EP2121033A2 - Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide - Google Patents

Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide

Info

Publication number
EP2121033A2
EP2121033A2 EP08707201A EP08707201A EP2121033A2 EP 2121033 A2 EP2121033 A2 EP 2121033A2 EP 08707201 A EP08707201 A EP 08707201A EP 08707201 A EP08707201 A EP 08707201A EP 2121033 A2 EP2121033 A2 EP 2121033A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligosaccharide
polysaccharide
color
marked
dye
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP08707201A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jörg Kowalczyk
Thomas Rose
Stephan Hausmanns
Thomas Walter
Wolfgang Wach
Norbert Gretz
Maliha Sadick
Daniel Schock
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universitaet Heidelberg
Original Assignee
Universitaet Heidelberg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet Heidelberg filed Critical Universitaet Heidelberg
Publication of EP2121033A2 publication Critical patent/EP2121033A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A61K47/549—Sugars, nucleosides, nucleotides or nucleic acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/0019—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules
    • A61K49/0021—Fluorescence in vivo characterised by the fluorescent group, e.g. oligomeric, polymeric or dendritic molecules the fluorescent group being a small organic molecule
    • A61K49/0032—Methine dyes, e.g. cyanine dyes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0052—Small organic molecules

Definitions

  • the invention relates to color-coded oligosaccharides or polysaccharides, to processes for preparing these color-coded oligosaccharides or polysaccharides, to their use for producing an agent for determining kidney function and to their use for determining kidney function.
  • the quantitative and qualitative functional testing plays a major role.
  • the glomerular filtration rate is an important factor in the assessment of renal function. It can be determined at least approximately from the renal clearance. Renal clearance refers to the removal of a specific exogenous or endogenous substance from the blood as a specific kidney function.
  • Renal clearance refers to the removal of a specific exogenous or endogenous substance from the blood as a specific kidney function.
  • various indicator substances are known. The most commonly used indicator substance is creatinine. Another example of an endogenous indicator substance is cystatin C. An exogenous indicator substance is inulin.
  • Gretz et al (Pediatr Nephral., 22 (2007); 167-169) describes various measuring methods of the glomerular filtration rate.
  • No. 6,995,019 B2 describes an indicator substance in which fluorescein isothiocyanate (FITC) is bound to sinestrin.
  • FITC-coupled inulin is also known from Lorenz and Gruenstein (Renal Physiol 45 (1999), 172-177).
  • the emission maximum of FITC is 520 nm.
  • Hemoglobin shows a very strong absorption at 520 nm. This leads to errors and inaccuracies in the measurement of the glomerular filtration rate with FITC-labeled indicator substances in the presence of hemoglobin, for example in hemolytic processes.
  • a technical problem underlying the invention is therefore the provision of indicator substances which make it possible to carry out accurate measurements of the renal clearance, wherein the presence of hemoglobin does not interfere with the measurement.
  • Another technical problem underlying the invention is the provision of improved indicator substances for measuring renal clearance.
  • the invention solves the underlying technical problem by color-coded oligo- or polysaccharides according to the independent claims, in particular by color-coded oligosaccharides or polysaccharides, comprising a coupled with a dye oligo- or polysaccharide, wherein the dye has an emission maximum of at least 725 nm and at most 875 nm. Furthermore, the present invention solves the underlying technical problem by color-coded oligo- or polysaccharides comprising an oligosaccharide or polysaccharide coupled with a cyanine dye.
  • the invention also solves the technical problem on which it is based by providing a color-coded oligosaccharide or polysaccharide comprising an oligosaccharide or polysaccharide coupled with a cyanine dye, the cyanine dye having an emissi onsmaximum of at least 725 nm and at most 875 nm.
  • indicator substances secreted by the kidney must be used.
  • the kidney excretes hydrophilic substances. It has surprisingly been found that hydrophobic dyes are either excreted from the kidney at all or excreted particularly well when bound to certain hydrophilic oligo- or polysaccharides.
  • the usability of the color-labeled indicator substances can be influenced by the chain length of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • the half life of the dye can be adjusted by the choice of certain oligo- or polysaccharides.
  • the half-life of dye-labeled 1-F-fructofuranosyl-D-nystose is higher than the half-life of dye-labeled sinistrin.
  • oligosaccharides in particular with a DP of 2 to 10 and even with a DP of 2 to 7 can be used with a color coding as indicator substance.
  • the color-labeled oligosaccharides and polysaccharides according to the invention enable accurate and time-saving methods for measuring kidney function.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide is preferably an oligosaccharide.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide is a polysaccharide.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a degree of polymerization, also called DP, of from 2 to 65.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 3 to 65.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 65.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 5 to 65. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 6 to 65.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 2 to 50. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 3 to 50. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 50. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 5 to 50.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 2 to 40.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 3 to 40.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 40.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 5 to 40.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 10 to 40.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 2 to 25. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 3 to 25. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 25. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 5 to 25. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 2 to 12. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 3 to 12. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 12. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 5 to 12.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 2 to 10. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 3 to 10. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 4 to 10. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of from 5 to 10. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 6 to 10.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 2. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 3. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 4. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 5. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 6. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 7.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at least 8. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at most 10. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at most 25. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at most 30. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at most 40. According to the invention, this is preferred Oligo- or polysaccharide a DP of at most 50 on. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of at most 65.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of 2 or 3. According to the invention, this is preferred
  • Oligosaccharide or polysaccharide a DP of 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11,
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably has a DP of more than 65.
  • an oligosaccharide is understood to mean a carbohydrate which consists of two to about 10, in particular from 2 to 10, very particularly from 2 to 7, monosaccharide units.
  • a polysaccharide is understood to mean a carbohydrate which consists of at least 10, preferably more than 10, monosaccharide units.
  • the oligosaccharide preferably has a DP of 2.
  • the oligosaccharide preferably has a DP of 3.
  • the oligosaccharide preferably has a DP of 4.
  • the oligosaccharide preferably has a DP of
  • the oligosaccharide preferably has a DP of 6. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of
  • the oligosaccharide preferably has a DP of
  • the oligosaccharide preferably has a DP of
  • the oligosaccharide preferably has a DP of According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 3 to 10. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 4 to 10. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 5 to 10. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 2 to 7. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 3 to 7. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 4 to 7. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 5 to 7.
  • the polysaccharide preferably has a DP of at least 10. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of at least 11. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 10 to 65. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 11 to 65. According to the invention, this has preferably Polysaccharide preferably has a DP of from 20 to 65. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 40 to 65. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 10. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 11. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 12. According to the invention, the polysaccharide preferably has a DP of 10 to 12.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is branched. According to the invention, the oligosaccharide is branched. According to the invention, the polysaccharide is branched.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is not branched. According to the invention, the oligosaccharide is not branched. According to the invention, the polysaccharide is preferably not branched. According to the invention, the oligosaccharide or polysaccharide is preferably selected from the group consisting of oligofructans, polyfructans, inulin, sinistrin and insoluble maltodextrins or dextrins which, in addition to the .alpha.-1, 4 bond, have at least one .alpha.-1, 3, ⁇ -1, 2 or / and have an ⁇ -1, 6-bond.
  • the fructose molecules in the oligofructans or in the polyfructans are linked to one another via ⁇ -2-1 bonds.
  • the fructose molecules in the oligofructans are preferably linked to one another via ⁇ -2,1-bonds.
  • the fructose molecules in the polyfructans are preferably linked to one another via ⁇ -2,1-bonds.
  • the oligofructans are oligofructose and / or fructo-oligosaccharides (FOS).
  • FOS fructo-oligosaccharides
  • the fructooligosaccharides preferably contain a terminal glucose molecule. It can also be provided that the fructose oligosaccharides contain a terminal fructose molecule in the pyranose form. According to the invention, the fructooligosaccharides preferably contain no terminal glucose molecule.
  • a source for obtaining the oligo and polysaccharides used according to the invention may be, for example, fructan inulin (alan starch, CAS No. 9005-80-5), which is used by many plants, for example the chicory / chicory, as a reserve substance. Reserve carbon hydrate is stored. From chicory, for example Chicory intybus, inulin is obtained technically by aqueous extraction and further purification steps. A plant-independent synthesis or the enzymatic structure of fructans is also possible, for example, with the aid of bacterial fructosyl transferases. If product mixtures are formed, the desired molecules can be separated therefrom by conventional methods.
  • fructan inulin alan starch, CAS No. 9005-80-5
  • Reserve carbon hydrate is stored.
  • chicory for example Chicory intybus
  • inulin is obtained technically by aqueous extraction and further purification steps.
  • a plant-independent synthesis or the enzymatic structure of fructans
  • Inulin which can be synthesized by means of bacterial fructosyltransferases, is generally longer-chain, but more branched ( ⁇ (2 ⁇ 6) branches within the chain of fructose molecules) than vegetable inulin.
  • Preference according to the invention is given to the polyfranc tanes of the GF n or F n type.
  • the polyfructans preferably contain a terminal glucose molecule.
  • the polyfructans preferably contain no terminal glucose molecule.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is sinistrin.
