EP2362913A1 - Procede et dispositif par electromouillage pour l ' analyse genetique - Google Patents

Procede et dispositif par electromouillage pour l ' analyse genetique

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Publication number
EP2362913A1
EP2362913A1 EP09752856A EP09752856A EP2362913A1 EP 2362913 A1 EP2362913 A1 EP 2362913A1 EP 09752856 A EP09752856 A EP 09752856A EP 09752856 A EP09752856 A EP 09752856A EP 2362913 A1 EP2362913 A1 EP 2362913A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
zone
sample
amplification
support
electrowetting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP09752856A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Dorothée JARY
Christine Peponnet
Valérie VAN WILDER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP2362913A1 publication Critical patent/EP2362913A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6846—Common amplification features

Definitions

  • the present invention belongs to the field of molecular biology and, more particularly, to the field of nucleic acid amplification.
  • the present invention provides a miniaturized device, transportable, easy to implement and use and a method implementing such a device, both for the amplification of nucleic acids from samples including low volume samples.
  • the polymerase chain reaction technique or PCR (for "Polymerase Chain Reaction") technique is a molecular biology technique for the in vitro amplification of nucleic sequences. This technique based on thermal cycles with a denaturation step and a hybridization - elongation step began to be used at the end of the 80s. It is now a classic and unavoidable technique that applies to all fields of analysis in which the nucleic acids play a direct or indirect role. These areas include academic research; clinical and diagnostic research and analysis, with tests conducted on blood samples or cell biopsies or tissues; environmental monitoring; civilian surveillance; food safety and especially quality control; criminal analyzes on traces ...
  • the current tools for routine PCR including a well plate, a heating system and a detection system are relatively bulky and do not allow to develop fully portable systems for the analysis of ground. They also do not allow to develop very fast analysis systems because the constituent materials such as plastic and the volume of each analysis often of the order of ten ⁇ l lead to kinetics, during temperature changes, incompressible .
  • the first preamplification step has at most 10 cycles of denaturation and hybridization-elongation, and implements the two specific primers of the nucleic acid to be amplified in a small amount (less than 0.0625 ⁇ M).
  • the second amplification step uses the same primers in larger amounts for 30 to 35 cycles.
  • the method of the international application WO 02/20845 only addresses the problem of sensitivity without addressing the problem of multiple analyzes for the same sample of reduced volume.
  • the device comprises a compartment for 1 st step the amplification which may be a multiplexed amplification and several other compartments for the 2 nd amplification step. Liquid samples pass 1 compartment to other compartments by centrifugation, the 1st compartment being connected directly or indirectly to other compartments.
  • the international application WO 2008/106719 solves the problem of contaminating the samples by avoiding manipulation between the two amplification steps, but the device described remains heavy to use and can not be portable since it requires means to enable it to be used. centrifuge, to bring it to different temperatures and possibly valves of wax for interrupting fluidic communication between compartments.
  • the present invention overcomes, at least in part, the disadvantages and technical problems listed above. Indeed, the latter proposes a method and a device for amplification of nucleotidic molecules, based on electrowetting that make it possible to implement the amplification method in the field, to make a large number of parallel analyzes from of the same sample and in particular of the same "micro-sample", ie a sample of low or reduced volume, and without losing sensitivity.
  • the present invention provides a method of amplifying at least one nucleotide molecule contained in a sample, hereinafter referred to as sample (E), comprising the following successive steps of: a) subjecting said sample (E) to the st step amplification on a first zone of a carrier, hereinafter designated area (Zi); b) bringing by electrowetting at least a portion of the sample obtained after step (a), (hereinafter referred to the sample (E) of the zone (Zi) on at least one 2 nd area of said support , separate from the area
  • sample (E) comprising the following successive steps of: a) subjecting said sample (E) to the st step amplification on a first zone of a carrier, hereinafter designated area (Zi); b) bringing by electrowetting at least a portion of the sample obtained after step (a), (hereinafter referred to the sample (E) of the zone (Zi) on at least one 2 nd area of said support , separate from the area
  • zone (Z 2 ) and hereinafter referred to as zone (Z 2 ); c) subjecting the sample (E) to a 2 nd amplification step on said zone (Z 2).
  • amplification is meant, in the context of the present invention, both a conventional polymerase chain reaction (or “PCR") amplification and any PCR variant known to a person skilled in the art such as a PCR asymmetric, interleaved thermal asymmetric PCR, temperature gradient PCR, end-point PCR, multiplex PCR, real-time PCR, RT-PCR (Reverse Transcription - Polymerase Chain Reaction), or Quantitative PCR.
  • st (or 2 nd) amplification step means a step in a preview ere (or 2 nd) amplification ie a l st (or 2 nd) amplification.
  • RT-PCR is meant reverse transcription followed by polymerase chain reaction.
  • An RT-PCR thus comprises two steps: a reverse transcription step, ie a synthesis of a single-stranded DNA complementary to an RNA sequence, implementing a reverse transcriptase followed by a chain amplification step by polymerase.
  • a reverse transcription step ie a synthesis of a single-stranded DNA complementary to an RNA sequence
  • implementing a reverse transcriptase followed by a chain amplification step by polymerase.
  • multiplex PCR is meant an amplification method for amplifying more than one amplicon at a time. This technique uses a set of amplification primer pairs, each primer pair being designed or adapted to amplify a different nucleotide molecule.
  • multiplex RT-PCR is meant a multiplex PCR as defined above preceded by reverse transcription as previously defined.
  • real-time PCR is meant an amplification method that makes it possible to detect and / or quantify the presence of the amplicons during the PCR cycles, in particular by means of a fluorescent marker. Amplification of the amplicons or the signal related to the amount of amplicons formed during the PCR cycles is used for the detection and / or quantification of a given nucleotide sequence in the solution subjected to PCR.
  • amplicon is meant a target nucleotide molecule resulting from the PCR amplification of a nucleotide molecule present in the sample (E).
  • the size of the amplicons in the context of the present invention, can be between 40 and several thousands of base pairs (bp), in particular between 50 and 1000 bp, in particular between 60 and 500 bp and, especially, between 60 and 150 bp.
  • nucleotide molecule used herein is equivalent to the following terms and expressions: "nucleic acid”, “Polynucleotide”, “nucleotide sequence”, “polynucleotide sequence”.
  • nucleotide molecule is meant, in the context of the present invention, a chromosome; a gene ; a regulatory polynucleotide; DNA, single-stranded or double-stranded, genomic, chromosomal, chloroplast, plasmidic, mitochondrial, recombinant or complementary; total RNA; messenger RNA; ribosomal RNA; a transfer RNA; a portion or a fragment thereof.
  • sample (E) used in the context of the present invention may be very varied in nature.
  • This sample (E) is a sample of an element advantageously chosen from the group consisting of a liquid solution containing at least one nucleotide molecule as defined above; a biological fluid; a vegetable fluid such as sap, nectar and root exudate; one or more animal or plant cells; an animal or plant tissue; a food matrix; city water, river water, sea water, air-cooled towers; an air sample; a sample of earth; etc. or a mixture thereof.
  • the biological fluid is preferably selected from the group consisting of blood such as whole blood or anti-coagulated whole blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, sperm, urine, stool, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated spinal fluid bone, mucus or fluid of the respiratory tract, intestinal or genitourinary tract, cell extracts, tissue extracts and organ extracts.
  • the biological fluid may be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered from a human or animal body by any technique known to those skilled in the art such as extraction. , a sample or a wash. The steps of recovery and isolation of these different fluids from the human body or animal are performed prior to the implementation of the method according to the invention.
  • the sample (E) used in the context of the present invention has a volume of between 0.01 and 1000 ⁇ l, in particular between 0.02 and 500 ⁇ l, in particular between 0.05 and 100 ⁇ l, and more particularly, between 0.1 and 20 ⁇ l.
  • the amount of nucleotide molecules in the sample (E) is very variable: it may be between 1 and 10 10 nucleotide molecules / sample (E).
  • the nucleotide molecules contained in the sample (E) can be synthetic or natural, originating from the same organism or from different organisms.
  • the method according to the present invention implements a device comprising:
  • a support having at least two distinct zones (Z 1 ) and (Z 2 ); - said first zone (Zi), hereinafter referred to as the "large reservoir”, being adapted to a first amplification step;
  • the method according to the present invention may comprise a preliminary step of providing such a device or any variant of this device which will be presented below.
  • the sample (E) is brought into contact with the reaction mixture necessary for the amplification of the step
  • the reaction mixture used in step (a) can be any mixture of commercially available PCR reagents such as kits sold by Roche Applied Science or Applied companies.
  • reaction mixture used during the amplification of step (a) may have any of all the reaction mixtures described in the state of the art for PCR.
  • the reaction mixture comprises one or more of a thermostable polymerase such as Taq polymerase and possibly reverse transcriptase; a salt such as TRIS (for "trishydroxymethylaminomethane"), KCl, NaCl or MgCl 2; deoxyribonucleotide triphosphates such as dATP, dGTP, dTTP, dCTP and optionally dUTP; at least one pair of primers, specific or degenerate, which may comprise from 15 to 35 base pairs; and optionally at least one oligo-dT or specific primer useful for reverse transcription.
  • a thermostable polymerase such as Taq polymerase and possibly reverse transcriptase
  • a salt such as TRIS (for "trishydroxymethylaminomethane"), KCl, NaCl or MgCl 2
  • deoxyribonucleotide triphosphates such as dATP, dGTP, dTTP, dCTP and optionally dUTP
  • reaction mixture may contain other additives and in particular additives known to improve the efficiency of a PCR such as BSA (for "Bovine Serum Albumin"), betaine, formamide, dimethylsulfoxide , Acetamide or Amide C2, Tween-20, polyethylene glycol (PEG) 6000, proteins such as the "Single Strand binding protein from E. CoIi” marketed by Sigma Aldrich (increase in the specificity of the reaction) , or the "T4 Gene32 Protein from E.
  • BSA for "Bovine Serum Albumin”
  • betaine betaine
  • formamide dimethylsulfoxide
  • Acetamide or Amide C2 Acetamide or Amide C2
  • Tween-20 polyethylene glycol (PEG) 6000
  • proteins such as the "Single Strand binding protein from E. CoIi” marketed by Sigma Aldrich (increase in the specificity of the reaction) , or the "T4 Gene32 Protein from E.
  • CoIi B infected with T4aml34 phage / amBL292 / amE219" marketed by Roche Applied Science increase production yield of long PCR products, or the reaction yield in the presence of inhibitors such as Humic acid), Rnase inhibitors such as Ribonuclease Inhibitor or Diethyl pyrocarbonate which improve the yield of the reverse transcription step in RT-PCR.
  • This reaction mixture may contain, when the amplification of step (a) is an RT-PCR multiplexed or multiplexed PCR, from 2 to 100 different primer pairs, each primer pair being specific or degenerate and may comprise from 15 to 35 base pairs.
  • An example of a reaction mixture that can be used for the amplification of step (a) of the process according to the present invention comprises between 50 and 100 mM Tris, between 10 and 100 mM and, advantageously, 50 mM KCl (or NaCl).
  • each primer is advantageously present in this reaction mixture at a concentration of between 1 and 200 nM and in particular between 10 and 100 nM.
  • concentration of 0.5 U / ⁇ l is used instead of the 0.1 U / ⁇ l concentration recommended by ABI.
  • the sample (E) which is electrically conductive is brought to said zone (Z 1 ) by electrowetting and this, in the form of one (or more) drop (s).
  • the sample (E) can be brought directly to the zone (Z 1 ) or to a zone (Z 10 ), distinct from (Z 1 ) then to the zone (Z 1 ).
  • the contact between the sample (E) and the reaction mixture prior to step (a) of the process according to the invention can be done in different ways: it can take place before the disposal of the sample ( E) on the zone (Zi) of the support, in this case, it is the sample (E) associated with the reaction mixture which is disposed on said zone (Zi) by electrowetting; it can take place on the zone (Zi) of the support, after or simultaneously at the disposal of the sample (E) on said zone (Zi).
  • the reaction mixture is brought, by electrowetting, advantageously in the form of a drop, to the zone (Zi) where it mixes with the sample (E) by coalescence.
  • the reaction mixture may be present: either on the support and in particular on a zone (Z 3 ) of the support, said zone (Z 3 ) being distinct from the previously defined zones (Z 1 ) and (Z 2 ), either in a reaction mixture tank located outside the device used in the context of the present invention, and can be brought onto the support via an orifice passing through a substrate disposed opposite said support, said orifice being connectable to the reservoir reaction mixture directly or indirectly by any input device such as a capillary or a hose.
  • the reaction mixture or at least some of its components has (have) been previously dried (s) or freeze-dried (s) on the zone (Zi) of said support, during its manufacture or following it.
  • Additives known in the state of the art can be implemented for the drying or lyophilization stage of the reaction mixture or of some of its constituents such as primers or probes on the zone (Zi) of the support.
  • These additives are chosen in particular from sugars or sugar alcohols such as mannitol, sucrose, trehalose, glucose, etc. ; polymers such as dextran, PEG, polyvinylpyrrolidone (PVP) or polyvinyl acetate (PVA) ...; or else EDTA.
