EP2121958A1 - Mikrobielles verfahren zur herstellung von enzymen - Google Patents

Mikrobielles verfahren zur herstellung von enzymen

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EP2121958A1
EP2121958A1 EP07819419A EP07819419A EP2121958A1 EP 2121958 A1 EP2121958 A1 EP 2121958A1 EP 07819419 A EP07819419 A EP 07819419A EP 07819419 A EP07819419 A EP 07819419A EP 2121958 A1 EP2121958 A1 EP 2121958A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
minimal medium
enzyme
medium
fungus
lipase
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07819419A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus-Peter Stahmann
Susanne Nieland
Anne Wuttke
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fachhochschule Lausitz
Original Assignee
Fachhochschule Lausitz
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Filing date
Publication date
Application filed by Fachhochschule Lausitz filed Critical Fachhochschule Lausitz
Publication of EP2121958A1 publication Critical patent/EP2121958A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the invention relates to a submerged process for the production of an enzyme and to an enzyme which can be obtained by this process.
  • Sterile technology not only means high investment costs for autoclaves and steam generators, as well as temperature and pressure stable containers, pipes and valves made of steel, but also high operating costs in terms of energy and time for heating and cooling.
  • the present invention is therefore based on the object to provide a process for the preparation of an enzyme which overcomes the disadvantages summarized above. While conventional methods require investment costs in the tens of millions, the cost of implementing the invention on the order of an agricultural utility vehicle, such as a tractor. This will make a new independent profession, the enzyme host, possible.
  • the present invention relates to a submerged process for producing an enzyme, comprising the steps of: a) providing a minimal medium comprising deionized water, mineral salts and an organic carbon source in a vessel, b) inoculating the minimal medium with a fungus, c) Incubating the minimal medium at a pH of 1-4 for a time sufficient for the fungus to be optically visible in the minimal medium, and d) recovering the enzyme, wherein the minimal medium and the vessel are not sterilized.
  • the invention comprises an enzyme which can be produced by the process according to the invention.
  • Figure 1 shows the growth of Phialemonium spec. or the Acremonium stricum isolate AW02 on an agar plate with a complete medium of 10 g / l glucose and yeast extract, which was solidified with 20 g / l agar. On the left is an entire agerplatte, on the right an enlargement of the aerial mycelium.
  • FIG. 2 shows a fluorescence micrograph of the Phialemonium spec. or the Acremonium strictum isolate AW02 after staining with Nile Red.
  • the hydrophobic fluorescent dye preferably accumulates in lipid droplets, which may serve as storage material for the cells.
  • a large droplet has a diameter of about 5 ⁇ m.
  • Figure 3 shows a phase contrast image of the culture broth after 3 days of growth at 34 C C and 120 rpm in minimal medium with 50 g / l glucose. Usually spores can be seen.
  • Figure 4 shows the lipase activity in a culture in a large open vessel. After mixing the culture with a concrete stirrer, a sample was taken and homogenized by a French-Press Passage. The homoge- nate was used in a continuous colorimetric lipase test. The hydrolysis of para-nitrophenyl palmitate was measured at 405 nm. One unit (U) corresponded to 1 ⁇ mol of released para-nitrophenol per minute.
  • Figure 5 shows a simple culture system for a lipase producer.
  • FIG. 6 shows a vessel in the form of a large vessel with a capacity of 100 l culture medium.
  • An apparatus for introducing sterile filtered air is provided.
  • a second identical vessel was cut vertically into six segments. These segments served to facilitate the harvesting of the biofilm. After inoculating the medium with a spore suspension, the growing mycelium colonized the surface of the segments and formed a biofilm. Approximately 90% of the lipase activity could be harvested by removing, draining and scraping the segments.
  • the present invention firstly relates to a submerged process for the production of an enzyme, comprising the steps: a) providing a minimal medium comprising deionized water, mineral salts and an organic carbon source in a vessel, b) inoculating the minimal medium with a fungus, c) incubating the minimal medium at a pH of 1-4, for a time period which is sufficient for the fungus to be optically visible in the minimal medium; and d) recovering the enzyme whereby the minimal medium and the vessel are not sterilized.
  • Essential for the invention is the isolation of a microorganism that reliably permeates non-sterilized medium. Specific conditions were set as selective conditions. First, a minimal medium with nitrate was used as nitrogen source. Furthermore, a carbon source was used, with emulsified vegetable fat as the sole source of carbon and energy has proven to be advantageous. Further, the initial pH was adjusted to an acidic range of 1 to 4, with a pH of 3 being particularly suitable. An incubation temperature of 35 ° C has also proved to be advantageous.
  • the fungus may initially be visibly deposited on the vessel wall as a biofilm.
  • the minimal medium is clouded by the growth of the fungus. This visual, visible to the naked eye turbidity of the medium is also an indication that the fungus was sufficiently long attracted.
  • the enzyme in step d), can be recovered from the biofilm or from the minimal medium (culture broth).
  • the enzyme is selected from the group consisting of lipase, amylase and protease. These belong to the class of extracellular hydrolases. Lipases split triglycerides into fatty acids and glycerol, which can then be absorbed by the microorganism into the cell. Amylases cleave alpha-1, 4 linked glucose chains. So-called endoglucanases release oligomers, whereas exoglucanases usually release maltose. Again, the degradation is used to allow the microorganism uptake of the degradation products in the energy and metabolism. The protease finally hydrolyzes proteins into peptides for which there are highly efficient importers in fungi. Intracellularly, decomposition into amino acids and, as required, degradation to keto acids or activation for protein biosynthesis take place.
  • lipase as a carbon source to use a fat, in particular vegetable triglycerides, such as soybean oil, sunflower oil or rapeseed oil. Only a few organisms can use these as the sole source of carbon and energy. Soybean oil has the particular advantage that only a few mushrooms can use this fat quickly and effectively as the sole carbon source. Thus, the soybean oil also acts as a selection agent to limit the growth of other unwanted microorganisms.
  • amylase is suitable as a carbon source in particular starch.
  • gelatin can be used to form a protease enzyme.
  • Nitrate is inexpensive and excludes microorganisms as contaminants of the process that can not reduce nitrate.
  • the minimum medium based on one liter of water, comprises about 0.5 to 10 g of KNO 3, about 0.5 to 5 g of KH 2 PO 4 approx. 0.2 to 0.75 g MgSO 4 x 7H 2 O approx. 0.2 to 0.75 g FeSO 4 x 7H 2 O approx. 0.2 to 0.75 g ZnSO 4 x 5H 2 O approx. 0.01 to 0.05 g CuSO 4 x 5H 2 O approx. 0.01 to 0.05 g MnCl 2 x 4H 2 O and approx. 5 to 100 ml soybean oil.
  • the minimal medium based on one liter of water, comprises about 1.5 g of KNO 3 , about 1.5 g of KH 2 PO 4, about 0.5 g of MgSO 4 .7H 2 O, about 0.5 g of FeSO 4 x 7H 2 O 0,5 g ZnSO 4 x 5 H 2 O about 0.02 g CuSO 4 x 5 H 2 O about 0.02 g MnCl 2 x 4H 2 O and 18 ml of soybean oil.
  • De-ionized water must be used to prevent the growth-inhibiting substances from entering the water.
  • fungus for enzyme production from the group consisting of deuteromycetes and anamorphs of the Ascomycetes.
  • the inventive method is carried out at acidic pH between about pH 1 and pH 4.
  • An initial pH of 3 has been found to be particularly advantageous for the preparation of soybean oil lipase.
