EP2041547A2 - Verfahren und vorrichtung zur untersuchung des adhäsionsverhaltens von thrombozyten - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur untersuchung des adhäsionsverhaltens von thrombozyten

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EP2041547A2
EP2041547A2 EP07785609A EP07785609A EP2041547A2 EP 2041547 A2 EP2041547 A2 EP 2041547A2 EP 07785609 A EP07785609 A EP 07785609A EP 07785609 A EP07785609 A EP 07785609A EP 2041547 A2 EP2041547 A2 EP 2041547A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
platelets
measuring chamber
sample carrier
wall
parts
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07785609A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Pedro Mestres-Ventura
Lutz Weber
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Universitaet des Saarlandes
Original Assignee
Universitaet des Saarlandes
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Filing date
Publication date
Application filed by Universitaet des Saarlandes filed Critical Universitaet des Saarlandes
Publication of EP2041547A2 publication Critical patent/EP2041547A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N15/00—Investigating characteristics of particles; Investigating permeability, pore-volume or surface-area of porous materials
    • G01N15/10—Investigating individual particles
    • G01N15/14—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry
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    • G01N15/1459—Optical investigation techniques, e.g. flow cytometry without spatial resolution of the texture or inner structure of the particle, e.g. processing of pulse signals the analysis being performed on a sample stream
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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
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    • G01N35/00029—Automatic analysis not limited to methods or materials provided for in any single one of groups G01N1/00 - G01N33/00; Handling materials therefor provided with flat sample substrates, e.g. slides
    • G01N2035/00099—Characterised by type of test elements
    • G01N2035/00138—Slides

Definitions

  • the invention relates to a method and a device for investigating the adhesion behavior of platelets according to the preamble of claim 1 or claim 4.
  • platelets play an essential role in blood clotting. They adhere to the walls of damaged vessels, thereby activating further platelets to aggregate to form a platelet plug which seals off the injured site.
  • the extent to which the platelets present in the blood are able to adhere to a substrate by adhesion is an important characteristic of the state of the hemostasis system.
  • the invention has for its object to reduce the effort required to investigate the adhesion behavior of platelets.
  • This object is achieved by a method in which a suspension of a blood sample of separated platelets is passed into a measuring chamber and which after a predetermined incubation period on the wall of the measuring chamber by adhesion adhering platelets are observed by means of a microscope.
  • a device with a sample carrier which has a measuring chamber for receiving a suspension of a blood sample of separated platelets, wherein the sample carrier is transparent in the region of the measuring chambers from at least one side to the wall To observe the measuring chamber by adhering adherent platelets with the help of a microscope.
  • platelets are extracted from a given amount of blood sample while avoiding additional activation, and the platelet fraction is diluted to form a suspension.
  • the suspension conducted into the measuring chamber is incubated, for example at 37 °, for a predetermined period of time. Thereafter, the adhering to the chamber wall platelets can be observed by means of a microscope.
  • the number of adhering platelets per unit area can be determined as a characteristic variable.
  • the various forms of the platelets which adjust depending on the activation state. For counting the platelets and evaluating the forms, automatic image evaluation methods are also possible.
  • test is designed to aid in the diagnosis of hereditary or acquired disorders of thrombocyte function.
  • test is suitable to investigate the effect of drugs on hemostasis, in particular the platelets. Further applications arise in quality control in blood banks and in transfusion medicine. In addition to applications in the evaluation of new substances, the test can also be important in the quality assurance of already established drugs.
  • the suspension is injected into a microchannel comprising the measuring chamber and passing through the sample carrier.
  • Complete filling of the microchannel with the suspension ensures that the sample volume from which platelets can settle on the measuring chamber wall is always the same. It does not require an exact dimension of a sample amount.
  • staining of the platelets may be carried out, e.g. through a tetrazolium-based substrate.
  • a fluoromarker e.g. Rhodamine G6
  • labeled platelets can be observed in a fluorescence microscope.
