WO2020256535A1 - Bioprocédé de préparation d'un milieu de culture à partir du fruit de cactus du genre opuntia pour la production de biomasse de levures, biocarburants, protéines, et produits chimiques renouvelables - Google Patents

Bioprocédé de préparation d'un milieu de culture à partir du fruit de cactus du genre opuntia pour la production de biomasse de levures, biocarburants, protéines, et produits chimiques renouvelables Download PDF

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WO2020256535A1
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cactus
fruit
yeasts
culture medium
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PCT/MA2020/050002
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Latifa JAMAI
Mohamed ETTAYEBI
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Université Sidi Mohamed Ben Abdellah
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Definitions

  • the present invention is advantageous for any field of application in which yeast is needed. It relates to the field of constitution of culture and fermentation substrate for microorganisms, in particular yeasts. It particularly relates to a substrate rich in sugars, various mineral elements, vitamins and growth factors for the production of yeasts suitable for industrial use such as the production of yeast biomass for breadmaking, the production of flavors, enzymes, proteins, lipids, yeast extract and ethanol.
  • the invention also enters the field of bioenergy for the production of first and second generation biofuels from the medium whose composition is based on cactus fruit at different temperatures.
  • yeasts The ability of yeasts to effect rapid and efficient conversion of sugars or carbohydrates into ethanol, glycerol, carbon dioxide, acids and / or biomass, has made these microorganisms one of the most exploited groups by humans . They are used as fermentation factors, (Production of yeasts and ferments for the preparation of bread, cheeses and alcoholic drinks, etc.) and produced as such. Their chemical composition, very abundant in proteins (45-50%) of high biological value, vitamins and growth factors, also make them considered as a food of great nutritional value, they are Proteins of Unicellular Organisms or Single Cell Protein (SCP). Their richness in lysine brings them closer to animal proteins. They are used in animal feed to gradually replace soybeans and in human food as a protein supplement.
  • SCP Single Cell Protein
  • yeasts are becoming more and more important to produce vitamins, antibiotics and various products such as steroids and heterologous proteins (insulin, hepatitis B surface antigen, alpha-amylases, cellulases, human serum albumin, etc.).
  • steroids and heterologous proteins insulin, hepatitis B surface antigen, alpha-amylases, cellulases, human serum albumin, etc.
  • yeasts can vary quantitatively depending on whether the yeast is required to ferment (bioethanol production) or to multiply vegetatively to produce biomass.
  • the culture medium serves as a support for the growth and production of metabolites, providing the essential elements for good development (cell synthesis and energy requirements). Carbon is the major compound in the yeast cell, it is also used as a source of energy.
  • the ability of yeasts to use certain carbon compounds varies depending on the species and the strain. Simple carbohydrates are the most frequently used, mono and disaccharides are metabolized by a large number of yeasts, on the other hand, pentoses and polysaccharides are only assimilated by a minority of species. Reduced nitrogen compounds and phosphorus are used by yeast cells in the biosynthesis of amino acids, nucleic acids and some vitamins. The various mineral elements, vitamins and growth factors are essential for the growth of yeasts and the optimization of a better biomass yield. The needs of yeasts for these factors vary quantitatively and qualitatively depending on the species and the strain.
  • fungicides quaternary ammoniums, sulphites, excess sodium, and other trace elements from bio acids used during the cultivation of beets and cane or from the extraction process of sugar such as, for example, acetic, propionic, butyric, formic and valeric acids, which make the production of yeasts more complex and very expensive;
  • the main technological obstacles to the conversion of these two types of biomass into bioethanol are the high cost of hydrolytic enzymes, the increase in the fermentation temperature, the poor conversion yields of the pentoses from the hemicellulosic fraction and the regeneration of fermentation inhibitors.
  • Adopting the Simultaneous Saccharification and Fermentation (SSF) process is one of the most suitable solutions. Indeed, this process combines in a single step, the enzymatic hydrolysis of the substrate and the fermentation of the sugars produced. It is produced by strains of yeast capable of fermenting both sugars at the same time, glucose and xylose.
  • yeast biomass A collection of efficient yeast strains in terms of resistance to temperature, inhibitors and alcohol, was used in the culture and fermentation processes of a medium whose composition is based on the cactus fruit described in the present invention.
  • the two processes, culture and fermentation, result in the production of yeast biomass, first and second generation biofuels with co-production of molecules of interest (proteins, lipids, enzymes, flavors and renewable chemicals) at different temperatures.
  • yeast biomass A collection of efficient yeast strains in terms of resistance to temperature, inhibitors and alcohol, was used in the culture and fermentation processes of a medium whose composition is based on the cactus fruit described in the present invention.
  • the two processes, culture and fermentation result in the production of yeast biomass, first and second generation biofuels with co-production of molecules of interest (proteins, lipids, enzymes, flavors and renewable chemicals) at different temperatures.
  • These conventional and unconventional yeasts belong to the genera Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida, Pichia, Schwanniomyces, Ogatea
  • Biomass production per unit of water is on average 5 to 10 times higher than for C4 and C3 plants.
  • its culture is not very demanding in investments and allows the diversification of income-generating activities.
  • the growing interest in this plant is attributed to its ecological, socio-economic and environmental impacts, such as the fight against erosion and desertification, carbon sequestration, conservation of biodiversity and habitats for wildlife.
  • Opuntia the most cultivated species is Opuntia ficus-indica, characterized by a very high potential for productivity in fruits called prickly pears and fodder resources.
  • yeasts to manufacture, degrade or transform various varieties of substrates lies primarily in their ability to produce a large number of enzymes necessary for their growth. These enzymes benefit from a constantly growing market. These are proteins which, because of their specific properties, participate in the synthesis of molecules. They allow reactions to occur millions of times faster than without them. Under special conditions, they make many processes possible. They are used as end products, but also as agents of industrial production. Enzymes find multiple applications in various sectors, such as the pharmaceutical industry, the food industry, fabrics, stationery, domestic products and even biofuels.
  • Biofuels are motivated by environmental and socioeconomic issues. They are obtained from different types of biomass. Thus, a first generation of biofuels is produced from sugar plants (sugar cane, sugar beet) rich in directly fermentable simple sugars and cereal plants rich in starch. The industry of this generation depends primarily on amylases (a amylase and glucoamylase), which are necessary for the hydrolysis of amylolite biomass. This generation is seriously contested because of its negative impact on the cultivated or livestock areas necessary for human food. To overcome this problem, second generation biofuels have been developed from lignocellulosic materials derived from plants. These materials consist of cellulose, hemicellulose and lignin.
  • the enzymes involved in the complete breakdown of cellulose are: endo-b-1, 4-D-glucanase, cxo-b-I, 4-D-glucanasc (also called cellobiohydrolase) and b-glucosidase. While those which hydrolyze pectins are pectate lyases, pectinases, pectin esterases and polygalacturonases.
  • the main enzymes responsible for the degradation of lignin are peroxidases and laccases.
  • the algal biomass in turn represents a rich resource of bioenergy. It is designed as a renewable raw material for the production of a third generation of biofuels.
  • the growth of this photosynthetic aquatic biomass in wastewater basins rich in mineral elements prevents competition with agricultural land, as well as the use of fertilizers and their harmful effects. Their productivity per hectare is much higher than that of land plants.
  • bioethanol The most widely used biofuel worldwide is bioethanol. It is ethyl alcohol produced by the process of alcoholic fermentation. According to this process, the biomass cultures undergo fermentation by yeasts, followed by distillation. The energy yield of a biofuel is all the more positive as it releases more energy than is needed to produce it.
  • Yeast is the essential part of the chemical process of fermenting the raw material into ethanol, but on an industrial scale, most traditional yeasts are not able to convert all types of sugars into ethanol, especially those that constitute lignocellulosic biomass.
  • the hydrolysis of this biomass into fermentable sugars is the limiting step in the production of second generation biofuels. Because of the high cost of the hydrolytic enzymes, this step represents approximately 50% of the cost price of the ethanol obtained from this biomass.
  • the main avenues of research are in the process of unlocking certain technological and economic obstacles. They mainly relate to improving the activity of hydrolytic enzymes (amylases and cellulases) and to genetic improvement of yeast strains, so that they become capable of metabolizing a wide spectrum of carbohydrates. However, their yield on substrates consisting of C5 sugars is very minimal. All of the enzymes involved in the hydrolysis of amylolite and lignocellulosic biomasses are commercially available in purified form, but have the drawback of being expensive. There is therefore a need for a more economical procedure on an industrial scale, making it possible to produce these enzymes at reduced cost.
  • yeast species in our collection are endowed with one or more enzymatic activities. They are used in the present invention to describe a process for the co-production of enzymes with the production of yeast biomass and / or bioethanol from the culture or fermentation medium whose composition is based on the cactus fruit.
  • cactus fruit encompasses the fruit obtained from cactus plants belonging to the genus Opuntia, and which is composed of various species, including O. ficus indica, O. vulgais, O. abjecta, O. camanchia, O. chlorotica, O. compressa, O. cymochila, O. dillenii, O. engelmanni, O. gosseliniana, O. megacanta, O. monacantha, O. nichollii, O. phaeacantha, O. Pinkavae, O. polyacantha, O. streptacantha Lemaire, O. stricta, O.
  • the present invention relates to a profitable, scalable, sustainable and reproducible process for the preparation of a culture and fermentation medium whose composition is based on the fruit of a cactus Opuntia sp; preferably Opuntia ficus-indica, for biomass production yeasts, enzymes, protein, lipids, biofuels and renewable chemical by-products.
  • the invention also relates to the production from the medium whose composition is based on the cactus fruit, a yeast biomass of interest in bread-making, the production of enzymes such as amylases, pectinases, invertases, laccases, peroxidases, phytases. , proteases and endoglucanases, production of secondary metabolites such as acetic acid and acetaldehyde, production of protein for animal feed and aquaculture, production of bioethanol, lipids, yeast extract and flavors such as ethyl acetate, ethyl lactate, 1 hexyl acetate, (E) -2-nonenal, and 2-pentylfuran.
  • enzymes such as amylases, pectinases, invertases, laccases, peroxidases, phytases. , proteases and endoglucanases, production of secondary metabolites such as acetic acid and acetaldehyde, production
  • Opuntia ficus-indica is characterized by a very high potential for fruit productivity. Yields can exceed 25 tonnes / hectare. Its fruits are juicy, qualified of remarkable nutritional value. They are very rich in sugars (glucose, fructose) which are easily assimilated and fermentable by all species of yeast. In addition, nutrient concentrations, fruit pH, acidity and total soluble solids do not vary during storage. These specificities constitute powerful arguments, justifying that the exploitation of the cactus fruit in the present invention will allow better yields than the conventional substrates currently used in the industry for the production of biomass of yeasts, proteins, enzymes, lipids, biofuels and renewable chemical by-products.
  • Another embodiment of the present invention provides a culture medium whose composition is based on cactus fruit, in liquid or solid form in dried powder, having a very variable total sugar concentration of 60 to 177 gL 1 , for the production of biomass from yeasts, enzymes, protein, lipids, biofuels and renewable chemical by-products.
  • Another embodiment of the present invention provides a process for preparing a culture medium and fermentation substrate whose composition is based on the fruit of cacti (Opuntia sp.)
  • cacti Oletia sp.
  • yeast biomass proteins, enzymes, biofuel and other post-fermentation products according to any one of the claims in which, there is mechanical pressing of whole cactus fruits (bark and pulp) followed by mechanical, thermochemical, acid and enzymatic treatments; the hydrolyzate of the whole cactus fruit obtained and its dried powder will be used for the composition of a culture medium and a fermentation substrate for the production of yeast biomass, proteins, enzymes, biofuels in the form of second generation bioethanol as well as renewable chemical by-products.
  • Another embodiment of the present invention consists in demonstrating the effectiveness of the use of Surface Response Methodology (RSM) in optimizing the parameters for maximum production of ethanol from the medium whose composition is made from the cactus fruit.
  • RSM Surface Response Methodology
  • the amount of ethanol produced by yeasts varies between 40 and 63 gL 1 after 12 hours of fermentation at 37 ° C and pH 5.
  • the contents of soluble solids and reducing sugars in the juice of the cactus fruit vary according to the degree of ripeness of the fruit, respectively, between 14 -17 ° Brix and 60-177 gL 1 .
  • the total acidity of cactus fruit juice expressed as a percentage of the weight of citric acid monohydrate varies between 0.07% and 0.2%.
  • the pretreatment of the cellulosic biomass of the cactus fruit peel can be carried out by various known thermochemical pretreatment methods: dilute acid pretreatment (DAP), pretreatment of steam explosion (SEP), organosolv, hot water liquid pretreatment (LHW), ammonia fiber expansion (AFEX), ammonia soaking (SAA), sodium hydroxide pretreatment and ozonolysis.
  • DAP dilute acid pretreatment
  • SEP steam explosion
  • organosolv hot water liquid pretreatment
  • AFEX ammonia fiber expansion
  • SAA ammonia soaking
  • sodium hydroxide pretreatment sodium hydroxide pretreatment and ozonolysis.
  • Another embodiment of the present invention consists in hydrolyzing the cellulosic biomass of the rind of the cactus fruit pretreated with enzymatic mixtures, allowing the release of fermentable simple sugars.
  • Said enzymatic mixtures comprise pectinase, endocellulase, exocellulase, glucosidase, phenol oxidase and xylanase activities.
  • the present invention consists in producing from the medium whose composition is based on the cactus fruit the yeast biomass, proteins, enzymes, lipids, biofuels and renewable chemicals using yeast species selected from the yeast species. genera exemplified but not limited to Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, subtropical (maltosa) and utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, Issatchenkia and Hensunella.