  • the quantity of reagents deposited for drying or lyophilization can be increased to avoid a loss of reagents during amplification of the step
  • step (a) due to the loss of reagents on the surfaces due to drying or lyophilization. It has been found that, without increasing the amount of dried reaction mixture constituents, the efficiency of the amplification during step (a) is decreased compared to that obtained under standard conditions, ie without dried reagents.
  • the amount of the constituents of the reaction mixture to be dried must be multiplied by a factor of about 2 relative to the amount used in the absence of any drying or lyophilization step.
  • the amplification implemented during step (a) of the method according to the invention is chosen from the group consisting of a multiplex PCR and a multiplexed RT-PCR.
  • This step constitutes a pre-amplification step of the nucleotide molecules contained in the sample (E).
  • step (a) of the method the multiplex PCR is carried out with a first denaturation step at 95 ° C, lasting from 1 second to 10 minutes depending on the size of the nucleotide molecules present in the sample (E) and the nature of the employed enzyme, followed by 5 to 15, advantageously 10 thermal cycles with a denaturation step at 95 ° C for 1 to 30 seconds and a hybridization-elongation step at a lower temperature, especially included between 50 and 70 ° C., advantageously 60 ° C., for 5 to 300 seconds and, in particular, for 5 to 30 seconds.
  • reverse transcription step can last from 5 to 90 minutes at 37 ° C and cycles of this multiplex PCR following the st step There can be 5 to 20, advantageously 10 in number.
  • the thermal cycles during the PCR can: comprising two temperatures with a hybridization-elongation stage of between 50 and 70 ° C., preferably 60 ° C., maintained for 5 to 300 seconds and a denaturation plateau at 95 ° C. held for 1 to 30 seconds; comprising three temperatures with a hybridization plateau of between 50 and 65 ° C., advantageously 60 ° C., maintained for 5 to 300 seconds, an elongation stage between 65 ° C.
  • step (a) of the process according to the invention are achieved, maintained and controlled using means for heating the support used and in particular the zone
  • the concentration for each pair of primers during the multiplex PCR cycles during step (a) of the process is between 10 and 200 nM, advantageously of the order of 50 nM, and may be different for the different nucleotide molecules. to amplify. In particular, it can be adjusted if it makes it possible to correct the biases amplification due to competition phenomena well known for multiplex amplification.
  • the duration of the cycles may also be adapted to correct all competition bias during the multiplex PCR.
  • the number of sequences amplified in parallel during this first step may be between 2 and several hundred, advantageously being of the order of several tens.
  • Step (b) of the process according to the present invention consists more particularly in forming at least one drop from the sample (E a ) obtained after step (a) of the electrowetting method and moving said drop of said zone (Zi) to said zone (Z 2 ) by electrowetting.
  • step (b) consists of forming, by electrowetting, x drop (s) from the sample (E a ) obtained after step (a) of the process and to move, by electrowetting, said (or said) drop (s) of said zone (Zi) to y zone (s) (Z 2 ) with x ⁇ y and x and y representing an integer between 1 and 500, advantageously between 1 and 50, in particular between 2 and 30 and, in particular, between 2 and 20.
  • the zones (Z 2 ) of the support are also referred to herein as "small reservoirs".
  • x is equal to y.
  • the (or) drop (s) formed during step (b) of the process has (s) an extremely small volume, of the order of one nanoliter.
  • This volume is in particular between 0.1 and 100 nor, in particular, between 1 and 80 ⁇ l and more particularly a volume of 10, 30, 50 or 65 ⁇ l.
  • the latter may have an identical volume (drops of calibrated volume) or different.
  • sample (E a ) corresponds to the sample (E) supplemented with the reaction mixture used for the amplification of step (a) and the amplicons produced during this first step. amplification.
  • the amplification during step (c) of the process according to the present invention is advantageously a simplex PCR, insofar as there is mainly a PCR implementing at least one pair of primers specific for a given nucleotide molecule and optionally at least one labeled probe specific for said nucleotide molecule.
  • labeled probe is meant, in the context of the present invention, a fluorescent probe capable of binding either to double-stranded DNA (SYBR technology) or to a specific DNA sequence (Taqman and Beacon technology) and which is fluorescent only once attached to the DNA.
  • SYBR technology double-stranded DNA
  • Tiqman and Beacon technology a specific DNA sequence
  • the specific labeled probes can be of any kind among the probes known and described in the state of the art.
  • specific labeled probes that may be used in the context of the present invention, mention may be made of TaqMan probes, molecular beacons, Scorpion probes and LNA probes.
  • step (c) employs from 1 to 4 pairs of primers specific for a given nucleotide molecule (or a given organism) and optionally from 1 to 4 labeled probes specific for said nucleotide molecule (or said organism), provided with 1 to 4 different markers.
  • the method according to the invention can take place on the zone (Z 2 ) of the support, after or simultaneously at the disposal of the sample (E a ) on said zone (Z 2 ).
  • an electrically conductive solution (S) containing the specific primer pair (s) and optionally the specific labeled probe (s) is supplied by electrowetting. , advantageously in the form of a drop, to the zone (Z 2 ) where it mixes with the sample (E a ).
  • said solution (S) may be present: - Or on the support and in particular on a zone (Z 4 ) of the support, said zone (Z 4 ) being distinct from the zones (Zi), (Z 2 ) and (Z 3 ) previously defined,
  • a solution tank (S) located outside the device implemented in the context of the present invention, and can be brought onto the support via a hole passing through the substrate disposed opposite said support, said orifice being be connected to the solution tank (S) directly or indirectly by any input device such as a capillary or a hose.
  • the concentration of primers and probes, specific, dried, after mixing with the sample drop (E a ) will be between 100 and 2000 nM, preferably of the order of 600 nM. That the pair (s) of specific primers and possibly the probe (s) specific label (s) occurs in liquid form or in dried or freeze-dried form, their mixing with the sample (E a ) at the level of the
  • (Z 2 ) is realized by a round-trip movement on electrodes adjacent to said zone (Z 2 ).
  • step (c) of the process of the present invention all temperature and duration conditions for the various cycles (denaturation, hybridization and elongation), known to those skilled in the art and suitable for PCR amplification with primers and possibly specific probes, are usable.
  • the amplification implemented during step (c) of the process according to the invention comprises from 20 to 40 cycles, in particular 30, each cycle including a denaturation step and a hybridization-elongation step.
  • the amplification implemented during step (c) of the method makes it possible to obtain amplicons of reduced size comprising from 50 to 200 bp and, in particular, from 60 to 150 bp.
  • the thermal cycles during the amplification implemented during step (c) of the process according to the invention may be between 50 and 70 ° C. for hybridization-elongation, advantageously of the order of 60 ° C. , and be of the order of 95 ° C for denaturation. They can last between 5 and 180 seconds, advantageously between 5 and 30 seconds, for the hybridization-elongation and between 1 and 30 seconds, advantageously between 1 and 5 seconds for the denaturation.
  • step (c) of the process according to the invention The temperatures used at each cycle during the amplification of step (c) of the process according to the invention are achieved, maintained and controlled using means for heating the support used and in particular the (or zone (s) (Z 2 ) of the latter, and possibly means for controlling the temperature of the support used and in particular the (or) zone (s) (Z 2 ) thereof.
  • step (c) of the method according to the invention and when the latter implements at least one specific labeled probe, the fluorescence of the drops can be measured at each thermal cycle for a real-time analysis or at the end of step (c) for end-point analysis. Fluorescent detection of the amplified DNA uses, during the step
  • a fluorophore such as Sybr green or a conventional fluorophore for labeling PCR probes such as Alexa Fluor488, Alexa Fluor546, Carboxy-Rhodamine 6G, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluorescein , HEX, JOE, TAMRA, TET, Texas Red.
  • step (c) of the method according to the invention when the latter implements no specific labeled probe, no detection of the amplicons is performed during this step.
  • the amplicons may require further analysis by another technique such as DNA hybridization or electrophoresis.
  • the product obtained after step (c) can be recovered on each zone (Z 2 ) manually or by electrowetting.
  • At least one drop is formed by electrowetting from the product obtained after step (c) and the latter is, by electrowetting, fed to a structure such as an orifice passing through the substrate disposed facing the support. , an orifice passing through said support or any hybrid device adaptable by those skilled in the art for handling discrete drops and / or transforming the sample in the form of drops in sample fluidic vein.
  • the method according to the present invention may comprise a preliminary step of purification of the sample (E), the latter involving the preparation of said sample and optionally the isolation of the nucleotide molecules contained in the latter.
  • This prior step can be carried out in different ways and can implement detergents leading to lysates, enzymes such as lysosyme or proteinase K, sonication or mechanical agitation in the presence of beads.
  • nucleotide molecules it may be necessary to purify the extracted nucleotide molecules in order to rid them of possible contaminants such as nucleases or PCR inhibitory molecules.
  • This purification of the nucleotide molecules may be carried out by phenol-chloroform extraction, by chromatography, by ion exchange, by electrophoresis, by equilibrium centrifugation and / or by hybridization capture on a solid support.
  • Commercially available purification and extraction kits or kits may be used in the prior purification step of the sample (E).
  • the device used in the context of the present invention may optionally be interfaced with an automatic sample preparation module making it possible to obtain a solution of pure nucleotide molecule (s) of volume adapted to said device, ie a volume of between 0.1 and 20 ⁇ l.
  • This sample preparation module can be directly present on the device.
  • it will preferentially be used a technique for purifying nucleotide molecules based on the use of magnetic particles such as magnetic beads on lab-chip operating by electrowetting, as described in the literature (Fouillet et al. microfluidic design and optimization of classic and new fluidic functions for Systems lab on a chip "3rd Microfluidics French Conference ⁇ Flu2006-23;.
  • This purification technique uses a magnet placed at proximity of the device implemented in the context of the present invention during the steps of magnetic beads capture. This magnet is removed during the redispersion steps of the balls. The redispersion is done by stirring the fluid by displacements of the drops by activation of the electrodes.
  • the method according to the present invention comprises a preliminary step of purifying the sample (E) comprising the steps of: i) contacting the sample (E) with a lysis solution ; ii) contacting the sample (E) lysed obtained after step (i) with at least one magnetic ball capable of adsorbing at least one nucleotide molecule; iii) washing said magnetic ball; iv) contacting said washed ball obtained after step (iii) with an elution solution and optionally heating the solution thus obtained; v) isolating the nucleotide molecule (s) obtained after step (iv).
  • the magnetic beads are advantageously in a saline solution in which the salt concentration and the pH are optimal for the capture of nucleotide molecules on the beads.
  • the magnetic beads used are advantageously commercially available and may be generic for the capture of nucleotide molecules (Chemicell silanol beads,) or specific (Dynabeads Streptavidin beads), or any other type of beads that can be functionalized with an oligonucleotide.
  • compositions of the lysis, washing and elution solutions are well known in the state of the art and those skilled in the art can prepare them without any inventive effort.
  • the lysis, washing or elution solutions can be obtained from commercial kits.
  • Commercial kits for purification of genomic or plasmid DNA, messenger RNA or total or ribosomal can be used
  • Bilatec Among the advantages of nucleic acid purification based on commercial kits on chip may however require adaptations: (1) possibly modification of the recommended volumes and (2) optionally addition of surfactant (s) in certain solutions to allow the introduction of the latter on the support implemented in the context of the present invention.
  • surfactants there may be mentioned Tween20 or Triton X-100, more particularly, used at final concentrations of 0.05% to 2%.
  • the latter may be placed on the support, advantageously by electrowetting, ⁇ ) prior to step (i) (sample
  • step (ii) following step (ii) and prior to step (iii) (sample (E) lysed and mixed with magnetic ball (s)).
  • the sample (E) can be deposited either on the zone (Zi) as defined above, or on a zone (Z 5 ) distinct from the zones (Zi), (Z 2 ), (Z 3 ) and
  • the sample can be brought onto the support via an orifice passing through the substrate disposed opposite said support, said orifice being connectable to the sample reservoir (E) directly or indirectly by any input device such as a capillary or a flexible.
  • the sample (E) deposited on the zone (Zi) or on a zone (Z 5 ) is mixed with the electrically conductive lysis solution, brought to said zone by electrowetting and this, in the form of one (or more) drop (s).
  • Said lysis solution may be present on the support on a zone (Z 6 ) distinct from the zones (Zi) to (Z 5 ) as previously defined or may be brought onto the support via an orifice passing through the substrate disposed opposite said support said orifice being connectable to the lysis solution reservoir directly or indirectly by any input device such as a capillary or a hose.
  • Said solution of magnetic beads may be present on the support on a zone (Z 7 ) distinct from the zones (Zi) to (Z 6 ) as previously defined or may be brought onto the support via an orifice passing through the substrate disposed opposite said support, said orifice being connectable to the magnetic bead solution tank directly or indirectly by any input device such as a capillary or a hose.
  • the magnetic beads are captured by means of a magnet to form a pellet of magnetic beads and the supernatant is removed from the device by electrowetting and this, in the form of a ( or several) drop (s).
  • the supernatant is advantageously directed towards a "trash can" present on the device.
  • the latter is advantageously as an orifice passing through the substrate disposed opposite the support, an orifice passing through said support or an enclave in the cover.
  • enclave means that the hood is hollowed in its thickness so as to provide a larger space between the hood and support.
  • the electrically conductive washing solution can be brought to the magnetic bead end, by electrowetting and this, in the form of one (or more) drop ( s).
