EP3008197A2 - Verfahren zur biokatalytischen synthese von substituierten oder unsubstituierten phenylessigsäuren und ketonen mit enzymen des mikrobiellen styrolabbaus - Google Patents

Verfahren zur biokatalytischen synthese von substituierten oder unsubstituierten phenylessigsäuren und ketonen mit enzymen des mikrobiellen styrolabbaus

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EP3008197A2
EP3008197A2 EP14734756.1A EP14734756A EP3008197A2 EP 3008197 A2 EP3008197 A2 EP 3008197A2 EP 14734756 A EP14734756 A EP 14734756A EP 3008197 A2 EP3008197 A2 EP 3008197A2
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EP
European Patent Office
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formula
enzyme
gene
whole
bacterial cells
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Withdrawn
Application number
EP14734756.1A
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English (en)
French (fr)
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Michel OELSCHLÄGEL
Juliane ZIMMERLING
Dirk Tischler
Michael SCHLÖMANN
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Technische Universitaet Bergakademie Freiberg
Original Assignee
Technische Universitaet Bergakademie Freiberg
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Publication date
Application filed by Technische Universitaet Bergakademie Freiberg filed Critical Technische Universitaet Bergakademie Freiberg
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    • C12Y114/14011—Styrene monooxygenase (1.14.14.11)
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    • C12Y503/99—Other intramolecular oxidoreductases (5.3.99)
    • C12Y503/99007—Styrene-oxide isomerase (5.3.99.7)

Definitions

  • the present invention relates to a process for the biocatalytic synthesis of substituted and unsubstituted phenylacetic acids and ketones from styrenes and bicyclic aromatic hydrocarbons using enzymes of microbial styrene degradation in a whole cell sensor, and a kit for the biocatalytic synthesis of substituted and unsubstituted phenylacetic acids and ketones containing a whole-cell catalyst and the use of the method.
  • the present invention further relates to novel bacterial strains for the biocatalytic synthesis of substituted and unsubstituted phenylacetic acids and ketones from styrenes and bicyclic aromatic hydrocarbons.
  • Phenylacetic acids and structurally related compounds belong to an industrially important class of compounds. In addition to the use of such compounds as flavorings and flavors (Fahlbusch et al. [Wiley-VCH 2012, 130]), they have a high importance for the pharmaceutical and cosmetic industries due to their mostly anti-inflammatory, antifungal and antimicrobial action (Milne et al Org. Chem., 2011, 76, 9519-9524], Zhu et al. [Food Chem., 2011, 124, 298-302]).
  • the ⁇ -methylphenylacetic acids provide u. a. important precursors in the synthesis of hepatitis C polymerase inhibitors (Wagner et al. [J. Med. Chem.
  • the anticholinergic hyoscyamine can be synthesized from 4-chloro- ⁇ -methylphenylacetic acid (Gualtieri et al. [J. Med. Chem. 1994, 37, 1704-171 1 ]).
  • Various methyl-, methoxy-, chlorine-, fluorine- and bromine-substituted phenylacetic acids are also used as important synthesis precursors in pharmacy, for example in the preparation of antimycotically active dihydrofurans (Pour et al., [Bioorg.Med Chem.
  • 4-fluorophenylacetic acids are u. a. in the preparation of medicaments for disorders of the gastrointestinal tract, the nervous system, bladder function (US Pat. No. 7,683,068 B2) and for the synthesis of preparations for the replication inhibition of picornavirus (Hamdouchi et al. [J. Med. Chem. 2003, 46, 4333 -4341]).
  • 4-methylphenylacetic acid is an important precursor for the production of anticancer drugs (Luo et al., [Bioorg. Med. Chem., 2011, 19, 6069-6076], Wei, et al., J. Med , 50, 3674-3680]).
  • phenylacetic acid and its derivatives are of essential importance as synthetic building blocks for analgesics, such as As ibuprofen and diclofenac and as precursors for the synthesis of penicillins.
  • analgesics such as As ibuprofen and diclofenac
  • penicillin X can be synthesized from p-hydroxyphenylacetic acid (Corse et al., J. Am. Chem.
  • US 4,237,314 A discloses a process for the synthesis of phenylacetic acid by the reaction of acetic acid and benzene in the presence of tellurium halide catalysts, wherein temperatures between 100 and 200 ° C and high pressures of up to 15 bar are necessary.
  • this presentation variant produces highly toxic and corrosive bromoacetic acid as a by-product.
  • No. 4,220,592 A discloses a two-stage process in which the corresponding phenylacetic acid is prepared by hydrolysis of substituted acetonitriles. In the context of this synthetic strategy, yields of 50 to 95% can be achieved.
  • Taqui Khan et al. ⁇ J. Mol. Catal. 1988, 44, 179-181) and Qui et al. ⁇ J. Nat. Gas Chem. 2005, 14, 40-46) disclose a method for the synthesis of phenylacetic acids based on the carbonylation of benzyl chloride using ruthenium (III) -EDTA complexes or 2-chlorobistriphenylphosphine, respectively. Due to the formation of by-products and the high demand for concentrated acids, the process is ecologically questionable. Nickel tetracarbonyl or nitrosyltricarbonylferrat catalysts also allow the conversion of benzyl chloride to phenylacetic acid, with yields of about 90% being achieved. However, this reaction also requires high pressures of 10 bar and a temperature of 80 ° C (Bertleff 2005, 13 f.]).
  • phenylacetic acid can also be obtained by the chemical reaction of benzyl alcohol at 175 ° C and 71 bar in the presence of rhodium catalysts (Bertleff [1 / Y / ey - / CH 2005, 13 f.]).
  • An amidase from Agrobacterium tumefaciens d3 also stereoselectively converts racemic 2-phenylpropionamide to 95% in (S) -2-phenylpropionic acid, whereby only half of the educt used is converted (Trott et al. [Microbiology 2W, 147, 1815-1824 ]).
  • Sosedov e. (Appl. Environ.Microbiol., 2010, 76, 3668-3674) disclose the direct hydrolysis of arylacetonitrile to carboxylic acids and ammonia using a recombinantly derived arylacetonitrilase derived from Pseudomonas fluorescens EBC191.
  • the required arylacetonitriles are expensive starting materials.
  • styrenes are one of the most important industrial educts for the production of large-scale products (including for the production of various plastics), why they represent a cost-effective and available alternative to the above educts.
  • more than 3 million tonnes of styrene were produced in 1990, compared to 14.7 million tonnes worldwide in 1996.
  • the object is achieved by a biocatalytic process for synthesizing a substituted or unsubstituted phenylacetic acid and / or a substituted or unsubstituted ketone and / or a bicyclic derivative according to the general formula (I) and / or formula (II)
  • the substituent R 1 is H, OH or a branched or a linear C 1 to C 3 alkyl radical
  • the substituent R 2 is H or a branched or a linear C 1 to C 3 -alkyl radical, where * is a chiral center
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are independently H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , where R x is an optionally substituted and / or branched Ci to Ci 0 -alkyl radical is
  • X is CH 2 , O, NH, NR X , S or SO 2 ,
  • n is the number 0, 1 or 2 and
  • R 1 is not OH.
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which codes for the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase, in conjunction with a gene E which codes for the enzyme alcohol dehydrogenase, wherein the genes D and E are functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • reaction product of the formula (I) or (II) advantageously accumulate in the aqueous component as a result of the removal from the whole-cell catalyst.
  • the present invention is based on the recent finding that substituted substrates having the general formula (III) or (IV) are metabolized by the styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase and alcohol dehydrogenase.
  • the process according to the invention thus has the advantage that, by the use of whole cell catalysts, preferably two enzymes (styrene monooxygenase and epoxide isomerase, FIG. 1), particularly preferably all three enzymes (styrene monooxygenase, epoxide isomerase and aldehyde dehydrogenase, FIG 1) can be used simultaneously for the biocatalytic synthesis of phenylacetaldehyde derivatives as a precursor of phenylacetic acid and / or their derivatives, more preferably of phenylacetic acid and / or their derivatives according to the formula (I) or (II), since the stability of the is increased in the context of biochemical synthesis and contributes to a more stable process.
  • two enzymes styrene monooxygenase and epoxide isomerase, FIG 1.
  • the whole-cell catalyst contains
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which encodes the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • whole-cell catalysts are used in which for the biocatalytic synthesis of phenylacetaldehyde derivatives as precursor of phenylacetic acid and / or derivatives thereof, more preferably of phenylacetic acid and / or their derivatives of formula (I) or ( II) simultaneously the three enzymes styrene monooxygenase, styrene oxide reductase and alcohol dehydrogenase, particularly preferably the enzymes styrene monooxygenase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase can be used.
  • the whole cell sensor preferably contains:
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase
  • a gene E which codes for the enzyme alcohol dehydrogenase
  • a gene C which codes for the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • the styrene monooxygenase is an enzyme in bacteria that undergoes the chemical reaction of styrene with flavin adenine dinucleotide (FADH 2 ) according to the reaction:
  • FAD is regenerated by the reductase subunit of styrene monooxygenase with NADH consumption.
  • the epoxide isomerase is a naturally occurring enzyme belonging to the class of isomerases and catalyzes the chemical reaction of the intermediate styrene oxide into phenylacetaldehyde.
  • Styrene oxide reductase is an enzyme that converts styrene oxide to 2-phenylethanol while relying on cell-internal cofactors. Preference is given to cofactors NADH or NADPH. Alcohol dehydrogenase is an enzyme that catalyzes the conversion of alcohols into aldehydes. The enzyme is dependent on cofactors. Preference is given to cofactors NAD + , NADP + , cytochromes. In addition, the enzyme is able to perform the reverse reaction.
  • the aldehyde dehydrogenase is an oxidoreductase and is selected from a group of enzymes that oxidize aldehydes to carboxylates in the metabolism of living things.
  • the epoxide isomerase is, for example, a cofactor (NADH and FAD) -independent enzyme.
  • NADH and FAD cofactor-independent enzyme
  • styrene monooxygenases are preferably cofactor-dependent, with FADH 2 being enzymatically converted to FAD.
  • FADH 2 as an energy carrier in the context of the biocatalystic reaction is not lost because it is regenerated via the enzymatic conversion with an aldehyde dehydrogenase via the intermediate compound NADH.
  • a method according to the invention for the synthesis of representatives of the general formula (I) and / or formula (II) using whole-cell catalysts which contain the genes A, B and C or A, C, D, E or A, B, C, D, E contain a so-called cofactor-independent system, because the necessary cofactors (NADH and FADH 2 ) are regenerated as energy sources in situ.
  • genes A, B, C, D and E which code for the enzymes mentioned, are functionally placed under the control of a regulatable promoter, wherein the promoters may be identical or different from each other.
  • the activation of the whole-cell catalyst is signal-dependent by contacting with an activator and / or an inducer, wherein the induction of the expression of the genes A, B, C, D, Essignalconnect induced and the whole-cell catalyst is converted into its active form.
  • the activators or inducers activate the regulatable promoter (also called operator within the meaning of the application) in which they interact directly with a regulatable promoter or in which they bind to a Bind repressor protein, which then dissolves from the promoter.
  • the abovementioned enzymes styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase
  • styrene monooxygenase epoxide isomerase
  • styrene oxide reductase styrene oxide reductase
  • alcohol dehydrogenase and aldehyde dehydrogenase aldehyde dehydrogenase
  • the regulatable promoters differ from one another, so that the promoters can be activated in a primary-signal-specific manner.
  • the presence of different activators and / or inducers in the whole-cell catalyst can lead to the expression of selected genes, thereby minimizing the stress for a recombinant cell.
  • promoters eg T7 promoter in pET16 expression systems
  • TRED pET16 expression systems
  • MPromDB known databases
  • a biocatalytic reaction takes place within a whole-cell catalyst with at least one enzyme of styrene monooxygenase, epoxide isomerase and / or aldehyde dehydrogenase to form a corresponding reaction product of the formula (I) or (II) instead.
  • substrates of the formula (III) according to the invention are converted biocatalytically into reaction products of the formula (I) or substrates of the formula (IV) to form reaction products of the formula (II).
  • biocatalytic reaction becomes one corresponding reaction product of the formula (I) or (II) instead.
  • the substrate of the formula (III) and / or (IV) is absorbed by the whole cell catalyst (ie uptake into the cell) and by at least one enzyme as described above correspondingly selected from A, B, C, D and E, to one Reaction product of the formula (I) and / or (II) biocatalytically reacted.
  • the contacting of the whole-cell catalyst with a substrate of the formula (III) and / or (IV) is preferably carried out by introducing the substrate via the gas phase and / or by direct addition to the liquid component in the form of a liquid and / or solid.
  • an organic phase can also be used as a substrate reservoir, whereby the process runtime can be optimized.
  • the substrate is a member of the general formula (III) or (IV) wherein R 2 is not H (ie R 2 is a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical)
  • the corresponding reaction products have the formula (I) or (II) on the C atom with the radical R 2 a chiral center ( * ) on.
  • reaction products of general formula (I) and / or (II) can be present as a racemic mixture with an enantiomeric excess between 0 and 20%, preferably between 0 and 10%, most preferably between 0 and 5%.
  • R and S is the molar concentration of the R- or S-configured enantiomer and always a positive value is obtained.
  • substrates of the formula (III) are used: where R 1 is H or a linear C 1 to C 3 -alkyl radical, particularly preferably H or methyl,
  • R 2 is H or a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , particularly preferably H, halogen or R x ,
  • R x is an optionally substituted and / or branched C 1 - to C 20 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 - to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or isobutyl,
  • substrates of the formula (III) are used:
  • R 1 is H or a linear C 1 to C 3 -alkyl radical, particularly preferably H or methyl,
  • R 2 is H or a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl, n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , particularly preferably H, halogen, OH, OR x or R x, very particularly preferably H, Halogen or R x are,
  • R x is an optionally substituted and / or branched C 1 to C 8 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or isobutyl,
  • substrates of the formula (III) in which two of the radicals R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are a substituent other than H (halogen, OH, R x , OR x or COOR x ) more preferably exclusively one of R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 is a substituent other than H.
  • substrates of the formula (III) are used: where R 1 is H or a linear C 1 to C 3 -alkyl radical, particularly preferably H or methyl,
  • R 2 is H or a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl or n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , particularly preferably H, halogen or R x ,
  • R x is an optionally substituted and / or branched C 1 - to C 20 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 - to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and / or isobutyl,
  • substrates of the formula (III) are used:
  • R 1 is H or a linear C 1 to C 3 -alkyl radical, particularly preferably H or methyl,
  • R 2 is H or a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl or n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , particularly preferably H, halogen, OH, OR x or R x ,
  • R x is an optionally substituted and / or branched C 1 to C 8 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and / or isobutyl,
  • substrates of the formula (III) in which two of the radicals R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are each substituent other than H (halogen, OH, R x , OR x or COOR x ) more preferably exclusively one of R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 is a substituent other than H.
  • bicyclic substrates of the formula (IV) are used, wherein: the substituent R 2 is a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl or n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 independently of one another are H, halogen, OH, R x , OR x or COOR x , particularly preferably H, halogen, OH, OR x or R x , where R x is an optionally substituted and / or branched C 1 to C 8 -alkyl radical, particularly preferably a C 1 to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl and / or isobutyl.
  • X is a CH 2 , O, NH, NR X , S or SO 2 , particularly preferably CH 2 , O, NH or NR X , very particularly preferably CH 2 or NH,
  • n is the number 0, 1 or 2, more preferably the number is 0 or 1,
  • the substrate of formula (III) and / or (IV) is preferably in a concentration between 0.1 and 10 mM, more preferably between 0.2 and 5 mM, most preferably between 0.2 and 2.5 mM in a biocatalytic reaction and can be performed continuously or discontinuously after.
  • the content of a reaction product of the formula (I) or (II) according to the biocatalytic reaction of a substrate of the formula (III) or (IV) is preferably at least 30 mol%, particularly preferably at least 40 mol%, very particularly preferably at least 50 mol% of the content of originally added substrate.
  • the substrate and the corresponding reaction product be in a defined ratio other than the aforementioned ratio to each other.