  • Another embodiment of the present invention consists in producing from the medium whose composition is based on the cactus fruit, the yeast biomass, proteins, enzymes, lipids, bioethanol and renewable chemicals by the heat-resistant, ethanolic yeast, Kluyveromyces marxianus, having the capacity to produce bioethanol at temperatures between 25 and 45 ° C.
  • the present invention consists in producing, from the medium whose composition is based on the cactus fruit, the yeast biomass, the proteins, the lipids, the enzymes and the biofuel, by using native yeast species or genetically modified by approaches non-GMO (by mutagenesis) and GMO (by multi-copy integration into the genome of the genes of interest), selected from the genera of yeasts mentioned below, individually or in co-cultures, Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, subtropical (maltosa) and utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis and Hensunella.
  • the present invention consists in producing from the medium whose composition is based on the cactus fruit, the yeast biomass, the enzymes and the biofuel by a fermentation process designated in the exemplified group but not limited to a process of fermentation in batch, in feed-batch, and continuously, by native yeasts or genetically modified by non-GMO approaches (by mutagenesis) and GMO (by multi-copy integration in the genome of the genes of interest), individually or in co-cultures with cellulase-producing microorganisms chosen from the groups of fungi filamentous, bacteria or yeasts.
  • the bioethanol and the fermentation by-products are recovered by methods known to those skilled in the art.
  • Another embodiment of the present invention relates to the production of biomass of yeasts, proteins, lipids, enzymes and biofuels by solid state fermentation using low water growing substrates ( reduction in water activity).
  • the medium is saturated with water, but with minimal fluid flow.
  • the solid medium comprises the cactus fruit mechanically treated and placed on a solid support, on which the fermentation takes place by native yeasts or genetically modified by non-GMO (by mutagenesis) and GMO (by multi-copy integration in the genome of genes of interest), individually or in co-cultures with cellulase-producing microorganisms chosen from the groups of filamentous fungi, bacteria or yeasts.
  • the bioethanol and the fermentation by-products are recovered by methods known to those skilled in the art.
  • Another embodiment of the present invention provides the raw material for the constitution of laboratory or industrial culture media, the composition of which is based on the cactus fruit in which said laboratory or industrial culture media allow the multiplication of fungi and yeasts for the purpose of recovering a compound designated in the exemplified group but not limited to cell biomass, single-cell-protein, protein, enzyme, lipid, bio-hydrocarbon, secondary metabolite , a bioactive product, and a vitamin.
  • yeasts designated in the exemplified group but not limited to the following genera: Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, subtropical (maltosa) and utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, Issatchenkia and Hensunella.
  • the cactus fruits used in this study are Moussa cultivars, a variety of the Opuntia ficus indica species, collected from the A ⁇ t Bâamrane region in southern Morocco. After washing, the fruits with or without peel are subjected to a mechanical treatment (pressing), followed by filtration. The juice of the resulting cactus fruit [a] is a basic element for the constitution of culture and fermentation media.
  • the peel of the fruit and the fiber mash resulting from the filtration are subjected to a mechanical treatment followed by a light chemical and / or enzymatic hydrolysis, the hydrolyzate obtained [b], is a basic constituent of the culture media and fermentation.
  • the measurement of the pH value of the juice of the cactus fruit studied is carried out by a pH meter, previously calibrated with buffer solutions of pH equal to 4 and 7.
  • the sample of the fruit juice is titrated with 0.01N sodium hydroxide (NaOH) solution in the presence of phenolphthalein.
  • NaOH sodium hydroxide
  • the indicator's turn zone was then determined. It is expressed in milliequivalents of acid per liter of juice.
  • the soluble solids content of the juice of the fruit is measured with a hand-held refractometer (ATAGO) at 20 ° C, it varies between 14 and 17 ° Brix depending on the degree of ripeness of the fruit.
  • ATAGO hand-held refractometer
  • the amount of sugar in the samples of the dosed fruit juices varies from 60 to 177 gL 1 depending on the samples and the maturity of the fruit. e) Determination of total protein
  • the principle is the determination of the total nitrogen, it is carried out by the method (Paterson, 1983), the standard range is prepared by the BSA O.lmg L 1 .
  • the total protein content in the test sample is 13.6 mgL 1
  • Example 3 Growth of the yeast strains on a medium whose composition is based on the cactus fruit at different temperatures
  • the growth of the yeast strains is carried out on petri dishes, containing the medium whose composition is based on the cactus fruit solidified by the addition of 2% agar and sterilized in an autoclave at 110 ° C for 15 mn.
  • the dishes are inoculated with spots of yeast strains and incubated for 48 hours at different temperatures: 37 ° C, 41 ° C, 45 ° C and 48 ° C.
  • Pectinase is a generic term for a combination of enzymes that participate in the hydrolysis of pectin.
  • Pectin a polysaccharide found in the cell walls of plants.
  • Pectinases are recommended in the food industry and in oenology to facilitate and increase the extraction rate; they are also used to clarify fruit or vegetable juices and reduce filtration time. The treatment of fruit pulps with pectinases also makes it possible to extract more juice (bananas, grapes, apples ).
  • the culture of the yeast strains is carried out on a medium whose composition is based on the cactus fruit, sterilized by autoclaving at 110 ° C. for 15 minutes. After inoculation, the cultures are incubated at 37 ° C. for 24 hours and with stirring at 300 rpm 1 . The cultures are centrifuged, the detection of the pectinase activity of the yeasts obtained is carried out by spot seeding on dishes containing the polygalacturonate medium at 2% agar (PGA). After 48 h of incubation at different temperatures (41 ° C, 45 ° C and 48 ° C), the enzymatic activity is revealed by a 7.5% copper acetate solution in the form of a clear halo.
  • PGA agar
  • Amylases are among the most important and oldest enzymes on an industrial scale, they hydrolyse starch into dextrins and gradually into small polymers composed of a few units of glucose. Their use is increasingly developed in various sectors. Indeed in biotechnology, their action has become essential in the manufacture and improvement of several food products as well as in industry. textiles, paper and cleaning (laundry); these enzymes are also introduced in the medical field and that of chemical analyzes.
  • the culture of the yeast strains is carried out on the medium whose composition is based on the cactus fruit, sterilized by autoclaving at 110 ° C. for 15 minutes. After inoculation, the cultures are incubated at 37 ° C. for 24 hours and with stirring at 300 rpm 1 . The cultures are centrifuged, the detection of the amylase activity of the yeast strains is carried out by spot seeding on dishes of PDA medium containing starch as a carbon source and incubated for 48 hours. Impregnation of the dishes with the potassium iodide reagent, followed by washing with distilled water, allowed the appearance of clear halos revealing the amylolitic activity of the yeasts.
  • Invertase is b-D-fructofuranoside fructohydrolase, its specificity is absolute for the unsubstituted fructofuranoside terminal residue; therefore, its hydrolytic action is not limited to sucrose but also includes methyl 1 -b - True to furan o si de, raffinose, stachyose and verbascose. This enzyme is of major interest in the food industry.
  • the cultures are carried out under the optimum conditions for the growth of the chosen yeast strain.
  • One liter of the medium whose composition is based on the cactus fruit, contained in a two-liter fermenter (RUIAN GLOBAL), sterilized by autoclaving at 110 ° C for 15 minutes is inoculated with 10 cells / ml of culture medium, then incubated at 37 ° C with agitation of 250 rpm 1 .
  • 10 ml aliquots are taken every hour under sterile conditions. After centrifugation, the enzymatic activity of the yeasts is assayed in the supernatant of the culture medium and in the whole cells.
  • the number of enzymatic units accounts for the total activity, it is defined by the quantity of enzymes capable of hydrolyzing one micromole of sucrose per minute (or of releasing two micromoles of reducing equivalents per minute) .
  • Example 7 Evaluation of the phytase activity secreted by C. tropicalis YMEC24 and Sc. Occidentalis (Debaryomyces occidentalis) at different temperatures
  • Phytase is the enzyme responsible for the hydrolysis of phytates or phytic acid, naturally present in the seeds of many cereals and legumes. In fact, 75% of the phosphorus in cereals is either complexed with proteins or in the form of calcium or magnesium salt which cannot be digested by monogastric animals.
  • the addition of phytase to livestock feed hydrolyzes phytates, releases minerals and facilitates their absorption. It also plays an ecological role, as it reduces the rejection of minerals by animals, in particular phosphorus which is the main cause of eutrophication of water reservoirs.
  • the yeast strains are cultured separately on a medium whose composition is based on the cactus fruit supplemented with 5% starch, sterilized by autoclaving at 110 ° C. for 15 minutes; then incubated with agitation of 250 rpm 1 at 37 ° C for 36 h. A volume of 50 ml of this saturated culture was centrifuged at 1000 rpm 1 min for 10 minutes. The recovered supernatant is then filtered through a 0.45 micron filter to remove any cells remaining after centrifugation. 45 ml of the filtrate from the supernatant are concentrated to a volume of 0.5 ml by a first dialysis against polyethylene glycol 2000, then a second dialysis against a cold solution of 12 ⁇ m CaC.
  • Example 8 Kinetics of batch fermentation of the production of bioethanol from the medium whose composition is based on the cactus fruit
  • the batch fermentation kinetics are carried out in a 2L benchtop fermenter (RUIAN GLOBAL), containing 1.3 liters of the medium whose composition is based on the cactus fruit, sterilized by autoclaving at 110 ° C. for 15 minutes.
  • the inoculation is made with 6 ⁇ 10 K. marxianus yeast cells per milliliter of the culture medium and incubated at a temperature of 37 ° C., with stirring at 450 rpm 1 .
  • 10 mL aliquots of the culture medium are taken every 4 hours to evaluate the production of biomass, ethanol and residual sugars.
  • the levels of ethanol produced are determined by gas chromatography; they vary between 40 and 63 gL 1 depending on the initial sugar concentrations and also depending on the yeast strains used. •
  • Example 9 Experimental and statistical design for the optimization of ethanol production
  • Table 2 Values of the real and coded levels of the optimized independent variables
  • a comparison of the ethanol yield was carried out on two laboratory culture media YPS 15% sucrose, YPA 9% starch treated with amylase, YPA 9% not treated with amylase and the culture medium including the composition is based on the cactus fruit.
  • the fermentations are carried out individually and in parallel on the four media, in 100 ml Erlenmeyer flasks each containing 30 ml of one of the four media, sterilized by autoclaving at 110 ° C. for 15 minutes.
  • Each of the four media is inoculated individually and separately with 6 x 10 yeast cells of S. cerevisiae, C. tropicalis and Sc. Occidentalis. They are then incubated under constant agitation of 450 rev min 1 for 24 hours.
  • the results of Table 3 make it possible to compare the state parameters (the yield of ethanol and the productivity) both between the different media and between the three strains.
  • the best ethanol yields as well as the best productivities are obtained from the medium based on the cactus fruit, followed by the YPS medium.
  • the comparison of the state parameters between the three strains cultivated on the three media shows the performance of S. cerevisiae compared to C. tropicalis and Sc. Occidentalis in the alcoholic fermentation of a medium whose composition is based on cactus fruit.
  • Example 11 Use of yeast strains for the fermentation of cactus fruits
  • Opuntia are species with a crassulaceous metabolism, having built-in mechanisms that confer water-use efficiency, the ability to grow in constrained soils, and tolerance to cold and heat.
  • Opuntia and more particularly, Opuntia ficus-indica represent bioenergetic and sustainable crops, characterized by a very high fruit productivity potential, yields can exceed 25 tonnes per hectare.
  • Opuntia ficus-indica is characterized by juicy fruits (87% water), and pulps of different colors based on a natural dye betalaine, The pigment content varies from 66 to 1140 mg kg 1 of pulp of fruit. The proportion of edible pulp in the fruit varies from 39 to 70%.
  • the composition below of the fruit shows its richness in sugar, the total soluble solids are between 12 and 17 ° Brix, glucose and fructose being the predominant carbohydrates.
  • This fruit contains a small amount of proteins and lipids; but it is rich in essential amino acids, in vitamins in particular ascorbic acid, in mineral elements especially calcium, potassium and magnesium, in antioxidants and in dietary fiber.
  • the pH varies between 5.6 and 6.5 in ripe fruit, resulting in very low acidity. It is a non-climacteric fruit, it has a low respiration rate and low ethylene production, therefore the nutrient concentrations, fruit pH, acidity and total soluble solids do not vary during storage.
  • Fruit Composition Water (87%), Proteins (1.1%), Carbohydrates (13%), Calories (53 Kcal), Lipids (0.8%), Calcium (60 mg), Phosphorus (28 mg), Iron (1.9 mg), Sodium (5 mg), Potassium (220 mg), Magnesium (85 mg), Vitamin A (330 IU), Vitamin B1 (0.1 mg), Vitamin B2 (0.3 mg) , Vitamin PP (0.4 mg), Vitamin C (22 mg), Tannin, Mineral salts., Mucilage, Sugar (7 mg), Pectin (R), Organic acids
  • the prickly pear is a fruit of multiple uses and a wide range of products and by-products can be derived from it. Considered an important source of bioactive substances, this fruit shows promising functional characteristics for health. It is currently transformed into several products in the food, cosmetic and pharmaceutical industries. This fruit can also be processed to prepare confectionery, syrups, spreads, jams, liquid sweeteners or jellies. Natural prickly pear juice is sold as a drink rich in vitamin C, flavonoids and anti-oxidants. Fermentation is also part of the transformation process of cactus fruit, it is used to produce vinegar, wine and alcoholic beverages ; the most traditional drink made in Mexico with the juice of the cactus fruit is colonche.
  • the mucilage which accounts for about 34% of the dry weight of cladodes reduces the accessibility of polysaccharides to hydrolysis and consequently reduces the overall yields of sugars.
