EP2989456A1 - Elektrophysiologische messanordnung und elektrophysiologisches messverfahren - Google Patents

Elektrophysiologische messanordnung und elektrophysiologisches messverfahren

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Publication number
EP2989456A1
EP2989456A1 EP14716237.4A EP14716237A EP2989456A1 EP 2989456 A1 EP2989456 A1 EP 2989456A1 EP 14716237 A EP14716237 A EP 14716237A EP 2989456 A1 EP2989456 A1 EP 2989456A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
aperture
region
wall
carrier
concentration
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP14716237.4A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Oliver Klink
Philipp Julian KÖSTER
Carsten Tautorat
Uwe Scheffler
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Rostock
Original Assignee
Universitaet Rostock
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Rostock filed Critical Universitaet Rostock
Publication of EP2989456A1 publication Critical patent/EP2989456A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/483—Physical analysis of biological material
    • G01N33/487—Physical analysis of biological material of liquid biological material
    • G01N33/48707—Physical analysis of biological material of liquid biological material by electrical means
    • G01N33/48728—Investigating individual cells, e.g. by patch clamp, voltage clamp
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
    • G01N27/02—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance
    • G01N27/04—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating impedance by investigating resistance

Definitions

  • the present invention relates to an electrophysiological measuring arrangement as well as to an electrophysiological measuring method, in particular using the electrophysiological measuring arrangement according to the invention.
  • electrical currents and / or electrical voltages are impressed and / or measured between a measuring electrode and a counterelectrode, which are arranged between the biological object.
  • the measured currents and / or voltages should provide information about the underlying physiological processes, in particular transport processes, conformational changes and the like.
  • comparatively very low signal strengths are present.
  • high sealing resistances that is to say the lowest possible residual electrical conductivities, are necessary over the membrane itself or in the contact or contact region between the membrane of the biological object to be examined and the aperture wall.
  • the object of the invention is based solved in an electrophysiological measuring arrangement according to the invention with the features of independent claim 1. Furthermore, the object underlying the invention in an electrophysiological measurement method according to the invention with the features of independent claim 10 is achieved. Advantageous developments are described in the dependent claims.
  • the present invention provides an electrophysiological measuring arrangement with a carrier, which at least in its interior with or from a carrier material having a specific composition - for example, certain concentrations of material or ion species - and with an aperture region in the region of the carrier - ie with an area that at least one aperture o- has the measuring aperture or forms - for the controlled sealing or sealing attachment of a biological object, for example a cell, a cell organelle, a vesicle, a liposome, a natural or artificial membrane, for example a lipid bilayer, or the like or a fragment thereof ,
  • the aperture region is formed with at least one aperture and with a wall region which forms the aperture as an aperture inner wall and surrounds the aperture.
  • an electrophysiological measuring arrangement with an aperture region, which is designed for sealing or sealant attachment, that is to say for attaching with high sealing resistance with respect to a biological object to be examined, at or in at least one Wall region which forms and surrounds an aperture of an aperture region, to modify and in particular to increase the concentration of at least one material or ion species, compared to the concentration of the material or ion species outside the modified region, ie in the underlying material of the support outside the aperture region, in particular in the middle of the carrier and / or inside the carrier.
  • the change in concentration and in particular concentration increase then lead via a corresponding chemical and / or electrical interaction to the fact that the sealing or sealing attachment of a biological object to be examined can be controlled and in particular promoted, in particular the probability of attachment of the biological object to be examined at the measuring aperture and / or the sealing resistance between the biological object to be examined and the measuring aperture are increased, compared with the situation in which the concentration modification according to the invention does not exist in an otherwise identical electrophysiological measuring arrangement or compared to the special case fully doped wafer, where the function of promoting or stabilizing the gigaseal is given, but the properties of the chip is inferior to the ability to measure.
  • Biological objects that are subjected to an examination can be cells, cell organelles, oocytes, bacteria or their combinations or fragments, in each case in the broadest sense. Also artificial or partially artificial essentially biological structures are conceivable, for example in the form of vesicles, liposomes, micelles, membrane fragments or the like, in which proteins are incorporated and / or deposited in a natural or artificial manner.
  • selected biological objects to be examined are attached with an improved sealing resistance and then measured so that a better signal-to-noise ratio is established and the addition is mechanically stabilized, e.g. resulting in a longer measurement time span and improved reliability in terms of measurement results.
  • the at least one material species or ionic species may be selected from the group consisting of protons (H + ), halide ions, in particular fluoride ions (F), doubly charged ions, in particular doubly charged metal cations, preferably Be 2+ , Sr 2+ , Having Ca 2+ and Mg 2+ .
  • the invention is not limited to this species, in principle all material species are conceivable, for example, to cope with certain specific surface situations of a biological object to be measured, for example in the presence of glycocalyx structures or in other situations high sealing resistances and mechanically stable deposits achieve.
  • the increase in the concentration of the at least one material or ion species may be spatially limited locally to the area of the wall area in such a way that the material of the carrier is at least in an area outside the area Apertur Schemes has no increased concentration of at least one material or ion species.
  • the carrier to be provided may also be referred to as base, substrate or base substrate.
  • the provision of such a substrate or such a carrier mechanically stabilizes the measuring arrangement and in particular the arrangement of the arranged biological object to be examined and allows a macroscopic subdivision of the measuring arrangement with respect to the electrolyte bath to be grounded in the sense of dividing a measuring cuvette or Wet cell in compartments with measuring and counter electrode.
  • a respective wall region forming an aperture can also be integrated in the inner wall of the hole in combination with the electrode arrangement.
  • one or more apertures with corresponding wall areas with respect to the upper side may then be formed protruding or emphasizing.
  • they may also be everted flush inwardly at the top to protrude on the underside of the carrier or substrate; However, this is not mandatory and can be omitted with appropriate thickness of the membrane.
  • the extent of the respective infeed or protrusion influences the inner wall of the respective wall area and thus the available exchange rate. Acting surface with the membrane of the biological object.
  • the choice of the degree of protrusion or invagination makes it possible to adapt it to the respectively available measurement objects, for example with regard to their shape or number in the measurement solution.
  • the carrier may be formed as - in particular planar - plate element with front or top and back or bottom. Other geometries are conceivable. Alternatively, it may be departed from the plate shape in which e.g. the shape of a pipette, e.g. in the sense of a classic patch pipette.
  • the wall region which forms an aperture can be designed in the manner of a lateral surface or as a combination of lateral surfaces.
  • the shell of a cylinder, a prism, a truncated cone and / or a truncated pyramid can be gripped back, with a corresponding wall thickness.
  • the shape of the wall region for forming the aperture there are therefore numerous possibilities. These can be selected depending on the shape and the other - e.g. mechanical, geometric and / or electrical properties of the biological objects to be examined.
  • the wall region forming an aperture can be formed by an edge region, so that the aperture is formed as a planar hole in the underlying substrate, and the concentration-modified region with or out of the material with modified concentration in the edge region embedded in the planar hole to promote attachment and sealing, thereby increasing the sealing resistance.
  • An aperture forming wall portion may be formed with or from material selected from the group of materials including glass, quartz glass, silicon, carbon and their combinations and derivatives. With regard to the choice of material, the properties of the underlying biological objects can also be taken into account, for example with regard to the surface structure or surface charge of the membrane outer side and / or the membrane inner side of the biological objects, for example, to provide a particularly intimate adhesion and thus the To further increase the sealing resistance of the seal.
  • the diameter of the aperture and in particular the inner diameter of one or the wall region forming the aperture can have a value in the range from about 0 .mu.m to about 50 .mu.m, preferably in the range from about 1 .mu.m to about 50 .mu.m.
  • One or the aperture forming wall portion may have a height or depth in the range of about 0 ⁇ to about 20 ⁇ over the top or bottom of the carrier or substrate.
  • a measuring electrode can be provided in the region or within the aperture or in a region on the rear or underside of the carrier or substrate.
  • a counter-electrode may be provided outside the aperture and in the region on the front or top side of the carrier.
  • Measuring electrode and counter electrode are preferably arranged on opposite sides of the carrier or substrate or the measuring aperture, in any case so that when attaching a preferably biological object to be measured, this is arranged between the electrodes and the formation of a suitable seal this practically electrically separates, preferably with a very high resistance, ideally greater than 1 GQ.
  • the basic structure of the electrophysiological measuring device thus includes in particular the provision of a measuring electrode arrangement and a counter electrode arrangement, between which an electric current and / or an electrical voltage can be measured, between the measuring electrode arrangement and the counter electrode arrangement just the biological object to be measured
  • the residual conductivity ie the conductivity between the membrane of the biological object and the wall region of the aperture
  • Currents and / or voltages as being of the characteristic th membrane of the biological object can be considered, for example, by transport processes, charge shifts within or over the membrane, by substrate binding or dispensing or the like.
  • an electrophysiological measurement method is provided. This is carried out in particular using an electrophysiological measuring arrangement according to the present invention.
  • an electrophysiological measuring arrangement for controlling and, in particular, for promoting the sealing or sealing attachment of a biological object to be measured at an aperture of an aperture region, at least a region of an inner wall of an aperture-forming wall region is controlled with respect to at least one material or ion species with a correspondingly suitable and opposite concentration the at least one material or ionic species is formed in the carrier outside the aperture region and in particular in the middle of the carrier and / or in the interior of the carrier increased concentration.
  • a key aspect underlying the electrophysiological measurement method according to the invention is the controlled modification and in particular increasing the concentration of at least one material or ion species at least on or in the wall forming the aperture, thereby interacting with the biological object and / or the electrolyte environment promoted a sealing or sealendes attaching and the sealing resistance is increased.
  • the focus is placed on the - especially lateral - localization of the modification of the concentration of the at least one material or ion species on the area of the aperture.
  • the wall region is formed with a region made of a material which essentially corresponds at least in its composition to the carrier material outside the aperture region, but has a locally modified, in particular locally increased, concentration with respect to at least one material species, in particular ion species.
  • the local concentration change and in particular concentration increase then leads, via a corresponding chemical and / or electrical interaction, to the fact that the sealing or sealing attachment of a biological object to be examined can be controlled and promoted, in particular the probability of attachment of the biological object to be examined the measuring aperture and / or the sealing resistance between the biological object to be examined and the measuring aperture are increased, compared with the situation in which the local modification of the concentration according to the invention does not exist in an otherwise identical electrophysiological measuring arrangement.
  • the concentration of the at least one species of material or ion may also be modified to a certain depth, eg, about 10 nm, from the surface of the inner wall of the aperture in this alternative aspect of the present invention. But there are also other local limited layers Deep or - especially in lateral locality - also a continuous implantation of the aperture wall conceivable.
  • an electrophysiological measuring method is again provided.
  • this is carried out using an electrophysiological measuring arrangement according to the alternative view of the present invention.