  • the reaction can be interrupted at any time.
  • the reaction product of the formula (I) or (II) is preferably secreted by the whole-cell catalyst into the aqueous component, whereby the isolation of at least one reaction product of the formula (I) or (II) from the biomass and the aqueous component is favored.
  • the isolation of the reaction product of the formula (I) or (II) from the biomass and the aqueous component stepwise, wherein in a first step by centrifugation or filtration, the biomass of the aqueous component containing a reaction product of formula (I) or . (II) is separated.
  • one type of whole-cell catalysts is selected from recombinant (i.e., genetically altered) and / or authentic bacterial cells.
  • the methods for cultivating recombinant and / or authentic bacterial cells are known to the person skilled in the art, wherein the bacterial cells are used continuously or discontinuously in the batch process (batch culturing) or in the fed-batch (feed process) or repeated fed-batch process (repetitive feed process) for the purpose of cultivation or the biocatalytic reaction of a substrate having the general formula (III) or formula (IV) are cultured.
  • a summary of known cultivation methods are described in the textbook by Chmiel (Bioprocessing Technology 1. Introduction to Bioprocess Engineering (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) or in the textbook by Storhas (Bioreactors and Peripheral Facilities (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)) ,
  • aqueous component to be used must suitably satisfy the requirements of the respective bacterial strains.
  • Descriptions of aqueous components (e.g., culture media) of various microorganisms are described in the Manual of Methods for General Bacteriology of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981).
  • the starting materials known from the cited documents can be added to the aqueous component in the form of a one-time batch or can be added in a suitable manner during the cultivation.
  • basic compounds such as sodium hydroxide, potassium hydroxide, ammonia or ammonia water or acidic compounds such.
  • phosphoric acid or sulfuric acid in a suitable manner and / or buffer compounds such.
  • hydrogen phosphate salts TRIS used.
  • fatty acid polyglycol esters are used.
  • selectively acting substances such. B.
  • Antibiotics eg chloramphenicol, ampicillin, kanamycin
  • Bacterial cells with partially inactivated metabolic pathways are preferably used, wherein on an (expression) vector containing at least one gene A, B, D, E and / or C, among others, genes for completing incomplete metabolic pathways are included.
  • oxygen or oxygen-containing gas mixtures such as air is introduced into the aqueous component.
  • the bacterial biomass in the form of bacteria can accordingly be obtained by culturing (culturing) known to the person skilled in the art, for example by culturing in LB medium, but preferably by culturing in a medium which is capable of producing high cell densities, in particular greater than 1 ⁇ 10 9 cells per ml, allowed.
  • the cultivation is preferably carried out in laboratory shaking flasks, but to produce larger amounts of bacterial biomass is also the cultivation under controlled conditions in the fermenter possible.
  • the cultivation of the authentic and / or recombinant bacterial cells is preferably carried out under physiological conditions at a temperature between 0 and 60 ° C, preferably between 10 and 50 ° C, more preferably between 20 and 40 ° C, wherein the pH of the aqueous component is preferred between 5.8 and 8.5, more preferably between 6.8 and 8.0.
  • authentic bacterial cells contain all three genes A, B and C, which encode the enzymes styrene monooxygenase, epoxide isomerase and aldehyde dehydrogenase, all three genes A, B and C being functionally placed under the control of an identical promoter or operator are. Alternatively, preferably all three genes A, B and C are placed under the control of several promoters or operators.
  • the wild-type strains from Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis and Corynebacterium particularly preferably from Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 and Pseudomonas putida S12 are selected.
  • the wild-type strain from Sphingopyxis sp. Kp5.2 DSM 28731.
  • authentic bacterial cells preferably contain genes A, C, D and E, which encode the enzymes styrene monooxygenase, styrene oxide reductase and alcohol dehydrogenase, all genes A, C, D and E being functionally under the control of an identical promoter or promoter Operators are provided.
  • all genes A, C, D and E are placed under the control of several promoters or operators.
  • the genus Gordonia particularly preferred Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) is.
  • the authentic bacterial cells used which can be used for a process according to the invention for the biocatalytic synthesis of phenylacetic acid and / or derivatives thereof, according to lists of ZKBS (Central Commission for Biological Safety) of risk class 1 and are therefore considered non-pathogenic for humans and Animal marked. Since these are naturally occurring isolates, their handling does not require the approval of a genetic engineering.
  • ZKBS Central Commission for Biological Safety
  • the recombinant bacterial cells which are capable of biocatalytically synthesizing representatives of the formula (I) and / or (II) from substrates of the formula (III) and / or (IV) are negative mutants of authentic bacterial cells or insertion mutants ,
  • the recombinant bacterial cells are negative mutants (i.e., knock-out mutants or deletion mutants) of the above-mentioned.
  • Wild-type strains i.e., authentic bacterial cells naturally having the three genes A, B and C
  • a gene A, B and / or C preferably the gene C is partially or completely deleted and / or replaced by a modified gene.
  • the term negative mutant is used synonymously for the terms deletion mutant and knockout mutant.
  • the recombinant bacterial cells are negative mutants (i.e., knock-out mutants or deletion mutants) of the above-mentioned.
  • Wild-type strains ie authentic bacterial cells which naturally have the genes A, C, D, E or A, B, C, D, E), where a gene A, B, D, E and / or C, preferably the gene C is partially or completely deleted and / or replaced by a modified gene.
  • the recombinant bacterial cells are preferably negative mutants (i.e., knock-out mutants or deletion mutants) in which a gene encoding phenylacetyl-CoA ligase is partially or completely deleted.
  • the recombinant bacterial cells are generated by the introduction of nucleotide sequences of genes A, B, D, E and / or C by genome insertion or introduction of expression vectors into bacterial cells, whereby sg insertion mutants be formed.
  • insertion mutants are naturally not capable of biocatalytic synthesis of representatives of formula (I) and / or (II), since they originally do not contain any nucleotide sequence of genes A, B, D, E and / or C.
  • Potential host organisms for insertion mutants are preferably selected from the genera Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Corynebacterium and Bacillus.
  • nucleotide sequences of genes A, B, D, E and / or C into a bacterial cell advantageously the conversion rates, the yield and the enantiomeric excesses in the biocatalytic reaction of substrates of the formula (III) and / or (IV) according to the invention be increased.
  • the nucleotide sequences of genes A, B, D, E and C include authentic and / or artificial reading frames.
  • an artificial reading frame is adapted via a gene synthesis to the "codon usage" of the host organism.
  • the nucleotide sequences to be inserted are designed such that they have nucleotide sequences coding for authentic or artificial amino acid linkers between the genes A, B, D, E and C, so that recombinant enzymes in the form of the expression are formed by heterodimers or heterotrimers, wherein the enzymes (styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and / or aldehyde dehydrogenase) are covalently linked to each other via linker sequences.
  • the enzymes styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and / or aldehyde dehydrogenase
  • the nucleotide sequences to be inserted are designed such that they have nucleotide sequences coding for authentic or artificial amino acid linkers between the genes A, B, D, E and / or C so that recombinant enzymes in Formed form heterodimers, heterotrimers, heterotetramers or Heteropentameren, wherein the enzymes (styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and / or aldehyde dehydrogenase) are covalently linked together via linker sequences.
  • the enzymes styrene monooxygenase, epoxide isomerase, styrene oxide reductase, alcohol dehydrogenase and / or aldehyde dehydrogenase
  • suitable genes A, B, D, E and / or C can be amplified by methods known per se, for example the polymerase chain reaction (PCR) with the aid of short, synthetic nucleotide sequences (primers) and then isolated.
  • PCR polymerase chain reaction
  • primers primers
  • the preparation of the primers used is generally based on known gene sequences due to existing homologies to the genes A, B, D, E and / or C.
  • the vector has a low molecular weight and has selectable genes to result in a readily recognizable phenotype in a cell, such that a simple selection of vector-containing and vector-free host cells is possible.
  • the vector should have a strong promoter and / or regulatory sequences. Replication of the vector also requires an origin of replication. For example, pET vector systems based on antibiotic selection are suitable, among others.
  • the inductor and / or activator is preferably selected from styrene, styrene oxide and / or phenylacetaldehyde, very particularly preferably styrene and / or styrene oxide.
  • the epoxide isomerase is a styrene oxide isomerase with EC number: 5.3.99.7 and the aldehyde dehydrogenase is a phenylacetaldehyde dehydrogenase with EC number: 1 .2.1 .39.
  • the alcohol dehydrogenase is a 2-phenylethanol dehydrogenase with EC no. 1 .1.1.
  • an organic solvent selected from the group of phthalic acid esters, more preferably bis (2-ethylhexyl) phthalate, 1, 2-cyclohexanedicarboxylic acid diisononylester and Mesamoll®, and / or the aliphatic branched and / or linear hydrocarbons, preferably having 5 to 16 carbon atoms, such as.
  • n-pentane, cyclopentane, n-hexane, cyclohexane, n-heptane, n-octane, cyclooctane, n-decane, n-dodecane or n-hexadecane For example, n-pentane, cyclopentane, n-hexane, cyclohexane, n-heptane, n-octane, cyclooctane, n-decane, n-dodecane or n-hexadecane.
  • the organic solvents mentioned are preferably used in a single-phase aqueous system for the extraction of the conversion of a substrate of the formula (III) or (IV).
  • the organic solvents mentioned serve in a two-phase system in the form of a second phase in addition to the aqueous component as a reservoir for a substrate of the formula (III) or (IV) and / or for the separation of the reaction product of the formula (I) and (II) , preferably of substituted or unsubstituted ketones and / or bicyclic derivatives, most preferably of bicyclic derivatives of the formula (II).
  • halogenated aliphatic hydrocarbons preferably having one or two carbon atoms, such as.
  • dichloromethane, chloroform, carbon tetrachloride, dichloroethane or tetrachloroethane aliphatic acyclic and cyclic ethers, preferably having 4 to 8 carbon atoms, such as.
  • diethyl ether methyl he / f-butyl ether, ethyl-he / f-butyl ether, dipropyl ether, diisopropyl ether, dibutyl ether, tetrahydrofuran or esters such.
  • reaction product of the formula (I) or (II) by extraction of the aqueous component with an organic solvent is preferably carried out after separation of the whole-cell catalyst in the form of biomass from the aqueous component, wherein the separation of the whole-cell catalyst in the form of biomass from the aqueous component is preferably carried out by centrifugation or filtration.
  • the extraction of reaction products of formula (I), wherein Ri OH, and the formula (II) with an organic solvent at a pH between 0 and 8, more preferably between 1 and 7, most preferably between 2 and 6, wherein advantageously high extraction ratios can be achieved.
  • the extraction ratio is a measure of the efficiency of the extraction and indicates how much product (in g) the organic solvent has absorbed in relation to the total content of product. The larger this value becomes, the better an organic solvent extracts the product.
  • the extraction ratio is greater than 4: 1, more preferably greater than 6: 1, and most preferably greater than 8: 1.
  • a distillation wherein preferably the organic solvent is separated off.
  • the separation of the organic solvent by evaporation takes place at a pressure between 0.1 and 1000 mbar, more preferably between 0.1 and 750 mbar, most preferably between 1 and 400 mbar.
  • the extraction of the aqueous component can also be carried out with pH-dependent methods of solid phase extraction.
  • pH-dependent methods of solid phase extraction For example, after the adjustment of an alkaline pH in the liquid component, anion exchangers or in the case of acidic pH ranges hydrophobic adsorber resins can be used as the adsorber.
  • the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and / or substituted or unsubstituted ketones and / or their bicyclic derivatives of the formula (I) and / or (II) preferably takes place in a single-phase, aqueous system or in a two-phase system.
  • the biocatalytic process for the synthesis of phenylacetic acid and / or its derivatives of the formula (I) and / or (II) takes place in a two-phase system.
  • organic solvents as mentioned above or ionic liquids, both of which are substantially immiscible with water, used as the second organic phase, wherein preferably the substrate in the accumulated organic phase.
  • Examples of known two-phase systems are in the writings of Panke et al. ⁇ Biotechnol. Bioeng. 2000, 69, 91-100) and Wubbolts et al. (Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 887-894).
  • Substantially water-immiscible organic phases are understood as meaning organic phases containing less than 1% by weight, preferably less than 0.5% by weight of water, based on the total weight of the organic phases.
  • Preferred substrates used for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and / or ketones according to the formula (I) are representatives of the formula (III), where:
  • the substituent R 1 is H or a linear C 1 to C 3 alkyl radical
  • the substituent R 2 is H or a branched or a linear C 1 to C 3 alkyl radical
  • the substituents R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, halogen, OH or R x , where R x an optionally substituted and / or branched C 1 to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or isobutyl,
  • radicals R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 are a substituent other than H (halogen, OH, R x , OR x or COOR x ), very particularly preferably only one of the radicals R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 is a substituent other than H.
  • a substrate of the general formula (III) is very particularly preferred:
  • 2-fluorostyrene, 3-fluorostyrene or 4-fluorostyrene 2-fluoro- ⁇ -alkylstyrene, 3-fluoro- ⁇ -alkylstyrene, 4-fluoro- ⁇ -alkylstyrene
  • 2-iodostyrene 3-iodostyrene or 4-iodostyrene
  • 2-iodo- ⁇ -alkylstyrene 3-iodo- ⁇ -alkylstyrene
  • 4-iodo- ⁇ -alkylstyrene 2-iodostyrene, 3-iodostyrene or 4-iodostyrene, 2-iodo- ⁇ -alkylstyrene, 3-iodo- ⁇ -alkylstyrene, 4-iodo- ⁇ -alkylstyrene
  • alkyl stands for a branched or linear C 1 to C 3 alkyl radical.
  • Preferred bicyclic substrates for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted bicyclic derivatives according to the general formula (II) are those of the formula (IV) where:
  • the substituent R 2 is H or a branched or linear C 1 to C 3 -alkyl radical (methyl, ethyl, isopropyl or n-propyl),
  • R 3 , R 4 , R 5 and R 6 and independently of one another are H, halogen, OH or R x , where R x is optionally a substituted and / or branched C 1 - to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n-propyl, isopropyl or isobutyl,
  • X is a CH 2 , O, NH or NR X , very particularly preferably CH 2 or NH, n is the number 0, 1 or 2, particularly preferably the number 0 or 1.
  • radicals R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are a substituent other than H (halogen, OH, R x , OR x or COOR x ), very particularly preferably only one of the radicals R 3 , R 4 , R 5 and R 6 is a substituent other than H.
  • a substrate of the general formula (IV) is very particularly preferred:
  • reaction products of the general formulas (I) and (II) can be synthesized biocatalytically in a particularly advantageous manner:
  • R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, OH or OR x , where R x is an optionally substituted and / or branched C 1 - to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n Propyl, isopropyl or isobutyl, in particular for the synthesis of derivatives of 4-hydroxyphenylacetic acid, (for example 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid (also homovanillic acid), derivatives of 3-hydroxyphenylacetic acid or derivatives of 2-hydroxyphenylacetic acid,
  • a) providing a whole-cell catalyst comprising:
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which encodes the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene C which encodes the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter. in an aqueous component
  • R 2 H the substituents R 3 , R 4 , R 5 , R 6 and R 7 independently of one another are H, OH or OR x , where R x is an optionally substituted and / or branched C 1 - to C 5 -alkyl radical, very particularly preferably methyl, ethyl, n Propyl, isopropyl or isobutyl, in particular for the synthesis of derivatives of 4-hydroxyphenylacetic acid, (for example 4-hydroxy-3-methoxyphenylacetic acid (also homovanillic acid), derivatives of 3-hydroxyphenylacetic acid or derivatives of 2-hydroxyphenylacetic acid,
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase
  • a gene E which codes for the enzyme alcohol dehydrogenase
  • a gene C which codes for the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • reaction products of the formula (I) in the whole-cell catalysts not only very restricted or preferably not further metabolized (ie degraded in the metabolism of the whole-cell catalyst) and accumulate in the aqueous component.
  • Reaction product of the formula (I) advantageously accumulates in the aqueous component as a consequence of the removal from the whole-cell catalyst, with preferably at least one reaction product of the formula (I) formed being isolated.
