EP2904098A1 - PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME D'UNE SOUCHE D'ASPERGILLUS JAPONICUS& xA; - Google Patents

PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME D'UNE SOUCHE D'ASPERGILLUS JAPONICUS& xA;

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EP2904098A1
EP2904098A1 EP13792749.7A EP13792749A EP2904098A1 EP 2904098 A1 EP2904098 A1 EP 2904098A1 EP 13792749 A EP13792749 A EP 13792749A EP 2904098 A1 EP2904098 A1 EP 2904098A1
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EP
European Patent Office
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secretome
strain
reesei
cncm
preparation according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP13792749.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Guy BERRIN
David Navarro
Nicolas Lopes-Ferreira
Antoine Margeot
Pedro Coutinho
Bernard Henrissat
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Original Assignee
Aix Marseille Universite
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
IFP Energies Nouvelles IFPEN
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
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Publication date
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Definitions

  • the present invention relates to improving the saccharification of lignocellulosic biomass.
  • Lignocellulose is a major constituent of plant biomass, and is of great interest as a raw material for the production of various chemicals, including simple fermentable sugars resulting from hydrolysis (commonly referred to as saccharification). its polysaccharide constituents.
  • saccharification simple fermentable sugars resulting from hydrolysis
  • the main saccharification product of lignocellulosic biomass is glucose, which can be converted by ethanol fermentation into ethanol for use as a biofuel.
  • Lignocellulose consists mainly of three types of polymers, in varying proportions depending on the plant species: cellulose, hemicellulose, and lignin. These constituents are interconnected by different types of bonds, covalent and non-covalent.
  • Cellulose represents up to 45% of the dry weight of lignocellulose. It is composed of linear chains of D-glucose units linked by ⁇ -1,4-glucosidic bonds, these chains being linked together by hydrogen bonds or van der Waals forces.
  • Hemicelluloses are heteropolymers representing 15 to 35% of the plant biomass, and containing pentoses ( ⁇ -D-xylose, ⁇ -L-arabinose), hexoses ( ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-glucose, ⁇ - D-galactose) and uronic acids.
  • pentoses ⁇ -D-xylose, ⁇ -L-arabinose
  • hexoses ⁇ -D-mannose, ⁇ -D-glucose, ⁇ - D-galactose
  • uronic acids uronic acids
  • Lignin is a complex heteropolymer consisting of phenylpropane units linked together by different types of bonds. Lignin is bound to both hemicellulose and cellulose, coating them in a complex three-dimensional structure that makes them difficult to hydrolyze.
  • lignocellulose Today, the path considered the most promising for the saccharification of lignocellulose is enzymatic hydrolysis, using enzymes produced by cellulolytic microorganisms, in particular filamentous fungi.
  • This hydrolysis is preceded by a pretreatment of the biomass, the purpose of which is to reduce the complexity of the lignocellulosic network, in particular by solubilizing lignin and / or hemicellulose, by decreasing the crystallinity of the cellulose or by increasing its accessible surface area.
  • This pretreatment can be carried out by various techniques, such as mechanical grinding, thermolysis, treatment with a dilute acid, a base, or a peroxide, steam explosion, etc. (For review Hendriks AT, Zeeman G, Pretreatments to Enhance the Digestibility of Lignocellulosic Biomass, Bioresource Technology 2009 - 1: 10-8.).
  • the filamentous fungus currently the most used as a source of cellulolytic enzymes is the ascomycete Trichoderma reesei.
  • Its secretome (that is to say all the enzymes excreted by the fungus in the culture medium) contains mainly three types of enzymes, the complementary activity of which allows the hydrolysis of cellulose to glucose: endoglucanases (EG, EC 3.2.1.4); exoglucanases, including in particular cellobiohydrolases I and II (CBH, EC 3.2.1.91); ⁇ -glucosidases (BGL, EC 3.2.1.21).
  • the entire secretome is generally used as an enzymatic cocktail.
  • the saccharification is carried out by simple contact of the lignocellulosic material pretreated with this enzymatic cocktail, and incubation under optimal temperature and pH conditions for the enzymes concerned for a variable duration depending on the nature of the lignocellulosic material concerned and the amount of enzymes used.
  • Trichoderma reesei The main interest of Trichoderma reesei lies in its ability to secrete very large quantities of enzymes.
  • Strains of T. reesei hypersecreting lignocellulolytic enzymes have been produced by mutagenesis, and their secretome is currently used for the saccharification of lignocellulose.
  • T. reesei (Martinez et al., Nat Biotechnol 26, 553-60, 2008) have shown that it actually has a number of deficiencies, particularly in the number and the diversity of genes encoding cellulases, hemicellulases and pectinases, which were lower than those reported for other filamentous fungi.
  • PCT WO / 99/46362 by modifying the signal peptide to increase the amount of secreted ⁇ -glucosidase (PCT WO / 99/46362), or by mutation of the ⁇ -glucosidase gene to produce a more active protein (PCT WO / 2010/029259).
  • Another proposed approach consists of looking for other cellulolytic fungi, whose secretome contains enzymatic activities capable of complementing those which appear to be insufficient in T. reesei, and to make it possible to obtain a more efficient saccharification.
  • the inventors have identified a strain of Aspergillus japonicus that meets these criteria, and in particular, when its secretome is used in combination with that of ⁇ . reesei, to increase significantly the production of glucose in particular from a pretreated biomass, compared to the secretome of T. reesei used alone.
  • CIRM-BRF 405 This strain, called CIRM-BRF 405, was deposited according to the Treaty of Budapest on June 6, 2012, at the CNCM (National Collection of Cultures of Microorganisms), 25 rue du Dondel Roux, Paris, under number CNCM 1 -4639.
  • the subject of the present invention is therefore the use of the CNCM 1-4639 strain for obtaining a multi-enzyme preparation containing cellulases and hemicellulases.
  • the subject of the present invention is a multi-enzyme preparation containing cellulases and hemicellulases, characterized in that it contains the secretome of Aspergillus japonicus strain CNCM 1-4639.
  • said secretome is likely to be obtained from a culture of the strain CNCM 1-4639 carried out in the presence of a carbon source inducing the production of lignocellulolytic enzymes, containing arabinoxylans.
  • Preferred inductive carbon sources are selected from cereal brans, and / or their autoclaved or non-autoclaved fractions.
  • cereal brans For example, it is possible to use corn bran, wheat, barley, etc., or a mixture of bran of different cereals and / or their fractions.
  • such an inductive carbon source contains between 14 and 18% by weight of arabinose, between 26 and 30% by weight of xylose, between 0 and 1% by weight of mannose, between 5 and 6% by weight of galactose, between 20 and 24% by weight of glucose, and optionally between 2 and 4% by weight of ferulic acid.
  • the other constituents of the culture medium are the usual constituents of the media for the cultivation of Aspergillus japonicus, which are known in themselves to those skilled in the art. Conventionally, these constituents comprise in addition to the carbon source, a nitrogen source, mineral salts, trace elements, vitamins, and generally, yeast extract.