  • Preferred according to the invention is oligosaccharide or the polysaccharide inulin.
  • the oligosaccharide or the polysaccharide is preferably an oligofructan.
  • the oligosaccharide or the polysaccharide is preferably a polyfructan.
  • the oligosaccharide is preferably an oligofructan.
  • the polysaccharide is preferably a polyfructan.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is preferably an insoluble maltodextrin or dextrin which, in addition to the .alpha.-1, 4-bond, contains at least one .alpha.-1, 3, .alpha.-1, 2 or / and one .alpha.-1, 6 - have binding.
  • the oligosaccharide is preferably a maltodextrin or dextrin which, in addition to the ⁇ -1,4-bond, has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1,6 linkage.
  • the polysaccharide is preferably a maltodextrin or dextrin which has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1,6 linkage in addition to the ⁇ -1,4 linkage.
  • the oligosaccharide or the polysaccharide is an insoluble maltodextrin which, in addition to the .alpha.-1, 4-bond has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and an ⁇ -1, 6 bond.
  • the oligosaccharide is preferably a maltodextrin which, in addition to the .alpha.-1, 4-bond, has at least one .alpha.-1, 3, .alpha.-1, 2-olefin and .alpha.1,6-bond.
  • the polysaccharide is preferably a maltodextrin which has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1, 6 bond in addition to the ⁇ -1, 4-bond.
  • the oligosaccharide or the polysaccharide is preferably an insoluble dextrin which has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1,6 linkage in addition to the ⁇ -1,4 linkage.
  • the oligosaccharide is preferably a dextrin which has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1,6 linkage in addition to the ⁇ -1,4 linkage.
  • the polysaccharide is preferably a dextrin which has at least one ⁇ -1, 3, ⁇ -1, 2 or / and one ⁇ -1,6 linkage in addition to the ⁇ -1,4 linkage.
  • the oligosaccharide is 1-F-fructofuranosyl-D-nystose.
  • the oligosaccharide is kestose. According to the invention, the oligosaccharide is nystose.
  • the oligosaccharide is of the type F 4 .
  • the oligosaccharide of the F 5 type is preferred according to the invention.
  • the oligosaccharide is of the GF 3 type.
  • Preferred according to the invention is the oligosaccharide of the GF 4 type.
  • the oligosaccharide preferably consists of 4 fructose molecules. According to the invention, the oligosaccharide preferably consists of 5 fructose molecules. According to the invention, the oligosaccharide preferably consists of 3 fructose molecules and one glucosemolecule. According to the invention, the oligosaccharide preferably consists of 4 fructose molecules and one glucose molecule. inventions According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 4. According to the invention, the oligosaccharide preferably has a DP of 5.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is a polyfructosan.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably consists of fructose units.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains predominantly fructose units.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains essentially no glucose units, in particular no glucose units.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains only terminal glucose units.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains glucose in a total proportion of at most 0 to 10%, more preferably at most 1 to 10%, more preferably at most 1 to 5%, in particular at most 2 to 3%, in particular at most 1%.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains glucose in a total proportion of at most 0 to 5%.
  • the oligosaccharide or polysaccharide preferably contains glucose in a total proportion of at most 0 to 3%.
  • the recovery of the oligo- and polysaccharides for color marking is preferably carried out by chromatographic separation of the desired substances from mixtures already containing them in proportions.
  • the dye coupled to the oligosaccharide or polysaccharide preferably has an emission maximum of at least 725 nm and at most 875 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of at least 750 and at most 850 nm.
  • the dye has an emission maximum of at least 775 and at most 825 nm.
  • the dye has an E mission maximum of at least 790 and at most 810 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of at least 700 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of at least 725 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of at least 750 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of at least 775 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of about 800 nm.
  • the dye preferably has an emission maximum of 800 nm.
  • the determination of the emission maximum of the coupled to the oligosaccharide or polysaccharide dye, in particular fluorescent dye, according to the invention is preferably carried out according to the method described in the European Pharmacopoeia.
  • the determination of the maximum emission of the coupled to the oligosaccharide or polysaccharide dye, in particular fluorescent dye, according to the invention is preferably carried out in accordance with the method described in the European Pharmacopoeia.
  • the solution of the dye is preferably filled into a suitable cuvette, irradiated with monochromatic light and the intensity of the fluorescence radiation emanating from the sample subsequently measured at an angle of 90 ° to the incoming light beam.
  • a Hitachi F-3010 fluorometer can be used as a device for these measurements.
  • the measurement is preferably carried out at room temperature, in particular 25 ° C.
  • Erfndungsge- Gurss preferably, the concentration of the sample solution between 5 and 50 ug / ml, in particular at about 30 ug / ml or 10 "6 mol / l.
  • a dye is understood to mean, in particular, an abovementioned dye having the emission maxima mentioned.
  • the dye is preferably a cyanine dye.
  • the dye is preferably a fluorescent dye.
  • the dye is not fluorescein isothiocyanate, which is also known to the person skilled in the art as FITC. According to the invention, the dye is preferably not a FITC derivative.
  • the dye is preferably a monofunctional or a difunctional isothiocyanate cyanine dye.
  • the dye is preferably an isothiocyanate-cyanine dye.
  • the dye is preferably a monofunctional isothiocyanate cyanine dye.
  • the dye is preferably a bifunctional isothiocyanate cyanine dye.
  • the dye is an isothiocyanate cyanine derivative.
  • the dye is a Indocyaninsetting- rivat. According to the invention, the dye is indocyanine green.
  • Preferred according to the invention is a color-marked oligosaccharide or polysaccharide having the structure CY-ITC-SAC, where CY is a cyanine dye, ITC is an isothiocyanate and SAC is an oligosaccharide or a polysaccharide.
  • CY is preferably a dye disclosed herein.
  • CY is preferably an indocyanine screen derivative.
  • CY is indocyanine green.
  • Preferred according to the invention is a color-marked oligosaccharide or polysaccharide, the dye being indocyanine green and the indocyanine greener derivative being produced from indocyanine green and isothiocyanate.
  • the dye is preferably a CY dye. CY dyes and their nomenclature are described in Mujumdar et al., Cytometry 10 (1989); Pp. 11-19 and in Ernst et al., Cytometry 10 (1989); P. 3-10.
  • the dye CY7.4 is preferred. According to the invention, the dye CY7.4-iodoacetamide is preferred. According to the invention, the dye is CY7.4-isothiocyanate.
  • the dye preferably has the structure of formula I:
  • X, Y, Ri, R 2 and R 3 may preferably be different groups according to the invention in formula I.
  • m is 1, 2 or 3.
  • m is preferably 3.
  • XS, O, an NR or an isopropylidene group is preferred.
  • YS 1 O, an NR or an isopropylidene group is preferred.
  • R 1 is preferably a methyl group.
  • R 2 is preferably a sulfopropyl group or a sulfobutyl group.
  • R 2 is preferably a sulfopropyl group.
  • R 2 is preferably a sulfobutyl group.
  • R 3 is preferably ITC, H, NH 2 , NCS, NHBOC or NHCSNHCH 3 .
  • R 3 is preferably ITC.
  • preference is given to R 3 NHBOC, ie a 5-t-butyl carbamido group.
  • R 3 is preferably NH 2 .
  • R 3 NCS.
  • R 3 is preferably NHCSNHCH 3 .
  • the dye preferably has the structure of formula II:
  • X, Y, R 1, R 2, R 3 and R 4 may according to the invention forthcoming Trains t be various groups in formula II.
  • m is 1, 2 or 3.
  • m is preferably 3.
  • XS, O, an NR or an isopropylidene group is preferred.
  • YS, O is an NR or an isopropylidene group.
  • R 1 is preferably a methyl group.
  • R 2 is preferably a sulfopropyl group or a sulfobutyl group.
  • R 2 is preferably a sulfopropyl group.
  • R 2 is preferably a sulfobutyl group.
  • R 3 is preferably ITC, H, NH 2 , NCS, NHBOC or NHCSNHCH 3 .
  • R 3 is preferably ITC.
  • preference is given to R 3 NHBOC, ie a 5-t-butyl carbamido group.
  • R 3 is preferably NH 2 .
  • R 3 is preferably NCS.
  • R 3 is preferably NHCSNHCH 3 .
  • R 4 is preferably ITC, H, NH 2 , NCS, NHBOC or NHCSNHCH 3 .
  • the dye CY7.8 is preferred. According to the invention, the dye is CY7.8-isothiocyanate.
  • the dye preferably has the structure of formula III:
  • n is 1, 2 or 3. According to the invention, m is preferably 3.
  • BOC in formula III is t-butoxycarbonyl.
  • the dye is preferably a merocyanine dye.
  • the dye MC6.1 is preferred.
  • the dye MC6.2 is preferred.
  • the dye MC6.1-iodoacetamide is preferred.
  • the dye MC6.2-iodoacetamide is preferred.
  • the dye preferably has the structure of formula IV:
  • X 1 Y, R 1, R 2 and R 3 may be Formula IV according to the invention preferably various groups.
  • m is 1, 2 or 3.
  • m is preferably 3.
  • XS, O, an NR or an isopropylidene group is preferred.
  • YS, O 1 is preferably an NR or an isopropylidene group.
  • X is preferably an isopropylidene group.
  • Y is preferably sulfur.
  • Y is oxygen.
  • R 1 is preferably a methyl group.
  • R 2 is preferably an ethyl group.
  • R 2 is preferably a butyl group.
  • Preferred according to the invention is R 3 IA 1 where IA is iodoacetamide.
  • the dye preferably has the structure according to formula V:
  • the dye is preferably a derivative of the dye according to formula V.
  • the dye preferably has the structure of formula VI: Formula VI:
  • R 1 in formula VI is isothiocyanate.
  • the dye has the structure according to formula VII:
  • SAC is an oligo- or polysaccharide
  • R is at least one other fructose unit.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is coupled directly to the dye.
  • the oligosaccharide or polysaccharide is coupled to the dye via isothiocyanate.
  • isothiocyanate is preferably used as coupling between dye and oligosaccharide or polysaccharide.
  • the isothiocyanate is preferably a constituent of the dyestuff.
  • the isothiocyanate is not a constituent of the dye.
  • the dye is preferably coupled to an OH group of a fructose unit or a glucose unit of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • the dye can be coupled to any free OH group of a fructose unit or a glucose unit.
  • the dye is coupled to a terminal fructose unit of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • the dye is preferably coupled to a terminal glucose unit of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • the dye is preferably coupled to an intermediate fructose unit of the oligosaccharide or polysaccharide.
  • the invention also solves the problem on which it is based by providing processes for preparing a color-marked oligosaccharide or polysaccharide, in particular an oligosaccharide or polysaccharide according to the invention.
  • preference is given to a process for preparing a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in which a) the oligosaccharide or polysaccharide is dissolved in a solvent, b) a hydride, in particular sodium hydride, is added to the dissolved oligosaccharide or polysaccharide, c) a dissolved dye, in particular a fluorescent dye, is added thereto, and d) the color-marked oligosaccharide or polysaccharide is isolated as a solid.
  • the hydride in step b) is sodium hydride.
  • the hydride in step b) is sodium borohydride, ie NABH 4 .
  • the hydride in step b) is lithium aluminum hydride, ie LiAlH 4 .
  • the invention also relates to the color-labeled oligosaccharides or polysaccharides prepared by this process.
  • the dye is preferably a fluorescent dye, preferably an above-mentioned fluorescent dye. According to the invention, the dye is preferably an above-mentioned dye.
  • the solvent in step a) is preferably a polar solvent.
  • the solvent in step a) is preferably an aprotic solvent.
  • the solvent in step a) is preferably a polar, aprotic solvent.