  • the inner wall of an aperture-forming wall region is or are controlled with respect to at least one material or ion species with a correspondingly suitable and opposite to the concentration of the at least one material or ion species Ion species formed in the carrier outside the aperture region locally increased concentration.
  • this measurement method according to the invention can therefore also a direct or indirect influence of molecules - the electrolyte environment and / or the membrane to be attached - near the wall by the locally modified concentration come into play.
  • a key aspect underlying this electrophysiological measurement method according to the invention is the controlled local modification and in particular increasing the concentration of at least one material or ionic species on or in the aperture forming wall region, thereby interacting with the biological object and / or the electrolyte environment promoted a sealing or sealendes attaching and the sealing resistance is increased.
  • measuring signals can also be measured, in particular in a capacitive manner, in order, for. B. single-channel activities to determine.
  • FIGS. 1B-1D show diagrammatic and sectional views of different cross-sectional shapes of an aperture and of the respective underlying wall region.
  • FIGS. 2A-2D show, in a schematic and sectional side view, details of various embodiments of the formation of the modified concentration at or in the wall region of an aperture.
  • FIGS. 3-7 show, in an analogous manner as in FIG. 1A, a schematic and sectional side view of various embodiments of an electrophysiological measuring arrangement according to the present invention, in which a respective aperture is formed by wall regions corresponding to lateral surfaces of different geometric bodies.
  • 8 shows an electrophysiological measuring arrangement according to an embodiment of the present invention, which is designed in the manner of a so-called patch pipette.
  • FIGS. 9A-9E show, in a schematic and sectional side view, various aspects of the use of the electrophysiological measuring arrangement according to the invention.
  • Figures 10-12 show in schematic and sectioned side view details in the attachment of a biological object to a respective embodiment of the electrophysiological measuring arrangement.
  • the patch-clamp technology is applied to e.g. Perform ion channel analyzes for drug testing.
  • the manual patch-clamp method and its refinements e.g. on single cells - electrical currents and voltages are measured which - e.g. of ion channels - are caused in the membranes of biological cells. Due to the growing importance of electrophysiological examinations and the time and effort involved in their implementation, a great demand has arisen for automated electrophysiological measurement techniques and in particular for planar patch clamp and other automated patch clamp or APC systems.
  • a cell as a biological object O is possibly sucked.
  • a small, limited part of the cell membrane M which is referred to as a patch, is thereby drawn in with a slight negative pressure.
  • the measuring surface or, in the case of a whole-cell measurement according to FIG. 9D the cell interior is electrically sealed in the mega to gigaohm region toward the outside of the cell.
  • the cell-attached configuration also allows current measurement on individual ion channels in the cell membrane.
  • the gigaseal rate and the sealing resistance of the manual patch clamp and the APC systems are a measure of the quality of the possible ion channel measurements. To date, a 100% gigaseal rate is not possible.
  • the training of the Gigaseal depends on many factors that are not accessible to active influence. So there is no real control of the gigaseal in the appendage and measurement process.
  • the present invention is based on the recognition that negative or positive charges on or in the carrier 12 and in particular on or in the inner wall I ii of a measuring aperture 14, e.g. also a patch pipette, support the training of a Gigaseal and can improve the Gigaseal itself.
  • a targeted and e.g. e.g.
  • the local charge density - by means of positive or negative charges - on or in the inner wall I ii of the measuring aperture 14 modified accordingly, ie in particular increased and it will be the processes for establishment and / or stabilizing a gigaseal influenced by direct and possibly local modification on or in the surface, eg by material implantation in the aperture wall, e.g. by means of a plasma.
  • the control of the charge density on or in the pipette wall or aperture wall 1 1 is effected by the modification and in particular by increasing the concentration of a material or ion species at least in a region 20 of the wall portion 1 1 of the aperture 10, so that at least in the Meßaperturwand 1 1 and there locally in region 20, the material 12 "of the support 12 has a modified and in particular increased concentration with respect to at least one material or ion species, compared to the concentration of the corresponding species in the material 12 'of the support 12 outside the region 20 and thus outside of the aperture region 10, in particular compared with the concentration in the interior of the carrier 12 and / or of the carrier 12 in the middle.
  • the described effects and advantages are achieved according to the invention.
  • the invention accordingly provides, inter alia, the targeted and optionally spatially resolved or local modification or increase in the concentration of ions or protons, at least in or on the inner wall of the measuring aperture, thereby positively influencing processes for establishing the Gigaseal. This can not be guaranteed when using conventional physiological measuring buffers.
  • the present invention accordingly relates to an electrophysiological measuring arrangement 100 and to an electrophysiological measuring method in which the sealing or sealing attachment of a biological object O to be examined to a support 12 of the measuring arrangement 100 can be controlled and in particular conveyed by at least on or in a region 20 of a Wall portion 1 1, which forms an aperture 14 of an aperture region 10, a material 12 "is provided which the material 12 'of the carrier outside the aperture region 10 and in particular the material of the carrier 12 in the interior 12i or in its spatial means at least in his Substantially corresponds to composition, but with respect to at least one material or ionic species - possibly locally - increased concentration, so that by this - possibly locally - increased concentration of or in the Aperturinnenwand I ii of the aperture 14, the sealing system
  • the carrier 12 of the so-called aperture area 10 is incorporated.
  • This has at least one aperture 14, namely e.g. in the manner of a through hole, which completely penetrates the carrier 12 in its thickness or layer thickness direction, namely in the direction from the upper side 12a to the lower side 12b.
  • a portion 70 of the electrolyte bath 40, 60, 70 is also provided.
  • the wall region 11 or the aperture wall 11 is not completely modified in terms of concentration.
  • the concentration-modified region 20 and the aperture wall 11 or the wall region 11 do not completely coincide in this embodiment. Rather, the concentration modification of the at least one material or ion species and thus the concentration-modified region 20 extend only up to a depth ⁇ of about 10 nm, namely viewed from the inner wall 11 of the aperture wall 11.
  • FIGS. 1C and 1D show a square as the base area, so that spatially a vertical square prism results or a prism with a base in the manner of an oval, quasi a square or rectangle with rounded corners, such as this is shown in Fig. 1 D.
  • the concentration modification of the at least one material or ion species and thus the concentration-modified region 20 extend only to a depth .DELTA. Of approximately 10 nm, specifically from the inner wall I.sub.i of the aperture wall 11.
  • the lateral locality of the concentration-modified region 20 and thus restriction to the aperture region 10 are and in particular canceled on the aperture wall 1 1. Rather, here are the entire top 12a of the support 12 and the aperture inner wall I ii concentration-modified to a depth ⁇ of about 10 nm in their concentration of at least one material or ion species.
  • FIGS. 3 and 4 show, analogously to FIG. 1A and likewise in schematic and sectional side view, other embodiments of the measuring arrangement according to the invention, in which there is a difference in that, according to FIG. 3, the wall region 11 for the aperture 14 is flush with the Top 12a of the substrate 12 closes and only protrudes beyond the bottom 12b of the substrate 12, so that a total of a kind of invagination from the top 12a inwardly to the compartment 60 for the aperture 14 is formed.
  • a portion of the wall portion 1 1 of the aperture 14 rises from the top 12 a of the substrate 12 in the compartment 40, on the other hand, however, a portion of the wall portion 1 1 from the bottom 12 b of the substrate 12 in the compartment 60th into it.
  • the heights above the upper side 12a and above the lower side 12b, about which the wall region 11 for the aperture 14 each rise, may be identical. This is not mandatory. In Fig. 4 they are designed differently.
  • the cross section or diameter along the extension direction of the wall portion 1 1 perpendicular to the top 12a and perpendicular to the bottom 12b of the substrate 12 is constant in its course.
  • FIG. 8 shows, in a schematic and sectional side view, an embodiment of the electrophysiological measuring arrangement 100 according to the invention, in which the aperture area 10 is formed by a wall area 11, which is designed overall in the manner of a patch pipette.
  • 2A to 2D show in more detail section X from FIG. 1A and various modifications with regard to the design of modified region 20 with material 12 "having the modified or increased concentration of the at least one material or ion species.
  • FIGS. 9A to 9E show, in a schematic and sectional side view, various measuring principles that can be used in the electrophysiological measuring arrangement 100 according to the invention and the corresponding electrophysiological measuring method according to the invention.
  • a biological object O in this case, for example, a cell sucked and approximated to the aperture 14.
  • the approaching mechanism may also be done in another manipulative manner, for example by means of a separate pipette, a laser pin or the like.
  • the cell is deposited without any destruction and completely on the measuring aperture 14. If a measurement is carried out in this state, this is called a cell-attached mode.
  • a membrane spot can be torn out of the membrane of the biological object O, so that according to FIG. 9C the torn-out membrane patch, a so-called patch, in the sealed or seamed state in FIG the measuring aperture 14 remains and actually forms the measuring object O.
  • this measurement mode is also called Inside-Out mode.
  • the cell O can be opened in its entirety by a renewed negative pressure, for example in the manner of a pressure surge, so that a transition takes place from the so-called cell-attached mode to the whole-cell mode according to FIG Fig. 9D, in which the measuring electrode 30 has direct access to the entire cell interior. That is, the cell interior is open to compartments 70 and 60, but substantially isolated from compartment 40. From the situation according to FIG. 9D, namely the whole-cell mode, it can be achieved by mechanical pulling that in turn a membrane fragment is torn out of the membrane of the biological object.
  • FIG. 10 shows in detail the geometrical situation which results in a sealed or sealing attachment of a biological object O to be measured between its membrane M and the measuring aperture 14 and in particular the inner wall l Oi, I ii of the wall region 1 1 is present.
  • the foremost portion of the wall portion 11 is formed by the concentration modified portion 20 with or from the modified concentration material 12 ".
  • FIG. 10 again shows a whole-cell mode in which the entire cell O, with its interior, is open to the measuring electrode 30 and to the electrolyte compartments 60 and 70.
  • This embodiment of the electrophysiological measurement arrangement 100 according to the invention is designed here in the manner of a patch pipette.
  • the sealing resistance between the cell membrane M of the biological object O to be measured and the inner wall 10i, 11 of the wall area 11 of the measuring aperture 14 is improved in that the concentration-modified area 20 is made with or from the material 12 "with modified concentration is provided and interacts with the outside cell membrane M of the biological object O.
  • the modification of the concentration in the concentration-modified region 20 it is possible according to type and strength to take into account the different situations on different surfaces of membranes M, be this cell membrane, membranes of organelles or membranes of artificial objects. This has not been possible so far and offers a possibility to promote an investment and a seal controlled or, once a seal is made to stabilize.
  • the substrate is quasi occupied by a layer of cells O '.
  • concentration-modified region 20 provided with the invention in the aperture wall 11 with or with modified concentration material 12 "
  • a single cell O of the ensemble of cells O ' is to be measured in whole-cell mode analogous to the situation according to FIG. 9D with improved sealing or sealing attachment of an electrophysiological measurement accessible.