  • whole-cell catalysts in an aqueous component having an OD 6 oo in the range from 0.5 to 30 are preferably provided.
  • the activation of the whole-cell catalyst preferably takes place by contacting with an activator and / or an inducer by direct addition to the aqueous component in the form of liquid and / or solid or via the gas phase, whereby the whole-cell catalyst is converted into its active form.
  • the contacting with the activator and / or the inductor in over the reaction period at intervals of 1 to 96 h, more preferably 12 to 72 h, wherein the activator and / or inducer can be followed continuously or discontinuously.
  • the contacting of the whole-cell catalyst with a substrate of the formula (III) and / or (IV) preferably takes place via the gas phase after activation of the whole-cell catalyst and / or by direct addition to the liquid component in the form of a liquid and / or solid, the substrate being absorbed by the whole-cell catalyst (ie taken up) and by at least one enzyme as described above selected accordingly from A, B, C, D and E. , is biocatalytically reacted to a reaction product of formula (I) and / or (II).
  • the contacting of the whole-cell catalyst with a substrate of the formula (III) and / or (IV) is preferably carried out in portions.
  • the invention also encompasses recombinant bacterial cells, preferably negative mutants and / or insertion mutants for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acid and / or cyclic derivatives thereof according to the formula (III) and / or formula (IV):
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which encodes the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene C which codes for the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • the invention also encompasses recombinant bacterial cells, preferably negative mutants and / or insertion mutants for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acid and / or cyclic derivatives thereof according to the formula (III) and / or formula (IV):
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • the gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase
  • a gene E which encodes the enzyme alcohol dehydrogenase
  • a gene C which codes for the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • the recombinant bacterial cells are negative mutants of authentic bacterial cells or insertion mutants.
  • the genes A, B and / or C of the recombinant bacterial cells contain artificial reading frames.
  • the genes D and / or E of the recombinant bacterial cells contain artificial reading frames
  • the regulatable promoters of the recombinant bacterial cells preferably differ from one another, so that the promoters can be activated in a primary-signal-specific manner.
  • the presence of different activators and / or inducers in the whole-cell catalyst can thus lead to the expression of selected genes A, B, D, E and / or C, which minimizes the stress resulting from gene expression for a recombinant cell.
  • Suitable are u. a. commercially available systems based on the / ac operon, on T7 promoters, on trp and phoA as well as arledge regulators, wherein the induction can be realized depending on the system with IPTG, tryptophan, by phosphate deficiency or with arabinose.
  • the invention also provides a kit for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and / or ketones and / or their bicyclic derivatives according to the formula (I) and / or formula (II) comprising:
  • the bacterial biomass in the form of bacteria for a biocatalytic synthesis process according to the invention can be obtained by precultivation of the whole cell catalysts contained in a kit according to the invention (culturing on complete medium and minimal medium), for example by culturing in complete medium, such as LB medium (DSM medium No. 381), but preferably by culturing in a medium which is capable of generating high cell densities, for example by culturing in minimal medium, such as DSM medium no. 55), in particular greater than 1 x 10 9 cells per mL.
  • the cultivation of this preculture contain whole-cell catalysts of a kit according to the invention is preferably carried out in laboratory shaking flasks, but to produce larger amounts of bacterial biomass is also the cultivation under controlled conditions in the fermenter possible.
  • kit of the invention contained whole cell catalysts (culturing on complete medium and minimal medium), this biomass in the aqueous component for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and / or ketones and / or their bicyclic derivatives according to the formula (I) and / or formula (II) be transferred.
  • the invention also provides authentic bacterial cells for the biocatalytic synthesis of substituted or unsubstituted phenylacetic acids and / or ketones and / or their bicyclic derivatives according to the formula (I) and / or formula (II), the authentic bacterial cells being selected from Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis and Corynebacterium, more preferably from Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 and Pseudomonas putida S12.
  • the wild-type strain from Sphingopyxis sp. Kp5.2 (DSM 28731).
  • the deposit of the strain Kp5.2 (DSM 28731) took place on 30.04.2014 in the German strain collection of microorganisms and cell cultures GmbH (DSMZ, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig), according to "Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the purposes of patent proceedings ".
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which encodes the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene C which encodes the enzyme aldehyde dehydrogenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • the authentic bacterial cells are Gordonia, more preferably Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758).
  • the deposit of the strain Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) took place on 30.04.2014 at the German strain collection of microorganisms and cell cultures GmbH (DSMZ, Mascheroder way Ib, D-38124 Braunschweig, according to "Budapest contract over the international acknowledgment of the deposit of microorganisms for the purposes of patent procedure".
  • the strain CWB2 (DSM 46758) is characterized by: i. a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter,
  • the gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase
  • a gene E which encodes the enzyme alcohol dehydrogenase, and which are functionally placed under the control of a regulatable promoter.
  • the invention also relates to the use of recombinant bacterial cells, preferably negative mutants and / or insertion mutants for a method according to the invention or a kit according to the invention.
  • the invention also provides an aqueous component comprising at least one reaction product of the formula (I) or (II) obtained by the process according to the invention described above, comprising:
  • a gene A which codes for the enzyme styrene monooxygenase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • a gene B which codes for the enzyme epoxide isomerase and is functionally placed under the control of a regulatable promoter and / or iii.
  • a gene D which codes for the enzyme styrene oxide reductase, in combination with a gene E which encodes the enzyme alcohol dehydrogenase, and which are functionally placed under the control of a regulatable promoter
  • reaction products in the whole-cell catalysts are not further metabolized (ie degraded in the metabolism of the whole-cell catalyst) and accumulate in the aqueous component.
  • Fig. 1 Metabolism of the styrene by side chain oxidation by the enzymes styrene monooxygenase (SMO), styrene oxide isomerase (SOI) and phenylacetaldehyde dehydrogenase (PAADH), or monooxygenase (SMO), styrene oxide reductase (SOR), alcohol dehydrogenase ( ADH) and phenylacetaldehyde dehydrogenase (PAADH), with the resulting phenylacetic acid being added to the tricarboxylic acid cycle (TCC) via subsequent intermediates (based on Velasco et al., [J. Bacteriol., 1998, 180, 1063-1071], modified; O'Leary et al., [FEMS Microbiol., Rev. 2002, 26, 403-417], modified).
  • SMO styrene monooxygenase
  • SOI styrene oxide is
  • FIG. 2 Reconstitution of substituted styrenes using Pseudomonas fluorescens ST as an authentic whole-cell catalyst, the product concentrations [mM] being shown after 12 h starting from 1.25 mM substrate.
  • FIG. 3 Sales of substituted styrenes using Sphingopyxis sp. Kp5.2 as an authentic whole-cell catalyst, with the product concentrations [mM] shown after 12 h starting from 1.25 mM substrate.
  • FIG. 4 Sales of substituted styrenes using Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) as an authentic whole-cell catalyst, with product concentrations [mM] shown after 12 h starting from 1.25 mM substrate.
  • FIG. 5 conversion of 4-chlorostyrene using Pseudomonas fluorescens ST as authentic whole-cell catalyst, wherein the amounts of substance [ ⁇ ] of substrate and product are shown over a period of 186 days.
  • Fig. 6 conversion of 4-chlorostyrene using Pseudomonas fluorescens ST as authentic whole-cell catalyst, wherein the amounts of substance [ ⁇ ] of substrate and product over a period of 348 days are shown.
  • FIG. 7 HPLC chromatograms and UV-VIS product spectrum for the conversion of 4-vinylguaiacol into homovanillic acid using Pseudomonas fluorescens ST as authentic whole-cell catalyst.
  • FIG. 8 conversion of 4-vinylguaiacol into homovanillic acid using Gordonia sp. CWB2 as authentic whole-cell catalyst, with product concentrations reached [mM] within 12 days.
  • the cultivation of whole-cell catalysts was carried out on minimal medium (modified according to Dorn, E., Hellwig, M. Reineke, W. Knackmuss, H.-J. (1974) Isolation and characterization of a 3- chlorobenzoate-degrading pseudomonad, Arch Microbiol 99: 61-70), which consists of the following separately autoclaved stock solutions:
  • the carbon source used was glucose or fructose.
  • Yeast extract added in a final concentration of 0.07 to 0.1% (w / v).
  • Table 2 12-hour conversion yields of styrenes with cells of Sphingopyxis sp. Kp5.2
  • the aqueous component was incubated with the whole cell catalysts for 6 days in the presence of styrene (as an inducer).
  • the induction with styrene was in this example only after the harvest and the washing step, but can also be done in advance.
  • Styrene was fed via the gas phase by means of an evaporator attachment (about 17-26 ⁇ every 1-3 days, before each re-feeding the piston was vented).
  • the substrate 4-chlorostyrene in portion sizes of 20-40 ⁇ was added via the gas phase.
  • the reaction product 4-chlorophenylacetic acid could be detected in the aqueous component.
  • a 1 L flask containing 200 ml of minimal medium, once 0.05% yeast and 5 mM glucose was inoculated with preculture of a type of whole cell catalysts (Pseudomonas fluorescens ST) and biomass was grown to an OD 6 oo of 1 by addition of glucose. Subsequently, the contents of the flask were sterile harvested by centrifugation (4 ° C, 5000 xg, 30 min), the pellet washed with sterile water or 25 mM phosphate buffer (pH 7) and subsequently resuspended in a suitable volume of minimal medium.
  • the aqueous component was incubated with the whole cell catalysts for 6 days in the presence of styrene (as an inducer).
  • the induction with styrene was in this example only after the harvest and the washing step, but can also be done in advance.
  • Styrene was fed via the gas phase by means of an evaporator attachment (about 18-26 ⁇ every 1 -3 days, before each re-feeding the piston was vented).
  • the substrate 4-chlorostyrene in portion sizes of 21 -42 ⁇ added via the gas phase.
  • the reaction product 4-chlorophenylacetic acid could be detected in the aqueous component.
  • Example 6 Stereoselective conversion of 4-chloro-cr-methylstyrene with Pseudomonas fluorescens ST
  • Embodiment 4 and 5 Cultivation and recovery of one type of whole-cell catalysts were carried out as indicated in Embodiment 4 and 5.
  • the substrate 4-chloro-a-methylstyrene in portion sizes of 20-40 ⁇ was added via the gas phase over a period of several days in addition to about 17 ⁇ styrene (as an energy source and inductor).
  • the reaction product 4-chloro-a-methylphenylacetic acid could be detected in the culture medium.
  • a 500 mL flask containing 100 mL minimal medium and 12.5 mM glucose was inoculated with preculture of one type of whole cell catalysts (Pseudomonas fluorescens ST) and biomass was grown to an OD 6 oo of 3.7 by addition of glucose. Subsequently, the aqueous component was incubated with the whole cell catalysts for a further day in the presence of styrene (as an inducer).
  • the reaction product homo-vanillic acid could be detected in each case in the aqueous component.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Synthesevon substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen aus Styrolen und bicyclischenaromatischen Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Enzymen des mikrobiellen Styrolabbaus in einem Ganzzellsensor, sowie ein Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonenenthaltend einen Ganzzellkatalysator und die Verwendung des Verfahrens, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: a)Bereitstellung von mindestens einem Typ an Ganzzellkatalysator, enthaltend Gene, die für die Enzyme des Styrolabbauskodieren und die funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind,in einer wässrigen Komponente, b)Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, zur Expression der Gene führt, c)Kontaktieren des aktivierten Ganzzellkatalysatorsmit einem Substrat, d)Isolierung der gebildeten Reaktionsprodukte, die vorteilhaft von dem Ganzzellkatalysator nicht weiter verstoffwechselt werden sich vorteilhaftin der wässrigen Komponente anreichern.

Description

Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen mit Enzymen des mikrobiellen Styrolabbaus
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen aus Styrolen und bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen unter Verwendung von Enzymen des mikrobiellen Styrolabbaus in einem Ganzzellsensor, sowie ein Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen enthaltend einen Ganzzellkatalysator und die Verwendung des Verfahrens. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner neue Bakterienstämme zur biokatalytischen Synthese von substituierten und unsubstituierten Phenylessigsäuren und Ketonen aus Styrolen und bicyclischen aromatischen Kohlenwasserstoffen.
Phenylessigsäuren und strukturell verwandte Verbindungen gehören zu einer industriell bedeutsamen Verbindungsklasse. Neben der Verwendung solcher Verbindungen als Aroma- und Geschmacksstoffe (Fahlbusch et al. [Wiley-VCH 2012, 130]) haben sie aufgrund ihrer meist entzündungshemmenden, antimykotischen und antimikrobiellen Wirkung eine hohe Bedeutung für die Pharmazie und Kosmetikindustrie (Milne et al. [J. Org. Chem. 2011 , 76, 9519-9524], Zhu et al. [Food Chem. 2011 , 124, 298-302]). Die σ-Methylphenylessigsäuren stellen u. a. wichtige Vorstufen bei der Synthese von Hepatitis C-Polymerase-Inhibitoren (Wagner et al. [J. Med. Chem. 2009, 52, 1659-1669]) sowie von Histamin-2-Rezeptor- Antagonisten (Ghorai et al. [J. Med. Chem. 2008, 51, 7193-7204]) dar. So kann aus 4-Chlor- σ-methylphenylessigsäure das Anticholinergikum Hyoscyamin synthetisiert werden (Gualtieri et al. [J. Med. Chem. 1994, 37, 1704-171 1 ]). Verschiedene Methyl-, Methoxy-, Chlor-, Fluor- sowie Brom-substituierte Phenylessigsäuren finden ebenso Anwendung als wichtige Synthesevorstufen in der Pharmazie, beispielsweise bei der Darstellung antimykotisch wirksamer Dihydrofurane (Pour et al. [Bioorg. Med Chem. 2003, 11, 2843- 5866]). 4-Fluorphenylessigsäuren werden u. a. bei der Herstellung von Medikamenten gegen Störungen des Magen-Darm-Traktes, des Nervensystems, der Blasenfunktion (US 7,683,068 B2) sowie zur Synthese von Präparaten zur Replikationsinhibierung des Picornavirus (Hamdouchi et al. [J. Med. Chem. 2003, 46, 4333-4341]) eingesetzt.
4-Methylphenylessigsäure stellt dagegen u. a. einen wichtigen Präkursor für die Gewinnung von Wirkstoffen gegen Krebs dar (Luo et al. [Bioorg. Med. Chem. 2011 , 19, 6069-6076], Wei et al. [J. Med. Chem. 2007, 50, 3674-3680]). Phenylessigsäure und ihre Derivate haben darüber hinaus eine essentielle Bedeutung als Synthesebausteine für Analgetika wie z. B. Ibuprofen und Diclofenac sowie als Vorstufen für die Synthese von Penicillinen. So kann aus p-Hydroxyphenylessigsäure das natürlich vorkommende Penicillin X synthetisiert werden (Corse et at. [J. Am. Chem. Soc. 1948, 70, 2837-3843]), wohingegen die unsubstituierte Phenylessigsäure als Vorstufe für Penicillin G eingesetzt wird (Douma et al. [Biotechnol. Prog. 2012, 28, 337-348]).
Aufgrund der vielfältigen Anwendungsmöglichkeiten von Phenylessigsäure und ihren Derivaten wurden verschiedene chemische Synthesen zur Herstellung dieser Verbindungen etabliert.
US 4,237,314 A offenbart ein Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure durch die Reaktion von Essigsäure und Benzol in Gegenwart von Tellurhalogenid-Katalysatoren, wobei Temperaturen zwischen 100 und 200°C sowie hohe Drücke von bis zu 15 bar notwendig sind. Neben den hohen ökonomischen und ökologischen Nachteilen basierend auf dem erheblichen Energiebedarf entsteht bei dieser Darstellungsvariante stark giftige und ätzende Bromessigsäure als Nebenprodukt.