  • the solvent in step a) is preferably anhydrous dimethylformamide.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide is preferably isolated in step d) by addition of aqueous ammonium chloride, subsequent extraction and subsequent lyophilization.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide is preferably purified in step d) by recrystallization and / or gel filtration.
  • the invention also relates to color-marked oligosaccharides or polysaccharides which have been prepared by a process according to the invention.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for determining kidney function.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for determining the glomerular filtration rate.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for determining the renal clearance.
  • the use of the color-marked oligosaccharides or polysaccharides according to the invention for determining the kidney function and / or as a diagnostic agent permits non-invasive detection. This contributes to reducing the physical impairment of the individual to be examined.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for the production of an agent for determining kidney function.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for the preparation of an agent for determining the glomerular filtration rate.
  • the invention also relates to the use of a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention for the production of an agent for determining the renal clearance.
  • the invention also relates to diagnostic agents, in particular for determining kidney function, comprising a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention.
  • the diagnostic agent is used for determining kidney function.
  • the diagnostic agent is preferably used to determine the glomerular filtration rate.
  • the diagnostic agent is preferably used to determine the renal clearance.
  • the diagnostic agent preferably contains a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention.
  • the diagnostic agent preferably contains at least two different color-marked oligosaccharides or polysaccharides according to the invention.
  • the diagnostic agent preferably contains substances selected from the group consisting of additives, carriers, excipients and mixtures thereof. According to the invention, the diagnostic agent preferably contains additives. According to the invention, the diagnostic agent preferably contains carriers. According to the invention, the diagnostic agent preferably contains auxiliaries. According to the invention, the diagnostic agent preferably contains physiologically acceptable buffer substances.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention is preferably used as constituent of a diagnostic agent to be administered parenterally.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in water, in particular water for injection according to DAB10, or physiological saline solution, in particular isotonic sodium chloride solution dissolved.
  • the concentration of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in the diagnostic agent is preferably in the range from 10 to 250 mg / ml, in particular from 25 to 125 mg / ml.
  • the invention also relates to a diagnostic method, in particular for determining kidney function, characterized in that a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention or a diagnostic agent according to the invention is administered.
  • the diagnostic method is preferably used for kidney functional specifications.
  • the diagnostic method is preferably used to determine the glomerular filtration rate.
  • the diagnostic method is preferably used to determine the renal clearance.
  • the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention or the diagnostic agent according to the invention is preferably administered to a vertebrate, particularly preferably to a mammal, in particular a human.
  • the diagnostic method is preferably used in a mammal.
  • the diagnostic method is preferably applied to a human.
  • the diagnostic method is preferably carried out with a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention. According to the invention, the diagnostic method is preferably carried out with at least two different color-marked oligosaccharides or polysaccharides according to the invention.
  • the chronological course of the concentration of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in the blood after parental administration of a specific dose of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention is preferably determined.
  • the diagnostic method preferably contains a fluorescence measurement.
  • the diagnosis is preferably carried out by determining the concentration of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention by means of fluorescence measurement.
  • the fluorescence measurement is preferably carried out according to methods from the prior art (compare, for example Sohtell et al., Acta Physiol. Scand. 119 (1983); Pp. 313 to 316, Lorenz and Gruenstein, Am. J. Physiol. 276 (1999) pages 172-177).
  • Fluorescence measurement offers the advantage of high sensitivity and speed of measurement.
  • the diagnosis is preferably transcutaneous.
  • Preferred according to the invention is a non-invasive diagnostic method for determining kidney function, comprising irradiating light onto the skin of a mammal to be examined, in particular humans, and detecting the fluorescence light from the skin by a color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention or by a diagnostic agent containing a novel color-coded oligosaccharide or polysaccharide.
  • the fluorescence measurement of the oligo or polysaccharide which is color-marked in accordance with the invention is preferably carried out in vitro, for example in blood samples. According to the invention, no enzymatic pretreatment is carried out for the fluorescence measurement.
  • the fluorescence measurement is carried out with conventional standard devices.
  • the fluorescence measurement of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention preferably takes place with a non-invasive detection method.
  • Non-invasive detection methods are methods which allow the detection of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in tissue or body fluids without prior sampling, for example by blood sampling.
  • the fluorescence measurement is preferably carried out by the color-coded oligosaccharide or polysaccharide according to the invention in the tissue or in body fluids.
  • a fluorescence measurement is preferably used, in which light for exciting the fluorescence is irradiated into the skin of the individual to be examined and the fluorescent light emerging from the skin is detected.
  • this is preferably done with the aid of a non-invasive measuring head.
  • a light source of the measuring head for example a laser emitting in the UV range, illuminates the skin via a glass fiber optic and excites the dyes of the color-marked oligosaccharides or polysaccharides according to the invention for fluorescence.
  • the fluorescent light is recorded with a glass fiber optic and measured with a corresponding detector, for example a CCD spectrograph.
  • the light source and / or the detector can be integrated into the measuring head or arranged outside the measuring head.
  • the measuring head is preferably applied to the skin of the individual to be examined with an adhesive, for example a transparent adhesive film, and remains there for the entire measuring time.
  • non-invasive measurement of the color-marked oligosaccharide or polysaccharide according to the invention preferably takes place continuously over a relatively long period of time.
  • the non-invasive measurement preferably takes place over a clinically relevant measurement time.
  • the non-invasive measurement preferably takes place over a period of 2 to 4 hours, in particular of about 3 hours, in particular of 3 hours.
  • the dose of the color-labeled oligosaccharide or polysaccharide according to the invention used as a diagnostic agent is preferably from 5 to 200 mg of substance per kg of body weight, especially preferably 5 to 100 mg substance per kg body weight, more preferably 5 to 50 mg substance per kg body weight, preferably 5 to 20 mg substance per kg body weight.
  • Example 1 Obtaining the Qliqo- and polysaccharides for color marking
  • Beneo TM GR and Beneo TM 95 used are from Beneo-Orafti (Tienen, Belgium). It is a food-grade inulin product made from chicory (chicory intybus).
  • Beneo TM GR about 92% of Beneo TM GR consists of inulin (oligo- fructose, DP distribution see Table 1) and about 8% of glucose (G), fructose (F) and sucrose (GF) ,
  • Beneo TM 95 consists of about 95% inulin (oligo- fructose, DP distribution see Table 1) and about 5% of glucose (G), Frucotse (F) and sucrose (GF) , The table clearly shows the larger proportion of shorter fructose chains compared to Beneo TM GR. Table 1 Composition of inulins used as starting material
  • SEC Size Exclusion Chromatography
  • GPC gel permeation chromatography
  • the detection of the substances separated on the column is preferably carried out by means of a refractive index (RI) meter which measures the deflection / change of direction which a light beam experiences when it enters an optically different medium at an angle ,
  • the RI detector outputs a voltage in mV, which is plotted against time (chromatogram).
  • the separating material is "Toyopearl HW-40S” (Tosoh Bioscience, D-70567 Stuttgart, Germany, molecular structure: hydroxylated methacrylate polymer, average particle size: 30 ⁇ m, particle size distribution: 20-40 ⁇ m, exclusion limit: up to 10,000 daltons , average pore size: 50 A (0.005 ⁇ m), height of the separation columns: 125 cm, diameter of the separation columns: 10 cm). Separation conditions:
  • Detection is by pulsed amperometry (PAD), which works with three different potentials.
  • the first potential causes a
  • Electrode surface oxidized Under the influence of the third potential as a reduction of the electrode surface to gold, which simultaneously cleans the electrode.
  • Table 2 Parameters of the HPAEC analysis.
  • the aim is to produce an oligo-fructan mixture which contains predominantly only fructans with a molecular size between DP 5 and DP 10. Since Beneo TM 95 contains 95% of fructans in the range between DP 2 and DP 9 (see Table 1), only the lower molecular weight range ⁇ DP 5 has to be separated by chromatography.
  • the product solution was collected after separation into 7 different fractions. Since it is known that the larger molecules leave the column first, the fractions were cut narrower in this area than later in the area in which the smaller molecules are eluted.
  • the composition of the fractions was analyzed by HPAEC. Even with the help of HPAEC analyzes, it is possible to assign the peaks to individual chain lengths.
  • the fructose tetramer F 4 which no longer belongs to the target compounds, appears for the first time in the 4th fraction. In Fraction 7, the proportion of smaller molecules was already so great that it was no longer used and discarded.
  • the fractions 2 to 6 were combined and concentrated on a rotary evaporator at 40 0 C and 40 mbar to 10% (w / w) TS.
  • the solution obtained by means of preparative gel chromatography shows a slight yellowing which can be removed with the aid of activated charcoal.
  • the solution is added at room temperature over a glass column with soil frit, which is filled with 250 mL activated carbon (Epibon MC-h 12-40, Danube Carbon GmbH & Co. KG, Frankfurt), and collected the decolourized solution.
  • the activated carbon was washed intensively with hot demineralized water. Since the activated carbon in addition to the colored substances also adsorbs fructans, the yield of the decolorization is 48% (based on the dry substance used).
  • the solution Since the solution is diluted again by decolorization, it must be prepared in a rotary evaporator for the preparation of freeze-drying 40 ° C and 40 mbar to 10% (w / w) TS are concentrated.
  • the concentrated solution is stirred at - 20 0 C frozen and then freeze-dried at 0.6 mbar. In the experiment, a total of 11.7 g of freeze-dried product was obtained.
  • Table 3 Composition of product DP 5 to DP 10 ("DP5 +").
  • the aim is to produce a poly-fructan fraction which contains predominantly only molecules with a size of DP 10.
  • TM GR was used (see Table 1).
  • the aim is to produce an oligo-fructan mixture containing predominantly only fructans with a molecular size between DP 10 and DP 15. Since Beneo TM GR is composed of fructans in the range from DP 2 to about DP 60 (Table 1 or manufacturer's instructions from Beneo-Orafti (Tienen, Belgium)), the DP range was from about. Before chromatographic separation with isopropanol DP 15 precipitated and filtered off.
  • the milky solution is first filtered through a black belt filter, then a 0.45 micron filter - on a rotary evaporator, the filtrate is concentrated at 50 0 C to one third of the initial amount (370 g) and can be used for chromatography
  • Table 4 Composition of the product DP 10 to DP 15 C.DP10 + ").

