EP2576770A1 - Procédé de culture d'adipocytes - Google Patents

Procédé de culture d'adipocytes

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EP2576770A1
EP2576770A1 EP11727787.1A EP11727787A EP2576770A1 EP 2576770 A1 EP2576770 A1 EP 2576770A1 EP 11727787 A EP11727787 A EP 11727787A EP 2576770 A1 EP2576770 A1 EP 2576770A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
adipocytes
culture
adipocyte
mature
adipose tissue
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP11727787.1A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Danièle LACASA
Vanessa Pellegrinelli
Mayoura Keophiphath
Karine Clement
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite Pierre et Marie Curie
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Original Assignee
Universite Pierre et Marie Curie
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite Pierre et Marie Curie, Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP filed Critical Universite Pierre et Marie Curie
Publication of EP2576770A1 publication Critical patent/EP2576770A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0653—Adipocytes; Adipose tissue
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/39—Steroid hormones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/50—Proteins

Definitions

  • the invention relates to a method of culturing adipocytes, a culture of adipocytes, and its use for the screening of compounds modulating adipocyte metabolism.
  • the current drug approaches are mainly aimed at reducing energy intake, for example by limiting the intestinal absorption of lipids (orlistat), or by decreasing the appetite, either by promoting the feeling of satiety (sibutramine), or by decreasing the pleasure associated with food intake (rimonabant).
  • mature adipocyte cells in particular characterized by the presence of a single lipid vacuole, which form the white adipose tissue, are particularly fragile and, in fact, these cells generally lose in less than 48 h their metabolic and secretory properties in culture.
  • adipocytes such as pre-adipocytes or endothelial cells (Sonda et al., (2008) Endocrinology 149: 4794-4798), or generally using adipocytes.
  • the present invention results from the unexpected finding by the inventors that mature adipocytes isolated from adipose tissue could be cultured, in the absence of other cell types, using a three-dimensional culture support and that the adipocytes thus cultured retain for at least 48 hours a phenotype similar to that of freshly isolated mature adipocytes.
  • the present invention thus relates to a method of culturing adipocytes, wherein a homogeneous population of mature adipocytes isolated from adipose tissue is cultured on a three-dimensional culture support.
  • the present invention also relates to an adipocyte culture, comprising a monoculture of mature adipocytes isolated from adipose tissue in contact with a three-dimensional culture support.
  • the invention also relates to the use of an adipocyte culture according to the invention, for the screening of compounds modulating adipocyte metabolism.
  • the invention also relates to a method for screening compounds that modulate adipocyte metabolism, in which:
  • a compound to be screened is contacted with a culture of adipocytes according to the invention
  • the compound is selected if it modifies at least one representative parameter of the adipocyte metabolism.
  • mature adipocytes represents differentiated adipocytes.
  • the mature adipocytes can be easily identified by those skilled in the art.
  • a mature adipocyte according to the invention usually has a single lipid vacuole, a lipolytic activity, in particular inducible by ⁇ -adrenergic agents, such as adrenaline and norepinephrine, as well as an insulin sensitivity, in particular particular defined by insulin-inducible transport, from the extracellular medium to the intracellular medium, glucose and fatty acids, which transport is particularly related to the insulin-dependent translocation, within the plasma membrane of mature adipocytes, GLUT-4 and CD36 carriers respectively.
  • the mature adipocytes according to the invention are distinguished in particular from pre-adipocytes, in particular in that the expression of the specific marker of the pre-adipocytes DelK1 / Prefl, well known to those skilled in the art, which can be measured by PCR in time. real, is essentially absent in mature adipocytes according to the invention.
  • the mature adipocytes according to the invention are isolated from adipose tissue.
  • mature adipocytes according to the invention are especially such that they do not come from the in vitro differentiation of adipocyte precursors, such as pre-adipocytes or stem cells, totipotent, multipotent, or pluripotent.
  • the adipose tissue according to the invention can come from any animal species. However, it is preferred that the adipose tissue according to the invention has been removed from one or more human individuals.
  • the mature adipocytes can be isolated from adipose tissue by many methods well known to those skilled in the art, taking particular advantage of the low density of mature adipocytes.
  • the adipose tissue can be treated with collagenase, then after digestion, be filtered on woven cotton gauze; the filtrate is left to decant in an aqueous medium and a homogeneous population of mature adipocytes according to the invention can be recovered by harvesting the floating cells.
  • a homogeneous population of mature adipocytes is especially such that it is substantially free of other cell types, including endothelial cells, or preadipocytes.
  • a homogeneous population of mature adipocytes according to the invention comprises less than 10%, more particularly less than 5% of cells other than mature adipocytes, in particular pre-adipocytes.
  • the amount of pre-adipocytes in a homogenous population of mature adipocytes can be determined by quantifying the number of cells expressing a specific preadipocyte marker, such as DelK1 / Prefl for example.
  • a "mature adipocyte monoculture” is a culture of a homogeneous population of mature adipocytes.
  • a homogeneous population of mature adipocytes is said to be "cultured” or “cultured” when it is incubated, that is to say preserved in vitro, under conditions allowing the survival of the cells constituting the population.
  • Such conditions as well as suitable culture media are well known to those skilled in the art. These culture media are such that they contain all the elements, in particular nutrients, capable of ensuring the survival of the cells constituting the population for at least 12 hours, preferably at least 24 hours, more preferably at least 48 h.
  • the population can be incubated in a DMEM / F12 medium, 1% Penicillin-Streptomycin, 50 nM Insulin, with stirring, at 37 ° C. and in an atmosphere at 5% C0 2 , the medium being regularly renewed.
  • the mature adipocyte culture media according to the invention may comprise compounds intended to modulate the metabolic activity of mature adipocytes, such as forskinin and dexamethasone, for example.
  • the culture of the mature adipocyte population is preferably carried out for at least 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, or 48 h.
  • the mature adipocytes are "cultured on a three-dimensional culture support" when the adipocytes are in contact with the support, ie they rest on the support or they adhere to the support.
  • the method for culturing adipocytes according to the invention comprises the following steps:
  • a "three-dimensional culture support” according to the invention consists of a material, in particular biocompatible, adapted to obtain a three-dimensional cell culture; in other words, the three-dimensional culture support is adapted, in particular, to obtaining several layers of superposed cells.