  • FIG. 12 shows an arrangement of the measuring arrangement 100 according to the invention, in which the wall region 1 1 forming an aperture 14 is formed by an edge region, so that the aperture 14 is formed as a planar hole in the underlying substrate 12 and thereby the concentration-modified region 20 with or from the material 12 "forms the edge region with a correspondingly modified concentration of at least one material or ion species in order to promote the attachment and to increase the sealing resistance.
  • electrolyte compartment electrolyte compartment, electrolyte bath to the top 12a of the support 12 60 electrolyte compartment, electrolyte bath to the back 12b of the support 12 70 electrolyte compartment, electrolyte bath in the lumen of the aperture 14

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine elektrophysiologische Messanordnung (100) sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren, bei welchen ein Träger (12) aus einem Trägermaterial (12') und ein Aperturbereich (10) im Bereich des Trägers (12) zum gesteuerten abdichtenden Anlagern eines biologischen Objekts (O) vorgesehen werden. Der Aperturbereich (10) ist mit mindestens einer Apertur (14) sowie mit einen Wandbereich (11) ausgebildet, welcher als Aperturinnenwand (11i) die Apertur (14) bildend umgibt. Zumindest der Wandbereich (11) ist mit einem Bereich (20) aus einem Material (12") ausgebildet, welches zumindest in seiner Zusammensetzung dem Trägermaterial (12') außerhalb des Aperturbereichs (10) im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer Ionenspezies eine erhöhte Konzentration aufweist, so dass durch diese erhöhte Konzentration an oder in zumindest der Aperturinnenwand (11i) der Apertur (14) das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts (O) am Aperturbereich (10) förderbar ist, wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer Tiefe von etwa 10 nm von der Oberseite (12a) oder Oberfläche des Trägers (12) und insbesondere von der Aperturinnenwand (Iii) her modifiziert ist.

Description

Elektrophysiologische Messanordnung und elektrophysiologisches Messverfahren
GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine elektrophysiologische Messanordnung so- wie ein elektrophysiologisches Messverfahren, insbesondere unter Verwendung der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG Es sind verschiedene Verfahren und Einrichtungen bekannt, die im Bereich der Elektrophysiologie eingesetzt werden, um biologische Objekte - insbesondere also Zellen im weitesten Sinne, Zellorganellen, Oozyten und deren Fragmente - im Hinblick auf in jeweilige Membranen integrierte und / oder dort angelagerte Proteine und deren Transporteigenschaften hin zu untersuchen, wobei auch Vesikel, Lipo- somen oder andere mehr oder weniger künstliche Systeme zum Einsatz kommen können.
Dabei werden häufig zwischen einer Messelektrode und einer Gegenelektrode, welche zwischen dem biologischen Objekt angeordnet werden, elektrische Ströme und/oder elektrische Spannungen aufgeprägt und/ oder gemessen. Die gemessenen Ströme und/ oder Spannungen sollen Aufschluss geben über die zu Grunde liegenden physiologischen Prozesse, insbesondere Transportprozesse, Konformationsänderungen und dergleichen. Häufig liegen dabei vergleichsweise sehr geringe Signalstärken vor. Zum Erzielen eines geeigneten Signal-zu-Rausch-Verhältnisses sind daher hohe Abdichtwiderstände, das heißt also möglichst geringe elektrische Restleitfähigkeiten, über die Membran selbst oder im Berührungs- oder Kontaktbereich zwischen der Membran des zu untersuchenden biologischen Objekts und der Aperturwand nötig.
Bei bekannten elektrophysiologischen Messverfahren und Messanordnungen lassen sich der Abdichtwiderstand oder die elektrische Restleitfähigkeit zwischen Zellinnerem und Zelläußerem - oder allgemeiner zwischen Membraninnenseite und Membranaußenseite - des zu vermessenden biologischen Objekts bisher nicht in ausreichendem Maße steuern. Dies führt dazu, dass die Abdichtwiderstände ganz allgemein häufig zu gering sind, so dass sich ungünstige Signal-zu-Rausch-Verhältnisse einstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Der Erfindung liegt die Aufgabe zu Grunde, eine elektrophysiologische Messanordnung sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren zu schaffen, bei welchen es möglich ist, das Anlagern eines zu vermessenden biologischen Objekts sowie das Ausbilden und die Qualität eines Abdichtwiderstands bei der Anlagerung zwi- sehen dem zu vermessenden biologischen Objekt und dem Messsystem möglichst zuverlässig zu fördern, insbesondere zur Erreichung eines Gigaseals, also einer Anlagerung mit einem Abdichtwiderstand im Gigaohmbereich.
Die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe wird bei einer elektrophysiologi- sehen Messanordnung erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 1 gelöst. Des Weiteren wird die der Erfindung zu Grunde liegende Aufgabe bei einem elektrophysiologischen Messverfahren erfindungsgemäß mit den Merkmalen des unabhängigen Patentanspruchs 10 gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Einerseits schafft die vorliegende Erfindung eine elektrophysiologische Messanordnung mit einem Träger, welcher zumindest in seinem Inneren mit oder aus einem Trägermaterial mit einer bestimmten Zusammensetzung - z.B. bestimmten Konzentrationen an materiellen oder Ionenspezies - und mit einem Aperturbereich im Bereich des Trägers - also mit einem Bereich, der mindestens eine Apertur o- der Messapertur aufweist oder bildet - zum gesteuerten abdichtenden oder sealenden Anlagern eines biologischen Objekts, z.B. einer Zelle, einer Zellorganelle, eines Vesikels, eines Liposoms, einer natürlichen oder künstlichen Membran, z.B. einer Lipiddoppelschicht, oder dergleichen oder eines Fragments davon. Der Aperturbereich ist mit mindestens einer Apertur ausgebildet sowie mit einem Wandbereich, welcher als Aperturinnenwand die Apertur bildet und diese umgibt. Zumindest der Wandbereich ist mit einem Bereich aus einem Material ausgebildet, welches dem Material des Trägers außerhalb des Aperturbereichs, insbesondere im Mittel des Trägers oder im Inneren des Trägers, zumindest in seiner Zusam- mensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer Materialspezies, insbesondere Ionenspezies eine modifizierte, insbesondere erhöhte Konzentration aufweist. Durch diese modifizierte, insbesondere lokal erhöhte Konzentration der Material- oder Ionenspezies an oder in zumindest der Aperturinnenwand der Apertur ist das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts am Aperturbereich förderbar. Dabei ist die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer vorgegebenen von der Oberseite oder Oberfläche des Trägers und insbesondere von der Aperturinnenwand her oder aus modifiziert, insbesondere bis zu einer Tiefe von etwa 10 nm.
Es ist somit eine Kernidee der vorliegenden Erfindung, bei einer elektrophysiologi- schen Messanordnung mit einem Aperturbereich, welcher zum abdichtenden oder sealenden Anlagern, also zum Anlagern mit hohem Abdichtwiderstand in Bezug auf ein zu untersuchendes biologisches Objekt ausgebildet ist, an oder in zumin- dest einem Wandbereich, welcher eine Apertur eines Aperturbereichs bildet und umgibt, die Konzentration mindestens einer Material- oder Ionenspezies zu modifizieren und insbesondere zu erhöhen, und zwar verglichen mit der Konzentration der Material- oder Ionenspezies außerhalb des modifizierten Bereichs, also im zu Grunde liegenden Material des Trägers außerhalb des Aperturbereichs, insbeson- dere im Mittel des Trägers und/oder im Inneren des Trägers.
Die Konzentrationsänderung und insbesondere Konzentrationserhöhung führen dann über eine entsprechende chemische und/ oder elektrische Wechselwirkung dazu, dass auch das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchen- den biologischen Objekts gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, wobei insbesondere die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung des zu untersuchenden biologischen Objekts an der Messapertur und/ oder der Abdichtwiderstand zwischen dem zu untersuchenden biologischen Objekt und der Messapertur gesteigert werden, und zwar verglichen mit der Situation, bei welcher in einer ansons- ten identischen elektrophysiologischen Messanordnung die erfindungsgemäße Modifikation der Konzentration nicht vorliegt, oder verglichen mit dem Sonderfalleines vollständig dotierten Wafers, bei dem die Funktion des Förderns oder Stabilisierens des Gigaseals gegeben ist, jedoch die Eigenschaften des Chips hinsichtlich der Eignung zum Messen schlechter ist.
Es ist somit erfindungsgemäß möglich, das gewünschte biologische Objekt in seiner Anlagerung und bei der Ausbildung eines Seals mit der Apertur und dem Wandbereich der Apertur zu unterstützen und die Stärke des Seals im Sinne eines erhöhten Abdichtwiderstands oder einer stark erniedrigten Restleitfähigkeit sowie einer verstärkten mechanischen Stabilität des Seals zu verbessern.
Biologische Objekte, die einer Untersuchung zugeführt werden, können dabei Zellen, Zellorganellen, Oozyten, Bakterien oder deren Kombinationen oder Fragmente, jeweils im weitesten Sinne, sein. Auch sind künstliche oder teilweise künstli- che im Wesentlichen biologische Strukturen denkbar, zum Beispiel in Form von Vesikeln, Liposomen, Mizellen, Membranfragmente oder dergleichen, in welche in natürlicher oder künstlicher Art und Weise Proteine ein- und / oder angelagert sind.
Die zu untersuchenden Objekte können ganz allgemein natürliche oder teilweise oder vollständig künstliche biologische Objekte sein. Auch sind nicht-biologische Objekte untersuchbar, um z.B. reine Lipidstrukturen und deren Modifikationen zu untersuchen. Im Folgenden wird ausschließlich von biologischen Objekten gespro- chen, wobei jedoch sämtliche, in diesem Sinne beschriebenen Variationen als Messobjekte mit umfasst sein sollen.
Erfindungsgemäß wird mit anderen Worten erreicht, dass ausgewählte zu untersuchende biologische Objekte mit einem verbesserten Abdichtwiderstand angela- gert und danach vermessen werden, so dass sich ein besseres Signal-zu-Rausch- Verhältnis einstellt und die Anlagerung mechanisch stabilisiert wird, z.B. mit der Folge einer verlängerten Messzeitspanne und einer verbesserten Zuverlässigkeit in Bezug auf die Messergebnisse. Durch die Wahl der Spezies und/ oder der Höhe der Konzentrationsmodifikation können Art und Stärke die Wechselwirkung in Abhängigkeit von der Ladung und/oder vom Aufbau der Membran der biologischen Objekte auf deren Außen- und Innenseite und damit die Qualität und Dauer der Anlagerung beeinflusst werden.