  • Said washing solution may be present on the support on an area (Z 8 ) distinct from zones (Zi) to
  • the magnetic beads may be redispersed in the washing solution by a back-and-forth movement of the latter, induced by electrowetting.
  • the magnetic beads can again be recaptured into a compact base by bringing the magnet closer to the zone (Zi) or (Z 5 ).
  • the supernatant is again evacuated via the bin as previously defined.
  • a new washing solution identical or different to the previous one may be brought into contact with the pellet of magnetic beads according to the previously defined protocol variants and this, to repeat the washing step (iii) at least once.
  • the washing step (iii) may be repeated as many times as necessary with the same wash solution or with one or more other wash solutions.
  • Step (iv) consists of bringing into contact a solution of elution of the nucleotide molecules on the pellet of magnetic beads obtained following the last washing step.
  • the introduction of said electrically conductive elution solution advantageously uses electrowetting.
  • Said washing solution may be present on the support on a zone (Z 9 ) distinct from the zones (Z 1) to (Z 8 ) as previously defined or may be brought via a orifice through the substrate disposed opposite said support, said orifice being connectable to the elution solution reservoir directly or indirectly by any input device such as a capillary or a hose.
  • the magnetic beads can be redispersed in the elution solution by a back-and-forth movement of the latter, induced by electrowetting.
  • the elution solution in contact with the dispersed magnetic beads may be heated in order to more effectively "unhook" the nucleotide molecules retained on said beads.
  • This heating may involve the use of means for heating the support used and in particular the zone (Zi) or (Z 5 ) thereof, and possibly means for controlling the temperature of the support used and in particular of the zone (Zi) or (Z 5 ) of the latter.
  • Step (v) consists in capturing the magnetic beads freed of the nucleotide molecules in a compact base using a magnet.
  • the supernatant thus obtained is the pure solution containing the nucleotide molecules which constitutes the sample
  • the present invention also relates to a device that can be implemented in a method as defined above, said device comprising a support having at least two distinct zones (Z 1 ) and (Z 2 ),
  • said 2 nd zone (Z 2) being adapted for 2 nd amplification step; - Means for bringing a fluid from said zone (Zi) to said zone (Z 2 ) by electrowetting.
  • said zone (Z 2 ) of the support has at least one pair of specific primers and optionally at least one specific labeled probe such as previously defined, freeze-dried or dried (s).
  • the support may have at least one additional zone, distinct from the zones (Zi) and (Z 2 ) and chosen from the group consisting of:
  • the support also referred to herein as "chip” comprises, in a sectional view, a substrate having an electrode matrix, an insulating layer (ie dielectric) covering substrate and electrodes and a hydrophobic layer covering said dielectric layer .
  • the different zones (Zi) to (Z 9 ) as previously defined are therefore located on the surface of said hydrophobic layer.
  • zones is therefore mainly meant an arrangement of electrodes defined on the surface of the chip, each of these electrodes having a particular function and possibly a form adapted to the function.
  • the support may be carried out according to the methods described in the state of the art (Fouillet Y et al., "Microfluidic Design and Optimization of Classical and New Fluidic Functions for the Labeling of Microfluid Systems.” Nanofluid. (2008) 4 : 159-165).
  • the support has not only means for bringing a fluid from the zone (Zi) to the zone (Z 2 ) but also:
  • a fluid of a selected zone into the group formed by the zones (Z 3 ), (Z 6 ), (Z 7 ), (Z 8 ) and (Z 9 ) to a zone chosen between zone (Zi) and zone (Z 5 ).
  • These means make it possible to manipulate and move drops of fluid and implement series of adjacent electrodes in a plane, which can be arranged linearly but also in two dimensions, and this, to define a plane of displacement of a fluid. in the form of drops.
  • the displacement of the drops also involves a counter electrode maintaining electrical contact with the drop during this movement and a voltage generator for applying a potential difference between the electrodes and the counter electrode.
  • the electrodes may be made by depositing a metal layer such as an Au, Al, ITO, Pt, Cr or Cu layer by photolithography.
  • the dielectric layer may be Si 3 N 4 , parylene or SiO 2 .
  • the device of the invention may have an "open" configuration. In this case, it consists only of the support as defined above and the counter-electrode is advantageously in the form of a catenary wire.
  • the latter advantageously has a "closed” configuration.
  • the support of the device as previously defined is associated with a substrate disposed opposite said support.
  • This substrate also referred to herein as the "bonnet”
  • the hydrophobic layers of the support and the cover will preferentially deposited according to the method described in the article of Thery et al., "SiOC as a hydrophobic layer dielectric applications for electrowetting is” ll th International Conference on Minaturized Systems for Chemistry and Life Sciences ( MicroTas - 07-11 / 10/2007 - Paris France).
  • the drops disposed on the support or displaced on the support are confined between the support and the substrate disposed opposite said support, the space between the support and the substrate being between 10 and 1000 nm, advantageously between 50 and 100 nm. Given the small volume of liquid displaced via the drops, we can add an oil aimed at contain the drops and prevent any risk of evaporation.
  • Said oil may be, for example, a mineral oil such as an oil M3516 from Zigma-Aldrich or any other oil adaptable by those skilled in the art.
  • a mineral oil such as an oil M3516 from Zigma-Aldrich or any other oil adaptable by those skilled in the art.
  • the oil also has a passive role of protecting against sample contamination.
  • the substrate has, as already explained, at least one orifice or suction hole that may advantageously have a shape converging towards the space between the support and the substrate and allowing the deposition of a liquid on the support or its suction from this last. Indeed, the suction of a liquid on a given area of the support is possible when the electrodes connected to the orifice through the hood are activated. Similarly, the deposition of a liquid on a given area of the support is possible via said orifice when the latter is connected to an injection device.
  • the device according to the present invention may comprise means making it possible to carry the support or at least a given zone of this support and, more particularly, the zones (Zi), (Z 2 ) and (Z 5 ) as previously defined in a given temperature in particular during step (a), during the step
  • These means for carrying the support at a given temperature can be either a Peltier-type heating element in contact with the face of the support opposite to the face carrying the zones (Zi), (Z 2 ) and any other zones (Z 3 ) to (Z 9 ), one (or more) resistance ( s) heating (s) integrated into the device.
  • These integrated heating resistors can be made from a thin metal layer such as a thin layer of platinum, aluminum, doped silicon, etc., by defining patterns by conventional microfabrication techniques (photolithography and etching). for example) or for example by screen printing a conductive material such as platinum.
  • the design of these heating resistors (thickness, section, length) will be performed to generate a given heating power for a fixed voltage, obtaining a well-defined electrical resistance value.
  • these heating resistors can make it possible to locate the heating under the areas of interest, such as the zones (Z 1 ), (Z 2 ) and (Z 5 ), etc., in the context of the process carried out. in the invention.
  • the device according to the present invention may also comprise one (or more) temperature probe (s) which makes it possible to control the temperature of the samples and reagents as close as possible to the zones (Zi), (Z 2 ) and (Z 5 ) as previously defined.
  • the method of manufacturing such temperature probes is identical to the method of manufacturing the previously exposed heating resistors. It is, for example, It is possible to slave the probes to the Peltier block in order to precisely control the temperature of the support.
  • the manufacturing technologies of devices using electrowetting involve patterning steps in metal layers.
  • the production of heating resistors and temperature probes therefore does not add complexity to the overall manufacturing process of the device according to the invention.
  • the device according to the present invention differs from the devices of the prior art, in that: it is portable because there is miniaturization of the volumes and the bulk of the analysis consumable;
  • the device may have a large number of zones such as zones (Z 5 ) to (Z 9 ) previously defined, and the organization of zones (Z 1) to (Z 9 ) previously defined on the surface of the support and their provisions relative to each other are freer and are not imposed contrary to the case of the device described in the international application WO 2008/106719, in which the disposition is imposed by the centrifugal force which moves the liquids of a compartment to another.
  • the device once the sample (E) introduced on the latter may no longer be in contact with the contaminant potential environment. This is particularly the case of a closed device on which the reagent (s) necessary for the different PCR amplification steps and the possible purification step of the sample to be analyzed have been previously embedded in liquid form, dried or freeze-dried.
  • the device according to the invention offers the possibility of amplifying and analyzing at least two different samples, or even 3, 4, 5 or more different samples.
  • Figures 1 and 2 propose optimal architectures for the amplification of nucleotide molecules for two samples (El) and
  • FIG. 1 proposes a device seen from above, in "closed" configuration of which only the support is materialized, said device presenting:
  • FIG. 2 proposes a device seen from above, in "closed" configuration, said device having: two zones (Zio-i) and (Z10-2) on which the samples (Ei) and (E 2 ) are respectively deposited;
  • the present invention also relates to an amplification kit comprising: a device as previously defined, and
  • thermostable polymerase a reverse transcriptase, deoxyribonucleotide triphosphates, a primer pair, specific or degenerate, an oligo-dT or specific primer useful for reverse transcription and a labeled probe.
  • a thermostable polymerase a reverse transcriptase, deoxyribonucleotide triphosphates, a primer pair, specific or degenerate, an oligo-dT or specific primer useful for reverse transcription and a labeled probe.
  • the method, the device and the amplification kit according to the present invention allow and are useful in field analyzes such as environmental monitoring, civilian surveillance, food safety, medical analyzes that can pass from the blood test with syringe to capillary sampling, oncologic markers analyzes on microbiopsies, criminal analyzes on traces, agrifood quality controls, veterinary analyzes including the search for viral, bacterial, parasitic or mycological pathogens on hair samples or microbiopsies.
  • FIG. 1 proposes an optimized architecture device for performing the analysis of a sample by two-step gene amplification with pre-amplification of the sample by closed microcomponent functioning by electrowetting.
  • FIG. 2 proposes an optimized architecture device for performing the nucleic acid purification of two samples in parallel, followed by the two-step gene amplification analysis with pre-amplification of the closed microcomponent sample using electrowetting.
  • FIG. 3 provides an illustration of the realization of the amplification protocol in two steps on a micro device operating by electrowetting.
  • FIG. 4 shows the increase in fluorescence obtained in 3 small reservoirs during the second amplification step of the protocol making it possible to detect the presence of E. coli, Bacillus subtilis and adenovirus 2 pathogens in the starting sample.
  • Figure 5 shows the reagent feed, the position of the magnet and the electrodes connecting the reagent feed zone, the purification zone and the bin for the purification of nucleic acids on an EWOD chip from a blood sample.
  • Figure 6 shows the PCR analysis of the EWOD purified DNA on an EWOD chip operating by electrowetting from a blood sample.
  • a sample from a nucleic acid preparation containing 10 6 copies of the bacterium Escherichia coli gram 10 3 copies of virus Adenovirus Type II and 10 3 copies of the bacterium Bacillus subtilis is mixed with the PCR reagents (BSA 0.8 mg / ml, buffer of AmpliTaq GoId enzyme without MgCl 2 Ix, MgCl 2 3 mM, nucleotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 200 ⁇ M, betaine 450 mM, AmpliTaq GoId (0.5 U / ⁇ l) and pathogen specific primers investigated at different concentrations (Escherichia CoIi 20 nM / Adenovirus 20 nM / Bacillus subtilis 80 nM).
  • the sample is first mixed in tube with the PCR reagents for the first amplification step and heated for 10 minutes at 95 ° C. in a tube (step of denaturation of the DNA and activation of Taq GoId). This solution is then introduced on the chip through a hole of the cover (Ti) and by activation of the electrodes.
  • the first step of the cascade PCR is carried out in the large reservoir (Zi) (FIG. 3): 10 thermal cycles with a denaturation step at 95 ° C. (5 seconds) and a hybridization-elongation step at 60 ° C. during 20 seconds.
  • the sample is dispensed in drops of 65 ni and each drop is sent to the small storage tanks Z 2 -I, Z2-2, Z 2 - 3 and Z2-4.
  • the mixing of the drop of sample and specific reagents previously shipped is achieved by a movement of round-trip drops on electrodes adjacent to the small tank (10 A / R).
  • the second step of cascade PCR is performed in small reservoirs. It consists of 40 thermal cycles with a denaturation step at 95 ° C. (5 seconds) and a hybridization-elongation step at 60 ° C. for 20 seconds. During this second PCR step, the fluorescence of the drops is measured at each thermal cycle at the end of the hybridization-elongation step. The fluorescence signal obtained during this second amplification step is given in FIG. 4.
  • the first wash solution (Bilatest Genomic DNA kit wash buffer A) is then deposited in the hole (Ti) using a micro-pipette. It is introduced on the chip by activating the electrodes 1, 2 and 3 and then deactivating the electrode 1.
  • the beads are redispersed in the washing solution by moving the magnet (A) away from the cover and activating the electrodes 2 and 3 for 2 minutes.
  • the magnet (A) is then again approached the chip cover to reform a compact ball pellet.
  • the supernatant is then brought into the bin constituted by the hole (T 2 ) by activating the electrodes 3, 4, 5, 6, 7 and 8 and then successively deactivating the electrodes 3, 4, 5, 6, 7 and 8. L all of these steps for washing the magnetic beads with washing solution A is repeated three times ( Figure 5).