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Cosmetics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

Die Erfindung betrifft farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide, Verfahren zur Herstellung dieser farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharide und ihre Verwendung zur Nierenfunktionsbestimmung.

Description

Farbmarkierte Oliqo- oder Polysaccharide
Beschreibung
Die Erfindung betrifft farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide, Verfahren zur Herstellung dieser farbmarkierten Oligo- oder Polysaccha- ride, ihre Verwendung zur Herstellung eines Mittels zur Nierenfunktionsbestimmung und ihre Verwendung zur Nierenfunktionsbestimmung.
In der Nierendiagnostik spielt die quantitative und qualitative Funktionsprüfung eine große Rolle. Unter anderem wird dabei die glomeru- läre Filtrationsrate gemessen. Die glomeruläre Filtrationsrate ist für die Abschätzung der Nierenfunktion eine wichtige Größe. Sie kann aus der renalen Clearance zumindest annäherungsweise bestimmt werden. Die renale Clearance bezeichnet die Entfernung einer bestimmten exogenen oder endogenen Substanz aus dem Blut als spezifische Leistung der Niere. Zur Bestimmung der renalen Clearance und damit der glomerulären Filtrationsrate sind verschiedene Indikatorsubstanzen bekannt. Die am häufigsten verwendete Indikatorsubstanz ist dabei Kreatinin. Ein weiteres Beispiel für eine endogene Indikatorsubstanz ist Cystatin C. Eine exogene Indikatorsub- stanz ist Inulin. Gretz et al (Pediatr Nephral. 22 (2007); 167-169) beschreibt verschiedene Messmethoden der glomerulären Filtrationsrate.
US 6,995,019 B2 beschreibt eine Indikatorsubstanz, bei der Fluores- cinisothiocyanat (FITC) an Sinestrin gebunden ist. Auch FITC ge- koppeltes Inulin ist aus Lorenz und Gruenstein (Renal Physiol. 45 (1999); 172-177) bekannt. Das Emissionsmaximum von FITC liegt bei 520 nm. Hämoglobin zeigt bei 520 nm eine sehr starke Absorption. Dies führt bei der Messung der glomerulären Filtrationsrate mit FITC markierten Indikatorsubstanzen in Anwesenheit von Hämoglobin, beispielsweise bei hämolytischen Prozessen, zu Fehlern und Ungenauigkeiten.
Ein der Erfindung zugrunde liegendes technisches Problem ist daher die Bereitstellung von Indikatorsubstanzen, die es ermöglichen, genaue Messungen der renalen Clearance durchzuführen, wobei die Anwesenheit von Hämoglobin sich nicht störend auf die Messung auswirkt.
Ein anderes der Erfindung zugrunde liegendes technisches Problem ist die Bereitstellung verbesserter Indikatorsubstanzen zur Messung der renalen Clearance.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem durch farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide gemäß der unabhängigen Ansprüche, insbesondere durch farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide, umfassend ein mit einem Farbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid, wobei der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 725 nm und höchstens 875 nm aufweist. Weiterhin löst die vorliegende Erfindung das ihr zugrunde liegende technische Problem durch farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide, die ein mit einem Cyaninfarbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid umfassen.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende technische Problem auch durch die Bereitstellung eines farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids, umfassend ein mit einem Cyaninfarbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid, wobei der Cyaninfarbstoff ein Emissi- onsmaximum von mindestens 725 nm und höchstens 875 nm aufweist.
Zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate müssen Indikatorsubstanzen verwendet werden, die von der Niere ausgeschieden werden. Die Niere scheidet hydrophile Stoffe aus. Es zeigte sich ü- berraschender Weise, dass hydrophobe Farbstoffe von der Niere entweder überhaupt ausgeschieden oder besonders gut ausgeschieden werden, wenn sie an bestimmte hydrophile Oligo- oder Polysaccharide gebunden sind. Insbesondere zeigte sich, dass sich in bevorzugter Ausführungsform die Verwendbarkeit der farbmarkierten Indikatorsubstanzen durch die Kettenlänge des Oligo- oder Polysaccharids beeinflussen lässt.
Weiterhin zeigte sich überraschender Weise, dass sich in bevorzugter Ausführungsform die Halbwertszeit des Farbstoffs durch die Wahl bestimmter Oligo- oder Polysaccharide einstellen lässt. So ist beispielsweise die Halbwertszeit von farbstoffmarkierter 1-F- Fructofuranosyl-D-Nystose höher als die Halbwertszeit von farbstoffmarkiertem Sinistrin.
Es zeigte sich darüber hinaus in bevorzugter Ausführungsform, dass auch Oligosaccharide, insbesondere mit einem DP von 2 bis 10 und sogar mit einem DP von 2 bis 7 mit einer Farbmarkierung als Indikatorsubstanz verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- und Polysaccharide ermöglichen genaue und zeitsparende Verfahren zur Messung der Nierenfunktion.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid ein Oligosaccharid. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid ein Polysaccharid. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen Polymerisationsgrad, auch DP genannt, von 2 bis 65 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 65 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 65 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 5 bis 65 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 6 bis 65 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 bis 50 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 50 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 50 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 5 bis 50 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 bis 40 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 40 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 40 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder PoIy- saccharid einen DP von 5 bis 40 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 10 bis 40 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 bis 25 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 25 auf. Erfindungsge- maß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 25 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 5 bis 25 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 bis 12 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 12 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 12 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 5 bis 12 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 bis 10 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 3 bis 10 auf. Erfindungsge- maß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 4 bis 10 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 5 bis 10 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 6 bis 10 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 2 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 3 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 4 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 5 auf. Erfin- dungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 6 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 7 auf. Erfin- dungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von mindestens 8 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 10 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 25 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 30 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 40 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 50 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von höchstens 65 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2 oder 3 auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist das
Oligo- oder Polysaccharid einen DP von 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ,
12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29,
30, 31 , 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 42, 43, 44, 45, 46, 47,
48, 49, 50, 51 , 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61 , 62, 63, 64 oder 65 auf.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist das Oligo- oder Polysaccharid einen DP von über 65 auf.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Oligosaccharid ein Kohlenhydrat verstanden, das aus zwei bis ca. 10, insbesondere aus 2 bis 10, ganz besonders aus 2 bis 7 Mono- saccharideinheiten besteht. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wird unter einem Polysaccharid ein Kohlenhydrat verstanden, das aus mindestens 10, bevorzugt mehr als 10, Monosaccha- rideinheiten besteht.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 2.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 3.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 4.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligossaccharid einen DP von
5. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 6. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von
7. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von
8. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligossacharid einen DP von
9. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 2 bis 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 3 bis 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 4 bis 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 5 bis 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 2 bis 7. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 3 bis 7. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 4 bis 7. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 5 bis 7.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von mindestens 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von mindestens 11. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 10 bis 65. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 11 bis 65. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 20 bis 65. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 40 bis 65. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 10. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 11. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 12. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Polysaccharid einen DP von 10 bis 12.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligo- oder Polysaccharid verzweigt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid ver- zweigt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid verzweigt.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligo- oder Polysaccharid nicht verzweigt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid nicht verzweigt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid nicht verzweigt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Oligofructa- nen, Polyfructanen, Inulin, Sinistrin und unlösliche Maltodextrine o- der Dextrine, die neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweisen.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Fructosemoleküle in den Oli- gofructanen oder in den Polyfructanen über ß-2-1 -Bindungen miteinander verknüpft. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Fructosemoleküle in den Oligofructanen über ß-2,1-Bindungen miteinander ver- knüpft. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Fructosemoleküle in den Polyfructanen über ß-2,1-Bindungen miteinander verknüpft.
Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Oligofructane Oligofructose und/oder Fructooligosaccharide (FOS). Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Fructooligosaccharide vom Typ GFn (Glucose-Fructosβn) oder vom Typ Fn (Fructosen). Erfindungsgemäß bevorzugt enthalten die Fructooligosaccharide ein endständiges Glucosemolekül. Es kann auch vorgesehen sein, dass die Fructoseoligosaccharide ein endständiges Fructosemolekül in der Pyranoseform enthalten. Erfindungsgemäß bevorzugt enthalten die Fructooligosaccharide kein endständiges Glucosemolekül.