  • a culture support allowing only the culture of a two-dimensional cellular mat, namely a monolayer of cells, is not a three-dimensional culture support according to the invention.
  • the three-dimensional culture support according to the invention is a hydrogel. More preferably, the three-dimensional culture support according to the invention is a hydrogel formed from the non-covalent association of peptides comprising from 10 to 30 residues, such as peptides comprising a repetition of the RADA sequence, and in particular a RADARADARADARA-DA sequence. (SEQ ID NO: 11).
  • the peptides forming the hydrogel can be modified, for example by the addition of acetyl groups on the N-terminus of the peptides and by the addition of a group -N3 ⁇ 4 at the C-terminus of the peptides.
  • the peptides can be represented by the sequence: Ac-RADA-RADARADARADA-CONH 2 .
  • the three-dimensional culture carrier according to the invention is the hydrogel PuraMatrix TM (3DM, Inc.).
  • the compounds which can be screened according to the invention can be of any type. In particular, they may be compounds from chemical libraries. Moreover, the culture of adipocytes according to the invention can be used to screen compounds activating lipolysis, or compounds activating PPARy2 transcription factor; or compounds that modulate insulin sensitivity.
  • lipolysis or lipolytic activity
  • insulin sensitivity or activity of the PPAR ⁇ 2 transcription factor
  • PPAR ⁇ 2 transcription factor are representative parameters of adipocyte metabolism.
  • lipolytic activity can be determined by measuring the amount of glycerol and free fatty acids released by an adipocyte culture according to the invention, in particular by spectrophotometry as described in Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128: 747-753.
  • the insulin sensitivity of adipocytes can be evaluated from the measurement of glucose transport in the adipocyte as described in Wood et al. (2007) B toc hem. Biophys. Res. Common. 361: 468-473.
  • the activity of the transcription factor PPARy2 can be measured by determining the amount of mRNA encoding it in a cell, for example by RT-PCR or by direct measurement of the binding activity at its specific DNA sites, such as is described in particular in Keophiphath et al. (2009) J. Nutr. 139: 2055-2060.
  • Figures 1 to 3 respectively represent the level of relative expression (ordinate axis, arbitrary units) measured by real-time PCR of three specific markers of mature adipocytes, namely PPARy2, FABP4 (a fatty acid transporter whose gene is a target of PPARy2), and an adipokine, adiponectin, in mature adipocytes freshly isolated from adipose tissue on the one hand (black bars) and in adipocytes obtained by in vitro differentiation of pre-adipocytes as described in Lacasa et al. Endocrinology 148: 868-877, on the other hand ( white bars).
  • FIG. 4 shows a cell lysates immunoelectrophoresis gel prepared from mature adipocytes maintained in culture on the three-dimensional support for 48 hours (3D) and freshly isolated mature adipocytes (J0) then labeled using an antibody directed against the adipocyte marker aP2 / FABP4 and an antibody directed against a positive control (actin).
  • Figures 5 and 6 show levels of lipolytic activity (y-axis in arbitrary units) basal and stimulated by forskolin (FK) of mature adipocytes grown (i) in the three-dimensional culture substrate (3D) in the absence (white bars) and in the presence of dexamethasone (Dex) (black bars), and (ii) in monolayers (2D) (shaded bars), depending on the culture time (x axis, in days).
  • FK forskolin
  • Figures 7 and 8 respectively represent the secreted amounts of leptin and adiponectin (y-axis, in ⁇ g / ml / 24h) by mature adipocytes cultured in the three-dimensional culture support (3D) in the absence (white bars) and in the presence of dexamethasone (Dex) (black bars).
  • the experiment presented is representative of a set of three replicated experiments.
  • FIG. 9 represents the relative gene expression of adipocyte markers (ordinate axes, arbitrary units) measured by real-time PCR from extracts of freshly isolated mature adipocytes (black bars) and mature adipocytes. maintained for 48 hours in culture in the three-dimensional culture support (white bars).
  • Figure 10 shows a cell lysates immunoelectrophoresis gel prepared from mature adipocytes maintained in culture on the three-dimensional support for 48 hours (3D) and freshly isolated mature adipocytes (2D) incubated in the presence of insulin (1 nM) at the indicated times then labeled with an antibody directed against the phosphorylated form of Akt and an antibody directed against a positive control (actin).
  • the BDTM Puramatrix TM peptide hydrogel is obtained from BD Biosciences (Two Oak Park, Bedford, MA, USA).
  • the primary anti-caveolin-1 (N-20, SC-894) and antiCD36 (1.BB.3414, CS-70642) antibodies used are from Santa Cruz Biotcchnology (Santa Cruz, CA, USA).
  • the corresponding Cy3-coupled antibodies are obtained from GE Healthcare (Little Chalfont, UK).
  • the mature adipocytes are isolated by collagenase treatment of human adipose tissue.
  • the subcutaneous human adipose tissue of young ( ⁇ 45 years old) and non-obese (BMI ⁇ 30) women is cut out of digestion media (DMEM, 2% low fatty acid albumin (A6003, Sigma St Louis, MI, USA). ), 1 mg / ml collagenase A (Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) in the proportion of 1 g of tissue per 2 ml of digestion medium in polypropylene tubes The tubes are placed at 37 ° C.
  • the medium is filtered on woven cotton gauze
  • the mature adipocytes are allowed to settle by flotation for 5 minutes and then washed 3 times with 5 volumes of sucrose 10%
  • the sucrose is withdrawn and the mature adipocytes are ready to be incorporated into the Puramatrix TM hydrogel.
  • the hydrogel is sonicated for 30 minutes to reduce its viscosity.
  • the gel is then diluted V / V with 20% sucrose and then centrifuged for 5 minutes at 1000 g to remove the air bubbles.
  • the washed mature adipocytes are rapidly incorporated into this mixture with homogenization by gentle suction with the pipette.
  • the adipocytes / gel mixture is then distributed in the proportion of 100 ⁇ l ⁇ per well in 96-well culture plates.
  • the incubation medium 150 ⁇ l
  • DMI contains 100 nM dexamethasone (Sigma Aldricht, St. Louis, MO, USA) or 100 nM rosiglitazone (Merck, Nottingham, UK).