  • the second washing solution (washing buffer B of the Bilatest Genomic DNA kit) is then deposited in the hole (Ti) using a micro-pipette. It is introduced on the chip by activating the electrodes 1, 2 and 3 and then deactivating the electrode 1. The beads are not redispersed in this washing solution and the supernatant is brought into the bin constituted by the hole (T 2 ) by activating the electrodes 3, 4, 5, 6, 7 and 8 and then successively deactivating the electrodes 3, 4, 5, 6, 7 and 8.
  • the DNA elution solution (Bilatest Genomic DNA kit) is then deposited in the hole (Ti) using a micro-pipette. It is introduced on the chip by activating the electrodes 1, 2 and 3 and then deactivating the electrode 1.
  • the beads are redispersed in the elution solution by moving the magnet (A) away from the cover, activating the electrodes 2 successively. and 3 for 10 minutes and heating the chip to 55 ° C.
  • the magnet (A) is then again approached the chip cover to reform a compact ball pellet.
  • the supernatant is the purified DNA solution.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé d'amplification d'au moins une molécule nucléotidique contenue dans un échantillon (E) comprenant les étapes successives suivantes consistant à (a) soumettre ledit échantillon (E) à une 1ère étape d'amplification sur une zone (Z1) d'un support; (b) amener par électromouillage au moins une partie de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) de la zone (Z1) sur au moins une zone (Z2) dudit support, distincte de la zone (Z1); (c) soumettre l'échantillon (Ea) à une 2nde étape d'amplification sur ladite zone (Z2). La présente invention concerne un dispositif susceptible d'être mis en oeuvre dans le cadre dudit procédé.

Description

PROCEDE ET DISPOSITIF PAR ELECTROMOUILLAGE POUR L'ANALYSE GENETIQUE
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention appartient au domaine de la biologie moléculaire et, plus particulièrement, au domaine de l'amplification des acides nucléiques.
La présente invention propose un dispositif miniaturisé, transportable, facile à réaliser et à utiliser et un procédé mettant en œuvre un tel dispositif, tous deux permettant l'amplification d'acides nucléiques à partir d'échantillons et notamment d'échantillons de faible volume.
ETAT DE LA TECHNIQUE ANTERIEURE La technique de réaction en chaîne par polymérase ou technique PCR (pour « Polymerase Chain Reaction ») est une technique de biologie moléculaire permettant l'amplification in vitro de séquences nucléiques. Cette technique basée sur des cycles thermiques avec une étape de dénaturation et une étape d' hybridation-élongation a commencé à être utilisée à la fin des années 80. Elle constitue maintenant une technique classique et incontournable qui s'applique à tous les domaines d'analyse dans lesquels les acides nucléiques jouent un rôle direct ou indirect. Ces domaines englobent notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces... Les outils actuels pour la PCR de routine avec notamment une plaque à puits, un système de chauffage et un système de détection sont relativement encombrants et ne permettent pas de développer des systèmes totalement portables pour l'analyse de terrain. Ils ne permettent pas non plus de développer des systèmes d' analyse très rapides car les matériaux constitutifs tels que le plastique et le volume de chaque analyse souvent de l'ordre de la dizaine de μl entraînent une cinétique, lors des changements de température, incompressible.
La recherche dans le domaine de la PCR vise à faire évoluer cette technique vers la miniaturisation aussi bien au niveau de l'échantillon à analyser par PCR qu'au niveau de l'analyse elle-même. En effet, une telle miniaturisation permettrait d'opérer sur des échantillons de très faible volume, d'être moins invasifs lors de leur prélèvement, d'obtenir un procédé plus rapide et d'avoir des outils plus compacts et avantageusement portables pour l'analyse de terrain. Aussi, il existe une forte activité de recherche dans le domaine des microsystèmes pour la PCR. Une telle activité de recherche est notamment développée par la société Fluidigm.
De plus, à l'heure actuelle, il est impossible de faire de nombreuses analyses impliquant une PCR à partir d'un même échantillon de volume réduit, à moins de mettre en œuvre des outils compliqués, lourds à utiliser ou encore en développement, tels que le robot de pipettage Mosquito™ de la société TTP LabTech (Royaume-Uni) et les lames Ampligrid™ A480F de la société Advalytix (Allemagne) . Seuls les microsystèmes permettent d'envisager les analyses multiples pour un même échantillon de volume réduit mais aucun ne prévoit de phase de préenrichissement en acides nucléiques, ce qui peut conduire à des seuils de sensibilité assez mauvais puisque l'échantillon analysé est très petit.
La demande internationale WO 02/20845
(Thomas Jefferson University) vise à résoudre ce problème de sensibilité et propose une méthode de PCR en deux étapes permettant d'empêcher la formation de dimères d'amorces (ou « primer-dimer » en anglais) . Dans cette méthode, la première étape de préamplification présente au plus 10 cycles de dénaturation et d' hybridation-élongation, et met en œuvre les deux amorces spécifiques de l'acide nucléique à amplifier en une quantité faible (inférieure à 0,0625 μM) , alors que la seconde étape d'amplification utilise les mêmes amorces en plus grande quantité et ce, pendant 30 à 35 cycles. Toutefois, le procédé de la demande internationale WO 02/20845 ne s'intéresse qu'au problème de la sensibilité sans aborder le problème des analyses multiples pour un même échantillon de volume réduit .
La demande internationale WO 2004/051218 (Applera Corporation) décrit une méthode pour réaliser une PCR en 2 étapes avec une première amplification multiplexe utilisant un ensemble de paires d'amorces permettant d'amplifier différentes séquences polynucléotidiques puis une seconde avec addition de paires d'amorces spécifiques pour une séquence donnée. Le plus gros désavantage de cette méthode réside dans la nécessité d'ajouter des réactifs, voire d'aliquoter le produit de la réaction d'amplification multiplexe et donc d'ouvrir les tubes après cette première phase. Cela présente un risque très fort vis-à-vis des phénomènes de contamination par amplicons qui est bien connu des laboratoires travaillant avec la technique de PCR. Par ailleurs, le cas d'échantillons rares de très petit volume n'est pas visé dans cette demande.
La demande internationale WO 2008/106719 (Corbett Research) propose un dispositif et un procédé pour l'amplification d'acide nucléique en deux étapes. Le dispositif présente un 1er compartiment pour la lere étape d'amplification qui peut être une amplification multiplexe et plusieurs autres compartiments pour la 2nde étape d'amplification. Les échantillons liquides passent du 1er compartiment aux autres compartiments par centrifugation, ce 1er compartiment étant connecté, directement ou indirectement, aux autres compartiments. Ainsi, la demande internationale WO 2008/106719 résout le problème de la contamination des échantillons en évitant des manipulations entre les deux étapes d'amplification mais le dispositif décrit reste lourd à utiliser et ne peut être portable puisqu' il nécessite des moyens permettant de le centrifuger, de le porter à différentes températures et éventuellement des valves de cire pour interrompre les communications fluidiques entre compartiments.
Il existe donc un réel besoin d'un procédé d'amplification de molécules nucléotidiques utilisant un dispositif, avantageusement miniaturisé et transportable, permettant de réaliser un grand nombre d'analyses PCR en parallèle à partir d'un même échantillon tel qu'un échantillon de volume réduit.
EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet de remédier, au moins en partie, aux inconvénients et problèmes techniques listés ci-dessus. En effet, cette dernière propose un procédé et un dispositif d'amplification de molécules nucléotidiques, basés sur l' électromouillage qui permettent de mettre en œuvre le procédé d'amplification sur le terrain, de faire un grand nombre d' analyses en parallèle à partir du même échantillon et notamment d'un même « micro-échantillon », i.e. un échantillon de volume faible ou réduit, et ce, sans perdre en sensibilité .
Plus particulièrement, la présente invention propose un procédé d'amplification d'au moins une molécule nucléotidique contenue dans un échantillon, ci-après désigné échantillon (E) , comprenant les étapes successives suivantes consistant à : a) soumettre ledit échantillon (E) à une lere étape d'amplification sur une lere zone d'un support, ci-après désignée zone (Zi) ; b) amener par électromouillage au moins une partie de l'échantillon obtenu après l'étape (a), (ci- après désigné l'échantillon (Ea) , de la zone (Zi) sur au moins une 2ieme zone dudit support, distincte de la zone
(Zi) et ci-après désignée zone (Z2) ; c) soumettre l'échantillon (Ea) à une 2nde étape d'amplification sur ladite zone (Z2).
Par « amplification », on entend, dans le cadre de la présente invention, aussi bien une amplification par réaction en chaîne par polymérase (ou « PCR ») classique que toute variante de PCR connue de l'homme du métier telle qu'une PCR asymétrique, une PCR asymétrique thermique entrelacée, une PCR en gradient de température, une PCR en point final, une PCR multiplexe, une PCR en temps réel, une RT-PCR (acronyme anglais pour « Reverse Transcription - Polymérase Chain Reaction ») ou une PCR quantitative. Par « lere (ou 2nde) étape d'amplification », on entend une étape consistant en une lere (ou 2nde) amplification i.e. une lere (ou 2nde) amplification . Par « RT-PCR », on entend une transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne par polymérase. Une RT-PCR comporte donc deux étapes : une étape de transcription inverse, i.e. de synthèse d'un ADN simple brin complémentaire d'une séquence d'ARN, mettant en œuvre une transcriptase inverse suivie d'une étape d'amplification en chaîne par polymérase. Par « PCR multiplexe », on entend une méthode d'amplification visant à amplifier plus d'un amplicon à la fois. Cette technique utilise un ensemble de paires d'amorces d'amplification, chaque paire d'amorces étant conçue ou adaptée pour amplifier une molécule nucléotidique différente.
Par « RT-PCR multiplexe », on entend une PCR multiplexe telle que précédemment définie précédée d'une transcription inverse telle que précédemment définie.
Par « PCR en temps réel », on entend une méthode d'amplification qui permet de détecter et/ou de quantifier la présence des amplicons durant les cycles de PCR notamment grâce à un marqueur fluorescent. L'augmentation des amplicons ou du signal lié à la quantité d' amplicons formés durant les cycles de PCR est utilisée pour la détection et/ou la quantification d'une séquence nucléotidique donnée dans la solution soumise à la PCR. Par « amplicon », on entend une molécule nucléotidique cible résultant de l'amplification par PCR d'une molécule nucléotidique présente dans l'échantillon (E). La taille des amplicons, dans le cadre de la présente invention, peut être comprise entre 40 et plusieurs milliers de paires de bases (pb) , notamment entre 50 et 1000 pb, en particulier, entre 60 et 500 pb et, tout particulièrement, entre 60 et 150 pb.
L'expression « molécule nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique », « séquence polynucléotidique ». Par « molécule nucléotidique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal ; un ARN de transfert ; une portion ou un fragment de ceux-ci.
L'échantillon (E) mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut être de nature très variée. Cet échantillon (E) est un échantillon d'un élément avantageusement choisi dans le groupe constitué par une solution liquide contenant au moins une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudât racinaire ; une ou plusieurs cellules animales ou végétales ; un tissu animal ou végétal ; une matrice alimentaire ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ; etc. ou un de leurs mélanges. Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito-urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
L'échantillon (E) mis en œuvre dans le cadre de la présente invention présente un volume compris entre 0,01 et 1000 μl, notamment entre 0,02 et 500 μl, en particulier, entre 0,05 et 100 μl et, plus particulièrement, entre 0,1 et 20 μl .
La quantité de molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E) est très variable : elle peut être comprise entre 1 et 1010 molécules nucléotidiques/échantillon (E) . Les molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E) peuvent être synthétiques ou naturelles, issues d'un même organisme ou de différents organismes.
Le procédé selon la présente invention met en œuvre un dispositif comprenant :
- un support présentant au moins deux zones distinctes (Z1) et (Z2) ; - ladite lere zone (Zi) , ci-après désignée par l'expression « grand réservoir », étant adaptée pour une première étape d'amplification ;
- ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour une seconde étape d'amplification ;
- des moyens permettant d' amener un fluide de ladite zone Z1 vers ladite zone Z2 par électromouillage. Par conséquent, le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape préalable de fourniture d'un tel dispositif ou de toute variante de ce dispositif qui sera présentée ci-après.
Dans le cadre du procédé selon la présente invention et préalablement à l'étape (a) de ce dernier, l'échantillon (E) est mis en contact avec le mélange réactionnel nécessaire à l'amplification de l'étape
(a) .
Le mélange réactionnel mis en œuvre lors de l'étape (a) peut être tout mélange de réactifs pour PCR disponible dans le commerce tel que les kits vendus par les sociétés Roche Applied Science ou Applied
Biosystems .
En variante, le mélange réactionnel mis en œuvre lors de l'amplification de l'étape (a) peut avoir n'importe quelle composition parmi tous les mélanges réactionnels décrits dans l'état de l'art pour la PCR.