  • the secretome of the CNCM 1-4639 strain can be obtained from a culture of this strain by simple separation of the cells and the culture supernatant, which contains the secreted proteins. This supernatant can be used as it is, or after simple filtration to rid it of cellular debris. However, generally, it will be preferable to concentrate it for example by diafiltration.
  • the proteins constituting the secretome may also be recovered by ammonium sulfate precipitation.
  • the secretome of the CNCM 1-4639 strain can be used for the saccharification of the lignocellulosic biomass, and in particular in combination with the secretome of a T. reesei strain.
  • a multienzymatic preparation according to the invention, it contains the secretome of the CNCM 1-4639 strain mixed with the secretome of a T. reesei strain.
  • Said strain of T. reesei may for example be a hypersecretory strain of lignocellulolytic enzymes such as one of the aforementioned MCG77, MCG 80, RUT C30 and CL847 strains. It may also be a recombinant strain such as those described in PCT Applications WO / 92/010581, PCT WO / 99/46362 or PCT WO / 2010/029259.
  • T. reesei secretome Methods of producing T. reesei secretome are well known in themselves to those skilled in the art. By way of example, mention may be made of the process described in Application FR 2 555 603.
  • the secretome of the CNCM 1-4639 strain can be mixed with that of a T. reesei strain in proportions (by weight): CNCM I-4639 secretory proteins / T. reesei secretome proteins ranging from 25 / 75 to 5/95
  • these proportions will be from 10/90 to 5/95.
  • the subject of the present invention is also a method for producing fermentable sugars, in particular glucose, from a lignocellulosic substrate, characterized in that it comprises the hydrolysis of said substrate with the aid of a multienzymatic preparation according to the invention, advantageously with the aid of a preparation containing the secretome of the CNCM 1-4639 strain mixed with the secretome of a T. reesei strain.
  • the lignocellulosic substrate can be derived from any material rich in lignocellulose, for example farm residues such as cereal straws, wood harvesting residues, materials from dedicated crops such as miscanthus and poplar, residues from the pulp and paper industry or any other cellulosic and lignocellulosic material processing industry.
  • this material Prior to hydrolysis, this material is pretreated, as described above, to obtain the lignocellulosic substrate on which the hydrolysis will be carried out.
  • the pretreatment is carried out in a manner known per se to those skilled in the art, for example according to one of the methods indicated above.
  • a particularly preferred pretreatment method is the steam explosion under acidic conditions.
  • the conditions of this pretreatment are conventional conditions, known in themselves to those skilled in the art.
  • the enzymatic hydrolysis will generally be carried out at a temperature of 30 ° C to 50 ° C, preferably between 37 and 45 ° C, and at a pH generally between 4.5 and 5.5.
  • the reaction mixture contains from 1 to 20% by weight of lignocellulosic substrate solids, and the enzyme preparation according to the invention is used in a proportion of 5 to 30 mg per gram of substrate (by weight of dry matter).
  • the duration of the enzymatic hydrolysis may vary in particular according to the nature of the substrate and the amount of enzyme preparation used, and the temperature at which the reaction is carried out. It is generally from 24 to 120h, preferably 72h to 96h.
  • the monitoring of the hydrolysis can be carried out by assaying the reducing sugars released and glucose and xylose simple sugars.
  • the simple sugars obtained by the process according to the invention can be recovered from the hydrolyzate for later use.
  • the hydrolyzate can be used directly for the production of alcohol, especially ethanol, by fermentation in the presence of an alcoholic microorganism.
  • the subject of the present invention is therefore also a process for producing alcohol, in particular ethanol, characterized in that it comprises the production, in accordance with the invention, of a hydrolyzate containing fermentable sugars from a lignocellulosic substrate, and the alcoholic fermentation of this hydrolyzate by an alcoholic microorganism.
  • the alcoholic fermentation can be carried out, following enzymatic hydrolysis, under standard conditions well known to those skilled in the art.
  • an alcoholic microorganism such as the yeast Saccharomyces cerevisiae or the bacterium Zymomonas mobilis is used, and the fermentation is carried out at a temperature preferably between 30 and 35 ° C.
  • the alcoholic fermentation can be carried out simultaneously with the enzymatic hydrolysis, according to a simultaneous saccharification and fermentation process known as the SSF method.
  • the operating conditions used in this case for enzymatic hydrolysis and alcoholic fermentation differ mainly from those indicated above by the temperature and the duration of the reaction.
  • the temperature is generally 28 to 40 ° C, and the reaction time is generally 50 h to 300 h.
  • CIRM-CF International Center for Microbial Resources
  • the strains are maintained in malted agar culture in slanted tubes, using MA2 medium (2% w / v malt extract) for basidiomycetes, and MYA2 medium (2% w / v malt extract and yeast at 0.1% w / v) for ascomycetes and zygomycetes.
  • the strains were cultured in baffled 16-well plates, in a liquid medium containing 15 g / l (based on the dry matter) of autoclaved corn bran fraction (supplied by ARD, Pomacle, France) as a carbon source. inducer of production of cellulolytic enzymes, 2.5 g / l of maltose for starting the culture, 1. 842 g / l of diammonium tartrate as nitrogen source, 0.5 g / 1 yeast extract, 0.2 g / l KH 2 PO 4 , 0.0132 g / l CaCl 2 .2H 2 O and 0.5 g / l MgSO 4 .7H 2 O.
  • the cultures were inoculated with 2 ⁇ 10 5 spores / ml for the sporulating fungi, or with mycelial fragments obtained by grinding for 40 s with a Fastprep®-24 (MP Biomedicals) set at 5 m / s for the non-fungi. -sporulants. They were then incubated at 30 ° C. with orbital shaking at 140 rpm (Infors HT, Switzerland) for 7 days for ascomycetes and 10 days for basidiomycetes.
  • the culture medium was harvested, filtered through a pore-size 0.2 ⁇ polyethersulfone membrane (Vivaspin®, Sartorius), and then concentrated by diafiltration on a polyethersulfone membrane with a cut-off threshold of 10 kDa (Vivaspin®, Sartorius). in a 50 mM acetate buffer, pH 5, to a final volume of 3 ml and stored at -20 ° C until use.
  • T. reesei strain CL847 also hereinafter referred to as enzymatic cocktail E508
  • IFPEN Rueil-Malmaison, France
  • the particles of micronized wheat straw have an average diameter of 100 ⁇ . These particles were suspended at 1% (w / v) in 50 mM of acetate buffer, pH 5, supplemented with 40 ⁇ g / ml of tetracycline, and 30 g / ml of cycloheximide. The suspension was distributed in 96-well plates, which were stored at -20 ° C until use.
  • the saccharification measurements were carried out according to the method described by Navarro et al. (Navarro et al., Microbial Cell Factories, 9:58, 2010), using a TECAN GENESIS EVO 200 robot (Tecan).
  • each concentrated secretome 15 ⁇ l of each concentrated secretome (5 to 30 ⁇ g of total protein) were added to the wells of the plate.
  • Each secretome was tested alone, or supplemented with 30 ⁇ g of T. reesei CL847 enzymatic cocktail.