  • the medium is removed and placed for 10 minutes at 70 ° C in order to inactivate the adipocyte enzymes that can interfere with the glycerol assay.
  • the glycerol released is assayed spectrophotometrically (Glycerol Assay Kit, R-Biopharm) as described in Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128: 747-753.
  • the DMI medium is taken 24 hours after the last change of medium.
  • adipokines (leptin, adiponectin) is carried out directly on this medium (100 ⁇ l) by the ELISA technique (Duoset, R & D Systems, Minneapolis, MN USA) as described by the manufacturer.
  • the DMI medium is rapidly removed from the wells and the gel / adipocyte assembly is homogenized by the lysis buffer in the proportion of 1 ml of lysis buffer / lml of gel / adipocyte assembly.
  • the RNAs are then extracted with chloroform delipidation treatment beforehand using the RNeasy extraction kit. (Qiagen, Courtaboeuf, France) as described in Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148: 868-877.
  • the total (1 ⁇ ") RNAs are then transcribed into cDNA as described in Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148: 868-877.
  • the list of primers used is shown in Table 1.
  • PCR test in real time are performed with 25ng cDNA and forward and reverse primers using the universal PCR mixture Sybergreen (Applied Biosystems, Minneapoîis, MN USA) and measured in a detection device (Applied Biosystems). All values are normalized to RPLPO ribosomal protein expression.
  • the gel / adipocyte assembly is deposited in wells of 96-well plates and fixed with 4% paraformaldehyde (PAF) for 1 hour.
  • PAF paraformaldehyde
  • the cells are permeabilized for 5 minutes at room temperature with 0.1% Triton X-100 in PBS / 3% albumin. Non-specific sites are blocked by PBS / 3% albumin buffer for 4 hours at room temperature, then primary antibodies are added and incubation is continued for 14 hours at 4 ° C.
  • the gel / adipocyte assembly is incubated with the secondary antibodies for 4 hours at room temperature in the dark.
  • the gel / adipocyte assembly is then washed (1 hour) and fragments of this gel are deposited in mounting medium (Fluomount, Birmingham, Alabama, USA) between blade and lamellae. The slides are examined in fluorescence after 24 hours.
  • the gel / adipocyte assembly is rapidly lysed with a volume of lysis buffer (PBS, 2% IGEPAL, 0.2% SDS, 1% sodium desoxycholate) containing a mixture of protease inhibitors and phosphatases (Complete mini and Phosphostop, Roche diagnoses).
  • PBS 2% IGEPAL, 0.2% SDS, 1% sodium desoxycholate
  • the homogenate is then kept 15 minutes at 4 ° C. and then centrifuged for 10 minutes at 5000 g.
  • the cell lysate is then collected and diluted in Laemmli buffer and electrophoresed as described in Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148: 868-877.
  • Wells containing Phydro gel / fundamentalrivés adipocytes insulin standby times are incubated with incubation medium (150 (DMEM / F 12 and 10 nM Insulin).
  • incubation medium 150 (DMEM / F 12 and 10 nM Insulin).
  • the plates are then placed in the incubator for 15 to 30 minutes.
  • the gel / adipocytes is rapidly lysed with a volume of lysis buffer (PBS, 2% IGEPAL, 0.2% SDS, 1% sodium deoxycholate) containing a mixture of protease inhibitors and phosphatases (Complete mini and Phosphostop, Roche diagnostics)
  • the homogenate is then kept 15 minutes at 4 ° C and then centrifuged for 10 minutes at 5000 g.
  • the lysate is then collected and diluted in Laemmli buffer and electrophoresed as previously described.
  • the membranes are then incubated with the primary antibodies respectively against the phosphorylated form of Akt at Ser 473 (ref G7441 Promega) or against actin (positive control) (MAB1501R, Millipore) at 4 ° C for 14 hours. . After washing, the membranes are incubated with the secondary antibodies (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). The signals are detected by chemiluminescence (ECL detection, GE Healthcare) and quantified by densitometry.
  • the proportion of contaminating pre-adipocytes present in the mature adipocyte population isolated from adipose tissue used for culture was determined by measuring the real-time PCR expression of the pre-adipocyte specific Del 1 / Prefl marker.
  • the mature adipocytes cultured in the three-dimensional support formed by the hydrogel do indeed exhibit a unilocular appearance after immunofluorescence labeling of the CD36 and caveolin-1 membrane proteins, which demonstrates the possibility of detecting membrane adipocyte proteins.
  • the adipocyte lysates can be analyzed by immunoelectrophoresis as shown by the detection of the cytosolic adipocyte protein aP2 / FABP4 and actin (FIG. 4),
  • the lipolytic activity is measured in terms basalcs conditions and stimulated with 10 ⁇ forskolin in mature adipocytes maintained in the hydrogel for 7 days. This activity is also compared to that of the same freshly isolated cells.
  • the results presented in Figures 5 and 6 show that the basal lipophilic activity (Figure 5) and forskolin-stimulated ( Figure 6) is of the same order as that of freshly isolated adipocytes and remains constant for 5-7 days.
  • dexamethasone synthetic glucocorticoid
  • the secretion of adiponectin (FIG. 7) and leptin (FIG. 8) is measured up to 7 days of maintenance of the mature adipocytes in the hydrogel, in the presence or absence of dexamethasone (synthetic glucocorticoid). Moreover, as shown in FIG. 7, the secretion of leptin decreases during the culture in the absence of dexamethasone whereas this secretion increases in the presence of the glucocorticoid, thus demonstrating that the response to these hormones remains functional in the adipocytes in culture. . The secretion of adiponectin remains constant for 7 days (Figure 8).
  • adipoeye genes is compared between freshly isolated mature adipocytes and the same cells maintained for 2 days in hydrogel.
  • Figure 9 shows that the expression of adipokines (leptin and adiponectin), the major adipocyte transcription factor PPARy2 and its target genes aP2 / FABP4 and LPL remains constant.
  • Adipocytes are a prime target for insulin, a major anabolic hormone.
  • insulin stimulates glucose consumption leading to increased synthesis of triglycerides and on the other hand inhibits the degradation of these lipids.
