer Temperatur von 22 bis 70 °C, bevorzugter 25 bis 65 °C.
Zudem wird die bei der bevorzugten Ausführungsform B) des erfindungsgemäßen Verfahrens eine Nachentschleimung durch die Zugabe von einer organischen Säure und/oder Lauge (nach
Schritt b) ) durchgeführt. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 35 bis 60 °C eingestellt, besonders bevorzugt 48 °C. Nach einer Reaktionszeit von 30 Minuten bis 2 Stunden, bevorzugt 1 Stunde, wird die Mischung durch Zugabe einer Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Konzentration von bevorzugt 0,5 bis 2 Mol/1, besonders bevorzugt 1 Mol/1, auf einen pH von 5 eingestellt.
Bevorzugte Ausführungsform C)
a) in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung ausgewählt aus Pflanzenölschleim mit einer Zusammensetzung umfassend eine erste
Enzymkomponente umfassend mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2 und Phospholipase C und eine zweite Enzymkomponente mit mindestens einem Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Proteasen, bevorzugt Endo-Proteasen, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn das mindestens eine Enzym der ersten Enzymkomponente auf einem Träger immobilisiert vorliegt; b) Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung durch Zentrifugation .
Bevorzugte Ausführungsform D)
a) in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung ausgewählt aus rohem Sojaöl und/oder rohem Rapsöl mit einer Zusammensetzung umfassend eine erste Enzymkomponente umfassend mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2 und Phospholipase C und eine zweite Enzymkomponente umfassend mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe der Proteasen, bevorzugt Endo-Proteasen, wobei es besonders bevorzugt ist, wenn das mindestens eine Enzym der ersten Enzymkomponente auf einem Träger immobilisiert vorliegt;
b) Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung durch Zentrifugation .
In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des
erfindungsgemäßen Verfahrens gemäß der bevorzugten
Ausführungsform D) ist es besonders bevorzugt, dass vor
Schritt a) des Verfahrens eine Vorkonditionierung
durchgeführt, indem das rohe Öl in einem eigenen
Verfahrensschritt mit einer Menge von 50-1500 ppm an
organischer Säure, bevorzugt 100-1200 ppm Zitronensäure, vermischt wird. Die Temperatur der Mischung wird hierbei bevorzugt auf 40 bis 90 °C eingestellt, besonders bevorzugt 45-85 °C. Nach einer Reaktionszeit von 5 Minuten bis 2
Stunden, bevorzugt 10-30 Minuten, wird die Mischung durch Zugabe einer Lauge, bevorzugt Natronlauge, in einer Menge von bevorzugt 0,5 bis 5 Mol/1, besonders bevorzugt 1 Mol/1, konditioniert. Erst danach wird gemäß Schritt a) des
erfindungsgemäßen Verfahrens weiter verfahren.
Zudem lassen sich etwaige, noch im der Triglycerid-haltigen Zusammensetzung gelöste und durch die Phospholipasen nicht gespaltene Phosphatidsäuren weiter reduzieren, indem der Ca- und/oder Mg-Gehalt des gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung behandelten Öls reduziert wird. Daher können die oben angeführten, bevorzugten Ausführungsformen A) bis D) des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaft noch durch einen Folgeschritt ergänzt werden, bei dem durch nochmalige Zugabe von Komplexierungsmitteln wie z.B. Zitronensäure oder
Phosphorsäure oder Oxalsäure oder Milchsäure oder Äpfelsäure der Gehalt an zweiwertigen Ionen und parallel dazu der Gehalt an P im Öl weiter reduziert wird.
Methoden
Es wurden folgende Analysenmethoden verwendet:
Bestimmung des Phosphorgehaltes in den Pflanzenölen Die Bestimmung von Phosphor erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22.
Bestimmung des Calcium- und Magnesiumgehaltes in den
Pflanzenölen
Die Bestimmung von Calcium und Magnesium erfolgte durch ICP gemäß DEV E-22. Bestimmung des Gehalts freier Fettsäuren (FFA)
Bestimmt wird der Gehalt freier Fettsäuren über den Verbrauch an Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid über eine
Verseifungsreaktion . Erhalten wird der prozentuale Gehalt freier Fettsäuren im untersuchten Öl. Die Bestimmung erfolgte gemäß DIN 53402 (Methode DGF C-V 2) .