  • Another drawback associated with this pre-treatment and hydrolysis step is the regeneration of fermentation inhibitor by-products which lead to low ethanol yields.
  • the high moisture content of the cladode leads to a dilution of the sugar concentration; a probably cost-effective way to remove moisture would be drying, which is an additional expense.
  • the documents presented in the state of the art are research work (articles and patents), concerning the production of bioethanol from the cladodes of the Opuntia ficus-indica cacti. This research concerns either the optimization of the pre-treatment and enzymatic hydrolysis step of cladodes or the optimization of the fermentation mode.
  • the fruit of Opuntia ficus-indica is the subject of a basic substrate to constitute a medium of complete chemical composition, containing all the necessary elements (sugars, vitamins and mineral elements) for the right yeast development.
  • Said medium is devoid of any growth inhibitors, it will be used for the culture of yeasts, it will also serve as a substrate for fermentation by the yeasts at different temperatures. On said medium, the yeasts show a very high growth rate and fermentation power.
  • This work addresses the production of wine from Opuntia ficus-indica cactus fruit juice by Saccharomyces cerevisiae, at 30 ° C, during a 6-day fermentation.
  • the wine produced has an acidity of 12.39 ⁇ 1.32 g / L, tartaric acid equivalent (TTAE), an alcohol content of 9 ⁇ 0.31%, (v / v) an antioxidant concentration of 235 , 3 ⁇ 9.15 mg / L AAE (ascorbic acid equivalent), and a sensory acceptance of 7.74 ⁇ 0.34.
  • This research concerns the production of a wine that preserves the particular and unique characteristics of traditional products from prickly pears.
  • the process is carried out with alcoholic fermentation at 20 ° C for 240 h by a mixed culture of Pichia fermentans and Saccharomyces cerevisiae, followed by malolactic fermentation at 16 ° C for 192 h by Oenococcus oeni.
  • the product obtained is characterized by a better perception of aromas and a velvety sensation.
  • This work relates to the optimization of a hydrolysis process dilute acid cladodes from Opuntia ficus-indica using response surface methodology.
  • the result of this optimization shows a production of 20,825 mg mL 1 of total reducing sugars in a reaction time of 27.25 minutes with a 3.46% sulfuric acid solution.
  • the main sugars obtained in the hydrolysis are galactose (57.14%), arabinose (20.51%), glucose (13.18%) and xylose (9.17%).
  • the present invention relates to a process for producing fermented prickly pear wine. This process involves enzymatic hydrolysis of the cactus fruit, followed by fermentation by a mixture of bacteria at low temperature.
  • the invention is based on the application of a number of techniques of mechanical pretreatment, acid thermochemical pretreatment, simultaneous saccharification and fermentation (SSF) and distillation to completely hydrolyze the sugars of the cactus lignocellulosic matrix and convert them. in second generation bioethanol
  • the invention describes a process for producing alcohol from pretreated lignocellulosic materials, comprising at least the following stages: a) a stage of enzymatic hydrolysis of said pretreated lignocellulosic materials using, as a mixture, cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes from the microorganism Trichoderma reesei and proteins from the fungus Podospora anserina; b) a step of alcoholic fermentation by an alcohologenic microorganism of the hydrolyzate resulting from step a) and obtaining a fermentation must and c) a step of separating the alcohol from the fermentation must.
  • the present invention describes a process for producing alcohol from pretreated lignocellulosic biomass in which the enzymatic hydrolysis step is carried out with cellulolytic and / or hemicellulolytic enzymes produced using at least one effluent obtained from another process of ethanol production using a sugar plant as raw material.
  • cladodes are modified stems of flattened shape, covered with a cerous cuticle (the cutin), which limits perspiration; thorns and glochids are planted on the cladodes.
  • the flowers are most often differentiated at the top of the cladodes, they are flowers with an inferior, unilocular ovary.
  • the pistil is surmounted by a multiple stigma.
  • the stamens are very numerous.
  • the sepals are inconspicuous and the petals are clearly yellow-orange in color.
  • the fruit, or prickly pear is a fleshy berry, unilocular, with many seeds (polyspermal) whose weight can vary from 150 to 400 g. It derives from the inferior ovary adherent to the floral receptacle. Its color is variable according to the varieties: yellow, red, white ...
  • the shape is also very variable, not only according to the varieties but also according to the time of formation, the first ones are rounded, the later ones have more an elongated shape. of peduncle. The number of seeds is very high, around 300 for a 160 g fruit.
  • Fig 2 is an illustration of the generic diagram of the main stages in the preparation of a culture medium for yeasts and of a fermentation substrate by yeasts whose composition is based on the cactus fruit, for the production biomass of yeasts, proteins, lipids, enzymes, biofuel and renewable chemicals according to the following steps:
  • Step 1 peeling, mechanical pressing of the pulp of the cactus fruit and collecting [a] juice from the cactus fruit and a puree of cactus fiber;
  • Step 2 mechanical treatment of the bark and the fibers resulting from pressing the pulp to obtain a suspension
  • Step 3 acid and enzymatic treatment of said suspension, to hydrolyze the polysaccharides and obtain a [b] hydrolyzate of the bark and fibers of the cactus fruit;
  • Step 4 culture of the yeasts or fermentation by yeasts of the culture medium based on: [a] juice of the cactus fruit and [b] hydrolyzate of the bark and fibers of the cactus fruit;
  • Step 5 recovery of the yeast biomass produced in step (4) and purification of proteins, enzymes, renewable chemicals and biofuel.
  • Figure 3 shows the growth of the yeast strains on the culture medium whose composition is based on the juice of the cactus fruit at different temperatures. According to this photo, all of the yeast strains tested show very significant growth on the medium of the juice of the cactus fruit up to a temperature of 41 ° C. The most resistant even grow at 48 ° C.
  • Figure 4 shows the activity of the pectinase enzyme of the yeast strains that have grown on the culture medium, the composition of which is based on the juice of the cactus fruit at different temperatures.
  • Figure 5 shows the activity of the amylase enzyme of the yeast strains that have grown on the culture medium, the composition of which is based on the juice of the cactus fruit at different temperatures.
  • Figure 7 represents the evaluation of the activity of the phytase enzyme in C. tropicalis YME C24 and Sc. Occidentalis as a function of the temperature on the culture medium whose composition is based on the juice of the cactus fruit supplemented with 5% starch.
  • the graphs in this figure show that the optimum temperature for phytase activity separately secreted by C. tropicalis YMEC24 and Sc. Occidentalis is maximum at 65 ° C and 60 ° C respectively.
  • Fig. 8 represents the batch fermentation kinetics of the production of bioethanol from the fermentation medium whose composition is based on the cactus fruit, carried out with K. marxianus at 37 ° C and pH 5. Aliquots of 10 ml are taken aseptically every 4 hours to quantify: (4Q the dry weight, () ethanol and (.4) reducing sugars.
  • the graphs in this figure illustrate cell growth and ethanol production in the fermentation medium as a function of the consumption of reducing sugars, the three parameters are determined in gL 1 .
  • the appearance of the graphs shows a very active fermentation metabolism of K. marxianus on this substrate, reflected by an early and exponential production of ethanol and a rapid consumption of sugars.
  • the maximum quantity of ethanol 41 gL 1 is reached after 12 hours of fermentation.
  • Fig 9 is a three-dimensional representation of the interaction of the effect of pH and temperature on the production of bioethanol from the fermentation medium whose composition is based on the cactus fruit by K. marxianus, (The quantity of added nitrogen is set at level coded 0). According to this graphic representation, the interaction between the two factors having significant effects on the production of ethanol, the maximum amount of this metabolite is obtained at a temperature between 36 and 41 ° C, and a pH between 4 and 6.
  • the appellation prickly pear is the fruit of cactus or cactus berry: a berry, in botany, is a type of fleshy fruit, generally indehiscent and containing one or more seeds, the pips.
  • the cladodes are commonly called “snowshoes” they are the modified rods of flattened shape.
  • YPA medium 1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v) peptone and 9% (w / v) starch
  • YPS medium 1% (w / v) yeast extract, 2% (w / v) peptone and 15% (w / v) sucrose
  • PGA solid medium Yeast extract 0.4g, MgSCL IM 1ml, PGA 2.5g, (NfL ⁇ SCL 10% 5ml, Glycerol 2g, Agar-agar 12g, distilled 3 ⁇ 40 800ml.
  • PGA buffer Na H2PO 43g, Na2HP 04 0.14g, distilled 3 ⁇ 40 200ml.

Abstract

L'invention concerne un procédé de constitution d'un milieu de culture pour les levures et de fermentation par des levures à base du fruit d'un cactus Opuntia sp; de préférence Opuntia ficus-indica, communément appelé "figue de barbarie". Ledit milieu est compatible avec la production industrielle et présente une efficacité applicative, c'est-à-dire une efficacité satisfaisante dans des applications et utilisations intéressants l'industrie des levures, telles que, la production de biomasse levuriène, de biocarburants, d'enzymes, de lipides et de produits chimiques renouvelables. Le procédé tel qu'il est décrit dans la présente invention comprend les étapes illustrées dans la figure 2. L'invention porte également sur la production à partir du milieu dont la composition est à base de fruit de cactus, de biocarburants de première et de deuxième génération par fermentation à différentes températures en utilisant des levures conventionnelles ou non conventionnelles.

Description

Bioprocédé de préparation âhm milieu de culture à partir du fruit de cactus du genre Opuntia pour la production de biomasse de levures, biocarburants, protéines, et produits chimiques renouvelables
DOMAINE ET RENDEMENT DE L’INVENTION
La présente invention est intéressante pour tout domaine d'application dans lequel on a besoin de levures. Elle se rapporte au domaine de constitution de substrat de culture et de fermentation pour les micro-organismes, notamment les levures. Elle concerne particulièrement un substrat riche en sucres, éléments minéraux variés, vitamines et facteurs de croissance pour la production de levures aptes à l’utilisation industrielle telles que, la production de biomasse de levures pour la panification, la production d’arômes, d’enzymes, de protéines, de lipides, d’extrait de levures et d’éthanol.
L’invention entre également dans le domaine des bioénergies pour la production de biocarburants de première et de seconde génération à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus à différentes températures.
En outre, l’utilisation d’une telle matière première abondante et bon marché, montre selon la présente invention des effets puissants. Les plus importants sont, les rendements élevés de levure et /ou de bioéthanol compatibles avec une exploitation économique et industrielle, un coût de production réduit et une disponibilité plus aisée de cette ressource par rapport aux substrats conventionnels utilisés actuellement dans l’industrie de production de biomasse de levures, de protéines, d’enzymes, de lipides, de biocarburants et de sous-produits chimiques renouvelables. Cette invention permettra la création d’une bio-industrie multivalente, la réduction du coût de production des enzymes ; comme elle peut également assister la sécurité énergétique renouvelable, réduire les émissions de gaz à effet de serre et la désertification.
CONTEXTE DE L’INVENTION
La capacité des levures à effectuer une conversion rapide et efficace des sucres ou des hydrates de carbone en éthanol, glycérol, dioxyde de carbone, acides et/ou biomasse, a fait de ces microorganismes l’un des groupes les plus exploités par l’homme. Elles sont utilisées comme facteurs de fermentation, (Production des levures et ferments pour la préparation du pain, des fromages et des boissons alcoolisées ...) et produites en tant que telles. Leur composition chimique, très abondante en protéines (45-50%) de haute valeur biologique, en vitamines et en facteurs de croissance, les font aussi considérer comme un aliment de grande valeur nutritive, ce sont des Protéines d'Organismes Unicellulaires ou Single Cell Protein (S.C.P.). Leur richesse en lysine les rapproche des protéines animales. Elles sont utilisées dans l’alimentation animale pour remplacer progressivement le soja et en alimentation humaine comme supplément protéique. Dans le secteur chimique et pharmaceutique, les levures deviennent de plus en plus importantes pour produire des vitamines, des antibiotiques et divers produits tels que les stéroïdes et les protéines hétérologues (insuline, antigène de surface de l'hépatite B, alpha-amylases, cellulases, albumine de sérum humain, etc.).
Les exigences nutritionnelles des levures peuvent varier sur un plan quantitatif selon qu’on demande à la levure de fermenter (production de bioéthanol) ou de se multiplier végétativement pour produire de la biomasse. Le milieu de culture, sert de support pour la croissance et la production de métabolites, en apportant les éléments essentiels au bon développement (synthèses cellulaires et besoins énergétiques). Le carbone est le composé majeur de la cellule de levure, il est également utilisé comme source d’énergie. La capacité des levures à utiliser certains composés carbonés varie suivant les espèces et les souches. Les glucides simples sont les plus fréquemment utilisés, les mono et disaccharides sont métabolisés par un grand nombre de levures, par contre, les pentoses et les polysaccharides ne sont assimilés que par une minorité d’espèces. Les composés azotés réduits et le phosphore sont utilisés par les cellules de levures dans la biosynthèse des acides aminés, des acides nucléiques et de certaines vitamines. Les éléments minéraux variés, vitamines et facteurs de croissance sont indispensables pour la croissance des levures et à l'optimisation d'un meilleur rendement en biomasse. Les besoins des levures en ces facteurs varient quantitativement et qualitativement suivant les espèces et les souches.