US 4,220,592 A offenbart ein zweistufiges Verfahren, wobei durch Hydrolyse substituierter Acetonitrile die korrespondierende Phenylessigsäure hergestellt wird. Im Rahmen dieser Synthesestrategie lassen sich Ausbeuten von 50 bis 95% realisieren. Der hohe Verbrauch an Mineralsäuren von 60 bis 70 Gew.-% und die notwendigen Reaktionstemperaturen von bis zu 250°C kennzeichnen allerdings die erheblichen ökologischen sowie ökonomischen Nachteile dieser Synthese
Taqui Khan et al. {J. Mol. Catal. 1988, 44, 179-181 ) und Qui et al. {J. Nat. Gas Chem. 2005, 14, 40-46) offenbaren ein Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäuren basierend auf der Carbonylierung von Benzylchlorid unter Verwendung von Ruthenium(lll)-EDTA- Komplexen bzw. 2-Chlorbistriphenylphosphin. Aufgrund des Entstehens von Nebenprodukten und des hohe Bedarfs an konzentrierten Säuren ist das Verfahren aus ökologischer Sicht bedenklich. Nickeltetracarbonyl- bzw. Nitrosyltricarbonylferrat- Katalysatoren erlauben ebenso die Umsetzung von Benzylchlorid zu Phenylessigsäure, wobei Ausbeuten von circa 90% erreicht werden. Allerdings erfordert auch diese Umsetzung hohe Drücke von 10 bar und eine Temperatur von 80°C (Bertleff 2005, 13 f.]).
Alternativ kann Phenylessigsäure auch durch die chemische Umsetzung von Benzylalkohol bei 175°C und 71 bar in Gegenwart von Rhodiumkatalysatoren gewonnen werden (Bertleff [l l/Y/ey-\/CH 2005, 13 f.]).
Chen et al. {J. Org. Chem. 1999, 64, 9704-9710) offenbaren ein mehrstufiges Verfahren zur Gewinnung von Phenylessigsäure-Derivaten durch die chemische Umsetzung von Styrolen mittels Hydroborierung bei -66°C und anschließender Homologisierung bei -100°C, wobei auch hier der erhebliche Energieaufwand während des Reaktionsverfahrens zu betonen ist. Milne et at. {J. Org. Chem. 2011 , 76, 9519-9524) offenbaren ein Verfahren zur Synthese substituierter und unsubstituierter Phenylessigsäuren durch die Jodid-katalysierte Reduktion entsprechender Mandelsäuren, wobei in Abhängigkeit der verwendeten Reduktionsmittel Ausbeuten von 41 % bis 100% erzielt werden. Das Verfahren ist allerdings zeit- und energieaufwendig, da die Produkte nach einer dreitägigen Reaktion bei Temperaturen von 95°C über ein mehrstufiges Aufbereitungsverfahren isoliert werden müssen.
Bekannte chemische Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure und ihren Derivaten weisen vielfach große Nachteile auf, da zum einen die Verwendung kostenintensiver Edukte, hoher Reaktionstemperaturen und Drücke sowie teils langwieriger und vielstufiger Verfahren aus ökonomischer Sicht nachteilig und zum anderen der Einsatz großer Volumina an konzentrierten Säuren und Basen ökologisch bedenklich ist. Gleichzeitig werden in vielen Fällen nur geringe Ausbeuten erreicht, wobei z. T. die Bildung toxischer Nebenprodukte in Kauf genommen werden muss.
Des Weiteren entstehen bei den bekannten chemischen Verfahren oft racemische Gemische, die beispielsweise für pharmazeutische Anwendung in ihre Enantiomere getrennt werden müssen. Daher sind selektive Synthesen wünschenswert, bei denen ein Enantiomer in hohem Überschuss gebildet wird..
Chavda et al. (Chirality 2007, 19, 366-373) offenbaren hierin ein aufwendiges, chemisches Verfahren zur enantioselektiven Synthese von 2-Phenylpropionsäure aus Tetrahydrofuran und Benzophenon.
Alternativ zu den vielfältigen chemischen Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäuren existieren auch einige biotechnologische Verfahren.
Gilligan et al. {Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993, 39, 720-725) offenbaren die Gewinnung von (S)-2-Phenylpropionsäure mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 99% durch die enzymatische Umsetzung von (R,S)-2-Phenylpropionitril mit den Enzymen Nitril-Hydratase und Amidase aus Rhodococcus equi TG328.
Eine Amidase aus Agrobacterium tumefaciens d3 setzt racemisches 2-Phenylpropionamid ebenfalls stereoselektiv zu 95% in (S)-2-Phenylpropionsäure um, wobei lediglich die Hälfte des eingesetzten Eduktes umgesetzt wird (Trott ei al. [Microbiology 2W\ , 147, 1815-1824]).
Sosedov ei al. (Appl. Environ. Microbiol. 2010, 76, 3668-3674) offenbaren die direkte Hydrolyse von Arylacetonitril zu Carbonsäuren und Ammoniak mit Hilfe einer aus Pseudomonas fluorescens EBC191 stammenden, rekombinant gewonnenen Arylacetonitrilase. Die benötigten Arylacetonitrile sind jedoch teure Ausgangstoffe.
Im Gegensatz dazu gehören Styrole zu einem der industriell wichtigsten Edukte für die Herstellung großtechnischer Erzeugnisse (u. a. für die Herstellung diverser Kunststoffe), weshalb sie eine kostengünstige und verfügbare Alternative zu den o. g. Edukten darstellen. Allein in den USA wurden im Jahre 1990 über 3 Millionen Tonnen Styrol hergestellt, weltweit waren es im Jahre 1996 ca. 14,7 Millionen Tonnen.
Es ist deshalb Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein biotechnologisches Verfahren zur Umsetzung derartiger Substrate zu substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren zyklischer Derivate bereitzustellen, das ökologisch unbedenklich und ökonomisch vorteilhaft ist.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein biokatalytisches Verfahren zur Synthese einer substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsaure und/oder eines substituierten oder unsubstituierten Ketons und/oder eines bizyklischen Derivates gemäß der allgemeinen Formel (I) und/oder Formel (II)
(l) Iii) durch die biokatalytische Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (I II) und/oder Formel (IV)
(III) (iv)
der Substituent R1 H, OH oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, wobei * ein Chiralitätszentrum ist,
die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis Ci0-Alkylrest ist,
- X CH2, O, NH, NRX, S oder S02 ist,
n die Zahl 0, 1 oder 2 ist und
wobei für Substrate der Formel (III) R1 nicht OH ist.
gelöst, das die folgenden Schritte umfasst:
a) Bereitstellung von mindestens einem Typ an Ganzzellkatalysator, enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und/oder iii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind
in einer wässrigen Komponente,
b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene A, B und/oder D und E führt,
c) Kontaktieren des aktivierten Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) umgesetzt wird,
d) Isolierung mindestens eines gebildeten Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II).
Überraschend hat sich gezeigt, dass nach der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (III) oder (IV) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) die Reaktionsprodukte in den Ganzzellkatalysatoren nicht weiter verstoffwechselt (d. h. im Stoffwechsel des Ganzzellkatalysators abgebaut) werden und sich in der wässrigen Komponente anreichern. Vorteilhaft reichern sich Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) in Folge des Ausschleusens aus dem Ganzzellkatalysator in der wässrigen Komponente an.
Der vorliegenden Erfindung liegt die jüngst gewonnene Erkenntnis zu Grunde, dass substituierte Substrate mit der allgemeinen Formel (III) oder (IV) durch die Styrol- Monooxygenase, Epoxid-Isomerase, Styroloxid-Reduktase und Alkohol-Dehydrogenase verstoffwechselt werden.
Überraschend ist, dass das im Zellmetabolismus nachgeordnete Enzym Phenylacetyl-CoA- Ligase nur sehr eingeschränkt oder vorzugsweise nicht in der Lage ist, substituierte Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) zur weiteren Verstoffwechslung zu nutzen und sich diese Reaktionsprodukte in der wässrigen Komponente anreichern.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat somit den Vorteil, dass durch die Verwendung von Ganzzellkatalysatoren bevorzugt zwei Enzyme (Styrol-Monooxygenase und Epoxid-Isomerase, Fig. 1 ), besonders bevorzugt alle drei Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid- Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase, Fig. 1 ) simultan für die biokatalytische Synthese von Phenylacetaldehyd-Derivaten als Vorstufe der Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten, besonders bevorzugt von Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten gemäß der Formel (I) bzw. (II) eingesetzt werden können, da die Stabilität der genannten drei Enzyme im Rahmen der biochemischen Synthese erhöht ist und zu einer stabileren Prozessführung beiträgt. Durch die Variation der Prozessführung hinsichtlich der Form der Substratzugabe (bevorzugt über die Gasphase, direkt zum Medium, Zweiphasensystem) kann diese auf die Zelldichte und den verwendeten Organismus angepasst werden, wodurch ein optimaler biokatalytischer Umsatz von Substraten der allgemeinen Formel (III) oder (IV) und eine möglichst lange Prozesslaufzeit ermöglicht wird.
Nach einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthält der Ganzellkatalysator
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist. Nach einer alternativ bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden Ganzzellkatalysatoren verwendet, bei denen für die biokatalytische Synthese von Phenylacetaldehyd-Derivaten als Vorstufe der Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten, besonders bevorzugt von Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten gemäß der Formel (I) bzw. (II) simultan die drei Enzyme Styrol-Monooxygenase, Styroloxid-Reduktase und Alkohol-Dehydrogenase, besonders bevorzugt die Enzyme Styrol-Monooxygenase, Styroloxid-Reduktase, Alkohol-Dehydrogenase und Aldehyd-Dehydrogenase eingesetzt werden können. Bevorzugt enthält der Ganzzellsensor:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
Die Styrol-Monooxygenase ist ein Enzym in Bakterien, das die chemische Umsetzung von Styrol mit Flavin-Adenin-Dinukleotid (FADH2) gemäß der Reaktion:
Styrol + FADH2 + 02 <-> (S)-2-Phenyloxiran + FAD + H20 als ersten Schritt des aeroben Styrol-Abbauweges (d. h. in Gegenwart von Sauerstoff) in Bakterien zum Zwischenprodukt (S)-2-Phenyloxiran (Styroloxid) katalysiert. FAD wird dabei von der Reduktase-Untereinheit der Styrol-Monooxygenase unter NADH-Verbrauch wieder regeneriert.
Die Epoxid-Isomerase ist ein natürlich vorkommendes Enzym, das zur Klasse der Isomerasen gehört und die chemische Umsetzung des Zwischenproduktes Styroloxid zu Phenylacetaldehyd katalysiert.
Die Styroloxid-Reduktase ist ein Enzym, welches Styroloxid in 2-Phenylethanol umwandelt und dabei von zellinternen Cofaktoren abhängig ist. Bevorzugt sind Cofaktoren NADH oder NADPH. Die Alkohol-Dehydrogenase ist ein Enzym, welches die Umwandlung von Alkoholen in Aldehyde katalysiert. Das Enzym ist von Cofaktoren abhängig. Bevorzugt sind Cofaktoren NAD+, NADP+, Cytochrome. Zudem ist das Enzym in der Lage, auch die Umkehrreaktion durchzuführen.
Die Aldehyd-Dehydrogenase ist eine Oxidoreduktase und ist ausgewählt aus einer Gruppe von Enzymen, die im Stoffwechsel von Lebewesen Aldehyde zu Carboxylaten oxidieren.
Bei der Epoxid-Isomerase handelt es sich bspw. um ein Cofaktor (NADH und FAD)- unabhängiges Enzym. Styrol-Monooxygenasen sind dagegen vorzugsweise Cofaktor- abhängig, wobei FADH2 zu FAD enzymatisch umgesetzt wird. FADH2 als Energieträger im Rahmen der biokatalystischen Reaktion geht jedoch nicht verloren, da es über den enzymatischen Umsatz mit einer Aldehyd-Dehydrogenase über die Zwischenverbindung NADH regeneriert wird.
Vorteilhafterweise handelt es sich bei einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von Vertretern der allgemeinen Formel (I) und/oder Formel (II) unter Einsatz von Ganzzellkatalysatoren, welche die Gene A, B und C bzw. A, C, D, E oder A, B, C, D, E enthalten, um ein s. g. quasi Cofaktor-unabhängiges System, da die notwendigen Cofaktoren (NADH und FADH2) als Energieträger in situ regeneriert werden.
Die entsprechenden Gen- und Aminosäuresequenzen für die genannten Enzyme (Styrol- Monooxygenase, Epoxid-Isomerase, Alkohol-Dehydrogenasen und Aldehyd- Dehydrogenase) sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. NCBI; RCSB PDB; UniProt; PDB Europa) entnommen werden.
Die Gene A, B, C, D und E, die für die genannten Enzyme kodieren, sind funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt, wobei die Promotoren identisch oder untereinander unterschiedlich sein können.
Erfindungsgemäß erfolgt die Aktivierung des Ganzzellkatalysators signalabhängig durch das Kontaktieren mit einem Aktivator und/oder einem Induktor, wobei die Induktion der Expression der Gene A, B, C, D, Esignalabhängig induziert und der Ganzzellkatalysator in seine aktive Form überführt wird. Vorzugsweise aktivieren die Aktivatoren bzw. Induktoren den regulierbaren Promotor (im Sinne der Anmeldung auch Operator genannt), in dem sie direkt mit einem regulierbaren Promotor interagieren bzw. in dem sie an ein Repressorprotein binden, das sich daraufhin vom Promotor löst. Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Aktivator und/oder Induktor werden die o. g. Enzyme (Styrol- Monooxygenase, Epoxid-Isomerase, Styroloxid-Reduktase, Alkohol-Dehydrogenase und Aldehyd-Dehydrogenase) in dem Ganzzellkatalysator synthetisiert und stehen somit für die biokatalytische Umsetzung eines Substrates der Formel (III) und/oder (IV) zur Verfügung.
In einer Ausgestaltung der Erfindung unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Aktivatoren und/oder Induktoren in dem Ganzzellkatalysator zur Expression ausgewählter Gene führen, wodurch der Stress für eine rekombinante Zelle minimiert wird.
Die entsprechenden Nukleinsäuresequenzen für Promotoren (bspw. T7-Promotor bei pET16- Expressionsystemen), die für ein erfindungsgemäßes Verfahren eingesetzt werden können, sind dem Fachmann bestens bekannt oder können bekannten Datenbanken (z. B. EPD; TRED; MPromDB) entnommen werden. Vorteilhaft können für ein erfindungsgemäßes Verfahren neben künstlich in Organismen eingebrachte Promotoren ebenfalls natürliche Promotoren eingesetzt werden.
Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren der Ganzzellkatalysatoren mit einem Aktivator und/oder Induktor in einer Konzentration des Aktivators und/oder Induktors bezogen auf das Gesamtvolumen der wässrigen Komponente zwischen 1 und 1000 μΜ, besonders bevorzugt zwischen 10 und 800 μΜ, ganz besonders bevorzugt zwischen 25 und 500 μΜ, wobei der Aktivator und/oder Induktor kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden kann.
Durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) findet innerhalb eines Ganzzellkatalysators mit mindestens einem Enzym von Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und/oder Aldehyd-Dehydrogenase eine biokatalytische Umsetzung zu einem korrespondierenden Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) statt. D. h., dass erfindungsgemäße Substrate der Formel (III) zu Reaktionsprodukten der Formel (I) bzw. Substrate der Formel (IV) zu Reaktionsprodukten der Formel (II) biokatalytisch umgesetzt werden.
Alternativ findet durch das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) innerhalb eines Ganzzellkatalysators mit mindestens den Enzymen Styrol-Monooxygenase, Styroloxid-Reduktase und Alkohol-Dehydrogenase und/oder Aldehyd-Dehydrogenase eine biokatalytische Umsetzung zu einem korrespondierenden Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) statt. Erfindungsgemäß wird das Substrat der Formel (III) und/oder (IV) von dem Ganzzellkatalysator resorbiert (d.h. Aufnahme in die Zelle) und durch mindestens ein Enzym, wie oben beschrieben entsprechend ausgewählt aus A, B, C, D und E, zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) biokatalytisch umgesetzt.
Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) durch das Einleiten des Substrates über die Gasphase und/oder durch direkte Zugabe zur flüssigen Komponente in Form als Flüssigkeit und/oder Feststoff. Bei direkter Zugabe zum Ganzzellbiokatalysator kann zudem eine organische Phase als Substratreservoir Anwendung finden, wodurch die Prozesslaufzeit optimiert werden kann.
Im Falle, dass das Substrat ein Vertreter der allgemeinen Formel (III) bzw. (IV) ist, wobei R2 nicht H ist (d. h. R2 ist ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest), weisen die korrespondierenden Reaktionsprodukte der Formel (I) bzw. (II) am C-Atom mit dem Rest R2 ein Chiralitätszentrum (*) auf.
Alle Enantiomere und racemischen Gemische von Reaktionsprodukten der Formel (I) und (II) können durch ein erfindungsgemäßes Verfahren gebildet werden und sind dabei grundsätzlich durch ein erfindungsgemäßes Verfahren als mitumfasst anzusehen.
Dabei wurde überraschend gefunden, dass bei der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates der allgemeinen Formel (III) bzw. (IV), wobei R2 nicht H ist, sich einzelne Enantiomere, bevorzugt in einer definierten Konfiguration, ganz besonders bevorzugt S- oder R-Konfiguration mit einem hohen Enantiomerenüberschuss bilden. Bevorzugt beträgt der Enantiomerenüberschuss mindestens 20%, besonders bevorzugt mindestens 40%.
Alternativ bevorzugt können die Reaktionsprodukte der allgemeinen Formel (I) und/oder (II) als racemisches Gemisch mit einem Enantiomerenüberschuss zwischen 0 und 20%, bevorzugt zwischen 0 und 10% vorliegen, ganz besonders bevorzugt zwischen 0 und 5%.
Der Enantiomerenüberschuss (ee in %) ist definiert als
wobei R und S die molare Konzentration des R- bzw. S-konfigurierten Enantiomers bedeutet und stets ein positiver Wert erhalten wird.
Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die drei Gene A, B und C enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt: wobei R1 H oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl) ist,
R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen oder Rxsind,
wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis Ci0-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
wobei deren korrespondierende Säuren oder Ketone (d. h. wenn R1 nicht H ist) gemäß Formel (I) gebildet werden.
Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die Gene A, C, D und E enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt:
wobei R1 H oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl, n-Propyl) ist,
R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen, OH, ORx oder Rx, ganz besonders bevorzugt H, Halogen oder Rx sind,
wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C8-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
wobei deren korrespondierende Säuren oder Ketone (d. h. wenn R1 nicht H ist) gemäß Formel (I) gebildet werden.
Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (III), wobei zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent sind (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx), ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die zwei Gene A und B enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt: wobei R1 H oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen oder Rx sind,
wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis Ci0-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl ist,
wobei deren korrespondierende Aldehyde oder Ketone (d. h. R1 ist nicht OH) gemäß Formel (I) gebildet werden.
Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die Gene A, D und E enthalten, Substrate der Formel (III) eingesetzt:
wobei R1 H oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest, besonders bevorzugt H oder Methyl ist,
R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen, OH, ORx oder Rx sind,
wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C8-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl ist,
wobei deren korrespondierende Aldehyde oder Ketone (d. h. R1 ist nicht OH) gemäß Formel (I) gebildet werden.
Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (III), wobei zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
Erfindungsgemäß werden bei dem Kontaktieren von aktivierten Ganzzellkatalysatoren, die die Gene A, B und/oder C enthalten, vorzugsweise authentische Bakterienzellen, bizyklische Substrate der Formel (IV) eingesetzt, wobei: der Substituent R2 ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
die Substituenten R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx, besonders bevorzugt H, Halogen, OH, ORx oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C8-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl ist.
- X ein CH2, O, NH, NRX, S oder S02, besonders bevorzugt CH2, O, NH oder NRX, ganz besonders bevorzugt CH2 oder NH ist,
n die Zahl 0, 1 oder 2, besonders bevorzugt die Zahl 0 oder 1 ist,
wobei deren korrespondierende bizyklische Ketone gemäß Formel (II) gebildet werden.
Besonders bevorzugt sind Substrate der Formel (IV), wobei zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent ist.
Das Substrat gemäß Formel (III) und/oder (IV) wird vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 0,1 und 10 mM, besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 5 mM, ganz besonders bevorzugt zwischen 0,2 und 2,5 mM in einer biokatalytischen Umsetzung eingesetzt und kann kontinuierlich oder diskontinuierlich nach geführt werden.
Bevorzugt beträgt der Gehalt eines Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) nach der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates der Formel (III) bzw. (IV) mindestens 30 mol- %, besonders bevorzugt mindestens 40 mol-%, ganz besonders bevorzugt mindestens 50 mol-% des Gehalts an ursprünglich zugesetztem Substrat.
Gegebenenfalls ist es wünschenswert, dass das Substrat und das korrespondierende Reaktionsprodukt in einem definierten Verhältnis abweichend zu dem vorgenannten Verhältnis zueinander vorliegen. In diesem Fall kann die Reaktion jederzeit unterbrochen werden.
Bevorzugt wird das Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II) von dem Ganzzellkatalysator in die wässrige Komponente sekretiert, wodurch die Isolierung mindestens eines Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) von der Biomasse und der wässrigen Komponente begünstigt wird. Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) von der Biomasse und der wässrigen Komponente schrittweise, wobei in einem ersten Schritt durch Zentrifugation oder Filtration die Biomasse von der wässrigen Komponente, enthaltend ein Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II), abgetrennt wird.
Vorangegangene und nachfolgende Quellennachweise sind nur insoweit aufgeführt, als dass sie für das Verständnis der Erfindung für den Fachmann notwendig sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist ein Typ der Ganzzellkatalysatoren ausgewählt aus rekombinanten (d. h. genetisch veränderten) und/oder authentischen Bakterienzellen.
Die Methoden zur Kultivierung rekombinanter und/oder authentischer Bakterienzellen sind dem Fachmann bekannt, wobei die Bakterienzellen kontinuierlich oder diskontinuierlich im batch-Verfahren (Satzkultivierung) oder im fed-batch (Zulaufverfahren) oder repeated fed- batch Verfahren (repetitives Zulaufverfahren) zum Zwecke der Anzucht oder der biokatalytischen Umsetzung eines Substrates mit der allgemeinen Formel (III) bzw. Formel (IV) kultiviert werden. Eine Zusammenfassung über bekannte Kultivierungsmethoden sind im Lehrbuch von Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991 )) oder im Lehrbuch von Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)) beschrieben.
Die zu verwendende wässrige Komponente muss in geeigneter Weise den Ansprüchen der jeweiligen Bakterienstämme genügen. Beschreibungen von wässrigen Komponenten (z. B. Kulturmedien) verschiedener Mikroorganismen sind im Handbuch "Manual of Methods for General Bacteriology" der American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981 ) beschrieben.
Die aus den genannten Schriften als bekannt vorausgesetzten Einsatzstoffe (z. B. Kohlenstoffquellen, Stickstoffquellen, Metallsalze) können zu der wässrigen Komponente in Form eines einmaligen Ansatzes hinzugegeben oder in geeigneter Weise während der Kultivierung zugeführt werden. Zur pH-Wert-Kontrolle der wässrigen Komponente werden basische Verbindungen wie z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Ammoniak bzw. Ammoniakwasser oder saure Verbindungen wie z. B. Phosphorsäure oder Schwefelsäure in geeigneter Weise und/oder Pufferverbindungen wie z. B. Hydrogenphosphatsalze, TRIS eingesetzt. Zur Kontrolle der Schaumentwicklung können Antischaummittel wie z. B. Fettsäurepolyglykolester eingesetzt werden. Zur Aufrechterhaltung der Stabilität von Plasmiden können der wässrigen Komponente geeignete, selektiv wirkende Stoffe wie z. B. Antibiotika (z. B. Chloramphenicol, Ampicillin, Kanamycin) hinzugefügt werden. Bevorzugt werden Bakterienzellen mit teilweise inaktivierten Stoffwechselwegen (bspw. auxotrophe Mutanten) verwendet, wobei auf einem (Expressions-)Vektor, enthaltend mindestens ein Gen A, B, D, E und/oder C, u. a. Gene zur Komplettierung unvollständiger Stoffwechselwege enthalten sind. Um aerobe Bedingungen aufrecht zu erhalten werden Sauerstoff oder sauerstoffhaltige Gasmischungen wie z. B. Luft in die wässrige Komponente eingetragen.
Die bakterielle Biomasse in Form von Bakterien kann demnach durch eine dem Fachmann bekannte Weise der Kultivierung (Anzucht) erhalten werden, beispielsweise durch Kultivierung in LB-Medium, vorzugsweise jedoch durch Kultivierung in einem Medium, das die Erzeugung hoher Zelldichten, insbesondere größer als 1 χ 109 Zellen pro ml_, zulässt. Die Anzucht erfolgt vorzugsweise in laborüblichen Schüttelkolben, zur Erzeugung größerer Mengen an bakterieller Biomasse ist aber auch die Anzucht unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter möglich.
Bevorzugt erfolgt die Kultivierung der authentischen und/oder rekombinanten Bakterienzellen unter physiologischen Bedingungen bei einer Temperatur zwischen 0 und 60°C, bevorzugt zwischen 10 und 50°C, besonders bevorzugt zwischen 20 und 40°C, wobei der pH-Wert der wässrigen Komponente bevorzugt zwischen 5,8 und 8,5, besonders bevorzugt zwischen 6,8 und 8,0 liegt.
Bevorzugt enthalten authentische Bakterienzellen alle drei Gene A, B und C, die für die Enzyme Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase und Aldehyd-Dehydrogenase kodieren, wobei alle drei Gene A, B und C funktionell unter die Kontrolle eines identischen Promotors bzw. Operators gestellt sind. Alternativ bevorzugt sind alle drei Gene A, B und C unter die Kontrolle mehrerer Promotoren bzw. Operatoren gestellt.
Bevorzugt werden für ein erfindungsgemäßes Verfahren authentische Bakterienzellen von Wildtypstämmen verwendet, wobei die Wildtypstämme aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium, besonders bevorzugt aus Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 und Pseudomonas putida S12 ausgewählt sind. Auch besonders bevorzugt ist der Wildtypstamm aus Sphingopyxis sp. Kp5.2 (DSM 28731 ) ausgewählt.
Alternativ bevorzugt enthalten authentische Bakterienzellen die Gene A, C, D und E, die für die Enzyme Styrol-Monooxygenase, Styroloxid-Reduktase und Alkohol-Dehydrogenase kodieren, wobei alle Gene A, C, D und E funktionell unter die Kontrolle eines identischen Promotors bzw. Operators gestellt sind. Alternativ bevorzugt sind alle Gene A, C, D und E unter die Kontrolle mehrerer Promotoren bzw. Operatoren gestellt. Hierbei werden bevorzugt authentische Bakterienzellen von Wildtypstämmen verwendet, wobei die Gattung Gordonia, besonders bevorzugt Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) ist.
Vorteilhaft entsprechen die verwendeten authentischen Bakterienzellen, die für ein erfindungsgemäßes Verfahren zur biokatalytischen Synthese von Phenylessigsäure und/oder deren Derivate eingesetzt werden können, laut Listen der ZKBS (Zentrale Kommission für die Biologische Sicherheit) der Risikoklasse 1 und sind demzufolge als nicht pathogen für Mensch und Tier gekennzeichnet. Da es sich um natürlich vorkommende Isolate handelt, setzt ihre Handhabung keine Gentechnikzulassung voraus.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die rekombinanten Bakterienzellen, die zur biokatalytischen Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder (II) aus Substraten der Formel (III) und/oder (IV) befähigt sind, Negativmutanten authentischer Bakterienzellen oder Insertionsmutanten.
Bevorzugt sind die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten (d. h. Knock-Out- Mutanten oder Deletionsmutanten) der o. g. Wildtypstämme (d. h. authentische Bakterienzellen, die natürlicherweise die drei Gene A, B und C aufweisen), wobei ein Gen A, B und/oder C, bevorzugt das Gen C teilweise oder komplett deletiert und/oder gegen ein modifiziertes Gen ausgetauscht ist. Im Sinne der Erfindung wird der Begriff Negativmutante synonym für die Begriffe Deletionsmutante und Knockout-Mutante verwendet.
Alternativ bevorzugt sind die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten (d. h. Knock- Out-Mutanten oder Deletionsmutanten) der o. g. Wildtypstämme (d. h. authentische Bakterienzellen, die natürlicherweise die Gene A, C, D, E oder A, B, C, D, E aufweisen), wobei ein Gen A, B, D, E und/oder C, bevorzugt ist das Gen C teilweise oder komplett deletiert und/oder gegen ein modifiziertes Gen ausgetauscht ist.
Im Falle, dass unsubstituierte Phenylessigsäuren gewonnen werden soll, sind die rekombinanten Bakterienzellen bevorzugt Negativmutanten (d. h. Knock-Out-Mutanten oder Deletionsmutanten), bei denen ein Gen, das für der Phenylacetyl-CoA-Ligase kodiert, teilweise oder komplett deletiert ist.
Alternativ erfolgt die Generierung rekombinanter Bakterienzellen durch die Einbringung von Nukleotidsequenzen der Gene A, B, D, E und/oder C durch Genom-Insertion oder Einbringung von Expressionsvektoren in Bakterienzellen, wobei s. g. Insertionsmutanten gebildet werden. Vorzugsweise sind Insertionsmutanten natürlicherweise nicht zur biokatalytischen Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder (II) befähigt, da sie ursprünglich keine Nukleotidsequenz der Gene A, B, D, E und/oder C enthalten. Potentielle Wirtsorganismen für Insertionsmutanten sind bevorzugt ausgewählt aus den Gattungen Escherichia, Pseudomonas, Arthrobacter, Rhodococcus, Corynebacterium und Bacillus.
Durch die gezielte Insertion ausgewählter Nukleotidsequenzen der Gene A, B, D, E und/oder C in eine Bakterienzelle können vorteilhaft die Umsatzraten, die Ausbeute und die Enantiomerenüberschüsse bei der erfindungsgemäßen biokatalytischen Umsetzung von Substraten der Formel (III) und/oder (IV) gesteigert werden. Die Nukleotidsequenzen der Gene A, B, D, E und C umfassen dabei authentische und/oder artifizielle Leserahmen. Bevorzugt ist ein artifizieller Leserahmen über eine Gensynthese an das "Codon Usage" des Wirtsorganismus angepasst.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die zu inserierenden Nukleotidsequenzen so konzipiert, dass sie zwischen den Genen A, B, D, E und/oder C Nukleotidsequenzen aufweisen, die für authentische oder artifizielle Aminosäurelinker kodieren, so dass durch die Expression rekombinante Enzyme in Form von Heterodimeren oder Heterotrimeren gebildet werden, wobei die Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid- Isomerase, Styroloxid-Reduktase, Alkohol-Dehydrogenase und/oder Aldehyd- Dehydrogenase) über Linkersequenzen miteinander kovalent verbunden sind.
In einer alternativ bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung sind die zu inserierenden Nukleotidsequenzen so konzipiert, dass sie zwischen den Genen A, B, D, E und/oder C Nukleotidsequenzen aufweisen, die für authentische oder artifizielle Aminosäurelinker kodieren, so dass durch die Expression rekombinante Enzyme in Form von Heterodimeren, Heterotrimeren, Heterotetrameren oder Heteropentameren gebildet werden, wobei die Enzyme (Styrol-Monooxygenase, Epoxid-Isomerase, Styroloxid-Reduktase, Alkohol- Dehydrogenase und/oder Aldehyd-Dehydrogenase) über Linkersequenzen miteinander kovalent verbunden sind.
Prinzipiell können geeignete Gene A, B, D, E und/oder C durch an sich bekannte Methoden, wie beispielsweise die Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Hilfe von kurzen, synthetischen Nukleotidsequenzen (Primern) amplifiziert und anschließend isoliert werden. Die Herstellung der verwendeten Primer erfolgt im Allgemeinen anhand bekannter Gensequenzen aufgrund bestehender Homologien zu den Genen A, B, D, E und/oder C.