  • the reducing sugars released by saccharification have been quantified to the saccharification tray (24h in the case of micronized wheat straw) by DNS assay. All reactions were performed independently, at least in triplicate.
  • EXAMPLE 2 PROFILES OF GLYCOSIDASE ACTIVITIES OF THE SELECTED MICROORGANISMS
  • the selected strains were cultured in baffled flasks in the inducing medium described above.
  • 100 ml cultures were made in flasks of 250 ml and 500 ml respectively for ascomycetes and basidiomycetes. Each culture was inoculated with 2 ⁇ 10 5 spores / ml for sporulating fungi, or with 5 ml of mycelium fragments per 100 ml of medium for non-sporulating fungi. They were then incubated at 30 ° C. with orbital shaking at 105 ° C. 120 rpm (Infors HT, Switzerland) for 7 days or 10 days for ascomycetes and basidiomycetes respectively.
  • Each secretome was harvested and filtered as described in Example 1 above. Two successive ammonium sulphate precipitation steps at 20% (w / w) and 95% (w / w) were performed. After the second precipitation, the pellet was resuspended in 50 mM acetate buffer, pH 5, concentrated by diafiltration on a 10 kDa cut-off polyethersulfone membrane (Vivaspin, Sartorius), and stored at -20 ° C until to use.
  • the proteins were assayed in each secretome, before and after concentration, by Bradford assay (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, Ivry, France) using a standard range of BSA at concentrations of 0.2 to 1 mg / ml. ml.
  • Concentrated secretomes were tested for their glycoside hydrolase activities on different substrates.
  • Cellulose degradation was estimated by quantifying endo-glucanase (carboxymethyl cellulose, CMC), Avicelase (Avicel, AVI), FPase (Filter paper, FP), cellobiohydrolase ( ⁇ - ⁇ -D-cellobioside, pCel and pNP- ⁇ -D-lactobioside, pLac) and ⁇ -glucosidase ( ⁇ - ⁇ -
  • D-glucopyranoside D-glucopyranoside, pGlc).
  • the degradation of hemicellulose was assessed by quantification of xylanases and mannanases using different xylan and mannan as substrates.
  • the main exoglycosidase activities were evaluated by quantifying the hydrolysis of pNP- ⁇ L-arabinofuranoside (pAra), ⁇ - ⁇ -D-galactopyranoside (pGal), ⁇ - ⁇ -D-xylopyranoside (pXyl), and ⁇ - ⁇ -D-mannopyranoside (pMan).
  • the degradation of pectins was determined using as substrates arabinogalactan and arabinan, and the overall esterase activity was determined on pNP-acetate (pAc).
  • pNPs For the pG1c, pLac, pCel, pXyl, pAra, pGal, and pMan (Sigma) pNPs, a 1 mM solution of pNP in 50 mM acetate buffer, pH 5, was dispensed into the wells of a polystyrene plate. 96 wells, 100 ⁇ per well, and one column per substrate. A range of 0 to 0.2 mM pNP used as a standard was added to each plate. The plates were frozen at -20 ° C until use.
  • the assay was performed by adding 20 ⁇ l of each secretome to the pNP plates, preincubated at 37 ° C. The plates were then sealed using a PlateLoc device (Velocity 11, Agilent) to prevent evaporation, and incubated at 37 ° C with shaking at 1000 rpm (Mixmate, Eppendorf). After 30 minutes, the reaction was stopped by addition of 130 ⁇ l of a 1 M solution of Na 2 CO 3 , pH 11.5. The amount of pNP released was measured at 410 nm and quantified against the standard range of pNP.
  • One unit of enzyme was defined as 1 ⁇ of p-nitrophenyl released per mg of protein per minute under the experimental conditions used.
  • the complex substrates used are carboxymethyl cellulose (CMC, Sigma), Avicel PH101 (Fluka), birch xylan (BirchX, Sigma), low viscosity wheat xylan (WheatX, Megazyme, Wicklow, Ireland), wheat insoluble arabinoxylan (heatXI, Megazyme), insoluble mannan of ivory palm seed (MAN, Megazyme), carob galactomannan (GalMan, Megazyme), larch arabinogalactan (AraGal, Megazyme) and sugar beet (Megazyme).
  • the overall cellulase activity was determined on paper filter discs (Whatmann No. 1) 6 mm in diameter. Flasks each containing a filter paper disc in 100 ⁇ l 50 mM acetate buffer, pH 5, and 50 ⁇ l of the secretome tested were incubated for 2 hours at 50 ° C. All tests were done in triplicate. After incubation, the reducing sugars were quantified by DNS assay as described above. One unit of enzyme was defined as 1 ⁇ of glucose equivalent released per mg of protein per minute under the experimental conditions used.
  • EXAMPLE 3 CAPACITY OF SECRETOMES OF MICROORGANISMS SELECTED TO COMPLEMENT TRICHODERMA SECREETO SECRETHOMY FOR THE PRODUCTION OF GLUCOSE AND XYLOSE
  • Secretomas of the 24 selected strains were tested for their ability to release glucose and xylose from a lignocellulosic substrate, alone or in combination with the secretome of Trichoderma reseii (E508 enzyme cocktail of strain CL847).
  • EXAMPLE 4 COMPLEMENTATION OF A SECRETE OF T. REESEI BY SECRETOMES OF SEVERAL FUNGAL STRAINS FOR THE RELEASE OF GLUCOSE FROM PRE-TREATED WHEAT STRAW
  • Example 4 Several secretomas show a complementation effect of the Trichoderma reesei secretome for the hydrolysis of native straw. Of these, several were prepared as described in Example 2 above and were tested for their ability to complement the T. reesei secretome for glucose release from an industrial-type substrate (straw). pretreated wheat).
  • the secretomes studied in Example 4 are those produced by strains of Aspergillus nidulans, Aspergillus wentii d 1 and Aspergillus japonicus CIRM-BRFM 405.
  • Pretreatment of the wheat straw was performed by steam explosion under acidic conditions.
  • the crude straw was soaked in a 0.04 M solution of H 2 SO 4 for 16 hours and then subjected to a steam explosion treatment in a batch reactor for 150 s at 20 bar and 210 ° C. vs. After 2 washes with water, the straw was subjected to a pressure of 100 bar for 3 minutes to obtain a solids content of about 30%.
  • the T. reesei cocktail used in this example is lot K616 produced by T. reesei strain CL847 ⁇ . It has the peculiarity of having a better level of ⁇ -glucosidase activity than the lot E508 produced by T. reesei CL847, because the T. reesei ⁇ strain integrates a vector overexpressing the native ⁇ -glucosidase (Specific activities of K616: Activity FPU (Filter paper unit): 0.67 IU / mg, PNPGU activity (hydrolysis of para-nitrophenyl-D-glucose): 4.6 IU / mg).