Die mindestens eine Materialspezies oder Ionenspezies kann aus der Gruppe ausgewählt sein oder werden, die Protonen (H+), Halogenidionen, insbesondere Fluo- ridionen (F ), zweifach geladene Ionen, insbesondere zweifach geladene Metallkationen, vorzugsweise Be2+, Sr2+, Ca2+ und Mg2+ aufweist. Die Erfindung ist jedoch nicht auf diese Spezies beschränkt, grundsätzlich sind nämlich sämtliche materiellen Spezies denkbar, um z.B. bestimmten speziellen Oberflächensituationen eines zu vermessenden biologischen Objekts gerecht zu werden, um z.B. auch beim Vorliegen von Glykokalyxstrukturen oder bei anderen Situationen hohe Abdichtwiderstände und mechanisch stabile Anlagerungen zu erzielen.
Die Erhöhung der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies kann räumlich lokal derart auf den Bereich des Wandbereichs beschränkt sein, dass das Material des Trägers zumindest in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs keine erhöhte Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies aufweist.
Die Konzentration der mindestens einen Material- oder Ionenspezies kann mittels einer Implantation erhöht ausgebildet sein oder werden, insbesondere vermittelt über einen Plasmaprozess, über einen Sputterprozess oder über einen Ionen- strahlprozess. Denkbar sind aber auch andere Implantations- oder Dotierungsverfahren. Bei einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messanordnung ist der Aperturbereich im Bereich eines Trägers, der eine Oberseite und eine Unterseite aufweist, ausgebildet. Dabei kann dann ein jeweiliger eine Apertur bildender Wandbereich in Bezug auf die Oberseite und /oder in Bezug auf die Unterseite des Trägers teilweise oder vollständig hervorstehen.
Der vorzusehende Träger kann auch als Basis, Substrat oder Grundsubstrat bezeichnet werden. Das Vorsehen eines derartigen Substrats oder eines derartigen Trägers stabilisiert die Messanordnung und insbesondere die Anordnung des angeordneten zu untersuchenden biologischen Objekts als solche mechanisch und ermöglicht eine makroskopische Unterteilung der Messanordnung in Bezug auf das der Messung zu Grunde zu legende Elektrolytbad im Sinne der Unterteilung einer Messküvette oder Nasszelle in Kompartimente mit Mess- und Gegenelektrode. Ein jeweiliger eine Apertur bildender Wandbereich kann auch in der Innenwand des Loches in Kombination mit der Elektrodenanordnung integriert ausgebildet sein.
Auf der Grundlage des Substrats oder des Trägers können dann ein oder mehrere Aperturen mit entsprechenden Wandbereichen in Bezug auf die Oberseite herausragend oder sich hervorhebend ausgebildet werden.
Alternativ dazu können diese auch an der Oberseite planar abschließend nach innen ausgestülpt sein, um auf der Unterseite des Trägers oder des Substrats hervorzustehen; dies ist jedoch nicht zwingend und kann bei entsprechender Dicke der Membran entfallen.
Das Ausmaß des jeweiligen Einstülpens oder Hervortretens beeinflusst die Innenwand des jeweiligen Wandbereichs und damit die zur Verfügung stehende Wech- selwirkungsfläche mit der Membran des biologischen Objekts. Die Wahl des Ausmaßes des Hervorragens oder Einstülpens ermöglicht darüber hinaus eine Anpassung an die jeweilig zur Verfügung stehenden Messobjekte, zum Beispiel im Hinblick auf deren Form oder Anzahl in der Messlösung.
Der Träger kann als - insbesondere planares - Plattenelement mit Vorder- oder Oberseite und mit Rück- oder Unterseite ausgebildet sein. Auch andere Geometrien sind denkbar. Alternativ dazu kann von der Plattenform abgewichen werden, in dem z.B. die Form einer Pipette, z.B. im Sinne einer klassischen Patchpipette aufgegriffen wird.
Der Wandbereich, der eine Apertur bildet, kann nach Art einer Mantelfläche oder als eine Kombination von Mantelflächen ausgebildet sein. Dabei kann jeweils auf den Mantel eines Zylinders, eines Prismas, eines Kegelstumpfs und/ oder eines Pyramidenstumpfs zurück gegriffen werden, mit entsprechender Wandstärke.
Bezüglich der Form des Wandbereichs zur Ausbildung der Apertur stehen also vielfältige Möglichkeiten zur Verfügung. Diese können ausgewählt werden in Ab- hängigkeit von der Form und den weiteren - z.B. mechanischen, geometrischen und/oder elektrischen - Eigenschaften der zu untersuchenden biologischen Objekte.
Des Weiteren kann der eine Apertur bildende Wandbereich von einem Rand oder Randbereich gebildet werden, so dass die Apertur quasi als planares Loch in dem zu Grunde liegenden Substrat ausgebildet ist und dabei der konzentrationsmodifi- zierte Bereich mit oder aus dem Material mit modifizierter Konzentration in den Randbereich des planaren Lochs eingebettet ist, um das Anlagern und Sealen zu fördern und damit den Abdichtwiderstand zu erhöhen.
Ein eine Apertur bildender Wandbereich kann mit oder aus einem Material aus der Gruppe von Materialien ausgebildet sein, welche Glas, Quarzglas, Silizium, Kohlenstoff und deren Kombinationen und Derivate aufweist. Auch in Bezug auf die Materialwahl können die Eigenschaften der zu Grunde liegenden biologischen Objekte berücksichtigt werden, zum Beispiel im Hinblick auf die Oberflächenstruktur oder Oberflächenladung der Membranaußenseite und / oder der Membraninnenseite der biologischen Objekte, zum Beispiel auch, um ein besonders inniges Anhaften und damit die Steigerung des Abdichtwiderstands beim Seal weiter zu unterstützen. Der Durchmesser der Apertur und insbesondere der Innendurchmesser eines oder des die Apertur bildenden Wandbereichs können einen Wert im Bereich von etwa 0 μ η bis etwa 50 μτη, vorzugsweise im Bereich im Bereich von etwa 1 μτη bis etwa 50 μπι aufweisen. Ein oder der eine Apertur bildende Wandbereich kann über der Oberseite oder der Unterseite des Trägers oder des Substrats eine Höhe oder Tiefe im Bereich von etwa 0 μτα bis etwa 20 μτη aufweisen.
Die angegebenen Maße in Bezug auf Höhe und Tiefe der Wandbereiche und deren Durchmesser können sich weiter an den geometrischen Gegebenheiten der zu untersuchenden biologischen Objekte orientieren, insbesondere also an deren Größe und an den mechanischen Eigenschaften ihrer Membranen, und folglich entsprechend andere Werte als die konkret angegebenen aufweisen. Zur Ausbildung eines Messkreises können eine Messelektrode im Bereich oder innerhalb der Apertur oder in einem Bereich auf der Rück- oder Unterseite des Trägers oder Substrats vorgesehen sein.
Es kann eine Gegenelektrode außerhalb der Apertur und im Bereich auf der Vor- der- oder Oberseite des Trägers vorgesehen sein.
Messelektrode und Gegenelektrode sind vorzugsweise auf gegenüberliegenden Seiten des Trägers oder Substrats oder der Messapertur angeordnet, jedenfalls so, dass bei Anlagerung eines zu vermessenden vorzugsweise biologischen Objekts dieses zwischen den Elektroden angeordnet ist und bei Ausbildung eines geeigneten Seals diese praktisch elektrisch trennt, vorzugsweise mit einem sehr hohen Widerstand, idealerweise größer als 1 GQ.
Der grundlegende Aufbau für die erfindungsgemäße elektrophysiologische Messanordnung gemäß dieser Ausführungsform beinhaltet also insbesondere das Vorsehen einer Messelektrodenanordnung und einer Gegenelektrodenanordnung, zwischen welchen ein elektrischer Strom und / oder eine elektrische Spannung gemessen werden kann, wobei zwischen der Messelektrodenanordnung und der Gegenelektrodenanordnung gerade das zu vermessende biologische Objekt im Be- reich der Apertur und deren Wandbereich derart angeordnet ist oder wird, dass durch die abdichtende oder sealende Anlagerung die Restleitfähigkeit, also die Leitfähigkeit zwischen der Membran des biologischen Objekts und dem Wandbereich der Apertur, möglichst gering ist, so dass die tatsächlich gemessenen elektrischen Ströme und/ oder elektrischen Spannungen als von den Eigenschaf- ten der Membran des biologischen Objekts hervorgerufen angesehen werden können, zum Beispiel durch Transportprozesse, Ladungsverschiebungen innerhalb oder über die Membran, durch Substratbindung oder Abgabe oder dergleichen. Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein elektrophysio- logisches Messverfahren geschaffen. Dieses wird insbesondere unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Zum Steuern und insbesondere zum Fördern des abdichtenden oder sealenden Anlagerns eines zu vermessenden biologischen Objekts an einer Apertur eines Aperturbereichs ist oder wird zumindest ein Bereich eines die Innenwand eines die Apertur bildenden Wandbereichs bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies im Träger außerhalb des Aperturbereichs und insbesondere im Mittel des Trägers und/ oder im Inneren des Trägers erhöhten Konzentration ausgebildet.
Beim erfindungsgemäßen Messverfahren kann also auch eine direkte oder auch indirekte Beeinflussung von Molekülen - der Elektrolytumgebung und/oder der anzulagernden Membran - in Wandnähe durch die modifizierte Konzentration zum Tragen kommen.
Entsprechend ist also ein Kernaspekt, welcher dem erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messverfahren zu Grunde liegt, das gesteuerte Modifizieren und insbesondere Erhöhen der Konzentration mindestens einer materiellen oder Io- nenspezies zumindest am oder im die Apertur bildenden Wandbereich, wobei dadurch über Wechselwirkung mit dem biologischen Objekt und/ oder der Elektrolytumgebung ein abdichtendes oder sealendes Anlagern gefördert und der Abdichtwiderstand gesteigert wird. Gemäß einer alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung wird der Fokus auf die - insbesondere laterale - Lokalität der Modifikation der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies auf den Bereich der Apertur gelegt. Dabei wird einerseits wieder eine elektrophysiologische Messanordnung geschaffen mit einem Träger aus einem Trägermaterial und mit einem Aperturbereich im Bereich des Trägers - also mit einem Bereich, der mindestens eine Apertur oder Messapertur aufweist oder bildet - zum gesteuerten abdichtenden oder sealenden Anlagern eines biologischen Objekts, z.B. einer Zelle, einer Zellorganelle, eines Vesikels, eines Liposoms, einer natürlichen oder künstlichen Membran, z.B. einer Lipiddoppelschicht, oder dergleichen oder eines Fragments davon. Der Aperturbereich ist mit mindestens einer Apertur ausgebildet sowie mit einem Wandbereich, welcher als Aperturinnenwand die Apertur bildet und diese umgibt. Der Wandbe- reich ist mit einem Bereich aus einem Material ausgebildet, welches dem Trägermaterial außerhalb des Aperturbereichs zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer Materialspezies, insbesondere Ionenspezies eine lokal modifizierte, insbesondere lokal erhöhte Konzentration aufweist. Durch diese lokal modifizierte, ins- besondere lokal erhöhte Konzentration der Material- oder Ionenspezies an oder in der Aperturinnenwand der Apertur ist das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts am Aperturbereich förderbar.
