EP2171035A1 - Verfahren und vorrichtung zur aufnahme von biologischen zellen aus einer stammzellenkultur - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur aufnahme von biologischen zellen aus einer stammzellenkultur

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Publication number
EP2171035A1
EP2171035A1 EP08785094A EP08785094A EP2171035A1 EP 2171035 A1 EP2171035 A1 EP 2171035A1 EP 08785094 A EP08785094 A EP 08785094A EP 08785094 A EP08785094 A EP 08785094A EP 2171035 A1 EP2171035 A1 EP 2171035A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
substrate
cells
receiving
main
cell
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP08785094A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Charli Kruse
Günter FUHR
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Original Assignee
Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV filed Critical Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Publication of EP2171035A1 publication Critical patent/EP2171035A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/14—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus with filters, sieves or membranes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus

Definitions

  • the invention relates to a method for receiving biological cells from a plurality of stem cells, in which the cells to be picked migrate by means of their natural cell movement onto a receiving substrate. Furthermore, the invention relates to a substrate arrangement for receiving biological cells from a plurality of stem cells, wherein the substrate arrangement comprises two substrates, between which the cells to be picked up can be transmitted by their natural cell movement.
  • the cell movement (English: cell locomotion) generally includes a change in location of a complete cell on the solid surface of the substrate or in cell material by a rearrangement of adhesive contacts of cell organs (membrane organs, for example membrane evaginations).
  • the natural cell movement is described, for example, by M. Abercrombie et al. in “Experimental Cell Research", Vol. 67, 1971, pp. 359-367 and by L.P. Cramer in "Biochem. Soc., Symp.”, Vol. 65, 1999, pp. 173-205.
  • 2006/051735 A1 describes a transfer of biological cells by natural cell movement between a carrier and a probe. Since the transfer is due to the natural cell movement, mechanical or biochemical minimizes mixing influences on the cells and prevents unphysiological interventions, such as trypsinization of the cell material.
  • the combination of a carrier and a probe described in US 2006/051735 A1 represents a special tool whose practical applicability may be limited by the following problems. Since the probe is for receiving a single cell from the carrier or for transmitting a single cell to the carrier, it is necessary to transmit a plurality of cells for serial operation or to use a plurality of probes. In the first case, there is the disadvantage of a high expenditure of time, while the second variant would be limited to the combination of a few probes for reasons of space. Furthermore, the probe is only suitable for transporting the cell. For further examinations or treatments, the cell must be transferred from the probe to another substrate.
  • a further disadvantage may be that all cells involved in the transfer, that is to say both the cells in the cell material on the support and also the cell to be transferred, have the natural cell movement.
  • the selective removal of individual cells or small cell groups from the cell material on the support therefore requires measures to avoid transmission of unwanted cells. For example, it may be necessary for the carrier and probe to be moved during transmission. Furthermore, for selective removal of certain cells, it may be necessary to observe the orientation of the support and the probe and the migration of the cell in question with a microscope. Because of the disadvantages mentioned restrictions are out ⁇ clearly the automation of the conventional art.
  • Another disadvantage of the conventional technique is that for the selective transmission of certain cells, previous knowledge about these cells must be available.
  • the differentiated cells For example, if in a stem cell culture in which some cells have differentiated (for example, differentiation to nerve cells), the differentiated cells are to be taken for further study or application, the differentiated cells in the stem cell culture must be identified. To date, this requires an invasive procedure in the stem cell culture, such as a specific staining, which is an undesirable effect on the cells.
  • biological cells on a substrate typically form a cell layer with few cell layers or a single cell layer (monolayer).
  • Certain cell types are characterized by the fact that they grow beyond the thickness of the monolayer.
  • stem cells in the adherent state form three-dimensional cell aggregates (so-called organoid bodies, see C. Kruse et al., Appl. Phys., A, Vol. 79, 2004, pp. 1617-1624, and C. Kruse et al. in Ann. Anat. x ⁇ Vol. 188 (6), 2006, pp.
  • the object of the invention is an improved method for receiving, in particular separation of biological cells from a stem cell culture that avoids the disadvantages and limitations of the conventional art. Furthermore, the object is to provide an improved substrate arrangement, with which in particular the disadvantages of the conventional combination of a carrier and a probe are overcome.
  • the invention is based on the general technical teaching to provide a method for receiving biological cells from a cell culture in which the cells move by their natural cell movement from one main substrate on which the cell culture is arranged on one or more receiving substrates on which or which a cultivation of the cells takes place.
  • the cell transfer takes place between substrates, which are both set up for a cultivation of biological cells.
  • the stated object is achieved by a substrate arrangement having at least two substrates which are positioned adjacent to one another such that the cells can be transferred from one of the substrates to the adjacent substrate by their natural cell movement.
  • the substrates comprise a main substrate on which a cell culture can be cultured, and at least one receiving substrate which is suitable for settling with cells from the cell culture of the main substrate and is set up to cultivate these cells.
  • the main substrate and the at least one receiving substrate are separate components which can be positioned adjacent to one another for cell transfer and can be separated from one another after cell transfer.
  • At least one receiving substrate may be a single cell or it may be a variety of
  • Cells (e.g., at least 10, 100, 1000, or even a million or more cells) can be simultaneously taken from the main substrate.
  • the cultivation of the cells on the at least one receiving substrate makes it possible for the cells on the receiving substrate to be subjected to further methods, in particular examinations or treatments, without further intermediate steps.
  • For the transfer of the cells on the at least one receiving substrate it is only necessary that this is arranged to match an edge of the main substrate.
  • the transmission of the cells does not require any combination of the cells on the at least one receiving substrate.
  • the at least one receiving substrate is set up for culturing cells that have migrated out of the cell culture.
  • the receiving substrate has a substrate surface whose size and material are selected such that an adherent cell culture comprising at least one cell or a multiplicity of cells (preferably at least 10 cells, eg a few thousand cells) can be formed on the receiving substrate.
  • the cells are culturable on the receiving substrate, ie the receiving substrate is for growth and / or differentiation of cells under adjustable, reproducible culture conditions.
  • a surface modification eg a molecular deposition or a micro- or nanostructurization
  • cells of at least one three-dimensional cell aggregate arranged on the main substrate are transferred to the at least one receiving substrate.
  • the three-dimensional cell aggregate is formed from stem cells, and if necessary a mixture of cell h ⁇ len of various types and preferably comprises an organoid body, as for example, by C. Kruse et al. described in the above publications.
  • the organoid body preferably has a cross-sectional dimension (eg, thickness, diameter) in the range of 50 ⁇ m to 20 mm.
  • the inventors have found that the property of organoid bodies to form a three-dimensional cell cluster in the adherent state, from the surface of which uniformly grow cells, offers a significant advantage for the invention.
  • the organoid body forms a fixed cell culture on the main substrate, ie during the transfer of cells to the at least one receiving substrate, the position of the organoid body remains unchanged.
  • Cell aggregate is impaired. There is no need for microscopic observation or control.
  • the method can advantageously be automated.
  • the permanent proliferation of organic the body exploited.
  • the growth of cells from organoid bodies can occur over long cultivation times, eg. B. be stable in the range of 1 or 2 days to 2, 10, 30 or more weeks.
  • the inclusion of cells on the at least one receiving substrate may also extend over a corresponding period of time.
  • the stated object is thus achieved, in particular, by a substrate arrangement with the main substrate and the at least one receiving substrate, wherein at least one three-dimensional cell aggregate, which is formed from stem cells and migrates out of the cell, is arranged on the main substrate.
  • the invention it would thus be possible to transfer exclusively cells to the at least one receiving substrate which migrate out of the organoid body, while other cells which are part of the organoid body remain on the main substrate. It allows a selective removal of the migrating cells from the stem cell culture in the organoid body. Special measures, such as tracking the adjacent substrates or monitoring the cell transfer are not required.
  • the method for receiving cells from the cell culture is in this case a process for the separation of cells from the organoid bodies, whereby, advantageously, the origin and the way the cells and optionally its change (for example, differentiation, dedifferentiation) tracked and documented ⁇ can be mented.
  • advantages may arise from the potential to form a plurality of daughter cell cultures on the receiving substrates, and / or from the possibility of exposing the cells on the different receiving substrates to different culturing conditions.
  • the substrate arrangement comprises the main substrate and a multiplicity of receiving substrates, which are formed matching the main substrate and can be positioned adjacent thereto.
  • a receiving substrate is formed to match the main substrate when the receiving substrate is positionable on the main substrate and a boundary line is formed by an edge of the main substrate, which cells overcome upon natural cell movement to reach the receiving substrate. It is preferably provided that the cells move from the main substrate directly to the receiving substrate.
  • the receiving substrates form a set of replacement parts with which the main substrate can be successively assembled. With each additional receiving substrate, additional cells can be taken up from the cell aggregate.
  • a modular system can thus be provided in which the first receiving substrate can be replaced by at least one further receiving substrate or in which an at least further receiving substrate follows the first receiving substrate.
  • the cells which are picked up by the various receiving substrates differ in their properties.
  • various inherent properties of the cells and / or different properties of the substrate surfaces of the receiving substrates can be used.
  • these cells may have different cell types, such as cells.
  • the inventors have found that the different cell types have different migration rates. Thus, starting from a start time at which the main substrate and the receiving substrate are positioned adjacent to each other, different cell types can be transferred to different receiving substrates at different times.
  • this allows a non-invasive separation of cells from the stem cell culture, in particular from the organoid body, depending on their cell types.
  • the inventors have also found that, depending on their types of differentiation, the cells may migrate to different receiving substrates by providing the receiving substrates with a modified substrate surface that is only exposed to a particular differentiation type.
  • the inventors have found evidence that, depending on previously unknown intrinsic properties, the cells may migrate or grow on different receiving substrates by providing the receiving substrates with a modified substrate surface onto which certain cells then migrate or grow.
  • the transfer of cells to a plurality of receiving substrates can be provided temporally successively on the main substrate.
  • the main substrate with the cell culture, in particular the organoid body, and a first receiving substrate for a cell transfer of a first cell group and / or a first cell type to the first receiving substrate are provided.
  • the main substrate and the first receiving substrate are separated from each other.
  • the further KuI The cells on the first receiving substrate are separated from the main substrate.
  • the steps of cell transfer and separation are repeated with at least one further receiving substrate, with further cells, in particular other cell types from the cell culture, migrating from the main substrate to the at least one further receiving substrate.