  • the hydrolysis tests were carried out in 10 ml glass vials. 250 mg of sieved substrate and lyophilized were suspended in a total volume of 5 ml containing 50 mM citrate buffer pH 4.8 (Merck, Prolabo) and 50 ⁇ l Chloramphenicol (30 g 1-1) (Sigma-Aldrich). The flasks were incubated at 45 ° C for 30 min before addition of secretomas. T. reesei secretome was used at a concentration of 10 mg protein per gram of substrate. Secretory supplementation of Aspergilli strains was performed at 7% by weight of added T. reesei proteins.
  • the flasks were re-incubated at 45 ° C with shaking at 175 rpm and samples were taken at 0 to 72 h. After inactivation of the enzymes in boiling water for 5 min, and centrifugation, the supernatants were filtered and the glucose production measured by CarboPac PA-1 column high performance anion exchange chromatography (Dionex).
  • EXAMPLE 5 COMPLEMENTATION OF SECRETOMES OF 27. REESEI BY THE STRAIN OF A. JAPONICUS CIRM-BRFM 405 (CNCM 1-4639) FOR THE RELEASE OF GLUCOSE FROM PRE-TREATED WHEAT STRAW.
  • the secretomes of 2 T. reesei strains were used.
  • the first secretome is the K616 cocktail used in Example 4.
  • the second secretome called the K667 enzymatic cocktail, was produced by a transformed T. reesei strain containing a high activity enhanced ⁇ -glucosidase, as described in the PCT Application.
  • WO 2010/029259 K667 specific activities: FPU 0.68 IU / mg, PNPGU 12, 5 IU / mg).
  • the hydrolysis tests were carried out as described in Example 4.
  • the T. reesei secretome was used at a concentration of 10 mg of protein per gram of substrate.
  • Secretion supplementation of the strain A. japonicus was carried out at 7% by weight of the added T. reesei proteins.
  • the flasks were incubated at 45 ° C with shaking at 175 rpm and samples were taken at 0, 4, 24, 48 and 72 h. After inactivation of the enzymes in boiling water for 5 min, and centrifugation, the supernatants were filtered and the glucose production measured by CarboPac PA-1 column high performance anion exchange chromatography (Dionex).

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Abstract

L'invention est relative à une préparation multi- enzymatique contenant le sécrétome de la souche CNCM I-4639 d'Aspergillus japonicus. Ce sécrétome qui contient notamment des cellulases et des hémicellulases, est utilisable pour la saccharification de substrats lignocellulosiques, notamment en association avec le sécrétome de Trichoderma reesei.

Description

PRÉPARATION MULTI-ENZYMATIQUE CONTENANT LE SÉCRÉTOME D ' UNE SOUCHE D ' ASPERGILLUS JAPONICUS.
La présente invention est relative à l'amélioration de la saccharification de la biomasse lignocellulosique.
La lignocellulose est un constituant majeur de la biomasse végétale, et fait l'objet d'un grand intérêt en tant que matière première pour la production de divers produits chimiques, notamment des sucres simples fermentescibles résultant de l'hydrolyse (généralement dénommée saccharification) de ses constituants polysaccharidiques . A l'heure actuelle, le principal produit de saccharification de la biomasse lignocellulosique est le glucose, qui peut être converti par fermentation éthanolique en éthanol utilisable comme biocarburant .
La lignocellulose est constituée principalement de trois types de polymères, en proportions variable selon les espèces de plantes : la cellulose, l' hémicellulose, et la lignine. Ces constituants sont reliés entre eux par différents types de liaisons, covalentes et non-covalentes .
La cellulose représente jusqu'à 45% du poids sec de la lignocellulose. Elle est composée de chaînes linéaires d'unités D-glucose reliées par des liaisons β-l, 4-glucosidiques, ces chaînes étant liées entre elles par des liaisons hydrogène ou des forces de van der Waals.
Les hémicelluloses sont des hétéropolymères représentant 15 à 35% de la biomasse végétale, et contenant des pentoses (β-D-xylose, α-L-arabinose ) , des hexoses ( β-D-mannose, β-D-glucose, α-D-galactose ) et des acides uroniques .
La lignine est un hétéropolymère complexe, constituée d'unités phénylpropane reliées entre elles par différents types de liaisons. La lignine est liée à la fois à 1' hémicellulose et à la cellulose, les enrobant dans une structure tri-dimensionnelle complexe qui les rend peu accessibles à l'hydrolyse.
Aujourd'hui, la voie considérée comme la plus prometteuse pour la saccharification de la lignocellulose est l'hydrolyse enzymatique, à l'aide d'enzymes produites par des micro-organismes cellulolytiques, notamment des champignons filamenteux. Cette hydrolyse est précédée d'un prétraitement de la biomasse, ayant pour but de diminuer la complexité du réseau lignocellulosique, notamment en solubilisant la lignine et/ou l' hémicellulose, en diminuant la cristallinité de la cellulose ou en augmentant sa surface accessible à l'hydrolyse. Ce prétraitement peut être effectué par différentes techniques, telles que le broyage mécanique, la thermolyse, le traitement par un acide dilué, par une base, ou par un peroxyde, l'explosion à la vapeur, etc. (pour revue Hendriks A. T., Zeeman G.; Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass; Bioresource Technology 2009 - 1:10-8.).
Le champignon filamenteux actuellement le plus utilisé comme source d'enzymes cellulolytiques est l'ascomycète Trichoderma reesei. Son sécrétome (c'est-à-dire l'ensemble des enzymes excrétées par le champignon dans le milieu de culture) contient principalement trois types d'enzymes, dont l'activité complémentaire permet l'hydrolyse de la cellulose en glucose : des endoglucanases (E.G ; EC 3.2.1.4); des exoglucanases , comprenant notamment des cellobiohydrolases I et II (CBH ; EC 3.2.1.91); des β-glucosidases (BGL ; EC 3.2.1.21).
Pour la saccharification de la lignocellulose, on utilise généralement la totalité du sécrétome, sous forme de cocktail enzymatique. La saccharification s'effectue par simple mise en contact du matériau lignocellulosique prétraité avec ce cocktail enzymatique, et incubation, dans les conditions de température et de pH optimales pour les enzymes concernées pendant une durée variable selon la nature du matériau lignocellulosique concerné et la quantité d'enzymes utilisée .
Le principal intérêt de Trichoderma reesei réside dans sa capacité à sécréter des quantités très importantes d'enzymes. Des souches de T. reesei hypersécrétrices d'enzymes lignocellulolytiques ont été produites par mutagénèse, et leur sécrétome est actuellement utilisé pour la saccharification de la lignocellulose . Parmi ces souches, on citera notamment les souches MCG77 (US 4275 167), MCG 80 (ALLEN &ANDREOTTI , Biotechnol Bioeng. 12, 451-459, 1982), RUT C30 ( ontenecourt & Eveleigh, Appl. Environ. Microbiol., 34, 777-782, 1977) et CL847 (Warzy oda et al., Biotechnol Bioeng. 25, 3005-3011, 1983) .
Cependant, le séquençage et l'analyse du génome de T. reesei (Martinez et al., Nat Biotechnol. 26, 553-60, 2008) ont montré que celui-ci présentait en fait un certain nombre de lacunes, notamment dans le nombre et la diversité des gènes codant pour des cellulases, des hémicellulases et des pectinases, qui étaient moindres que ceux rapportés pour d'autres champignons filamenteux.