La richesse des mélasses en sucres simples glucose et fructose (80 à 90°Brix), en composés organiques et en composés minéraux, a fait de cette biomasse un substrat de choix pour la production des levures à l’échelle industrielle ; mais ils existent plusieurs défis qui rendent la production sur les plans économique et technique plus complexe et onéreuse. Parmi ces défis, on cite :
- la nécessité de la supplémentation des mélasses en azote ammoniacal assimilable et quelques oligo-éléments et vitamines ;
- Le traitement et la clarification des mélasses pour éliminer la matière colloïdale et les impuretés ;
- L’élimination de toxiques : fongicides, ammoniums quaternaires, sulfites, excès de sodium, et d'autres éléments à l'état de traces provenant des bio acides utilisés pendant la culture des betteraves et de la canne ou du procédé d’extraction du sucre comme par exemple, les acides acétique, propionique, butyrique, formique et valérique, qui rendent la production des levures plus complexe et très onéreuse ;
D’un autre côté, l’exploitation massive des mélasses dans le domaine des bioénergies pour la production du biocarburant de première génération a provoqué une augmentation de son prix et sa raréfaction.
D’autres substrats sont utilisés aussi pour la production de levures et des biocarburants, tels que le lactosérum des fromageries ou les eaux résiduaires de papeterie. Néanmoins, ces derniers nécessitent une hydrolyse préalable des glucides pour les rendre assimilables par les levures. Il est de ce fait nécessaire de trouver de nouveaux substrats carbonés, plus économiques et potentiellement viables. En effet, plusieurs programmes de développement actuels s’intéressent aux biomasses amylacées et lignocellulosiques. Ces deux types de biomasses représentent les ressources de bioénergies les plus abondantes sur terre et certainement les moins coûteuses. L’optimisation de leurs conversions en éthanol à usage carburants de première et de deuxième génération respectivement a fait l’objet de plusieurs travaux de recherche. Ainsi, les principaux verrous technologiques de la conversion de ces deux types de biomasses en bioéthanol sont le coût élevé des enzymes hydrolytiques, l'augmentation de la température de fermentation, les mauvais rendements de conversion des pentoses issus de la fraction hémicellulosique et la régénération des inhibiteurs de la fermentation. L’adoption du procédé de Saccharification et Fermentation Simultanées (SSF) est l’une des solutions les plus adéquates. En effet, ce procédé combine en une seule étape, l'hydrolyse enzymatique du substrat et la fermentation des sucres produits. Il est réalisé par des souches de levures capables de fermenter les deux sucres à la fois, le glucose et le xylose. Son inconvénient est lié aux différences entre les températures optimales des enzymes de saccharification (45 à 50°C) et celles des levures (28 à 37°C) (agents de la fermentation), conduisant ainsi à un faible rendement. La recherche donc de microorganismes conservant de bonnes performances fermentaires aux températures élevées comprises entre 40 et 50°C est un facteur primordial dans la résolution de cette problématique.
Une collection de souches de levures performantes en termes de résistance à la température, aux inhibiteurs et à l’alcool, a été utilisée dans les procédés de culture et de fermentation d’un milieu dont la composition est à base du fruit de cactus décrit dans la présente invention. Les deux procédés, culture et fermentation, aboutissent à la production de biomasse de levures, de biocarburants de première et de seconde génération avec coproduction de molécules d'intérêts (protéines, lipides, enzymes, arômes et produits chimiques renouvelables) à différentes températures. Ces levures conventionnelles et non conventionnelles appartiennent aux genres Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida, Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, Issatchenkia et Hensunella.
En mettant donc de plus en plus l’accent sur futilisation de biomasses peu coûteuses et non compétitives aux denrées alimentaires dans les différents secteurs de la biotechnologie industrielle, l’utilisation de bioraffinerie pour l'exploitation des plantes résistantes, aux usages multiples telles que le figuier de Barbarie ( Opuntia spp.), constitue une voie prometteuse pour intégrer aussi bien l'extraction d’une variété de produits chimiques à haute valeur ajoutée que la production de biocarburants. En effet, les espèces Opuntia ont développé des adaptations anatomiques, morphologiques et physiologiques pour croître et survivre dans des environnements arides où de sévères stress hydriques entravent la survie d’autres espèces de plantes. Le Métabolisme Acide Crassulacée (CAM) des Opuntia, leur permet d’utiliser l’eau bien plus efficacement que les plantes C3 et C4 en ce qui concerne l’assimilation du CO 2 et la productivité. La production de biomasse par unité d’eau est en moyenne 5 à 10 fois plus élevée que pour les plantes C4 et C3. En outre, sa culture est peu exigeante en investissements et permet la diversification des activités génératrices de revenu. L’intérêt grandissant pour cette plante est attribué à ses impacts écologiques, socio-économiques et environnementaux, tels que la lutte contre l'érosion et la désertification, la séquestration du carbone, la conservation de la biodiversité et des habitats pour la faune sauvage. Au sein du genre Opuntia, l’espèce la plus cultivée est Opuntia ficus-indica, caractérisée par un potentiel très élevé de productivité en fruits appelés figues de barbarie et en ressources fourragères. Grâce à la teneur élevée des figues de barbarie en éléments essentiels au bon développement des levures et aussi en sucres simples facilement assimilables et fermentables par toutes les espèces de levures ; elles représentent dans cette invention une matière première de choix pour la constitution d’un milieu hautement efficace pour assurer la culture des levures et la fermentation par les levures. Les deux procédés culture et fermentation, aboutissent à la production de la biomasse de levures, de protéines, de lipides, d’enzymes, du biocarburant et d'autres produits post fermentaires utilisées dans les différents domaines de la bio-industrie.
La capacité des levures à fabriquer, dégrader ou transformer divers variétés de substrats, réside essentiellement dans leur aptitude à produire un grand nombre d’enzymes nécessaires à leur croissance. Ces enzymes bénéficient d'un marché en perpétuelle croissance. Ce sont des protéines qui en raison de leurs propriétés spécifiques participent à la synthèse de molécules. Elles permettent à des réactions de se produire des millions de fois plus vite qu’en leur absence. Dans des conditions particulières, elles rendent possible de nombreux processus. Elles sont utilisées comme produits finaux, mais aussi comme agents de production industrielle. Les enzymes trouvent de multiples applications dans des secteurs variés, tels que l’industrie pharmaceutique, l’agroalimentaire, les tissus, la papeterie, les produits domestiques ou encore les biocarburants.
Les biocarburants sont motivés par les enjeux environnementaux et socioéconomiques. Ils sont obtenus à partir des différents types de biomasses. Ainsi, une première génération de biocarburants est produite à partir des plantes sucrières (canne à sucre, betterave à sucre) riches en sucres simples directement fermentables et des plantes céréalières riches en amidon. L’industrie de cette génération dépend primordialement, des amylases (a amylase et glucoamylase), nécessaires à l’hydrolyse de la biomasse amylolitique. Cette génération est sérieusement contestée à cause de son impact négatif sur les surfaces cultivées ou d’élevage nécessaire à l’alimentation humaine. Pour pallier ce problème, des agro carburants de deuxième génération se sont développés à partir des matériaux lignocellulosiques dérivés de plantes. Ces matériaux sont constitués de cellulose, d'hémicellulose et de lignine. Les enzymes qui interviennent dans la dégradation complète de la cellulose sont : l’endo- b-1 ,4-D- glucanase, l’cxo-b-I ,4-D-glucanasc (encore appelée cellobiohydrolase) et la b-glucosidase. Alors que celles qui hydrolysent les pectines sont les pectates lyases, les pectinases, les pectines estérases et les polygalacturonases. Les principales enzymes chargées de la dégradation de la lignine sont les peroxydases et les laccases. La biomasse algale à son tour représente une riche ressource de bioénergie. Elle est conçue comme une matière première renouvelable pour la production d’une troisième génération de biocarburants. La croissance de cette biomasse photosynthétique aquatique dans des bassins des eaux usées riches en éléments minéraux, prévient la compétition avec les surfaces agricoles, ainsi que l’utilisation des engrais et leurs effets néfastes. Leur productivité à l’hectare, est largement supérieure à celle des plantes terrestres.
Le biocarburant le plus utilisé à l’échelle mondiale est le bioéthanol. C’est de l’alcool éthylique produit par le procédé de la fermentation alcoolique. Selon ce procédé, les cultures de biomasses subissent une fermentation par des levures, suivit d’une distillation. Le rendement énergétique d’un biocarburant est d’autant positif qu’il restitue plus d'énergie qu'il n'en faut pour le produire. La levure est l’élément essentiel du processus chimique de la fermentation de la matière première en éthanol, mais à l’échelle industrielle, la plupart des levures traditionnelles ne sont pas capables de transformer en éthanol tous les types de sucres, surtout ceux qui constituent la biomasse lignocellulosique. L’hydrolyse de cette biomasse en sucres fermentables est l’étape limitante de la production de biocarburants de seconde génération. A cause du coût élevé des enzymes hydrolytiques, cette étape représente environ 50% du prix de revient de l'éthanol issu de cette biomasse. Les principales voies de recherches sont en cours de débloquer certains verrous technologiques et économiques. Elles portent essentiellement sur l’amélioration de l'activité des enzymes hydrolytiques (amylases et cellulases) et sur l’amélioration génétique des souches de levures, de telle sorte que celles-ci deviennent capables de métaboliser un large spectre de carbohydrates. Cependant, leur rendement sur des substrats constitués de sucres en C5 est très minime. L’ensemble des enzymes intervenant dans l’hydrolyse des biomasses amylolitique et lignocellulosique sont disponibles dans le commerce sous forme purifiée, mais ont l’inconvénient d’être onéreuses. Il existe donc un besoin de disposer d’une procédure plus économique à échelle industrielle, permettant de produire ces enzymes à coût réduit.
La majorité des espèces de levures de notre collection sont pourvues d’une ou de plusieurs activités enzymatiques. Elles sont utilisées dans la présente invention pour décrire un procédé de coproduction d’enzymes avec la production de biomasse de levure et /ou de bioéthanol à partir du milieu de culture ou de fermentation dont la composition est à base du fruit de cactus.
MODES DE REALISATION DE L’INVENTION
L’expert du métier connaît que la description de cette invention est soumise à des variations et à des modifications autres que celles décrites spécifiquement. Il faut savoir que l’invention décrite ici comprend toutes ces variations et modifications. L'invention comprend également toutes les étapes, les caractéristiques, les compositions et les composés mentionnés ou indiqués dans cette spécification individuellement ou collectivement et toutes les combinaisons de deux ou de plusieurs de ces étapes et des caractéristiques.
Le terme «figue de barbarie» ou « fruit de cactus » utilisé ici, englobe le fruit obtenu à partir de plantes de cactus appartenant au genre Opuntia, et qui est composé de diverses espèces, y compris O. ficus indica, O. vulgais, O. abjecta, O. camanchia, O. chlorotica, O. compressa, O. cymochila, O. dillenii, O. engelmanni, O. gosseliniana, O. megacanta, O. monacantha, O. nichollii, O. phaeacantha, O. Pinkavae, O. polyacantha, O. streptacantha Lemaire, O. stricta, O. indheimeri Engel, O. robusta Wendland, O. tortispina, O. bakeri, O. aciculata, O. aquatorialis, O. zebrine, O. basilaris, O. dulcis, O. page, O. macrocenta, O. discata, O. rastrera, O. humifusa.
La présente invention concerne un procédé rentable, évolutif, durable et reproductible pour la préparation d’un milieu de culture et de fermentation dont la composition est à base du fruit d’un cactus Opuntia sp ; de préférence Opuntia ficus-indica, pour la production de biomasse de levures, d’enzymes, de protéine, de lipides, de biocarburants et de sous-produits chimiques renouvelables.
L'invention concerne encore la production à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, une biomasse de levures intéressantes dans la panification, la production d’enzymes telles que les amylases, pectinases, invertases, laccases, peroxidases, phytases, proteases et les endoglucanases, la production de métabolites secondaires comme l’acide acétique et l’acétaldéhyde, la production de protéine pour l’alimentation animale et aquaculture, la production de bioéthanol, des lipides, d’extrait de levure et des arômes tels que l’ethyl acetate, l’ethyl lactate, 1’ hexyl acetate, (E)-2-nonenal, et 2-pentylfuran.
Opuntia ficus-indica, est caractérisée par un potentiel très important de productivité en fruits. Les rendements peuvent dépasser 25 tonnes /hectare. Ses fruits sont juteux, qualifiés d’une valeur nutritionnelle remarquable. Ils sont très riches en sucres (glucose, fructose) facilement assimilables et fermentables par toutes les espèces de levures. De plus les concentrations en nutriments, le pH du fruit, l’acidité et les solides solubles totaux ne varient pas pendant le stockage. Ces spécificités constituent des arguments puissants, justifiant que l’exploitation du fruit de cactus dans la présente invention, permettra des rendements meilleurs que les substrats conventionnels utilisés actuellement dans l’industrie de production de biomasse de levures, de protéines, d’enzymes, de lipides, de biocarburants et de sous-produits chimiques renouvelables.
Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un milieu de culture dont la composition est à base du fruit de cactus, sous forme liquide ou solide en poudre séchée, ayant une concentration en sucres totaux très variable de 60 à 177 gL 1, pour la production de biomasse de levures, d’enzymes, de protéine, de lipides, de biocarburants et de sous-produits chimiques renouvelables.
Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit un procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation dont la composition est à base du fruit de cactus (Opuntia sp .) pour la production de biomasse de levures, de protéines, d’enzymes, du biocarburant et d’autres produits post fermentaires selon l’une quelconque des revendications dans lequel, il y a pressurage mécanique des fruits de cactus entiers (écorce et pulpe) suivit par des traitements mécaniques, thermochimiques, acides et enzymatiques ; l’hydrolysat du fruit de cactus entier obtenu et sa poudre séchée serviront pour la composition d’un milieu de culture et d’un substrat de fermentation pour la production de biomasse de levures, de protéines, d’enzymes, du biocarburants sous forme de bioéthanol de deuxième génération ainsi que des sous-produits chimiques renouvelables.