Bestimmung des Schleimvolumens
Mithilfe dieser Bestimmung wird die im Öl enthaltene
Schleimphase von enzymatisch unbehandeltem und enzymatisch behandeltem Schleim gemessen. Ein 10 mL Schleuderglas wird auf die Arbeitstemperatur des Reaktionsansatzes erwärmt, die
Proben (2X 2 mL) werden eingefüllt und temperiert mindestens 4 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert um die Schleimphase vom Öl zu trennen. Von der oberen Ölphasen werden Proben für die Analytik entnommen. Zu Dokumentationszwecken wird das Ergebnis der Phasenbildung zusätzlich fotografiert. Variante 1 :
Die zu behandelnde Menge Rohöl, 400 bis 600 g, wird in einen Duran Reaktor DN120 1000 mL eingefüllt und Proben für die Analytik werden abgenommen. Das Öl im Duranreaktor wird mit Hilfe einer Heizplatte auf eine Temperatur von 40 bis 85 °C, insbesondere 48 bis 80 °C, aufgeheizt. Nachdem die Temperatur erreicht ist, wird mit der Vorkonditionierung begonnen. Dafür wird eine definierte, von der Ölmenge abhängige Menge
Zitronensäure, (z.B. 1000 ppm) , zum Öl zu dosiert.
Anschließend wird die Mischung mit einem Ultraturrax® für
1 Minute durchmischt. Als Alternative wird unter Rühren bei etwa 600 rpm 15 Minuten inkubiert, um die Reaktion der Säure abzuwarten. Anschließend wird eine definierte Menge
Natronlauge (1 Mol/L, Restmenge zu 2 % v/v, bzw. 3 % v/v abzüglich Wasser aus Säurezugabe und Enzymzugabe) zugegeben, bis ein pH-Wert von ca. 4 erreicht ist und es wird weitere 10 Minuten unter Rühren inkubiert. Nach Abkühlung auf 48 °C erfolgt die Zugabe des Enzyms, der Enzym-Mischung oder des Immobilisats , vorzugsweise gelöst in Wasser oder Puffer. Das Enzym wird untergerührt, wofür die Rührerdrehzahl kurzzeitig erhöht werden kann (1 Minute auf 900 rpm), anschließend wird bei niedrigerer Drehzahl weitergerührt.
Die Probenahme erfolgt in definierten Zeitabständen. Die Probe wird mit Hilfe einer Pipette abgenommen, in ein temperiertes Schleuderglas eingefüllt (Temperatur des Reaktionsansatzes) und temperiert mindestens 4 Minuten bei 3000 rpm zentrifugiert um die Schleimphase vom Öl zu trennen. Zu
Dokumentationszwecken wird das Ergebnis der Phasenbildung fotografiert, vom Überstand werden Proben zur Bestimmung des Phosphor-, Calcium- und Magnesiumgehaltes abgenommen. Variante 2 :
In einer weiteren Durchführung werden Phospholipasen und zusätzliche Enzyme in einer geeigneten Kombination als freie Enzyme oder immobilisierte Enzyme zusammen mit einer wässrigen Phase (Enzym-Puffer, pH 4-5) 0,05 bis 5 % w/v, dem Rohöl zugesetzt. Die Emulsion, bestehend aus Wasser, Enzym,
eventuell Enzymträgern und Öl, wird durchmischt. Idealerweise wird die Reaktion temperiert zwischen 20 bis 70 °C, besser zwischen 40 bis 65 °C durchgeführt. Anschließend wird die Phasentrennung abgewartet, die Feststoffe setzen sich ab oder können nach einem dem Fachmann bekannten Standardverfahren z.B. über Zentrifugation oder Filtration entfernt werden. Als Nachbehandlung kann das Öl mit verdünnter Säure (z.B.
Zitronensäure) oder Lauge nach einem dem Fachmann als
„Degumming" bekannten Verfahren restentschleimt werden.
Variante 3:
In einer weiteren Durchführung wird die Schleimphase mit
Enzymen behandelt. Die Schleimphase, welche nach einem dem Fachmann als „degumming" bekannten Verfahren erhalten wird, werden neben Phospholipasen, weitere Enzyme zugesetzt. Diese können sich gelöst in einer wässrigen Phase oder suspendiert in einem organischen Lösungsmittel befinden. Der Ansatz wird idealerweise auf eine Temperatur zwischen 20 bis 70 °C
temperiert, besser auf eine Temperatur zwischen 35 bis 60 °C. Der Ansatz wird durchmischt bis der Prozess abgeschlossen ist. Dies kann durch Viskositätsmessungen überprüft werden oder visuell, durch Auflösen der ansonsten festen Schleimphase. Durch Zentrifugation lässt sich eine Phasenseparation
erreichen, die einzelnen Phasen können abgetrennt werden. In der Regel besteht die obere Phase aus dem gewonnenen Öl, die mittlere Phase aus den Phospholipiden und die untere Phase ist eine wässrige Phase und enthält die Enzyme. Durch Wiederverwendung der wässrigen Phase lassen sich die Enzyme recyceln und wiederverwenden. Je nach Gehalt zweiwertiger Ionen kann das Öl oder die das Enzym enthaltende Wasserphase durch Zusatz von Komplexierungsmitteln vor der weiteren Verwendung von den Ionen bereinigt werden.