  • the Akt enzyme transmits the metabolic effects of insulin which causes its activation by phosphorylation of the 473 seine (Ser 473 Akt).
  • Ser 473 Akt phosphorylation of the 473 seine
  • Insulin (10 nM) stimulates phosphorylation of Akt in an identical manner in freshly isolated (2D) adipocytes and those maintained for 48 h in the hydrogel (3D) thus indicating a good maintenance of the insulin response. of these cells ( Figure 10).
  • the mature adipocytes maintained in a three-dimensional hydrogel culture medium with an incubation medium which can be supplemented with glucocorticoids and thiazolinidinediones, exhibit lipolytic and secretion activity of adipokines (leptin and adiponectin) comparable to those of freshly isolated adipocytes.
  • adipokines lactin and adiponectin
  • mature adipocytes maintained in the hydrogel retain for at least 7 days the ability to respond to glucocorticoids, hormones crucial for adipocyte metabolism and development (Macfarlane et al (2008) J. Endocrinol 197: 189-204). ).
  • this system can be used for the screening of pharmacological compounds having lipolytic activities or adipo-specific transcription factor activation PPAR ⁇ 2, for example.
  • mature adipocytes maintained in three-dimensional culture carrier hydrogel according ⁇ invention retain at least 2 days their insulin sensitivity compared to freshly isolated mature adipocytes. This confirms that the culture of adipocyte according ⁇ invention is a model representative of the mature adipocytes in vivo.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel.

Description

PROCEDE DE CULTURE D'ADIPOCYTES
Domaine de l'invention
L'invention concerne un procédé de culture d'adipocytes, une culture d'adipocytes, et son utilisation pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire.
Arrière-plan technique
La prévalence de l'obésité, liée à une hypertrophie du tissu adipeux blanc, est en augmentation constante dans la population générale. Ainsi, la proportion des personnes en surpoids ou obèses a progressé de 36,7% à 41,6% entre 1997 et 2003 en France, en outre, la prévalence de l'obésité (définie par un index de masse corporelle (IMC) supérieur 30 kg/m2) y est de 14,5% en 2009. Par ailleurs, l'obésité est un facteur de risque pour de nombreux troubles pathologiques, dont notamment les accidents cardiovasculaires, rendant d'autant plus urgente sa prise en charge thérapeutique.
Si les principaux axes de lutte contre cette épidémie restent l'amélioration de l'alimentation et l'augmentation de la dépense physique des individus obèses, d'autres approches, notamment chirurgicales et médicamenteuses sont également explorées.
Les approches médicamenteuses actuelles visent principalement à réduire les apports énergétiques, par exemple en limitant l'absorption intestinale de lipides (orlistat), ou en diminuant l'appétit, soit en favorisant la sensation de satiété (sibutramine), soit en diminuant le plaisir associé à la prise alimentaire (rimonabant).
Toutefois, l'efficacité limitée de ces méthodes ou leurs effets secondaires - il a ainsi été rapporté que le rimonabant pouvait provoquer des troubles dépressifs sévères - ont notamment conduit au retrait de la sibutramine et du rimonabant du marché, laissant des options thérapeutiques très limitées et rendant nécessaires l'exploration d'autres voies, permettant par exemple de moduler le métabolisme des cellules adipocytaires pour limiter le stockage des lipides ou au contraire favoriser leur utilisation. Cette dernière voie est cependant rendue difficile d'approche par l'absence de modèles in vitro ou animaux d'étude du métabolisme adipocytaire véritablement représentatifs de la situation in vivo chez l'homme.
En effet, s' agissant des modèles in vitro, les cellules adipocytaires matures, notamment caractérisées par la présence d'une vacuole lipidique unique, qui forment le tissu adipeux blanc, sont particulièrement fragiles et, de fait, ces cellules perdent généralement en moins de 48 h leurs propriétés métaboliques et sécrétoires en culture.
Plusieurs systèmes de culture ont ainsi été proposés pour surmonter ces difficultés. Toutefois, ces cultures comprennent des types cellulaires additionnels en plus des adipocytes, tels que des pré-adipocytes ou des cellules endothéliales (Sonda et al. (2008) Endocrinology 149:4794-4798) ou se font généralement à l'aide d'adipocytes différenciés in vitro à partir de cellules souches (Choi et al, (2010) Tissue Engineering: Part C, Kang et al. (2007) Biomaterials 28:450-458) ou de pré- adipocytes (Daya et al. (2007) Differentiation 75:360-370, WO 2007/1 13591 , Stacey et al. (2009) Tissue Engineering: Part A 15:3389-3399), dont le phénotype est relativement éloigné de celui des adipocytes matures isolés de tissu adipeux (voir les Figures 1 à 3).
Ainsi, ces systèmes n'apparaissent pas être spécifiquement et directement représentatifs du métabolisme d'adipocytes matures isolés du tissu adipeux.
C'est donc un objet de la présente invention que de fournir un tel système de culture, proche de la physiologie, notamment humaine.
Résumé de l'invention
La présente invention résulte de la mise en évidence inattendue, par les inventeurs, que des adipocytes matures isolés de tissu adipeux pouvaient être cultivés, en l'absence d'autres types cellulaires, à l'aide d'un support de culture tridimensionnel et que les adipocytes ainsi cultivés conservent pendant au moins 48 h un phénotype semblable à celui d'adipocytes matures fraîchement isolés.
La présente invention concerne ainsi un procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel. La présente invention concerne également une culture d'adipocyte, comprenant une monoculture d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux au contact d'un support de culture tridimensionnel.
L'invention concerne également l'utilisation d'une culture d'adipocytes selon l'invention, pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire.
L'invention concerne également une méthode de criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire, dans laquelle :
on met en contact un composé à cribler avec une culture d'adipocytes selon l'invention ;
- on détermine si au moins un paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire de la culture d'adipocytes est modifié par rapport à une culture d'adipocytes selon l'invention n'ayant pas été mise en contact avec le composé à cribler ;
on sélectionne le composé s'il modifie au moins paramètre représentatif du métabolisme adipocytaire.