Il apparaît donc envisageable d'améliorer le cocktail enzymatique issu de T. reesei en le complétant avec des activités enzymatiques qui permettraient de combler ces lacunes .
Il est souvent considéré que l'une de ces lacunes, dans le cadre d'une utilisation pour la saccharification in vitro, est le faible taux de β-glucosidases de T. reesei. Pour cette raison, il a été proposé d'utiliser des souches de T. reesei recombinantes dont l'activité β-glucosidase était augmentée, par exemple par insertion de plusieurs copies du gène de la β-glucosidase (PCT WO/92/010581 ) , par modification du peptide signal pour augmenter la quantité de β-glucosidase sécrétée (PCT WO/99/46362) , ou par mutation du gène de la β-glucosidase pour produire une protéine plus active (PCT WO/2010/029259) .
Une autre approche proposée consiste à rechercher d'autres champignons cellulolytiques , dont le sécrétome contiendrait des activités enzymatiques capables de complémenter celles qui apparaissent insuffisantes chez T. reesei, et de permettre d'obtenir une saccharification plus efficace .
Dans ce cadre, les Inventeurs ont identifié une souche d' Aspergillus japonicus répondant à ces critères, et permettant notamment, lorsque son sécrétome est utilisé en combinaison avec celui de Γ. reesei, d'augmenter significativement la production de glucose notamment à partir d'une biomasse prétraitée, par rapport au sécrétome de T. reesei utilisé seul.
Cette souche, dénommée CIRM-BRF 405, a été déposée selon le traité de Budapest le 6 juin 2012, auprès de la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Micro-organismes) , 25 rue du Docteur Roux, Paris, sous le numéro CNCM 1-4639.
La présente invention a en conséquence pour objet l'utilisation de la souche CNCM 1-4639 pour l'obtention d'une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases et des hémicellulases .
Plus spécifiquement la présente invention a pour objet une préparation multi-enzymatique contenant des cellulases et des hémicellulases, caractérisée en ce qu'elle contient le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 d' Aspergillus japonicus .
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit sécrétome est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM 1-4639 effectuée en présence d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques, contenant des arabinoxylanes .
Des sources de carbone inductrices préférées sont choisies parmi les sons de céréales, et/ou leurs fractions autoclavé (e) s ou non. On peut par exemple utiliser du son de maïs, de blé, d'orge, etc., ou un mélange de son de différentes céréales et ou de leurs fractions. Généralement, une telle source de carbone inductrice contient entre 14 et 18 % en poids d'arabinose, entre 26 et 30 % en poids de xylose, entre 0 et 1 % en poids de mannose, entre 5 et 6 % en poids de galactose, entre 20 et 24 % en poids de glucose, et le cas échéant entre 2 et 4 % en poids d'acide férulique.
Les autres constituants du milieu de culture sont les constituants usuels des milieux pour la culture d' Aspergillus japonicus, qui sont connus en eux-mêmes de l'homme de l'art. Classiquement, ces constituants comprennent outre la source de carbone, une source d'azote, des sels minéraux, des oligo-éléments, des vitamines, et généralement, de l'extrait de levure. Le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 peut être obtenu à partir d'une culture de cette souche par simple séparation des cellules et du surnageant de culture, qui contient les protéines sécrétées. Ce surnageant peut être utilisé tel quel, ou après simple filtration pour le débarrasser des débris cellulaires. Toutefois, généralement, il sera préférable de le concentrer par exemple par diafiltration . Les protéines constituant le sécrétome peuvent également être récupérées par précipitation au sulfate d'ammonium.
Le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 peut être utilisé pour la saccharification de la biomasse lignocellulosique, et notamment en combinaison avec le sécrétome d'une souche de T. reesei.
En conséquence selon un mode de réalisation particulièrement préféré d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, elle contient le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 en mélange avec le sécrétome d'une souche de T. reesei.
Ladite souche de T. reesei peut être par exemple une souche hypersécrétrice d'enzymes lignocellulolytiques telle que l'une des souches MCG77, MCG 80, RUT C30, et CL847 mentionnée ci-dessus. Il peut s'agir également d'une souche recombinante telle que celles décrites dans les Demandes PCT WO/92/010581, PCT WO/99/46362 ou PCT WO/2010/029259.
Des méthodes de productions du sécrétome de T. reesei sont bien connues en elles-mêmes de l'homme de l'art. A titre d'exemple, on citera le procédé décrit dans la Demande FR 2 555 603.
Le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 peut être mélangé avec celui d'une souche de T. reesei dans des proportions (en poids) : protéines du sécrétome de CNCM I-4639/protéines du sécrétome de T. reesei allant de 25/75 jusqu'à 5/95 Avantageusement ces proportions seront de 10/90 à 5/95.
La présente invention a également pour objet un procédé de production de sucres fermentescibles , et notamment de glucose, à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse dudit substrat à l'aide d'une préparation multienzymatique conforme à l'invention, avantageusement à l'aide d'une préparation contenant le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 en mélange avec le sécrétome d'une souche de T. reesei.
Le substrat lignocellulosique peut être issu de n'importe quel matériau riche en lignocellulose, par exemple des résidus d' exploitation agricoles tels que les pailles de céréales, des résidus d'exploitation du bois, des matériaux issus de cultures dédiées telles que le miscanthus et le peuplier, des résidus de l'industrie papetière ou de toute autre industrie de transformation des matériaux cellulosiques et lignocellulosiques . Préalablement à l'hydrolyse, ce matériau est prétraité, comme décrit ci-dessus, pour obtenir le substrat lignocellulosique sur lequel sera effectuée l'hydrolyse. Le prétraitement est effectué de manière connue en elle-même de l'homme du métier, par exemple selon une des méthodes indiquées plus haut. Une méthode de prétraitement particulièrement préférées est l'explosion à la vapeur en conditions acides. Les conditions de ce prétraitement (quantité d'acide, pression, et durée) sont des conditions classiques, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art.
L'hydrolyse enzymatique sera généralement effectuée à une température de 30°C à 50°C, de préférence entre 37 et 45°C, et à un pH généralement compris entre 4,5 et 5,5.
Généralement le mélange réactionnel contient de 1 à 20% en poids de matière sèche de substrat lignocellulosique, et la préparation enzymatique conforme à l'invention est utilisée à raison de 5 à 30 mg par gramme de substrat (en poids de matière sèche) .
La durée de l'hydrolyse enzymatique peut varier notamment selon la nature du substrat et la quantité de préparation enzymatique utilisée, et la température à laquelle est effectuée la réaction. Elle est généralement de 24 à 120h, de préférence 72h à 96h. Le suivi de l'hydrolyse peut être effectué par dosage des sucres réducteurs libérés et des sucres simples glucose et xylose. Les sucres simples obtenus par le procédé conforme à l'invention peuvent être récupérés à partir de l' hydrolysat , en vue d'une utilisation ultérieure.
Alternativement, l' hydrolysat peut être utilisé directement pour la production d'alcool, notamment d'éthanol, par fermentation en présence d'un micro-organisme alcooligène.