L'homme du métier saura préparer un tel mélange réactionnel en fonction du type de PCR mis en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention. Le mélange réactionnel comprend un ou plusieurs éléments parmi une polymérase thermostable telle que la Taq polymérase et éventuellement une transcriptase inverse ; un sel tel que du TRIS (pour « trishydroxyméthylaminométhane ») , du KCl, du NaCl ou du MgCl2 ; des déoxyribonucléotides triphosphates tels que dATP, dGTP, dTTP, dCTP et éventuellement dUTP ; au moins une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, pouvant comprendre de 15 à 35 paires de base ; et éventuellement au moins une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse. En outre, le mélange réactionnel peut contenir d'autres additifs et notamment des additifs connus pour améliorer l'efficacité d'une PCR tels que de la BSA (pour « Bovine Sérum Albumin ») , de la bétaine, de la formamide, du diméthylsulfoxyde, de l'Acetamide ou Amide C2, du Tween-20, du polyéthylène glycol (PEG) 6000, des protéines telles que la « Single Strand binding protein from E. CoIi » commercialisée par Sigma Aldrich (augmentation de la spécificité de la réaction), ou la « T4 Gene32 Protein from E. CoIi B infected with phage T4aml34/amBL292/amE219 » commercialisée par Roche Applied Science (augmentation du rendement de production des longs produits de PCR, ou le rendement de la réaction en présence d'inhibiteurs tels que l'acide humique) , des inhibiteurs de Rnases tels que le « Ribonuclease Inhibitor » ou le Diéthyl pyrocarbonate qui améliorent le rendement de l'étape de transcription inverse lors d'une RT-PCR.
Ce mélange réactionnel peut contenir, lorsque l'amplification de l'étape (a) est une RT-PCR multiplexe ou une PCR multiplexe, de 2 à 100 paires d'amorces différentes, chaque paire d'amorces étant spécifique ou dégénérée et pouvant comprendre de 15 à 35 paires de base. Un exemple de mélange réactionnel utilisable pour l'amplification de l'étape (a) du procédé selon la présente invention comprend entre 50 et 100 mM de Tris, entre 10 et 100 mM et, avantageusement, 50 mM de KCl (ou de NaCl) , entre 1 et 5 mM de MgCl2, entre 20 μM et 1 mM d'un mélange de dNTP contenant des dCTP, dATP, dTTP, dGTP et éventuellement dUTP, de la Taq Polymérase hot start ou non à 0,1 U/μl, des amorces comprenant entre 15 et 35 paires de bases et pouvant être spécifiques ou dégénérées. Chaque amorce est avantageusement présente, dans ce mélange réactionnel, à une concentration comprise entre 1 et 200 nM et, en particulier, entre 10 et 100 nM. De plus, il a été constaté que les résultats obtenus sont meilleurs lorsqu'il est ajouté, au mélange réactionnel, entre 0,1 à 1 mg/ml de BSA et de la Taq Polymérase en excès par rapport aux recommandations des fournisseurs. A titre d'exemple, dans le cas de la TaqGold ABI, une concentration de 0,5 U/μl est utilisée au lieu de la concentration de 0,1 U/μl recommandée par ABI.
L'échantillon (E) qui est électriquement conducteur est amené sur ladite zone (Z1) par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte (s) . L'échantillon (E) peut être amené directement sur la zone (Z1) ou sur une zone (Z10) , distincte de (Z1) puis sur la zone (Z1) . La mise en contact entre l'échantillon (E) et le mélange réactionnel préalablement à l'étape (a) du procédé selon l'invention peut se faire de différentes façons : - elle peut avoir lieu préalablement à la disposition de l'échantillon (E) sur la zone (Zi) du support, dans ce cas, c'est l'échantillon (E) associé au mélange réactionnel qui est disposé sur ladite zone (Zi) par électromouillage ; - elle peut avoir lieu sur la zone (Zi) du support, après ou simultanément à la disposition de l'échantillon (E) sur ladite zone (Zi).
Cette dernière mise en œuvre peut présenter plusieurs variantes. Dans une première variante, le mélange réactionnel est amené, par électromouillage, avantageusement sous forme d'une goutte, jusqu'à la zone (Zi) où il se mélange à l'échantillon (E) par coalescence. Dans cette variante, le mélange réactionnel peut être présent : - soit sur le support et notamment sur une zone (Z3) du support, ladite zone (Z3) étant distincte des zones (Zi) et (Z2) précédemment définies, soit dans un réservoir de mélange réactionnel situé à l'extérieur du dispositif mis en œuvre dans le cadre de la présente invention, et peut être amené sur le support via un orifice traversant un substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de mélange réactionnel directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible . Dans une seconde variante, le mélange réactionnel ou du moins certains de ses constituants a (ont) été préalablement séché (s) ou lyophilisé (s) sur la zone (Zi) dudit support, lors de sa fabrication ou suite à cette dernière.
Des additifs connus dans l'état de la technique peuvent être mis en œuvre pour l'étape de séchage ou lyophilisation du mélange réactionnel ou de certains de ses constituants tels que les amorces ou les sondes sur la zone (Zi) du support. Ces additifs sont notamment choisis parmi des sucres ou sucres- alcools tels que le mannitol, le sucrose, le tréhalose, le glucose, etc. ; des polymères tels que du dextran, du PEG, du polyvinylpyrrolidone (PVP) ou de l'acétate de polyvinyle (PVA)... ; ou encore l'EDTA. La quantité de réactifs déposés pour le séchage ou la lyophilisation peut être augmentée pour éviter une perte de réactifs lors de l'amplification de l'étape
(a) due à la perte de réactifs sur les surfaces à cause du séchage ou de la lyophilisation. Il a été constaté que, sans augmentation de la quantité de constituants du mélange réactionnel séchés, l'efficacité de l'amplification lors de l'étape (a) est diminuée par rapport à celle obtenue en conditions standards, i.e. sans réactifs séchés. Avantageusement, la quantité des constituants du mélange réactionnel à sécher doit être multipliée par un facteur d'environ 2 par rapport à la quantité utilisée en absence d'une quelconque étape de séchage ou de lyophilisation. Lors de l'étape (a) du procédé selon la présente invention, toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation) , connues de l'homme du métier et appropriées au type de PCR utilisé lors de cette étape, sont utilisables.
Avantageusement, l'amplification mise en œuvre lors de l'étape (a) du procédé selon l'invention est choisie dans le groupe constitué par une PCR multiplexe et une RT-PCR multiplexe. Cette étape constitue une étape de pré-amplification des molécules nucléotidiques contenues dans l'échantillon (E).
Lors de l'étape (a) du procédé, la PCR multiplexe est effectuée avec une première étape de dénaturation à 95°C, durant de 1 seconde à 10 minutes en fonction de la taille des molécules nucléotidiques présentes dans l'échantillon (E) et de la nature de l'enzyme employée, suivie de 5 à 15, avantageusement, 10 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C durant 1 à 30 secondes et une étape d'hybridation— élongation à une température inférieure, notamment comprise entre 50 et 700C, avantageusement de 600C, pendant 5 à 300 secondes et, en particulier, pendant 5 à 30 secondes. Lors de l'étape (a) du procédé et dans le cadre d'une RT-PCR multiplexe, l'étape de transcription inverse peut durer de 5 à 90 minutes à 37°C et les cycles de PCR multiplexe suivant cette lere étape peuvent être au nombre de 5 à 20, avantageusement au nombre de 10. Les cycles thermiques lors de la PCR peuvent : comprendre deux températures avec un palier d' hybridation—élongation compris entre 50 et 700C, préférentiellement 600C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; comprendre trois températures avec un palier d'hybridation compris entre 50 et 65°C, avantageusement de 600C, maintenu pendant 5 à 300 secondes, un palier d'élongation entre 65°C et 75°C, avantageusement de 72°C, maintenu pendant 5 à 300 secondes et un palier de dénaturation à 95°C maintenu pendant 1 à 30 secondes ; ou être des cycles « touch down » consistant à diminuer progressivement la température d'hybridation de 1°C par cycle par exemple.
Les températures mises en œuvre à chaque cycle lors de l'amplification de l'étape (a) du procédé selon l'invention sont atteintes, maintenues et contrôlées en utilisant des moyens permettant de chauffer le support mis en œuvre et notamment la zone
(Zi) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en œuvre et notamment de la (ou des) zone (s) (Z2) de ce dernier . La concentration pour chaque paire d' amorces pendant les cycles de PCR multiplexe lors de l'étape (a) du procédé est comprise entre 10 et 200 nM, avantageusement de l'ordre de 50 nM, et pourra être différente pour les différentes molécules nucléotidiques à amplifier. Elle pourra notamment être ajustée si cela permet de corriger les biais d'amplification dus aux phénomènes de compétition bien connus pour l'amplification multiplexe. La durée des cycles pourra également être adaptée pour corriger tous les biais de compétition lors de la PCR multiplexe. Le nombre de séquences amplifiées en parallèle lors de cette première étape peut être compris entre 2 et plusieurs centaines, avantageusement être de l'ordre de plusieurs dizaines.
L'étape (b) du procédé selon la présente invention consiste plus particulièrement à former au moins une goutte à partir de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) du procédé par électromouillage et à déplacer ladite goutte de ladite zone (Zi) vers ladite zone (Z2) par électromouillage.
Avantageusement, l'étape (b) consiste à former, par électromouillage, x goutte (s) à partir de l'échantillon (Ea) obtenu après l'étape (a) du procédé et à déplacer, par électromouillage, ladite (ou lesdites) goutte (s) de ladite zone (Zi) vers y zone (s) (Z2) avec x ≥ y et x et y représentant un entier compris entre 1 et 500, avantageusement entre 1 et 50, notamment entre 2 et 30 et, en particulier, entre 2 et 20. Les zones (Z2) du support sont également désignées, dans la présente, par l'expression « petits réservoirs ». Dans une variante particulière, x est égal à y.
La (ou les) goutte (s) formée (s) lors de l'étape (b) du procédé présente (nt) un volume extrêmement réduit, de l'ordre du nanolitre. Ce volume est notamment compris 0,1 et 100 ni, en particulier, entre 1 et 80 ni et, plus particulièrement, un volume de 10, 30, 50 ou 65 ni. Dans le cas où plusieurs gouttes sont formées à partir de l'échantillon (Ea) , ces dernières peuvent présenter un volume identique (gouttes de volume calibré) ou différent.
Il est clair pour l'homme du métier que l'échantillon (Ea) correspond à l'échantillon (E) complété du mélange réactionnel utilisé pour l'amplification de l'étape (a) et des amplicons produits lors de cette première étape d'amplification.
L'amplification lors de l'étape (c) du procédé selon la présente invention est avantageusement une PCR simplex, dans la mesure où on a principalement une PCR mettant en œuvre au moins une paire d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique de ladite molécule nucléotidique.
Par « sonde marquée », on entend, dans le cadre de la présente invention, une sonde fluorescente susceptible de se fixer soit sur l'ADN double brin (technologie SYBR) ou sur une séquence d'ADN précise (technologie Taqman et Beacon) et qui n'est fluorescente qu'une fois fixée à l'ADN. Les sondes marquées spécifiques peuvent être de n'importe quelle sorte parmi les sondes connues et décrites dans l'état de l'art. A titre d'exemples de sondes marquées spécifiques utilisables dans le cadre de la présente invention, on peut citer les sondes TaqMan, les molecular Beacons, les sondes Scorpion et les sondes LNA. Avantageusement, l'étape (c) met en œuvre de 1 à 4 paires d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée (ou d'un organisme donné) et éventuellement de 1 à 4 sondes marquées spécifiques de ladite molécule nucléotidique (ou dudit organisme) , munies de 1 à 4 marqueurs différents.
Dans le cadre de la présente invention, après la disposition d'au moins une goutte d'échantillon (Ea) sur au moins une zone (Z2) du support et préalablement à l'étape (c) dudit procédé, ladite goutte est mise en contact avec la (ou les) paire (s) d'amorces spécifiques et éventuellement avec la (ou les) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) nécessaire (s) à l'amplification de l'étape (c) .
La mise en contact entre l'échantillon (Ea) et la (ou les) paire (s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) préalablement à l'étape (c) du procédé selon l'invention peut avoir lieu sur la zone (Z2) du support, après ou simultanément à la disposition de l'échantillon (Ea) sur ladite zone (Z2).
Dans une première variante, une solution (S) électriquement conductrice contenant la (ou les) paire (s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) est amenée, par électromouillage, avantageusement sous forme d'une goutte, jusqu'à la zone (Z2) où elle se mélange à l'échantillon (Ea) . Dans cette variante, ladite solution (S) peut être présente : - soit sur le support et notamment sur une zone (Z4) du support, ladite zone (Z4) étant distincte des zones (Zi) , (Z2) et (Z3) précédemment définies,
- soit dans un réservoir de solution (S) situé à l'extérieur du dispositif mis en œuvre dans le cadre de la présente invention, et peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution (S) directement ou indirectement et ce, par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible.
Dans une seconde variante, la (ou les) paire (s) d'amorce (s) spécifique (s) et éventuellement la
(ou les) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) a (ont) été préalablement séchée(s) ou lyophilisée (s) sur la zone (Z2) dudit support, lors de sa fabrication ou suite à cette dernière.
Les particularités précédemment décrites pour l'étape de séchage ou de lyophilisation du mélange réactionnel ou de certains de ses constituants sur la zone (Zi) du support telles que l'ajout d'additifs et la quantité de réactifs s'appliquent mutatis mutandis à l'étape de séchage ou de lyophilisation de la (ou des) paire (s) d'amorces spécifiques et éventuellement de la (ou des) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) sur la zone (Z2) dudit support. La concentration d'amorces et de sondes, spécifiques, séchées, après mélange avec la goutte d'échantillon (Ea) sera comprise entre 100 et 2000 nM, avantageusement de l'ordre de 600 nM. Que la (ou les) paire (s) d'amorces spécifiques et éventuellement la (ou les) sonde (s) marquée (s) spécifique (s) se présente (nt) sous forme liquide ou sous forme séchée ou lyophilisée, leur mélange avec l'échantillon (Ea) au niveau de la zone
(Z2) est réalisé par un mouvement d'aller-retour sur des électrodes adjacentes à ladite zone (Z2) .