Idealerweise weist der Vektor für die Klonierung eines amplifizierten Gens A, B, D, E und/oder C eine geringe Molekülmasse auf und besitzt selektierbare Gene, um in einer Zelle zu einem leicht erkennbaren Phänotyp zu führen, so dass eine einfache Selektion von vektorhaltigen und vektorfreien Wirtszellen möglich ist. Um eine hohe Ausbeute an DNA und entsprechenden Genprodukten zu erhalten, sollte der Vektor einen starken Promotor und/oder Regulatorsequenzen aufweisen. Für eine Replikation des Vektors ist zudem ein Replikationsursprung wichtig. Beispielsweise sind u. a. pET-Vektorsysteme basierend auf einer Antibiotikaselektion geeignet.
Bei der Verwendung von authentischen Bakterienzellen als Ganzzellkatalysator ist der Induktor und/oder Aktivator bevorzugt ausgewählt aus Styrol, Styroloxid und/oder Phenylacetaldehyd, ganz besonders bevorzugt Styrol und/oder Styroloxid.
Bevorzugt ist die Epoxid-Isomerase eine Styroloxid-Isomerase mit der EC-Nr.: 5.3.99.7 und die Aldehyd-Dehydrogenase eine Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase mit der EC-Nr.: 1 .2.1 .39. Vorzugsweise ist die Alkohol-Dehydrogenase eine 2-Phenylethanol- Dehydrogenase mit der EC-Nr. 1 .1.1.
Bevorzugt erfolgt die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel ausgewählt aus der Gruppe der Phthalsäureester, besonders bevorzugt Bis(2-ethylhexyl)phthalat, 1 ,2-Cyclo- hexandicarbonsäurediisononylester und Mesamoll®, und/oder der aliphatischen verzweigten und/oder linearen Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit 5 bis 16 Kohlenstoffatomen, wie z. B. n-Pentan, Cyclopentan, n-Hexan, Cyclohexan, n-Heptan, n-Octan, Cyclooctan, n- Decan, n-Dodecan oder n-Hexadecan. Bevorzugt dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem einphasigen, wässrigen System zur Extraktion nach dem Umsatz eines Substrates der Formel (III) bzw. (IV). Alternativ dienen die genannten organischen Lösungsmittel in einem zweiphasigen System in Form einer zweiten Phase neben der wässrigen Komponente als Reservoir für ein Substrat der Formel (III) bzw. (IV) und/oder zur Abtrennung von Reaktionsprodukt der Formel (I) und (II), bevorzugt von substituierten oder unsubstituierten Ketonen und/oder bizyklischen Derivaten, ganz besonders bevorzugt von bizyklischen Derivaten der Formel (II).
Für die Extraktion des Produktes nach dem Umsatz eignen sich darüber hinaus halogenierte aliphatische Kohlenwasserstoffe, vorzugsweise mit einem oder zwei Kohlenstoffatomen, wie z. B. Dichlormethan, Chloroform, Tetrachlorkohlenstoff, Dichlorethan oder Tetrachlorethan, aliphatische acyclische und cyclische Ether, vorzugsweise mit 4 bis 8 Kohlenstoffatomen, wie z. B. Diethylether, Methyl-ie/f-butylether, Ethyl-ie/f-butylether, Dipropylether, Diisopropylether, Dibutylether, Tetra hydrofu ran oder Ester wie z. B. Ethylacetat oder n-Butylacetat oder Ketone wie z. B. Methylisobutylketon oder Dioxan oder Gemische davon. Die Isolierung des Reaktionsproduktes der Formel (I) bzw. (II) durch Extraktion der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel erfolgt vorzugsweise nach der Abtrennung des Ganzzellkatalysators in Form von Biomasse von der wässrigen Komponente, wobei die Abtrennung des Ganzzellkatalysators in Form von Biomasse von der wässrigen Komponente bevorzugt durch Zentrifugation oder Filtration erfolgt.
Bevorzugt erfolgt die Extraktion von Reaktionsprodukten der Formel (I), wobei Ri = OH ist, und der Formel (II) mit einem organischen Lösungsmittel bei einem pH-Wert zwischen 0 und 8, besonders bevorzugt zwischen 1 und 7, ganz besonders bevorzugt zwischen 2 und 6, wobei vorteilhaft hohe Extraktionsverhältnisse erzielbar sind. Definitionsgemäß ist das Extraktionsverhältnis ein Maß für die Effizienz der Extraktion und gibt an, wie viel Produkt (in g) das organische Lösungsmittel im Verhältnis zum Gesamtgehalt an Produkt aufgenommen hat. Je größer dieser Wert wird, desto besser extrahiert ein organisches Lösungsmittel das Produkt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Extraktionsverhältnis größer 4:1 , besonders bevorzugt größer 6:1 und am meisten bevorzugt größer 8:1 .
Gegebenenfalls erfolgt zur Aufreinigung des Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II) im Anschluss an die Extraktion eine Destillation, wobei bevorzugt das organische Lösungsmittel abgetrennt wird. Bevorzugt erfolgt die Abtrennung des organischen Lösungsmittels durch Verdampfung bei einem Druck zwischen 0,1 und 1000 mbar, besonders bevorzugt zwischen 0,1 und 750 mbar, ganz besonders bevorzugt zwischen 1 und 400 mbar.
Alternativ zur Extraktion von Produkten der Formel (I), wobei Ri = OH ist, aus der wässrigen Komponente mit einem organischen Lösungsmittel kann die Extraktion der wässrigen Komponente auch mit pH-Wert abhängigen Methoden der Festphasenextraktion durchgeführt werden. Beispielsweise können nach der Einstellung eines alkalischen pH- Werts in der flüssigen Komponente Anionenaustauscher oder bei sauren pH-Bereichen hydrophobe Adsorberharze als Adsorber verwendet werden.
Bevorzugt erfolgt die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder substituierten oder unsubstituierten Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate der Formel (I) und/oder (II) in einem einphasigen, wässrigen System oder in einem zweiphasigen System.
In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung findet das biokatalytische Verfahren zur Synthese von Phenylessigsäure und/oder ihren Derivaten der Formel (I) und/oder (II) in einem zweiphasigen System statt. Dabei werden organische Lösungsmittel, wie bereits oben genannt oder ionische Flüssigkeiten, die beide substanziell nicht mit Wasser mischbar sind, als zweite organische Phase verwendet, wobei sich bevorzugt das Substrat in der organischen Phase akkumuliert. Beispiele bekannter zweiphasiger Systeme sind in den Schriften von Panke et at. {Biotechnol. Bioeng. 2000, 69, 91 -100) und Wubbolts et at. (Enzyme Microb. Technol. 1994, 16, 887-894) beschrieben.
Unter substanziell nicht mit Wasser mischbare organische Phasen werden organische Phasen verstanden, die weniger als 1 Gew.-%, vorzugsweise weniger als 0,5 Gew.-% Wasser, bezogen auf das Gesamtgewicht der organische Phasen enthalten.
Bevorzugt werden als Substrate für die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen gemäß der Formel (I) Vertreter der Formel (III) eingesetzt, wobei:
der Substituent R1 H oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist,
der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent ist.
Beispielsweise ist ein Substrat der allgemeinen Formel (III) ganz besonders bevorzugt:
2-Fluorstyrol, 3-Fluorstyrol oder 4-Fluorstyrol, 2-Fluor-a-alkylstyrol, 3-Fluor-a- alkylstyrol, 4-Fluor-a-alkylstyrol
- 2-Chlorstyrol, 3-Chlorstyrol oder 4-Chlorstyrol, 2-Chlor-a-alkylstyrol, 3-Chlor-a- alkylstyrol, 4-Chlor-a-alkylstyrol
2-Bromstyrol, 3-Bromstyrol oder 4-Bromstyrol, 2-Brom-a-alkylstyrol, 3-Brom-a- alkylstyrol, 4-Brom-a-alkylstyrol
2-lodstyrol, 3-lodstyrol oder 4-lodstyrol, 2-lod-a-alkylstyrol, 3-lod-a-alkylstyrol, 4-lod- σ-alkylstyrol
2-lsobutyl-a-alkylstyrol, 3-lsobutyl-a-alkylstyrol, 4-lsobutyl-a-alkylstyrol
- 2-Methylstyrol, 3-Methylstyrol oder 4-Methylstyrol, 2-Methyl-a-alkylstyrol, 3-Methyl-a- alkylstyrol, 4-Methyl-a-alkylstyrol
2-Methoxy-4-vinylphenol
3,4-Methylendioxy-styrol wobei die Bezeichnung„Alkyl-" für einen verzweigten oder linearen Ci bis C3-Alkylrest steht.
Bevorzugt werden als bizyklische Substrate für die biokatalytische Synthese von substituierten oder unsubstituierten bizyklischen Derivaten gemäß der allgemeinen Formel (II) Vertreter der Formel (IV) eingesetzt, wobei:
der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest (Methyl, Ethyl, Isopropyl oder n-Propyl) ist,
die Substituenten R3, R4, R5 und R6 und unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx gegebenenfalls ein substituierter und/oder verzweigter Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist,
X ein CH2, O, NH oder NRX, ganz besonders bevorzugt CH2 oder NH ist, n die Zahl 0, 1 oder 2, besonders bevorzugt die Zahl 0 oder 1 ist.
wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent (Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx) sind, ganz besonders bevorzugt ausschließlich einer der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent ist.
Beispielsweise ist ein Substrat der allgemeinen Formel (IV) ganz besonders bevorzugt:
ein Indol (das zu Indigo als finales Produkt weiterreagiert, vgl. O'Connor et al. [Appl. Environ. Microbiol. 1997, 63, 4287-4291])
ein Inden
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren lassen sich insbesondere vorteilhaft auch die folgenden Vertreter von Reaktionsprodukten der allgemeinen Formeln (I) und (II) biokatalytisch synthetisieren:
4-Chlor-, 4-Fluor- und 4-Methylphenylessigsäure (insbesondere herstellbar mit Pseudomonas fluorescens ST und Sphingopyxis sp. Kp.5.2)
4-Hydroxy-3-methoxy-phenylessigsäure (Homovanillinsäure) und 4-Hydroxy-3- methoxy-phenylacetaldehyd (insbesondere herstellbar mit Pseudomonas fluorescens ST und Gordonia sp. CWB2
σ-Methylphenylessigsäure und 4-Chlor-a-methylphenylessigsäure (insbesondere herstellbar mit Pseudomonas fluorescens ST und Sphingopyxis sp. Kp.5.2) (7?S)-2-(4-lsobutylphenyl)propionsäure (insbesondere herstellbar mit Gordonia sp. CWB2)
Derivate des 3,4-Methylendioxyphenylacetaldehyd und der 3,4-Methylendioxy- phenylessigsäure
Es sei angemerkt, dass die erfindungsgemäßen Ausgestaltungen in jeder Anordnung miteinander kombinierbar sind.
Nach einer besonders bevorzugten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von substituierten Phenylessigsäuren der allgemeinen Formel (I), wobei:
- R1 OH,
- R2 H,
die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, OH oder ORx, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist, insbesondere zur Synthese von Derivaten der 4-Hydroxyphenylessigsäure, (bspw. 4- Hydroxy-3-methoxy-phenylessigsäure (auch Homovanillinsäure), Derivaten der 3- Hydroxyphenylessigsäure oder Derivaten der 2-Hydroxyphenylessigsäure,
werden diese aus entsprechend substituierten Substraten mit der allgemeinen Formel (III) erhalten durch:
a) die Bereitstellung eines Ganzzellkatalysators, enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und
iii. ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist. in einer wässrigen Komponente,
b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene A, B und C führt,
c) Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit dem Substrat der Formel (III), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu dem Reaktionsprodukt der Formel (I) umgesetzt wird.
Alternativ bevorzugt enthält der Ganzzellkatalysator des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Synthese von substituierten Phenylessigsäuren der allgemeinen Formel (I), wobei:
- R1 OH,
- R2 H, die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, OH oder ORx, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C5-Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy oder Isobutyl ist, insbesondere zur Synthese von Derivaten der 4-Hydroxyphenylessigsäure, (bspw. 4- Hydroxy-3-methoxy-phenylessigsäure (auch Homovanillinsäure), Derivaten der 3- Hydroxyphenylessigsäure oder Derivaten der 2-Hydroxyphenylessigsäure,
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
Bevorzugt werden die Reaktionsprodukt der Formel (I) in den Ganzzellkatalysatoren nicht nur sehr eingeschränkt oder vorzugsweise nicht weiter verstoffwechselt (d. h. im Stoffwechsel des Ganzzellkatalysators abgebaut) und reichern sich in der wässrigen Komponente an. Vorteilhaft reichern sich Reaktionsprodukt der Formel (I) in Folge des Ausschleusens aus dem Ganzzellkatalysator in der wässrigen Komponente an, wobei vorzugsweise mindestens ein gebildetes Reaktionsprodukt der Formel (I) isoliert wird.
Bevorzugt werden bei einem erfindungsgemäßen Verfahren Ganzzellkatalysatoren in einer wässrigen Komponente mit einer OD6oo im Bereich von 0,5 und 30 bereitgestellt.
Bevorzugt erfolgt die Aktivierung des Ganzzellkatalysators durch das Kontaktieren mit einem Aktivator und/oder einem Induktor durch direkte Zugabe zur wässrigen Komponente in Form als Flüssigkeit und/oder Feststoff oder über die Gasphase, wobei der Ganzzellkatalysator in seine aktive Form überführt wird. Vorzugsweise erfolgt das Kontaktieren mit dem Aktivator und/oder dem Induktor in über den Reaktionszeitraum in Zeitabständen von 1 bis 96 h, besonders bevorzugt 12 bis 72 h, wobei der Aktivator und/oder Induktor kontinuierlich oder diskontinuierlich nachgeführt werden kann.
Bevorzugt erfolgt das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) nach der Aktivierung des Ganzzellkatalysators über die Gasphase und/oder durch direkte Zugabe zur flüssigen Komponente in Form als Flüssigkeit und/oder Feststoff, wobei das Substrat von dem Ganzzellkatalysators resorbiert (d.h. aufgenommen) und durch mindestens ein Enzym, wie oben beschrieben entsprechend ausgewählt aus A, B, C, D und E, zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) biokatalytisch umgesetzt wird. Vorzugsweise erfolgt das Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV) portionsweise.
Die Erfindung umfasst auch rekombinante Bakterienzellen, bevorzugt Negativmutanten und/oder Insertionsmutanten zur biokatalytischen Synthese substituierter oder unsubstituierter Phenylessigsäure und/oder deren zyklischer Derivate gemäß der Formel (III) und/oder Formel (IV) enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist,
ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
Die Erfindung umfasst auch rekombinante Bakterienzellen, bevorzugt Negativmutanten und/oder Insertionsmutanten zur biokatalytischen Synthese substituierter oder unsubstituierter Phenylessigsäure und/oder deren zyklischer Derivate gemäß der Formel (III) und/oder Formel (IV) enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist,
ii. das Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Kombination mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, und die funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind, iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
Bevorzugt sind die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten authentischer Bakterienzellen oder Insertionsmutanten. In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung enthalten die Gene A, B und/oder C der rekombinanten Bakterienzellen artifizielle Leserahmen. Weiterhin bevorzugt enthalten die Gene D und/oder E der rekombinanten Bakterienzellen artifizielle Leserahmen
Bevorzugt unterscheiden sich die regulierbaren Promotoren der rekombinanten Bakterienzellen voneinander, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind. Vorteilhaft kann somit die Anwesenheit unterschiedlicher Aktivatoren und/oder Induktoren im Ganzzellkatalysator zur Expression ausgewählter Gene A, B, D, E und/oder C führen, wodurch der Stress in Folge der Genexpression für eine rekombinante Zelle minimiert wird. Geeignet sind u. a. handelsübliche Systeme basierend auf dem /ac-Operon, auf T7-Promotoren, auf trp- und phoA- sowie araß-Regulatoren, wobei die Induktion je nach System mit IPTG, Tryptophan, durch Phosphatmangel oder mit Arabinose realisiert werden kann.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend:
a) mindestens einen Typ an Ganzzellkatalysatoren, bevorzugt eine Typ rekombinanter Bakterienzellen in einer wässrigen Komponente und/oder b) mindestens einen Typ kryokonservierter Ganzzellkatalysatoren, bevorzugt einen Typ rekombinanter Bakterienzellen.