La présente invention a donc également pour objet un procédé de production d'alcool, notamment d'éthanol, caractérisé en ce qu' il comprend la production, conformément à l'invention, d'un hydrolysat contenant des sucres fermentescibles à partir d'un substrat lignocellulosique, et la fermentation alcoolique de cet hydrolysat par un microorganisme alcooligène.
La fermentation alcoolique peut être effectuée, à la suite de l'hydrolyse enzymatique, dans des conditions classiques bien connues de l'homme du métier.
Généralement on utilise un microorganisme alcooligène tel que la levure Saccharomyces cerevisiae ou la bactérie Zymomonas mobilis, et la fermentation est effectuée à une température comprise de préférence entre 30 et 35°C.
Alternativement, la fermentation alcoolique peut être effectuée simultanément à l'hydrolyse enzymatique, selon un procédé de saccharification et fermentation simultanées dit procédé SSF. Les conditions opératoires mises en œuvre dans ce cas pour l'hydrolyse enzymatique et la fermentation alcoolique diffèrent principalement de celles indiquées ci-dessus par la température et la durée de la réaction. La température est généralement de 28 à 40 °C, et la durée de la réaction est généralement de 50 h à 300 h.
La présente Invention sera mieux comprise à l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples non limitatifs illustrant les propriétés du sécrétome de la souche CNCM 1-4639.
EXEMPLE 1: RECHERCHE DE MICROORGANISMES SUSCEPTIBLES
D'AMÉLIORER LES CAPACITÉS DE SACCHARIFICATION DE TRICHODEKMA RESEII.
Les sécrétomes de diverses souches fongiques des classes ascomycètes, basidiomycètes , et zygomycètes, issues de la collection du Centre International de Ressources Microbiennes (CIRM-CF; http://www.inra.fr/crb-cirm/), à l'INRA de Marseille ont été testés pour leur capacité de saccharification d'un substrat lignocellulosique , seuls ou en combinaison avec le sécrétome de Trichoderma reesei.
Les espèces auxquelles appartiennent ces souches, ainsi que le nombre de souches pour chaque espèce sont listées dans le Tableau I ci-après.
Tableau I
Les souches sont maintenues en culture sur gélose maltée en tubes inclinés, en utilisant le milieu MA2 (extrait de malt à 2 % p/v) pour les basidiomycètes, et le milieu MYA2 (extrait de malt à 2% p/v et extrait de levure à 0.1 % p/v) pour les ascomycètes et les zygomycètes.
Préparation des sécrétomes :
Les souches ont été cultivées dans des plaques de 16 puits bafflées, en milieu liquide contenant 15 g/1 (basé sur la matière sèche) de fraction autoclavée de son de maïs (fournie par ARD, Pomacle, France) en tant que source de carbone inductrice de la production d'enzymes cellulolytiques , 2,5 g/1 de maltose pour le démarrage de la culture, 1, 842 g/1 de tartrate de diammonium comme source d'azote, 0,5 g/1 d'extrait de levure, 0,2 g/1 de KH2P04, 0,0132 g/1 de CaCl2.2H20 and 0,5 g/1 de MgS04.7H20.
Les cultures ont été inoculées avec 2 x 105 spores/ml pour les champignons sporulants, ou avec des fragments de mycélium obtenus par broyage pendant 40 s avec un Fastprep®-24 (MP Biomedicals) réglé à 5 m/s pour les champignons non-sporulants . Elles ont ensuite été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 140 rpm (Infors HT, Switzerland) pendant 7 jours pour les ascomycètes et 10 jours pour les basidiomycètes .
Le milieu de culture a été récolté, filtré sur membrane de polyéthersulfone de 0,2 μπι de taille de pores (Vivaspin®, Sartorius), puis concentré par diafiltration sur membrane de polyéthersulfone de seuil de coupure de 10 kDa (Vivaspin®, Sartorius) dans un tampon acétate 50 mM, pH 5, à un volume final de 3 ml et conservé à -20 °C jusqu'à utilisation .
Chaque sécrétome diafiltré et concentré a été testé pour sa capacité à saccharifier de la paille de blé (Triticum aestivum, variété Apache, France) micronisée. Le sécrétome de la souche CL847 de T. reesei (également dénommé ci-après cocktail enzymatique E508), fourni par IFPEN ( Rueil-Malmaison, France) a été utilisé comme référence.
Les particules de paille de blé micronisé ont un diamètre moyen de 100 μιη. Ces particules ont été mises en suspension à 1% (p/v) dans 50 mM de tampon acétate, pH 5, supplémenté avec 40 μg/ml de tétracycline, et 30 g/ml de cycloheximide . La suspension a été répartie dans des plaques à 96 puits, qui ont été conservées à -20°C jusqu'à utilisation.
Les mesures de saccharification ont été effectuées selon la méthode décrite par Navarro et al. (Navarro et al., Microbial Cell Factories, 9:58, 2010), à l'aide d'un robot TECAN GENESIS EVO 200 (Tecan) .
15 μΐ de chaque sécrétome concentré (5 à 30 μg de protéines totales) ont été ajoutés dans les puits de la plaque. Chaque sécrétome a été testé seul, ou additionné de 30 μg du cocktail enzymatique de T. reesei CL847. Les sucres réducteurs libérés par la saccharification ont été quantifiés au plateau de saccharification (24h dans le cas de la paille de blé micronisée) par dosage au DNS. Toutes les réactions ont été effectuées indépendamment, au moins en triplicat.
Les sécrétomes de 21 des souches testées, utilisés en combinaison avec celui de T. reesei, produisaient une quantité de sucres réducteurs supérieure d'au moins 30% à celle produite par le sécrétome de T. reesei seul. Ces souches, qui sont listées dans le Tableau II ci-dessous, ont été sélectionnées pour la suite de l'étude.
Tableau II
EXEMPLE 2 : PROFILS D ' ACTIVITÉS GLYCOSIDASES DES MICROORGANISMES SÉLECTIONNÉS .
Afin d' obtenir les sécrétomes en quantité suffisante pour poursuivre leur caractérisation, Les souches sélectionnées ont été cultivées en flasques bafflées dans le milieu inducteur décrit ci-dessus.
Des cultures de 100 ml ont été effectuées dans des flasques de 250 ml et 500 ml respectivement pour les ascomycètes et les basidiomycètes. Chaque culture a été inoculée avec 2 x 105 spores/ml pour les champignons sporulants, ou avec 5 ml de fragments de mycélium pour 100 ml de milieu pour les champignons non-sporulants . Elles ont ensuite été incubées à 30°C sous agitation orbitale à 105 ou 120 rpm (Infors HT, Switzerland) pendant 7 jours ou 10 jours pour les ascomycètes et les basidiomycètes respectivement.
Chaque sécrétome a été récolté et filtré comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus. Deux étapes successives de précipitation au sulfate d'ammonium à 20% (p/p) et 95 % (p/p) ont été effectuées. Après la deuxième précipitation le culot a été remis en suspension dans du tampon acétate 50 mM, pH 5, concentré par diafiltration sur membrane de polyéthersulfone de seuil de coupure de 10 kDa (Vivaspin, Sartorius), et conservé à -20°C jusqu'à utilisation.