  • the microchannel containing the measuring chamber extends between two adjoining parts forming the sample carrier, which are expediently plate-shaped or comprise a plate-shaped section.
  • a Einl ⁇ ssk ⁇ n ⁇ l ⁇ bêt and / or a Ausl ⁇ ssk ⁇ n ⁇ l ⁇ bêt can / can be in fluid communication with a protruding from one of the parts of the pipe socket, to which, for example, attach a pipette or connect a pump.
  • the inlet channel section may be in fluid communication with a receptacle formed on the sample vessel for receiving the suspension, in particular for receiving a sample total.
  • the suspension contained in the vessel can be drawn into the microchannel via a suction device that can be connected to the tube attachment at the outlet channel section.
  • the tube attachment connected to the outlet channel section has an overflow channel at the free end, which leads to a collecting vessel formed on the sample carrier. Excess sample material thus remains on the sample carrier and does not escape into the environment.
  • a series arrangement of a plurality of measuring chambers and on the sample carrier a plurality, each comprising at least one measuring chamber comprising microchannels may be formed in a parallel arrangement.
  • the contour of the sample carrier in plan view corresponds to the contour of an ordinary microscope slide.
  • the sample carrier can then easily be used in the microscope like such a slide.
  • the Messkam- merwand a, preferably flat, wall portion whose Adphaseshunt with respect to platelets relative to the wall portion adjacent to the parts of the measuring chamber, preferably with respect to the entire remaining measuring chamber wall is increased.
  • the Messkam- merwand a, preferably flat, wall portion whose Adphaseshunt with respect to platelets relative to the wall portion adjacent to the parts of the measuring chamber, preferably with respect to the entire remaining measuring chamber wall is increased.
  • the sample carrier may be made of different materials with different adhesiveness with respect to platelets.
  • the two parts of the sample carrier may be different in material, so that adhering to only one of the parts, which forms one of the two parallel to the plate plane wall sections of the measuring chamber, platelets.
  • Said wall portion may be subjected to an adhesion-enhancing surface treatment and, conversely, the adhesiveness of the wall portions of the measuring chamber adjoining said wall portion may be reduced by a corresponding surface treatment.
  • the latter surface treatment is particularly suitable for sections of the microchannel lying outside the measuring chambers in order to prevent the adhesion of platelets there.
  • a combination of plastic / glass is also possible.
  • One of the two parts could consist of a plastic film.
  • the surface treatment may also be carried out in a coating, e.g. based on silica compounds, by plasma polymerization.
  • a coating e.g. based on silica compounds
  • fluoropolymer-based coatings are applied.
  • a significant advantage of the invention over the prior art is also that after counting or / and qualitative assessment of the adhering platelets located in the channel system liquid medium can be exchanged for a there solidifying fixation without triggering the adherent platelets.
  • the analysis result is thus "frozen”, can be archived and is available for later checks and inspections.
  • FIG. 1 shows a sample carrier according to the invention in a perspective view
  • FIG. 2 shows the sample carrier of FIG. 1 in a sectional view
  • FIG 3 is a sectional view of a sample carrier according to a second embodiment of the present invention
  • 4 shows a partial view of a sample carrier according to the invention, with a measuring chamber and a grid provided on the measuring chamber.
  • a sample carrier 1 made of plastic consists of a first part 2 with a plate-shaped portion 3 and a second, formed in the form of a plate part 4, which is connected to the plate portion 3 of the first part 2.
  • the two parts 2 and 4 are each made in one piece by injection molding of different plastic materials. Both materials are transparent. Part 4 could also be made from a film.
  • microchannels 20 each having three measuring chambers 5, an inlet channel section 6, an outlet channel section 7 and intermediate sections 8 connecting the measuring chambers 5, two depressions are formed in the plate section 3 of the first plastic part 2, which are covered in a fluid-tight manner by the plate-shaped part 4.
  • the measuring chamber 5 facing away from the end of the inlet channel section 6 is in communication with a protruding from the plate section 3 pipe extension 9.