Eine Quelle zur Gewinnung der erfindungsgemäß eingesetzten Oli- go- und Polysaccharide kann zum Beispiel das Fructan-Inulin (Alanstärke, CAS-Nr. 9005-80-5) sein, das von vielen Pflanzen, zum Beispiel den Wegwarten/Zichorien, als Reservestoff/Reservekohlen- hydrat eingelagert wird. Aus Zichorien, zum Beispiel Chicorium inty- bus, wird Inulin technisch durch wässrige Extraktion und weitere Aufreinigungsschritte gewonnen. Eine pflanzenunabhängige Synthese beziehungsweise der enzymatische Aufbau von Fructanen ist zum Beispiel auch mit Hilfe bakterieller Fructosyl-Transferasen möglich. Sofern dabei Produktgemische entstehen, können die gewünschten Moleküle daraus mittels üblicher Verfahren abgetrennt werden. Inu- lin, das mit Hilfe bakterieller Fructosyl-Transferasen aufgebaut werden kann, ist in der Regel langkettiger, aber stärker verzweigt (ß(2→6)-Verzweigungen innerhalb der Kette der Fructosemoleküle) als pflanzliches Inulin. Erfindungsgemäß bevorzugt sind die Polyfruc- tane vom Typ GFn oder vom Typ Fn. Erfindungsgemäß bevorzugt enthalten die Polyfructane ein endständiges Glucosemolekül. Erfindungsgemäß bevorzugt enthalten die Polyfructane kein endständi- ges Glucosemolekül.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid Sinistrin. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Oligosaccharid oder das Polysaccharid Inulin. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein Oligofructan. Erfindungs- gemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein Polyfructan. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid ein Oligofructan. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid ein Polyfructan.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das PoIy- saccharid ein unlösliches Maltodextrin oder Dextrin, die neben der α- 1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6- Bindung aufweisen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid ein Maltodextrin oder Dextrin, die neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufwei- sen. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid ein Maltodextrin oder Dextrin, die neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweisen.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein unlösliches Maltodextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid ein Maltodextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- o- der/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid ein Maltodextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein unlösliches Dextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid ein Dextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Polysaccharid ein Dextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- oder/und eine α-1 ,6-Bindung aufweist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid 1-F- Fructofuranosyl-D-Nystose.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid Kestose. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid Nystose.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid vom Typ F4. Er- findungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid vom Typ F5. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid vom Typ GF3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligosaccharid vom Typ GF4.
Erfindungsgemäß bevorzugt besteht das Oligosaccharid aus 4 Fruc- tosemolekülen. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht das Oligosac- charid aus 5 Fructosemolekülen. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht das Oligosaccharid aus 3 Fructosemolekülen und einem GIu- cosemolekül. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht das Oligosaccharid aus 4 Fructosemolekülen und einem Glucosemolekül. Erfin- dungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 4. Erfindungsgemäß bevorzugt hat das Oligosaccharid einen DP von 5.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligo- oder Polysaccharid ein Polyfructosan. Erfindungsgemäß bevorzugt besteht das Oligo- oder Polysaccharid aus Fructoseeinheiten. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid überwiegend Fructoseeinheiten. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid im wesentlichen keine Glucoseeinheiten, insbesondere keine Glucoseeinheiten. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid nur endständige Glucoseeinheiten. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid Glucose in einem Gesamtanteil von höchstens 0 bis 10 %, besonders bevorzugt von höchstens 1 bis 10 %, mehr bevorzugt von höchstens 1 bis 5 %, insbesondere von höchstens 2 bis 3 %, insbesondere von höchstens 1 %. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid Glucose in einem Gesamtanteil von höchstens 0 bis 5 %. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Oligo- oder Polysaccharid Glucose in einem Gesamtanteil von höchstens 0 bis 3 %.
Die Gewinnung der Oligo- und Polysaccharide zur Farbmarkierung erfolgt vorzugsweise durch chromatographische Abtrennung der gewünschten Substanzen aus Gemischen, die diese in Anteilen bereits enthalten.
Erfindungsgemäß bevorzugt weist der an das Oligo- oder Polysaccharid gekoppelte Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 725 nm und höchstens 875 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 750 und höchstens 850 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 775 und höchstens 825 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein E- missionsmaximum von mindestens 790 und höchstens 810 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 700 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 725 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 750 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 775 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von etwa 800 nm auf. Erfindungsgemäß bevorzugt weist der Farbstoff ein Emissionsmaximum von 800 nm auf.
Die Bestimmung des Emissionsmaximums des an das Oligo- oder Polysaccharid gekoppelten Farbstoffs, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffs, erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt nach der im Europäisches Arzneibuch beschrieben Methode. Die Bestimmung des Emis- sionsmaximums des an das Oligo- oder Polysaccharid gekoppelten Farbstoffs, insbesondere Fluoreszenzfarbstoffs, erfolgt erfindungsgemäß bevorzugt in Anlehnung an die im Europäisches Arzneibuch beschrieben Methode. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Lösung des Farbstoffs in eine geeignete Küvette gefüllt, mit monochromati- schem Licht bestrahlt und die Intensität der von der Probe ausgehenden Fluoreszenzstrahlung anschließend in einem Winkel von 90° zum eingehenden Lichtstrahl gemessen. Als Gerät für diese Messungen kann Beispielsweise ein Hitachi Fluorometer F- 3010 eingesetzt werden. Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Messung bei Raumtemperatur, insbesondere 25°C durchgeführt. Erfndungsge- mäß bevorzugt liegt die Konzentration der Probenlösung zwischen 5 und 50 μg/ml, insbesondere bei etwa 30 μg/ml bzw. 10"6 mol/l.
Im Zusammenhang mit dieser Erfindung wird unter einem Farbstoff insbesondere ein vorgenannter Farbstoff mit den genannten Emissi- onsmaxima verstanden. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Cyaninfarbstoff.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff nicht Fluoresceinisothi- ocyanat, dem Fachmann auch als FITC bekannt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff kein FITC-Derivat.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein monofunktioneller oder ein bifunktioneller Isothiocyanat-Cyanin-Farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Isothiocyanat-Cyanin- Farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein monofunktioneller Isothiocyanat-Cyanin-Farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein bifunktioneller Isothiocyanat-Cyanin- Farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Isothio- cyanat-Cyanin-derivat.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Indocyaningründe- rivat. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff Indocyaningrün.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid mit dem Aufbau CY-ITC-SAC, wobei CY ein Cyaninfarbstoff ist, ITC ein Isothiocyanat ist und SAC ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist CY ein vorliegend offenbarter Farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist CY ein Indocyaningründerivat. Erfindungsgemäß bevorzugt ist CY Indocyaningrün.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein farbmarkiertes Oligo- oder PoIy- saccharid, wobei der Farbstoff Indocyaningrün ist und das Indocyaningründerivat aus Indocyaningrün und Isothiocyanat hergestellt ist. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein CY-Farbstoff. CY- Farbstoffe und ihre Nomenklatur sind in Mujumdar et al., Cytometry 10 (1989); S. 11-19 und in Ernst et al., Cytometry 10 (1989); S. 3-10 beschrieben.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff CY7.4. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff CY7.4-lodoacetamid. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff CY7.4-lsothiocyanat.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel I:
Formel I:
X, Y, Ri, R2 und R3 können in Formel I erfindungsgemäß bevorzugt verschiedenste Gruppen sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 1 ,2 oder 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist X S, O, eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Y S1 O, eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Ri eine Methylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfopropylgruppe oder eine Sulfobutylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfopropylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfobutylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 ITC, H, NH2, NCS, NHBOC oder NHCSNHCH3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = ITC. Erfindungs- gemäß bevorzugt ist R3 = NHBOC, also eine 5-t-butyl Carbamido- Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NH2. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NCS. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NHCSNHCH3.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel II:
Formel M:
X, Y, R1, R2, R3 und R4 können in Formel Il erfindungsgemäß bevor- zugt verschiedenste Gruppen sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 1 ,2 oder 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist X S, O, eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Y S, O, eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Ri eine Methylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfopropylgruppe oder eine Sulfobutylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfopropylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Sulfobutylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 ITC, H, NH2, NCS, NHBOC oder NHCSNHCH3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = ITC. Erfindungs- gemäß bevorzugt ist R3 = NHBOC, also eine 5-t-butyl Carbamido- Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NH2. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NCS. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 = NHCSNHCH3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R4 ITC, H, NH2, NCS, NHBOC oder NHCSNHCH3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R4 = ITC. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R4 = NHBOC, also eine 5-t-butyl Carbamido-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R4 = NH2. Erfin- dungsgemäß bevorzugt ist R4 = NCS. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R4 = NHCSNHCH3.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff CY7.8. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff CY7.8-lsothiocyanat.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel III:
Formel
Erfindungsgemäß bevorzugt ist in Formel Il m 1 ,2 oder 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 3. BOC steht in Formel III für t- butoxycarbonyl.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Merocyanin- farbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff MC6.1. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff MC6.2. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff MC6.1-lodoacetamid. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff MC6.2-lodoacetamid.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel IV:
Formel IV:
X1 Y, R1, R2 und R3 können in Formel IV erfindungsgemäß bevorzugt verschiedenste Gruppen sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 1 ,2 oder 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist m 3. Erfindungsgemäß bevorzugt ist X S, O, eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Y S, O1 eine N-R- oder eine Isopropyliden-Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist X eine Isopropyliden- Gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Y Schwefel. Erfindungsgemäß bevorzugt ist Y Sauerstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R1 eine Methylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Ethyl- gruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R2 eine Butylgruppe. Erfindungsgemäß bevorzugt ist R3 IA1 wobei IA für lodoacetamid steht.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel V:
Formel V:
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Derivat des Farbstoffes nach Formel V.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel VI: Formel VI:
Erfindungsgemäß bevorzugt ist Ri in Formel VI Isothiocyanat.
Erfindungsgemäß bevorzugt hat der Farbstoff die Struktur nach Formel VII:
Formel VII:
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid umfassend ein Agens mit der Formel VIII, Formel VIII:
wobei SAC ein Oligo- oder Polysaccharid ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid umfassend ein Agens mit der Formel IX,
Formel IX:
wobei R für mindestens eine weitere Fructoseeinheit steht.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligo- oder Polysaccharid direkt an den Farbstoff gekoppelt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Oligo- oder Polysaccharid über Isothiocyanat an den Farbstoff gekop- pelt. Erfindungsgemäß bevorzugt dient Isothiocyanat als Kopplung zwischen Farbstoff und Oligo- oder Polysaccharid. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Isothiocyanat Bestandteil des Farbstoffs. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Isothiocyanat kein Bestandteil des Farbstoffs. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff an eine OH- Gruppe einer Fructoseeinheit oder einer Glucoseeinheit des Oligo- oder Polysaccharids gekoppelt. Der Farbstoff kann dabei an jede freie OH-Gruppe einer Fructoseeinheit oder einer Glucoseeinheit gekoppelt sein. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff an eine endständige Fructoseeinheit des Oligo- oder Polysaccharids gekop- pelt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff an eine endständige Glucoseeinheit des Oligo- oder Polysaccharids gekoppelt. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff an eine mittelständige Fructoseeinheit des Oligo- oder Polysaccharids gekoppelt.
Die Erfindung löst das ihr zugrunde liegende Problem auch durch die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung eines farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids, insbesondere eines erfindungsgemäßen Oligo- oder Polysaccharids. Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids, wobei a) das Oligosaccharid oder das Po- lysaccharid in einem Lösungsmittel gelöst wird, b) zu dem gelösten Oligosaccharid oder Polysaccharid ein Hydrid, insbesondere Natriumhydrid, zugegeben wird, c) ein gelöster Farbstoff, insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff, dazugegeben wird, und d) das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid als Feststoff isoliert wird. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Hydrid in Schritt b) Natriumhydrid. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Hydrid in Schritt b) Natriumborhydrid, also NABH4. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Hydrid in Schritt b) Lithiumaluminiumhydrid, also LiAIH4.
Die Erfindung betrifft auch die mittels diese Verfahrens hergestellten farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharide.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff, vorzugsweise ein vorstehend genannter Fluoreszenzfarbstoff. Erfindungsgemäß bevorzugt ist der Farbstoff ein vorstehend genann- ter Farbstoff.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Lösungsmittel in Schritt a) ein polares Lösungsmittel. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Lösungsmittel in Schritt a) ein aprotisches Lösungsmittel. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Lösungsmittel in Schritt a) ein polares, aprotisches Lösungsmittel. Erfindungsgemäß bevorzugt ist das Lösungsmittel in Schritt a) anhydriertes Dimethylformamid.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid in Schritt d) durch Zugabe von wässrigem Ammoniumchlorid, anschließendem Extrahieren und anschließendem Lyophilisie- ren isoliert.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid in Schritt d) durch Umkristallisieren und/oder Gelfiltration gereinigt.
Die Erfindung betrifft auch farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren hergestellt wurden. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids zur Nierenfunktionsbestimmung. Die Erfindung betrifft auch Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids zur Be- Stimmung der glomerulären Filtrationsrate. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids zur Bestimmung der renalen Clearance.
Die Verwendung der erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharide zur Nierenfunktionsbestimmung und/oder als Diag- nosemittel erlaubt eine nicht-invasive Detektion. Dies trägt zur Reduzierung der körperlichen Beeinträchtigung des zu untersuchenden Individuums bei.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids zur Herstellung eines Mittels zur Nierenfunktionsbestimmung. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids zur Herstellung eines Mittels zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate. Die Erfindung betrifft auch die Verwendung eines erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder PoIy- saccharids zur Herstellung eines Mittels zur Bestimmung der renalen Clearance.
Die Erfindung betrifft auch diagnostische Mittel, insbesondere zur Nierenfunktionsbestimmung, enthaltend ein erfindungsgemäßes farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharids. Erfindungsgemäß bevor- zugt dient das diagnostische Mittel zur Nierenfunktionsbestimmung. Erfindungsgemäß bevorzugt dient das diagnostische Mittel zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate. Erfindungsgemäß bevorzugt dient das diagnostische Mittel zur Bestimmung der renalen Clearance. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel ein erfindungsgemäßes farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel mindestens zwei unterschiedliche erfindungsgemäße farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide.
Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel Stoffe, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Additiven, Trägerstoffen, Hilfsstoffen und Mischungen davon. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel Additive. Erfindungsgemäß bevor- zugt enthält das diagnostische Mittel Trägerstoffe. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel Hilfsstoffe. Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das diagnostische Mittel physiologisch verträglicher Puffersubstanzen.
Das erfindungsgemäße farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid wird erfindungsgemäß bevorzugt als Bestandteil eines parental zu verabreichenden diagnostischen Mittels verwendet. Zur Herstellung des diagnostischen Mittels wird erfindungsgemäß bevorzugt, das erfindungsgemäße farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid in Wasser, insbesondere Wasser für Injektionszwecke gemäß DAB10, oder physiologische Kochsalzlösung, insbesondere isotonische Natriumchloridlösung, gelöst. Erfindungsgemäß bevorzugt liegt die Konzentration des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids in dem diagnostischen Mittel im Bereich von 10 bis 250 mg/ml, insbesondere von 25 bis 125 mg/ml.
Die Erfindung betrifft auch ein Diagnoseverfahren, insbesondere zur Nierenfunktionsbestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass ein erfindungsgemäßes farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid oder ein erfindungsgemäßes diagnostisches Mittel verabreicht wird. Erfindungsgemäß bevorzugt dient das Diagnoseverfahren zur Nieren- funktionsbestimmung. Erfindungsgemäß bevorzugt dient das Diagnoseverfahren zur Bestimmung der glomerulären Filtrationsrate. Erfindungsgemäß bevorzugt dient das Diagnoseverfahren zur Bestimmung der renalen Clearance.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das erfindungsgemäße farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid oder das erfindungsgemäße diagnostische Mittel einem Wirbeltier, besonders bevorzugt einem Säugetier, insbesondere einem Menschen verabreicht. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Diagnoseverfahren bei einem Säugetier an- gewendet. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Diagnoseverfahren bei einem Menschen angewendet.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Diagnoseverfahren mit einem erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharid durchgeführt. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Diagnoseverfah- ren mit mindestens zwei verschiedenen erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysacchariden durchgeführt.
Zur Beurteilung der Nierenfunktion wird erfindungsgemäß bevorzugt der zeitliche Verlauf der Konzentration des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids im Blut nach parentaler Gabe einer bestimmten Dosis des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids bestimmt.
Erfindungsgemäß bevorzugt enthält das Diagnoseverfahren eine Fluoreszenzmessung. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Diagnose durch Bestimmung der Konzentration des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids mittels Fluoreszenzmessung. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Fluoreszenzmessung nach Methoden aus dem Stand der Technik (vergleiche zum Beispiel Sohtell et al., Acta Physiol. Scand. 119 (1983); S. 313 bis 316, Lorenz und Gruenstein, Am. J. Physiol. 276 (1999) Seite 172-177).
Die Fluoreszenzmessung bietet den Vorteil einer hohen Empfindlichkeit und Schnelligkeit der Messung.
Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Diagnose transkutan.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist ein nicht-invasives Diagnoseverfahren zur Nierenfunktionsbestimmung, umfassend das Einstrahlen von Licht auf die Haut eines zu untersuchenden Säugetiers, insbesondere Menschen, und das Erfassen des Fluoreszenzlichts aus der Haut, das durch ein erfindungsgemäßes farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid oder durch ein diagnostisches Mittel, das ein erfindungs- gemäßes farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid enthält, erzeugt wird.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Fluoreszenzmessung des er- findungsgemäß farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids in vitro durchgeführt, beispielsweise in Blutproben. Erfindungsgemäß bevorzugt wird für die Fluoreszenzmessung keine enzymatische Vorbehandlung durchgeführt.