Description détaillée de l'invention
Comme on l'entend ici l'expression « adipocytes matures » représente des adipocytes différenciés. Les adipocytes matures peuvent être aisément identifiés par l'homme du métier. En particulier, un adipocyte mature selon l'invention présente habituellement une vacuole lipidique unique, une activité lipolytique, notamment inductible par des agents β-adrénergiques, tels que l'adrénaline et la noradrénaline, ainsi qu'une sensibilité à l'insuline, en particulier définie par un transport inductible par l'insuline, depuis le milieu extracellulaire vers le milieu intracellulaires, de glucose et d'acides gras, lequel transport est notamment lié à la translocation insulino-dépendante, au sein de la membrane plasmique des adipocytes matures, des transporteurs GLUT-4 et CD36 respectivement. Les adipocytes matures selon Γ invention se distinguent en particulier des pré-adipocytes, notamment en ce que l'expression du marqueur spécifique des pré-adipocytes DelKl/Prefl, bien connu de l'homme du métier, qui peut être mesurée par PCR en temps réelle, est essentiellement absente dans les adipocytes matures selon l'invention. Les adipocytes matures selon l'invention sont isolés de tissu adipeux. Ainsi, les adipocytes matures selon l'invention sont notamment tels qu'ils ne proviennent pas de la différenciation in vitro de précurseurs adipocytaires, tels que les pré- adipocytes ou les cellules souches, totipotentes, multipotentes, ou pluripotentes.
S'agissant du tissu adipeux selon l'invention, il peut provenir de n'importe quelle espèce animale. Toutefois, on préfère que le tissu adipeux selon l'invention ait été prélevé chez un ou plusieurs individus humains.
Les adipocytes matures peuvent être isolés à partir de tissu adipeux par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier, prenant notamment avantage de la faible densité des adipocytes matures. En particulier, le tissu adipeux peut être traité à la collagénase, puis après digestion, être filtré sur de la gaze de coton tissé ; le filtrat est laissé à décanter dans un milieu aqueux et une population homogène d' adipocytes matures selon l'invention peut être récupérée en récoltant les cellules flottantes.
Comme on l'entend ici, « une population homogène d' adipocytes matures » est notamment telle qu'elle est essentiellement exempte d'autres types cellulaires, notamment de cellules endothéliales ou de pré-adipocytes. En particulier, une population homogène d' adipocytes matures selon l'invention comprend moins de 10%, plus particulièrement moins de 5% de cellules autres que des adipocytes matures, notamment de pré-adipocytes. La quantité de pré-adipocytes dans une population homogène d' adipocytes matures peut être déterminée en quantifiant le nombre de cellules exprimant un marqueur spécifique des pré-adipocytes, tel que DelKl/Prefl par exemple.
Comme on l'entend ici, une « monoculture d' adipocytes mature » est une culture d'une population homogène d'adipocytes matures.
Une population homogène d'adipocytes matures est dite « cultivée » ou en « culture » lorsqu'elle est incubée, c'est-à-dire conservée in vitro, dans des conditions permettant la survie des cellules constituant la population. De telles conditions ainsi que les milieux de culture adéquats sont bien connus de l'homme du métier. Ces milieux de culture sont tels qu'ils contiennent l'ensemble des éléments, notamment nutritifs, susceptibles d'assurer la survie des cellules constituant la population pendant au moins 12 h, de préférence au moins 24 h, plus préférablement au moins 48 h. A titre d'exemple, la population peut être incubée dans un milieu DMEM/F12, 1% Pénicilline-Streptomycine, 50 nM Insuline, sous agitation, à 37°C et dans une atmosphère à 5% C02, le milieu étant régulièrement renouvelé. De manière avantageuse, les milieux de culture des adipocytes matures selon l'invention peuvent comprendre des composés destiné à moduler l'activité métabolique des adipocytes matures, tels que la forskoîine et la dexaméthasone, par exemple. Par ailleurs, la culture de la population d'adipocytes matures est de préférence réalisée pendant au moins 3 h, 6 h, 12 h, 24 h, ou 48 h.
Selon l'invention, les adipocytes matures sont « cultivés sur un support de culture tridimensionnel » lorsque les adipocytes sont au contact du support, c'est dire qu'ils reposent sur le support ou qu'ils adhèrent au support.
Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de culture d'adipocytes scion l'invention comprend les étapes suivantes :
mettre en contact une population homogène d'adipocytes avec un support de culture tridimensionnel ;
incuber les adipocytes matures en contact avec le support de culture, en particulier dans des conditions permettant la survie des cellules, notamment pendant au moins 48 h.
Un « support de culture tridimensionnel » selon l'invention est constitué d'un matériau, notamment biocompatible, adapté à l'obtention d'une culture tridimensionnelle de cellules ; autrement dit, le support de culture tridimensionnel est adapté, en particulier, à l'obtention de plusieurs couches de cellules superposées. Ainsi, un support de culture ne permettant que la culture d'un tapis cellulaire bidimensionnel, à savoir une monocouche de cellules, n'est pas un support de culture tridimensionnel selon l'invention.
De préférence, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel. Plus préférablement, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est un hydrogel formé de l'association non covalente de peptides comprenant de 10 à 30 résidus, tels que des peptides comprenant une répétition de la séquence R-A-D-A, et notamment une séquence R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A- D-A (SEQ ID NO : 11). Les peptides formant l'hydrogel peuvent être modifiés, par exemple par l'adjonction de groupements acétyles sur l'extrémité N-terminale des peptides et par l'adjonction d'un groupement -N¾ à l'extrémité C-terminale des peptides. Ainsi, les peptides peuvent être représentés par la séquence : Ac-R-A-D-A- R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-CONH2. De manière particulièrement préférée, le support de culture tridimensionnel selon l'invention est l'hydrogel PuraMatrix™ (3DM, Inc.).
Les composés susceptibles d'être criblés selon l'invention peuvent être de tout type. En particulier, il peut s'agir de composés issus de chimiothèques. Par ailleurs, la culture d'adipocytes selon l'invention peut être utilisée pour cribler des composés activant la lipolyse, ou des composés activant le facteur de transcription PPARy2 ; ou des composés modulant la sensibilité à l'insuline.
Comme on l'entend ici, la lipolyse (ou activité lipolytique), la sensibilité à l'insuline, ou l'activité du facteur de transcription PPARy2, sont des paramètres représentatifs du métabolisme adipocytaire.