  • an even lower pH of about 2.5 could prove to be particularly suitable.
  • the incubation time can take up to 14 days.
  • the enzyme production can be significantly increased if the inventive method at a temperature between about 20 0 C and about 45 ° C, preferably at 20 0 C to about 35 ° C, more preferably at about 21 ° C is performed. Particularly preferred is a temperature range above room temperature, most preferably at about 35 ° C.
  • the enzyme production by the fungi preferably takes place in the aerobic medium, in a further embodiment it is preferable to aerate the minimal medium.
  • aerate the minimal medium particularly suitable for this is the ventilation via a sterile filter and a frit.
  • the process can be carried out to a large extent under non-sterile conditions and thus extremely cost-effectively, it has proved to be advantageous for the inoculum culture which inoculates the minimal medium to use sterile conditions. This ensures that the minimal medium is inoculated with a pure fungal culture that is not contaminated by bacteria or other unwanted microorganisms.
  • the volume of the minimal medium is preferably about 1 liter to about 3500 m 3 . Suitable is a volume of about 100 liters. Particularly suitable is a volume of about 350 liters has been found.
  • the culture vessel used may be a large vessel or a vessel or a bucket which is inoculated with a spore suspension.
  • a further subject of this invention is an enzyme, preferably a lipase, amylase or protease, which can be prepared by the process according to the invention.
  • the soybean oil was emulsified before pouring the plates. Initially, it was incubated at room temperature. Subsequently, the temperature was gradually increased to 35 ° C. By inoculating on new plates macroscopic different colonies were separated.
  • the microorganism isolated in this way was designated AW02 and determined by the German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (DSMZ) in Braunschweig as Acremonium strictum. A second analysis has shown that it is Phialemonium spec. is.
  • the mycelium of Acremonium strictum has been described as very tender.
  • the Hyphen micr was about 1 - 1, 5 microns.
  • the conidiophores were short and rare.
  • the phialides were simple, not chromophilic, laterally arranged on undifferentiated hyphae, up to 25 ⁇ m long and mostly found directly on the aerial mycelium.
  • the conidia were cylindrical / ellipsoidal with a size of about 4 - 5 x 1, 6 microns, and they were arranged in a slimy basket. No Chlamydospores could be detected.
  • Phialemonium spec. and Acre- minium strictum to the lowest risk group 1. include organisms that are characterized by experimentally proven and long-term safe use, ie no danger to humans, animals or the environment.
  • AW02 The microorganism Phialemonium spec. or Acremonium strictum AW02 grew with white substrate and aerial mycelium on full medium plates with glucose as the carbon source (FIG. 1). Under the microscope, AW02 showed filamentous cells with conspicuous droplets. These could be stained with the fluorescent dye Nile Red (FIG. 2). This indicates intracellular storage of triglycerides. AW02 was able to biomass form in submerged culture on mineral salt medium. The best growth was measured with soybean oil, the least with glycerin as the carbon source. A maximum of 3 g / l biomass was obtained from 5 g / l substrate (see Table 1).
  • Phialemonium spec. or Acremonium strictum isolate AW02 Shown is the growth of Phialemonium spec. or Acremonium strictum isolate AW02 on minimal medium with 5 g / l of different carbon sources. Shake flasks with a volume of 500 ml were inoculated with 50 ml of medium with 10 7 spores each. After three to five days at 34 ° C and 120 rpm, the mycelium was harvested by centrifugation or filtration and lyophilized. Carbon source dry weight [g / l]
  • the isolated fungus showed a massive sporulation in submerged culture. 10 8 spores per ml were formed in 500 ml shake flask culture (see Table 2). The spores appeared unicellular in the phase contrast microscope, usually showed two conspicuous intracellular particles and were about 10 microns in size (Figure 3).
  • the fungus was incubated in sterile minimal medium with 20 g / l glucose and a pH 3 start at 34 ° C. After four days incubation of 100 ml in a 500 ml baffled flask, the mycelium was completely disintegrated into spores. The spores were storable with 30% glycerol at -2O 0 C. These spores were inoculated into a 200 liter vessel containing 100 liters of minimal medium. Neither the vessel nor the medium were sterilized.
  • Minimal medium mixed with 5 g / l soybean oil, pH 3, room temperature, once a day with a drill and concrete mixer
  • lipase activity can be measured by the standard literature lipase assay (Okeke and Okolo, supra)
  • a new continuous lipase assay was established according to Kabaoglu with a constant pH of 8.0 in which deoxycholate was substituted for Triton X-100 .
  • the reliability of the assay was checked using four commercially available lipases (see Table 3) and good agreement was obtained with the manufacturer's instructions.
  • Substrate mixture A / B (1: 9, v / v) was prepared by emulsifying solution A (30 mg p-nitrophenyl palmitate dissolved in 10 ml isopropanol) in solution B (0.8 g Triton X-100, 0.1 g Gum arabic in 100 ml of 100 mM Tris-HCl pH 8.0). 900 .mu.l of the mixture A / B were incubated with 100 .mu.l of enzyme solution, and the activity was over a period of 240 sec.
  • lipase activity was determined for the culture supernatant and in the mechanically homogenized mycelium. In the mycelium there was a 100-fold increased activity compared to culture supernatant. This means that the lipase was cell-associated.
  • the culture device is shown schematically in FIG.
  • On display is a culture vessel with a capacity of at least 100 I.
  • the culture vessel is equipped with mineral salt solution in deionized water.
  • Shown is also a device for introducing compressed air, which passes through a sterile air filter in the frit of the vessel. This allowed the culture to be optimally ventilated.
  • a first approach to optimize culture conditions began with a lipase activity of 5,700 U / L in the culture homogenate after 7 days growth to 10 g / L soybean oil. Reduction of the soybean oil to 5 g / L showed an increase in activity to 6,200 U / L, and a doubling of the salt concentration showed an increase in activity to ⁇ 9,000 U / L (see Table 6). No or very reduced growth was observed when tap water was used instead of distilled water. In tap water no lipase activity could be detected. Table 6
  • Phialemonium spec. or Acremonium stûct ⁇ m AW02 as a biofilm on the surface of plastic segments, which were hung in a barrel, settles, if not stirred, but only the rising air bubbles for convection. Over 99% of the enzyme activity was measured in the homogenized biofilm. The absence of stirring saves the filtration or centrifugation for the cell harvest.
  • the aim of this experiment was to increase the lipase activity of Phialemonium spec. or Acremonium strictum (strain AW02) in a 100 L culture.
  • the questions should be examined as to whether the lipase is cell bound or freely diffused, if the lipase is cell bound, if it can be removed and what temperature tolerance the lipase has.
  • FIG. 6 shows a vessel measuring 84 cm ⁇ 42 cm. It has a capacity of at least 100 I. Also shown is a device for the introduction of sterile air, with which the cell culture can be aerated.
  • One of the vessels was cut vertically into six segments. Three of these segments were hung in the first vessel over the edge. Through these segments, the biofilm forming on the surface could simply be lifted out of the medium and scraped off the surface.
  • the medium was inoculated with a spore suspension (100 ml, 10 10 spores).
  • Phialemonium spec. or Acremonium strictum AW02 grew under aerobic conditions in 100 l of minimal medium with 1, 5 g / l KNO 3 , 0.5 g / l MgSO 4 ⁇ 7H 2 O, 1, 5 g / l KH 2 PO 4 , 0.5 mg / l FeSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.5 mg / l ZnSO 4 ⁇ 7H 2 O, 0.05 mg / l CuSO 4 ⁇ 5H 2 O and 0.02 mg / l MnCl 2 .