  • the measuring chambers 5 facing away from the end of the outlet channel 8 is connected to such a pipe neck 10.
  • an overflow channel 11 At the free end of the pipe socket 10 is an overflow channel 11, which leads to a collecting vessel 12.
  • the plastic material of the plate-shaped part 4 has a thrombocyte to large adhesion.
  • the part 2, however, consists of a plastic material with low adhesiveness.
  • a suspension from a blood sample separated platelets is filled as shown in arrow 13 via the tube 9.
  • the inner diameter of the pipe socket 9 is dimensioned so that a pipette can be used for this purpose.
  • the suspension passes through the inlet channel section 6 into the first measuring chamber 5 and then via the channel intermediate sections 8 into the further measuring chambers and finally into the outlet channel section 7. Then it ascends in the tube extension 10.
  • the rising can be supported by a connectable to the pipe socket 10 suction device, such as a pipette.
  • Excess sample material runs according to arrow 15 through the overflow channel 11 into the collecting vessel 12. By the collecting vessel 12 ensures that the entire sample remains on the sample carrier and does not enter the environment.
  • platelets adhere only to a wall section 16 of the measuring chambers 5 which is parallel to the plane of the plate and formed by the plate-shaped part 4.
  • a dye is introduced via the tube approach 9, which displaces the sample suspension and stains the adhering to the wall portion 16 of the measuring chambers 5 platelets so that they are visible under the microscope.
  • the sample carrier 1 shown in Rg. 1 and 2 has in plan view the dimensions of a microscope slide and can therefore be inserted like such a carrier in a microscope, under which then adhered to the wall portion 16 by adhesion platelets can be observed.
  • the wall section 16 it is easy to determine the number of adhering platelets per unit area.
  • the platelets can be classified and the frequencies of certain shape characteristics exhibiting platelets can be determined.
  • An exemplary embodiment of a sample carrier 1a shown in FIG. 3 has, instead of tube attachments 9, vessels 17 for filling a sample total.
  • a suction pump which ensures that a microchannel 20a comprising measuring chambers 5a, is quickly completely filled with sample liquid, can be connected to a pipe socket 10a connected to an outlet channel 7a.
  • a square in cross-section measuring chamber 5b is formed.
  • a plate-shaped part 4b On its side facing away from the measuring chamber, a plate-shaped part 4b has a grid 19, which facilitates the counting in a microscope of platelets adhering to a wall section 16b of the measuring chamber 5b.
  • the channel wall formed by the part 4 can be treated such that the adhesion of platelets is avoided. Errors by counting within the channel sections of adherent platelets are excluded.
  • the embodiments described above have two plate-shaped components which are firmly connected to each other. It would also be possible to connect both components in a fluid-tight but yet detachable manner, e.g. with the help of a clamping device.
  • a glass slide could form a stable base and have a top clamped thereto having the channels and measuring chambers.
  • the glass surface could be modified, for which purpose wet-chemical and physical processes are suitable.
  • the top has some ductility and may be e.g. made of an elastomer or silicone.
  • the channels and measuring chambers can be easily sealed fluid-tight by the glass plate.
  • a hardened fixing medium advantageously remains after loosening the clamp connection on the glass slide, which can then be archived like other microscopy samples. The upper part with the measuring chambers and channels is available for further analysis.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten. Erfindungsgemäß wird eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten in eine Messkammer geleitet, und die nach einer Inkubationszeit an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten werden mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet. Entsprechend umfasst eine erfindungsgemäße Vorrichtung einen Probenträger (1 ), der eine Messkammer (5) für die Aufnahme einer Suspension aus. einer Blutprobe separierter Thrombozyten aufweist, wobei der Probenträger transparent ist, um an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftende Thrombozyten im Mikroskop beobachten zu können.

Description

Beschreibung:
„Verfahren und Vorrichtung zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten"
Die Erfindung betrifft ein Verfahren und eine Vorrichtung zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten gemäß Oberbegriff des Anspruchs 1 bzw. Anspruchs 4.