La détermination de la lipolyse peut être mise en œuvre par de nombreuses méthodes bien connues de l'homme du métier. En particulier, Γ activité lipolytique peut être déterminée en mesurant la quantité de glycérol et d'acides gras libres libérée par une culture d'adipocytes selon l'invention, notamment par spectrophotométrie comme cela est décrit dans Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128:747-753. La sensibilité à l'insuline des adipocytes peut être évaluée d'après la mesure du transport du glucose dans l'adipocyte comme cela est décrit dans Wood et al. (2007) B toc hem. Biophys. Res. Commun. 361:468-473. L'activité du facteur de transcription PPARy2 peut être mesurée en déterminant la quantité d'ARNm le codant dans une cellule, par exemple par RT-PCR ou par mesure directe de l'activité de liaison à ses sites spécifiques de l'ADN comme cela est notamment décrit dans Keophiphath et al. (2009) J. Nutr. 139 : 2055-2060.
Description des figures
Figures 1 , 2 et 3
Les figures 1 à 3 représentent respectivement le niveau d'expression relative (axe des ordonnées, unités arbitraires) mesuré par PCR en temps réel de trois marqueurs spécifiques des adipocytes matures, à savoir PPARy2, FABP4 (un transporteur d'acide gras dont le gène est une cible de PPARy2), et une adipokine, l'adiponectine, dans des adipocytes matures fraichement isolés de tissu adipeux d'une part (barres noires) et dans des adipocytes obtenus par différenciation in vitro de pré-adipocytes comme cela est décrit dans Lacasa et al Endocrinology 148:868-877, d'autre part (barres blanches).
Figure 4
La figure 4 représente un gel d'immunoélectrophorèse de lysats cellulaires préparés à partir d'adipocytes matures maintenus en culture sur le support tridimensionnel pendant 48 heures (3D) et d'adipocytes matures fraichement isolés (J0) puis marqués à l'aide d'un anticorps dirigé contre le marqueur adipocytaire aP2/FABP4 et d'un anticorps dirigé contre un témoin positif (actine).
Figures 5 et 6
Les figures 5 et 6 représentent respectivement les niveaux d'activité lipolytique (axe des ordonnées, en unités arbitraires) basale et stimulée par la forskoline (FK) d'adipocytes matures cultives (i) dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires), et (ii) en monocouches (2D) (barres grisées), en fonction de la durée de culture (axe des abscisses, en jours). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences répliquées.
Figures 7 et 8
Les figures 7 et 8 représentent respectivement les quantités de leptine et d'adiponectine sécrétées (axe des ordonnées, en pg/ml/24h) par des adipocytes mature cultivés dans le support de culture tridimensionnel (3D) en l'absence (barres blanches) et en présence de dexaméthasone (Dex) (barres noires). L'expérience présentée est représentative d'un ensemble de trois expériences répliquées.
Figure 9
La figure 9 représente l'expression génique relative de marqueurs adipocytaires (axes des ordonnées, unités arbitraires) mesurée par PCR en temps réel à partir d'extraits d'adipocytes matures fraichement isolés (barres noires) et d'adipocytes mature maintenus 48 h en culture dans le support de culture tridimensionnel (barres blanches).
Figure 10
La figure 10 représente un gel d'immunoélectrophorèse de lysats cellulaires préparés à partir d'adipocytes matures maintenus en culture sur le support tridimensionnel pendant 48 heures (3D) et d'adipocytes matures fraîchement isolés (2D) incubés en présence d'insuline ( 1 nM) aux temps indiqués puis marqués à l'aide d'un anticorps dirigé contre la forme phosphorylée d'Akt et d'un anticorps dirigé contre un témoin positif (actine).
Exemples
A. Matériels et Méthodes
1. Matériels
L'hydrogel peptidique BDTM PuramatrixTM est obtenu de BD Biosciences (Two oak Park, Bedford, MA, USA).
Les anticorps primaires anti cavéoline- 1 (N-20, SC-894) et antiCD36 (1.BB.3414, CS-70642) utilisés proviennent de Santa Cruz Biotcchnology (Santa Cruz, CA, USA). Les anticorps correspondants couplés à Cy3 sont obtenus auprès de GE healthcare (Little Chalfont, UK).
2. Préparation des adipocytes matures isolés
Les adipocytes matures sont isolés par traitement à la collagénase de tissu adipeux humain. Le tissu adipeux humain sous-cutané de femmes jeunes (<45 ans) et non obèses (IMC<30) est découpé dans du milieu de digestion (DMEM, 2% albumine pauvre en acides gras (A6003, Sigma St Louis, MI, USA), lmg/ml collagénase A (Roche Diagnostics, Mannhein, Allemagne) dans la proportion de lg de tissu pour 2 ml de milieu de digestion dans des tubes en polypropylène. Les tubes sont placés à 37°C pendant 30 minutes sous agitation (200 cycles /minute). Après digestion, le milieu est filtré sur de la gaze de coton tissé. Les adipocytes matures sont laissés à décanter par flottaison pendant 5 minutes puis sont lavés 3 fois avec 5 volumes de saccharose 10%. A la fin du dernier lavage, le saccharose est soutiré et les adipocytes matures sont prêts à être incorporés dans l'hydrogel Puramatrix™.
3. Préparation de l'hydrogel contenant les adipocytes matures
Comme préconisé par le fabricant, l'hydrogel est soniqué pendant 30 minutes afin de réduire sa viscosité. Le gel est ensuite dilué V/V avec du saccharose 20% puis centrifugé 5 minutes à 1000g pour éliminer les bulles d'air. Les adipocytes matures lavés sont rapidement incorporés à ce mélange avec une homogénéisation par aspiration douce à la pipette. Le mélange adipocytes/gel est ensuite distribué dans la proportion de 100 μL· par puits dans des plaques de culture de 96 puits. Très rapidement, le milieu d'incubation ( 150 μί) (DMEM/F12, 1% Pénicilline- Streptomycine, 50 nM Insuline) (DMI) est ajouté dans les puits et les plaques placées dans un incubateur à 37°C sous atmosphère à 5% de C02. Après 30 minutes, le milieu DMI est renouvelé. Le changement de milieu est répété deux fois. Le lendemain, le milieu DMI est changé et cette opération est renouvelée tous les jours. Dans certaines expériences, le DMI contient 100 nM dexaméthasone (Sigma Aldricht, saint Louis, MO, USA) ou 100 nM de rosiglitazone (Merck, Nottingham, UK).