  • the lipase showed a wide temperature tolerance.
  • the biofilm was homogenized by means of French Press Passage and this homogenate was used directly for the stability test. This was followed by incubation at a temperature of 30 to 65 ° C, each in 5-step temperature for 60 min. The material was freeze-dried and a lipase activity test was performed. The stability of the 'lipase activity was one hour preincubation tion at temperatures between 30 0 C and 65 0 C and subsequent activity test. Between 3O 0 C and 45 0 C, no significant loss of activity was found. After one hour at 50 ° C, the residual activity dropped to 50%.
  • Phialemonium spec. or Acremonium strictum can be effectively attracted as a biofilm in a vessel under non-sterile conditions. 99.4% of the lipase activity was bound to the biofilm. Weak lipase release of activity after mechanical shearing or glucanase treatment was observed. The lipase activity was after storage at -20 0 C and after incubation for 60 min stable at 40 ° C.

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte des Bereitstellens eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß; des Beimpfens des Minimalmediums mit einem Pilz; des Inkubierens des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1-4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie des Gewinnens des Enzyms, wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden. Ferner betrifft die Erfindung ein Enzym, das durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbar ist.

Description

Mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Enzymen
Gebiet der Erfindung Die Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms sowie ein Enzym, das durch dieses Verfahren gewonnnen werden kann.
Hintergrund der Erfindung
Heute sind etwa 5.000 chemische Reaktionen, die durch Enzyme katalysiert wer- den, bekannt. Für jede dieser Reaktionen sind mehrere, teilweise über 100 verschiedene Enzyme mit unterschiedlichen Eigenschaften beschrieben worden. Zudem macht die Gentechnik ein "Protein Engineering" möglich. Trotzdem werden derzeit industriell nur etwa 10 Enzyme, z.B. die Glucose Isomerase, eingesetzt. Es gibt Beispiele für chemische Prozesse, die durch enzymatische Verfahren abge- löst werden könnten, d.h. die Funktionstüchtigkeit wurde im Labor nachgewiesen. Trotzdem erfolgt keine Umsetzung in die Produktion, weil der Preis für das Enzym zu hoch ist. Dies gilt z.B. für die Bleichung bei der Papierherstellung, die mit Lac- casen möglich ist, oder für die Umesterung von Polyurethan-Vorstufen, die mit Lipasen erfolgen kann.
Mit Ausnahme der molekularbiologischen Forschung oder der medizinischen Diagnostik, in der mehr als 100 Enzyme, z.B. Restriktionsendonukleasen, eingesetzt werden, spielt der hohe Preis für die Herstellung und Gewinnung von Enzymen häufig die entscheidende Rolle.
Durch die heterologe Expression von Genen in etablierten Wirten, z.B. in Bakterien wie Escherichia coli oder Bacillus spec, aber auch in Pilzen, z.B. Pichia pasto- ris, kann fast jedes Enzym mit hoher Produktivität, d.h. einem hohen Anteil aktivem Protein pro Biomasse, hergestellt werden. Die Kosten für die Herstellung sind jedoch hoch, weil alle bisher bekannten Wirte in zuvor sterilisierten Anlagen und Medien kultiviert werden müssen. Die dazu nötige Steriltechnik ist ein Hauptnachteil der meisten herkömmlichen mikrobiellen Verfahren. Manche Verfahren kamen nie zum Einsatz, weil Kontaminationen nicht beherrschbar waren. Ein Beispiel dafür ist die Ethanolproduktion mit Zymomonas mobilis.
Steriltechnik bedeutet nicht nur hohe Investitionskosten für Autoklaven und Dampferzeuger sowie temperatur- und druckstabile Behältnisse, Leitungen und Ventile aus Stahl, sondern auch hohe Betriebskosten in Form von Energie sowie Zeit für das Aufheizen und das Abkühlen.
Wegen dieser hohen Kosten müssen die Raum-Zeit-Ausbeuten durch hohe Wachstumsraten und hohe Endzelldichten maximiert werden. Diese Anforderung zieht eine Kette von Konsequenzen nach sich, die wiederum hohe Kosten verursachen. So werden zunächst komplexe Medien mit teuren Bestandteilen, z.B. Hefeextrakt, eingesetzt. Zum optimalen Gasaustausch müssen weiterhin Rührer bei hoher Geschwindigkeit betrieben werden. Das kostet doppelt Energie, denn es muss ferner gegengekühlt werden. Die komplexen Medien erlauben es zudem nicht, bei rekombinanten Verfahren Komplementationsmarker, z.B. für Aminosäu- reauxotrophien, einzusetzen. Stattdessen werden, z.B. für die Produktion rekom- binanter Enzyme mit Bacillυs spec, dominante Marker, d.h. Resistenzgene für Antibiotika eingesetzt. Letztere stellen einen weiteren Kostenfaktor dar. Dabei ist nachteilig, dass der Einsatz von Antibiotika Einschränkungen, z.B. beim Einsatz der Produkte für die Ernährung, verursacht.
Der vorliegenden Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms bereitzustellen, das die oben zusammengefassten Nachteile überwindet. Während herkömmliche Verfahren Investitionskosten in zweistelliger Millionenhöhe erfordern, liegen die Kosten zur Durchführung der Erfindung in der Größenordnung eines landwirtschaftlichen Nutzfahrzeugs, wie z.B. eines Traktors. Dadurch wird ein neuer selbständiger Beruf, der "Enzymwirt", möglich.
Zusammenfassung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß, b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz, c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1-4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie d) Gewinnen des Enzyms wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
Ferner umfasst die Erfindung ein Enzym, das durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbar ist.
Kurzbeschreibung der Figuren Figur 1 zeigt das Wachstum des Phialemonium spec. bzw. des Acremonium stric- tum Isolats AW02 auf einer Agarplatte mit einem Vollmedium aus 10 g/l Glucose und Hefeextrakt, das mit 20 g/l Agar verfestigt wurde. Links ist eine ganze A- garplatte gezeigt, rechts eine Ausschnittvergrößerung des Luftmyzels.
Figur 2 zeigt eine fluoreszenzmikroskopische Aufnahme des Phialemonium spec. bzw. des Acremonium strictum Isolats AW02 nach Anfärbung mit Nile Red. Der hydrophobe Fluoreszenzfarbstoff lagert sich bevorzugt in Lipidtröpfchen ein, die den Zellen möglicherweise als Speicherstoff dienen. Ein großes Tröpfchen weist einen Durchmesser von etwa 5 μm auf. Figur 3 zeigt ein Phasenkontrastbild der Kulturbrühe nach 3 Tagen Wachstum bei 34CC und 120 rpm in Minimalmedium mit 50 g/l Glucose. Zu sehen sind überwiegend Sporen.
Figur 4 zeigt die Lipaseaktivität in einer Kultivierung in einem großen offenen Gefäß. Nach Durchmischung der Kultur mit einem Betonrührer wurde eine Probe entnommen und durch eine French-Press Passage homogenisiert. Das Homoge- nat wurde in einem kontinuierlichen kolorimetrischen Lipasetest eingesetzt. Dabei wurde die Hydrolyse von para-Nitrophenylpalmitat bei 405 nm gemessen. Eine Einheit (U) entsprach 1 μmol freigesetztem para-Nitrophenol pro Minute.