  • said separation can be achieved by cell types having different migration rates by providing the receiving substrates at predetermined time intervals on the main substrate. Furthermore, a multiplicity of daughter substrates can be colonized with cells from the cell culture. By sequentially combining the main substrate with the receiving substrates, for example, in a culturing device, a main substrate having an organoid body can be successively transferred between different receiving substrates to respectively colonize cells from the organoid body.
  • the receiving substrates may be arranged adjacent eg. To various portions of the edge of the main ⁇ substrate. This design is particularly suitable for the transfer of cells with the same migration speeds on receiving substrates with differently modified substrate surfaces.
  • the receiving substrates may be arranged on the main substrate in such a way that cells initially have an immediate bar migrate to the main substrate adjacent receiving substrate before they reach a receiving substrate at a greater distance from the main substrate.
  • high-rate migration cells in a time range migrate to remotely located receiving substrates by simultaneously moving cells at a slower rate of migration onto receiving substrates a short distance from the main substrate.
  • the migration of the cells can be directed or accelerated via chemotaxis, galvanotaxis or other attractors.
  • the cells migrate from the cell culture on the main substrate in at least two different directions to the at least one receiving substrate, advantages may result from an increased effectiveness of cell uptake from the cell culture.
  • the cells may migrate to a single receiving substrate which at least partially surrounds the main substrate, or may migrate to various receiving substrates which are respectively arranged in different directions of cell migration.
  • Particularly preferred is a variant in which the cells move radially on all sides from the cell culture, in particular from the organoid body on the main substrate on the at least one receiving substrate. The inventors have found that the speed of the
  • the at least one recording Substrate formed a substrate frame surrounding the main substrate.
  • the substrate frame is particularly suitable for receiving cells which migrate on all sides from the main substrate onto the at least one receiving substrate.
  • a receiving substrate is referred to as a substrate frame when the substrate surface intended to receive and cultivate the cells surrounds an area which remains free of cells during cell transfer.
  • the substrate frame may have an inner opening that forms the cell-free area and into which the main substrate can be inserted.
  • the receiving substrate for forming the substrate frame may be a substrate having a closed substrate surface on which the main substrate can be placed for cell transfer so that an outer region of the substrate remains free as a substrate surface for receiving and culturing the cells.
  • the substrate arrangement according to the invention comprises a stack of a main substrate and at least one renewable sub- strat.
  • the substrate frame thus generally has an inner edge adapted to the shape and size of the edge of the main substrate.
  • the inner edge of the substrate frame is complementary to the polygonal shape.
  • a circular shape of the main substrate and the inner edge of the substrate frame is preferred.
  • the substrate frame is also referred to as a substrate ring.
  • the circular shape offers advantages for a radially all-round uniform transfer of the cells to the receiving substrate.
  • the substrate frame may be composed of a plurality of receiving substrates (substrate segments). be set, which are positioned on different sides adjacent to the main substrate.
  • the substrate segments are separable components which, when assembled, form the substrate frame. With the substrate segments, differently modified substrate surfaces can advantageously be provided for a cell transfer.
  • the cells separated simultaneously from the cell culture on the main substrate may be subjected to various culture conditions on the substrate segments.
  • the receiving substrates can form a composite substrate.
  • the main substrate and the substrate composite can be positioned relative to each other so that the main substrate is adjacent to a respective receiving substrate of the composite substrate.
  • the main substrate and the substrate composite are movable relative to each other.
  • the composite substrate forms a flexible substrate strip, in the surface of which the receiving substrates are formed.
  • a number of the receiving substrates are provided along the length of the substrate tape.
  • the substrate tape is adapted for translational movement relative to a peripheral edge of the main substrate. The peripheral edge of the main substrate rests on the surface of the substrate tape.
  • a predetermined receiving substrate can be provided on the main substrate by the translation of the substrate tape.
  • the substrate tape may be from a substrate roll are pulled past the main substrate to accommodate cells on the various receiving substrates.
  • the displacement of the composite substrate relative to the main substrate is discontinuous, there are advantages for processes in which cells alternately migrate on one of the receiving substrates and then the respective receiving substrate is separated from the main substrate.
  • the displacement of the composite substrate relative to the main substrate can be carried out continuously.
  • the cells can be transferred continuously to the composite substrate.
  • large surfaces can be populated with cells that have emigrated from a single cell culture, in particular a single organoid body.
  • Main substrate is preferably at a rate adapted to the rate of natural cell movement.
  • the speed is z. B. in the range of 1 .mu.m / h to 400 .mu.m / h.
  • FIG. 1 shows a schematic illustration of a first embodiment of the invention with a cell migration onto a substrate ring
  • FIG. 2 shows a plan view of a substrate arrangement with a stack of main and receiving substrates
  • FIGS. 3 and 4 are schematic side views of substrate arrangements according to the invention.
  • FIG. 5 shows a further schematic illustration of the first embodiment of the invention with a cell migration onto substrate segments
  • FIG. 6 shows a schematic side view of a second embodiment of the invention with a composite substrate
  • FIG. 7 shows a plan view of the embodiment of the invention shown in FIG.
  • Embodiments of the invention are described below by way of example with reference to the inclusion of stem cells and / or differentiated cells from cell aggregates (organoid bodies) formed from glandular stem cells.
  • the implementation of the invention is not limited to the use of the glandular stem cells, but also possible with other, adult or embryonic stem cells, progenitor cells and cell mixtures of human or animal origin.
  • the cell aggregates may contain different cell types, that is to say in addition to the stem cells, also progenitor cells and / or differentiated cells.
  • cells can be picked from a tissue isolate (eg, dermis, hair band). Details of the cultivation of stem cells or other cell types are not described here, as these are known per se from the standard methods of cell biology.
  • the substrate here is generally used a component which is suitable as a carrier for biological cells.
  • the substrate has a substrate surface on which the cells adhere and can perform the natural cell movement.
  • the substrate has a planar extent, it consists of a solid material, which may be rigid (eg, disc, plate) or compliant (eg, foil).
  • the main and recording substrates are interconnected.
  • the main and recording substrates have z. B. planar substrate surfaces, which are arranged adjacent to each other in the connected state or overlapping.
  • the substrate arrangement according to the invention is in a cultivation device, which is not shown in the figures.
  • the cultivation device comprises z. B. a conventional culture vessel with a liquid culture medium.
  • FIG. 1 schematically illustrates in plan view a first embodiment of the substrate arrangement 100 according to the invention a main substrate 10 and a receiving substrate 20.
  • the main substrate 10 comprises a plate in the form of a circular disk with a circular outer edge 11.
  • the main substrate 10 is z. As glass or plastic.
  • a coating for providing predetermined cultivation conditions e.g. As a coating of laminin, poly-lysine, gelatin, fibronectin or other peptides may be provided.
  • the diameter of the main substrate 10 is z. B. in the range of 0.5 mm to 2 cm.
  • the thickness of the main substrate 10 is z. B. in the range of 10 microns to 2 mm.
  • the main substrate 10 can be equipped with a schematically illustrated support element 13 (see FIG. 3).
  • the support member 13 is a protrusion facilitating manipulation of the main substrate 10 using a mechanical tool.
  • the receiving substrate 20 comprises a substrate ring 21 with a substrate surface 21.1, which is set up for culturing biological cells.
  • the substrate ring 21 has an inner opening 21.2, which is bounded by the inner edge 21.3 of the substrate ring 21.
  • the shape and size of the inner edge 21.3 is equal to the shape and size of the outer edge 11 of the main substrate 10 is selected.
  • the outer diameter of the substrate ring 21 is z. B. in the range of 5 mm to 5 cm.
  • the main substrate 10 fits positively into the inner opening 21.2 of the substrate ring 21.
  • the surfaces of the main substrate and the receiving substrate are preferably aligned.
  • the main substrate 10 and the substrate ring 21 are separate components which can be assembled for the cell transfer according to the invention.
  • FIG. 1 also shows the steps of the method according to the invention for receiving cells from a cell culture scheme. illustrated.
  • the cell culture 3 is cultured on the main substrate 10.
  • the cell culture 3 comprises one or more organoid bodies containing stem cells.
  • the cultivation of the cell culture 3 with the formation of the organoid body on the main substrate 10 takes place while the main substrate 10 is still separated from the substrate ring 21 or already inserted therein.
  • organoid body cells 1, 2 migrate from the cell culture 3 radially all sides (see arrows).
  • the cells 1, 2 migrate to the substrate ring 21, on which a further cultivation of the cells takes place.
  • the main substrate 10 and the receiving substrate 20 are separated from each other (see the lower part of Fig. 1).
  • the time of separation is chosen depending on the specific conditions of use of the invention. For example, the separation can take place after a predetermined transfer time (eg 1 hour to 14 days) or after reaching a predetermined degree of colonization of the receiving substrate 20.
  • Receiving substrate 20 (not shown in Figure 1) are combined to transfer more cells on the other receiving substrate. Furthermore, the cell culture formed on the substrate ring 21 further steps of treatment and / or examination, such. B. undergo further differentiation.
  • FIG. 2 illustrates a modified variant of a substrate arrangement 100 in which a plurality of receiving substrates 20. 20.2, 20.3 are combined with a main substrate 10 as a substrate stack.
  • the main substrate 10 with the cell culture 3 comprises a circular disc which rests on the first receiving substrate 20.1.
  • the first receiving substrate 20.1 likewise comprises a circular disk which lies on the second receiving substrate 20.2, which in turn lies on the third receiving substrate 20.3. Since the receiving substrates 20.1, 20.2 and 20.3 have different diameters, a substrate ring is formed by a concentric arrangement on each of the receiving substrates.
  • the first substrate ring which surrounds the main substrate 10 on all sides, is formed by the part of the first receiving substrate 20. 1 not covered by the main substrate 10.
  • the thickness of the main substrate 10 is preferably chosen to be less than 1 mm, in particular less than 250 ⁇ m.
  • the main substrate 10 for example, from a plastic film, for. B. polyurethane.
  • the thicknesses of the receiving substrates 20.1 and 20.2 preferably also have a thickness which is less than 1 mm, in particular less than 250 ⁇ m.
  • the contiguous edges of the main and receiving substrates may be tapered to facilitate cell migration between the substrates.
  • the main substrate 10 is placed with the cell culture 3 on the stack of receiving substrates 20.1, 20.2 and 20.3.