Bekanntermaßen spielen Thrombozyten eine wesentliche Rolle bei der Blutge- rinnung. Sie haften an den Wänden lädierter Gefäße an, wodurch weitere Thrombozyten aktiviert werden, so dass sie durch Aggregation einen die verletzte Stelle abschließenden Blutblättchenpfropf bilden. Das Ausmaß, in welchem die im Blut vorhandenen Thrombozyten in der Lage sind, durch Adhäsion an einem Substrat anzuhaften, stellt ein wichtiges Charakteristikum für den Zustand des Hämostase- Systems dar.
Bei einem bekannten Verfahren zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten wird Blut durch zwei Röhrchen geleitet, von denen eines mit Glasperlen ausgefüllt ist, an denen Thrombozyten anhaften können. Zur Bestimmung des Haftvermögens werden die in den durch die verschiedenen Röhrchen geleiteten Blutfraktionen gemessenen Thrombozytenkonzentrationen ins Verhältnis gesetzt (Hellem AJ. The adhesiveness of human blood platelets in vitro. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 12 (Suppl.):l-17, 1960). Aus den Veröffentlichungen „Nickels RM, Seyfert UT, Wenzel E, Menger MD, Vollmar B. A simple and reproducible method to reliably assess platelet activation. Thrombosis research 1 10: 53-56, 2003" sowie
"Krischek B, Morgenstern E, Mestres P, Klinhardt U, Brannath W, Wieding U, Nemeh A, Heinrich W, Schenk J, Wenzel T, Wenzel E. Adhesion, spreading, and aggrega- tion of plαtelets in flowing blood αnd the reliαbiiity of the retention fest Homburg. Seminars in Thrombosis and Hemostasis, 31 (4):449-457 (2005)" gehen ähnliche Verfahren hervor.
Eine andere, aus der Veröffentlichung „Wasiluk, A. Markers of platelets activation, CD62P and soluble P-Selectin in healthy term neontates. J. Perinatal med.
32(6):514-515.2004." bekannte Richtung sieht die Detektion spezifischer Moleküle an der Oberfläche der Thrombozyten vor, die in verstärktem Maße erscheinen, wenn diese aktiviert sind. An der Zelloberfläche wird mit Hilfe eines spezifischen Antikörpers das mit einem Fluoromarker versehene Protein p-Selectin mit Hilfe der Flow-Cytometry detektiert.
Diese bekannten Verfahren erfordern einen verhältnismäßig hohen gerätetechnischen Aufwand.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, den zur Untersuchung des Adhäsions- Verhaltens von Thrombozyten erforderlichen Aufwand zu verringern.
Diese Aufgabe wird durch ein Verfahren gelöst, bei dem eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten in eine Messkammer geleitet wird und die nach einer vorgegebenen Inkubationsdauer an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden.
Zur Durchführung des Verfahrens lässt sich erfindungsgemäß eine Vorrichtung mit einem Probenträger benutzen, der eine Messkammer für die Aufnahme einer Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten aufweist, wobei der Proben- träger im Bereich der Messkammern von wenigstens einer Seite her transparent ist, um an der Wand der Messkammer durch Adhäsion anhaftende Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachten zu können.
Gemäß der Erfindung werden also aus einer bestimmten Blutprobenmenge unter Vermeidung zusätzlicher Aktivierung Thrombozyten extrahiert, und die Thrombozy- tenfraktion wird unter Bildung einer Suspension verdünnt. Die in die Messkammer geleitete Suspension wird, z.B. bei 37°, über einen vorgegebenen Zeitraum inkubiert. Danach können die an der Kammerwand durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden. So lässt sich als charakteristische Größe die Zahl der anhaftenden Thrombozyten pro Flächen- einheit ermitteln. Unter dem Mikroskop beobachtbar sind ferner die verschiedenen Formen der Thrombozyten, welche sich je nach Aktivierungszustand einstellen. Zur Zählung der Thrombozyten und Auswertung der Formen kommen auch automatische Bildauswertverfahren in Betracht.