Die bakterielle Biomasse in Form von Bakterien für ein erfindungsgemäßes Verfahren zur biokatalytischen Synthese kann durch eine dem Fachmann bekannte Weise der Vorkultivierung der in einem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Ganzzellkatalysatoren (Anzucht auf Vollmedium und Minimalmedium) erhalten werden, beispielsweise durch Kultivierung in Vollmedium, wie LB-Medium (DSM-Medium No. 381 ), vorzugsweise jedoch durch Kultivierung in einem Medium, das die Erzeugung hoher Zelldichten, beispielsweise durch Kultivierung in Minimalmedium, wie DSM-Medium No. 55) insbesondere größer als 1 x 109 Zellen pro mL, zulässt. Die Anzucht dieser Vorkultur enthalten Ganzzellkatalysatoren eines erfindungsgemäßen Kits erfolgt vorzugsweise in laborüblichen Schüttelkolben, zur Erzeugung größerer Mengen an bakterieller Biomasse ist aber auch die Anzucht unter kontrollierten Bedingungen im Fermenter möglich.
Nach der Anzucht bakterieller Biomasse in Form von Bakterien für ein erfindungsgemäßes Verfahren zur biokatalytischen Synthese durch die Vorkultivierung der in einem erfindungsgemäßen Kit enthaltenen Ganzzellkatalysatoren (Anzucht auf Vollmedium und Minimalmedium), kann diese Biomasse in die wässrige Komponente zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) transferiert werden.
Gegenstand der Erfindung sind auch authentische Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II), wobei die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium, besonders bevorzugt aus Rhodococcus opacus 1 CP, Rhodococcus species ST-5, Pseudomonas fluorescens ST, Corynebacterium species AC-5, Pseudomonas putida CA-3 und Pseudomonas putida S12. Auch besonders bevorzugt ist der Wildtypstamm aus Sphingopyxis sp. Kp5.2 (DSM 28731 ) ausgewählt. Die Hinterlegung des Stammes Kp5.2 (DSM 28731 ) erfolgte am 30.04.2014 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig), gemäß "Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren".
Der Stamm Kp5.2 (DSM 28731 ) ist gekennzeichnet durch:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und
iii. ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
Alternativ sind die authentischen Bakterienzellen Gordonia, besonders bevorzugt Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758). Die Hinterlegung des Stammes Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) erfolgte am 30.04.2014 bei der Deutschen Stammsammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Mascheroder Weg Ib, D-38124 Braunschweig, gemäß "Budapester Vertrag über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren".
Der Stamm CWB2 (DSM 46758) ist gekennzeichnet durch: i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist,
ii. das Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Kombination mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, und die funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind.
Es wurde gefunden, dass durch die Bereitstellung des neuen Bakterienstamms Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) in einem erfindungsgemäßen Verfahren zur Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsauren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II), vorzugsweise substituierte oder unsubstituierte Phenylessigsäuren und/oder Ketonen, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis C8-Alkylrest, besonders bevorzugt ein Ci bis C5- Alkylrest, ganz besonders bevorzugt Methyl, Ethyl, n-Propyl, Isopropy und/oder Isobutyl synthetisierbar sind.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung rekombinanter Bakterienzellen, bevorzugt Negativmutanten und/oder Insertionsmutanten für ein erfindungsgemäßes Verfahren oder ein erfindungsgemäßes Kit.
Gegenstand der Erfindung ist auch eine wässrige Komponente, enthaltend mindestens ein Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw. (II), erhalten durch das vorstehend beschriebene erfindungsgemäße Verfahren, umfassend:
a) die Bereitstellung von mindestens einem Typ an Ganzzellkatalysator, enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und/oder iii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Kombination mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol- Dehydrogenase kodiert, und die funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind
in einer wässrigen Komponente,
b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene A, B und/oder D und E führt, c) Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) umgesetzt wird.
wobei die Reaktionsprodukte in den Ganzzellkatalysatoren nicht weiter verstoffwechselt (d. h. im Stoffwechsel des Ganzzellkatalysators abgebaut) werden und sich in der wassrigen Komponente anreichern.
Anhand folgender Figuren und Ausführungsbeispiele soll die Erfindung näher erläutert werden, ohne die Erfindung auf diese zu beschränken.
Fig. 1 : Metabolisierung des Styrols durch Seitenkettenoxidation durch die Enzyme Styrol- Monooxygenase (SMO), Styroloxid-Isomerase (SOI) und Phenylacetaldehyd- Dehydrogenase (PAADH), oder Monooxygenase (SMO), Styroloxid-Reduktase (SOR), Alkohol-Dehydrogenase (ADH) und Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase (PAADH), wobei die gebildete Phenylessigsäure über anschließende Zwischenschritte dem Tricarbonsäurezyklus (TCC) zugeführt wird (basierend auf Velasco et at. [J. Bacteriol. 1998, 180, 1063-1071], modifiziert; O'Leary et at. [FEMS Microbiol. Rev. 2002, 26, 403-417], modifiziert).
Fig. 2: Umsatz substituierter Styrole unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Produktkonzentrationen [mM] nach 12 h ausgehend von 1 ,25 mM Substrat dargestellt sind.
Fig. 3: Umsatz substituierter Styrole unter Verwendung von Sphingopyxis sp. Kp5.2 als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Produktkonzentrationen [mM] nach 12 h ausgehend von 1 ,25 mM Substrat dargestellt sind.
Fig. 4: Umsatz substituierter Styrole unter Verwendung von Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758) als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Produktkonzentrationen [mM] nach 12 h ausgehend von 1 ,25 mM Substrat dargestellt sind.
Fig. 5: Umsatz von 4-Chlorstyrol unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Stoffmengen [μηηοΙ] von Substrat und Produkt über einen Zeitraum von 186 Tagen dargestellt sind.
Fig. 6: Umsatz von 4-Chlorstyrol unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die Stoffmengen [μηηοΙ] von Substrat und Produkt über einen Zeitraum von 348 Tagen dargestellt sind.
Fig. 7: HPLC-Chromatogramme und UV-VIS-Produktspektrum zum Umsatz von 4- Vinylguaiacol in Homovanillinsäure unter Verwendung von Pseudomonas fluorescens ST als authentischen Ganzzellkatalysator.
Fig. 8: Umsatz von 4-Vinylguaiacol in Homovanillinsäure unter Verwendung von Gordonia sp. CWB2 als authentischen Ganzzellkatalysator, wobei die erreichten Produktkonzentrationen [mM] binnen 12 Tagen dargestellt sind. Wenn nicht anders genannt, erfolgte in nachstehenden Ausführungsbeispielen die Kultivierung von Ganzzellkatalysatoren auf Minimalmedium (modifiziert nach Dorn, E.; Hellwig, M.; Reineke, W.; Knackmuss, H.-J. (1974) Isolation and characterization of a 3- chlorobenzoate-degrading pseudomonad. Arch Microbiol 99: 61 -70), das sich aus folgenden, getrennt voneinander autoklavierten Stammlösungen zusammensetzt:
20 x Phosphatpuffer 100 ml
Na2HP04 2 H20
KH2P04
H20 (deionisiert)
50 x Salzlösung 20 ml
Ca(N03)2 . 4 H20 3 g
Fe(lll)NH4-citrat 0,5 g
MgS04 7 H20 10 g
(NH4)2S04 50 g
1000 x Spurenelementlösung 6
(Pfennig & Lippert, 1966) 50 ml
H20 (deionisiert) ad 1 I
Kohlenstoffquelle (Stammlösung oder reine Komponente) x ml
H20 (deionisiert) ad 1 I
Als Kohlenstoffquelle wurde Glukose oder Fructose eingesetzt. Zudem wurde zum besseren Anwachsen im Flüssigmedium z.T. Hefeextrakt in einer Endkonzentration von 0,07 bis 0,1 % (w/v) zugegeben.
Beispiel 1 Synthese substituierter Phenylessigsäuren mit Pseudomonas fluorescens ST
1 L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium (Dorn et al. 1974) und einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose (als Kohlenstoffquelle) wurden mit einer Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und nachfolgend die Biomasse mit Glukose auf eine OD6oo (Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm) von ca. 1 ,5 herangezogen. Anschließend wurde die Biomasse für mind. 3 Tage mit täglich 17-26 pmol Styrol (als Induktor) induziert, zuvor wurde jeweils der Kolben entsprechend belüftet. Die Zugabe des Styrols erfolgte über die Gasphase unter Verwendung eines Verdampferaufsatzes. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C und 5000 x g (30 min) geerntet. Das Pellet wurde im Folgenden 2x mit 50 mL einer 25 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7) gewaschen und anschließend in einem geeigneten Volumen an Phosphatpuffer (25 mM; pH = 7) aufgenommen. Über einen Verdampferaufsatz konnten nachfolgend die verschiedenen Substrate über die Gasphase zugegeben werden. Der Umsatz erfolgte bevorzugt bei 30°C und 120 rpm.
Im Vorversuch konnten mit einer Zellsuspension (OD6oo = 1 ; Zelltrockenmasse ca. 0,6 mg/mL) bei einmaliger Zugabe von jeweils 1 ,25 mM Substrat (wenn nicht anderes benannt über Gasraum zugefüttert) nach unvollständiger Umsetzung des Substrates innerhalb von 12 h die in Tabelle 1 und Fig. 2 angegebenen Produktkonzentrationen im Kulturmedium nachgewiesen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Beispiel um eine Testtransformation zur Untersuchung des Substratspektrums handelt, welches durch einen Typ von Ganzzellkatalysatoren umgesetzt werden kann. Die angegebenen Ausbeuten sind dabei nicht die finalen Ausbeuten, wie sie nach Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden (siehe Ausführungsbeispiel 4 und 5).
Tabelle 1 : 12-stündige Ausbeuten beim Umsatz von Styrolen mit Zellen von Pseudomonas fluorescens ST
Beispiel 2 - Synthese substituierter Phenylessigsäuren mit dem Isolat Sphingopyxis sp. Kp5.2
1 L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium (Dorn et al. 1974) und einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose (als Kohlenstoffquelle) wurden mit einer Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Sphingopyxis sp. Kp5.2) inokuliert und nachfolgend die Biomasse mit Glukose auf eine OD6oo von ca. 0,8 herangezogen. Anschließend wurde die Biomasse für mind. 3 Tage mit täglich 18-26 pmol Styrol (als Induktor) induziert, zuvor wurde jeweils der Kolben entsprechend belüftet. Die Zugabe des Styrols erfolgte über die Gasphase unter Verwendung eines Verdampferaufsatzes. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C und 5000 x g (30 min) geerntet. Das Pellet wurde im Folgenden 2x mit 50 ml_ einer 25 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7) gewaschen und anschließend in einem geeigneten Volumen an Phosphatpuffer (25 mM; pH = 7) aufgenommen. Über einen Verdampferaufsatz konnten nachfolgend die verschiedenen Substrate über die Gasphase zugegeben werden. Der Umsatz erfolgte bevorzugt bei 30°C und 120 rpm.
Im Vorversuch konnten mit einer Zellsuspension (OD6oo = 1 ; Zelltrockenmasse ca. 1 ,0 mg/ml_) bei einmaliger Zugabe von jeweils 1 ,25 mM Substrat (wenn nicht anderes benannt über Gasraum zugefüttert) nach unvollständiger Umsetzung des Substrates innerhalb von 12 h die in Tabelle 2 und Fig. 3 angegebenen Produktkonzentrationen im Kulturmedium nachgewiesen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Beispiel um eine Testtransformation zur Untersuchung des Substratspektrums, welches durch einen Typ von Ganzzellkatalysatoren umgesetzt werden kann. Die angegebenen Ausbeuten sind dabei nicht die finalen Ausbeuten, wie sie nach Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden (siehe Ausführungsbeispiel 4 und 5).
Tabelle 2: 12-stündige Ausbeuten beim Umsatz von Styrolen mit Zellen von Sphingopyxis sp. Kp5.2
Substrat Produkt Produkt- unvollständige
Konzentration Ausbeute [%] [μΜ] nach 12 h
Styrol Phenylessigsäure 43 3,4
3-Chlorstyrol 3-Chlorphenylessigsäure 100 8,0
4-Chlorstyrol 4-Chlorphenylessigsäure 102 8,2
4-Fluorstyrol 4-Fluorphenylessigsäure 97 7,8
σ-Methylstyrol σ-Methylphenylessigsäure 156 12,5
4-Chlor-a- 4-Chlor-a- 19 1 ,5
methylstyrol methylphenylessigsäure Beispiel 3 Synthese substituierter Phenylessigsäuren mit Gordonia sp. CWB2
1 L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium (Dorn et al. 1974) und einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose (als Kohlenstoffquelle) wurden mit einer Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Gordonia sp. CWB2) inokuliert und nachfolgend die Biomasse mit Glukose auf eine OD6oo (Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 600 nm) von ca. 4,5 herangezogen. Anschließend wurde die Biomasse für mind. 3 Tage mit täglich 18-26 pmol Styrol (als Induktor) induziert, zuvor wurde jeweils der Kolben entsprechend belüftet. Die Zugabe des Styrols erfolgte über die Gasphase unter Verwendung eines Verdampferaufsatzes. Nachfolgend wurden die Zellen mittels Zentrifugation bei 4°C und 5000 x g (30 min) geerntet. Das Pellet wurde im Folgenden 2x mit 50 mL einer 25 mM Phosphatpufferlösung (pH = 7) gewaschen und anschließend in einem geeigneten Volumen an Phosphatpuffer (25 mM; pH = 7) aufgenommen. Über einen Verdampferaufsatz konnten nachfolgend die verschiedenen Substrate über die Gasphase zugegeben werden. Der Umsatz erfolgte bevorzugt bei 30°C und 120 rpm.
Im Vorversuch konnten mit einer Zellsuspension (OD6oo = 6,08; Zelltrockenmasse ca. 1 ,5 mg/mL) bei einmaliger Zugabe von jeweils 1 ,25 mM Substrat (wenn nicht anderes benannt über Gasraum zugefüttert) nach unvollständiger Umsetzung des Substrates innerhalb von 12 h die in Tabelle 3 und Fig. 4 angegebenen Produktkonzentrationen im Kulturmedium nachgewiesen werden. Es ist darauf hinzuweisen, dass es sich bei diesem Beispiel um eine Testtransformation zur Untersuchung des Substratspektrums handelt, welches durch einen Typ von Ganzzellkatalysatoren umgesetzt werden kann. Die angegebenen Ausbeuten sind dabei nicht die finalen Ausbeuten, wie sie nach Ablauf eines erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten werden (siehe Ausführungsbeispiel 4 und 5).