  • the cells migrating out of the cell culture 3 move radially on all sides towards the substrate rings due to the natural cell movement. Since the different cell types that migrate out of the cell culture 3 may differ in their migration rates, the cell transfer can be separated into cell types. So After a predetermined time of cell transfer (eg 1 to 2 hours to 14 days), the fastest cells reach the outermost substrate ring 21.3, while the remaining cells are located on the inner substrate rings 21.1, 21.2. Subsequently, a separation of the main substrate 10 from the receiving substrates 20.1, 20.2 and 20.3 and a separation of the receiving substrates from each other. The main substrate 10 with the cell culture 3 is then placed on a further substrate stack to accommodate further cells from the cell culture 3. The receiving substrates 20.1, 20.2 and 20.3 are subjected to further cultivation steps.
  • the principle of forming a substrate stack shown in Figure 2 is not limited to the combination of the main substrate 10 with three recording substrates, but correspondingly also possible, for example, with a single recording substrate or more than three recording substrates.
  • the receiving substrates may comprise substrate rings with different inner diameters, which are placed on a main substrate.
  • the main substrate 10 lies on a flat substrate as described in FIG. By its part not covered by the main substrate 10, the Radiosub- strat 20 (substrate ring 21) is formed.
  • the cell culture 3 is arranged, from which cells 1, 2 emigrate and are transferred to the substrate ring 21. After the settlement of the substrate ring 21 with the cells 1, 2, the main substrate 10 may be removed from the Sub-area ⁇ strat with the cell culture 3 and fed to further process steps, become.
  • the main substrate 10 on the support member 13 with a mechanical tool (not shown) is taken.
  • Figure 4 illustrates the reverse principle of forming a substrate stack, in which the main substrate 10 forms a support for an annular receiving substrate 20 having an inner opening 21.2.
  • the cell culture 3 rests immobile on the receiving substrate 10 in the inner opening 21.2 of the receiving substrate 20.
  • the cell 1, 2 migrating from the cell culture colonize the substrate surface of the receiving substrate 20, where a further cultivation of the cells 1, 2 takes place.
  • FIG. 5 illustrates a further variant of the invention in which a plurality of substrate segments 22.1, 22.2 and 22.4, which surround the main substrate 10, are provided as receiving substrates 20.
  • the substrate segments 22.1 to 22.4 in the assembled state form a substrate ring which can be populated with cells, as described above with reference to FIG. After cell transfer, substrate segments 22.1 to 22.4 can be separated (see arrows). After the separation of different substrate segments may be combined with ⁇ each other to bring the cells to the substrate segments to interact.
  • the separation may comprise a displacement of the substrate segments 22.1 to 22.4 on a common carrier, which forms a further receiving substrate 20.4.
  • the cells can migrate from the substrate segments 22.1 to 22.4 onto the further receiving substrate 20.4 and interact therewith.
  • FIG. 5 schematically illustrates that the receiving substrate 20 may have a biologically active coating.
  • the biologically active coating may, for. Fibronectin, another matrix molecule, a polymer or immobilizing signaling molecules.
  • the coating may be homogeneously formed (22.1), have a surface density gradient (22.2) or comprise at least one coating substance (22.3, 22.4). Different coating substances may partially overlap at the transition between the substrate segments (22.3, 22.4).
  • patterns of the coating may be provided with detail structures with typical dimensions in the ⁇ m or mm scale. Due to the biologically effective coating of the substrate segments, different cultivation conditions are created on the different parts of the receiving substrate 20. For example, the stem cells that migrate out of the cell culture 3 can be differently differentiated on the substrate segments 22.1 to 22.4. After separation of the substrate segments and / or transfer to the common receiving substrate 20.4, the differentially differentiated cells can interact with each other. According to a further variant, different recording substrates can be colonized with cells from different cell cultures (not shown in FIG. 5). After the cell transfer to the receiving substrates , a mutual interaction of the different cells can be provided.
  • FIGS ⁇ and 7 show a second embodiment of the invention, in which the receiving substrates 20, 20.1, ... are part of a substrate strip 23, in a schematic side view and top view.
  • the substrate arrangement 100 comprises the main substrate 10 for receiving the cell culture 3 and the substrate strip 23.
  • the main substrate 10 is arranged in a stationary manner in a cultivation device and z. B. on a wall 30 of a cultivation vessel (not shown) attached.
  • On the Main substrate 10 may be provided with an adhesion-reducing coating 14 (eg of PTFE, alginate, polysaccharides) to restrict the movement of cells towards the edge 11.
  • a depression 15 of the main substrate 10 serves to receive the cell culture 3.
  • the substrate tape 23 comprises a flexible material, e.g. As plastic, on the surface of the receiving substrates 20, 20.1 are formed.
  • the receiving substrates 20, 20. 1 comprise separate regions of the surface of the substrate strip 23.
  • the substrate strip 23 has a thickness of z. B. 250 microns and a width of z. B. 10 mm.
  • the receiving substrates 20, 20.1 are coated with various biologically active coatings, for. From laminin, fibronectin or other bioactive molecules used for specific adhesion of cells.
  • the substrate tape 23 is disposed in a substrate roll 24 below the main substrate 10.
  • the substrate belt 23 is guided past the substrate roller 24 via deflection rollers (not shown) on the edge 11 of the main substrate 10 in such a way that cells 1, 2 can migrate onto the respectively adjacent receiving substrate 20, 20.1.
  • the translational movement (see arrow) of the substrate strip 24 takes place, for example, at a speed in the range from 1 ⁇ m / h to 400 ⁇ m / h.
  • the band is switched on discontinuously more rapidly in order to create distances with less or without cell colonization.
  • the band can then be severed at these distances without damaging the remaining cells.
  • this is arranged on the main substrate 10. Due to the natural cell movement, the cells 1, 2 migrating out of the cell culture 3 move over the edge 11 onto the adjacent receiving substrate 20.
  • the substrate band 23 becomes relative to the receiving substrates 20, 20 moved to the edge 11 of the main substrate 10.
  • cell culture 3 comprising eg an organoid body or a tissue isolate
  • Further culture steps, treatments and / or examinations may be followed by separate cells.

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Abstract

Ein Verfahren zur Aufnahme von biologischen Zellen (1, 2) aus einer Zellkultur (3), umfasst die Schritte Kultivierung der Zellkultur auf einem Hauptsubstrat (10), Zellübertragung von dem Hauptsubstrat (10) auf mindestens ein Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4...), wobei die Zellen (1, 2) sich durch eine natürliche Zellbewegung auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4...) bewegen und auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3,...) eine Kultivierung der Zellen (1, 2) vorgesehen ist, und Trennung des Hauptsubstrats (10) und des mindestens einen Aufnahmesubstrates (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4...) voneinander. Es wird auch eine Substratanordnung (100) zur Bereitstellung von biologischen Zellen (1, 2) einer Zellkultur (3) beschrieben.

Description

Verfahren und Vorrichtung zur Aufnahme von biologischen Zellen aus einer Stammzellenkultur
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Aufnahme von biologischen Zellen aus einer Vielzahl von Stammzellen, bei dem die aufzunehmenden Zellen mittels ihrer natürlichen Zellbewegung auf ein Aufnahmesubstrat wandern. Des Weiteren betrifft die Erfindung eine Substratanordnung zur Aufnahme von biologischen Zellen aus einer Vielzahl von Stammzellen, wobei die Substratanordnung zwei Substrate aufweist, zwischen denen die aufzunehmenden Zellen durch ihre natürliche Zellbewegung übertragen werden können.
Es ist bekannt, dass adhärente biologische Zellen auf einem Substrat eine natürliche Zellbewegung ausführen. Die Zellbewegung (englisch: cell locomotion) umfasst allgemein eine Ortsänderung einer kompletten Zelle auf der festen Oberfläche des Substrats oder in Zellmaterial durch eine Umordnung von Adhäsionskontakten von Zellorganen (Membranorgane, zum Beispiel Membranausstülpungen) . Die natürliche Zellbewegung wird zum Beispiel von M. Abercrombie et al. in „Experimental Cell Research", Band 67, 1971, S. 359-367 und von L. P. Cramer in „Biochem. Soc. Symp.", Band 65, 1999, S. 173-205, beschrieben.
Eine praktische Anwendung der natürlichen Zellbewegung besteht in der stressfreien und verletzungsfreien Entnahme von Zellen aus in vitro-Kulturen. So wird beispielsweise in US
2006/051735 Al ein Transfer biologischer Zellen durch natürliche Zellbewegung zwischen einem Träger und einer Sonde beschrieben. Da der Transfer durch die natürliche Zellbewegung erfolgt, werden bei diesem Verfahren mechanische oder bioche- mische Einflüsse auf die Zellen minimiert und unphysiologische Eingriffe, wie zum Beispiel eine Trypsinierung des Zellmaterials, vermieden.
Die in US 2006/051735 Al beschriebene Kombination aus einem Träger und einer Sonde stellt ein Spezialwerkzeug dar, dessen praktische Anwendbarkeit durch die folgenden Probleme beschränkt sein kann. Da die Sonde zur Aufnahme einer einzelnen Zelle vom Träger oder zur Übertragung einer einzelnen Zelle auf den Träger vorgesehen ist, bedarf es zur Übertragung einer Vielzahl von Zellen eines seriellen Betriebes oder der Verwendung einer Vielzahl von Sonden. Im ersten Fall ergibt sich der Nachteil eines hohen Zeitaufwandes, während die zweite Variante aus Platzgründen auf die Kombination von we- nigen Sonden beschränkt wäre. Des Weiteren ist die Sonde nur zum Transport der Zelle geeignet. Für weitere Untersuchungen oder Behandlungen muss die Zelle von der Sonde auf ein weiteres Substrat übertragen werden.
Nachteilig kann ferner sein, dass alle an der Übertragung beteiligten Zellen, das heißt sowohl die Zellen im Zellmaterial auf dem Träger und als auch die zu übertragende Zelle die natürliche Zellbewegung aufweisen. Die selektive Entnahme einzelner Zellen oder kleiner Zellgruppen aus dem Zellmaterial auf dem Träger erfordert daher Maßnahmen, um eine Übertragung unerwünschter Zellen zu vermeiden. Es kann beispielsweise erforderlich sein, dass der Träger und die Sonde während der Übertragung bewegt werden. Des Weiteren kann es für eine selektive Entnahme bestimmter Zellen erforderlich sein, dass die Ausrichtung des Trägers und der Sonde und die Wanderung der betreffenden Zelle mit einem Mikroskop beobachtet werden. Aufgrund der genannten Nachteile bestehen Beschränkungen hin¬ sichtlich der Automatisierbarkeit der herkömmlichen Technik. Ein weiterer Nachteil der herkömmlichen Technik besteht darin, dass zur selektiven Übertragung bestimmter Zellen Vorkenntnisse über diese Zellen vorhanden sein müssen. Wenn beispielsweise in einer Stammzellenkultur, in der sich einige Zellen differenziert haben (zum Beispiel Differenzierung zu Nervenzellen) , die differenzierten Zellen für eine weitere Untersuchung oder Anwendung entnommen werden sollen, müssen die differenzierten Zellen in der Stammzellenkultur identifiziert werden. Dies erfordert bisher einen invasiven Eingriff in die Stammzellenkultur, wie zum Beispiel eine spezifische Färbung, was eine unerwünschte Beeinflussung der Zellen darstellt.