Somit steht ein einfacher, mit geringem Aufwand an Geräten durchführbarer Test zur Verfügung, der sich als zuverlässig erwiesen hat und Eingang in die klinische Routine finden kann. Bei geringem Probendurchsatz kann die Analyse manuell durch einen Laboranten erfolgen, bei hohem Durchsatz sind insbesondere Bildverarbeitungssysteme anwendbar. Eine komplette Automatisierung ist möglich, wenn z.B. bekannte Methoden der Probendispensierung Anwendung finden. Der Test ist geeignet, die Diagnose erblicher oder erworbener Störungen der Thrombo- zytenfunktion zu unterstützen. Ebenso eignet sich der Test, um die Wirkung von Medikamenten auf die Hämostasie, insbesondere die Thrombozyten zu untersuchen. Weitere Anwendungsmöglichkeiten ergeben sich bei der Qualitätskontrolle in Blutbanken und bei der Transfusionsmedizin. Neben Anwendungs- möglichkeiten bei der Evaluierung neuer Stoffe kann der Test auch bei der Qualitätssicherung bereits etablierter Medikamente von Bedeutung sein.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird die Suspension in einen die Messkammer umfassenden, durch den Probenträger hindurchverlaufenden Mikrokanal injiziert. Durch vollständige Ausfüllung des Mikrokanals mit der Suspension ist gesichert, dass das Probenvolumen, aus dem sich Thrombozyten an der Messkammerwand absetzen können, stets gleich ist. Es bedarf keiner genauen Abmessung einer Probenmenge. Zur Beobachtung der Thrombozyten im Hellfeld eines gewöhnlichen Lichtmikros- kops kann eine Einfärbung der Thrombozyten erfolgen, z.B. durch ein Substrat auf Tetrazoliumbasis. Alternativ können durch einen Fluoromarker, z.B. Rhodamin G6, markierte Thrombozyten im Fluoreszenzmikroskop beobachtet werden.
Vorzugsweise verläuft der die Messkammer enthaltende Mikrokanal zwischen zwei aneinander anliegenden, den Probenträger bildenden Teilen, welche zweckmäßig plattenförmig ausgebildet sind oder einen plattenförmigen Abschnitt umfassen.
In einem der Teile können zur Bildung des Mikrokanals Vertiefungen vorgesehen sein, während der andere Teil diese Vertiefungen fluiddicht abdeckt. Ein Einlαsskαnαlαbschnitt und/oder ein Auslαsskαnαlαbschnitt können/kann in Fluid- verbindung mit einem von einem der Teile vorstehenden Rohransatz stehen, an welchen sich z.B. eine Pipette ansetzen oder eine Pumpe anschließen lässt.
Alternativ kann der Einlasskanalabschnitt in Fluidverbindung mit einem an den Probenträger angeformten Gefäß für die Aufnahme der Suspension, insbesondere für die Aufnahme einer Probengesamtmenge, stehen. Die in dem Gefäß enthaltene Suspension lässt sich über eine an den Rohransatz am Ausgangkanalabschnitt anschließbare Saugeinrichtung in den Mikrokanal hineinziehen.
Vorteilhaft weist der mit dem Auslasskanalabschnitt verbundene Rohransatz am freien Ende eine Überlaufrinne auf, welche zu einem an den Probenträger angeformten Auffanggefäß führt. Überschüssiges Probenmaterial verbleibt so auf dem Probenträger und gelangt nicht in die Umwelt.
Durch den Mikrokanal kann eine Reihenanordnung aus mehreren Messkammern und auf dem Probenträger können mehrere, jeweils wenigstens eine Messkammer umfassende Mikrokanäle in paralleler Anordnung gebildet sein.