Figur 5 zeigt ein einfaches Kultivierungssystem für einen Lipaseproduzenten. Es wurden 100 I wie in Tabelle 4 beschrieben mit 20 g/l Sojabohnenöl hergestellt. Die Kultur wurde durch verdichtete Luft durch eine Fritte gemischt und bei 21 CC gehal- ten. Über einen Zeitraum von 14 Tagen war keine Kontamination mit anderen Mikroorganismen mikroskopisch erkennbar. Jedoch wurde nur langsames Wachstum beobachtet. Nach Ende des Versuchs wurde eine schlammartige Myzelmasse am Boden des Gefäßes festgestellt.
Figur 6 zeigt ein Gefäß in Form eines großen Gefäßes mit einem Fassungsvermögen von 100 I Kulturmedium. Eine Vorrichtung zum Einleiten von steril filtrierter Luft ist vorgesehen. Ein zweites identisches Gefäß wurde vertikal in sechs Segmente zerschnitten. Diese Segmente dienten der erleichterten Ernte des Biofilms. Nach Animpfen des Mediums mit einer Sporensuspension besiedelte das wach- sende Myzel die Oberfläche der Segmente und bildete ein Biofilm. Ca. 90 % der Lipaseaktivität konnten durch Entnahme, Abtropfen und Abkratzen der Segmente geerntet werden.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung Die vorliegende Erfindung betrifft zunächst ein Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß, b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz, c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1-4, für einen Zeit- räum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie d) Gewinnen des Enzyms wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
Wesentlich für die Erfindung ist die Isolierung eines Mikroorganismus, der sich auf nicht sterilisiertem Medium zuverlässig durchsetzt. Als Selektivbedingungen wurden konkrete Konditionen eingestellt. Zunächst wurde ein Minimalmedium mit Nitrat als Stickstoffquelle verwendet. Weiterhin wurde eine Kohlenstoffquelle verwendet, wobei sich emulgiertes pflanzliches Fett als einzige Kohlenstoff- und Ener- giequelle als vorteilhaft erwiesen hat. Ferner wurde der Ausgangs pH-Wert auf einen sauren Bereich von 1 bis 4 eingestellt, wobei ein pH-Wert von 3 besonders geeignet war. Eine Inkubationstemperatur von 35°C hat sich ebenfalls als vorteilhaft erwiesen.
In Schritt c) kann sich der Pilz zunächst sichtbar an der Gefäßwand als Biofilm abscheiden. Wenn der Pilz in einem Schüttel- oder Schikanekolben in Suspensionskultur angezogen wird, trübt sich das Minimalmedium durch das Wachstum des Pilzes. Diese optische, mit bloßem Auge sichtbare Trübung des Mediums ist ebenfalls ein Zeichen, dass der Pilz ausreichend lange angezogen wurde.
In Schritt d) kann das Enzym aus dem Biofilm oder aus dem Minimalmedium (Kulturbrühe) gewonnen werden.
Mit einem derart isolierten Mikroorganismus wurde das denkbar einfachste Sub- mersverfahren etabliert, erprobt und für die Herstellung von Lipase verwendet. In einer vorteilhaften Ausführungsform ist das Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lipase, Amylase und Protease. Diese gehören zu der Klasse der extrazellulären Hydrolasen. Lipasen spalten Triglyzeride in Fettsäuren und Glyzerin, welche dann vom Mikroorganismus in die Zelle aufgenommen werden können. Amylasen spalten alpha-1 ,4 verknüpfte Glucoseketten. So genannte Endogluca- nasen setzen Oligomere frei, während Exoglucanasen in der Regel Maltose abspalten. Auch hier dient der Abbau dazu, dem Mikroorganismus die Aufnahme der Abbauprodukte in den Energie- und Aufbaustoffwechsel zu ermöglichen. Die Protease hydrolysiert schließlich Proteine in Peptide, für die es in Pilzen hocheffizien- te Importer gibt. Intrazellulär erfolgt dann die Zerlegung in Aminosäuren und je nach Bedarf der Abbau zu Ketosäuren oder die Aktivierung für die Proteinbio- sythese.
Es ist weiterhin vorteilhaft für die Herstellung von Lipase als Kohlenstoffquelle ein Fett, insbesondere pflanzliche Triglyzeride, wie beispielsweise Sojaöl, Sonnenblumenöl oder Rapsöl zu verwenden. Nur wenige Organismen können diese als einzige Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Sojaöl hat den besonderen Vorteil, dass nur wenige Pilze dieses Fett schnell und wirksam als einzige Kohlenstoffquelle verwerten können. Damit wirkt das Sojaöl auch als Selektionsmittel, um das Wachstum von anderen, ungewünschten Mikroorganismen zu begrenzen. Für die Herstellung von Amylase eignet sich als Kohlenstoffquelle insbesondere Stärke. Um ein Proteaseenzym zu bilden kann insbesondere Gelatine verwendet werden.
Es hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, als Stickstoffquelle Nitrat zu ver- wenden. Nitrat ist kostengünstig und schließt Mikroorganismen als Kontaminanten des Verfahrens aus, die Nitrat nicht reduzieren können.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser ca. 0,5 bis 10 g KNO3 ca. 0,5 bis 5 g KH2PO4 ca. 0,2 bis 0,75 g MgSO4 x 7H2O ca. 0,2 bis 0,75 g FeSO4 x 7H2O ca. 0,2 bis 0,75 g ZnSO4 x 5H2O ca. 0,01 bis 0,05 g CuSO4 x 5H2O ca. 0,01 bis 0,05 g MnCI2 x 4H2O und ca. 5 bis 100 ml Sojaöl.
Am meisten bevorzugt umfasst das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser ca. 1 ,5 g KNO3 ca. 1 ,5 g KH2PO4 ca. 0,5 g MgSO4 x 7H2O ca. 0,5 g FeSO4 x 7H2O ca. 0,5 g ZnSO4 x 5H2O ca. 0,02 g CuSO4 x 5H2O ca. 0,02 g MnCI2 x 4H2O und ca. 18 ml Sojaöl.
Um über das Wasser keine, das Wachstum hemmenden Substanzen einzutragen, muss entionisiertes Wasser verwendet werden.
Es ist weiterhin bevorzugt, den Pilz für die Enzymproduktion aus der Gruppe bestehend aus Deuteromyceten und Anamorphen der Ascomyceten auszuwählen.
Als besonders geeignet erscheinen die Pilze Phialemonium spec, Acremonium strictum, Aspergillus spec, Botrytis cinerea oder Trichoderma spec.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird bei saurem pH-Wert zwischen ca. pH 1 und pH 4 durchgeführt. Ein Ausgangs pH-Wert von 3 hat sich für die Herstellung von Lipase auf der Basis von Sojaöl als besonders vorteilhaft erwiesen. Wenn insbesondere der Pilz Aspergillus nidulans zur Herstellung von Lipase verwendet wird, könnte sich ein noch niedrigerer pH-Wert von ca. 2,5 als besonders geeignet erweisen.
Weil der Pilz in einem Minimalmedium auf Mineralsalzbasis und einer erst zu hydrolysierenden Kohlenstoffquelle gezüchtet wird, hat sich gezeigt, dass die Inkubationszeit bis zu 14 Tage dauern kann.
Die Enzymproduktion kann deutlich gesteigert werden wenn das erfindungsgemäße Verfahren bei einer Temperatur zwischen ca. 200C und ca. 45°C, vorzugsweise bei 200C bis ca. 35°C, weiter bevorzugt bei ca. 21 °C durchgeführt wird. Besonders bevorzugt ist ein Temperaturbereich über Raumtemperatur, am besten bei ca. 35°C.