Un autre mode de réalisation de la présente invention, consiste à démontrer l’efficacité de l’utilisation de la Méthodologie de Surface de Réponse (RSM) dans l’optimisation des paramètres pour une production maximale d'éthanol à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus. Ainsi, il a été démontré que selon la teneur en solides solubles présent dans le jus du fruit de cactus la quantité d’éthanol produite par des levures varie entre 40 et 63 gL 1 après 12 heures de fermentation à 37°C et pH 5. Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, les teneurs en solides solubles et en sucres réducteurs du jus du fruit de cactus varient respectivement selon le degré de maturité du fruit entre 14 -17°Brix et 60 - 177 gL 1. L’acidité totale du jus de fruit de cactus exprimée en pourcentage du poids d’acide citrique monohydraté varie entre 0,07% et 0,2%.
Dans un autre mode de réalisation de la présente invention, le prétraitement de la biomasse cellulosique de l’écorce du fruit de cactus peut être réalisé par différents procédés thermochimiques de prétraitement connus : le prétraitement à l’acide dilué (DAP), le prétraitement de l'explosion à la vapeur (SEP), l'organosolv, le prétraitement liquide à l'eau chaude (LHW), l'expansion de fibre d'ammoniac (AFEX), le trempage dans de l'ammoniaque (SAA), le prétraitement au sodium hydroxyde et l’ozonolyse.
Un autre mode de réalisation de la présente invention, consiste à hydrolyser la biomasse cellulosique de l’écorce du fruit de cactus prétraitée avec des mélanges enzymatiques, permettant la libération des sucres simples fermentables. Lesdits mélanges enzymatiques, comprennent des activités pectinase, endocellulase, exocellulase, glucosidase, phénol oxydase et xylanase.
La présente invention consiste à produire à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus la biomasse de levures, les protéines, les enzymes, les lipides, les biocarburant et des produits chimiques renouvelables en utilisant des espèces de levures sélectionnées dans les genres exemplifiés mais sans s'y limiter à Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, sous-tropicales (maltosa) et utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, Issatchenkia et Hensunella.
Un autre mode de réalisation de la présente invention, consiste à produire à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, la biomasse de levures, les protéines, les enzymes, les lipides, le bioéthanol et des produits chimiques renouvelables par la levure thermorésistante, éthanolique, Kluyveromyces marxianus, ayant la capacité de produire du bioéthanol à des températures comprises entre 25 et 45°C.
La présente invention consiste à produire à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus la biomasse de levures, les protéines, les lipdes, les enzymes et le biocarburant, en utilisant des espèces de levures natives ou modifiées génétiquement par des approches non- OGM (par mutagénèse) et OGM (par intégration multi-copies dans le génome des gènes d’intérêt), sélectionnées à partir des genres de levures mentionnées ci-dessous, individuellement ou en cocultures, Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, sous- tropicales (maltosa) et utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis et Hensunella.
La présente invention consiste à produire à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, la biomasse de levures, les enzymes et le biocarburant par un procédé de fermentation désigné dans le groupe exemplifié mais sans s'y limiter à un procédé de fermentation en batch, en feed-batch, et en continue, par des levures natives ou modifiées génétiquement par des approches non-OGM (par mutagénèse) et OGM (par intégration multi- copies dans le génome des gènes d’intérêt), individuellement ou en co-cultures avec des microorganismes producteurs de cellulases choisis dans les groupes de champignons filamenteux, bactéries ou levures. Le bioéthanol et les sous-produits de fermentation sont récupérés par des méthodes connues par l’expert du métier.
Un autre mode de réalisation de la présente invention, concerne la production de biomasse de levures, de protéines, de lipides, d’enzymes et de biocarburants par fermentation à l'état solide en utilisant des substrats de culture à faible quantité d’eau (réduction de l’activité de l'eau). Le milieu est saturé d'eau, mais avec un minimum de flux du fluide. Le milieu solide comprend le fruit de cactus traité mécaniquement et placé sur un support solide, sur lequel se déroule la fermentation par des levures natives ou modifiées génétiquement par des approches non-OGM (par mutagénèse) et OGM (par intégration multi-copies dans le génome des gènes d’intérêt), individuellement ou en co-cultures avec des microorganismes producteurs de cellulases choisis dans les groupes de champignons filamenteux, bactéries ou levures. Le bioéthanol et les sous-produits de fermentation sont récupérés par des méthodes connues par l’expert du métier.
Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit la matière première pour la constitution de milieux de cultures de laboratoire ou industriel, dont la composition est à base du fruit de cactus dans lequel lesdits milieux de culture de laboratoire ou industriel, permettent la multiplication des champignons et des levures dans le but de récupérer un composé désigné dans le groupe exemplifié mais sans s'y limiter à une biomasse cellulaire, single-cell- protein, une protéine, une enzyme, un lipide, un bio-hydrocarbure, un métabolite secondaire, un produit bioactif, et une vitamine.
Un autre mode de réalisation de la présente invention fournit la matière première pour la constitution de milieux de cultures de laboratoire ou industriel, dont la composition est à base du fruit de cactus dans lequel lesdits milieux de culture de laboratoire ou industriel permettent la multiplication des espèces de levures désignées dans le groupe exemplifié mais sans s'y limiter aux genres suivants : Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida (tropicalis, sous-tropicales (maltosa) et utilis), Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, Issatchenkia et Hensunella.
Bien que des modes de réalisation spécifiques de la présente invention aient été décrits dans les exemples, il est évident que des modifications et des adaptations de la présente invention apparaîtront à l’expert de l'art. Les modes de réalisation de la présente invention ne sont pas destinés à être limités par les exemples. Il doit être expressément compris que de telles modifications et adaptations qui apparaîtront à l’expert dans le métier entrent dans le cadre de la présente invention, comme indiqué dans les revendications ci-dessous. Par exemple, des caractéristiques illustrées ou décrites dans le cadre d’un mode de réalisation peuvent être utilisées dans un autre mode de réalisation, pour donner un autre mode de réalisation supplémentaire. Ainsi, il est prévu que la présente invention couvre de telles modifications et variations entrant dans le cadre des revendications et de leurs équivalents.
EXEMPLES
• Exemple 1 : Préparation du jus de fruit de cactus
Illustré sur figure 2 Les fruits de cactus utilisés dans cette étude, sont des cultivars Moussa, une variété de l'espèce Opuntia ficus indica, recueillis de la région d’Aït Bâamrane dans le sud du Maroc. Après lavage, les fruits avec ou sans écorce sont soumis à un traitement mécanique (pressurage), suivit d’une filtration. Le jus du fruit de cactus résultant [a], est un élément de base pour la constitution des milieux de culture et de fermentation.
L’écorce du fruit et la purée de fibre résultante de la filtration sont soumises à un traitement mécanique suivit d’une hydrolyse légère chimique et/ou enzymatique, l’hydrolysat obtenu [b], est un constituant de base des milieux de culture et de fermentation.
Après autoclavage à 110°C pendant 15mn des milieux de cultures et des milieux de fermentation issus du [a] jus du fruit de cactus ou du [b] hydrolysat de l’écore et des fibres du fruit de cactus, ces derniers sont utilisés soit sous formes brutes ou avec certaines adéquations dans les différentes expériences selon leurs spécificités.
• Exemple 2 : Caractérisation physico-chimique du fruit de cactus
Tableau 1 : Caractérisation physico-chimique des échantillons du fruit de cactus
Figure imgf000011_0001
a) Mesure du pH
La mesure de la valeur du pH du jus du fruit de cactus étudié est effectuée par un pH-mètre, préalablement étalonné par des solutions tampons de pH égal à 4 et à 7.
La valeur du pH des échantillons mesurés varie entre 4.5 et 5.5. b) Mesure de V acidité
L’échantillon du jus du fruit, est titré par une solution d’hydroxyde de sodium (NaOH) 0,01N, en présence de phénolphtaléine. La zone de virage de l’indicateur a été alors déterminée. Elle est exprimée en milliéquivalents d’acide par litre du jus.
La valeur de l'acidité titrable varie de 0,07% à 0,2%. c) Détermination de la teneur en solide soluble total
La teneur en solides solubles du jus du fruit est mesurée avec un réfractomètre à main (ATAGO) à 20 °C, elle varie entre 14 et 17 °Brix selon le degré de maturité du fruit. d) Dosage des Sucres réducteurs La teneur en sucre réducteur est quantifiée par un dosage colorimétrique avec l'acide 3.5- dinitrosalicylique (DNS), la courbe standard est établie à partir d’une gamme étalon d’une solution de glucose avec une concentration qui varie de 0,1 à 1 gL , (R = 0,987).
La quantité de sucre dans les échantillons des jus de fruits dosés varient de 60 à 177 gL 1 selon les échantillons et la maturité du fruit. e) Dosage de protéines totales
Le principe est la détermination de l'azote total, il est réalisé par la méthode (Paterson, 1983), la gamme étalon est préparée par la BSA O.lmg L 1.
La teneur en protéines totaux dans l’échantillon dosé est de 13.6 mgL 1
• Exemple 3 : Croissance des souches de levures sur milieu dont la composition est à base du fruit de cactus à différentes températures
Illustré sur figure 3
La croissance des souches de levures est réalisée sur des boites de pétri, contenant le milieu dont la composition est à base du fruit de cactus solidifié par l’addition de 2% d’agar et stérilisé à l’autoclave à 110°C pendant 15 mn. Les boites sont ensemencées par des spots de souches de levures et incubées pendant 48h à différentes températures : 37°C, 41°C, 45°C et 48°C.
• Exemple 4 : Révélation de l’activité pectinase
Illustré sur figure 4
La pectinase est un terme générique pour désigner une combinaison d’enzymes qui participent à l’hydrolyse de la pectine. La pectine un polysaccharide présent dans les parois cellulaires des plantes. Les pectinases sont recommandées en agroalimentaire, en œnologie pour faciliter et augmenter le taux d’extraction ; elles sont utilisées aussi pour clarifier les jus de fruits ou de légumes et diminuer le temps de filtration. Le traitement des pulpes de fruits avec des pectinases permet également d’extraire plus de jus (bananes, raisins, pommes...).
La culture des souches de levures est réalisée sur milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes. Après inoculation, les cultures sont incubées à 37°C pendant 24h et sous une agitation de 300 tr min 1. Les cultures sont centrifugées, la détection de l’activité péctinase des levures obtenues est réalisée par un ensemencement en spot sur des boites contenant le milieu polygalacturonate à 2 % d’agar (PGA). Après 48 h d’incubation à différentes températures (41°C, 45°C et 48°C), l’activité enzymatique est révélée par une solution d’acétate de cuivre à 7.5 % sous forme d’une auréole claire.
• Exemple 5 : Révélation de l’activité amylase
Illustré sur figure 5
Les amylases sont parmi les enzymes les plus importantes et les plus anciennes à l’échelle industrielle, elles hydro lysent l’amidon en dextrines et progressivement en petits polymères composés de quelques unités de glucose. Leur utilisation est de plus en plus développée dans divers secteurs. En effet en biotechnologie, leur action est devenue essentielle dans la fabrication et le perfectionnement de plusieurs produits alimentaires ainsi que dans l’industrie du textile, du papier et du nettoyage (lessive) ; ces enzymes sont aussi introduites dans le domaine médical et celui des analyses chimiques.
La culture des souches de levures est réalisée sur le milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes. Après inoculation, les cultures sont incubées à 37°C pendant 24h et sous une agitation de 300 tr min 1. Les cultures sont centrifugées, la détection de l’activité amylase des souches de levures est réalisée par un ensemencement en spot sur des boites du milieu PDA contenant l’amidon comme source de carbone et incubées pendant 48h. L’imprégnation des boites avec le réactif iodure de potassium, suivit d’un lavage avec l’eau distillée, a permis l’apparition d’auréoles claires révélant l’activité amylolitique des levures.
• Exemple 6 : Cinétique de production de l’activité invertase chez S. cerevisiae YMES2 au cours d’une fermentation en batch
Illustré sur figure 6
L’invertase, est la b-D-fructofuranoside fructohydrolase, sa spécificité est absolue pour le résidu terminal fructofuranoside non substitué ; de ce fait, son action hydrolytique n’est pas limitée au saccharose mais elle inclue aussi le m éth y 1 -b - True to furan o si de, le raffinose, le stachyose et le verbascose. Cette enzyme présente un intérêt capital dans l'industrie alimentaire.
Les cultures sont réalisées dans les conditions optimales de croissance de la souche de levure choisie. Un litre du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, contenu dans un fermenteur de deux litres (RUIAN GLOBAL), stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes est inoculé avec 10 cellules /ml de milieu de culture, puis incubé à 37°C sous une agitation de 250 tr min 1. Au cours de la croissance, des aliquotes de 10 ml sont prélevés toutes les heures dans des conditions stériles. Après centrifugation, l’activité enzymatique des levures est dosée dans le surnageant du milieu de culture et dans les cellules entières.
L’extraction de l’invertase cellulaire est réalisée par la technique décrite par Fischer et al (1952), avec quelques modifications. L’activité saccharolytique est évaluée par le dosage colorimétrique au réactif DNS des sucres réducteurs issus de l’hydrolyse du saccharose. La courbe étalon est établie à partir du mélange équimolaire de glucose et de fructose (0.3 g/l de chaque sucre). Le milieu réactionnel (1 ml) contient 1% de saccharose en tampon acétate de sodium 50 mM pH 6 ; l’initiation de la réaction se fait par addition de 100 mΐ de la fraction à étudier, l’incubation est réalisée à 30°C pendant 5 minutes ; la réaction est bloquée par l’addition de 1.5 ml du réactif DNS. Le mélange est porté à ébullition pendant 10 minutes. Après refroidissement, l’absorbance est mesurée à 640 nm.