Lors de l'étape (c) du procédé de la présente invention, toutes conditions de température et de durée pour les différents cycles (dénaturation, hybridation et élongation) , connues de l'homme du métier et appropriées pour une amplification PCR avec amorces et éventuellement sondes spécifiques, sont utilisables .
Avantageusement, l'amplification mise en œuvre lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention comprend de 20 à 40 cycles, notamment 30, chaque cycle incluant une étape de dénaturation et une étape d' hybridation—élongation . De plus, l'amplification mise en œuvre lors de l'étape (c) du procédé permet d'obtenir des amplicons de taille réduite comprenant de 50 à 200 pb et, en particulier, de 60 à 150 pb .
Les cycles thermiques lors de l'amplification mise en œuvre lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention peuvent être compris entre 50 et 700C pour l' hybridation—élongation, avantageusement de l'ordre de 600C, et être de l'ordre de 95°C pour la dénaturation. Ils peuvent durer entre 5 et 180 secondes, avantageusement entre 5 et 30 secondes, pour l' hybridation—élongation et entre 1 et 30 secondes, avantageusement entre 1 et 5 secondes pour la dénaturation. Les températures mises en œuvre à chaque cycle lors de l'amplification de l'étape (c) du procédé selon l'invention sont atteintes, maintenues et contrôlées en utilisant des moyens permettant de chauffer le support mis en œuvre et notamment la (ou les) zone (s) (Z2) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en œuvre et notamment de la (ou des) zone (s) (Z2) de ce dernier. Lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention et lorsque cette dernière met en œuvre au moins une sonde marquée spécifique, la fluorescence des gouttes peut être mesurée à chaque cycle thermique pour une analyse en temps réel ou bien à la fin de l'étape (c) pour une analyse en point final. La détection fluorescente de l'ADN amplifié utilise, pendant l'étape
(c) du procédé selon l'invention, un fluorophore tel que le Sybr green ou un fluorophore classique pour le marquage des sondes de PCR tel que Alexa Fluor488, Alexa Fluor546, Carboxy-Rhodamine 6G, Cy3, Cy5, 6-FAM, Fluorescein, HEX, JOE, TAMRA, TET, Texas Red.
Lors de l'étape (c) du procédé selon l'invention et lorsque cette dernière ne met en œuvre aucune sonde marquée spécifique, aucune détection des amplicons n'est effectuée lors de cette étape. Les amplicons peuvent nécessiter une analyse ultérieure par une autre technique telle que de l'hybridation sur puce à ADN ou de l' électrophorèse . Dans ce cas, il peut être nécessaire d'associer le dispositif mis en œuvre lors du procédé selon l'invention et plus particulièrement la (ou les) zone (s) (Z2) vers un autre dispositif d'analyse. Ainsi, dans cette variante, le produit obtenu après l'étape (c) peut être récupéré sur chaque zone (Z2) manuellement ou par électromouillage.
Dans ce dernier cas, au moins une goutte est formée par électromouillage à partir du produit obtenu après l'étape (c) et cette dernière est, par électromouillage, amenée vers une structure telle qu'un orifice traversant le substrat disposé en regard du support, un orifice traversant ledit support ou tout dispositif hybride adaptable par l'homme du métier permettant de manipuler des gouttes discrètes et/ou transformer l'échantillon sous forme de gouttes en échantillon en veine fluidique.
En fonction de la nature de l'échantillon
(E) mis en œuvre dans le cadre de la présente invention et tel que précédemment défini, le procédé selon la présente invention peut comprendre une étape préalable de purification de l'échantillon (E), cette dernière impliquant la préparation dudit échantillon et éventuellement l'isolement des molécules nucléotidiques contenues dans ce dernier.
Cette étape préalable peut être réalisée de différentes façons et peut mettre en œuvre des détergents conduisant à des lysats, des enzymes telles qu'une lysosyme ou la protéinase K, un traitement aux ultrasons ou une agitation mécanique en présence de billes .
Dans certains cas, il peut être nécessaire de purifier les molécules nucléotidiques extraites afin de les débarrasser d'éventuels contaminants tels que des nucléases ou des molécules inhibitrices de PCR. Cette purification des molécules nucléotidiques peut être réalisée par extraction au phénol-chloroforme, par chromatographie, par échange d'ions, par électrophorèse, par centrifugation à l'équilibre et/ou par capture par hybridation sur un support solide. Des trousses ou kits de purification et d'extraction disponibles dans le commerce peuvent être utilisés lors de l'étape préalable de purification de l'échantillon (E) .
Ainsi, le dispositif mis en œuvre dans le cadre de la présente invention peut éventuellement être interface avec un module de préparation automatique d'échantillons permettant d'obtenir une solution de molécule (s) nucléotidique (s) pure de volume adapté audit dispositif, i.e. un volume compris entre 0,1 à 20 μl . Ce module de préparation d'échantillon peut être directement présent sur le dispositif. Dans ce cas, il sera préférentiellement utilisé une technique de purification des molécules nucléotidiques reposant sur l'utilisation de particules magnétiques telles que des billes magnétiques sur laboratoire sur puce fonctionnant par électromouillage, comme il est décrit dans la littérature (Fouillet et al. « Digital microfluidic design and optimization of classic and new fluidic functions for lab on a chip Systems » 3rd Microfluidics French Conférence μFlu2006-23 ; Yizhong Wang et al., « Efficient in-droplet séparation of magnetic particles for digital microfluidics » J. Micromech. Microeng. 17 (2007) 2148-2156) . Cette technique de purification utilise un aimant placé à proximité du dispositif mis en œuvre dans le cadre de la présente invention lors des étapes de capture des billes magnétiques. Cet aimant est éloigné lors des étapes de redispersion des billes. La redispersion se fait en agitant le fluide par des déplacements des gouttes par activation des électrodes.
Dans une forme de mise en œuvre particulière, le procédé selon la présente invention comprend une étape préalable de purification de l'échantillon (E) comprenant les étapes consistant à : i) mettre en contact l'échantillon (E) avec une solution de lyse ; ii) mettre en contact l'échantillon (E) lysé obtenu après l'étape (i) avec au moins une bille magnétique susceptible d' adsorber au moins une molécule nucléotidique ; iii) laver ladite bille magnétique ; iv) mettre en contact ladite bille lavée obtenue après l'étape (iii) avec une solution d'élution et éventuellement chauffer la solution ainsi obtenue ; v) isoler la (ou les) molécule (s) nucléotidique (s) obtenue (s) après l'étape (iv) .
Lors de l'étape (ii) , les billes magnétiques sont avantageusement dans une solution saline dans laquelle la concentration en sels et le pH sont optimaux pour la capture de molécules nucléotidiques sur les billes. Les billes magnétiques utilisées sont avantageusement issues du commerce et peuvent être génériques pour la capture de molécules nucléotidiques (billes silanol Chemicell, ) ou spécifiques (billes Dynabeads Streptavidine) , ou tout autre type de billes que l'on peut fonctionnaliser avec un oligonucléotide .
Les compositions des solutions de lyse, de lavage et d'élution sont bien connues de l'état de la technique et l'homme du métier peut les préparer sans aucun effort inventif.
De façon alternative, les solutions de lyse, de lavage ou d'élution peuvent être obtenues à partir de kits commerciaux. Des kits commerciaux de purification d'ADN génomique ou plasmidique, d'ARN messagers ou total ou ribosomal peuvent être utilisés
(kits développés par Dynal, Polysciences, Novagen,
Bilatec, ...) en choisissant le kit adapté au type d'échantillon (E) testé et à l'application visée. La réalisation de la purification d'acides nucléiques à base de kits commerciaux sur puce peut toutefois demander des adaptations : (1) éventuellement modification des volumes préconisés et (2) éventuellement addition de tensioactif (s) dans certaines solutions pour permettre l'introduction de ces dernières sur le support mis en œuvre dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemples de tensioactifs utilisables, on peut citer du Tween20 ou du Triton X-IOO, plus particulièrement, utilisé à des concentrations finales de 0,05% à 2%.
Lors de l'étape préalable de purification de l'échantillon (E), ce dernier peut être disposé sur le support, avantageusement par électromouillage, α) préalablement à l'étape (i) (échantillon
(E) brut), β) suite à cette dernière et préalablement à l'étape (ii) (échantillon (E) lysé) ,
Y) suite à l'étape (ii) et préalablement à l'étape (iii) (échantillon (E) lysé et mélangé avec une (ou des) bille (s) magnétique (s) ).
L'échantillon (E) peut être déposé soit sur la zone (Zi) telle que précédemment définie, soit sur une zone (Z5) distincte des zones (Zi) , (Z2) , (Z3) et
(Z4) telles que précédemment définies. L'échantillon peut être amené sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir d'échantillon (E) directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible.
Dans la variante (α) , l'échantillon (E) déposé sur la zone (Zi) ou sur une zone (Z5) est mélangé avec la solution de lyse électriquement conductrice, amenée sur ladite zone par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte (s). Ladite solution de lyse peut être présente sur le support sur une zone (Z6) distincte des zones (Zi) à (Z5) telles que précédemment définies ou peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de lyse directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible.
Par la suite ou dans la variante (β), l'échantillon (E) lysé, présent sur la zone (Zi) ou (Z5) , est mélangé avec la solution de billes magnétiques, électriquement conductrice, amenée sur ladite zone par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte (s). Ladite solution de billes magnétiques peut être présente sur le support sur une zone (Z7) distincte des zones (Zi) à (Z6) telles que précédemment définies ou peut être amenée sur le support via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de billes magnétiques directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible.
Par la suite ou suite à la variante (Y) , les billes magnétiques sont capturées à l'aide d'un aimant pour former un culot de billes magnétiques et le surnageant est évacué du dispositif par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte (s). Le surnageant est avantageusement dirigé vers une « poubelle » présente sur le dispositif. Cette dernière se présente avantageusement comme un orifice traversant le substrat disposé en regard du support, un orifice traversant ledit support ou une enclave dans le capot. Par « enclave », on entend que le capot est creusé dans son épaisseur de façon à aménager un espace plus important entre capot et support.
Préalablement à l'étape (iii) de lavage des billes magnétiques, la solution de lavage, électriquement conductrice, peut être amenée jusqu'au culot de billes magnétiques, par électromouillage et ce, sous forme d'une (ou de plusieurs) goutte (s) . Ladite solution de lavage peut être présente sur le support sur une zone (Z8) distincte des zones (Zi) à
(Z7) telles que précédemment définies ou peut être amenée via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution de lavage directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Lors de l'étape (iii) , les billes magnétiques peuvent être redispersées dans la solution de lavage par un mouvement d'aller-retour de cette dernière, induit par électromouillage.
Les billes magnétiques peuvent à nouveau être recapturées en un culot compact en approchant l'aimant de la zone (Zi) ou (Z5) . Le surnageant est à nouveau évacué via la poubelle telle que précédemment définie. Une nouvelle solution de lavage identique ou différente à la précédente peut être mise en contact avec le culot de billes magnétiques selon les variantes protocolaires précédemment définies et ce, pour répéter l'étape (iii) de lavage au moins une fois. L'étape (iii) de lavage peut être répétée autant de fois que nécessaire avec la même solution de lavage ou avec une ou plusieurs autres solutions de lavage.
L'étape (iv) consiste à mettre en contact une solution d'élution des molécules nucléotidiques sur le culot de billes magnétiques obtenu suite à la dernière étape de lavage. L'introduction de ladite solution d'élution électriquement conductrice utilise avantageusement l' électromouillage . Ladite solution de lavage peut être présente sur le support sur une zone (Z9) distincte des zones (Zi) à (Z8) telles que précédemment définies ou peut être amenée via un orifice traversant le substrat disposé en regard dudit support, ledit orifice pouvant être connecté au réservoir de solution d'élution directement ou indirectement par tout dispositif d'entrée tel qu'un capillaire ou un flexible. Lors de l'étape (iv) , les billes magnétiques peuvent être redispersées dans la solution d'élution par un mouvement d'aller-retour de cette dernière, induit par électromouillage. Lors de l'étape (iv) , la solution d'élution en contact avec les billes magnétiques dispersées peut être chauffée afin de « décrocher » plus efficacement les molécules nucléotidiques retenues sur lesdites billes. Ce chauffage peut impliquer l'utilisation de moyens permettant de chauffer le support mis en œuvre et notamment la zone (Zi) ou (Z5) de ce dernier, et éventuellement des moyens permettant de contrôler la température du support mis en œuvre et notamment de la zone (Zi) ou (Z5) de ce dernier.