Tabelle 3: 12-stündige Ausbeuten beim Umsatz von Styrolen mit Zellen von Gordonia sp. CWB2
Substrat Produkt Produkt- unvollständige
Konzentration Ausbeute [%] [μΜ] nach 12 h
Styrol Phenylessigsäure 15 1 ,2
3-Chlorstyrol 3-Chlorphenylessigsäure 27 2,2
4-Chlorstyrol 4-Chlorphenylessigsäure 132 10,6
4-Fluorstyrol 4-Fluorphenylessigsäure 63 5,0
σ-Methylstyrol σ-Methylphenylessigsäure 53 4,2 4-Chlor-a- 4-Chlor-a- 25 2,0 methylstyrol methylphenylessigsäure
4-lsobutyl-a- 4-lsobutyl-a-methylphenylessig- 7 0,6
methylstyrol säure (Ibuprofen)
4-lsobutyl-a- 4-lsobutyl-a-methylphenylessig- 34 2,7
methylstyrol säure (Ibuprofen)
(direkte Zugabe zum Medium)
Beispiel 4 - Langzeitversuch zur Synthese von 4-Chlor-Phenylessigsäure mit Pseudomonas fluorescens ST
Ein 1 L-Kolben mit 200 mL Minimalmedium (Dorn et al. 1974), einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose wurde mit Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und Biomasse durch Zugabe von Glukose auf eine OD6oo von 1 angezogen. Nachfolgend wurde der Kolbeninhalt steril mittels Zentrifugation geerntet (4°C, 5000 x g, 30 min), das Pellet mit sterilem Wasser oder 25 mM Phosphatpuffer (pH = 7) gewaschen und nachfolgend in einem geeigneten Volumen Minimalmedium resuspendiert. Nachfolgend wurde die wässrige Komponente mit den Ganzellkatalysatoren für 6 Tage in Anwesenheit von Styrol (als Induktor) inkubiert. Die Induktion mit Styrol erfolgte in diesem Beispiel erst nach der Ernte und dem Waschschritt, kann aber auch bereits im Vorfeld erfolgen. Styrol wurde dabei über die Gasphase mittels Verdampferaufsatz zugefüttert (ca. 17-26 μηηοΙ aller 1 -3 Tage, vor jeder erneuten Fütterung wurde der Kolben belüftet). Nachfolgend wurde über einen Zeitraum von einigen Monaten neben ca. 17 μηηοΙ Styrol (als Energiequelle und Induktor) das Substrat 4-Chlorstyrol in Portionsgrößen von 20-40 μηηοΙ über die Gasphase zugegeben. Das Reaktionsprodukt 4-Chlorphenylessigsäure konnte in der wässrigen Komponente nachgewiesen werden.
Im Vorversuch konnte mit einer eingesetzten Zellsuspension (OD6oo = 0,8; Zelltrockenmasse ca. 0,4-0,5 mg/mL) nach 20 Tagen eine Stoffmenge von 260 μηηοΙ Reaktionsprodukt nach Zugabe von 308 μηηοΙ Substrat erreicht werden, was einer Ausbeute von ca. 85% entspricht. Nach 60 Tagen entsprach die Stoffmenge der gebildeten Phenylessigsäure ca. 670 μηηοΙ nach Zugabe von 750 μηηοΙ Substrat (Ausbeute >85%). Binnen 120 Tagen konnten 1260 μηηοΙ Reaktionsprodukt aus 1390 μηηοΙ Substrat umgesetzt werden, was einer Ausbeute von bis zu 90% entspricht. Die erreichte Konzentration betrug dabei 8,4 mM. Der Verlauf der Transformation ist in Fig. 5 dargestellt. Die sich langsam einstellende Divergenz zwischen gefüttertem Substrat und gebildetem Produkt ist auf eine Inaktivierung des Ganzzellkatalysators zurückzuführen, allerdings über den gesamten Beobachtungszeitraum nur schwach ausgeprägt.
Beispiel 5 - Langzeitversuch zur Synthese von 4-Chlor-Phenylessigsäure mit Pseudomonas fluorescens ST (längere Versuchsdauer)
Ein 1 L-Kolben mit 200 ml_ Minimalmedium, einmalig 0,05% Hefe sowie 5 mM Glukose wurde mit Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und Biomasse durch Zugabe von Glukose auf eine OD6oo von 1 angezogen. Nachfolgend wurde der Kolbeninhalt steril mittels Zentrifugation geerntet (4°C, 5000 x g, 30 min), das Pellet mit sterilem Wasser oder 25 mM Phosphatpuffer (pH = 7) gewaschen und nachfolgend in einem geeigneten Volumen Minimalmedium resuspendiert. Nachfolgend wurde die wässrige Komponente mit den Ganzellkatalysatoren für 6 Tage in Anwesenheit von Styrol (als Induktor) inkubiert. Die Induktion mit Styrol erfolgte in diesem Beispiel erst nach der Ernte und dem Waschschritt, kann aber auch bereits im Vorfeld erfolgen. Styrol wurde dabei über die Gasphase mittels Verdampferaufsatz zugefüttert (ca. 18-26 μηηοΙ aller 1 -3 Tage, vor jeder erneuten Fütterung wurde der Kolben belüftet). Nachfolgend wurde über einen Zeitraum von einigen Monaten neben ca. 19-20 μηηοΙ Styrol (als Energiequelle und Induktor) das Substrat 4-Chlorstyrol in Portionsgrößen von 21 -42 μηηοΙ über die Gasphase zugegeben. Das Reaktionsprodukt 4-Chlorphenylessigsäure konnte in der wässrigen Komponente nachgewiesen werden.
Im Vorversuch konnte mit einer eingesetzten Zellsuspension (OD6oo = 0,8; Zelltrockenmasse ca. 0,4mg/ml_) nach 214 Tagen eine Stoffmenge von 2330 μηηοΙ Reaktionsprodukt nach Zugabe von 2430 μηηοΙ Substrat erreicht werden, was einer Ausbeute von ca. 96% entspricht. Nach 284 Tagen entsprach die Stoffmenge der gebildeten Phenylessigsäure ca. 2700 μηιοΙ nach Zugabe von 31 10 μηιοΙ Substrat (Ausbeute 87%). Binnen 348 Tagen konnten letztlich 3150 μηηοΙ Reaktionsprodukt aus 3630 μηηοΙ Substrat umgesetzt werden, was einer Ausbeute von ca. 87%% entspricht. Die erreichte Konzentration betrug dabei 27,5 mM. Der Verlauf der Transformation ist in Fig. 6 dargestellt. Die sich langsam einstellende Divergenz zwischen gefüttertem Substrat und gebildetem Produkt ist auf eine Inaktivierung des Ganzzellkatalysators zurückzuführen, allerdings über den gesamten Beobachtungszeitraum nur schwach ausgeprägt. Beispiel 6 - Stereoselektiver Umsatz von 4-Chlor-cr-methylstyrol mit Pseudomonas fluorescens ST
Kultivierung und Gewinnung eines Typs an Ganzzellkatalysatoren erfolgte wie in Ausführungsbeispiel 4 und 5 angegeben. Nach Induktion der Biomasse mit Styrol über die Gasphase wurde nachfolgend über einen Zeitraum von einigen Tagen neben ca. 17 μηηοΙ Styrol (als Energiequelle und Induktor) das Substrat 4-Chlor-a-methylstyrol in Portionsgrößen von 20-40 μηηοΙ über die Gasphase zugegeben. Das Reaktionsprodukt 4-Chlor-a- methylphenylessigsäure konnte im Kulturmedium nachgewiesen werden.
Im Vorversuch konnten mit der verwendeten Zellsuspension (OD6oo 0,8; Zelltrockenmasse ca. 0,4-0,5 mg/mL) nach 14 Tagen ca. 80 μηηοΙ Reaktionsprodukt nach Zugabe von 220 μηηοΙ Substrat nachgewiesen werden, was einer Ausbeute von ca. 36% entspricht. Die erreichte Konzentration betrug dabei 0,4 mM. Die Reaktion erwies sich mit einem Enantiomerenüberschuss (ee) von 40% als enantioselektiv. Letzteres war auf Grundlage der Literatur über die beteiligten Enzyme des hier angewandten Ganzzellkatalysators nicht vorhersehbar.
Beispiel 7 - Transformation von 4-Vinylguaiacol in Homovanillinsäure mit Pseudomonas fluorescens ST
Ein 500-mL-Kolben mit 100 mL Minimalmedium und 12,5 mM Glukose wurde mit Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Pseudomonas fluorescens ST) inokuliert und Biomasse durch Zugabe von Glukose auf eine OD6oo von 3,7 angezogen. Nachfolgend wurde die wässrige Komponente mit den Ganzellkatalysatoren für einen weiteren Tag in Anwesenheit von Styrol (als Induktor) inkubiert. Styrol wurde dabei über die Gasphase mittels Verdampferaufsatz zugefüttert (ca. 13 μη"ΐοΙ). Anschließend wurde über einen Zeitraum von einigen Tagen neben ca. 13 μηηοΙ Styrol (als Energiequelle und Induktor; aller 2-3 Tage zugefüttert, vor jeder erneuten Fütterung wurde der Kolben belüftet) das Substrat 4-Vinylguaiacol in Portionsgrößen von 50 μηηοΙ direkt zum Medium zugegeben (insgesamt 150 μη"ΐοΙ). Das Reaktionsprodukt Homovanillinsäure konnte in der wässrigen Komponente nachgewiesen werden.
Im Vorversuch konnte mit der verwendeten Zellsuspension (OD6oo 3,7; Zelltrockenmasse ca. 2,0 mg/mL) nach 12 Tagen eine Ausbeute von ca. 40% an Homovanillinsäure (0,6 mM, 1 1 mg im Ansatz) erreicht werden (Fig. 7). Die Reaktion verlief ebenso sehr selektiv. Neben dem Zielprodukt trat nur bei einer Retentionszeit von 5,5 min (siehe Fig. 7) noch ein schwacher Nebenproduktpeak auf. Beispiel 8 - Transformation von 4-Vinylguaiacol in Homovanillinsäure mit Gordonia sp. CWB2
Je ein 1 -L-Kolben mit 200 ml_ Minimalmedium und 5 mM Fructose wurde mit Vorkultur eines Typs an Ganzzellkatalysatoren (Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758)) inokuliert und Biomasse durch Zugabe von Fructose auf eine OD6oo von ca. 5,9 angezogen. Nachfolgend wurde jeweils die wässrige Komponente mit den Ganzellkatalysatoren für zwei weitere Tage in Anwesenheit von Styrol (als Induktor) inkubiert. Styrol wurde dabei über die Gasphase mittels Verdampferaufsatz zugefüttert (2 mal ca. 26 μηηοΙ, am 2. Tag vor erneuter Zufütterung wurden die Kolben belüftet). Anschließend wurde über einen Zeitraum von einigen Tagen neben ca. 26 μηηοΙ Styrol (als Energiequelle und Induktor; aller 2-3 Tage zugefüttert, vor jeder erneuten Fütterung wurden die Kolben belüftet) das Substrat 4- Vinylguaiacol in Portionsgrößen von 100 μηηοΙ einmal direkt zum Medium zugegeben (Kolben A), einmal über die Gasphase zugefüttert (Kolben B) (insgesamt je 300 μηηοΙ Substrat). Das Reaktionsprodukt Homo-Vanillinsäure konnte jeweils in der wässrigen Komponente nachgewiesen werden.
Im Vorversuch konnten mit der verwendeten Zellsuspension (OD6oo ca. 5,9; Zelltrockenmasse ca. 1 ,9 mg/mL) nach 12 Tagen eine Ausbeute von ca. 33% an Homovanillinsäure (0,5 mM, 18 mg im Ansatz) in Kolben A erreicht werden (Fig. 8). Die Reaktion verlief ebenso sehr selektiv. In Kolben B wurde 0,1 mM Homovanillinsäure gebildet, was einer Ausbeute von 7% entspricht (Fig. 8). In Fall von 4-Vinylguaiacol ist daher die direkte Zugabe des Substrates zum Medium deutlich zu bevorzugen.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Verbindungen gemäß der Formel (I) und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (II),
(III) flV) wobei:
der Substituent R1 H, OH oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, wobei * ein Chiralitätszentrum ist,
die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH, Rx, ORx oder COORx sind, wobei Rx ein gegebenenfalls substituierter und/oder verzweigter Ci bis Ci0-Alkylrest ist,
- X CH2, O, NH, NRX, S oder S02 ist,
n die Zahl 0, 1 oder 2 ist, umfassend die folgenden Schritte:
a) Bereitstellung von mindestens einem Ganzzellkatalysator, enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und/oder iii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind
in einer wässrigen Komponente,
b) Aktivierung des Ganzzellkatalysators mit einem Induktor und/oder einem Aktivator, der zur Expression der Gene definiert in (a) führt,
c) Kontaktieren des Ganzzellkatalysators mit einem Substrat der Formel (III) und/oder (IV), wobei das Substrat mit mindestens einem Enzym definiert in (a) zu einem Reaktionsprodukt der Formel (I) und/oder (II) umgesetzt wird,
d) Isolierung mindestens eines gebildeten Reaktionsproduktes der Formel (I) und/oder (II).
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ganzellkatalysator i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist
enthält.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der Ganzellkatalysator i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist
enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass der Ganzellkatalysator ausgewählt ist aus authentischen und/oder rekombinanten Bakterienzellen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 , 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacteriium.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 , 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Gordonia.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten authentischer Bakterienzellen oder Insertionsmutanten sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Induktor Styrol, Styroloxid und/oder Phenylacetaldehyd ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxid- Isomerase eine Styroloxid-Isomerase und die Aldehyd-Dehydrogenase eine Phenylacetaldehyd-Dehydrogenase ist.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Isolierung des Produktes durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel oder mittels Festphasenextraktion erfolgt.
1 1 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die biokatalytische Synthese von Vertretern der Formel (I) und/oder Formel (II) in einem einphasigen wässrigen System oder in einem zweiphasigen System erfolgt.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass als Substrat Vertreter der Formel (III) eingesetzt werden, wobei:
der Substituent R1 H oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder ein linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, die Substituenten R3, R4, R5, R6 und R7 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein Ci bis C5-Alkylrest ist
wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5, R6 und R7 ein von H verschiedener Substituent sind.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass als bizyklisches Substrat Vertreter der Formel (IV) eingesetzt werden, wobei:
der Substituent R2 H oder ein verzweigter oder linearer Ci bis C3-Alkylrest ist, die Substituenten R3, R4, R5 und R6 unabhängig voneinander H, Halogen, OH oder Rx sind, wobei Rx ein Ci bis C5-Alkylrest ist,
- X ein CH2, O, NH oder NRX ist,
n die Zahl 0, 1 oder 2 ist.
wobei ausschließlich maximal zwei der Reste R3, R4, R5 und R6 ein von H verschiedener Substituent sind.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Enantiomerenüberschuss des Reaktionsproduktes mindestens 70% beträgt.
15. Rekombinante Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen B, das für das Enzym Epoxid-Isomerase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist und iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
16. Rekombinante Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend:
i. ein Gen A, das für das Enzym Styrol-Monooxygenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist, ii. ein Gen D, das für das Enzym Styroloxid-Reduktase kodiert, in Verbindung mit einem Gen E, das für das Enzym Alkohol-Dehydrogenase kodiert, wobei die Gene D und E funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt sind und
iii. optional ein Gen C, das für das Enzym Aldehyd-Dehydrogenase kodiert und funktionell unter die Kontrolle eines regulierbaren Promotors gestellt ist.
17. Rekombinante Bakterienzellen nach einem der Ansprüche 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, dass die rekombinanten Bakterienzellen Negativmutanten authentischer Bakterienzellen oder Insertionsmutanten sind.
18. Rekombinante Bakterienzellen nach einem der Ansprüche 15 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass sich die regulierbaren Promotoren voneinander unterscheiden, sodass die Promotoren Primärsignal-spezifisch aktivierbar sind.
19. Kit zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II) enthaltend:
a) mindestens einen Typ rekombinanter Bakterienzellen gemäß der Ansprüche 15 bis 18 in einer wässrigen Komponente und/oder
b) mindestens einen Typ kryokonservierter, rekombinanter Bakterienzellen gemäß der Ansprüche 15 bis 18.
20. Verwendung authentischer Bakterienzellen zur biokatalytischen Synthese von substituierten oder unsubstituierten Phenylessigsäuren und/oder Ketonen und/oder deren bizyklischer Derivate gemäß der Formel (I) und/oder Formel (II), dadurch gekennzeichnet, dass die authentischen Bakterienzellen ausgewählt sind aus Rhodococcus, Pseudomonas, Sphingobium, Sphingopyxis und Corynebacterium oder Gordon ia.
21 . Verwendung von rekombinanten Bakterienzellen nach einem der Ansprüche 15 bis 18 in einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder einem Kit nach Anspruch 19.
22. Wässrige Komponente, enthaltend mindestens ein Reaktionsprodukt der Formel (I) bzw.
(II), erhalten durch ein Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14.
23. Der Bakterien stamm Sphingopyxis sp. Kp5.2 (DSM 28731 ).
24. Der Bakterien stamm Gordonia sp. CWB2 (DSM 46758).
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