Le nombre d’unités enzymatiques (UE) rend compte de l’activité totale, il est défini par la quantité d’enzymes capables d’hydro lyser une micromole de saccharose par minute (ou de libérer deux micromoles d’équivalents réducteurs par minute).
:U mole de saccharose x volume de la fraction active en ml
UE= -
2 x 180 x temps d’in uhationen mm x volume de la fraction testée en ml La représentation graphique montre, une alternance entre les deux formes d’enzymes durant la croissance cellulaire ; le nombre maximal d’unités enzymatiques dans le surnageant (4816 UE /l) est supérieur à celui de la forme cellulaire, il est atteint une heure après le déclenchement de la réaction
• Exemple 7 : Evaluation de l’activité phytase sécrétée par C. tropicalis YMEC24 et Sc. occidentalis ( Debaryomyces occidentalis) à différentes températures
Illustré sur figure 7
La phytase est l’enzyme responsable de l’hydrolyse des phytates ou encore acide phytique, naturellement présents dans les graines de nombreuses céréales et légumineuses. En effet 75% du phosphore des céréales est soit complexé avec des protéines soit sous forme de sel de calcium ou de magnésium non digérable par les animaux monogastriques. L’addition de la phytase aux aliments du bétail hydrolyse les phytates, libère les minéraux et facilite leur assimilation. Elle joue également un rôle écologique, puisqu’elle réduit le rejet des minéraux par les animaux, en particulier le phosphore qui est la cause principale de l’eutrophisation des retenues d’eau.
La purification de la phytase est réalisée selon le protocole suivant :
Les souches de levures sont cultivées séparément sur milieu dont la composition est à base du fruit de cactus supplémenté de 5 % d’amidon, stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes ; puis incubé sous une agitation de 250 tr min 1 à 37 °C pendant 36 h. Un volume de 50 ml de cette culture saturée est centrifugé à 1000 tr min 1 pendant 10 minutes. Le surnageant récupéré est ensuite filtré à travers un filtre de 0,45 micron pour éliminer toutes les cellules restantes après centrifugation. 45ml du filtrat du surnageant sont concentrés à un volume de 0,5 ml par une première dialyse contre le polyéthylène glycol 2000, puis une deuxième dialyse contre une solution froide du CaC 12 ImM. Des aliquotes de 20 mΐ de la solution de protéine concentrée sont appliquée à une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 4%. La phytase purifiée de la souche de levure Schwanniomyces occidentalis de poids moléculaire connu 400 KD a été utilisée comme témoin positif. La révélation de l’activité phytase est réalisée par incubation du gel dans une suspension de phytate à 0,4% pendant une heure à 65 °C. Après incubation du gel dans 2% de Chlorure de cobalte, les bandes de l’activité enzymatique sont révélées par des zones claires.
• Exemple 8 : Cinétique de fermentation en batch de la production du bioéthanol à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus
Illustré sur figure 8
La cinétique de fermentation en batch est réalisée dans un fermenteur de paillasse 2L (RUIAN GLOBAL), contenant 1,3 litre du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus, stérilisé par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes. L’inoculation est faite avec 6 x 10 cellules de levures de K. marxianus par millilitre du milieu de culture et incubé à une température de 37°C, sous une agitation de 450 tr min 1. Des aliquotes de 10 mL du milieu de culture sont prélevés toutes les 4 heures pour évaluer la production de la biomasse, de l'éthanol et des sucres résiduels. Les taux d’éthanol produits sont déterminés par chromatographie en phase gazeuse, ils varient entre 40 et 63 gL 1 selon les concentrations initiales en sucres et aussi selon les souches de levures utilisées. • Exemple 9 : Conception expérimentale et statistique pour l’optimisation de la production d’éthanol
Illustré sur figure 9
Tableau 2 : Valeurs des niveaux réelles et codées des variables indépendantes optimisées
Figure imgf000015_0001
Des expériences préliminaires ont pu montrer que la production d’éthanol à partir du milieu dont la composition est à base du fruit de cactus est influencée par trois variables indépendantes. Afin de déterminer quantitativement l’effet de chacune de ces variables, la Méthodologie de Surface de Réponse (RSM) a été utilisée. Les expériences sont conçues en utilisant un plan Box-Behnken. Les variables indépendantes sont optimisées dans les intervalles suivants : (XI) la température (37°C-45°C), (X2) le pH (3.5-6.5) et (X3) la quantité d’azote ajoutée (0 -IgL 1). La concentration en éthanol (Y, gL 1) constitue la réponse (la variable dépendante). Comme le montre le tableau 1, les niveaux de la variable Xi sont codés comme xi selon l’équation suivante : Xi = (xi. Axj) + X’i, selon laquelle, xi est la valeur codée pour la ième variable, Arj est le pas (variation de la grandeur réelle correspondant à une unité de la variable codée) et Xi’ est la valeur réelle pour la ième variable correspondant à la valeur codée 0 (valeur centrale de la gamme). Les codes -1 et 1 correspondent respectivement au niveau bas et haut du facteur étudié.
• Exemple 10 : Fermentation en batch
Tableau 3 Comparaison du rendement et de la productivité en éthanol sur deux milieux de culture de laboratoire : YPS à 15% de saccharose, YPA à 9% d’amidon traité avec a amylase, YPA à 9% d’amidon non traité par a amylase et le milieu de culture dont la composition est à base du fruit de cactus.
Ethanol (gL 1) YP/S (gr ethanol/gr substrat) Productivité (g L 'H ')
Milieux de
culture c. Sc. s. c. Sc. s. c. Sc. s.
tropicalis occident cerevisiae tropicalis occident cerevisiae tropicalis occident cerevisiae
YPA sans
16.5 11.45 2.89 0.19 0.13 0.02 0.26 0.17 0.03 a-amylase YPA avec
35.5 24.80 11.454 0.4 0.27 0.13 0.54 0.37 0.17 a-amylase
YPS
73.7 76.51 83.26 0.82 0.85 0.93 1.12 1.16 1.26 saccharose 15%
Milieu à base de
76.17 82.12 131.14 0.85 0.91 1.46 1.15 1.24 1.99 fruit de cactus
Une comparaison du rendement en éthanol a été réalisée sur deux milieux de culture de laboratoire YPS à 15% de saccharose, YPA à 9% d’amidon traité par a amylase, YPA à 9% non traité par a amylase et le milieu de culture dont la composition est à base du fruit de cactus. Les fermentations sont réalisées individuellement et en parallèle sur les quatre milieux, dans des erlenmeyers de 100 ml contenant chacun 30 ml de l’un des quatre milieux, stérilisés par autoclavage à 110°C pendant 15 minutes. Chacun des quatre milieux est inoculé individuellement et séparément avec 6 x 10 cellules de levures de S. cerevisiae, C. tropicalis et Sc. Occidentalis . Ils sont ensuite incubés sous une agitation constante de 450 tr min 1 pendant 24 heures. Les résultats du tableau 3 permettent de faire la comparaison des paramètres d’états (le rendement en éthanol et la productivité) aussi bien entre les différents milieux, qu’entre les trois souches. Les meilleurs rendements en éthanol ainsi que les meilleures productivités sont obtenus à partir du milieu à base du fruit de cactus, suivit du milieu YPS. La comparaison des paramètres d’état entre les trois souches cultivées sur les trois milieux, laisse apparaître la performance de S. cerevisiae par rapport à C. tropicalis et Sc. occidentalis dans la fermentation alcoolique d’un milieu dont la composition est à base du fruit de cactus.
• Exemple 11 : Utilisation de souches de levures pour la fermentation des fruits de cactus
L’adoption du procédé de la fermentation aux hautes températures dans les pays à climat chaud tel le Maroc, permet de réduire les coûts de refroidissement et les risques de contaminations microbiennes, elle réduit aussi l'inhibition des activités enzymatiques par les monomères de sucres et les oligosaccharides libérés. Ces effets contribuent à l’augmentation du rendement global en bioéthanol. L’application d’un tel procédé nécessite des souches de levures bien sélectionnées ; pour ce faire, une souche de levure thermorésistante, Kluyveromyces marxianus YMEK23 est utilisée dans la réalisation de cette étude. Elle est reconnue par ses performances dans la production du bioéthanol à des températures supérieures à 40°C alors que sa croissance peut se faire jusqu’à une température de 52°C. Cette espèce est caractérisée par un taux de croissance très élevé et aussi par ses capacités à métaboliser une large gamme de sucres, tels que la cellobiose, le xylose et l'arabinose. ETAT DE L’ART
Le changement climatique et l’augmentation des populations humaines et de bétails requièrent tous une utilisation plus efficace des systèmes en terres arides. Des cultures pérennes adaptées avec une plus forte productivité par unité de surface sont nécessaires pour protéger les systèmes de pâturages naturels de la dégradation. Les Opuntia sont des espèces au métabolisme crassulacée, ayant des mécanismes intégrés leur conférant de l’efficience d’utilisation d’eau, la capacité de croître dans des sols contraignants, et la tolérance au froid et à la chaleur. Les Opuntia et plus particulièrement, Opuntia ficus-indica représentent des cultures bioénergétiques et durables, caractérisées par un potentiel de productivité en fruits très élevé, les rendements peuvent dépasser 25 tonnes par hectare.
Opuntia ficus-indica, est caractérisée par des fruits juteux (87% d’eau), et des pulpes de différentes couleurs à base d’un colorant naturel la bétalaïne, La teneur en pigment varie de 66 à 1140 mg kg 1 de pulpe de fruit. La proportion de la pulpe comestible dans le fruit varie de 39 à 70%. La composition ci-dessous du fruit montre sa richesse en sucre, le total des solides solubles se situe entre 12 et 17°Brix, le glucose et le fructose étant les glucides prédominants. Ce fruit contient une faible quantité de protides et de lipides ; mais il est riche en acides aminés essentiels, en vitamines notamment l’acide ascorbique, en éléments minéraux surtout le calcium, le potassium et le magnésium, en antioxydants et en fibres alimentaires. Le pH varie entre 5,6 et 6,5 dans les fruits bien mûrs, ce qui entraîne une très faible acidité. C’est un fruit non climactérique, il a un faible taux de respiration et une faible production d’éthylène, par conséquent les concentrations en nutriments, le pH du fruit, l’acidité et les solides solubles totaux ne varient pas pendant le stockage.
Composition du Fruit : Eau (87 %), Protides (1,1 %), Glucides (13 %), Calories (53 Kcal), Lipides (0,8 %), Calcium (60 mg), Phosphore (28 mg), Fer (1,9 mg), Sodium (5 mg), Potassium (220 mg), Magnésium (85 mg), Vitamine A (330 Ul), Vitamine B1 (0,1 mg), Vitamine B2 (0,3 mg), Vitamine PP (0,4 mg), Vitamine C (22 mg), Tanin, Sels minéraux., Mucilage, Sucre (7 mg), Pectine (R), Acides organiques
Le figuier de barbarie est un fruit de multiples usages et une large gamme de produits et de sous-produits peuvent en être dérivée. Considéré comme une source importante de substances bioactives, ce fruit montre des caractéristiques fonctionnelles prometteuses pour la santé. Il est transformé actuellement en plusieurs produits dans les industries agro-alimentaires, cosmétiques et pharmaceutiques. Ce fruit peut être transformé aussi pour préparer des confiseries, des sirops, des pâtes à tartiner, des confitures, des édulcorants liquides ou des gelées. Le jus naturel de figue de Barbarie est vendu comme une boisson riche en vitamine C, en flavonoïdes et en anti-oxydants. La fermentation fait partie aussi des procédés de transformation du fruit de cactus, il est utilisé pour produire du vinaigre, du vin et des boissons alcoolisées ; la boisson la plus traditionnelle faite au Mexique avec le jus du fruit de cactus est le colonche. Beaucoup de travaux de recherche à travers le monde ont porté sur l’optimisation des procédés pour la production de vin et de boisson alcoolisée de haute qualité à partir du fruit de cactus. Dans cet état d’art deux articles et un brevet (CN105273934A), concernant l’optimisation de la production de vin fermenté de figue de Barbarie sont cités.
D’après la littérature, tous les travaux de recherches concernant la production de bioéthanol à partir de la plante cactus, sont réalisés tous sur les cladodes comme matière première. A notre connaissance aucun travail de recherche n'a abordé la constitution d’un milieu de culture ou de fermentation pour des applications industrielles ou de laboratoire à partir du fruit de la plante cactus. Sachant que les cladodes de cactus contiennent essentiellement l’hémicellulose, la cellulose, la lignine et le mucilage, plusieurs défis se présentent devant leur utilisation comme matière première pour la production de bioéthanol. Les plus importants sont, la conversion efficace des polysaccharides constituants la cladode en sucres monomères fermentables par les levures. Cette procédure est coûteuse, puisqu’elle implique un prétraitement et une hydrolyse enzymatique. De plus, le mucilage qui représente environ 34% du poids sec des cladodes réduit l’accessibilité des polysaccharides à l’hydrolyse et réduit par conséquent les rendements globaux en sucres. Un autre inconvénient lié à cette étape de prétraitement et d’hydrolyse, c’est la régénération des sous-produits inhibiteurs de la fermentation qui conduisent à de faibles rendements en éthanol. D’autre part la forte teneur en humidité de la cladode entraîne une dilution de la concentration en sucres ; un moyen probablement rentable d'éliminer l'humidité serait un séchage ce qui représente des frais en plus. Les documents présentés dans l’état de l’art sont des travaux de recherches (articles et brevets), concernant, la production de bioéthanol à partir des cladodes de cactus Opuntia ficus-indica. Ces recherches portent soit sur l’optimisation de l’étape de prétraitement et d’hydrolyse enzymatique des cladodes soit sur l’optimisation du mode de fermentation.