Erfindungsgemäß bevorzugt wird die Fluoreszenzmessung mit übli- chen Standardgeräten durchgeführt. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die Fluoreszenzmessung des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids mit einer nicht-invasiven Nachweismethode. Nicht-invasive Nachweismethoden sind Methoden, die den Nachweis des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids in Gewebe oder Körperflüssigkeiten ohne vorherige Probennahme beispielsweise durch Blutabnahme erlauben. Erfin- dungsgemäß bevorzugt erfolgt die Fluoreszenzmessung von dem erfindungsgemäß farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharid im Gewebe oder in Körperflüssigkeiten. Erfindungsgemäß bevorzugt wird ein Fluoreszenzmessung eingesetzt, bei der Licht zur Anregung der Fluoreszenz in die Haut des zu untersuchenden Individuums eingestrahlt wird und das aus der Haut austretende Fluoreszenzlicht de- tektiert wird. Erfindungsgemäß bevorzugt geschieht dies mit Hilfe eines nicht-invasiven Messkopfes. Erfindungsgemäß bevorzugt beleuchtet eine Lichtquelle des Messkopfes, beispielsweise ein im UV- Bereich emittierender Laser, über eine Glasfaseroptik die Haut und regt die darin enthaltenden Farbstoffe der erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharide zur Fluoreszenz an. Erfindungsgemäß bevorzugt wird das Fluoreszenzlicht mit einer Glasfaseroptik aufgenommen und mit einem entsprechenden Detektor, beispielsweise einem CCD-Spektrographen, gemessen. Die Lichtquelle und/oder der Detektor kann dabei in den Messkopf integriert oder außerhalb des Messkopfes angeordnet sein. Erfindungsgemäß bevorzugt wird der Messkopf mit einem Kleber, beispielsweise einer transparenten Klebefolie, auf die Haut des zu untersuchenden Indi- viduums aufgebracht und verbleibt dort für die gesamte Messzeit.
Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die nicht-invasive Messung des erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids kontinuierlich über einen längeren Zeitraum. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die nicht-invasive Messung über eine klinisch relevante Messzeit. Erfindungsgemäß bevorzugt erfolgt die nicht-invasive Messung über einen Zeitraum von 2 bis 4 Stunden, insbesondere von etwa 3 Stunden, insbesondere von 3 Stunden.
Erfindungsgemäß bevorzugt beträgt die Dosis des als Diagnosemittel eingesetzten erfindungsgemäßen farbmarkierten Oligo- oder Po- lysaccharids 5 bis 200 mg Substanz je kg Körpergewicht, besonders bevorzugt 5 bis 100 mg Substanz je kg Körpergewicht, mehr bevorzugt 5 bis 50 mg Substanz je kg Körpergewicht, vorzugsweise 5 bis 20 mg Substanz je kg Körpergewicht.
Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen.
Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung der Erfindung, beschränken diese jedoch nicht.
Beispiel 1 : Gewinnung der Qliqo- und Polysaccharide zur Farbmarkierung
Verwendete Ausgangsmaterialien:
Die verwendeten Ausgangsmaterialien Beneo™GR und Beneo™95 stammen von der Firma Beneo-Orafti (Tienen, Belgien). Es handelt sich um im Lebensmittelbereich eingesetzte Produkte aus Inulin, das aus Zichorien (Chicorium intybus) hergestellt wird.
Beneo™GR: Beneo™GR besteht zu ca. 92 % aus Inulin (Oligo- Fructose, DP-Verteilung siehe Tabelle 1) und zu ca. 8 % aus Gluco- se (G), Fructose (F) und Saccharose (GF).
Beneo™95: Beneo™95 besteht zu ca. 95 % aus Inulin (Oligo- Fructose, DP-Verteilung siehe Tabelle 1) und zu ca. 5 % aus Gluco- se (G), Frucotse (F) und Saccharose (GF). Die Tabelle zeigt deutlich den im Vergleich zu Beneo™GR größeren Anteil kürzerer Fructose- Ketten. Tabelle 1 Zusammensetzung der als Ausgangsmaterial verwendeten Inuline
Präparative Gel-Chromatographie
Zur Abtrennung der Moleküle der gewünschten Kettenlänge wird die Größenausschlußchromatographie (engl. Size Exclusion Chromatographie, „SEC") angewendet, die auch als Gel-Permeations- Chromatographie (GPC) bezeichnet wird.
Die Detektion der auf der Säule aufgetrennten Substanzen erfolgt vorzugsweise mittels eines Durchfluss-Brechungsindex-Messers (Refraction Index-Detektors (Rl)), der die Ablenkung/ Richtungsänderung misst, die ein Lichtstrahl erfährt, wenn er unter einem Winkel in ein optisch andersartiges Medium eintritt. Der Rl-Detektor gibt eine Spannung in mV aus, die gegen die Zeit aufgetragen wird (Chroma- togramm).
Als Trennmaterial wird „Toyopearl HW-40 S" (Tosoh Bioscience, D- 70567 Stuttgart, Germany, Molekülstruktur: Hydroxyliertes Methacry- lat Polymer, durchschnittliche Partikelgröße: 30 μm, Partikelgrößen- Verteilung: 20 - 40 μm, Ausschlußgrenze: bis zu 10.000 Dalton, durchschnittliche Porengröße: 50 A (0,005 μm), Höhe der Trennsäulen: 125 cm, Durchmesser der Trennsäulen: 10 cm) eingesetzt. Trennbedingungen:
Volumen-Gelbett: 3 x 8 L = 24 L
Temperatur: 60 0C Laufmittel: vollentsalztes, entgastes Wasser
Fließgeschwindigkeit: 12 ml_/min
Aufgabe: jeweils 150 ml_ mit 10 % (w/w) TS
Analytik mittels HPAEC:
Die Analytik aller Proben erfolgt mit Hilfe der HPAEC (High Pressure Anion Exchange Chromatography). Stationäre Phase ist ein stark basisches Anionenaustauscher-Harz, an das verschiedene Anionen verschieden stark binden. Da es sich bei den hier zu analysierenden Kohlenhydraten um schwache Säuren handelt, liegen diese im basi- sehen Milieu als Anionen vor und können abhängig von ihrem pKs- Wert mittels Gradientenelution getrennt und detektiert werden. Die Retentionszeit nimmt von den Monosacchriden zu den Polysacchariden hin zu.
Die Detektion erfolgt durch gepulste Amperomtrie (PAD), die mit drei verschiedenen Potentialen arbeitet. Das erste Potential bewirkt eine
Oxidation der Ionen in der Probe an einer Goldelektrode, wobei ein
Strom entsteht, der der Konzentration des jeweiligen Probe-Ions äquivalent ist. Durch Einwirkung des zweiten Potentials wird die
Elektrodenoberfläche oxidiert. Unter Einwirkung des dritten Potenti- als erfolgt eine Reduktion der Elektrodenoberfläche zu Gold, was gleichzeitig die Elektrode reinigt. Tabelle 2: Parameter der HPAEC-Analyse.
Parameter Bedingung / Gerät
Säule Vorsäule: Carbo-Pac , PA 1 Guard 4 x 50 mm Trennsäule: Carbo-Pac™, PA 1 4 x 250 mm
Eluent 1 M NaOH, 1 M Natrium-Acetat, vollentsalztes Wasser
Gradient innerhalb von 60 Minuten: [2 - 45 % Natrium-Acetat + 88 - 45 % vollentsalztes Wasser] + 10 % NaOH
Druck 70 - 100 bar
Fluß 1 mL / min
Injektionsvolumen 20 μL
Probenkonzentration 10 - 50 ppm in Puffer
Puffer 0.1 % Toluol in vollentsalztem Wasser
Elutionspumpe Dionex Gradient pump
Probenaufgabe Dionex Autosampier
Detektion Pulsed Amperometric Detection (PAD)
Integration HP ChemStation
Empfindlichkeit 1 μA
Chromatographische Abtrennung eines Fructo-Oligosaccharid- Gemisches im Bereich DP 5 bis DP 10 („DP5+") aus Inulin (Be- neo™95):
Ziel ist die Herstellung einer Oligo-Fructan-Mischung, die überwiegend nur Fructane mit einer Molekülgröße zwischen DP 5 und DP 10 enthält. Da Beneo™95 zu 95 % Fructane im Bereich zwischen DP 2 und DP 9 enthält (siehe Tabelle 1), muß nur der niedermolekularere Bereich < DP 5 chromatographisch abgetrennt werden.
Für 11 ,7 g TS Produkt wurden 6 Trennungen (Bedingungen: siehe oben) auf einer Trennanlage durchgeführt, bei denen jeweils 150 ml_ mit 10 % (w/w) TS auf die Säule aufgegeben wurden. In der Summe wurden 90 g TS Beneo™95 aufgelöst und chromatographiert.
Die Produktlösung wurde nach der Trennung in 7 verschiedenen Fraktionen aufgefangen. Da bekannt ist, daß zuerst die größeren Moleküle die Säule verlassen, wurden in diesem Bereich die Fraktionen enger geschnitten als später in dem Bereich, in dem die kleineren Moleküle eluiert werden. Die Zusammensetzung der Fraktionen wurde mit Hilfe der HPAEC analysiert. Auch nur mit Hilfe der HPAEC-Analysen ist es möglich, die Peaks einzelnen Kettenlängen zuzuordnen. Das Fructose-Tetramer F4, das bereits nicht mehr zu den Zielverbindungen gehört, taucht erstmals in der 4. Fraktion auf. In Fraktion 7 war der Anteil an kleineren Molekülen bereits so groß, daß sie nicht mehr verwendet und verworfen wurde. Die Fraktionen 2 bis 6 wurden vereinigt und am Rotationsverdampfer bei 40 0C und 40 mbar auf 10 % (w/w) TS aufkonzentriert.
Entfärbung über Aktivkohle und Gefriertrocknung:
Die mit Hilfe der präparativen Gel-Chromatographie gewonnene und eingeengte Lösung zeigt eine leichte Gelbfärbung, die mit Hilfe von Aktivkohle entfernt werden kann. Dazu wird die Lösung bei Raum- temperatur über eine Glassäule mit Bodenfritte gegeben, die mit 250 mL Aktivkohle (Epibon MC-h 12-40, Donau Carbon GmbH & Co. KG, Frankfurt) gefüllt ist, und die entfärbte Lösung aufgefangen. Zur Vorbehandlung wurde die Aktivkohle intensiv mit heißem vollentsalzten Wasser gewaschen. Da die Aktivkohle neben den farbigen Substan- zen auch Fructane adsorbiert, beträgt die Ausbeute der Entfärbung 48 % (bezogen auf die eingesetzte Trockensubstanz).
Da durch die Entfärbung die Lösung erneut verdünnt wird, muss sie zur Vorbereitung der Gefriertrocknung am Rotationsverdampfer bei 40 °C und 40 mbar auf 10 % (w/w) TS aufkonzentriert werden. Die aufkonzentrierte Lösung wird bei - 200C eingefroren und anschließend bei 0,6 mbar gefriergetrocknet. Im Versuch wurden insgesamt 11 ,7 g gefriergetrocknetes Produkt erhalten.
Im HPAEC-Chromatogramm des hergestellten Produktes ist im Vergleich zum Ausgangsmaterial Beneo™95 deutlich zu erkennen, dass die kleineren Moleküle (hier < DP5) mit einer Retentionszeit < 18 Minuten nicht mehr vorhanden sind.
Zusammensetzung:
Tabelle 3: Zusammensetzung des Produktes DP 5 bis DP 10 („DP5+").
Chromatographische Abtrennung einer Fructo-Oligosaccharid-
Fraktion mit DP 10 („DP 10") aus Inulin (Beneo Tι Mm,GR):
Ziel ist die Herstellung einer Poly-Fructan-Fraktion, die überwiegend nur Moleküle mit einer Größe von DP 10 enthält. Als Ausgangsmate- rial wurde Beneo »TM GR verwendet (siehe Tabelle 1).
Für 4,7 g TS Produkt wurden 11 Trennungen (Bedingungen: siehe oben) auf einer Trennanlage durchgeführt, bei denen jeweils 150 ml_ mit 10 % (w/w) TS Beneo™GR auf die Säule aufgegeben wurden. In der Summe wurden 225 g TS Beneo™GR aufgelöst und chroma- tographiert. Die Ausbeute beträgt 2 %. Die auf DP 10 bezogene Reinheit beträgt ca. 30 %.
Chromatographische Abtrennung eines Fructo-Oligosaccharid- Gemisches im Bereich > DP 10 („DP10+") aus Inulin (Bene- o™GR):
Ziel ist die Herstellung einer Oligo-Fructan-Mischung, die überwiegend nur Fructane mit einer Molekülgröße zwischen DP 10 und DP 15 enthält. Da sich Beneo™GR aus Fructanen im Bereich von DP 2 bis etwa DP 60 zusammensetzt (Tabelle 1 bzw. Herstellerangaben Fa. Beneo-Orafti (Tienen, Belgien)), wurde vor der chromatographi- sehen Auftrennung mit Isopropanol der DP-Bereich ab etwa DP 15 ausgefällt und abfiltriert.
Isopropanol-Fällung:
- in einem Becherglas werden 110 g Beneo™GR in 1.100 g vollent- salztem Wasser eingewogen
- zur Ausfällung der höhermolekularen Anteile werden 2.200 g Isopropanol zugegeben und 10 Minuten gerührt
- die milchige Lösung wird erst über einen Schwarzbandfilter, dann über einen 0,45 μm - Filter abgenutscht - am Rotationsverdampfer wird das Filtrat bei 50 0C auf ein Drittel der Ausgangsmenge eingeengt (370 g) und kann so zur Chromatographie verwendet werden
- erhalten wurden 55,6 g TS Oligo-Fructan-Mischung
Für 3,3 g TS Produkt DP 10+ wurden 2 Trennungen (Bedingungen: siehe oben) auf einer Trennanlage durchgeführt, bei denen jeweils 150 mL mit 10 % (w/w) TS der Oligo-Fructan-Mischung auf die Säule aufgegeben wurden. Die Ausbeute beträgt 3 %.
Tabelle 4: Zusammensetzung des Produktes DP 10 bis DP 15 C.DP10+").
Beispiel 2:
Synthese und Aufreinigung von ICG-ITC markiertem Sinistrin
• 2g Sinistrin in 80 ml DMF bei 35° C unter N2 Begasung im Dreihalskolben unter Rückflusskühler lösen
• Lösung auf Raumtemperatur abkühlen lassen
• 0,44g NaH in kleinen Teilen zugeben (Lösung wird leicht gelb und viskos)
• Lösung bei 45°C 30 min rühren
• Lösung bei 55°C 30 min rühren
• 0,072g ICG-ITC gelöst in 35ml DMF auf ein mal zugeben
• Lösung bei 55°C 60 min rühren
• Über Nacht bei Raumtemperatur rühren • Lösung auf 50C kühlen und unter starkem Rühren 0,95g NH4CL gelöst in 5ml H2O zugeben ( Lösung verfärbt sich von braun zu dunkel grün)
• Lösungsmittel im Rotationsverdampfer abtrennen « Es bleibt ein grüner Feststoff
• Produkt in Methanol/ H2O 1/1 lösen
• In Aceton ausfällen
• Feststoff in 40ml Methanol/H2O 1/1 resuspendieren
• 2g Silica 60 zugeben • Lösungsmittel im Rotationsverdampfer abtrennen
• Produkt wird auf eine mit SilicaθO/Methanol/Toluol (2/1) geladene Säule gegeben
• Verunreinigungen werden mit Methanol/Toluol (2/1) abgetrennt • Produkt mit Methanol/H2O eluieren
• Erneut auf Silica 60 aufziehen und mit den selben Lösungsmitteln eluieren
• Produkt wird bei -80° C gefroren
• Beim Lyophilisieren entsteht ein grüner Feststoff.