Es ist somit eine Kernidee dieser alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfin- dung, bei einer elektrophysiologischen Messanordnung mit einem Aperturbereich, welcher zum abdichtenden oder sealenden Anlagern, also zum Anlagern mit hohem Abdichtwiderstand in Bezug auf ein zu untersuchendes biologisches Objekt ausgebildet ist, an oder in einem Wandbereich, welcher eine Apertur eines Aperturbereichs bildet und umgibt, lokal die Konzentration mindestens einer Ma- terial- oder Ionenspezies zu modifizieren und insbesondere zu erhöhen, und zwar verglichen mit der Konzentration der Material- oder Ionenspezies im zu Grunde liegenden Trägermaterial außerhalb des Aperturbereichs.
Die lokale Konzentrationsänderung und insbesondere Konzentrationserhöhung führt dann über eine entsprechende chemische und/ oder elektrische Wechselwirkung dazu, dass auch das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchenden biologischen Objekts gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, wobei insbesondere die Wahrscheinlichkeit der Anlagerung des zu untersuchenden biologischen Objekts an der Messapertur und/ oder der Abdichtwiderstand zwischen dem zu untersuchenden biologischen Objekt und der Messapertur gesteigert werden, und zwar verglichen mit der Situation bei welcher in einer ansonsten identischen elektrophysiologischen Messanordnung die erfindungsgemäße lokale Modifikation der Konzentration nicht vorliegt. Die Konzentration der mindestens einen Material- oder Ionenspezies kann auch bei dieser alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung bis zu einer bestimmten Tiefe, z.B. von etwa 10 nm von der Oberfläche der Aperturinnenwand her oder aus modifiziert sein. Es sind aber auch andere lokale begrenzte Schicht- tiefen oder - insbesondere bei lateraler Lokalität - auch eine durchgehende Implantation der Aperturwand denkbar.
Gemäß einem weiteren Aspekt der alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfin- dung wird andererseits wieder ein elektrophysiologisches Messverfahren geschaffen. Dieses wird insbesondere unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung gemäß der alternativen Sichtweise der vorliegenden Erfindung ausgeführt. Zum Steuern und insbesondere Fördern des abdichtenden oder sealenden Anlagerns eines zu vermessenden biologischen Objekts an einer Apertur eines Aperturbereichs ist oder wird die Innenwand eines die Apertur bildenden Wandbereichs bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies im Träger außerhalb des Aperturbereichs lokal erhöhten Konzentration ausgebildet.
Bei diesem erfindungsgemäßen Messverfahren kann also auch eine direkte oder auch indirekte Beeinflussung von Molekülen - der Elektrolytumgebung und/ oder der anzulagernden Membran - in Wandnähe durch die lokal modifizierte Konzentration zum Tragen kommen.
Entsprechend ist also ein Kernaspekt, welcher diesem erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messverfahren zu Grunde liegt, das gesteuerte lokale Modifizieren und insbesondere Erhöhen der Konzentration mindestens einer materiellen oder Ionenspezies am oder im die Apertur bildenden Wandbereich, wobei dadurch über Wechselwirkung mit dem biologischen Objekt und / oder der Elektrolytumgebung ein abdichtendes oder sealendes Anlagern gefördert und der Abdichtwiderstand gesteigert wird.
Bei den erfindungsgemäßen Messverfahren und mit den erfindungsgemäßen Messanordnungen können Messsignale insbesondere auch in kapazitiver Art und Weise gemessen werden, um z. B. Einzelkanalaktivitäten zu ermitteln.
Diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung werden auf der Grundlage der beigefügten Zeichnungen näher erläutert.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
Fig. 1A, IE zeigen in geschnittener Seitenansicht eine erste bzw. eine alternative zweite Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysi- ologischen Messanordnung, bei welcher der Wandbereich einer Apertur sich über der Oberseite eines zu Grunde liegenden Trägers erhebt. Fig. 1B - 1D zeigen in schematischer und geschnittener Draüfsicht verschiedene Querschnittsformen einer Apertur und des jeweils zu Grunde liegenden Wandbereichs.
Fig. 2A - 2D zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht Details verschiedener Ausführungsformen der Ausbildung der modifizierten Konzentration am oder im Wandbereich einer Apertur.
Fig. 3 - 7 zeigen in analoger Art und Weise wie in Fig. 1A in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Ausführungsformen für eine elektrophysiologische Messanordnung gemäß der vorliegenden Erfindung, bei welchen eine jeweilige Apertur durch Wandbereiche gebildet werden, die Mantelflächen unterschiedlicher geometrischer Körper entsprechen. Fig. 8 zeigt eine elektrophysiologische Messanordnung gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, welche nach Art einer so genannten Patchpipette ausgebildet ist.
Fig. 9A - 9E zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht ver- schiedene Aspekte des Einsatzes der erfindungsgemäßen elektro- physiologischen Messanordnung.
Fig. 10 - 12 zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht Details bei der Anlagerung eines biologischen Objekt an einer jeweiligen Ausführungsform der elektrophysiologischen Messanordnung.
DETAILBESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es werden im Folgenden Im Detail Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung beschrieben. Sämtliche Ausführungsformen der Erfindung und auch ihre technischen Merkmale und Eigenschaften können einzeln isoliert und wahlfrei zusammengestellt und miteinander beliebig und ohne Einschränkung kombiniert werden. Es werden nachfolgend - soweit nichts anderes gesagt ist - strukturell und / oder funktionell gleiche, ähnliche oder gleich wirkende Merkmale oder Elemente im Zusammenhang mit den Figuren mit denselben Bezugszeichen bezeichnet. Nicht in jedem Fall ihres Auftretens wird eine detaillierte Beschreibung dieser Merkmale oder Elemente wiederholt.
Zunächst wird auf Zeichnungen im Allgemeinen Bezug genommen.
In der Elektrophysiologie wird unter anderem die Patch-Clamp-Technologie ange- wandt, um z.B. Ionenkanalanalysen für die Medikamententestung durchzuführen. Beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren und dessen Verfeinerungen können - z.B. an Einzelzellen - elektrische Ströme und Spannungen gemessen werden, die - z.B. von Ionenkanälen - in den Membranen biologischer Zellen hervorgerufen werden. Auf Grund der wachsenden Bedeutung elektrophysiologischer Untersuchungen und des personellen und zeitlichen Aufwandes bei deren Durchführung ist eine große Nachfrage nach automatisierten elektrophysiologischen Messtechniken und insbesondere nach planaren Patch-Clamp- und weiteren automatisierten Patch- Clamp- oder APC-Systemen entstanden.
Die Funktionsweisen beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren und bei APC- Systemen sind grundlegend gleich. Problematisch ist bei beiden Systemtypen die Notwendigkeit der Ausbildung eines hochohmigen Abdichtwiderstandes zwischen der dem Messobjekt O, z.B. einer Zelle O, und der Messanordnung 100. Man spricht auch von der Notwendigkeit eines so genannten Gigaseals, also eines Abdichtwiderstands im Gigaohmbereich. Damit wird die elektrische Isolierung - z.B. des Zellinneren zum Zelläußeren - z. B. durch eine Patchpipette beschrieben, wie dies z.B. in Fig. 10 gezeigt ist, oder bei einer flächigen Zellanordnung, wie bei einem APC-Schema gemäß Fig. 1 1 und 12.
Mittels einer Patchpipette wird eine Zelle als biologisches Objekt O ggf. angesaugt. Ein kleiner, begrenzter Teil der Zellmembran M, der als Patch bezeichnet wird, wird dabei mit einem leichten Unterdruck eingesogen. Dadurch wird bei der Cell- Attached-Messung gemäß Fig. 9B die Messfläche bzw. bei einer Whole-Cell- Messung gemäß Fig. 9D das Zellinnere im Mega- bis Gigaohmbereich zum Zelläußeren hin elektrisch abgedichtet. Die Cell-Attached-Konfiguration ermöglicht eine Strommessung auch an einzelnen Ionenkanälen in der Zellmembran. Die Gigasealrate sowie der Abdichtwiderstand sind beim manuellen Patch-Clamp sowie bei den APC-Systemen ein Maß für die Qualität der möglichen Ionenkanal- messungen. Bis heute ist eine 100 %-ige Gigasealrate nicht möglich. Die Ausbildung des Gigaseals hängt von vielen Faktoren ab, die einer aktiven Beeinflussung bisher nicht zugänglich sind. Es fehlt also eine echte Steuerung des Gigaseals im Anlagerungs- und im Messprozess.
Beim manuellen Patch-Clamp-Verfahren kann bisher nur mit frisch hergestellten Glaspipetten eine ausreichend hohe Gigasealrate erreicht werden. Bei der Entwicklung von Chips für APC-Systeme muss auf eine Reduktion der Oberflächenrauhigkeit und auf eine Vermeidung scharfer Kanten geachtet werden. Weiter kann eine sorgfältige Kombination der intra- und extrazellulären Puffer zu einer Verbesserung des Gigaseals führen. Dies bietet jedoch durch die Notwendigkeit, physiologische Puffer verwenden zu müssen, nur begrenzte Möglichkeiten der Steuerung und Beeinflussung.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass negative oder positive Ladungen am oder im Träger 12 und insbesondere an oder in der Innenwand I ii einer Messapertur 14, z.B. auch einer Patchpipette, die Ausbildung eines Gigaseals unterstützen und den Gigaseal selbst verbessern können. Durch eine gezielte und z.B. auch ortsaufgelöste Modifikation und insbesondere Erhöhung der Konzentration bestimmter materieller Spezies und insbesondere von Ionen wird die lokale Ladungsdichte - mittels positiver bzw. negativer Ladungen - an oder in der Innenwand I ii der Messapertur 14 entsprechend modifiziert, also insbesondere erhöht und es werden die Prozesse zur Etablierung und/ oder zur Stabilisierung eines Gigaseals beeinflussbar, und zwar durch direkte und ggf. lokale Modifikation an oder in der Oberfläche, z.B. durch eine Materialimplantation in die Aperturwand, z.B. mittels eines Plasmas.
Die Kontrolle der Ladungsdichte an oder in der Pipettenwand oder Aperturwand 1 1 wird erfindungsgemäß durch die Modifikation und insbesondere durch Erhöhung der Konzentration einer materiellen oder Ionenspezies zumindest in einem Bereich 20 des Wandbereichs 1 1 des Aperturbereichs 10 bewirkt, so dass zumindest in der Messaperturwand 1 1 und dort lokal im Bereich 20 das Material 12" des Trägers 12 bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies eine modifizierte und insbesondere erhöhte Konzentration aufweist, und zwar verglichen mit der Konzentration der entsprechenden Spezies im Material 12' des Trägers 12 außerhalb des Bereichs 20 und somit außerhalb des Aperturbereichs 10 insbesondere verglichen mit der Konzentration im Inneren des Trägers 12 und/ oder des Trägers 12 im Mittel. Insbesondere im Zusammenwirken mit dem Anlegen bestimmter Spannungen an Mess- und Gegenelektrode 30, 50 werden erfindungsge- mäß die beschriebenen Wirkungen und Vorteile erreicht.