Beispiele und Figuren:
Die Erfindung wird im Weiteren an Hand von Figuren und
Beispielen näher erläutert. Es wird hierbei betont, dass die Beispiele und Figuren lediglich veranschaulichenden Charakter besitzen und besonders bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung veranschaulichen. Weder Beispiele noch Figuren beschränken den Rahmen der vorliegenden Erfindung. Es zeigen:
Fig. 1 rohes Rapsöl: Vorkonditionierung mit 3 %
Gesamtwasseranteil
Fig. 2 rohes Rapsöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym
PLA1 0,3 Unit/g Öl und 3 % Gesamtwasseranteil Fig. 3 rohes Rapsöl: Vorkonditionierung mit Zugabe von Enzym
PLA1 0,3 Unit/g Öl und dem Enzym Pepsin 1 Unit/g Öl, 3 % Gesamtwasseranteil
Beispiel 1 :
Gemäß Reaktionsvariante 1 wurde ein rohes Rapsöl mit folgenden Ausgangsgehalten verwendet: Phosphor 1200 ppm, Calcium
365 ppm, Magnesium 155 ppm und einem Gehalt an freien
Fettsäuren von 1,99 %. Das Rohöl wurde einer
Vorkonditionierung mithilfe von wässriger Zitronensäure
(1000 ppm) und wässriger Natronlauge (1 Mol/L) unterzogen. Es wurden regelmäßig Proben genommen (siehe Figur 1, Tabelle 1) . Am Ende der Reaktion wurde die Schleimphase abzentrifugiert und der Restölgehalt dieser nach Soxhlet bestimmt.
Als Vergleich wurde eben diese Vorkonditionierung mit Zugabe eines Enzyms, Phospholipase AI aus dem Organismus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) , durchgeführt (siehe Figur 2, Tabelle 2) . In Figur 3, Tabelle 3 sind Ergebnisse der
Vorkonditionierung mit Zusatz des Enzyms PLA1 aus Thermomyces lanuginosus und eines weiteren Enzyms, Pepsin aus Porcine Gastric mucosa ( Sigma-Aldrich) dargestellt.
Tab. 1 Vorkonditionierung mit 3 % Gesamtwasseranteil,
Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
Tab. 2 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 aus Thermomyces lanuginosus 0,3 Units/g Öl und 3 % Gesamtwasseranteil,
Phosphor-, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt
Tab. 3 Vorkonditionierung mit Zugabe von PLA1 (aus Thermomyces lanuginosus) 0,3 Units/g Öl und Pepsin 1 Unit/g Öl, 3 %
Gesamtwasseranteil, Phosphor, Calcium-, Magnesium- und FFA Gehalt Zeit [min] 10 60 120 180 240
Ca [ppm] 55 10 9,3 6, 4 5,7
Mg [ppm] 23 3,1 3 1,9 1,6
P [ppm] 199 26 25 16 14
FFA [%] 1,86 2, 14 2, 17
Schleim [%]3 min 4,3 5, 0 4,2 4,0 4,0
Wie aus Figur 1 ersichtlich ist, führt die Anwendung von Säure und Lauge auf das Rohöl als Vorkondit ionierung zu einem nicht unerheblichen Schleimvolumen, welches in der Folge trotz
Einsatz eines Rührers bei 600 rpm nicht wesentlich abnimmt. Das einzelne Foto entspricht einer Probeentnahme. Die
Probeentnahmen erfolgen zu den Zeitpunkten 10, 60, 120, 180 und 240 Minuten (von links nach rechts) . In Tabelle 1 sind die zugehörigen analytischen Daten aufgeführt: der Phosphorgehalt sank nach 240 Minuten von 247 ppm auf 14 ppm; die
Konzentration der zweiwertigen Ionen Calcium und Magnesium nimmt im Fall des Calciums von 76 ppm auf 9,5 ppm ab; die Konzentration des Magnesiums sinkt von 31 ppm auf 1,7 ppm im Verlauf der Reaktion. Der Gehalt freier Fettsäuren bleibt nahezu unverändert. Die Vorkondit ionierung dient als
Vorbereitungsreaktion zur Ölent schleimung und gleichzeitig als Referenzbehandlung .