Les protéines ont été dosées dans chaque sécrétome, avant et après concentration, par dosage de Bradford (Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate, Ivry, France) en utilisant une gamme étalon de SAB à des concentrations de 0,2 à 1 mg/ml.
Les rendements en protéines pour chacune des souches sont indiqués dans le Tableau III ci-dessous.
Tableau III
Les sécrétomes concentrés ont été testés pour leurs activités glycoside hydrolase sur différents substrats. La dégradation de la cellulose a été estimée en quantifiant les activités endo-glucanase ( carboxy-methyl cellulose, CMC) , Avicelase (Avicel, AVI), FPase (Filter paper, FP) , cellobiohydrolase (ρΝΡ-β-D-cellobioside, pCel et pNP- β-D-lactobioside, pLac) et β-glucosidase (ρΝΡ-β-
D-glucopyranoside, pGlc) . La dégradation de l' hémicellulose a été évaluée par quantification des xylanases et mannanases en utilisant différents xylanes and mannanes comme substrats. Les principales activités exoglycosidases ont été évaluées en quantifiant l'hydrolyse du pNP-a-L-arabinofuranoside (pAra) , du ρΝΡ-α-D-galactopyranoside (pGal), du ρΝΡ-β-D-xylopyranoside (pXyl) , et du ρΝΡ-β-D-mannopyranoside (pMan) . La dégradation des pectines a été déterminée en utilisant comme substrats l' arabinogalactane et l'arabinane, et l'activité estérase globale a été déterminée sur pNP-acetate (pAc) .
Pour les pNPs pGlc, pLac, pCel, pXyl, pAra, pGal, et pMan (Sigma) , une solution 1 mM de pNP dans du tampon acétate 50 mM, pH 5, a été distribuée dans les puits d'une plaque de polystyrène à 96 puits, à raison de 100 μΐ par puits, et une colonne par substrat. Une gamme de 0 à 0,2 mM de pNP utilisée comme étalon a été ajoutée à chaque plaque. Les plaques ont été congelées à -20°C jusqu'à utilisation.
Le dosage a été effectué en ajoutant 20 μΐ de chaque sécrétome aux plaques de pNP, préincubées à 37 °C. Les plaques ont ensuite été scellées à l'aide d'un dispositif PlateLoc (Velocity 11, Agilent) pour prévenir 1 ' évaporation, et incubées à 37 °C sous agitation à 1000 rpm (Mixmate, Eppendorf) . Au bout de 30 minutes la réaction a été stoppée par addition de 130 μΐ d'une solution 1 M de Na2C03, pH 11.5. La quantité de pNP libéré a été mesurée à 410 nm et quantifiée par rapport à la gamme étalon de pNP. Dans le cas du pAc (Sigma) , une solution de stockage à 20 mM in DMSO a été diluée à 1 mM dans du phosphate de sodium 50 mM, pH 6.5, immédiatement avant l'utilisation. 15 μΐ de chaque sécrétome ont été ajoutés, et la cinétique d'hydrolyse a été suivie par mesure de l'absorbance à 410 nm pendant une minute.
Une unité d'enzyme a été définie comme 1 μπιοΐθ de p-nitrophényl libérée par mg de protéine et par minute dans les conditions expérimentales utilisées.
Les substrats complexes utilisés sont la carboxyméthyl cellulose (CMC, Sigma), l'Avicel PH101 (Fluka), xylane de bouleau (BirchX, Sigma) , le xylane de blé à faible viscosité (WheatX, Megazyme, Wicklow, Ireland) , l' arabinoxylane insoluble de blé ( heatXI, Megazyme), le mannane insoluble de graine de palmier à ivoire (MAN, Megazyme) , le galactomannane de caroube (GalMan, Megazyme) , l' arabinogalactane de mélèze (AraGal, Megazyme) et l'arabinane de betterave à sucre (Megazyme) .
Une solution ou suspension à 1% p/v de chacun de ces substrats dans du tampon acétate 50 mM, pH 5, a été distribuée dans les puits d'une plaque de polystyrène à 96 puits, à raison de 100 μΐ par puits, et une colonne par substrat. Une gamme de 0 à 20 mM de glucose utilisée comme étalon a été ajoutée à chaque plaque. Les plaques ont été congelées à -20°C jusqu'à utilisation. Le dosage a été effectué en ajoutant 20 μΐ de chaque sécrétome aux plaques préincubées à 37 °C. Les plaques ont ensuite été incubées à 37°C sous agitation dans l'incubateur robotisé Tecan Genesis Evo 200 (Tecan France, Lyon, France) pendant 1 heure. Les sucres réducteurs ont été quantifiés par dosage au DNS, en utilisant la méthode automatisée décrite par Navarro et al. (2010, précité) . Une unité d'enzyme a été définie comme 1 μπιοΐβ d'équivalent glucose libérée par mg de protéine et par minute dans les conditions expérimentales utilisées.
L'activité cellulase globale a été déterminée sur des disques de papier filtre (Whatmann n°l) de 6 mm de diamètre. Des flacons contenant chacun un disque de papier filtre dans 100 μΐ tampon acétate 50 mM, pH 5, et 50 μΐ du sécrétome testé ont été incubés pendant 2 heures à 50°C. Tous les tests ont été effectués en triplicat. Après incubation, les sucres réducteurs ont été quantifiés par dosage au DNS comme décrit ci-dessus. Une unité d'enzyme a été définie comme 1 μιηοΐε d' équivalent glucose libérée par mg de protéine et par minute dans les conditions expérimentales utilisées.
Les résultats pour l'ensemble des souches testées sont résumés dans le Tableau IV ci-après.
Tableau IV
EXEMPLE 3 : CAPACITÉ DES SÉCRÉTOMES DES MICRO-ORGANISMES SÉLECTIONNÉS À COMPLÉMENTER LE SÉCRÉTOME DE TRICHODERMA RESEII POUR LA PRODUCTION DE GLUCOSE ET DE XYLOSE
Les sécrétomes des 24 souches sélectionnées ont été testés pour leur capacité à libérer du glucose et du xylose à partir d'un substrat lignocellulosique, seuls ou en combinaison avec le sécrétome de Trichoderma reseii (cocktail enzymatique E508 de la souche CL847) .
Les essais de saccharification et le dosage des sucres réducteurs libérés ont été effectués sur paille de blé micronisée, comme décrit à l'Exemple 1 ci-dessus. Le glucose et le xylose ont été quantifiés par chromatographie d'échange d'anions à haute performance sur colonne CarboPac PA-1 (Dionex, Voisins-le-Bretonneux, France) .
Les résultats sont représentés dans le Tableau V ci-après. Ils sont exprimés en % de ceux obtenus avec le cocktail enzymatique E508, utilisé comme référence.