Bei der in vitro-Kultivierung bilden biologische Zellen auf einem Substrat typischerweise eine Zellschicht mit wenigen Zelllagen oder einer einzigen Zelllage (Monoschicht ) . Bestimmte Zelltypen zeichnen dadurch aus, dass sie über die Dicke der Monoschicht hinauswachsen. Beispielsweise bilden Stammzellen im adhärenten Zustand dreidimensionale Zellaggre- gate (so genannte organoide Körper, siehe C. Kruse et al. in „Appl. Phys. A", Band 79, 2004, S. 1617-1624; und C. Kruse et al. in „Ann. Anat . x\ Band 188 (6), 2006, S. 503-517). Aus diesen Publikationen ist auch bekannt, dass aus den Zellaggregaten Stammzellen oder differenzierte Zellen herauswach- sen, die ebenfalls die oben genannte natürliche Zellbewegung aufweisen (siehe des Weiteren S. Danner et al . in "Mol. Hum. Reprod." Bd. 13, 2007, S. 11-20). Ein Problem der Kultivierung der Zellaggregate besteht insbesondere darin, dass bisher kein praktikables, nicht-invasives Verfahren zur Charak- terisierung der in einem Zellaggregat enthaltenen Zellen verfügbar ist.
Die Aufgabe der Erfindung ist es, ein verbessertes Verfahren zur Aufnahme, insbesondere Trennung von biologischen Zellen aus einer Stammzellenkultur bereitzustellen, mit dem die Nachteile und Beschränkungen der herkömmlichen Technik vermieden werden. Des Weiteren besteht die Aufgabe in der Bereitstellung einer verbesserten Substratanordnung, mit der insbesondere die Nachteile der herkömmlichen Kombination aus einem Träger und einer Sonde überwunden werden.
Diese Aufgaben werden durch ein Verfahren und eine Substratanordnung mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche ge- löst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Erfindung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.
Gemäß einem ersten Gesichtspunkt beruht die Erfindung auf der allgemeinen technischen Lehre, ein Verfahren zur Aufnahme biologischer Zellen aus einer Zellkultur bereitzustellen, bei dem die Zellen sich durch ihre natürliche Zellbewegung von einem Hauptsubstrat, auf dem die Zellkultur angeordnet ist, auf ein oder mehrere Aufnahmesubstrate bewegen, auf dem oder denen eine Kultivierung der Zellen erfolgt. Im Unterschied zur herkömmlichen Zellübertragung zwischen einem Träger, der ein Substrat für eine Zellkultur bildet, und einer Sonde, die ein Transportwerkzeug für einzelne Zellen darstellt, erfolgt erfindungsgemäß die Zellübertragung zwischen Substraten, die beide für eine Kultivierung biologischer Zellen eingerichtet sind.
Vorrichtungsbezogen wird die genannte Aufgabe durch eine Substratanordnung mit mindestens zwei Substraten gelöst, die an- einandergrenzend so positioniert sind, dass die Zellen durch ihre natürliche Zellbewegung von einem der Substrate auf das benachbarte Substrat übertragen werden können. Die Substrate umfassen ein Hauptsubstrat, auf dem eine Zellkultur kultivierbar ist, und mindestens ein Aufnahmesubstrat, das zur Be- siedelung mit Zellen aus der Zellkultur des Hauptsubstrats und zur Kultivierung dieser Zellen eingerichtet ist. Das Hauptsubstrat und das mindestens eine Aufnahmesubstrat sind separate Bauteile, die für die Zellübertragung aneinander- grenzend positionierbar und nach der Zellübertragung vonein- ander trennbar sind.
Ein wichtiger Vorteil der Erfindung besteht darin, dass zahlreiche Nachteile und Beschränkungen der herkömmlichen Technik überwunden werden. Mit dem mindestens einen Aufnahmesubstrat kann eine einzelne Zelle oder es können eine Vielzahl von
Zellen (z. B. mindestens 10, 100, 1000 oder sogar eine Millionen oder mehr Zellen) gleichzeitig vom Hauptsubstrat übernommen werden. Die Kultivierung der Zellen auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat ermöglicht, dass die Zellen auf dem Aufnahmesubstrat ohne weitere Zwischenschritte weiteren Verfahren, insbesondere Untersuchungen oder Behandlungen unterzogen werden können. Für die Übertragung der Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat ist es lediglich erforderlich, dass dieses passend zu einem Rand des Hauptsubstrats angeordnet ist. Die Übertragung der Zellen erfordert keine
Rückkopplungs-gesteuerte Manipulation der Substrate und auch keine besonderen Maßnahmen zur Justierung der Haupt- und Aufnahmesubstrate relativ zueinander vor oder während der Zellübertragung.
Erfindungsgemäß ist das mindestens eine Aufnahmesubstrat für eine Kultivierung der aus der Zellkultur ausgewanderten Zellen eingerichtet. Das Aufnahmesubstrat hat eine Substratoberfläche, deren Größe und Material so gewählt sind, dass auf dem Aufnahmesubstrat eine adhärente Zellkultur umfassend mindestens eine Zelle oder eine Vielzahl von Zellen (vorzugsweise mindestens 10 Zellen, z. B. einige Tausend Zellen) gebildet werden kann. Die Zellen sind auf dem Aufnahmesubstrat kultivierbar, d. h. das Aufnahmesubstrat ist für ein Wachstum und/oder eine Differenzierung der Zellen unter einstellbaren, reproduzierbaren Kultivierungsbedingungen geeignet. Auf dem Aufnahmesubstrat kann eine Oberflächenmodifizierung (z. B. eine molekulare Deposition oder eine Mikro- oder Nanostruktu- rierung) vorgesehen sein.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Zellen aus mindestens einem dreidimensionalen Zellaggregat, das auf dem Hauptsubstrat angeordnet ist, auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat übertragen. Das dreidimensionale Zellaggregat ist aus Stammzellen und ggf. einer Mischung von Zel¬ len verschiedener Typen gebildet und umfasst vorzugsweise einen organoiden Körper, wie er bspw. von C. Kruse et al. in den oben genannten Publikationen beschrieben ist. Der orga- noide Körper hat vorzugsweise eine Querschnittsdimension (z. B. Dicke, Durchmesser) im Bereich von 50 μm bis 20 mm. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Eigenschaft organoider Körper, im adhärenten Zustand einen dreidimensionalen Zellhaufen zu bilden, von dessen Oberfläche gleichmäßig Zellen auswachsen, einen wesentlichen Vorteil für die Erfindung bietet. Der organoide Körper bildet auf dem Hauptsubstrat eine ortsfeste Zellkultur, d. h. während der Übertragung von Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat bleibt die Position des organoiden Körpers unverändert.
Im Unterschied zu der herkömmlichen Technik werden daher keine besonderen Anforderungen an eine gegenseitige Ausrichtung oder sogar Bewegung der Haupt- und Aufnahmesubstrate gestellt. Aus dem Zellaggregat können selektiv ausschließlich die auswandernden Zellen aufgenommen werden, ohne dass das
Zellaggregat beeinträchtigt wird. Dabei bedarf es keiner mikroskopischen Beobachtung oder Steuerung. Das Verfahren kann vorteilhafterweise automatisiert werden. Des weiteren wird mit besonderem Vorteil die dauerhafte Proliferation organoi- der Körper ausgenutzt. Das Wachstum von Zellen aus organoiden Körpern kann über lange Kultivierungszeiten, z. B. im Bereich von 1 oder 2 Tagen bis 2, 10, 30 oder mehr Wochen stabil erhalten werden. Somit kann sich die Aufnahme von Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat ebenfalls über einen entsprechenden Zeitraum erstrecken.
Vorrichtungsbezogen wird die genannte Aufgabe somit insbesondere durch eine Substratanordnung mit dem Hauptsubstrat und dem mindestens einen Aufnahmesubstrat gelöst, wobei auf dem Hauptsubstrat mindestens ein dreidimensionales Zellaggregat angeordnet ist, das aus Stammzellen gebildet ist und aus dem Zellen heraus wandern.
Vorteilhafterweise könnten somit erfindungsgemäß ausschließlich Zellen auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat übertragen werden, die aus dem organoiden Körper herauswandern, während andere Zellen, die Teil des organoiden Körpers sind, auf dem Hauptsubstrat bleiben. Es wird eine selektive Entnahme der wandernden Zellen aus der Stammzellen-Zellkultur im organoiden Körper ermöglicht. Besondere Maßnahmen, etwa eine Nachführung der aneinandergrenzenden Substrate oder eine Überwachung der Zellübertragung sind nicht erforderlich. Das Verfahren zur Aufnahme von Zellen aus der Zellkultur bildet in diesem Fall ein Verfahren zur Trennung von Zellen aus organoiden Körpern, wobei vorteilhafterweise der Herkunftsort und der Weg der Zellen sowie gegebenenfalls deren Veränderung (z.B. Differenzierung, Dedifferenzierung) verfolgt und doku¬ mentiert werden können.
Wenn die Zellen aus der Zellkultur auf dem Hauptsubstrat auf mehrere verschiedene Aufnahmesubstrate bewegt werden, können sich Vorteile aus dem Potential, eine Vielzahl von Tochter- Zellkulturen auf den Aufnahmesubstraten zu bilden, und/oder aus der Möglichkeit ergeben, die Zellen auf den verschiedenen Aufnahmesubstraten verschiedenen Kultivierungsbedingungen auszusetzen.