4. Mesure de l'activité lipolvtique
Les puits contenant l'ensemble hydro gel/adipocytes sont lavés une première fois avec 150 μΐ^ de milieu Krebs Ringer (115 m M NaCl, 4,7 m M KC1, 1,2 m M CaCl2, 1 ,2 m M KH2P04, 1 ,2 mM MgS04, 20 m NaHC03), 5 m M glucose, 3% Albumine pauvre en acides gras (KRB/ALB) pour équilibrer l'hydrogel. 100 μϊ, de RB/ALB contenant soit 0,1% DMSO ou 10 μΜ Forskoline (Sigma) sont distribués dans les puits. Les plaques sont ensuite placées dans Γ incubateur pendant 4 heures. Le milieu est prélevé et placé 10 minutes à 70°C afin d'inactiver les enzymes adipocytaires pouvant interférer avec le dosage du glycérol. Le glycérol libéré est dosé par spectrophotométrie (Trousse de dosage du Glycerol, R-Biopharm) comme décrit dans Lacasa et al. (1991) Endocrinology 128:747-753.
5. Mesure de la sécrétion des adipokines
Le milieu DMI est prélevé 24 heures après le dernier changement de milieu.
Le dosage des adipokines (leptine, adiponectine) est réalisé directement sur ce milieu (100 μΐ) par la technique ELIS A (Duoset, R&D Systems, Minneapolis, MN USA) comme décrit par le fabricant.
6. Mesure de l'expression génique
Le milieu DMI est rapidement éliminé des puits et l'ensemble gel/adipocytes est homogénéisé par le tampon de lyse dans la proportion de 1ml de tampon de lyse/ lml d'ensemble gel/adipocytes. Les ARN sont ensuite extraits avec au préalable un traitement délipidant par le chloroforme en utilisant le kit d'extraction RNeasy (Qiagen, Courtaboeuf, France) comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Les ARNs totaux (1 μ«) sont ensuite transcrits en ADNc comme décrits dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. La liste des amorces utilisées est indiquée dans le tableau 1. Les essais de PCR en temps réel sont effectués avec 25ng d'ADNc et les amorces sens et antisens en utilisant le mélange PCR universel Sybergreen (Applied Biosystems, Minneapoîis, MN USA) et mesurés dans un appareil de détection (Applied Biosystems). Toutes les valeurs sont normalisées par rapport à l'expression de la protéine ribosomalc RPLPO.
Tableau 1 : Amorces utilisées
7. Techniques d'immunotluorcsccnce
Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est déposé dans des puits de plaques à 96 puits et fixé par 4% paraformaldéhyde (PAF) pendant 1 heure. Après inactivation du PAF par traitement par un tampon PBS/Glycinc 0,1 M, les cellules sont perméabilisées 5 minutes à température ambiante par 0,1% Triton X-100 dans du PBS/3% albumine. Les sites non spécifiques sont bloqués par le tampon PBS/3% albumine pendant 4 heures à température ambiante puis les anticorps primaires sont ajoutés et l'incubation se poursuit pendant 14 heures à 4°C. Après 6 lavages (1 heure), l'ensemble gel/adipocytes est incubé avec les anticorps secondaires pendant 4 heures à température ambiante dans l'obscurité. L'ensemble gel/adipocytes est ensuite lavé (1 heure) et des fragments de ce gel sont déposés dans du milieu de montage (Fluomount, Birmingham, Alabama, USA) entre lame et lamelles. Les lames sont examinées en fluorescence après 24 heures.
8. Techniques d'immuno-clectrophorèsc
Après élimination du milieu DMI et lavage par du PBS, l'ensemble gel/adipocytes est rapidement lysé par un volume de tampon de lyse (PBS, 2% IGEPAL, 0,2% SDS, 1% desoxycholate de sodium) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Complète mini et Phosphostop, Roche diagnostics). L'homogénat est ensuite gardé 15 minutes à 4°C puis centrifugé 10 minutes à 5000g. Le lysat cellulaire est ensuite collecté et dilué dans du tampon de Laemmli et soumis à une électrophorèse comme décrit dans Lacasa et al. (2007) Endocrinology 148:868-877. Après transfert des protéines sur membrane de cellulose, une coloration au rouge Ponceau permet de vérifier la charge et la qualité du transfert. Les membranes sont ensuite incubées avec les anticorps primaires à 4°C pendant 14 heures. Puis, après lavages, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires (GE Healthcare, Littlc Chai font, U ). Les signaux sont détectés par chimioluminescence (Détection ECL, GE Healthcare) et quantifiés par densitométrie.
9. Mesure de la sensibilité à l'insuline
Les puits contenant Phydro gel/adipocytes déprivés la veille en insuline sont incubés avec le milieu d'incubation ( 150 (DMEM/F 12 et 10 nM Insuline). Les plaques sont ensuite placées dans l'incubateur pendant 15 à 30 minutes. Le gel/adipocytes est rapidement lysé par un volume de tampon de lyse (PBS, 2% IGEPAL, 0,2% SDS, 1% déoxycholate de sodium) contenant un mélange d'inhibiteurs de protéases et de phosphatases (Complète mini et Phosphostop, Roche diagnostics) L'homogénat est ensuite gardé 15 minutes à 4°C puis centrifugé 10 minutes à 5000 g. Le lysat est ensuite collecté et dilué dans du tampon de Laemmli et soumis à une électrophorèse comme décrit précédemment. Les membranes sont alors incubées avec les anticorps primaires respectivement dirigés contre la forme phosphorylée de Akt au niveau de la Ser473 (réf. G7441 Promega) ou contre l'actine (témoin positif) (MAB1501R, Millipore) à 4°C pendant 14 heures. Puis après lavages, les membranes sont incubées avec les anticorps secondaires (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Les signaux sont détectés par chimioluminescence {Détection ECL, GE Healthcare) et quantifiés par densitométrie.