La rentabilité de l’industrie des biocarburants dépend grandement du prix en vigueur des ressources en matières premières. Dans l’exemple de bioéthanol de première génération issue de cultures destinées aux denrées alimentaires (cas du maïs par exemple), les dépenses associées à l’approvisionnement en matière première représentent près de 60 % des coûts totaux de production. Les biocarburants de deuxième génération même s’ils ne représentent pas une menace considérable pour les objectifs de la production alimentaire, l’étape d’hydrolyse de la matière première lignocellulosique représente à elle seule environ 50% du prix de revient de l'éthanol issu de cette biomasse. Afin d’améliorer le rendement en éthanol et minimiser le prix de production, plusieurs travaux sont réalisés sur la diversification de la matière première, également sur l’optimisation soit du prétraitement et d’hydrolyse de la matière première, soit sur le mode de fermentation. Les recherches dans ce domaine sont allées jusqu’à la modification génétique des souches de levures. Il s’est avéré que le prétraitement et l’hydrolyse enzymatique sont obligatoires pour assurer un bon rendement en bioéthanol. Notre contribution dans ce volet de recherche a été citée dans cet état de l’art ; il s’agit d’un article intitulé " Production of éthanol from starch by free and immobilized Candida tropicalis in the presence of a amylase". Dans cette étude nous avons cherché à améliorer la production de l’éthanol à partir de l’amidon par deux espèces de levures C. tropicalis pourvue d’une activité glucoamylase et S. cerevisaie dépourvue de toute activité amylolitique selon les procédés d’amélioration cités ci-dessus. Des travaux d’autres chercheurs sont cités aussi comme par exemple " La production de l’éthanol à partir du manioc", les auteurs de cette étude Shuvashish Behera & Ramesh Chandra Ray, ont comparé deux procédés d'hydrolyse du manioc sur les teneurs en sucres récupérées et l’éthanol produit.
La qualité nutritionnelle du fruit de cactus, son usage multiple, sa conservation pendant le stockage, sa disponibilité et son coût réduit, sont autant d’atouts pour faire de ce fruit une matière première de choix dans le domaine du bioraffinage. En effet, dans la présente invention, le fruit d 'Opuntia ficus-indica fait l’objet d’un substrat de base pour constituer un milieu de composition chimique complète, contenant tous les éléments nécessaires (sucres, vitamines et éléments minéraux) au bon développement des levures. Ledit milieu est dépourvu de tout inhibiteurs de croissance, il servira à la culture des levures, il servira également comme un substrat de fermentation par les levures à différentes températures. Sur ledit milieu les levures montrent un taux de croissance et un pouvoir fermentaire très élevés. C’est un milieu compatible avec la production industrielle et présente une efficacité satisfaisante dans des applications et utilisations intéressants l’industrie des levures telles que, la production de biomasse de levure, la production de biocarburants, de protéines, d’enzymes, de lipides et de produits chimiques renouvelables. Le dit milieu est décrit également dans la présente invention comme une matière première de choix pour la production de biocarburant de première génération sans aucun traitement préalable et la production de biocarburant de deuxième génération après un traitement enzymatique très léger (du fait de l’absence de la lignine) de la purée de fibres et de l’écorce obtenues après pressurage et filtration du fruit.
ARTICLES
1. Optimization of Cactus Pear Fruit Fermentation Process for Wine Production
Tsegay, Z., Sathyanarayana, C., & Lemma, S. (2018)
Foods, 7(8), 121
Ce travail aborde la production de vin à partir de jus de fruits de cactus Opuntia ficus-indica par Saccharomyces cerevisiae, à 30 °C, durant une fermentation de 6 jours. Le vin élaboré a une acidité de 12,39 ± 1,32 g/L, équivalente d’acide tartrique (TTAE), une teneur en alcool de 9 ± 0,31%, (v/v) une concentration en antioxydants de 235,3 ± 9,15 mg/L AAE (équivalent en acide ascorbique), et une acceptation sensorielle de 7,74 ± 0,34.
2. A Strategy to Design Efficient Fermentation Processes for Traditional Beverages Production: Prickly Pear Wine
Navarrete-Bolanos, J., Fato-Aldeco, E., Gutiérrez-Moreno, K., Botello-Alvarez, J., Jiménez-Islas, H., & Rico- Martinez, R. (2013)
Journal of Food Science, 78(10)
Cette recherche concerne la production d’un vin qui préserve les caractéristiques particulières et uniques des produits traditionnels à partir des figues de Barbarie. Le procédé est réalisé avec une fermentation alcoolique à 20°C pendant 240 h par une culture mixte de Pichia fermentans et de Saccharomyces cerevisiae, suivie d’une fermentation malolactique à 16°C pendant 192 h par Oenococcus oeni. Le produit obtenu est caractérisé par une meilleure perception des arômes et une sensation veloutée.
3. Semi-simultaneous Saccharification and Fermentation of opuntia ficus-indica cladode for Bioethanol Production using Wild Strain
Lôpez-Dominguez, C. M., & Ramirez- Sucre, M. O. (2018)
International Journal of Advanced Research, 6(9), 877-884
Production d’éthanol à partir des cladodes à! Opuntia ficus-indica séchées puis broyées. La fermentation est réalisée par une bactérie sauvage Acinetobacter pittii, et une levure sauvage, Kluyveromyces marxianus, selon le mode de saccharification et de fermentation (SSSF) semi- simultanés avec et sans agitation (0 and 200 rpm). Les concentrations finales en éthanol produit sont respectivement 11,7 ± 0,02 gL 1 et 5,80 ± 0,02 gL 1 pour 0 et 200 tr / min.
4. Simultaneous Saccharification and Fermentation of Cactus Pear Biomass Evaluation of using different Pretreatments
Filho, P. F., Ribeiro, V. T., Santos, E. S., & Macedo, G. R. (2016)
Industrial Crops and Products, 89, 425-433
Production d’éthanol à partir des cladodes séchées, broyées et traitées de deux espèces de cactus, Opuntia ficus indica et Nopalea cochenillifera par deux souches de Saccharomyces cerevisiae. Les résultats montrent que le prétraitement alcalin fournit les meilleurs rendements de saccharification enzymatique. Les expériences SSF ont donné les meilleurs rendements en éthanol.
5. Enzymatic Hydrolysis of Cactus Pear Varieties with high Solids Loading for Bioethanol Production
Alencar, B. R., Dutra, E. D., Everardo Valadares De Sa Barretto Sampaio, Menezes, R. S., & Morais, M. A. (2018)
Bioresource Technology, 250, 273-280
L’optimisation de l’hydrolyse enzymatique des cladodes de Nopalea cochenillifera et d’Opuntia ficus indica pour évaluer l’influence du surfactant Tween 80 du prétraitement avec H2O et H2SO4, des cellulase, des pectinase et de la charge solide (% p/v) sur la production du bioéthanol. Les résultats montrent que les meilleures conditions sont 10 FPU de cellulase par gramme de biomasse et la charge solides est de 30% pour les deux espèces. L’efficacité de fermentation des hydrolysats de Nopalea cochenillifera et Opuntia ficus-indica sont 76,3% et 82,8%.
6. Opuntia ficus-indica cladodes as Feedstock for Ethanol Production by
kluyveromyces marxianus and saccharomyces cerevisiae
Kuloyo, O. O., Preez, J. C., Garcia-Aparicio, M. D., Kilian, S. G., Steyn, L., & Gôrgens, J. (2014)
World Journal of Microbiology and Biotechnology, 30(12), 3173-3183
Optimisation de la production d’éthanol à partir des cladodes d’O. ficus-indica, prétraitées et hydrolysées par voie enzymatique. Les résultats montrent que les procédés de l’hydrolyse et fermentation séparées (SHF) et saccharification et fermentation simultanées (SSF) en utilisant Kluyveromyces marxianus et Saccharomyces cerevisiae à 40°C et 35°C, respectivement, ont donné des rendements similaires en éthanol dans les conditions non aérées. Dans les cultures aérées, K. marxianus montre presque le double de la productivité de l'éthanol par rapport aux cultures non aérées. Des concentrations en éthanol allant jusqu'à 19,5 et 20,6 g L 1 ont été obtenues avec K. marxianus et S. cerevisiae, respectivement.
7. Batch Ethanol Production from cassava (Manihot esculenta Crantz.) Flour using Saccharomyces cerevisiae Cells Immobilized in Calcium Alginate
Behera, S., & Ray, R. C. (2014)
Annals of Microbiology, 65(2), 779-783
Production de l’éthanol à partir la farine de manioc hydro lysée selon deux procédés ; l’hydrolyse acide-enzyme a abouti à une teneur en sucre total plus élevée (72,88%), et l’hydrolyse enzyme-enzyme (58,1%). Le maximum d'éthanol obtenu en utilisant S. cerevisiae immobilisée dans l’alginate de calcium à partir de l'hydrolyse acide-enzyme est de 189 ± 3,1 g / kg de farine avec une conversion de sucre de 94,74 ± 2,187%.
8. Production of Ethanol from Starch by Free and Immobilized Candida tropicalis in the Presence of a— amylase
Jamai, L., Ettayebi, K., Yamani, J., & Ettayebi, M. (2007)
Bioresource Technology, 98(14), 2765-2770
Ce travail porte sur l’amélioration de la production de l’éthanol à partir de l’amidon par deux espèces de levures C. tropicalis pourvue d’une activité glucoamylase et S. cerevisaie dépouvue de toute activité amylolytique selon les procédés suivants :
a) Utilisation d’une souche de levure amylolytique
b) Hydrolyse de l’amidon par l’a-amylase exogène
c) Clonage dans les deux espèces de levures d’un vecteur d’expression du gène a- amylase
d) Comparaison des deux procédés de fermentation en batch et en feed batch.
Les résultats ont montré, le bon choix de la souche amylolytique C. tropicalis ; la présence de la glucoamylase chez cette souche provoque une augmentation de la production de l’éthanol de 600% par rapport à S. cerevisiae. L’hydrolyse de de l’amidon par l’a-amylase exogène a fait doubler et quadruplé respectivement le rendement en éthanol chez C. tropicalis et S. cerevisaie. Le clonage du gène a-amylase, a abouti à l’amélioration du rendement en éthanol uniquement chez S. cerevisaie. Le système de fermentation en feed batch a augmenté le rendement en éthanol de 80% par rapport au système de fermentation en batch.
9. Prickly pear cactus as a raw material for lactic acid production by Lactococcus lactis sub sp. Lactis
Tamine, M., Nancib, A., Nancib, N., & Boudrant, J. (2018)
Malaysian Journal of Microbiology, 14(1), 16 -24
Cette étude démontre la faisabilité de la production d’acide lactique par Lactococcus lactis à partir de fruits et de cladodes d’Opuntia ficus indica en tant que matière première. La méthodologie de surface de réponse basée sur la conception composite centrale (CCD) a été utilisée pour évaluer les effets des paramètres de fermentation sur la production d’acide lactique à partir de fruits. Des variables telles que l’âge de l’inoculum et la réduction de la concentration en sucres ont eu une influence significative sur la production de l’acide lactique. La concentration finale en acide lactique et la productivité atteintes dans des conditions de fermentation optimales sont de 32,5 g / L et 0,74 g / L.h, respectivement. Le prétraitement de la biomasse des cladodes a été réalisé par hydrolyse acide dilué H2SO4, La productivité volumétrique maximale de l'acide lactique était de 16,85 g / L et 0,65 g / L.h, respectivement.
10. Optimization of the acid hydrolysis of cladodes of Opuntia ficus-indica by response surface methodology
A. Texco-Lôpez, A. Cadena-Ramirez, J. Alvarez-Cervantes, X. Tovar-Jiménezl, C.A., Gômez-Aldapa, J.
Castro-Rosas, & A. Téllez-Jurado. (2018)
Revista Mexicana de Ingenieria Quimica, 17 (3), 1095-1104
Ce travail concerne l’optimisation d’un processus d'hydrolyse à l’acide dilué des cladodes d 'Opuntia ficus-indica en utilisant la méthodologie de surface de réponse. Le résultat de cette optimisation montre une production de 20 825 mg mL 1 de sucres réducteurs totaux en un temps de réaction 27,25 minutes avec une solution d'acide sulfurique à 3,46%. Les principaux sucres obtenus dans l'hydrolyse sont le galactose (57,14%), l'arabinose (20,51%), le glucose (13,18%) et le xylose (9,17%).
BREVETS
1. BREVET CN105273934A
Date de la publication internationale: 2016-01-27
Procédé de production de vin de figue de barbarie fermenté
La présente invention concerne un procédé de production de vin fermenté de figue de Barbarie. Ce procédé comprend une hydrolyse enzymatique du fruit de cactus, suivit d’une fermentation par un mélange de bactéries à basse température.
2. BREVET ES2552603A1
Date de la publication internationale: 2015-11-30
Procédure de traitement des cladodes de cactus, Opuntia ficus-indica, séchée pour produire du bioéthanol de deuxième génération
Procédures de traitements des cladodes de cactus, Opuntia ficus-indica, séchées pour produire du bioéthanol de deuxième génération. L’invention est basée sur l’application d’un certain nombre de techniques de prétraitement mécanique, de prétraitement thermochimique acide, de saccharification et fermentation simultanées (SSF) et de distillation pour hydrolyser complètement les sucres de la matrice lignocellulosique de cactus et les convertir en bioéthanol de deuxième génération
3. BREVET WO 2013/088003 Al Date de la publication internationale: 2013-06-20
Procédé de production d'alcool à partir de biomasse lignocellulosique par complémentation des enzymes cellulolytiques et hemicellulolytiques de trichoderma reesei par le champignon podospora anserina
L’invention décrit un procédé de production d’alcool à partir de matériaux lignocellulosiques prétraités, comprenant au moins les étapes suivantes : a) une étape d'hydrolyse enzymatique desdits matériaux lignocellulosiques prétraités utilisant, en mélange, des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulo lytiques provenant du microorganisme Trichoderma reesei et de protéines du champignon Podospora anserina ; b) une étape de fermentation alcoolique par un microorganisme alcooligène de l'hydrolysat issu de l'étape a) et obtention d'un moût de fermentation et c) une étape de séparation de l'alcool du moût de fermentation.