Zweckmäßig entspricht die Kontur des Probenträgers in der Draufsicht der Kontur eines gewöhnlichen Mikroskop-Objektträgers. Der Probenträger lässt sich dann wie ein solcher Objektträger problemlos im Mikroskop verwenden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die Messkam- merwand einen, vorzugsweise ebenen, Wandabschnitt auf, dessen Adhäsionsvermögen in bezug auf Thrombozyten gegenüber den an den Wandabschnitt angrenzenden Teilen der Messkammer, vorzugsweise gegenüber der gesamten übrigen Messkammerwand, erhöht ist. Auf diese Weise lässt sich sichern, dass Thrombozyten beispielsweise nur an einer von zwei zur Plattenebene parallelen Wand- abschnitten der Messkammer anhaften. Die Thrombozyten lassen sich dann ungestört durch an dem anderen parallelen Wandabschnitt anhaftende Thrombozyten beobachten.
Der Probenträger kann aus verschiedenen Materialien mit unterschiedlichem Adhäsionsvermδgen in bezug auf Thrombozyten bestehen. Insbesondere können die beiden Teile des Probenträgers im Material verschieden sein, so dass nur an einem der Teile, welcher einen der beiden zur Plattenebene parallelen Wandabschnitte der Messkammer bildet, Thrombozyten anhaften. Der genannte Wandabschnitt kann einer das Adhäsionsvermögen steigernden Oberflächenbehandlung unterzogen und umgekehrt könnte das Adhäsionsvermögen der an den genannten Wandabschnitt angrenzenden Wandteile der Messkammer durch eine entsprechende Oberflächenbehandlung herabgesetzt sein. Letztere Oberflächenbehandlung kommt vor allem für außerhalb der Messkammern liegende Abschnitte des Mikrokanals in Betracht, um dort das Anhaften von Thrombozyten zu vermeiden. Für die Teile des Probenträgers kommt neben unterschiedlichen Kunststoffen auch eine Kombination Kunststoff/Glas in Betracht. Eines der beiden Teile könnte aus einer Kunststofffolie bestehen.
Zur Steigerung der Adhäsionsfähigkeit durch Oberflächenaktivierung kommt z.B. eine Behandlung mit Sauerstoffplasma in Betracht. Die Oberflächenbehandlung kann auch in einer Beschichtung, z.B. basierend auf Siliziumoxidverbindungen, durch Plasmapolymerisation bestehen. Ferner besteht die Möglichkeit der Bildung einer Mikro- oder Nano-Strukturierung an der betreffenden Oberfläche, die hierdurch vergrößert wird.
Zur Verringerung des Adhäsionsvermögen können z.B. auf Fluorpolymeren basierende Beschichtungen aufgebracht werden.
Ein wesentlicher Vorteil der Erfindung gegenüber dem Stand der Technik besteht auch darin, dass nach erfolgter Auszählung oder/und qualitativer Bewertung der anhaftenden Thrombozyten das sich im Kanalsystem befindende flüssige Medium gegen ein sich dort verfestigendes Fixiermedium ausgetauscht werden kann, ohne dabei die anhaftenden Thrombozyten auszulösen. Das Analyseergebnis wird somit „eingefroren", lässt sich archivieren und steht für spätere Kontrollen und Einsichtnahmen zur Verfügung.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen und der beilie- genden, sich auf diese Ausführungsbeispiele beziehenden Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen:
Fig. 1 einen Probenträger nach der Erfindung in einer perspektivischen Darstellung, Fig.2 den Probenträger von Fig. 1 in einer Schnittansicht,
Fig.3 eine Schnittansicht eines Probenträgers gemäß einem zweiten Ausführungsbeispiel für die vorliegende Erfindung, und Fig. 4 eine Teilαnsicht eines Probenträgers nach der Erfindung, mit einer Messkammer und einem an der Messkammer vorgesehenen Gitternetz.
Ein Probenträger 1 aus Kunststoff besteht aus einem ersten Teil 2 mit einem platten- förmigen Abschnitt 3 und einem zweiten, in der Form einer Platte ausgebildeten Teil 4, das mit dem Plattenabschnitt 3 des ersten Teils 2 verbunden ist. Die beiden Teile 2 und 4 sind jeweils einstückig im Spritzgießverfahren aus unterschiedlichen Kunststoffmaterialien hergestellt. Beide Materialien sind durchsichtig. Das Teil 4 ließe sich auch aus einer Folie herstellen.