Somit umfasst die Substratanordnung gemäß einer bevorzugten Variante der Erfindung das Hauptsubstrat und eine Vielzahl von Aufnahmesubstraten, die passend zu dem Hauptsubstrat gebildet und an dieses angrenzend positionierbar sind. Ein Aufnahmesubstrat ist passend zum Hauptsubstrat gebildet, wenn das Aufnahmesubstrat am Hauptsubstrat positionierbar ist und durch einen Rand des Hauptsubstrats eine Grenzlinie gebildet wird, bei deren Überwindung durch die natürliche Zellbewegung die Zellen auf das Aufnahmesubstrat gelangen. Vorzugsweise ist vorgesehen, das sich die Zellen vom Hauptsubstrat unmit- telbar auf das Aufnahmesubstrat bewegen. Die Aufnahmesubstrate bilden einen Satz von Austauschteilen, mit denen das Hauptsubstrat aufeinander folgend zusammensetzbar ist. Mit jedem weiteren Aufnahmesubstrat können weitere Zellen aus dem Zellaggregat aufgenommen werden. Erfindungsgemäß kann somit ein Modulsystem geschaffen werden, bei dem das erste Aufnahmesubstrat durch mindestens ein weiteres Aufnahmesubstrat ersetzbar ist oder bei dem auf das erste Aufnahmesubstrat ein mindestens weiteres Aufnahmesubstrat folgt.
Gemäß einer vorteilhaften Variante der Erfindung kann vorgesehen sein, dass sich die Zellen, die von den verschiedenen Aufnahmesubstraten aufgenommen werden, in ihren Eigenschaften unterscheiden. Zur spezifischen Aufnahme von Zellen mit unterschiedlichen Eigenschaften jeweils auf verschiedene Auf- nahmesubstrate können verschiedene inhärente Eigenschaften der Zellen und/oder verschiedene Eigenschaften der Substratoberflächen der Aufnahmesubstrate verwendet werden. Wenn aus der Stammzellen-Zellkultur auf dem Hauptsubstrat Zellen auswandern, können diese Zellen verschiedene Zelltypen, wie z. B. Stammzellen, Vorläuferzellen oder differenzierte Zellen umfassen. Die Erfinder haben festgestellt, dass die verschiedenen Zelltypen verschiedene Wanderungsgeschwindigkeiten haben. Somit können, ausgehend von einer Startzeit, zu der das Hauptsubstrat und das Aufnahmesubstrat aneinandergrenzend positioniert werden, zu verschiedenen Zeiten verschiedene Zelltypen auf verschiedene Aufnahmesubstrate übertragen werden.
Vorteilhafterweise ermöglicht dies eine nicht-invasive Tren- nung von Zellen aus der Stammzellen-Zellkultur, insbesondere aus dem organoiden Körper, in Abhängigkeit von ihren Zelltypen. Die Erfinder haben des Weiteren festgestellt, dass die Zellen in Abhängigkeit von ihren Differenzierungstypen auf verschiedene Aufnahmesubstrate wandern können, in dem die Aufnahmesubstrate mit einer modifizierten Substratoberfläche bereitgestellt werden, auf die ausschließlich ein bestimmter Differenzierungstyp aufwandert . Die Erfinder haben Hinweise darauf gefunden, dass die Zellen in Abhängigkeit von bisher unbekannten intrinsischen Eigenschaften auf verschiedene Auf- nahmesubstrate wandern oder anwachsen können, in dem die Aufnahmesubstrate mit einer modifizierten Substratoberfläche bereitgestellt werden, auf die dann bestimmte Zellen aufwandern oder anwachsen.
Wenn die Übertragung von Zellen auf eine Vielzahl von Aufnahmesubstraten vorgesehen ist, können diese gemäß einer ersten Variante der Erfindung zeitlich aufeinanderfolgend an dem Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Beispielsweise werden in einem ersten Schritt das Hauptsubstrat mit der Zellkultur, insbesondere dem organoiden Körper, und ein erstes Aufnahmesubstrat für eine Zellübertragung einer ersten Zellgruppe und/oder eines ersten Zelltyps auf das erste Aufnahmesubstrat bereitgestellt. Anschließend werden das Hauptsubstrat und das erste Aufnahmesubstrat voneinander getrennt. Die weitere KuI- tivierung der Zellen auf dem ersten Aufnahmesubstrat erfolgt getrennt von dem Hauptsubstrat. Anschließend werden die Schritte der Zellübertragung und Trennung mit mindestens einem weiteren Aufnahmesubstrat wiederholt, wobei weitere ZeI- len, insbesondere weiterer Zelltypen aus der Zellkultur von dem Hauptsubstrat auf das mindestens eine weitere Aufnahmesubstrat wandern.
Mit der zeitlich aufeinanderfolgenden Zellübertragung auf verschiedene Aufnahmesubstrate können verschiedene Vorteile erreicht werden. Erstens kann die genannte Trennung nach Zelltypen mit verschiedenen Wanderungsgeschwindigkeiten erreicht werden, indem die Aufnahmesubstrate in vorbestimmten Zeitbereichen am Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Des Weiteren können eine Vielzahl von Tochtersubstraten mit Zellen aus der Zellkultur besiedelt werden. Durch die aufeinanderfolgende Kombination des Hauptsubstrats mit den Aufnahmesubstraten kann bspw. in einer Kultivierungseinrichtung ein Hauptsubstrat mit einem organoiden Körper aufeinanderfolgend zwischen verschiedenen Aufnahmesubstraten umgesetzt werden, um jeweils eine Besiedelung mit Zellen aus dem organoiden Körper zu erzielen.
Bei der Übertragung der Zellen auf verschiedene Aufnahmesub- strate kann gemäß einer weiteren Variante der Erfindung vorgesehen sein, dass alle AufnahmeSubstrate gleichzeitig am Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Die Aufnahmesubstrate können bspw. an verschiedene Abschnitte des Randes des Haupt¬ substrats angrenzend angeordnet sein. Diese Gestaltung eignet sich besonders für die Übertragung von Zellen mit gleichen Wanderungsgeschwindigkeiten auf Aufnahmesubstrate mit verschieden modifizierten Substratoberflächen. Gemäß einem weiteren Beispiel können die Aufnahmesubstrate so an dem Hauptsubstrat angeordnet sein, dass Zellen zunächst ein unmittel- bar an das Hauptsubstrat angrenzendes Aufnahmesubstrat überwandern, bevor sie auf ein Aufnahmesubstrat mit einem größeren Abstand vom Hauptsubstrat gelangen. In diesem Fall wandern Zellen mit hoher Wanderungsgeschwindigkeit in einem Zeitbereich auf entfernt angeordnete Aufnahmesubstrate, indem gleichzeitig Zellen mit einer geringeren Wanderungsgeschwindigkeit auf Aufnahmesubstrate mit einem geringen Abstand vom Hauptsubstrat wandern. Die Wanderung der Zellen kann über Chemotaxis, Galvanotaxis oder andere Attraktoren gerichtet oder beschleunigt werden.
Wenn gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung die Zellen von der Zellkultur auf dem Hauptsubstrat in mindestens zwei verschiedene Richtungen auf das mindestens eine Aufnah- mesubstrat auswandern, können sich Vorteile aus einer erhöhten Effektivität der Zellaufnahme aus der Zellkultur ergeben. Die Zellen können bspw. auf ein einziges Aufnahmesubstrat wandern, welches das Hauptsubstrat zumindest teilweise umgibt, oder auf verschiedene Aufnahmesubstrate wandern, die entsprechend in verschiedenen Richtungen der Zellwanderung angeordnet sind. Besonders bevorzugt ist eine Variante, bei der sich die Zellen radial allseitig aus der Zellkultur, insbesondere aus dem organoiden Körper auf dem Hauptsubstrat auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat bewegen. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Geschwindigkeit der aus dem
Zellaggregat auswandernden Zellen mit fallender Dichte ansteigt. Somit wird vorteilhafterweise eine gleichmäßige Be- siedelung des mindestens einen Aufnahmesubstrats erzielt.
Vorteilhafterweise besteht eine große Variabilität bei der Gestaltung des mindestens einen Aufnahmesubstrates. Somit kann die Erfindung unter verschiedenen Anwendungsbedingungen und für verschiedene Aufgaben implementiert werden. Gemäß einer ersten Variante wird durch das mindestens eine Aufnahme- Substrat ein Substratrahmen gebildet, der das Hauptsubstrat umgibt. Der Substratrahmen ist besonders für die Aufnahme von Zellen geeignet, die allseitig vom Hauptsubstrat auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat wandern.
Allgemein wird ein Aufnahmesubstrat als Substratrahmen bezeichnet, wenn die Substratoberfläche, die zur Aufnahme und Kultivierung der Zellen vorgesehen ist, einen Bereich umgibt, der während der Zellübertragung frei von Zellen bleibt. Bei- spielsweise kann der Substratrahmen eine innere Öffnung aufweisen, die den zellfreien Bereich bildet und in die das Hauptsubstrat einsetzbar ist. Alternativ kann das Aufnahmesubstrat zur Bildung des Substratrahmens ein Substrat mit einer geschlossenen Substratoberfläche sein, auf die zur ZeIl- Übertragung das Hauptsubstrat aufsetzbar ist, so dass ein äußerer Bereich des Substrats als Substratoberfläche zur Aufnahme und Kultivierung der Zellen frei bleibt. In diesem Fall umfasst die erfindungsgemäße Substratanordnung einen Stapel aus einem Hauptsubstrat und mindestens einem Aufnahmesub- strat.
Der Substratrahmen hat somit allgemein einen Innenrand, der an die Form und Größe des Randes des Hauptsubstrats angepasst ist. Hat das Hauptsubstrat bspw. allgemein eine Vieleckform, so ist der Innenrand des Substratrahmens komplementär zu der Vieleckform. Bevorzugt ist jedoch eine Kreisform des Hauptsubstrats und des Innenrandes des Substratrahmens. In diesem Fall wird der Substratrahmen auch als Substratring bezeichnet. Die Kreisform bietet Vorteile für eine radial allseitig gleichförmige Übertragung der Zellen auf das Aufnahmesubstrat.