Nachdem die Enzymproduktion durch die Pilze bevorzugt im aeroben Milieu statt- findet, ist es in einer weiteren Ausführungsform bevorzugt das Minimalmedium zu belüften. Besonders geeignet hierfür ist die Belüftung über einen Sterilfilter und eine Fritte.
Obwohl das Verfahren weitestgehend bei nicht sterilen Bedingungen und damit extrem kostengünstig durchgeführt werden kann, hat es sich als vorteilhaft erwiesen für die Inokulumkultur, mit der das Minimalmedium beimpft wird, sterile Bedingungen zu verwenden. Damit wird sichergestellt, dass das Minimalmedium mit einer reinen Pilzkultur beimpft wird, die nicht durch Bakterien oder andere unerwünschte Mikroorganismen kontaminiert ist.
Um die Gewinnung des Enzyms aus dem erfindungsgemäßen Verfahren zu vereinfachen, werden in den Kessel bzw. das große Gefäß leicht zu entnehmende und leicht zu reinigende Segmente mit großer Oberfläche eingeführt, auf denen der Pilz als Biofilm aufwächst und dann leicht aus der Kultur geerntet und weiter verarbeitet werden kann. Bevorzugt werden deshalb solche Pilze eingesetzt, bei denen die gewünschten Hydrolasen nicht frei diffundierbar, sondern Zell-assoziiert vorliegen.
Das Volumen des Minimalmediums beträgt vorzugsweise ca. 1 Liter bis ca. 3.500 m3. Geeignet ist ein Volumen von ca. 100 Liter. Als besonders geeignet hat sich ein Volumen von ca. 350 Liter herausgestellt. Im einfachsten Fall kann als Kulturgefäß ein großes Gefäß bzw. ein Kessel oder eine Tonne verwendet werden, das mit einer Sporensuspension beimpft wird.
Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist ein Enzym, vorzugsweise eine Lipa- se, Amylase oder Protease, die durch das erfindungsgemäße Verfahren herstellbar ist.
Bevorzugte Ausführungsformen und detaillierte Beispiele Die folgenden Beispiele stellen die Erfindung näher dar. Sie sind exemplarisch angegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht beschränken.
Beispiel 1
Isolierung eines geeigneten Mikroorganismus Aus verschiedenen Komposthaufen wurden Proben auf Agarplatten mit folgender Medienzusammensetzung ausgestrichen.
KNO3 1 ,5 g
KH2PO4 1 ,5 g MgSO4 x 7H2O 0,5 g
FeSO4 x 7H2O 0,5 mg
ZnSO4 x 7H2O 0,5 mg
CuSO4 x 5H2O 0,02 mg MnCI2 x 4 H2O 0,02 mg Sojaöl 18 ml
Agar 20 g
H2O, deionisiert ad 1 Liter pH-Wert: 3
Das Sojaöl wurde vor dem Gießen der Platten emulgiert. Anfangs wurde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde die Temperatur schrittweise bis 35°C erhöht. Beim Überimpfen auf neue Platten wurden makroskopisch verschie- dene Kolonien getrennt. Der auf diese Weise isolierte Mikroorganismus wurde als AW02 bezeichnet und von der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig als Acremonium strictum bestimmt. Eine zweite Analyse hat ergeben, dass es sich um Phialemonium spec. handelt.
Das Myzel von Acremonium strictum wurde als sehr zart beschrieben. Der Hyphendurchmesser betrug etwa 1 - 1 ,5 μm. Die Konidienträger waren kurz und selten. Die Phialiden waren einfach, nicht chromophil, seitlich an undifferenzierten Hyphen angeordnet, bis zu 25 μm lang und kamen meist direkt am Luftmyzel vor. Die Konidien waren zylindrisch/ellipsoid mit einer Größe von ca. 4 - 5 x 1 ,6 μm, und sie waren in einem schleimigen Körbchen angeordnet. Es konnten keine Chlamydosporen nachgewiesen werden.
Acremonium strictum wurde in der wissenschaftlichen Literatur als Lipaseprodu- zent beschrieben. Okeke und Okolo, (1990), Biotechnology Letters 12:747-750 verwendeten jedoch zur Anzucht ein Vollmedium mit 10 g/l Pepton. In dieser Veröffentlichung wird auch die Durchführung eines Standard Lipase Assays beschrieben. Die Lipaseaktivität konnte durch ein Titrationsverfahren gemessen werden. Das Assay Gemisch enthielt 5 ml einer Enzymlösung und 5 ml Citrat/Na2HPO4 Puffer (pH 7,5) mit 0,05 M CaCI2 und 3 % (v/v) Tween 80. Die Reaktion wurde un- ter Rühren bei 350C für 30 min durchgeführt. Sie wurde durch die Zugabe von 10 ml Aceton/Ethanol Gemisch (1 :1 , v/v) beendet. Die Menge der freigesetzten Fett- säuren wurde mit 0,05 M KOH unter Verwendung von 0,3 ml 1 % Phenolphthalein Lösung als einem Indikator titriert. Eine für 3 min aufgekochte Enzymlösung wurde als eine Kontrolle verwendet. Mit diesem Test konnten z.B. nach Wachstum auf Xylose über 400 U/ml Lipaseaktivität gemessen werden.
Laut Gentechnik-Sicherheitsverordnung gehören Phialemonium spec. und Acre- monium strictum zur geringsten Risikogruppe 1. Dazu zählen Organismen, die sich durch experimentell erwiesene und langfristig sichere Anwendung auszeichnen, also keine Gefahr für Mensch, Tier oder für die Umwelt darstellen.
Der Mikroorganismus Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum AW02 wuchs mit weißem Substrat- und Luftmyzel auf Vollmediumplatten mit Glucose als Kohlenstoffquelle (Figur 1 ). Unter dem Mikroskop zeigte AW02 filamentöse Zellen mit auffälligen Tröpfchen. Diese ließen sich mit dem Fluoreszenzfarbstoff Nile Red anfärben (Figur 2). Dies deutet auf eine intrazelluläre Speicherung von Triglyceriden hin. AW02 war in der Lage in Submerskultur auf Mineralsalzmedium Biomasse zu bilden. Das beste Wachstum wurde mit Sojaöl, das Geringste mit Glycerin als Kohlenstoffquelle gemessen. Maximal wurden aus 5 g/l Substrat 3 g/l Biomasse gewonnen (vgl. Tabelle 1 ).
Tabelle 1
Dargestellt ist das Wachstum von Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum Isolat AW02 auf Minimalmedium mit je 5 g/l verschiedener Kohlenstoffquellen. Dazu wurden Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml mit 50 ml Medium mit je 107 Sporen beimpft. Nach drei bis fünf Tagen bei 34°C und 120 rpm wurde das Myzel durch Zentrifugation oder Filtration geerntet und lyophilisiert. Kohlenstoffquelle Trockengewicht [g/l]
Messwerte Mittelwerte ± Standardabweichung
Glycerin 0,130
0,104 0,1 ± 0,0
0,094
Glucose 0,996
1 ,238 1 ,3 ± 0,3
1 ,642
Saccharose 1 ,342
0,564 1 ,6 ± 0,9
2,830
Sojaöl 0,152
2,594 1 ,9 ± 1 ,3
3,096
Der isolierte Pilz zeigte in Submerskultur eine massive Sporulation. In 500 ml Schüttelkolbenkultur wurden 108 Sporen pro ml gebildet (vgl. Tabelle 2). Die Sporen erschienen im Phasenkontrastmikroskop einzellig, zeigten meist zwei auffällige intrazelluläre Partikel und waren etwa 10 μm groß (Figur 3).