In Figur 2 ist bei Verwendung des Enzyms Phospholipase AI aus Thermomyces lanuginosus (Sigma-Aldrich) eine Abnahme des
Schleimvolumens im Verlauf der Reaktion erkennbar (je Messung/ Probenahme ein Foto) . Die zugehörigen Daten und die Zeitpunkte der Probenahme sind in Tabelle 2 dargestellt. Aus Tab. 2 ergibt sich eine Abnahme der Calciumkonzentration von 26 ppm auf 7,9 ppm, eine Abnahme der Magnesiumkonzentration von 9,7 ppm auf 1,5 ppm und eine Abnahme des Phosphorgehalts von 82 ppm auf 12 ppm; der Gehalt freier Fettsäuren steigt von 1,76 % auf 2,14 % an, jeweils nach 240 min Reaktionszeit. Aus dem Anstieg im Gehalt der freien Fettsäuren und der Abnahme des Phosphorgehalts lässt sich schließen, dass die PLA1
enzymatisch aktiv ist und folglich die Ölent schleimung erfolgreich funktioniert. Die Zunahme der freien Fettsäure ist ein Zeichen für die Aktivität der PLA1, welche die Fettsäuren aus den Phospholipidmolekulen abspaltet und auch das
Schleimvolumen nimmt kontinuierlich ab.
In Figur 3 ist das Volumen der Schleimphase eines mit PLA1 und zusätzlich mit Pepsin behandelten vorkonditionierten Rohöls dargestellt. Aus den dazugehörigen analytischen Daten aus Tabelle 3 ist ersichtlich, dass erstaunlicherweise bereits nach 120 Minuten ein reduziertes Schleimvolumen von 4,2 % erreicht wird, im Vergleich zum Schleimvolumen von 5,0 % bei Einsatz der PLA1 alleine (Tabelle 2) . Zusätzlich sind die Ionenwerte (Tabelle 3) vergleichbar mit denen der Reaktion mit der PLA1 alleine, siehe Tabelle 2. Der Gehalt freier
Fettsäuren steigt von 1,86 % auf 2,17 % an und weist damit auf die Aktivität der Phospholipase hin. Die Ergebnisse belegen, dass es erstaunlicherweise durch Zusatz eines einzigen
weiteren Enzyms, einem Pepsin, zu einer stärkeren Reduktion der Schleimphase kommt und damit die Olausbeute der Reaktion erhöht wird.

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung umfassend eine erste Enzymkomponente
umfassend mindestens ein Phospholipid-spaltendes Enzym sowie eine zweite Enzymkomponente umfassend mindestens eine Protease.
2. Zusammensetzung gemäß Anspruch 1, wobei die erste
Enzymkomponente ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus Phospholipase AI, Phospholipase A2, Phospholipase C,
Phospholipase B, Phospholipase D, Acyltransferase und deren Mischungen.
3. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die zweite Enzymkomponente ausgewählt wird aus der
Gruppe bestehend aus Aminopeptidasen, Dipeptidasen, Dipeptidylpeptidasen, Tripeptidylpeptidasen,
Peptidyldipeptidasen, Carboxypeptidase des Typs Serin, Metallocarboxypeptidasen, Carboxypeptidasen des Typs Cystein, Omegapeptidasen, Serin-Endopeptidasen, Cystein-
Endopeptidasen, Asparagin-Endopeptidasen,
Metalloendopeptidasen, Threonin-Endopeptidasen,
Endopeptidasen und deren Mischungen.
4. Zusammensetzung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Verhältnis der ersten Enzymkomponente zu der zweiten Enzymkomponente im Bereich von 0,001 : 20 bis 20 : 0,001 liegt.
5. Verfahren zur Entschleimung von Triglycerid-haltigen
Zusammensetzungen, welches folgende Schritte umfasst: a) in-Kontakt-Bringen der Triglycerid-haltigen
Zusammensetzung mit einer Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 definiert. b) Abtrennen der Schleimstoffe von der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung.
6. Verfahren gemäß Anspruch 5, wobei die Triglycerid-haltige Zusammensetzung ausgewählt wird aus rohem Pflanzenöl und
Pflanzenölschleim.
7. Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, wobei vor dem in- Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) die Triglycerid-haltige Zusammensetzung mit Wasser und/oder wässriger Säure in
Kontakt gebracht wird, jedoch vor Schritt a) keine
Abtrennung der wässrigen Phase stattfindet.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 7, wobei die
erste und/oder zweite Enzymkomponente in geträgerter Form eingesetzt wird.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 8, wobei das in- Kontakt-Bringen gemäß Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bei einer Temperatur von 22 bis 70°C erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 bis 9, weiter umfassend den Schritt c) erneutes in-Kontakt-Bringen der Triglycerid- haltigen Zusammensetzung gemäß Schritt b) mit der ersten und/oder zweiten Enzymkomponente.
11. Verwendung einer Zusammensetzung wie in einem der
Ansprüche 1 bis 4 definiert zur Entschleimung Triglycerid- haltiger Zusammensetzungen.
EP15705030.3A 2014-02-21 2015-02-19 Zusammensetzung für die enzymatische ölentschleimung Withdrawn EP3113625A1 (de)

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