Gemäß einer weiteren Alternative kann der Substratrahmen aus mehreren Aufnahmesubstraten (Substratsegmente) zusammenge- setzt sein, die auf verschiedenen Seiten an das Hauptsubstrat angrenzend positionierbar sind. Die Substratsegmente sind voneinander trennbare Bauteile, die in zusammengesetztem Zustand den Substratrahmen bilden. Mit den Substratsegmenten können vorteilhafterweise für eine Zellübertragung verschieden modifizierte Substratoberflächen bereitgestellt werden. Die aus der Zellkultur auf dem Hauptsubstrat gleichzeitig abgetrennten Zellen können auf den Substratsegmenten verschiedenen Kultivierungsbedingungen unterzogen werden.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform der Erfindung können die Aufnahmesubstrate einen Substratverbund bilden. Das Hauptsubstrat und der Substratverbund können so relativ zueinander positioniert werden, dass das Hauptsubstrat an jeweils ein Aufnahmesubstrat des Substratverbundes angrenzt. Des Weiteren sind das Hauptsubstrat und der Substratverbund relativ zueinander beweglich. Somit kann durch eine gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes und des Hauptsubstrates ein vorbestimmtes Aufnahmesubstrat für die Aufnahme von Zellen bereitgestellt und/oder dieses Aufnahmesubstrat nach der Aufnahme der Zellen vom Hauptsubstrat getrennt werden.
Besonders bevorzugt ist eine Variante der Erfindung, bei der der Substratverbund ein biegsames Substratband bildet, in dessen Oberfläche die Aufnahmesubstrate gebildet sind. Es ist eine Reihe der Aufnahmesubstrate entlang der Länge des Substratbandes vorgesehen. Das Substratband ist für eine Translationsbewegung relativ zu einer Randkante des Hauptsubstrats eingerichtet. Die Randkante des Hauptsubstrats liegt auf der Oberfläche des Substratbandes auf. Somit kann durch die Translation des Substratbandes jeweils ein vorbestimmtes Aufnahmesubstrat am Hauptsubstrat bereitgestellt werden. Vorteilhafterweise kann das Substratband von einer Substratrolle am Hauptsubstrat vorbeigezogen werden, um Zellen auf die verschiedenen Aufnahmesubstrate aufzunehmen.
Wenn die Verschiebung des Substratverbundes relativ zum Hauptsubstrat diskontinuierlich erfolgt, ergeben sich Vorteile für Verfahren, bei denen abwechselnd Zellen auf eines der Aufnahmesubstrate wandern und dann das betreffende Aufnahmesubstrat vom Hauptsubstrat getrennt wird. Alternativ kann die Verschiebung des Substratverbundes relativ zum Hauptsubstrat kontinuierlich erfolgen. In diesem Fall können die Zellen ununterbrochen auf den Substratverbund übertragen werden. Vorteilhafterweise können somit große Oberflächen mit Zellen besiedelt werden, die aus einer einzigen Zellkultur, insbesondere einem einzigen organoiden Körper ausgewandert sind. Die gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes und des
Hauptsubstrats erfolgen vorzugsweise mit einer Geschwindigkeit, die an die Geschwindigkeit der natürlichen Zellbewegung angepasst ist. Die Geschwindigkeit ist z. B. im Bereich von 1 μm/h bis 400 μm/h gewählt.
Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der Möglichkeit, nach der Aufnahme der Zellen auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat weitere Schritte der Behandlung und/oder Untersuchung der auf dem Aufnahmesubstrat kultivierten Zellen zu realisieren. So kann eine Immobilisierung der Zellen auf dem Aufnahmesubstrat vorgesehen sein, bspw. um eine Testkultur bereitzustellen. Auf dem Aufnahmesubstrat kann ein weiteres Wachstum und/oder eine Differenzierung der Zellen erfolgen. Da die Zellen auf verschiedenen Aufnahmesubstraten aus einer gemeinsamen Zellkultur, insbesondere aus einem einzigen organoiden Körper ausgewandert sind, sind vorteilhafterweise vergleichende Untersuchungen möglich. Des Weiteren kann nach der Aufnahme der Zellen auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat eine weitere Trennung von differenzierten und nicht differenzierten Zellen und/oder eine Wechselwirkung der Zellen mit weiteren biologischen Zellen vorgesehen sein. Beispielsweise können die Zellen, die mit verschiedenen Aufnahmesubstraten aufgenommen und dort verschiedenen Kultivie- rungsbedingungen ausgesetzt wurden, gegenseitig zu Wechselwirkung gebracht werden.
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden unter Bezug auf die beigefügten Zeichnungen be- schrieben. Es zeigen:
Figur 1: eine schematische Illustration einer ersten Ausführungsform der Erfindung mit einer Zellwanderung auf einen Substratring;
Figur 2: eine Draufsicht auf eine Substratanordnung mit einem Stapel aus Haupt- und Aufnahmesubstraten;
Figuren 3 und 4: schematische Seitenansichten erfindungsgemä- ßer Substratanordnungen;
Figur 5: eine weitere schematische Illustration der ersten Ausführungsform der Erfindung mit einer Zellwanderung auf Substratsegmente;
Figur 6: eine schematische Seitenansicht einer zweiten Aus- führungsform der Erfindung mit einem Substratverbund; und
Figur 7: eine Draufsicht auf die in Figur 6 gezeigte Ausführungsform der Erfindung.
Ausführungsformen der Erfindung werden im Folgenden unter beispielhaftem Bezug auf die Aufnahme von Stammzellen und/oder differenzierten Zellen aus Zellaggregaten (organoiden Körpern) erläutert, die aus glandulären Stammzellen gebildet sind. Die Umsetzung der Erfindung ist jedoch nicht auf die Verwendung der glandulären Stammzellen beschränkt, son- dern auch mit anderen, adulten oder embryonalen Stammzellen, Vorläuferzellen und Zellgemischen menschlichen oder tierischen Ursprungs möglich. Die Zellaggregate können verschiedene Zelltypen, das heißt neben den Stammzellen auch Vorläuferzellen und/oder differenzierte Zellen enthalten. Alternativ können Zellen aus einem Gewebeisolat (z. B. Dermis, Haarfoli- kel) aufgenommen werden. Einzelheiten der Kultivierung von Stammzellen oder anderen Zelltypen werden hier nicht beschrieben, da diese aus den Standardverfahren der Zellbiologie an sich bekannt sind.
Als "Substrat" wird hier allgemein ein Bauteil verwendet, das als Träger für biologische Zellen geeignet ist. Das Substrat weist eine Substratoberfläche auf, auf der die Zellen adhä- rent anwachsen und die natürliche Zellbewegung ausführen kön- nen . Das Substrat hat eine flächige Ausdehnung, es besteht aus einem festen Material, das starr (z. B. Scheibe, Platte) oder nachgiebig (z. B. Folie) sein kann. Während der Übertragung der Zellen sind die Haupt- und Aufnahmesubstrate miteinander verbunden. Die Haupt- und Aufnahmesubstrate weisen z. B. ebene Substratoberflächen auf, die im verbundenen Zustand unmittelbar aneinander grenzend oder überlappend angeordnet sind. Die erfindungsgemäße Substratanordnung ist in einer Kultivierungseinrichtung, die in den Figuren nicht dargestellt ist. Die Kultivierungseinrichtung umfasst z. B. ein herkömmliches Kultivierungsgefäß mit einem flüssigen Kultivierungsmedium.
Figur 1 illustriert in Draufsicht schematisch eine erste Ausführungsform der erfindungsgemäßen Substratanordnung 100 mit einem Hauptsubstrat 10 und einem Aufnahmesubstrat 20. Das Hauptsubstrat 10 umfasst eine Platte in Form einer Kreisscheibe mit einem kreisförmigen äußeren Rand 11. Das Hauptsubstrat 10 besteht z. B. aus Glas oder Kunststoff. Auf der ebenen Substratoberfläche 12 des Hauptsubstrats 10 kann eine Beschichtung zur Bereitstellung vorbestimmter Kultivierungsbedingungen, z. B. eine Beschichtung aus Laminin, Poly-Lysin, Gelatine, Fibronektin oder andere Peptide vorgesehen sein. Der Durchmesser des Hauptsubstrats 10 ist z. B. im Bereich von 0,5 mm bis 2 cm gewählt. Die Dicke des Hauptsubstrats 10 ist z. B. im Bereich von 10 μm bis 2 mm gewählt. Das Hauptsubstrat 10 kann mit einem schematisch illustrierten Trägerelement 13 ausgestattet sein (siehe Figur 3). Das Trägerele- ment 13 ist ein Vorsprung, mit dem eine Manipulation des Hauptsubstrats 10 unter Verwendung eines mechanischen Werkzeugs erleichtert wird.
Das Aufnahmesubstrat 20 umfasst einen Substratring 21 mit einer Substratoberfläche 21.1, die für eine Kultivierung biolo- gischer Zellen eingerichtet ist. Der Substratring 21 weist eine innere Öffnung 21.2 auf, die vom Innenrand 21.3 des Substratringes 21 umgrenzt ist. Die Form und Größe des Innenrandes 21.3 ist gleich der Form und Größe des äußeren Randes 11 des Hauptsubstrats 10 gewählt. Der äußere Durchmesser des Substratringes 21 ist z. B. im Bereich von 5 mm bis 5 cm gewählt. Das Hauptsubstrat 10 passt formschlüssig in die innere Öffnung 21.2 des Substratringes 21. Die Oberflächen des Hauptsubstrates und des Aufnahmesubstrates sind vorzugsweise fluchtend ausgerichtet. Das Hauptsubstrat 10 und der Sub- stratring 21 sind getrennte Bauteile, die für die erfindungsgemäße Zellübertragung zusammensetzbar sind.
In Figur 1 sind auch die Schritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Aufnahme von Zellen aus einer Zellkultur Schema- tisch illustriert. In einer ersten Phase wird die Zellkultur 3 auf dem Hauptsubstrat 10 kultiviert. Die Zellkultur 3 um- fasst einen oder mehrere, Stammzellen enthaltende, organoide Körper. Die Kultivierung der Zellkultur 3 mit der Bildung des organoiden Körpers auf dem Hauptsubstrat 10 erfolgt, während das Hauptsubstrat 10 noch vom Substratring 21 getrennt oder bereits in diesem eingesetzt ist.
Nach der Bildung des organoiden Körpers wandern Zellen 1, 2 aus der Zellkultur 3 radial allseitig aus (siehe Pfeile) .
Aufgrund der natürlichen Zellbewegung wandern die Zellen 1, 2 auf den Substratring 21, auf dem eine weitere Kultivierung der Zellen erfolgt.
Nach der Zellübertragung der Zellen 1, 2 auf den Substratring 21 werden das Hauptsubstrat 10 und das Aufnahmesubstrat 20 (Substratring 21) voneinander getrennt (siehe unterer Teil von Figur 1) . Der Zeitpunkt der Trennung wird in Abhängigkeit von den konkreten Anwendungsbedingungen der Erfindung ge- wählt. Beispielsweise kann die Trennung nach einer vorbestimmten Übertragungszeit (z. B. 1 Stunde bis 14 Tage) oder nach Erreichen eines vorbestimmten Besiedelungsgrades des Aufnahmesubstrats 20 erfolgen.