Tableau V
Ces résultats montrent notamment que les sécrétomes des souches d'Aspergillus nidulans, Aspergilus wentii et Aspergillus japonicus CIRM-BRFM 405 (CNCM 1-4639) sont parmi les meilleures pour complémenter le sécrétome de T. reesei afin de libérer des quantités importantes de glucose.
EXEMPLE 4 : COMPLÉMENTA ION D'UN SÉCRÉTOME DE T. REESEI PAR DES SÉCRÉTOMES DE PLUSIEURS SOUCHES FONGIQUES POUR LA LIBÉRATION DE GLUCOSE À PARTIR DE PAILLE DE BLÉ PRÉTRAITÉE.
Plusieurs sécrétomes montrent un effet de complémentation du sécrétome de Trichoderma reesei pour l'hydrolyse de paille native. Parmi ceux-ci, plusieurs ont été préparés comme décrit à l'Exemple 2 ci-dessus et ont été testés pour leurs capacités à complémenter le sécrétome de T. reesei pour la libération du glucose à partir d'un substrat de type industriel (paille de blé prétraitée) . Les sécrétomes étudiés dans l'exemple 4 sont ceux produits par les souches d' Aspergillus nidulans, d1 Aspergillus wentii et d' Aspergilus japonicus CIRM-BRFM 405.
Le prétraitement de la paille de blé a été effectué par explosion à la vapeur en conditions acides. La paille brute a été mise à tremper dans une solution 0,04 M de H2SO pendant 16 heures, puis soumise à un traitement d'explosion à la vapeur dans un réacteur à autohydrolyse discontinu, pendant 150 s à 20 bars et 210 °C. Après 2 lavages à l'eau, la paille a été soumise à une pression de 100 bars pendant 3 mn pour obtenir un contenu en matière sèche d'environ 30%.
Le cocktail de T. reesei utilisé dans cet exemple est le lot K616 produit par la souche T. reesei CL847 ίβ. Il possède comme particularité d'avoir un meilleur niveau d'activité β-glucosidase que le lot E508 produit par T. reesei CL847, car la souche T. reesei ίβ intègre un vecteur surexprimant la β-glucosidase native (Activités spécifiques de K616 : Activité FPU (Filter paper unit) : 0,67 IU/mg ; activité PNPGU (hydrolyse du para-nitrophenyl^-D-glucose) : 4,6 IU/mg) .
Les essais d'hydrolyse ont été effectués dans des flacons en verre de 10 ml. 250 mg de substrat tamisé et lyophilisé ont été suspendus dans un volume total de 5 ml contenant 50 mM de tampon citrate pH 4.8 (Merck, Prolabo) et 50 μΐ de Chloramphenicol (30 g 1-1) (Sigma-Aldrich) . Les flacons ont été incubés à 45°C pendant 30 min avant l'addition des sécrétomes. Le sécrétome de T. reesei a été utilisé à une concentration de 10 mg de protéine par gramme de substrat. La supplémentation par le sécrétome des souches d' Aspergilli a été effectuée à raison de 7% en poids des protéines de T. reesei ajoutées. Les flacons ont été remis à incuber à 45°C sous agitation à 175 rpm et des échantillons ont été prélevés à entre 0 et 72h. Après inactivation des enzymes dans l'eau bouillante pendant 5 min, et centrifugation, les surnageants ont été filtrés et la production de glucose mesurée par chromatographie d' échange d' anions à haute performance sur colonne CarboPac PA-1 (Dionex) .
Les résultats sont illustrés par la Figure 1. Ces résultats montrent que seul le sécrétome de la souche d'A. japonicus CIRM-BRF 405 permet d'améliorer les capacités de libération du glucose.
EXEMPLE 5 : COMPLÉMENTA ION DE SÉCRÉTOMES DE 27. REESEI PAR LA SOUCHE D'A. JAPONICUS CIRM-BRFM 405 (CNCM 1-4639) POUR LA LIBÉRATION DE GLUCOSE À PARTIR DE PAILLE DE BLÉ PRÉTRAITÉE.
Afin de déterminer si les propriétés du sécrétome de la souche CIRM-BRFM 405 pouvaient être attribuées à un effet de supplémentation en activité β-glucosidase du sécrétome de T. reesei, les sécrétomes de 2 souches de T. reesei ont été utilisés. Le premier sécrétome est le cocktail K616 utilisé dans l'exemple 4. Le second sécrétome, dénommé cocktail enzymatique K667, a été produit par une souche transformée de T. reesei contenant une β-glucosidase améliorée à forte activité, comme décrit dans la Demande PCT WO 2010/029259 (Activités spécifiques de K667 : FPU 0,68 IU/mg ; PNPGU 12, 5 IU/mg) .
Les essais d'hydrolyse ont été effectués comme décrit dans l'exemple 4. Le sécrétome de T. reesei a été utilisé à une concentration de 10 mg de protéine par gramme de substrat. La supplémentation par le sécrétome de la souche ά' A. japonicus a été effectuée à raison de 7% en poids des protéines de T. reesei ajoutées. Les flacons ont été remis à incuber à 45°C sous agitation à 175 rpm et des échantillons ont été prélevés à 0, 4, 24, 48 et 72h. Après inactivation des enzymes dans l'eau bouillante pendant 5 min, et centrifugation, les surnageants ont été filtrés et la production de glucose mesurée par chromatographie d'échange d'anions à haute performance sur colonne CarboPac PA-1 (Dionex) .
Les résultats sont illustrés par la Figure 2. Ces résultats montrent que, quel que soit le sécrétome de T. reesei utilisé, le sécrétome de la souche d' A. japonicus CIRM- BRFM 405 permet d'améliorer les capacités de libération du glucose, et que cette amélioration apparaît indépendante d'un effet de supplémentation en activité β-glucosidase .

Claims

REVENDICATIONS
1) Préparation multi-enzymatique contenant des cellulases et des hémicellulases , caractérisée en ce qu'elle contient le sécrétome de la souche CNCM 1-4639 d' Aspergillus japonicus .
2) Préparation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit sécrétome est susceptible d'être obtenu à partir d'une culture de la souche CNCM 1-4639 effectuée en présence d'une source de carbone inductrice de la production d'enzymes lignocellulolytiques , contenant des arabinoxylanes .
3) Préparation selon la revendication 2, caractérisée en ce que ladite source de carbone inductrice est choisie parmi les sons de céréales et les fractions de sons de céréales ou leurs mélanges.
4) Préparation multi-enzymatique selon une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle contient en outre le sécrétome d'une souche de Trichoderma reesei.
5) Utilisation d'une préparation multi-enzymatique selon une quelconque des revendications 1 à 4, pour la saccharification d'un substrat lignocellulosique.
6) Procédé de production de sucres fermentescibles à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend l'hydrolyse dudit substrat à l'aide d'une préparation multienzymatique selon une quelconque des revendications 1 à 4.
7) Procédé de production d'alcool à partir d'un substrat lignocellulosique, caractérisé en ce qu'il comprend la production d'un hydrolysat contenant des sucres fermentescibles par un procédé selon la revendication 6, et la fermentation alcoolique dudit hydrolysat par un microorganisme alcooligène.
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