B. Résultats
1. Homogénéité de la population adipocytaire mature
La proportion de pré-adipocytes contaminants présent dans la population d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux utilisée pour la culture a été déterminée en mesurant l'expression par PCR en temps réel du marqueur Del l/Prefl spécifique des pré-adipocytes.
Cette mesure montre que la population d'adipocytes matures utilisée est essentiellement homogène, dans la mesure où elle comprend moins de 5% de pré- adipocytes (environ 4%).
2. Détection des protéines adipocytaircs
Les adipocytes matures cultivés dans le support tridimensionnel formé par l'hydrogel présentent bien un aspect uniloculaire après marquage par immuno fluorescence des protéines membranaires CD36 et cavéoline-1, ce qui démontre la possibilité de détecter des protéines adipocytaircs membranaires. Par ailleurs, les lysats adipocytaircs peuvent être analysés par immuno-électrophorèse comme le montre la détection de la protéine cytosolique adipocytaire aP2/FABP4 et de l'actine (Figure 4),
3. Activité lipolytique
L'activité lipolytique est mesurée en conditions basalcs et en conditions stimulées par 10 μΜ de forskoline sur les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel pendant 7 jours. Cette activité est également comparée à celle des mêmes cellules fraîchement isolées. Les résultats présentés dans les Figures 5 et 6 montrent que l'activité lipolytique basale ( Figure 5) et stimulée par la forskoline (Figure 6) est du même ordre que celle des adipocytes fraîchement isolés et reste constante pendant 5-7 jours. Par ailleurs, la présence de dexaméthasone (gluco corticoïde de synthèse) dans le milieu de culture ne modifie pas les activités basales et stimulées.
4. Sécrétion des adipokines : adiponectine et leptine
La sécrétion d' adiponectine (Figure 7) et de leptine (Figure 8) est mesurée jusqu'à 7 jours de maintien des adipocytes matures dans l'hydrogel en présence ou non de dexaméthasone (glucocorticoïde de synthèse). Par ailleurs, comme le montre la Figure 7, la sécrétion de leptine diminue au cours de la culture en l'absence de dexaméthasone alors que cette sécrétion augmente en présence du glucocorticoïde démontrant ainsi que la réponse à ces hormones reste fonctionnelle dans les adipocytes en culture. La sécrétion d' adiponectine reste quant à elle constante pendant 7 jours (Figure 8).
5. Expression génique des adipocytes
L'expression de gènes adipoeytaires est comparée entre des adipocytes matures fraîchement isolés et les mêmes cellules maintenues pendant 2 jours en hydrogel. La Figure 9 montre que l'expression des adipokines (leptine et adiponectine), du facteur de transcription majeur adipocytaire PPARy2 et de ses gènes cibles aP2/FABP4 et LPL reste constante.
6. Mesure de la sensibilité à l'insuline
Les adipocytes constituent une cible privilégiée de l'insuline, hormone anabolique majeure. Dans les adipocytes humains, l'insuline stimule la consommation du glucose entraînant une synthèse accrue de triglycérides et en revanche inhibe la dégradation de ces lipides. L'enzyme Akt transmet les effets métaboliques de l'insuline qui provoque son activation par phosphorylation de la senne 473 (Ser473Akt). Ainsi, le niveau de phosphorylation de Akt constitue un index de sensibilité à l'insuline des cellules.
L'insuline (10 nM) stimule la phosphorylation d'Akt d'une manière identique dans les adipocytes fraîchement isolés (2D) et ceux maintenus pendant 48h dans l'hydrogel (3D) indiquant ainsi un bon maintien de la réponse à l'insuline de ces cellules (Figure 10). Conclusions
Les adipocytes matures maintenus dans un support de culture tridimensionnel d'hydrogel avec un milieu d'incubation, qui peut être supplémenté avec des glucocorticoïdes et des thiazolinidinediones, présentent une activité lipolytique et de sécrétion des adipokines (leptine et adiponectine) comparable à celles d' adipocytes fraîchement isolés. De plus, les adipocytes matures maintenus dans l'hydrogel conservent pendant au moins 7 jours la capacité de réponse aux glucocorticoïdes, hormones cruciales pour le métabolisme et le développement adipocytaires (Macfarlane et al. (2008) J. Endocrinol. 197:189-204).
Ainsi, ce système peut être utilisé pour le criblage de composés pharmacoîogiques présentant des activités lipolytiques ou d'activation du facteur de transcription adipo-spécifiques PPARy2, par exemple.
Par ailleurs, les inventeurs ont montré que les adipocytes matures maintenus dans un support de culture tridimensionnel d'hydrogel selon Γ invention conservent au moins 2 jours leur sensibilité à l'insuline par rapport à des adipocytes matures fraîchement isolés. Ceci confirme que la culture d'adipocyte selon Γ invention est un modèle représentatif des adipocytes matures in vivo.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de culture d'adipocytes, dans lequel une population homogène d'adipocytes matures isoles de tissu adipeux est cultivée sur un support de culture tridimensionnel.
2. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 1, dans lequel le support de culture tridimensionnel est un hydro el.
3. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 1 ou 2, dans lequel le support de culture tridimensionnel est un hydrogel formé de l'association non covalente de peptides comprenant de 10 à 30 résidus.
4. Procédé de culture d'adipocytes selon la revendication 3, dans lequel les peptides comprennent la séquence R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A-R-A-D-A (SEQ ID NO : 11).
5. Procédé de culture d'adipocytes selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel le tissu adipeux a été prélevé chez un ou plusieurs individus humains.
6. Culture d'adipocytes, comprenant une monoculture d'adipocytes matures isolés de tissu adipeux au contact d'un support de culture tridimensionnel tel que défini dans l'une des revendications 1 à 3.
7. Culture d'adipocytes selon la revendication 6, dans laquelle le tissu adipeux a été prélevé chez un ou plusieurs individus humains.
8. Utilisation d'une culture d'adipocytes telle que définie dans la revendication 6 ou 7, pour le criblage de composés modulant le métabolisme adipocytaire.
9. Utilisation d'une culture d'adipocytes selon la revendication 8, pour le criblage de composés activant la lipolyse.
10. Utilisation d'une culture d'adipocytes selon la revendication 8, pour le criblage de composés activant le facteur de transcription PPARy2.
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