L'étape (v) consiste à capturer les billes magnétiques débarrassées des molécules nucléotidiques en un culot compact à l'aide d'un aimant. Le surnageant ainsi obtenu est la solution pure contenant les molécules nucléotidiques qui constitue l'échantillon
(E) purifié mis en œuvre à l'étape (a) du procédé selon l'invention. Lorsque les étapes de purification ont eu lieu sur la zone (Z5) du support, il convient d'amener, préalablement à la mise en œuvre de l'étape (a) du procédé selon l'invention, l'échantillon (E) purifié sur la zone (Zi) par électromouillage et ce, sous formes d'une (ou de plusieurs) goutte (s). La présente invention concerne également un dispositif susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que précédemment défini, ledit dispositif comprenant un support présentant au moins deux zones distinctes (Z1) et (Z2),
- ladite lere zone (Zi) étant adaptée pour une lere étape d'amplification ;
- ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour une 2nde étape d'amplification ; - des moyens permettant d'amener un fluide de ladite zone (Zi) vers ladite zone (Z2) par électromouillage .
Avantageusement, ladite zone (Z2) du support présente au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique telle (s) que précédemment définie (s), lyophilisée (s) ou séchée (s) .
De plus, le support peut présenter au moins une zone supplémentaire, distincte des zones (Zi) et (Z2) et choisie dans le groupe constitué par :
- une zone (Z3) sur laquelle est disposé un mélange réactionnel tel que précédemment défini, utile pour la lere étape d'amplification ;
- une zone (Z4) sur laquelle est disposée une solution S telle que précédemment définie, contenant au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique telle (s) que précédemment définie (s), utile pour la 2nde étape d'amplification ; - une zone (Z5) adaptée pour la purification d'un échantillon tel que l'échantillon (E) précédemment défini ;
- une zone (Z6) sur laquelle est disposée une solution de lyse telle que précédemment définie ;
- une zone (Z7) sur laquelle est disposée une solution contenant des billes magnétiques, telle que précédemment définie ;
- une zone (Z8) sur laquelle est disposée une solution de lavage telle que précédemment définie ; et
- une zone (Z9) sur laquelle est disposée une solution d'élution telle que précédemment définie.
Le support également désigné dans la présente par le terme « puce » comprend, dans une vue en coupe, un substrat, présentant une matrice d'électrodes, une couche isolante (i.e. diélectrique) recouvrant substrat et électrodes et une couche hydrophobe recouvrant ladite couche diélectrique. Les différentes zones (Zi) à (Z9) telles que précédemment définies se situent donc à la surface de ladite couche hydrophobe .
Par « zones », on entend donc principalement un agencement d'électrodes définies en surface de la puce, chacune de ces électrodes présentant une fonction particulière et éventuellement une forme adaptée à la fonction. Par exemple, on peut avoir des électrodes réservoirs, des électrodes de transfert pour acheminer les gouttes, des électrodes dévolues au mélange des réactifs, etc Le support peut être réalisé suivant les méthodes décrites dans l'état de l'art (Fouillet Y et al. « Digital microfluidic design and optimization of classic and new fluidic functions for lab on a chip Systems » Microfluid. Nanofluid. (2008) 4 :159-165).
Le support présente non seulement des moyens permettant d'amener un fluide de la zone (Zi) vers la zone (Z2) mais aussi :
- des moyens permettant d' amener un fluide de la zone (Z4) vers la zone (Z2) et
- des moyens permettant d' amener un fluide d'une zone choisie dans le groupe constitué par les zones (Z3) , (Z6) , (Z7) , (Z8) et (Z9) vers une zone choisie entre la zone (Zi) et la zone (Z5) . Ces moyens permettent de manipuler et de déplacer des gouttes de fluide et mettent en œuvre des séries d'électrodes adjacentes dans un plan, pouvant être disposées de manière linéaire mais aussi en deux dimensions et ce, pour définir un plan de déplacement d'un fluide sous forme de gouttes. Dans la technique d' électromouillage, le déplacement des gouttes implique également une contre-électrode maintenant un contact électrique avec la goutte pendant ce déplacement et un générateur de tension pour appliquer une différence de potentiel entre les électrodes et la contre-électrode.
Les électrodes peuvent être réalisées par dépôt d'une couche métallique telle qu'une couche en Au, Al, ITO, Pt, Cr ou Cu par photolithographie. La couche diélectrique peut être en Si3N4, en parylène ou en SiO2. Le dispositif de l'invention peut présenter une configuration « ouverte ». Dans ce cas, il n'est constitué que du support tel que précédemment défini et la contre-électrode se présente avantageusement sous forme d'un fil caténaire.
Toutefois, afin de favoriser la portabilité du dispositif selon la présente invention, ce dernier présente avantageusement une configuration « fermée ». Dans cette dernière, le support du dispositif tel que précédemment défini est associé à un substrat disposé en regard dudit support. Ce substrat également désigné dans la présente par le terme « capot » comporte des moyens conducteurs afin de former une contre-électrode. II est avantageusement fabriqué dans un matériau adapté pour les mesures de fluorescence et possède une couche électrique et une couche hydrophobe . Les couches hydrophobes du support et du capot seront préférentiellement déposées suivant la méthode décrite dans l'article de Thery et al., « SiOC as a hydrophobic layer for electrowetting on dielectric applications » llth International Conférence on Minaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (MicroTas - 07-11/10/2007 - Paris France) . Les gouttes disposées sur le support ou déplacées sur ce dernier sont confinées entre le support et le substrat disposé en regard dudit support, l'espace entre le support et le substrat étant compris entre 10 et 1000 nm, avantageusement entre 50 et 100 nm. Compte tenu du faible volume de liquide déplacé via les gouttes, on peut rajouter une huile visant à confiner les gouttes et prévenir tout risque d' évaporation . Ladite huile peut être, par exemple, une huile minérale comme une huile M3516 de chez Zigma- Aldrich ou toute autre huile adaptable par l'homme du métier. Outre sa fonction liée à l' évaporation, il est important de choisir une huile favorisant le déplacement des gouttes par électromouillage. L'huile possède également un rôle passif de protection contre la contamination des échantillons. Le substrat présente, comme déjà expliqué, au moins un orifice ou trou d' aspiration pouvant avoir avantageusement une forme convergente vers l'espace entre le support et le substrat et permettant le dépôt d'un liquide sur le support ou son aspiration à partir de ce dernier. En effet, l'aspiration d'un liquide sur une zone donnée du support est possible lorsque les électrodes connexes à l'orifice traversant le capot sont activées. De même, le dépôt d'un liquide sur une zone donnée du support est possible via ledit orifice lorsque ce dernier est connecté à un dispositif d' injection .
Le dispositif selon la présente invention peut comprendre des moyens permettant de porter le support ou du moins une zone donnée de ce support et, plus particulièrement, les zones (Zi) , (Z2) et (Z5) telles que précédemment définies à une température donnée notamment lors de l'étape (a), lors de l'étape
(c) et/ou lors de l'étape de purification de l'échantillon (E). Ces moyens permettant de porter le support à une température donnée peuvent être soit un élément chauffant du type Peltier en contact avec la face du support opposée à la face portant les zones (Zi) , (Z2) et les éventuelles autres zones (Z3) à (Z9) , soit une (ou plusieurs) résistance (s) chauffante (s) intégrée (s) au dispositif.
Ces résistances chauffantes intégrées peuvent être réalisées à partir d'une couche mince métallique telle qu'une couche mince en platine, en aluminium, en silicium dopé, etc.... en définissant des motifs par des techniques classiques de microfabrication (photolithographie et gravure par exemple) ou par exemple par sérigraphie d'un matériau conducteur tel que du platine. La conception de ces résistances chauffantes (épaisseur, section, longueur) sera effectuée de manière à générer une puissance de chauffage donnée pour une tension fixée, en obtenant une valeur de résistance électrique bien définie. Avantageusement, ces résistances chauffantes peuvent permettre de localiser le chauffage sous les zones d'intérêt, telles que les zones (Z1), (Z2) et (Z5), etc...., dans le cadre du procédé mis en œuvre dans 1' invention .
Par ailleurs, le dispositif selon la présente invention peut également comprendre une (ou plusieurs) sonde (s) de température qui permet (tent) de contrôler la température des échantillons et des réactifs au plus près des zones (Zi) , (Z2) et (Z5) telles que précédemment définies. Le procédé de fabrication de telles sondes de température est identique au procédé de fabrication des résistances chauffantes précédemment exposé. Il est, par exemple, possible d'asservir les sondes au bloc Peltier de manière à contrôler avec précision la température du support .
Par définition, les technologies de fabrication des dispositifs utilisant 1' électromouillage font intervenir des étapes de définition de motifs dans des couches métalliques. La réalisation des résistances chauffantes et des sondes de température ne rajoute donc pas de complexité dans le procédé global de fabrication du dispositif selon 1' invention .
Le dispositif selon la présente invention se distingue des dispositifs de l'art antérieur, par le fait : qu' il est portable car il y a miniaturisation des volumes et de l'encombrement du consommable d' analyse ;
- qu' il permet des analyses très rapides puisque les températures lors des étapes d'amplification PCR sont rapidement atteintes compte- tenu de la miniaturisation du volume d'échantillon à traiter et du matériau utilisé pour le dispositif qui est un très bon conducteur thermique ; - qu'il n'a pas à être ouvert entre la phase de pré-amplification et la phase d'amplification avec détection spécifique, pour l'ajout de réactifs, voire entre la purification de l'échantillon à traiter et la phase d'amplification avec détection spécifique ; ce qui évite tous les risques reconnus et très sérieux de contamination par amplicons. De plus, le dispositif peut présenter un grand nombre de zones telles que les zones (Z5) à (Z9) précédemment définies, et l'organisation des zones (Zi) à (Z9) précédemment définies à la surface du support et leurs dispositions les unes par rapport aux autres sont plus libres et ne sont pas imposées contrairement au cas du dispositif décrit dans la demande internationale WO 2008/106719, dans lequel la disposition est imposée par la force centrifugeuse qui déplace les liquides d'un compartiment à un autre.
Il convient de remarquer que le dispositif une fois l'échantillon (E) introduit sur ce dernier peut ne plus être en contact avec l'environnement à potentiel contaminant. C'est notamment le cas d'un dispositif fermé sur lequel le (ou les) réactif (s) nécessaire (s) aux différentes étapes d'amplification PCR et à l'éventuelle étape de purification de l'échantillon à analyser ont été préalablement embarqués sous forme liquide, séchée ou lyophilisée. Enfin, le dispositif selon l'invention offre la possibilité d'amplifier et d'analyser au moins deux échantillons différents, voire 3, 4, 5 ou plus échantillons différents. Les figures 1 et 2 proposent des architectures optimales pour l'amplification de molécules nucléotidiques pour deux échantillons (El) et
(E2) suivant l'invention (figure 1) avec éventuellement une étape préalable de purification des molécules nucléotidiques contenues dans ces échantillons
(figure 2) . La figure 1 propose un dispositif vu de dessus, en configuration « fermée » dont seul le support est matérialisé, ledit dispositif présentant :
- deux zones (Zio-i) et (Z10-2) sur lesquelles les échantillons (Ei) et (E2) sont respectivement déposés ;
- deux zones (Z3-1) et (Z3_2) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la lere étape d'amplification ; - une pluralité de réservoirs formant les gros réservoirs (Z1-1) et (Zi_2) , sur lesquels la lere étape d'amplification respectivement des échantillons (Ei) et (E2) est mise en œuvre ;
- une 2 X 13 zones (Z2) , sur lesquelles la 2nde étape d'amplification est mise en œuvre. Sur chaque zone (Z2) , des réactifs spécifiques (amorces et éventuellement sondes marquées) identiques ou différents sont séchés.
Avec le dispositif d'architecture optimisée de la figure 1, il est possible de réaliser simultanément pour deux échantillons (Ei) et (E2) :
1) Un mélange entre l'échantillon et les réactifs liquides pour la lere étape d'amplification et envoi du mélange dans un gros réservoir (Z1-1) ou (Zi_2) pour la lere étape PCR ;
2) La lere étape PCR dans deux gros réservoirs (Z1-1) et (Zi_2) notamment en parallèle ;
3) La distribution et l'envoi de gouttes de 65 ni en fin de lere étape PCR ; 4) La 2ieme étape PCR avec détection spécifique dans 13 petits réservoirs (Z2) . La figure 2 propose un dispositif vu de dessus, en configuration « fermée », ledit dispositif présentant : - deux zones (Zio-i) et (Z10-2) sur lesquelles les échantillons (Ei) et (E2) sont respectivement déposés ;
- deux zones (Z1-1) et (Zi_2) , sur lesquelles la purification et la lere étape d'amplification respectivement des échantillons (Ei) et (E2) sont mises en œuvre ;
- deux zones (Z3-1) et (Z3_2) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la lere étape d'amplification ; - 6 zones (ZA) sur lesquelles sont disposés les réactifs liquides pour la lere étape d'amplification et/ou les réactifs pour la purification des échantillons (Ei) et (E2) , ces zones (ZA) pouvant avantageusement être choisies parmi les zones (z3), (z6), (z7), (z8) et (Z9) telles que précédemment définies ;
- un orifice (Ti) sur le substrat disposé en regard du support, par lequel sont évacués les différents surnageants obtenus lors de l'étape de purification ;
- une 2 X 11 zones (Z2) , sur lesquelles la 2nde étape d'amplification est mise en œuvre. Sur chaque zone (Z2) , des réactifs spécifiques (amorces et éventuellement sondes marquées) identiques ou différents sont séchés. Avec le dispositif d'architecture optimisée de la figure 2, il est possible de réaliser simultanément pour deux échantillons (Ei) et (E2) en parallèle : 1) la purification des molécules nucléotidiques à partir de deux échantillons (Ei) et (E2) ;
2) une lere étape d'amplification des deux échantillons (Ei) et (E2) purifiés ; 3) une 2ieme étape d'amplification avec des sondes spécifiques dans 11 petits réservoirs pour les deux échantillons (Ei) et (E2) purifiés.