Tabelle 2
Dargestellt ist die Sporulation von Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum Isolat AW02 auf Minimalmedium bei verschiedenen Glucosekonzentrationen. In sechs- 500 ml Schikanekolben, wurden je 50 ml Medium beimpft und drei Tage bei 34°C inkubiert. Die Sporen wurden in der Thoma-Kammer gezählt. Glucosekon- Sporen [ml] zentration Einzelwerte Mittelwerte Standardabweichung
10 g/l 4.60E+08 3.30E+08 3.95E+08 6.50E+07
20 g/l 3.40E+08 5.10E+08 4.25E+08 8.50E+07
50 g/l 7.50E+08 7.70E+08 7.60E+08 1 ,00E+07
Beispiel 2:
Etablierung eines einfachen Verfahrens zur Herstellung einer Lipase
Zur Herstellung eines Inokulums wurde der Pilz in sterilem Minimalmedium mit 20 g/l Glucose und einem Start pH 3 bei 340C inkubiert. Nach vier Tagen Inkubati- on von 100 ml in einem 500 ml Kolben mit Schikanen war das Myzel komplett zu Sporen zerfallen. Die Sporen waren mit 30 % Glycerin bei -2O0C lagerfähig. Mit diesen Sporen wurde ein 200 Liter Gefäß mit 100 Liter Minimalmedium beimpft. Weder das Gefäß noch das Medium wurden sterilisiert.
Verlauf:
Tag 1 Animpfen mit 100 ml aussporulierter Vorkultur
Minimalmedium mit 5 g/l Sojaöl, pH 3, Raumtemperatur, 1 x am Tag mit Bohrmaschine und Betonrührer durchmischt
Begasung 14 l/min Druckluft über einen 0,2 μm Membranfilter Tag 4 Makroskopisch: sehr geringe Mediumtrübung
Mikroskopisch: vereinzelte Myzelfäden
Tag 5 Makroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar
Mikroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar Tag 6 Makroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, kleine Myzelkugeln
Mikroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar
Tag 7 Makroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag er- kennbar
Mikroskopisch: deutliches Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, Sporenbildung
Tag 8 Makroskopisch: Wachstum im Vergleich zum Vortag erkennbar, Myzel gleichmäßig im ganzen Medium verteilt Mikroskopisch: sehr viele Sporen
Vom vierten Tag an war in mechanisch homogenisierten Proben Lipaseaktivität messbar. Maximal wurde eine Freisetzung von 125 μmol/l/min Nitrophenol aus einem Palmitinsäureester gemessen (Figur 4).
Um die Lokalisation der Lipase-Aktivität zu untersuchen, wurden am achten Tag 40 ml Kulturbrühe zentrifugiert. Im Überstand waren 24 U/l messbar. Das Pellet wurde in 5 ml Wasser resuspendiert und homogenisiert. Darin wurden 700 U/l Lipase-Aktivität gemessen. Weil dadurch das Volumen auf ein Achtel reduziert wur- de, bedeutet dies, dass der überwiegende Teil der Aktivität zeilassoziiert vorlag.
Von 500 ml Öl, die für 100 I Medium eingesetzt worden waren, konnten nach Abbruch am achten Tag noch 460 ml als leichtere Phase von der Kulturbrühenoberfläche abgeschöpft werden.
Beispiel 3: Einfluss des Mediums auf die Lipaseproduktion
Es konnte gezeigt werden, dass sich Änderungen der Kohlenstoff- und Energiequelle oder der Salzkonzentrationen deutlich auf Wachstum und die Produktion von Lipaseaktivität auswirken. Auf den Einsatz von entionisiertem Wasser konnte nicht verzichtet werden. Mit Leitungswasser wuchs der Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum praktisch nicht. Der Einsatz von Glucose führte nur zu ganz geringen Lipaseaktivitäten.
Obwohl die Lipaseaktivität nach dem Standard Literatur Lipase Assay (Okeke und Okolo, supra) gemessen werden kann, wurde ein neuer kontinuierlicher Lipase Assay gemäß Kabaoglu mit einem konstanten pH-Wert von 8,0 etabliert, in dem Desoxycholat gegen Triton X-100 ausgetauscht war. Die Verlässlichkeit des As- says wurde anhand von vier kommerziell erhältlichen Lipasen (vgl. Tabelle 3) überprüft, und es wurde eine gute Übereinstimmung mit den Angaben des Herstellers erhalten.
Tabelle 3
Überprüfung des Assays durch die Analyse von vier kommerziell erhältlichen Lipa- sen. Der Assay wurde mit 100 μl reiner Enzymlösung durchgeführt.
Hersteller Bezeichnung angegebene Aktivität nachgewiesene
[U/ml] Aktivität [U/ml]
Novostab K 311305i 12.000 12.928
Novarenko K 311307ik 20.000 18.808
Novarenko K 311307Ϊ 5.000 5.885
Saulich - 1 ,140* * in [U/mg]
Ferner wurden der Einfluss von Sojabohnenöl oder Glucose in Minimalmedium auf die extrazelluläre Lipaseaktivität untersucht. Die höchste Aktivität (~ 90 U/l) im Kulturüberstand wurde mit 10 g/l Sojabohnenöl nachgewiesen. Die geringste Aktivität (~ 1 U/l) wurde beim Wachstum auf Glucose gefunden (vgl. Tabelle 4).
Tabelle 4 Lipaseaktivität in Kulturüberständen. Der Stamm AW02 wurde in Minimalmedium mit 1 ,5 g KNO3, 0,5 g MgSO4 x 7H2O, 1 ,5 g KH2PO4, 0,5 mg FeSO4 x 7H2O, 0,5 mg ZnSO4 x 7H2O, 0,02 mg CuSO4 x 5H2O und 0,02 mg MnCI2, gelöst in 1 I destilliertem Wasser, kultiviert. Sojabohnenöl oder Glucose wurden in verschiedenen Konzentrationen als die einzige Kohlenstoffquelle eingesetzt. Das Experiment wurde als Doppelbestimmung in zwei unabhängigen Schüttelkolben durchgeführt. Die Kulturen wurden bei 32°C und 120 rpm inkubiert, und der Assay wurde wie folgt durchgeführt:
Für die Lipasebestimmung wurden 2 ml Probe aus jeder Kultur entnommen, 15 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, und der Überstand wurde für den Assay verwendet. Ein Substratgemisch A/B (1 :9, v/v) wurde durch Emulgieren der Lösung A (30 mg p-Nitrophenylpalmitat, gelöst in 10 ml Isopropanol) in Lösung B (0,8 g Triton X-100, 0,1 g Gummi arabicum in 100 ml 100 mM Tris-HCI pH 8,0) hergestellt. 900 μl des Gemisches A/B wurden mit 100 μl Enzymlösung inkubiert, und die Akti- vität wurde über einen Zeitraum von 240 sek. bei 405 nm und 300C bestimmt. Als Negativkontrolle wurde durch Hitze inaktiviertes Enzym (10 min, 95°C) gemessen. Die Werte, die als "n.n." in der Tabelle angegeben sind, waren nicht nachweisbar. Die Grenze für dieses Messverfahren betrug < 1 U/l.