Claims

Ansprüche
1. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid, umfassend ein mit einem Farbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid, wobei der Farbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 725 nm und höchstens 875 nm aufweist.
2. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid, umfassend ein mit einem Cyaninfarbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid.
3. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid, umfassend ein mit einem Cyaninfarbstoff gekoppeltes Oligo- oder Polysaccharid, wobei der Cyaninfarbstoff ein Emissionsmaximum von mindestens 725 nm und höchstens 875 nm aufweist.
4. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Farbstoff ein Fluoreszenzfarbstoff ist.
5. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Farbstoff ein Cyaninfarbstoff ist.
6. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Farbstoff ein monofunktionel- ler oder ein bifunktioneller Isothiocyanat-Cyannin-Farbstoff ist.
7. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Farbstoff ein Indocya- ningründerivat ist.
8. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche mit dem Aufbau
CY-ITC-SAC,
wobei CY ein Cyaninfarbstoff ist, ITC Isothiocyanat ist und SAC ein Oligosaccharid oder ein Polysaccharid ist.
9. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach Anspruch 1 , wobei das Indocyaningründerivat aus Indocyaningrün und Isothiocyanat hergestellt ist.
10. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend ein Agens mit der Formel VIII1
Formel VIII:
wobei SAC ein Oligo- oder Polysaccharid ist.
11. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid einen DP von 2 bis 65, bevorzugt einen DP von 3 bis 25, mehr bevorzugt einen DP von 4 bis 25, besonders bevorzugt einen DP von 5 bis 10 aufweist.
12. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid verzweigt ist.
13. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der An- sprüche 1 bis 5, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid nicht verzweigt ist.
14. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Oligofruc- tanen, Polyfructanen, Inulin, Sinistrin und unlöslichen Maltodextrinen oder Dextrinen, die neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- und/oder eine α-1 ,6-Bindung aufweisen.
15. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Oligosaccharid oder das Po- lysaccharid Sinistrin ist.
16. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein Oligofructan ist.
17. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein Polyfructan ist.
18. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der An- Sprüche 1 bis 14, wobei das Oligosaccharid 1-F-Fructofuranosyl-D-
Nystose ist.
19. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein unlösliches Maltodextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindes- tens eine α-1 ,3-, α-1 ,2- und/oder eine α-1 ,6-Bindung aufweist, ist.
20. Farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei das Oligosaccharid oder das Polysaccharid ein unlösliches Dextrin, das neben der α-1 ,4-Bindung mindestens eine α-1 , 3-, α-1 ,2- und/oder eine α-1 ,6-Bindung aufweist, ist.
21. Verfahren zur Herstellung eines farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 20, wobei
a) das Oligosaccharid oder das Polysaccharid in einem Lösungsmittel gelöst wird,
b) zu dem gelösten Oligosaccharid oder Polysaccharid Natriumhydrid zugegeben wird, c) ein gelöster Farbstoff, insbesondere ein Fluoreszenzfarbstoff, dazugegeben wird, und
d) das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid als Feststoff isoliert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21 , wobei das Lösungsmittel in Schritt a) anhydriertes Dimethylformamid ist.
23. Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, wobei das farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharid in Schritt d) durch Zugabe von wässrigem Ammoniumchlorid, anschließendem Extrahieren und anschließen- dem Lyophilisieren isoliert wird.
24. Verwendung eines farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Nierenfunktionsbestimmung.
25. Verwendung eines farbmarkierten Oligo- oder Polysaccharids nach einem der Ansprüche 1 bis 20 zur Herstellung eines Mittels zur Nierenfunktionsbestimmung.
26. Diagnostisches Mittel, insbesondere zur Nierenfunktionsbestimmung, enthaltend ein farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 und Stoffe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Additiven, Trägerstoffen, Hilfsstoffen und Mischungen davon.
27. Diagnoseverfahren, insbesondere zur Nierenfunktionsbestimmung, dadurch gekennzeichnet, dass ein farbmarkiertes Oligo- oder Polysaccharid nach einem der Ansprüche 1 bis 20 oder ein diagnostisches Mittel nach Anspruch 26 einem Wirbeltier, bevorzugt einem Säugetier, besonders bevorzugt einem Menschen, verabreicht wird.
EP08707201A 2007-02-09 2008-01-23 Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide Withdrawn EP2121033A2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102007007738A DE102007007738A1 (de) 2007-02-09 2007-02-09 Farbmarkierte Oligo- oder Polysaccharide
PCT/EP2008/000479 WO2008095603A2 (de) 2007-02-09 2008-01-23 Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide

Publications (1)

Publication Number Publication Date
EP2121033A2 true EP2121033A2 (de) 2009-11-25

Family

ID=39591140

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EP08707201A Withdrawn EP2121033A2 (de) 2007-02-09 2008-01-23 Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide

Country Status (7)

Country Link
US (1) US20100008860A1 (de)
EP (1) EP2121033A2 (de)
JP (1) JP2010518034A (de)
AU (1) AU2008213452B2 (de)
CA (1) CA2677686A1 (de)
DE (1) DE102007007738A1 (de)
WO (1) WO2008095603A2 (de)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3019715B1 (fr) 2014-04-09 2018-04-06 Agro Innovation International Composition fertilisante et biostimulante contenant des fructo-oligosaccharides, procede d'application et utilisations
GB201805577D0 (en) * 2018-04-04 2018-05-16 Optibiotix Health Ltd Prebiotic compositions and methods of production thereof

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5466471A (en) * 1994-07-18 1995-11-14 Wm. Wrigley Jr. Company Chewing gum containing aspartame and maltodextrin or purified maltodextrin
US5928625A (en) * 1997-03-13 1999-07-27 Mallinckrodt Inc. Method of measuring physiological function
US6228344B1 (en) * 1997-03-13 2001-05-08 Mallinckrodt Inc. Method of measuring physiological function
US6280703B1 (en) * 1997-03-13 2001-08-28 Mallinckrodt Inc. Simultaneous multimodal measurement of physiological function
CA2326650A1 (en) * 1998-04-03 1999-10-14 Mallinckrodt Inc. Azo and diaza dericatives and uses thereof in phototherapy
DE10023051B4 (de) 2000-05-11 2004-02-19 Roche Diagnostics Gmbh Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
TWI312369B (en) * 2000-08-01 2009-07-21 Hayashibara Biochem Lab A-isomaltosylglucosaccharide synthase,process for producing the same and use thereof
US6669926B1 (en) * 2000-10-16 2003-12-30 Mallinckrodt, Inc. Hydrophilic light absorbing indole compounds for determination of physiological function in critically ill patients
ATE314398T1 (de) * 2002-01-30 2006-01-15 Sigma Coatings Bv Polysaccharidester und ihre verwendung als lackbindemittel
DE102004045748A1 (de) * 2004-09-21 2006-04-06 Roche Diagnostics Gmbh Stöchiometrisch definierte farbstoffmarkierte Substanzen zur Messung der glomerulären Filtrationsrate, ihre Herstellung und Verwendung

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See references of WO2008095603A2 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2008095603A3 (de) 2009-04-16
DE102007007738A1 (de) 2008-08-14
CA2677686A1 (en) 2008-07-14
AU2008213452A1 (en) 2008-08-14
JP2010518034A (ja) 2010-05-27
WO2008095603A2 (de) 2008-08-14
AU2008213452B2 (en) 2012-09-27
US20100008860A1 (en) 2010-01-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP0934986A1 (de) Farbstoff-Polyaccharid- bzw. Cyclosaccharid-Konjugate und deren Verwendung als Diagnostikum
EP0988060B1 (de) Säurelabile und enzymatisch spaltbare farbstoffkonstrukte zur diagnostik mit nahinfrarotlicht und zur therapie
DE19649971A1 (de) Optische Diagnostika zur Diagnostik neurodegenerativer Krankheiten mittels Nahinfrarot-Strahlung (NIR-Strahlung)
DE3129923A1 (de) Verfahren zur bestimmung von tumor-assoziierten, glykoprotein enthaltenden verbindungen und verfahren zur diagnose von krebs
DE102008039271A1 (de) Neuer Mariendistelextrakt, Verfahren zur Herstellung und Verwendung
DE10023051B4 (de) Verfahren zur Herstellung von Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin, dessen Verwendung und Fluoresceinisothiocyanat-Sinistrin enthaltende diagnostische Zubereitung
EP2652510A1 (de) Verwendung von hydrogelen für biosensoren mit erhöhter sensitivität
EP1809340B1 (de) Stöchiometrisch definierte farbstoffmarkierte substanzen zur messung der glomerulären filtrationsrate
DE102009028526A1 (de) Verfahren zur Modifikation und Funktionalisierung von Sacchariden
WO2008095603A2 (de) Farbmarkierte oligo- oder polysaccharide
DE69115181T2 (de) Polysaccharid enthaltende Zusammensetzung oder Polysaccharid mit heparinoidaler Aktivität, Verfahren zu ihrer Herstellung und Antikoagulans welche dieses als aktives Ingredienz enthält.
DE69214215T2 (de) Magnetisches Kernresonanz Bilderzeugungsmittel
WO2001023005A1 (de) Antikörper-farbstoffkonjugate gegen zielstrukturen der angiogenese zur intraoperativen tumorranddarstellung
DE69723880T2 (de) Delta 1,2 bicyclo 4,4,0] basierte farbstoffe zur kontrastverstärkung in der optischen bilderzeugung
DE69432268T2 (de) Verwendung von aminierten cyclodextrinen zum löslichmachen von als antiepileptika anzuwendenden dibenzazepinderivaten
DE69417261T2 (de) VERWENDUNG VON MONO-3,6-ANHYDROCYCLODEXTRINEN ZUM AUFLöSEN EINER HYDROPHOBISCHEN VERBINDUNG UND PRüFEN DER REINHEIT EINES ENANTIOMERS UND VERFAHREN ZU IHRER HERSTELLUNG
DE102007060599A1 (de) Verfahren zur Extraktion von Membranproteinen
EP0398024B1 (de) Konjugate zur Tumorlokalisation und/oder Tumortherapie
EP1657551A1 (de) Verfahren und Kit zum Nachweis von Cannabinoiden
WO2018153944A1 (de) Gewebe-targetingkomplex
DE112022002225T5 (de) Endoskopisches submukosales injektionsmaterial
DE2524278A1 (de) Diagnostisches mittel, hilfsmittel zu dessen herstellung sowie diagnoseverfahren
Poreddy et al. Development of fluorescent tracers for the real-time monitoring of renal function
AT344334B (de) Verfahren zum abtrennen von flavonoidaglykonen und -glykosiden
DE4217916A1 (de) N-Alkylamin- und N-Arylalkylaminderivate von Heparin, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihrer Verwendung

Legal Events

Date Code Title Description
PUAI Public reference made under article 153(3) epc to a published international application that has entered the european phase

Free format text: ORIGINAL CODE: 0009012

17P Request for examination filed

Effective date: 20091016

AK Designated contracting states

Kind code of ref document: A2

Designated state(s): AT BE BG CH CY CZ DE DK EE ES FI FR GB GR HR HU IE IS IT LI LT LU LV MC MT NL NO PL PT RO SE SI SK TR

DAX Request for extension of the european patent (deleted)
STAA Information on the status of an ep patent application or granted ep patent

Free format text: STATUS: THE APPLICATION IS DEEMED TO BE WITHDRAWN

18D Application deemed to be withdrawn

Effective date: 20110802