La présente invention concerne également un kit d'amplification comprenant : un dispositif tel que précédemment défini, et
- au moins un élément choisi dans le groupe constitué par une polymérase thermostable, une transcriptase inverse, des déoxyribonucléotides triphosphates, une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse et une sonde marquée. Chacun de ces éléments est tel que précédemment défini.
Le procédé, le dispositif et le kit d'amplification selon la présente invention permettent et sont utiles dans des analyses de terrain telles que la surveillance environnementale, la surveillance civile, la sécurité alimentaire, les analyses médicales qui peuvent passer de la prise de sang avec seringue au prélèvement capillaire, les analyses de marqueurs cancérologiques sur microbiopsies, les analyses criminelles sur traces, les contrôles qualité agroalimentaires, les analyses vétérinaires avec notamment la recherche de pathogènes viraux, bactériens, parasitaires ou mycologiques sur des prélèvements capillaires ou des microbiopsies.
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La figure 1 propose un dispositif d'architecture optimisée pour réaliser l'analyse d'un échantillon par amplification génique en deux étapes avec pré-amplification de l'échantillon en microcomposant fermé fonctionnant par électromouillage.
La figure 2 propose un dispositif d'architecture optimisée pour réaliser la purification des acides nucléiques de deux échantillons en parallèle, suivie de l'analyse par amplification génique en deux étapes avec pré-amplification de l'échantillon en microcomposant fermé fonctionnant par électromouillage .
La figure 3 propose une illustration de la réalisation du protocole d'amplification en deux étapes sur un micro dispositif fonctionnant par électromouillage . La figure 4 présente l'augmentation de fluorescence obtenue dans 3 petits réservoirs lors de la deuxième étape d'amplification du protocole permettant de détecter la présence des pathogènes E. CoIi, Bacillus Subtilis et adénovirus 2 dans l'échantillon de départ.
La figure 5 présente l'alimentation en réactifs, la position de l'aimant et des électrodes reliant la zone d'alimentation des réactifs, la zone de purification et la poubelle pour la purification d'acides nucléiques sur puce EWOD à partir d'un échantillon sanguin.
La figure 6 présente l'analyse par PCR de l'ADN purifié sur puce EWOD fonctionnant par électromouillage à partir d'un échantillon sanguin.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I . Exemple d'une mise en oeuyre particulière du procédé selon l'invention. 1. Echantillon et réactifs.
Un échantillon provenant d'une préparation d'acides nucléiques contenant 106 copies de la bactérie Gram- Escherichia CoIi, 103 copies du virus Adénovirus type II et 103 copies de la bactérie Bacillus Subtilis est mélangé aux réactifs PCR (BSA 0,8 mg/ml, tampon de l'enzyme AmpliTaq GoId sans MgCl2 Ix, MgCl2 3 mM, nucléotides (dATP, dTTP, dCTP, dGTP) 200 μM, bétaine 450 mM, AmpliTaq GoId (0,5 U/μl) et des amorces spécifiques aux pathogènes étudiés à des concentrations différentes (Escherichia CoIi 20 nM/ Adénovirus 20 nM/ Bacillus subtilis 80 nM) . Dans les 4 petits réservoirs de stockage Z3_i, Z3_2, Z3_3 et Z3_4 (Figure 3) du microcomposant, les amorces et sondes spécifiques à chaque pathogène recherché ont été pré-embarquées
(dépôts de gouttelettes de solutions au robot de spotting puis séchage) . Les quantités déposées correspondent à une concentration de 600 nM après remise en suspension.
2. Réalisation des étapes. L'échantillon est tout d'abord mélangé en tube avec les réactifs PCR pour la première étape d'amplification et chauffé 10 minutes à 95°C en tube (étape de dénaturation de l'ADN et d' activation de la Taq GoId) . Cette solution est ensuite introduite sur la puce à travers un trou du capot (Ti) et par activation des électrodes. La première étape de la PCR cascade est effectuée dans le gros réservoir (Zi) (Figure 3) : 10 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C (5 secondes) et une étape d' hybridation—élongation à 600C pendant 20 secondes.
A la fin de cette première étape, l'échantillon est distribué en gouttes de 65 ni et chaque goutte est envoyée dans les petits réservoirs de stockage Z2-I, Z2-2, Z2-3 et Z2-4. Le mélange de la goutte d'échantillon et des réactifs spécifiques préalablement embarqués est réalisé par un mouvement d'aller-retour des gouttes sur des électrodes adjacentes au petit réservoir (10 A/R) . La deuxième étape de PCR cascade est effectuée dans les petits réservoirs. Elle consiste en 40 cycles thermiques avec une étape de dénaturation à 95°C (5 secondes) et une étape d' hybridation—élongation à 600C pendant 20 secondes. Pendant cette deuxième étape de PCR, la fluorescence des gouttes est mesurée à chaque cycle thermique en fin de l'étape d' hybridation- élongation. Le signal de fluorescence obtenu pendant cette deuxième étape d'amplification est donné Figure 4.
II. Exemple d'une autre mise en oeuyre du procédé selon l'invention.
Pour prouver qu' il est possible de coupler une préparation d'échantillons directement sur le micro-dispositif selon l'invention et une amplification en deux étapes, un exemple de purification d'ADN sur le micro-dispositif est donné.
Des réactifs commerciaux (Bilatest Genomic DNA kit) ont été utilisés. Un mélange de sang, tampon de lyse, tampon de fixation et billes magnétiques a été introduit sur puce (volume total du mélange : 5 μl contenant 0,26 μl de sang) par le trou (Ti) (Figure 5) . Les électrodes n°l à 8 sont activées pour déplacer la solution du trou d'entrée (Ti) vers la poubelle constituée par le trou (T2) . Lorsque le liquide est déplacé du trou (Ti) vers le trou (T2) , les billes sont collectées en culot compact lors du passage à proximité de l'aimant (A) placé sur le capot au-dessus de l'électrode 3.
La première solution de lavage (tampon de lavage A du Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (Ti) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. Les billes sont redispersées dans la solution de lavage en éloignant l'aimant (A) du capot et en activant successivement les électrodes 2 et 3 pendant 2 minutes. L'aimant (A) est ensuite à nouveau approché du capot de la puce pour reformer un culot compact de billes. Le surnageant est ensuite amené dans la poubelle constituée par le trou (T2) en activant les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8 puis en désactivant successivement les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8. L'ensemble de ces étapes pour le lavage des billes magnétiques avec la solution de lavage A est répété trois fois (Figure 5) .
La seconde solution de lavage (tampon de lavage B du Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (Ti) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. Les billes ne sont pas redispersées dans cette solution de lavage et le surnageant est amené dans la poubelle constituée par le trou (T2) en activant les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8 puis en désactivant successivement les électrodes 3, 4, 5, 6, 7 et 8.
La solution d'élution de l'ADN (Bilatest Genomic DNA kit) est ensuite déposée dans le trou (Ti) à l'aide d'une micro-pipette. Elle est introduite sur la puce en activant les électrodes 1, 2 et 3 puis en désactivant l'électrode 1. Les billes sont redispersées dans la solution d'élution en éloignant l'aimant (A) du capot, en activant successivement les électrodes 2 et 3 pendant 10 minutes et en chauffant la puce à 55°C. L'aimant (A) est ensuite à nouveau approché du capot de la puce pour reformer un culot compact de billes. Le surnageant est la solution d'ADN purifié.
Il a été vérifié que la solution ainsi obtenue sur puce contient bien de l'ADN à la concentration attendue en réalisant une PCR en temps réel de génotypage (détection de la délétion ΔF508 du gène CFTR) . Nous avons comparé l'allure des courbes de fluorescence pour un échantillon purifié sur puce et un échantillon purifié en tube en suivant le protocole fourni par Bilatec avec le kit (Figure 6) . Les courbes obtenues sont absolument similaires dans les deux cas avec des Ct (pour « Threshold cycle », i.e. le cycle à partir duquel la fluorescence augmente significativement et se déconnecte du bruit de fond et grâce auquel on peut remonter à la quantité de molécules d'ADN initialement présente) montrant que la concentration d'ADN obtenue sur puce et en tube est tout à fait similaire (6,8 ng d'ADN obtenu par μl de sang purifié dans les deux cas) .

Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé d'amplification d'au moins une molécule nucléotidique contenue dans un échantillon, ci-après désigné échantillon (E) , comprenant les étapes successives suivantes consistant à : a) soumettre ledit échantillon (E) à une lere étape d'amplification sur une lere zone d'un support, ci-après désignée zone (Zi) ; b) amener par électromouillage au moins une partie de l'échantillon obtenu après l'étape (a), (ci- après désigné l'échantillon (Ea) , de la zone (Zi) sur au moins une 2ieme zone dudit support, distincte de la zone (Zi) et ci-après désignée zone (Z2) ; c) soumettre l'échantillon (Ea) à une 2nde étape d'amplification sur ladite zone (Z2).
2) Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit échantillon (E) est un échantillon d'un élément choisi dans le groupe constitué par une solution liquide contenant au moins une molécule nucléotidique ; un fluide biologique ; un fluide végétal ; une ou plusieurs cellules animales ou végétales ; un tissu animal ou végétal ; une matrice alimentaire ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de tours aéro-réfrigérées ; un prélèvement aérien ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges.
3) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que, préalablement à ladite étape (a) , ledit échantillon (E) est mis en contact avec le mélange réactionnel nécessaire à l'amplification de ladite étape (a).
4) Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que ledit échantillon (E) est amené sur ladite zone (Z1) par électromouillage .
5) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification lors de ladite étape (a) est choisie dans le groupe constitué par une PCR multiplexe et une RT-PCR multiplexe.
6) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite étape (b) consiste à former, par électromouillage, x goutte (s) à partir dudit échantillon (Ea) et à déplacer, par électromouillage, ladite (ou lesdites) goutte (s) de ladite zone (Zi) vers y zone (s) (Z2), avec x ≥ y et x et y représentant un entier compris entre 1 et 50.
7) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ladite amplification lors de ladite étape (c) met en œuvre au moins une paire d'amorces spécifiques d'une molécule nucléotidique donnée et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique de ladite molécule nucléotidique. 8) Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit procédé comprend une étape préalable de purification de l'échantillon (E) .
9) Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite étape préalable de purification comprend les étapes consistant à : i) mettre en contact l'échantillon (E) avec une solution de lyse ; ii) mettre en contact l'échantillon (E) lysé obtenu après l'étape (i) avec au moins une bille magnétique susceptible d' adsorber au moins une molécule nucléotidique ; iii) laver ladite bille magnétique ; iv) mettre en contact ladite bille lavée obtenue après l'étape (iii) avec une solution d'élution et éventuellement chauffer la solution ainsi obtenue ; v) isoler la (ou les) molécule (s) nucléotidique (s) obtenue (s) après l'étape (iv) .
10) Dispositif susceptible d'être mis en œuvre dans un procédé tel que défini à l'une quelconque des revendications précédentes, ledit dispositif comprenant un support présentant au moins deux zones distinctes (Z1) et (Z2),
- ladite lere zone (Zi) étant adaptée pour une lere étape d'amplification ;
- ladite 2nde zone (Z2) étant adaptée pour une 2nde étape d'amplification et présentant au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique, lyophilisées ou séchées ; et
- des moyens permettant d' amener un fluide de ladite zone (Zi) vers ladite zone (Z2) par électromouillage.
11) Dispositif selon la revendication 10, caractérisé en ce que le support présente au moins une zone supplémentaire, distincte des zones (Zi) et (Z2) et choisie dans le groupe constitué par :
- une zone (Z3) sur laquelle est disposé un mélange réactionnel, utile pour la lere étape d'amplification ;
- une zone (Z4) sur laquelle est disposée une solution S, contenant au moins une paire d'amorces spécifiques et éventuellement au moins une sonde marquée spécifique, utile pour la 2nde étape d'amplification ;
- une zone (Z5) adaptée pour la purification d'un échantillon ;
- une zone (Z6) sur laquelle est disposée une solution de lyse ;
- une zone (Z7) sur laquelle est disposée une solution contenant des billes magnétiques ; - une zone (Z8) sur laquelle est disposée une solution de lavage ; et
- une zone (Z9) sur laquelle est disposée une solution d'élution. 12) Dispositif selon la revendication 10 ou 11, caractérisé en ce que ledit support est associé à un substrat disposé en regard dudit support.
13) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend des moyens permettant de porter le support ou du moins une zone donnée de ce support à une température donnée.
14) Dispositif selon l'une quelconque des revendications 10 à 13, caractérisé en ce que ledit dispositif comprend au moins une sonde de température.
15) Kit d'amplification comprenant : un dispositif tel que défini à l'une quelconque des revendications 10 à 14, et
- au moins un élément choisi dans le groupe constitué par une polymérase thermostable, une transcriptase inverse, des déoxyribonucléotides triphosphates, une paire d'amorces, spécifique ou dégénérée, une amorce oligo-dT ou spécifique utile pour la transcription inverse et une sonde marquée.
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