Aktivität [U/l]
Tag 5 Tag 6 Tag 7 Tag 8 Tag 11
10 g/l Sojabohnenöl 88 14 n.n. 1 n.n. 68 15 n.n. 1 n.n.
20 g/l Sojabohnenöl 5 n.n. n.n. 1 n.n. 9 4 31 n.n. 5
50 g/l Sojabohnenöl 14 10 6 4 2 28 7 n.n. n.n. 5
20 g/l Glucose 1 n.n. n.n. n.n. n.n. 1 n.n. n.n. n.n. n.n.
Nach der Ernte wurde zum Kulturüberstand und im mechanisch homogenisierten Myzel Lipaseaktivität bestimmt. Im Myzel fand sich eine 100-fach erhöhte Aktivität im Vergleich zu Kulturüberstand. Dies bedeutet, dass die Lipase Zell-assoziiert vorlag.
Tabelle 5
Bestimmung der Lipaseaktivität mit homogenisiertem Myzel nach einem Kultivierungszeitraum von 11 Tagen. 15 ml Kulturlösung wurden filtriert, das Myzel wurde geerntet und in 1 ,5 ml Assay Puffer (Lösung B) suspendiert. Das Myzel wurde an- schließend durch eine French Press Passage homogenisiert und 20 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. 100 μl Überstand wurden wie oben beschrieben untersucht. Aktivität [U/I]
KulturFrench Press Kulturbrühe überstand Aufschluss des Myzels (berechnet)
10 g/l Sojabohnenöl n.n.* 838 84 n.n. 995 99
20 g/l Sojabohnenöl n.n. 338 34 5 192 19
* n.n. = nicht nachweisbar
Nach 5 Tagen des Wachstums wurde eine vollständige Transformation des My- zels in Sporen beobachtet nachdem die Glucose verbraucht war. Es wurden mindestens 108 Sporen pro 100 ml gebildet.
Weiterhin wurde eine 100 I Kultur begonnen. Obwohl sie unter nicht sterilen Bedingungen durchgeführt wurde, wurde keine Kontamination mit anderen Mikroor- ganismen beobachtet. Nach 5 Tagen des Wachstums wurden 11 U/l und nach 6 Tagen des Wachstums 7 U/l in dem Kulturüberstand nachgewiesen. Die Kulturvorrichtung ist schematisch in Figur 5 gezeigt. Zu sehen ist ein Kulturgefäß mit einem Fassungsvermögen von mindestens 100 I. Das Kulturgefäß wird mit Mineralsalzlösung in deionisiertem Wasser bestückt. Gezeigt ist ferner eine Vorrichtung zur Ein- leitung von Druckluft, die über einen sterilen Luftfilter in die Fritte des Gefäßes gelangt. So konnte die Kultur optimal belüftet werden.
Ein erster Ansatz, um die Kulturbedingungen zu optimieren, begann bei einer Li- paseaktivität von 5.700 U/l im Kulturhomogenat nach 7 Tagen Wachstum auf 10 g/l Sojabohnenöl. Eine Verringerung des Sojabohnenöls auf 5 g/l zeigte einen Anstieg in der Aktivität auf 6.200 U/l, und eine Verdopplung der Salzkonzentration zeigte einen Anstieg der Aktivität auf ~ 9.000 U/l (vgl. Tabelle 6). Keines oder sehr verringertes Wachstum wurde beobachtet, wenn Leitungswasser anstelle von destilliertem Wasser verwendet wurde. In Leitungswasser konnte keine Lipaseaktivität nachgewiesen werden. Tabelle 6
Bestimmung von Lipaseaktivität in homogenisierter Kultur. Aus zwei verschiedenen Schüttelkolben wurden jeweils 3 ml Kultur entnommen, und das Myzel wurde durch Ultraturrax Behandlung für 1 Minute homogenisiert. 100 μl wurden wie oben beschrieben untersucht.
Aktivität [U/l]
Tag 2 Tag 3 Tag 4 Tag 7
Destilliertes Wasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 1 18 148 5.705 1 x Salz 8 17 143 1.410
Destilliertes Wasser, 5 g/( Sojabohnenöl, 62 275 2.445 6.206 1 x Salz 23 119 1.668 6.286
Destilliertes Wasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 23 8 11 n.n. 2 x Salz 24 118 834 8.958
Leitungswasser, 10 g/l Sojabohnenöl, 8 10 4 11 2 x Salz n.n.* 1 6 3
Leitungswasser, 10g/l Sojabohnenöl, n.n. n.n. 7 n.n. 1 x Salz n.n. n.n. 2 n.n.
* n.n. = nicht nachweisbar
Beispiel 4
Lipaseaktivität im Biofilm
Es konnte ferner gezeigt werden, dass sich Phialemonium spec. bzw. Acremonium stήctυm AW02 als Biofilm an der Oberfläche von Plastiksegmenten, die in ein Ge- faß eingehängt wurden, absetzt, wenn nicht gerührt wird, sondern nur die aufsteigenden Luftblasen für Konvektion sorgen. Über 99 % der Enzymaktivität wurde im homogenisierten Biofilm gemessen. Der Verzicht auf das Rühren erspart die Filtration oder Zentrifugation für die Zellernte. Ziel dieses Versuchs war es, die Lipaseaktivität von Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum (Stamm AW02) in einer 100 I Kultur zu charakterisieren. Insbesondere sollten die Fragen untersucht werden, ob die Lipase zellgebunden ist oder frei diffundiert, falls die Lipase zellgebunden ist, ob sie entfernt werden kann und welche Temperaturtoleranz die Lipase aufweist.
Für diesen Versuch wurden zwei Gefäße (vgl. Figur 6) verwendet. In Figur 6 ist ein Gefäß mit den Maßen 84 cm x 42 cm gezeigt. Es besitzt ein Fassungsvermögen von mindestens 100 I. Gezeigt ist ferner eine Vorrichtung zur Einleitung von steri- ler Luft, mit welcher die Zellkultur belüftet werden kann. Eines der Gefäße wurde vertikal in sechs Segmente zerschnitten. Drei dieser Segmente wurden in das erste Gefäß über den Rand eingehängt. Über diese Segmente konnte der sich auf der Oberfläche bildende Biofilm einfach aus dem Medium herausgehoben und von der Oberfläche abgekratzt werden.
Das Medium wurde mit einer Sporensuspension (100 ml, 1010 Sporen) inokuliert. Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum AW02 wuchs unter aeroben Bedingungen in 100 I Minimalmedium mit 1 ,5 g/l KNO3, 0,5 g/l MgSO4 x 7H2O, 1 ,5 g/l KH2PO4, 0,5 mg/l FeSO4 x 7H2O, 0,5 mg/l ZnSO4 x 7H2O, 0,05 mg/l CuSO4 x 5H2O und 0,02 mg/l MnCI2.
Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum AW02 wuchs als ein weißer Biofilm auf der Oberfläche der Segmente des Gefäßes. Die Hyphen, die in den Biofilm eingebettet sind, waren nach einer Anfärbung mit Kongorot sichtbar.