Diese betreffen insbesondere und unter anderem: die Verbesserung des Gigaseals hinsichtlich der zeitlichen Ausbildung und Höhe des Gigaseals, also des Abdichtwiderstands,
• die ortsaufgelöste Erhöhung der Konzentration, insbesondere von zweiwertigen Ionen oder von Protonen, und
die Verwendung für ein gerichtetes Adhärieren und für Wachstum von Zellen, und zwar jeweils für alle Varianten der Patch-Clamp-Technologie und Zellkultur.
Im Zusammenhang mit der Entwicklung eines APC-Systems für Zellnetzwerke ist diese Erfindung besonders vorteilhaft, da auf Gründ der Verwendung von nicht optimalen Materialien, die Ausbildung eines guten Gigaseals vermindert wird. Eine Verbesserung des Gigaseals bzw. Erhöhung der Gigasealwahrscheinlichkeit bietet einen grundlegenden Vorteil, wenn Zellen Patch-Pipetten z.B. von APC- Systemen über eine längere Zeit überwachsen. Die vorliegende Erfindung fußt unter anderem auch auf der Erkenntnis, dass zweiwertige Ionen und /oder Protonen eine konzentrationsabhängige Wirkung auf die zeitliche Ausbildung, die Höhe und die Stabilität des Gigaseals und auf den Abdichtwiderstand haben. Dies gilt situationsabhängig ggf. auch für andere implantierte Spezies, die erfindungsgemäß Anwendung finden können.
Gegenstand der Erfindung ist demnach unter anderem die gezielte und ggf. ortsaufgelöste oder lokale Modifikation oder Erhöhung der Konzentration von Ionen bzw. Protonen zumindest in oder an der Innenwand der Messapertur, um dadurch Prozesse zur Etablierung des Gigaseals positiv zu beeinflussen. Dies kann bei der Verwendung von herkömmlichen physiologischen Messpuffern nicht gewährleistet werden.
Die materielle Spezies und insbesondere die Ionen und/ oder Protonen können z.B. durch einen speziellen physikalischen Plasmaprozess an oder in die Oberfläche des Materials - Innenwand der Messapertur - implantiert werden. Denkbar ist auch die Implantierung eines Materials, das darauf folgend zweiwertige Ionen und/ oder Protonen an der Oberfläche konzentriert. Die Erfindung dient mithin unter anderem auch der Verbesserung der Materialeigenschaften der durch die Chiptechnologie bedingten Materialien - z.B. von Glas oder Silizium und deren Varianten - bezüglich der Ausbildung eines Gigaseals.
Die durch die Erfindung ermöglichte - insbesondere lokale - Konzentrationsände- rung und insbesondere -Steigerung z.B. von Ionen bzw. Protonen ist bisher nicht bekannt und äußert sich in einer Erhöhung der Gigasealwahrscheinlichkeit sowie in der Erhöhung der gemessenen Abdichtwiderstandswerte am Ort der Konzentrationsmodifikation also z.B. am Ort der Implantation sowie einer Steigerung der mechanischen Stabilität des Seals.
Die durch die Erfindung ermöglichte vergleichsweise hohe lokale Konzentrationsänderung und mithin ggf. die einhergehende lokale Ladungsdichte, sei diese negativ oder positiv, ist konventionell nicht zu erzielen. Die vorliegende Erfindung betrifft demzufolge eine elektrophysiologische Messanordnung 100 sowie ein elektrophysiologisches Messverfahren, bei welchen das abdichtende oder sealende Anlagern eines zu untersuchenden biologischen Objekts O an einen Träger 12 der Messanordnung 100 gesteuert und insbesondere gefördert werden kann, indem zumindest an oder in einem Bereich 20 eines Wandbereichs 1 1 , welcher eine Apertur 14 eines Aperturbereichs 10 bildet, ein Material 12" vorgesehen wird, welches dem Material 12' des Trägers außerhalb des Aperturbereichs 10 und insbesondere dem Material des Trägers 12 in dessen Inneren 12i oder in dessen räumlichen Mittel zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindes- tens einer materiellen oder Ionenspezies eine - ggf. lokal - erhöhte Konzentration aufweist, so dass durch diese - ggf. lokal - erhöhte Konzentration an oder in der Aperturinnenwand I i i der Apertur 14 das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts O am Aperturbereich 10 förderbar ist, um also über Wechselwirkung mit der Membran des zu untersuchenden biologischen Objekts O das ab- dichtende oder sealende Anlagern steuernd zu fördern. Dabei liegt die Tiefe oder Schichtdicke Δ, bis zu welchen die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies, gemessen von der Oberfläche oder Oberseite 12a des Trägers 12 aus, reicht, vorzugsweise im Bereich von etwa 10 nm. Nun wird im Detail auf die Zeichnungen Bezug genommen.
Fig. 1A zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100.
Ein grundlegendes Element dieser Ausführungsform ist der Träger 12, der auch als Basis 12 oder Substrat 12 bezeichnet werden kann. Dieser Träger 12 unterteilt ein während der Messung vorgesehenes Elektrolytbad 40, 60, 70 in mindestens zwei Kompartimente, wobei das erste Kompartiment 60 der Unterseite 12b des Trägers 12 oder Substrats 12 zugewandt ist und wobei das zweite Kompartiment 40 der Oberseite 12a des Trägers 12 oder Substrats 12 zugewandt ist.
In den Träger 12 ist der so genannte Aperturbereich 10 eingearbeitet. Dieser weist mindestens eine Apertur 14 auf, nämlich z.B. nach Art eines Durchgangslochs, welches den Träger 12 in seiner Dicken- oder Schichtstärkenrichtung, nämlich in der Richtung von der Oberseite 12a zur Unterseite 12b, lokal vollständig durchdringt. Im Bereich der Apertur 14 ist ebenfalls ein Teil 70 des Elektrolytbads 40, 60, 70 vorgesehen. Insgesamt gesehen besteht also zwischen der Oberseite 12a und der Unterseite 12b über die Apertur 14 des Aperturbereichs 10 eine fluidmechanische Verbindung und entsprechend über die gegebenenfalls vorgesehene Leitfähigkeit des Elektrolytbads, häufig handelt es sich dabei in der Anwendung um eine physiologische Lösung, auch eine elektrische Verbindung.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1A ist im oberseitigen Kompartiment 40 eine mit einer Leitung 51 angeschlossene Gegenelektrode 50 zu einer auf der Unterseite 12b des Trägers 12 vorgesehenen Messelektrode 30 angeordnet. Die Messelektrode 30 befindet sich also im unterseitigen Kompartiment 60 des Elektrolytbades 40, 60, 70 und ist mit einer Leitung 31 angeschlossen. Die Leitungen 5 1 und 31 zur Gegenelektrode 50 bzw. zur Messelektrode 30 sind an sich isoliert und führen zu einem entsprechenden Steuer- und Messkreis, der hier nicht dargestellt ist.
Das Substrat 12 oder der Träger 12 wird von einem Trägermaterial 12' gebildet, das zumindest im Inneren 12i oder im Bulk des Trägers 12 einer bestimmten Zusammensetzung entspricht. Zumindest am oder im Wandbereich 1 1 des Aperturbereichs 10 ist ein Bereich 20 vorgesehen, der mit oder aus einem Material 12" gebildet ist, welches dem Trägermaterial 12' außerhalb des Aperturbereichs 10 und mithin außerhalb des Bereichs 20 und insbesondere dem Material im Inneren 12i des Trägers oder dem Material des Trägers 12 im räumlichen Mittel zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies eine - ggf. lokal oder lateral lokal - modifizierte oder erhöhte Konzentration aufweist.
Das Vorsehen und Ausbilden eines solchen Bereichs 20 - der im Folgenden auch als konzentrationsmodifizierter Bereich 20 bezeichnet wird und in den Figuren durch gestrichelt umrandete und mit Punktierung gefüllt dargestellt ist - mit gegenüber dem sonstigen Trägermaterial 12' oder Substratmaterial 12' modifizierter Konzentration zur Förderung der abdichtenden oder sealenden Anlagerung eines zu untersuchenden biologischen Objekts O an die Apertur 14 und zur Steigerung des Rest- oder Abdichtwiderstands ist ein Kernaspekt der vorliegenden Erfindung,
Ein zusätzlicher oder alternativer Kernaspekt der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm von der Oberseite 12a oder Oberfläche des Trägers 12 und insbesondere von der Aperturinnenwand I ii her oder aus modifiziert sein kann. Die erfindungsgemäßen Aspekte der lateralen Lokalität - z.B. auf den Aperturbereich 10 oder aus einen Bereich 20 des Aperturbereichs 10 - und der Tiefe Δ von etwa 10 nm in Bezug auf die Konzentrationsmodifikation können getrennt oder gemeinsam realisiert sein oder werden. Der Wandbereich 1 1 als solcher bildet bei der Ausführungsform der Fig. 1A und 1 B eine nach Art einer inneren Mantelfläche verlaufende geschlossene Wand mit einer Innenseite l Oi, I ii oder Innenwand l Oi, I ii und einer Außenseite 10a, I Ia oder Außenwand 10a, I I a. Auf diese Art und Weise wird eine Apertur 14 des Aperturbereichs 10 der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanord- nung 100 gebildet, wobei die Innenseite oder die Innenwand 10i, l li des Wandbereichs 1 1 der Apertur 14 zugewandt, die Außenwand oder Außenseite 10a, I Ia des Wandbereichs 1 1 dagegen der Apertur 14 abgewandt, jedoch dem Kompartiment 40 des Elektrolytbades 40, 60, 70 zugewandt ist. Bei der Ausführungsform der Fig. 1A erhebt sich der Wandbereich 1 1 ausschließlich oberhalb der Oberseite 12a des Trägers oder Substrats 12. Auf der Unterseite 12b des Substrats oder Trägers 12 ist der Aperturbereich 10 quasi planar ausgebildet. Eine derartige Struktur ist jedoch nicht zwingend und die Fig. 3 bis 7 zei- gen diesbezüglich abgewandelte Ausführungsformen, die später im Detail beschrieben werden.
Wie oben erwähnt wurde, ist der Wandbereich 1 1 , welcher die Apertur 14 bildet, nach Art einer Mantelfläche eines geometrischen Körpers ausgebildet. Gemäß Fig. 1 B kann in Zusammenschau mit der Fig. 1A diese Mantelfläche von einem senkrechten Kreiszylinder als Grundform stammen.