Anschließend kann das Hauptsubstrat 10 mit einem weiteren
Aufnahmesubstrat 20 (in Figur 1 nicht dargestellt) kombiniert werden, um weitere Zellen auf das weitere Aufnahmesubstrat zu übertragen. Des Weiteren kann die auf dem Substratring 21 gebildete Zellkultur weiteren Schritten der Behandlung und/oder Untersuchung, wie z. B. einer weiteren Differenzierung unterzogen werden.
Figur 2 illustriert eine abgewandelte Variante einer Substratanordnung 100, bei der mehrere Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2, 20.3 mit einem Hauptsubstrat 10 als Substratstapel kombiniert sind. Das Hauptsubstrat 10 mit der Zellkultur 3 (organoider Körper) umfasst eine Kreisscheibe, die auf dem ersten Aufnahmesubstrat 20.1 aufliegt. Das erste Aufnahmesub- strat 20.1 umfasst ebenfalls eine Kreisscheibe, die auf dem zweiten Aufnahmesubstrat 20.2 liegt, das seinerseits auf dem dritten Aufnahmesubstrat 20.3 liegt. Da die Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2 und 20.3 verschiedene Durchmesser haben, wird durch eine konzentrische Anordnung an jedem der Aufnahmesub- strate ein Substratring gebildet. Beispielsweise wird durch den vom Hauptsubstrat 10 nicht abgedeckten Teil des ersten Aufnahmesubstrats 20.1 der erste Substratring gebildet, der das Hauptsubstrat 10 allseitig umgibt.
Für eine wirksame Zellübertragung ist die Dicke des Hauptsubstrats 10 vorzugsweise geringer als 1 mm, insbesondere geringer als 250 μm gewählt. Hierzu besteht das Hauptsubstrat 10 bspw. aus einer Kunststofffolie, z. B. aus Polyurethan. Die Dicken der Aufnahmesubstrate 20.1 und 20.2 weisen vorzugswei- se ebenfalls eine Dicke auf, die geringer als 1 mm, insbesondere geringer als 250 μm ist. Die aneinander grenzenden Ränder der Haupt- und Aufnahmesubstrate können angeschrägt sein, so dass die Zellwanderung zwischen den Substraten erleichtert wird.
Zur erfindungsgemäßen Aufnahme biologischer Zellen aus der Zellkultur 3 wird das Hauptsubstrat 10 mit der Zellkultur 3 auf den Stapel aus Aufnahmesubstraten 20.1, 20.2 und 20.3 aufgesetzt. Die aus der Zellkultur 3 auswandernden Zellen be- wegen sich aufgrund der natürlichen Zellbewegung radial allseitig auf die Substratringe. Da sich die verschiedenen Zelltypen, die aus der Zellkultur 3 auswandern, in ihren Wanderungsgeschwindigkeiten unterscheiden können, kann durch die Zellübertragung eine Trennung nach Zelltypen erfolgen. So er- reichen nach einer vorbestimmten Zeit der Zellübertragung (z. B. 1 bis 2 Stunden bis 14 Tage) die schnellsten Zellen den äußersten Substratring 21.3, während die übrigen Zellen auf den inneren Substratringen 21.1, 21.2 angeordnet sind. An- schließend erfolgt eine Trennung des Hauptsubstrats 10 von den Aufnahmesubstraten 20.1, 20.2 und 20.3 und eine Trennung der Aufnahmesubstrate voneinander. Das Hauptsubstrat 10 mit der Zellkultur 3 wird anschließend auf einen weiteren Substratstapel aufgesetzt, um weitere Zellen aus der Zellkultur 3 aufzunehmen. Die Aufnahmesubstrate 20.1, 20.2 und 20.3 werden weiteren Kultivierungsschritten unterzogen.
Das in Figur 2 gezeigte Prinzip der Bildung eines Substratstapels ist nicht auf die Kombination des Hauptsubstrats 10 mit drei Aufnahmesubstraten beschränkt, sondern entsprechend auch bspw. mit einem einzigen Aufnahmesubstrat oder mehr als drei Aufnahmesubstraten möglich. Alternativ zu der gezeigten Anordnung des Hauptsubstrates mit einem geringen Durchmesser auf den Aufnahmesubstraten mit steigenden Durchmessern können die Aufnahmesubstrate Substratringe mit verschiedenen Innendurchmesser umfassen, die auf ein Hauptsubstrat aufgesetzt sind. Diese beiden Varianten der Bildung des Substratstapels sind mit den Seitenansichten in den Figuren 3 und 4 schematisch illustriert.
Gemäß Figur 3 liegt das Hauptsubstrat 10 wie bei Figur 2 beschrieben auf einem flächigen Substrat. Durch dessen vom Hauptsubstrat 10 nicht abgedeckten Teil wird das Aufnahmesub- strat 20 (Substratring 21) gebildet. Auf dem Hauptsubstrat 10 ist die Zellkultur 3 angeordnet, aus der Zellen 1, 2 auswandern und auf den Substratring 21 übertragen werden. Nach der Besiedelung des Substratringes 21 mit den Zellen 1, 2 kann das Hauptsubstrat 10 mit der Zellkultur 3 vom flächigen Sub¬ strat abgenommen und weiteren Verfahrensschritten zugeführt werden. Zur Trennung der Haupt- und Aufnahmesubstrate 10, 20 wird das Hauptsubstrat 10 am Trägerelement 13 mit einem mechanischen Werkzeug (nicht dargestellt) ergriffen.
Figur 4 illustriert das umgekehrtes Prinzip der Bildung eines Substratstapels, bei dem das Hauptsubstrat 10 einen Träger für ein ringförmiges Aufnahmesubstrat 20 mit einer inneren Öffnung 21.2 bildet. Die Zellkultur 3 ruht unbeweglich auf dem Aufnahmesubstrat 10 in der inneren Öffnung 21.2 des Auf- nahmesubstrats 20. Die von der Zellkultur auswandernden Zellen 1, 2 besiedeln die Substratoberfläche des Aufnahmesubstrats 20, wo auch eine weitere Kultivierung der Zellen 1, 2 erfolgt.
Figur 5 illustriert eine weitere Variante der Erfindung, bei der als Aufnahmesubstrate 20 mehrere Substratsegmente 22.1, 22.2 und 22.4 vorgesehen sind, die das Hauptsubstrat 10 umgeben. Die Substratsegmente 22.1 bis 22.4 bilden im zusammengesetzten Zustand einen Substratring, der mit Zellen besiedelt werden kann, wie dies oben unter Bezug auf Figur 1 beschrieben wurde. Nach der Zellübertragung können Substratsegmente 22.1 bis 22.4 voneinander getrennt werden (siehe Pfeile). Nach der Trennung können verschiedene Substratsegmente mit¬ einander kombiniert werden, um die Zellen auf den Substrat- Segmenten zur Wechselwirkung zu bringen.
Gemäß einer Variante der Erfindung kann die Trennung eine Verschiebung der Substratsegmente 22.1 bis 22.4 auf einem gemeinsamen Träger umfassen, das ein weiteres Aufnahmesubstrat 20.4 bildet. Dabei können die Zellen von den Substratsegmenten 22.1 bis 22.4 auf das weitere Aufnahmesubstrat 20.4 aufwandern und auf diesem miteinander wechselwirken. Figur 5 illustriert schematisch, dass das Aufnahmesubstrat 20 eine biologische wirksame Beschichtung aufweisen kann. Die biologisch wirksame Beschichtung kann z. B. Fibronektin, ein anderes Matrixmolekül, ein Polymer oder immobilisierende Sig- nalmoleküle umfassen. Die Beschichtung kann homogen gebildet sein (22.1), eine Flächendichtegradienten aufweisen (22.2) oder mindestens eine Beschichtungssubstanz (22.3, 22.4) umfassen. Verschiedene Beschichtungssubstanzen können sich beim Übergang zwischen den Substratsegmenten ggf. teilweise über- lagern (22.3, 22.4). Gemäß einer weiteren Alternative können Muster der Beschichtung mit Detailstrukturen mit typischen Dimensionen im μm- oder mm-Maßstab vorgesehen sein. Durch die biologisch wirksame Beschichtung der Substratsegmente werden auf den verschiedenen Teilen des Aufnahmesubstrates 20 ver- schiedene Kultivierungsbedingungen geschaffen. Beispielsweise können die aus der Zellkultur 3 auswandernden Stammzellen auf den Substratsegmenten 22.1 bis 22.4 verschieden differenziert werden. Nach der Trennung der Substratsegmente und/oder der Übertragung auf das gemeinsame Aufnahmesubstrat 20.4 können die verschieden differenzierten Zellen miteinander wechselwirken. Gemäß einer weiteren Variante können verschiedene Aufnahmesubstrate mit Zellen aus verschiedenen Zellkulturen (in Figur 5 nicht gezeigt) besiedelt werden. Nach der Zell¬ übertragung auf die Aufnahmesubstrate kann eine gegenseitige Wechselwirkung der verschiedenen Zellen vorgesehen sein.
Die Figuren β und 7 zeigen eine zweite Ausführungsform der Erfindung, bei der die Aufnahmesubstrate 20, 20.1, ... Teil eines Substratbandes 23 sind, in schematischer Seitenansicht und Draufsicht. Die Substratanordnung 100 umfasst das Hauptsubstrat 10 zur Aufnahme der Zellkultur 3 und das Substratband 23. Das Hauptsubstrat 10 ist ortsfest in einer Kultivierungseinrichtung angeordnet und z. B. an einer Wand 30 eines Kultivierungsgefäßes (nicht dargestellt) befestigt. Auf dem Hauptsubstrat 10 kann eine adhäsionsmindernde Beschichtung 14 (z. B. aus PTFE, Alginat, Polysaccharide) vorgesehen sein, um die Bewegung von Zellen auf Wege hin zum Rand 11 zu beschränken. Eine Mulde 15 des Hauptsubstrates 10 dient der Aufnahme der Zellkultur 3.