Nach dem Wachstum wurde der Biofilm geerntet. Nach Suspension und Zentrifu- gation wurde sowohl mit dem Überstand als auch mit dem Pellet, welches resuspendiert und per French Press homogenisiert wurde, ein Lipase Aktivitätstest durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass im Überstand nahezu keine Lipaseak- tivität nachweisbar war, wohingegen eine gegenüber dem Überstand ca. 40-fach gesteigerte Lipaseaktivität in der Suspension nach der French Press nachweisbar war. Dies zeigte, dass die Lipase an dem Biofilm bzw. zellgebunden ist. Zur Bestimmung der Verteilung der Lipaseaktivität in dem Biofilm und der Kulturflüssigkeit wurde 1/6 (23,7 g) des Biofilms aus dem 100 I Gefäß geerntet. Davon wurden 1 ,5 g resuspendiert, durch eine French Press Passage homogenisiert und darin eine Lipaseaktivität von 280 U/l gemessen. Ferner wurden 22,2 g lyophilisiert, was zu einem Trockengewicht von 3,2 g führte. Hiervon wurden 0,2 g resuspendiert, was zu einer Lipaseaktivität von 920 U/l führte. Parallel wurden 200 ml Kulturmedium aus dem 100 I Gefäß entnommen, auf 20 ml durch Ultrafiltration konzentriert und einem Lipase Assay unterzogen. Dieser Lipase Aktivitätstest führte lediglich zu 2 U/l. Es konnte auch gezeigt werden, dass die Ultrafiltration nur zu einem schwachen Anstieg in der Aktivität des Kulturmediums führte, was anzeigte, dass die Lipase nur geringfügig freigesetzt wird.
Zur Bestimmung der schwachen Freisetzung der Lipaseaktivität aus dem Biofilm wurde eine Behandlung mit wiederholtem Scheren oder Glucanase Behandlung verwendet. Ein Teil des Biofilms wurde mit ß-1 ,3-Glucanasegemisch (Glucanex) für 60 min bei 32°C inkubiert. Der Versuch die Matrix des Biofilms und/oder die Zellwand enzymatisch zu degradieren zeigte eine schwache Freisetzung der Lipaseaktivität in den Überstand. Ein anderer Teil des Biofilms wurde resuspendiert und mit einem Ultraturrax für 1 min, 2 min und weitere 10 min behandelt. Nach jeder Behandlung wurden die Suspension und der Überstand hinsichtlich Lipaseaktivität gemessen. Die Lipaseaktivität wurde nur geringfügig aus dem Überstand freigesetzt. Aufgrund des Aktivitätsverlustes vermuten die Erfinder, dass die Biofilm gebundene Lipase durch die Ultraturrax Behandlung zerstört wird.
Femer wurde nachgewiesen, dass die Lipase eine breiteTemperaturtoleranz zeigte. Der Biofilm wurde mittels French Press Passage homogenisiert und dieses Homogenisat direkt für den Stabilitätstest engesetzt. Es folgte eine Inkubation bei einer Temperatur von 30 bis 65°C, jeweils in 5er Temperaturschritten für 60 min. Das Material wurde gefriergetrocknet, und es wurde ein Lipase Aktivitätstest durchgeführt. Die Stabilität der' Lipaseaktivität wurde durch eine Stunde Vorinkuba- tion bei Temperaturen zwischen 300C und 650C und anschließenden Aktivitätstest gemessen. Zwischen 3O0C und 450C wurde kein signifikanter Aktivitätsverlust festgestellt. Nach einer Stunde bei 50°C fiel die Restaktivität auf 50 %.
Zusammenfassend konnte deshalb festgestellt werden, dass Phialemonium spec. bzw. Acremonium strictum wirksam als ein Biofilm in einem Gefäß unter nicht sterilen Bedingungen angezogen werden kann. 99,4 % der Lipaseaktivität war an den Biofilm gebunden. Es wurde eine schwache Lipase Aktivitätsfreisetzung nach mechanischem Scheren oder Glucanase Behandlung beobachtet. Die Lipaseaktivität war nach Lagerung bei -200C als auch nach Inkubation für 60 min bei 40°C stabil.
Abschließend sei angemerkt, dass sämtlichen Merkmalen, die in den Anmeldungsunterlagen und insbesondere in den abhängigen Ansprüchen genannt sind, trotz dem vorgenommenen formalen Rückbezug auf einen oder mehrere bestimm- te Ansprüche, auch einzeln oder in beliebiger Kombination eigenständiger Schutz zukommen soll.
Referenzliste
Okeke und Okolo, (1990), „The Effect of Cultural Conditions on the Production of Lipase by Acremonium strictum", Biotechnology Letters 12:747-750
Kabaoglu F (2005) Studien zur Optimierung der rekombinanten Genexpression in der methylotrophen Hefe Pichia pastoris, Dissertation, Universität Konstanz, Fachbereich Biologie.

Claims

Patentansprüche
1. Submersverfahren zur Herstellung eines Enzyms, umfassend die Schritte: a) Bereitstellen eines Minimalmediums, das entionisiertes Wasser, Mineralsalze und eine organische Kohlenstoffquelle aufweist, in einem Gefäß, b) Beimpfen des Minimalmediums mit einem Pilz, c) Inkubieren des Minimalmediums bei einem pH-Wert von 1 -4, für einen Zeitraum, der ausreichend ist, damit der Pilz in dem Minimalmedium optisch sichtbar ist, sowie d) Gewinnen des Enzyms wobei das Minimalmedium und das Gefäß nicht sterilisiert werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei das Enzym ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lipase, Amylase und Protease.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kohlenstoffquelle ein Fett, Polysaccharide oder Proteine ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Fett vorzugsweise ein pflanzliches Triglyzerid, weiter bevorzugt Sojaöl ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Stickstoffquelle Nitrat ist.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mini- malmedium, bezogen auf einen Liter Wasser ca. 0,5 bis 10 g KNO3 ca. 0,5 bis 5 g KH2PO4 ca. 0,2 bis 0,75 g MgSO4 x 7H2O ca. 0,2 bis 0,75 g FeSO4 x 7H2O ca. 0,2 bis 0,75 g ZnSO4 x 5H2O ca. 0,01 bis 0,05 g CuSO4 x 5H2O ca. 0,01 bis 0,05 g MnCI2 x 4H2O und ca. 5 bis 100 ml Sojaöl enthält.
7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Minimalmedium, bezogen auf einen Liter Wasser ca. 1 ,5 g KNO3 ca. 1 ,5 g KH2PO4 ca. 0,5 g MgSO4 x 7H2O ca. 0,5 g FeSO4 x 7H2O ca. 0,5 g ZnSO4 x 5H2O ca. 0,02 g CuSO4 x 5H2O ca. 0,02 g MnCI2 x 4H2O und ca. 18 ml Sojaöl enthält.
8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Pilz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Deuteromyceten und Anamorphen der Ascomyceten.
9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei der Pilz Phialemonium spec, Acremoni- um strictum, Aspergillus spec, Botrytis cinerea oder Trichoderma spec. ist.
10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der pH-Wert 3 ist.
11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Inkubationszeit ca. 3 bis 14 Tage beträgt.
12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es bei einer Temperatur zwischen ca. 200C und ca. 45°C, vorzugsweise bei 200C bis ca. 35°C, weiter bevorzugt bei ca. 210C durchgeführt wird.
13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Minimalmedium über einen Sterilfilter belüftet wird.
14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Mini- malmedium mit einem Reinkultur-Inokulum beimpft wird.
15. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Pilz auf von einem Trägermaterial geerntet wird, das in das Minimalmedium eingetaucht wird.
16. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Volumen des Minimalmediums ca. 1 Liter bis ca. 3.500 m3, vorzugsweise ca. 100 Liter, weiter bevorzugt ca. 350 Liter beträgt.
17. Enzym, das durch ein Verfahren nach den vorhergehenden Ansprüchen herstellbar ist.
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