4. BREVET WO 2009/098365 A 2
Date de la publication internationale 2009-08-13
Procédé de production d'alcool dans un contexte de bio raffinerie
La présente invention décrit un procédé de production d'alcool à partir de biomasse lignocellulosique prétraitée dans lequel l’étape d’hydrolyse enzymatique est réalisée avec des enzymes cellulolytiques et/ou hémicellulolytiques produites en utilisant au moins un effluent issu d'un autre procédé de production d'éthanol utilisant comme matière première une plante sucrière.
Brève description des dessins
• Figure 1 représente 4 photos d’Opuntia ficus-indica
a) la plante entière avec les fruits qui poussent en amas au sommet des cladodes.
b) les cladodes sont des tiges modifiées de forme aplatie, recouvertes d’une cuticule céreuse (la cutine), qui limite la transpiration ; sur les cladodes se plantent des épines et des glochides.
c) Les fleurs se différencient le plus souvent au sommet des cladodes, ce sont des fleurs à ovaire infère, uniloculaire. Le pistil est surmonté d'un stigmate multiple. Les étamines sont très nombreuses. Les sépales peu apparents et les pétales bien visibles de couleur jaune orange.
d) Le fruit, ou figue de Barbarie, est une baie charnue, uniloculaire, à nombreuses graines (polyspermique) dont le poids peut varier de 150 à 400 g. Il dérive de l’ovaire infère adhérent au réceptacle floral. Sa couleur est variable selon les variétés : jaune, rouge, blanc... La forme est également très variable, non seulement selon les variétés mais aussi selon l'époque de formation, les premiers sont arrondis, les plus tardifs ont davantage une forme allongée de pédoncule. Le nombre de graines est très élevé, il est de l’ordre de 300 pour un fruit de 160 g.
• Figue 2 c’est une illustration du schéma générique des principales étapes de la préparation d’un milieu de culture pour les levures et d’un substrat de fermentation par les levures dont la composition est à base du fruit de cactus, pour la production de biomasse de levures, de protéines, de lipides, d’enzymes, de biocarburant et de produits chimiques renouvelables selon les étapes suivantes :
- Etape 1 : épluchage, pressurage mécanique de la pulpe du fruit de cactus et recueille du [a] jus du fruit de cactus et d’une purée de fibre de cactus ;
- Etape 2 : traitement mécanique de l'écorce et des fibres résultantes du pressurage de la pulpe pour obtenir une suspension ;
- Etape 3 : traitement acide et enzymatique de ladite suspension, pour hydrolyser les polysaccharides et obtenir un [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus ;
- Etape 4 : culture des levures ou fermentation par des levures du milieu de culture à base de : [a] jus du fruit de cactus et de [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus ;
- Etape 5 : récupération de la biomasse de levures produite dans l'étape (4) et purification de protéines, d’enzymes, de produits chimiques renouvelables et du biocarburant.
* le fruit de cactus, peut être utilisée entier ou épluché
* [a] jus du fruit de cactus et [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus, peuvent être utilisés sous leur forme humide ou sous forme de poudre séchée pour la culture des levures ou comme substrat de fermentation par les levures.
• Figure 3 montre la croissance des souches de levures sur le milieu de culture dont la composition est à base du jus du fruit de cactus à différentes températures. D’après cette photo l’ensemble des souches de levures testées montrent une croissance très importante sur le milieu du jus du fruit de cactus jusqu’à une température de 41°C. Les plus résistantes poussent même à 48°C.
• Figure 4 montre l’activité de l’enzyme péctinase des souches de levures ayant poussées sur le milieu de culture dont la composition est à base du jus du fruit de cactus à différentes températures.
La présence d’auréoles claires, révèlent la présence d’une activité pectinase très importante à 41°C chez l’ensemble des souches de levures testées. Cette activité enzymatique persiste jusqu’à 48°C chez les souches de levures les plus résistante à la température.
• Figure 5 montre l’activité de l’enzyme amylase des souches de levures ayant poussées sur le milieu de culture dont la composition est à base du jus du fruit de cactus à différentes températures.
La présence de tache blanche après imprégnation des boites avec une solution d’iodure de potassium et lavage immédiat avec de l’eau distillée, révèle la présence d’une activité amylase. Cette activité persiste jusqu’à 48°C chez les souches de levures résistantes à la température.
• Figure 6 Les graphes de cette figure représentent l’évolution en fonction du temps de la turbidité du milieu de culture dont la composition est à base du jus du fruit de cactus exprimée en Densité Optique (DO) à une longueur d'onde de 600 nm et de l’activité enzymatique invertase (forme sécrétée et forme cellulaire) exprimée en unité d’enzyme L 1 chez S. cerevisiae YME S2 à 37°C pendant lOh de culture. Ces graphes montrent une alternance entre les deux formes d’enzymes (forme sécrétée et forme cellulaire) durant la croissance cellulaire de S. cerevisiae sur le milieu du jus du fruit de cactus. Le nombre maximal d’unités enzymatiques dans le surnageant (4816 UE L 1) est supérieur à celui de la forme cellulaire, il est atteint une heure après le déclenchement de la réaction.
• Figure 7 représente l’évaluation de l’activité de l’enzyme phytase chez C. tropicalis YME C24 et Sc. occidentalis en fonction de la température sur le milieu de culture dont la composition est à base du jus du fruit de cactus supplémenté de 5% d’amidon. Les graphes de cette figure montrent que la température optimale de l’activité phytase secrétée séparément par C. tropicalis YMEC24 et Sc. Occidentalis est maximale à 65°C et 60°C respectivement.
• Figue 8 représente de la cinétique de fermentation en batch de la production du bioéthanol à partir du milieu de fermentation dont la composition est à base du fruit du cactus, réalisée avec K. marxianus à 37°C et pH 5. Des aliquotes de 10 ml sont prélevés de manière aseptique toutes les 4 heures pour quantifier : (4Q le poids sec, ( ) l’éthanol et ( .4) les sucres réducteurs.
Les graphes de cette figure illustrent la croissance cellulaire et la production d’éthanol dans le milieu de fermentation en fonction de la consommation des sucres réducteurs, les trois paramètres sont déterminés en gL 1. L’allure des graphes montre un métabolisme fermentaire très actif de K. marxianus sur ce substrat, traduit par une production précoce et exponentielle de l’éthanol et une consommation rapide des sucres. Ainsi la quantité maximale d’éthanol 41 gL 1 est atteinte après 12h de fermentation.
• Figue 9 est une représentation tridimensionnelle de l’interaction de l'effet du pH et de la température sur la production de bioéthanol à partir du milieu de fermentation dont la composition est à base du fruit de cactus par K. marxianus, (La quantité d’azote ajoutée est fixée au niveau codé 0). D’après cette représentation graphique, l’interaction entre les deux facteurs ayant des effets significatifs sur la production d’éthanol, la quantité maximale de ce métabolite est obtenue à une température comprise entre 36 et 41°C, et un pH compris entre 4 et 6.
Annexe
1. Terminologie :
• L’appellation figue de Barbarie, est le fruit de cactus ou baie du cactus : une baie, en botanique, est un type de fruit charnu, en général indéhiscent et contenant une ou plusieurs graines, les pépins.
• Les cladodes sont couramment appelés « raquettes » ce sont les tiges modifiées de forme aplatie.
2. Espèces de levures citées :
Figure imgf000026_0001
3. Milieux de cultures et de révélation des activités enzymatiques :
• Milieu YPA : 1% (p/v) extrait de levure, 2% (p/v) peptone et 9 % (p/v) amidon
• Milieu YPS : 1% (p/v) extrait de levure, 2% (p/v) peptone et 15% (p/v) saccharose
• Milieu de révélation de l’activité péctinase :
a) Milieu solide PGA : Extrait de levure 0.4g, MgSCL IM 1ml, PGA 2.5g, (NfL^SCL 10% 5ml, Glycérol 2g, Agar-agar 12g, ¾0 distillée 800ml.
b) Tampon PGA: Na H2PO 43g, Na2HP 04 0.14g, ¾0 distillée 200ml.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation dont la composition est à base du fruit de cactus ( Opuntia sp .) pour la production de biomasse de levures, de protéines, de lipides, d’enzymes, du biocarburant et d'autres produits post fermentaires, selon les étapes suivantes :
(1) Récolte des baies de cactus, épluchage, pressurage mécanique de la pulpe et recueille du [a] jus du fruit de cactus, c’est un substrat de base pour la constitution de milieux de culture et de fermentation.
(2) traitement mécanique de l'écorce et des fibres résultantes du pressurage de la pulpe pour obtenir une suspension contenant au moins 2 à 50 % de matières solides.
(3) traitement acide et enzymatique de ladite suspension, permettant l’hydrolyse des polysaccharides et l’obtention d’un [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus ; c’est un substrat de base pour la constitution de milieux de culture et de fermentation.
(4) culture des levures ou fermentation par des levures des milieux composés de [a] jus du fruit de cactus et de [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit du cactus.
(5) récupération de la biomasse de levures produite dans l'étape (4) et purification de protéines, d’enzymes, du biocarburant et de produits chimiques renouvelables.
2. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon la revendication 1 selon lequel le milieu de culture et substrat de fermentation dont la composition est à base du [a] jus du fruit de cactus et de sa poudre séchée sont utilisés pour la culture des levures et la fermentation par des levures.
3. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon la revendication 1 selon lequel le milieux de culture et substrat de fermentation dont la composition est à base du [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus et de sa poudre séchée sont utilisés pour la culture des levures et la fermentation par des levures.
4. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon l’une quelconque des revendications comportant un pressurage mécanique des fmits de cactus entiers (écorce et pulpe) suivit d’une filtration, le jus séparé des fibres servira à la composition d’un milieu de culture et d’un substrat de fermentation pour la production de biomasse de levures, d’enzymes et du biocarburants sous forme de bioéthanol de première génération, ainsi que des sous-produits chimiques renouvelables.
5. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon l’une quelconque des revendications comportant un pressurage mécanique des fmits de cactus entiers (écorce et pulpe) suivit d’une filtration, les fibres résultantes sont soumises à des traitements mécaniques, thermochimiques, acides et enzymatiques ; G hydrolysat du fruit de cactus entier obtenu servira pour la composition d’un milieu de culture et d’un substrat de fermentation pour la production de biomasse de levures, d’enzymes, du biocarburants sous forme de bioéthanol de deuxième génération ainsi que des sous-produits chimiques renouvelables.
6. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon la revendication 1 selon lequel, les milieux de culture et les substrats de fermentation issus du [a] jus de fruit du cactus et du [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus, sont utilisés pour la culture des levures et la fermentation par des levures pour produire des protéines et des enzymes endogènes de la levure ou encore des protéines et des enzymes qui sont issues de l’expression de gènes hétérologues clonés et introduits dans la levure.
7. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon la revendication 1 selon lequel, les milieux de culture et les substrats de fermentation issus du [a] jus de fruit du cactus et du [b] hydrolysat de l'écorce et des fibres du fruit de cactus, sont utilisés pour la culture des levures et la fermentation par des levures pour produire des sous-produits post fermentaires, désignés dans le groupe suivant : extrait de levure, peptides antimicrobiens, arômes de levures, acides organiques, lipides, vitamines, flavonoïdes, anti-oxydants.
8. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation selon l’une quelconque des revendications, caractérisé en ce que les fruits de cactus sont obtenues à partir d'espèces de cactus ( Opuntia sp .) sélectionnées dans les genres suivants : entre autres, O. ficus indica, O. vulgais, O. abjecta, O. camanchia, O. chlorotica, O. compressa, O. cymochila, O. dillenii, O. engelmanni, O. gosseliniana, O. megacanta, O. monacantha, O. nichollii, O. phaeacantha, O. Pinkavae, O. polyacantha, O. streptacantha Lemaire, O. stricta, O. indheimeri Engel, O. robusta Wendland, O. tortispina, O. bakeri, O. aciculata, O. aquatorialis, O. zebrine, O. basilaris, O. dulcis, O. page, O. macrocenta, O. discata, O. rastrera, O. humifusa.
9. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation, selon l’une quelconque des revendications dans lequel, lesdites culture ou fermentation sont effectuées à une température comprise entre 25 et 48°C et un pH allant de 3.5 à 8, avec des espèces de levures sélectionnées dans les genres suivants : Saccharomyces, kluyvuromyces, Candida, Pichia, Schwanniomyces, Ogatea, Saccharomycopsis, îssatchenkia, et Hensunella.
10. Procédé de préparation d’un milieu de culture et substrat de fermentation, selon l’une quelconque des revendications dans lequel ; lesdits milieux de culture et substrats de fermentation issus du [a] jus de fruit du cactus et [b] hydrolysat de l'écorce du fmit de cactus utilisés sous forme liquide ou solide séchées en poudre, sont supplémentés ou non avec des composés désignés dans le groupe suivant : peptone, extrait de levure, extrait d’algues, azote, phosphate, mélasse, caroube et lactosérum.
PCT/MA2020/050002 2019-06-21 2020-06-19 Bioprocédé de préparation d'un milieu de culture à partir du fruit de cactus du genre opuntia pour la production de biomasse de levures, biocarburants, protéines, et produits chimiques renouvelables WO2020256535A1 (fr)

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