In Fig. 1A und 1 B sind der Wandbereich 1 1 oder die Aperturwand 1 1 hinsichtlich der Konzentration nicht vollständig modifiziert ausgebildet. Der konzentrations- modifizierte Bereich 20 und die Aperturwand 1 1 oder der Wandbereich 1 1 fallen bei dieser Ausführungsform nicht vollständig zusammen. Vielmehr erstrecken sich die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies und also der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 nur bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm, und zwar von der Innenwand I ii der Aperturwand 1 1 aus betrachtet.
Weitere Alternativen werden im Zusammenhang mit den Fig. 2A bis 2D unten beschrieben.
Die Ausbildung als Mantelfläche eines senkrechten Kreiszylinders als grundlegender Form ist nicht zwingend. Die Fig. I C und 1 D zeigen anstelle einer Zylinderform in schematischer Draufsicht als Grundfläche ein Quadrat, so dass sich räumlich ein senkrechtes quadratisches Prisma ergibt bzw. ein Prisma mit einer Grundfläche nach Art eines Ovals, quasi eines Quadrats oder Rechtecks mit abgerundeten Ecken, wie dies in Fig. 1 D dargestellt ist. Auch hier erstrecken sich die Konzentrationsmodifikation der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies und also der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 nur bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm, und zwar wieder von der Innenwand I i i der Aperturwand 1 1 aus be- trachtet.
Es sind grundsätzlich beliebige Grundflächenformen denkbar. Jedoch bieten sich auf Grund der oben beschriebenen Umstände, bei welchen Oberflächenrauhigkeiten und scharfe Kanten vermieden werden sollten, gerade Formen mit abgerunde- ten Strukturen an, also zum Beispiel die Ausgestaltung gemäß der Fig. 1B, welche als geometrische Grundform einen senkrechten Kreiszylinder besitzt.
Bei der Ausführungsform der Fig. IE sind die laterale Lokalität des konzentrati- onsmodifizierten Bereichs 20 und damit Beschränkung auf den Aperturbereich 10 und insbesondere auf die Aperturwand 1 1 aufgehoben. Vielmehr sind hier die gesamte Oberseite 12a des Trägers 12 und die Aperturinnenwand I ii bis zu einer Tiefe Δ von etwa 10 nm in ihrer Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies konzentrationsmodifiziert.
Die Fig. 3 und 4 zeigen analog zu Fig. 1A und ebenfalls in schematischer und geschnittener Seitenansicht andere Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Messanordnung, bei welchen ein Unterschied dahingehend besteht, dass nämlich gemäß der Fig. 3 der Wandbereich 1 1 für die Apertur 14 bündig mit der Oberseite 12a des Substrats 12 abschließt und ausschließlich über die Unterseite 12b des Substrats 12 hinaus hervorsteht, so dass insgesamt eine Art Einstülpung von der Oberseite 12a nach innen zum Kompartiment 60 für die Apertur 14 entsteht.
Bei der Fig. 4 erhebt sich ein Teil des Wandbereichs 1 1 der Apertur 14 von der Oberseite 12a des Substrats 12 aus in das Kompartiment 40, andererseits jedoch auch ein Teil des Wandbereichs 1 1 von der Unterseite 12b des Substrats 12 aus in das Kompartiment 60 hinein.
Die Höhen über der Oberseite 12a und über der Unterseite 12b, um welche sich der Wandbereich 1 1 für die Apertur 14 jeweils erhebt, können identisch sein. Dies ist aber nicht zwingend. In Fig. 4 sind sie unterschiedlich gestaltet.
Bei den Ausführungsformen der Fig. 1A sowie 3 und 4 ist der Querschnitt oder Durchmesser entlang der Erstreckungsrichtung des Wandbereichs 1 1 senkrecht zur Oberseite 12a bzw. senkrecht zur Unterseite 12b des Substrats 12 konstant in seinem Verlauf.
Alternativ können sich verjüngende oder erweiternde Querschnittsverläufe vorgesehen werden. Dies ist in der Abfolge der Fig. 5 bis 7 dargestellt, wobei die Fig. 5 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Messanordnung zeigt, welche der Ausführungsform der Fig. 1 entspricht, jedoch mit einem Querschnittsverlauf für die Apertur 14, der sich mit zunehmendem Abstand von der Oberseite 12a verengt. Bei der Ausführungsform der Fig. 6 ist dagegen analog dazu und im Vergleich zur Ausführungsform der Fig. 3 die Apertur 14 so ausgebildet, dass sich der Querschnittsverlauf mit Abstand von der Unterseite 12b des Substrats 12 verjüngt. In Kombination der Ausführungsformen der Fig. 5 und 6 und in analoger Sichtweise zur Ausführungsform der Fig. 4 zeigt die Fig. 7 eine Apertur 14, bei welcher auf der Höhe des Substrats 12 der Durchmesser der Apertur 14 maximal ist und sich mit zunehmendem Abstand sowohl von der Oberseite 12a des Substrats 12 als auch von der Unterseite 12b des Substrats 12 aus verjüngt.
Gemäß der Ausführungsform der Fig. 1A ist die Messelektrode 30 mit dem An- schluss oder Leitung 31 stark benachbart und teilweise in den Aperturbereich 10 mit der Apertur 14 eingeführt ausgebildet. Die Position der Messelektrode 30 kann variiert sein, sie kann zum Beispiel stärker in den Elektrolytbereich 70 in der Apertur 14 hineingeführt sein oder weiter davon entfernt werden.
Fig. 8 zeigt in schematischer und geschnittener Seitenansicht eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100, bei wel- eher der Aperturbereich 10 von einem Wandbereich 1 1 gebildet, welcher insgesamt nach Art einer Patchpipette ausgebildet ist.
Auch hier liegen ein Innenwandbereich l Oi, I ii, welcher der Apertur 14 zugewandt ist, sowie ein Außenwandbereich 10a, I Ia vor, wobei der Außenwandbe- reich 10a, I Ia in der Anwendung einem außen liegenden Elektrolytkompartiment 40 des Bades 40, 60, 70 zugewandt ist und wobei der Innenwandbereich l Oi, I ii dem in der Apertur 14 vorgesehenen Elektrolytkompartiment 70 des Bades 40, 60, 70 zugewandt ist. Am äußersten Bereich ist der die Apertur 14 bildende Wandbereich 1 1 ausgebildet, welcher den modifizierten Bereich 20 mit dem Material 12" mit der modifizierten oder erhöhten Konzentration an der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies trägt somit die abdichtende oder sealende Anlagerung eines zu untersuchenden biologischen Objekts O unterstützen kann.
Die Fig. 2A bis 2D zeigen in größerem Detail den Ausschnitt X aus der Fig. 1A und verschiedene Abwandlungen hinsichtlich der Ausgestaltung des modifizierten Bereichs 20 mit dem Material 12" mit der modifizierten oder erhöhten Konzentration an der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies.
Bei der Fig. 2A erstreckt sich der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 mit dem konzentrationsmodifizierten Material 12" über den gesamten obersten Abschnitt des Wandbereichs 1 1 , die Konzentrationsänderung betrifft dort eine Schicht bis zur Tiefe Δ von etwa 10 nm und dabei die Innenwand I ii der Aperturwand 1 1 und deren Außenwand I I a. Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2B liegt die Konzentrationsmodifikation mit der Schichttiefe Δ nur bis zu einem bestimmten Abstand oder Höhe δ von der Oberkante l lo oder vom oberen Rand l l o der Aperturwand 1 1 vor. Bei der Fig. 2C sind nur der oberste Bereich der Innenseite l Oi, I ii und der oberste Abschnitt bis zur Schichttiefe Δ betroffen und in der Konzentration modifiziert.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 2D ist dagegen nur die Innenseite lOi, I ii bis zur Schichttiefe Δ betroffen und in der Konzentration modifiziert.
Die Fig. 9A bis 9E zeigen in schematischer und geschnittener Seitenansicht verschiedene Messprinzipien, die bei der erfindungsgemäßen elektrophysiologischen Messanordnung 100 und dem entsprechenden erfindungsgemäßen elektrophysio- logischen Messverfahren zum Tragen kommen können.
Ausgehend von der in Fig. 9A dargestellten Situation, bei welcher durch ein leichtes Ansaugen des Elektrolytbades 40, 60, 70 durch die Messapertur 14, also mit einem Sog vom Kompartiment 40 über das Kompartiment 70 in der Apertur 14 zum Kompartiment 60 hin, wird ein biologisches Objekt O, in diesem Fall zum Beispiel eine Zelle, angesaugt und an die Apertur 14 angenähert.
Der Mechanismus des Annäherns kann auch auf eine andere manipulative Art und Weise erfolgen, zum Beispiel mittels einer separaten Pipette, einer Laserpin- zette oder dergleichen.
Über einen leichten Unterdruck wird gemäß Fig. 9B die Zelle ohne jegliche Zerstörung und komplett an die Messapertur 14 angelagert. Wird in diesem Zustand eine Messung durchgeführt, so spricht man vom so genannten Cell-Attached- Modus.
Durch einen mechanischen Zug kann, ausgehend von der in Fig. 9B beschriebenen Situation ein Membranfleck aus der Membran des biologischen Objekts O herausgerissen werden, so dass gemäß Fig. 9C der herausgerissene Membran- fleck, ein so genannter Patch, im abgedichteten oder gesealten Zustand in der Messapertur 14 verbleibt und das eigentlich Messobjekt O bildet. Dabei zeigt durch das Herausreißen die vorher im Inneren angeordnete Seite des Membranflecks nach außen, also zum Kompartiment 40 hin. Aus diesem Grund heißt dieser Messmodus auch Inside-Out-Modus. Andererseits kann, ausgehend von der in Fig. 9B dargestellten Situation durch einen erneuten Unterdruck, nämlich z.B. nach Art eines Druckstoßes die Zelle O insgesamt geöffnet werden, so dass ein Übergang stattfindet vom so genannten Cell-Attached-Modus zum Whole-Cell-Modus gemäß Fig. 9D, bei dem die Messelektrode 30 direkten Zugriff auf das gesamte Zellinnere hat. Das heißt, das Zellinnere ist zu den Kompartimenten 70 und 60 hin geöffnet, gegenüber dem Kom- partiment 40 jedoch im Wesentlichen isoliert. Von der Situation gemäß der Fig. 9D, nämlich dem Whole-Cell-Modus kann durch mechanischen Zug erreicht werden, dass wiederum ein Membranfragment aus der Membran des biologischen Objekts herausgerissen wird. Da vorher der Whole- Cell-Modus vorlag, besteht eine gewisse Wahrscheinlichkeit dafür, dass dabei der herausgerissene Membranfleck derart in der Messapertur 14 verbleibt, dass er als eigentliches Messobjekt O dienen kann und dabei gemäß Fig. 9E die Außenseite der Zellmembran oder der Membran des biologischen Objekts auch außen verbleibt. In diesem Fall spricht man vom Outside-Out-Modus der Messanordnung 100. Fig. 10 zeigt im Detail die geometrische Situation, die bei einem abgedichteten oder sealenden Anlagern eines zu vermessenen biologischen Objekts O zwischen dessen Membran M und der Messapertur 14 und insbesondere der Innenwand l Oi, I ii des Wandbereichs 1 1 vorliegt. Der vorderste Abschnitt des Wandbereich 1 1 wird vom konzentrationsmodifizierten Bereich 20 mit oder aus dem Material 12" mit modifizierter Konzentration gebildet.