Das Substratband 23 umfasst ein flexibles Material, z. B. Kunststoff, auf dessen Oberfläche die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 gebildet sind. Die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 umfassen voneinander getrennte Bereiche der Oberfläche des Substratbandes 23. Das Substratband 23 weist eine Dicke von z. B. 250 μm und eine Breite von z. B. 10 mm auf. Die Aufnahmesubstrate 20, 20.1 sind mit verschiedenen biologisch wirksamen Be- schichtungen, z. B. aus Laminin, Fibronektin oder andere bio- aktive Moleküle, die für eine spezifische Adhäsion von Zellen verwendet werden, gebildet.
Das Substratband 23 ist in einer Substratrolle 24 unterhalb des Hauptsubstrats 10 angeordnet. Von der Substratrolle 24 wird das Substratband 23 über Umlenkrollen (nicht dargestellt) so an dem Rand 11 des Hauptsubstrats 10 vorbeigeführt, dass Zellen 1, 2 auf das jeweils angrenzende Aufnahme- substrat 20, 20.1 aufwandern können. Die Translationsbewegung (siehe Pfeil) des Substratbandes 24 erfolgt bspw. mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1 μm/h bis 400 μm/h.
Gemäß einer weiteren Variante kann vorgesehen sein, dass das Band diskontinuierlich schneller weiter geschaltet wird, um Abstände mit geringerer oder ohne Zellbesiedelung zu schaf- fen. Vorteilhafterweise kann das Band anschließend an diesen Abständen durchtrennt werden, ohne die übrigen Zellen zu beschädigen . Zur erfindungsgemäßen Aufnahme biologischer Zellen aus der Zellkultur 3 wird diese auf dem Hauptsubstrat 10 angeordnet. Die aus der Zellkultur 3 auswandernden Zellen 1, 2 bewegen sich aufgrund der natürlichen Zellbewegung über den Rand 11 auf das angrenzende Aufnahmesubstrat 20. Um weitere Zellen aus der Zellkultur 3 aufzunehmen, wird das Substratband 23 mit den Aufnahmesubstraten 20, 20.1, ... relativ zum Rand 11 des Hauptsubstrats 10 verschoben.
Mit der in den Figuren 6 und 7 gezeigten Ausführungsform der Erfindung können vorteilhafterweise verschiedene Zelltypen aus der Zellkultur 3 (umfassend z. B. einen organoiden Körper oder ein Gewebeisolat ) separiert und auf Oberflächen getrennt aufgenommen werden. Weitere Kultivierungsschritte, Behandlun- gen und/oder Untersuchungen können sich an den voneinander getrennten Zellen anschließen.
Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüche offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.

Claims

ANSPRUCHE
1. Verfahren zur Aufnahme von biologischen Zellen (1, 2) aus einer Zellkultur (3) , mit den Schritten:
- Kultivierung der Zellkultur auf einem Hauptsubstrat (10),
- Zellübertragung von dem Hauptsubstrat (10) auf mindestens ein Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...), wobei die Zellen (1, 2) sich durch eine natürliche Zellbewegung auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) bewegen, und
- Trennung des Hauptsubstrats (10) und des mindestens einen Aufnahmesubstrates (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) voneinan- der, dadurch gekennzeichnet:, dass
- auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, ...) eine Kultivierung der Zellen (1, 2) vorgesehen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem
- die Zellkultur auf dem Hauptsubstrat (10) ein dreidimensionales Zellaggregat (3) umfasst, das aus Stammzellen gebildet ist und aus dem die Zellen (1, 2) heraus wandern.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, bei dem
- die Zellen (1, 2) sich auf mehrere verschiedene Aufnahmesubstrate (20.1, 20.2, 20.3) bewegen.
4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem
- die Zellen (1, 2), die sich auf die verschiedenen Aufnahmesubstrate (20.1, 20.2, 20.3) bewegen, jeweils verschiedene Eigenschaften aufweisen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, bei dem
- die Zellen (1, 2), die sich auf die verschiedenen Aufnahmesubstrate (20.1, 20.2, 20.3) bewegen, verschiedene 'Wanderungsgeschwindigkeiten der natürlichen Zellbewegung und/oder verschiedene Differenzierungstypen aufweisen.
6. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
- die Aufnahmesubstrate (20, 20.1 ...) für die Zellübertra- gung zeitlich aufeinander folgend an dem Hauptsubstrat (10) bereitgestellt werden.
7. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) für die Zellübertragung gleichzeitig an dem Hauptsubstrat (10) bereitgestellt werden.
8. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden An- sprüche, bei dem
- die Zellen (1, 2) sich bei der Zellübertragung in mindestens zwei verschiedenen Richtungen aus der Zellkultur (3) auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ... ) bewegen.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem
- die Zellen (1) sich radial allseitig aus der Zellkultur (3) auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ... ) bewegen.
10. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem - die Aufnahmesubstrate (20) Substratrahmen (21) umfassen, die für die Zellübertragung so angeordnet werden, dass das Hauptsubstrat (10) von den Substratrahmen (21) umgeben ist.
11. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
- die Aufnahmesubstrate (20) Substratsegmente (22.1, 22.2, 22.3, 22.4) umfassen, die für die Zellübertragung an das HauptSubstrat (10) angrenzend angeordnet sind.
12. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem
- die Aufnahmesubstrate (20, 20.1, ...) einen Substratverbund bilden, wobei - für die Bereitstellung und/oder die Aufnahme der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, ...) der Substratverbund und das Hauptsubstrat (10) relativ zueinander verschoben werden.
13. Verfahren nach Anspruch 12, bei dem - der Substratverbund ein flexibles Substratband (23) um- fasst, auf dessen Oberfläche eine Reihe der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, ...) gebildet ist, und
- für die Bereitstellung und/oder die Aufnahme eine Translation des Substratbandes (23) relativ zu einem Rand (11) des Hauptsubstrats (10) vorgesehen ist.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, bei dem
- die gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes und des Hauptsubstrats (11) diskontinuierlich erfolgt.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 oder 13, bei dem
- die gegenseitige Verschiebung des Substratverbundes und des Hauptsubstrats (11) kontinuierlich erfolgt.
16. Verfahren nach Ansprüche 15, bei dem
- die Verschiebung mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1 μm/h bis 400 μm/h erfolgt.
17. Verfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, mit mindestens einem der Schritte:
- Immobilisierung der Zellen (1, 2) auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...),
- Untersuchung der Zellen (1, 2) auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...),
- Aufnahme von differenzierten und nicht differenzierten Zellen von dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ... ) ,
- Wechselwirkung der Zellen (1, 2) auf dem mindestens einen Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) mit weiteren biologischen Zellen, und
- Wechselwirkung der Zellen (1, 2) auf einem der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) mit den Zellen (1, 2) auf einem anderen der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ... ) .
18. Substratanordnung (100) zur Bereitstellung von biologischen Zellen (1, 2) einer Zellkultur, umfassend:
- ein Hauptsubstrat (10), auf dem die Zellkultur kultivierbar ist, und
- mindestens ein Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...), das zur Aufnahme der Zellen (1, 2) eingerichtet ist, wobei
- das Hauptsubstrat (10) und das mindestens eine Aufnahmesub- strat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) so zueinander passend gebildet und positionierbar sind, dass die Zellen (1, 2) durch eine natürliche Zellbewegung aus der Zellkultur auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ... ) wandern können, und - das Hauptsubstrat (10) und das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) voneinander trennbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass - das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) eine Substratoberfläche aufweist, auf der die Zellen (1, 2) kultivierbar sind.
19. Substratanordnung nach Anspruch 18, bei der - mehrere Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) vorgesehen sind, wobei das Hauptsubstrat (10) und die Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) so zueinander passend gebildet und positionierbar sind, dass die Zellen (1, 2) durch die natürliche Zellbewegung aus der Zellkultur (3) auf das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) wandern können.
20. Substratanordnung nach Anspruch 19, bei der
- das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) einen Rand aufweist, dessen geometrische Form komplementär zu einem äußeren Rand (11) des Hauptsubstrat (10) gebildet ist.
21. Substratanordnung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem
- das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) einen Substratrahmen bildet, der das Hauptsubstrat (10) umgibt.
22. Substratanordnung nach Anspruch 21, bei dem
- jeder der Substratrahmen einen Substratring (21) umfasst, der das Hauptsubstrat (10) umgibt.
23. Substratanordnung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 20, bei dem
- das mindestens eine Aufnahmesubstrat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) mehrere, voneinander trennbare Substratsegmente (22.1, 22.2, 22.3, 22.4) umfasst, die auf verschiedenen Seiten an das Hauptsubstrat (10) angrenzend positionierbar sind.
24. Substratanordnung nach Anspruch 23, bei dem
- mehrere Aufnahmesubstrate (20, 20.1, ...) einen Substrat- verbünd bilden, auf dem ein Rand (11) des Hauptsubstrats (10) aufliegt, wobei
- das Hauptsubstrat (10) und der Substratverbund relativ zueinander verschiebbar sind.
25. Substratanordnung nach Anspruch 24, bei dem
- der Substratverbund ein flexibles Substratband (23) umfasst, auf dessen Oberfläche eine Reihe der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, ...) gebildet ist, wobei
- das Substratband (23) für eine Translation relativ zum Rand (11) des Hauptsubstrats (10) eingerichtet ist.
26. Substratanordnung nach Anspruch 24 oder 25, bei dem
- das Hauptsubstrat (10) und das Substratband (23) für eine Relativbewegung mit einer Geschwindigkeit im Bereich von 1 μm/h bis 400 μm/h eingerichtet sind.
27. Substratanordnung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 23, bei der
- das Hauptsubstrat (10) und das mindestens eine Aufnahmesub- strat (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) einen Stapel bilden.
28. Substratanordnung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 27, die mindestens eine der folgenden Eigenschaften aufweist : - mindestens eines der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) hat eine immobilisierende Oberfläche, die zur Immobilisierung der Zellen eingerichtet ist,
- mindestens eines der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) trägt eine Oberflächenmodifizierung, mit der die Kultivierung, insbesondere ein Wachstum und/oder ein Differenzierung, der Zellen (1) gefördert wird,
- mindestens eines der Aufnahmesubstrate (20, 20.1, 20.2, 20.3, 20.4 ...) trägt weiteren biologische Zellen.
29. Substratanordnung nach mindestens einem der Ansprüche 18 bis 28, bei der
- die Zellkultur (3) auf dem Hauptsubstrat (10) angeordnet ist, wobei die Zellkultur (3) ein dreidimensionales Zellag- gregat umfasst, das aus Stammzellen gebildet ist und aus dem die Zellen (1, 2) heraus wandern.
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