Bei der Fig. 10 handelt es sich erneut um einen Whole-Cell-Modus, bei welchem die gesamte Zelle O mit ihrem Inneren zur Messelektrode 30 und zu den Elektro- lytkompartimenten 60 und 70 hin geöffnet ist. Diese Ausführungsform der erfin- dungsgemäßen elektrophysiolgischen Messanordnung 100 ist hier nach Art einer Patchpipette ausgestaltet.
Erfindungsgemäß wird der Abdichtwiderstand zwischen der Zellmembran M des zu vermessenden biologischen Objekts O und der Innenwand lOi, I ii des Wand- bereichs 1 1 der Messapertur 14 dadurch verbessert, dass der konzentrationsmo- difizierte Bereich 20 mit oder aus dem Material 12" mit modifizierter Konzentration vorgesehen ist und in Wechselwirkung tritt mit der Außenseite Zellmembran M des biologischen Objekts O. Erfindungsgemäß ist es somit durch Wahl der Modifikation der Konzentration im konzentrationsmodifizierten Bereich 20 nach Art und Stärke möglich, den verschiedenen Situationen an unterschiedlichen Oberflächen von Membranen M, seien dies Zellmembran, Membranen von Organellen oder Membranen von künstli- chen Objekten, Rechnung zu tragen. Dies war bisher so nicht möglich und bietet eine Möglichkeit, ein Anlagern und einen Seal gesteuert zu fördern bzw. , ist ein Seal erst einmal hergestellt, zu stabilisieren.
Bei der Ausführungsform gemäß Fig. 1 1 ist das Substrat quasi von einer Schicht von Zellen O' belegt. Über die mechanische und / oder elektrische Wechselwirkung unter Einsatz des erfindungsgemäß in der Aperturwand 1 1 vorgesehenen konzentrationsmodifizierten Bereich 20 mit oder aus dem Material 12" mit modifizierter Konzentration ist eine einzelne Zelle O des Ensembles von Zellen O' als Messobjekt im Whole-Cell-Modus analog zur Situation gemäß Fig. 9D bei verbesserter abdichtender oder sealender Anlagerung einer elektrophysiologischen Messung zugänglich.
Fig. 12 zeigt eine Anordnung der erfindungsgemäßen Messanordnung 100, bei der der eine Apertur 14 bildende Wandbereich 1 1 von einem Rand oder Randbereich gebildet wird, so dass die Apertur 14 quasi als planares Loch in dem zu Grunde liegenden Substrat 12 ausgebildet ist und dabei der konzentrationsmodifizierte Bereich 20 mit oder aus dem Material 12" den Randbereich mit einer entsprechend abgewandelten Konzentration mindestens einer materiellen oder Ionenspezies bildet, um das Anlagern zu fördern und den Abdichtwiderstand zu steigern.
Bezugszeichenliste
10 Aperturbereich
10a Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite des Aperturbereichs 10 l Oi Innenwand, Innenwandbereich, Innenseite des Aperturbereichs 10
1 1 Wandbereich, Wand, Aperturwand
I I a Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite des Wandbereichs 1 1
I ii Innenwand, Aperturinnenwand, Innenwandbereich, Innenseite des Wandbereichs 1 1
l l o oberer Rand/ Oberkante Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite der Aperturwand 1 1
l lu unterer Rand/ Unterkante Außenwand, Außenwandbereich, Außenseite der Aperturwand 1 1
12 Substrat, Träger, Basis, Grundsubstrat
12' Trägermaterial oder Substratmaterial (mit normaler Konzentration)
12" Material, Trägermaterial oder Substratmaterial mit modifizierter, insbesondere erhöhter Konzentration einer materiellen oder Ionenspezies
12a Oberseite, Vorderseite
12b Unterseite, Rückseite
12i Inneres oder innerer Bereich des Trägers 12, Bulk des Trägers 12
14 Apertur, Messapertur
20 Bereich mit modifizierter, insbesondere erhöhter Konzentration; konzentra- tionsmodifizierter Bereich
30 Messelektrode, Messelektrodenanordnung
31 Messleitung, Leitung
40 Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad
50 Gegenelektrode, Gegenelektrodenanordnung
5 1 Leitung
40 Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad zur Oberseite 12a des Trägers 12 60 Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad zur Rückseite 12b des Trägers 12 70 Elektrolytkompartiment, Elektrolytbad im Lumen der Apertur 14
100 elektrophysiologische Messanordnung
M Membran des biologischen Objekts O
O biologisches Objekt, Zelle, Liposom, Vesikel, Mizelle, Oozyt, Messobjekt
O' biologisches Objekt, Zelle, Liposom, Vesikel, Mizelle, Oozyt δ Höhe des konzentrationsmodifizierten Bereichs 20 in der Aperturwand 1 1 Δ Tiefe oder Schichtstärke des konzentrationsmodifizierten Bereichs 20

Claims

Patentansprüche
1. Elektrophysiologische Messanordnung ( 100),
mit einem Träger ( 12), welcher zumindest in seinem Inneren ( 12i) aus einem Trägermaterial ( 12') mit einer gegebenen Zusammensetzung besteht, und
mit einem Aperturbereich ( 10) im Bereich des Trägers ( 12) zum gesteuerten abdichtenden Anlagern eines biologischen Objekts (O),
wobei der Aperturbereich ( 10) mit mindestens einer Apertur ( 14) sowie mit einem Wandbereich ( 1 1 ) ausgebildet ist, welcher als Aperturinnenwand ( I ii) die Apertur ( 14) bildend umgibt,
wobei zumindest der Wandbereich ( 1 1 ) mit einem Bereich (20) aus einem Material ( 12") ausgebildet ist, welches dem Material des Trägers ( 12) außerhalb des Aperturbereichs ( 10), insbesondere im Mittel des Trägers ( 12) oder im Inneren ( 12i) des Trägers ( 12), zumindest in seiner Zusammensetzung im Wesentlichen entspricht, gegenüber diesem jedoch hinsichtlich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies eine erhöhte Konzentration aufweist,
so dass durch diese erhöhte Konzentration an oder in zumindest der
Aperturinnenwand ( I ii) der Apertur ( 14) das abdichtende Anlagern eines biologischen Objekts (O) am Aperturbereich ( 10) förderbar ist, und
wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies bis zu einer vorgegebenen Tiefe von der Oberseite ( 12a) und/ oder Oberfläche des Trägers ( 12) und insbesondere von der Aperturinnenwand ( I ii) her modifiziert ist, insbesondere bis zu einer Tiefe von etwa 10 nm.
2. Messanordnung ( 100) nach Anspruch 1 ,
wobei die mindestens eine materielle oder Ionenspezies aus der Gruppe ausgewählt ist, die Protonen (H+), Halogenidionen, insbesondere Fluoridionen (F ), zweifach geladene Ionen, insbesondere zweifach geladene Metallkationen, vorzugsweise Be2+, Sr2+, Ca2+ und Mg2+ aufweist.
3. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
wobei die Erhöhung der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies räumlich lokal auf den Bereich (20) des Wandbereichs ( 1 1 ) derart beschränkt ist,
dass das Material des Trägers ( 12) zumindest in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs ( 10) keine erhöhte Konzentration der mindestens einen mate- riehen oder Ionenspezies aufweist.
4. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies mittels einer Implantation erhöht ausgebildet ist, insbesondere vermittelt über einen Plasmaprozess, über einen Sputterprozess oder über einen Ionen- strahlprozess.
5. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei welcher der Aperturbereich ( 10) im Bereich des Trägers ( 12), der eine Oberseite ( 12a) und eine Unterseite ( 12b) aufweist, ausgebildet ist und
bei welcher ein jeweiliger eine Apertur ( 14) bildender Wandbereich ( 1 1 ) in Bezug auf die Oberseite ( 12a) und / oder in Bezug auf die Unterseite ( 12b) des Trägers ( 12) teilweise oder vollständig hervorsteht.
6. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei welcher ein eine Apertur ( 14) bildender Wandbereich ( 1 1 ) nach Art einer Mantelfläche oder als Kombination von Mantelflächen ausgebildet ist, insbesondere jeweils auf der Grundlage eines Mantels eines Zylinders, eines Prismas, eines Kegelstumpfs und/ oder eines Pyramidenstumpfs.
7. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei welcher ein eine Apertur ( 14) bildender Wandbereich ( 1 1 ) mit oder aus einem Material aus der Gruppe von Materialien ausgebildet ist, welche Glas, Quarzglas, Silizium, Kohlenstoff und deren Kombinationen und Derivate aufweist.
8. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei welcher der Durchmesser der Apertur ( 14) und insbesondere der Innendurchmesser des die Apertur ( 14) bildenden Wandbereichs ( 1 1 ) einen Wert im Bereich von etwa 1 μν bis etwa 50 μτη aufweist und/ oder
bei welcher der eine Apertur ( 14) bildende Wandbereich ( 1 1 ) über der Oberseite ( 12a) oder der Unterseite ( 12b) des Trägers ( 12) eine Höhe oder Tiefe im Be- reich von etwa 0 μπι bis etwa 20 μχη aufweist.
9. Messanordnung ( 100) nach einem der vorangehenden Ansprüche,
bei welcher eine Messelektrode (30) im Bereich ( 70) oder innerhalb der Apertur ( 14) oder in einem Bereich (60) auf der Unterseite ( 12b) des Trägers ( 12) vorgesehen ist und
bei welcher eine Gegenelektrode (50) außerhalb der Apertur ( 14) und im Bereich (40) auf der Oberseite ( 12a) des Trägers ( 12) vorgesehen ist.
10. Elektrophysiologisches Messverfahren, insbesondere unter Verwendung einer elektrophysiologischen Messanordnung ( 100) nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
bei welchem zum Steuern des abdichtenden Anlagerns eines zu vermessen- den biologischen Objekts (O) an einer Apertur ( 14) eines Aperturbereichs ( 10) zumindest ein Bereich (20) eines die Innenwand ( I ii) eines die Apertur ( 14) bildenden Wandbereichs ( 1 1 ) bezüglich mindestens einer materiellen oder Ionenspezies gesteuert mit einer entsprechend geeigneten und gegenüber der Konzentration der mindestens einen materiellen oder Ionenspezies im Träger ( 12) in einem Bereich außerhalb des Aperturbereichs ( 10) erhöhten Konzentration ausgebildet ist oder wird.
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