Zur Bildung von Mikrokanälen 20 mit jeweils drei Messkammern 5, einem Einlasskanalabschnitt 6, einem Auslasskanalabschnitt 7 sowie die Messkammern 5 verbindenden Zwischenabschnitten 8 sind in dem Plattenabschnitt 3 des ersten Kunststoffteils 2 Vertiefungen gebildet, welche durch das plattenförmige Teil 4 fluiddicht abgedeckt werden.
Das den Messkammern 5 abgewandte Ende des Einlasskanalabschnitt 6 steht in Verbindung mit einem von dem Plattenabschnitt 3 vorstehenden Rohransatz 9. Das den Messkammern 5 abgewandte Ende des Auslasskanalabschnitt 8 ist mit einem solchen Rohransatz 10 verbunden. Am freien Ende des Rohransatzes 10 befindet sich eine Überlaufrinne 11 , welche zu einem Auffanggefäß 12 führt. Das Kunststoff material des plattenförmigen Teils 4 weist ein gegenüber Thrombozyten großes Adhäsionsvermögen auf. Das Teil 2 besteht hingegen aus einem Kunststoffmaterial mit geringem Adhäsionsvermögen.
Bei der Untersuchung von Thrombozyten wird gemäß Pfeil 13 über den Rohransatz 9 eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten eingefüllt. Der Innendurchmesser des Rohransatzes 9 ist so bemessen, dass zu diesem Zweck eine Pipette angesetzt werden kann. Die Suspension tritt durch den Einlasskanalab- schnitt 6 in die erste Messkammer 5 und danach über die Kanalzwischenabschnitte 8 in die weiteren Messkammern und schließlich in den Auslasskanalabschnitt 7. Dann steigt sie in dem Rohransatz 10 hoch. Das Hochsteigen kann durch eine an den Rohransatz 10 anschließbare Saugeinrichtung, z.B. eine Pipette, unterstützt werden. Überschüssiges Probenmaterial läuft gemäß Pfeil 15 durch die Überlaufrinne 11 hindurch in das Auffanggefäß 12. Durch das Auffanggefäß 12 wird gesichert, dass die gesamte Probe auf dem Probenträger verbleibt und nicht in die Umwelt gelangt. Wegen des hohen Adhäsionsvermögens des Kunststoff- mαteriαls des plαttenförmigen Teils 4 und des geringen Adhäsionsvermögens des zur Herstellung des Teils 2 verwendeten Materials haften Thrombozyten lediglich an einem durch den plattenförmigen Teil 4 gebildeten, zur Plattenebene parallelen Wandabschnitt 16 der Messkammern 5 an.
Nach einer vorgegebenen Dauer einer z.B. bei 37°C durchgeführten Inkubation wird über den Rohransatz 9 ein Farbstoff eingefüllt, welcher die Probensuspension verdrängt und die am Wandabschnitt 16 der Messkammern 5 anhaftenden Thrombozyten einfärbt, so dass sie unter dem Mikroskop sichtbar sind.
Der in Rg. 1 und 2 gezeigte Probenträger 1 weist in der Draufsicht die Abmessungen eines Mikroskop-Objektträgers auf und lässt sich daher wie ein solcher Träger in ein Mikroskop einlegen, unter dem dann die an dem Wandabschnitt 16 durch Adhäsion anhafteten Thrombozyten beobachtet werden können. So lässt sich bei bekannter Größe des Wandabschnitts 16 leicht die Zahl der anhaftenden Thrombozyten pro Flächeneinheit ermitteln. Ferner können die Thrombozyten klassifiziert und die Häufigkeiten bestimmte Formmerkmale aufweisender Thrombozyten ermittelt werden.
Bei den nachfolgenden Ausführungsbeispielen sind gleiche oder gleichwirkende Teile mit derselben Bezugszahl wie bei dem vorangehenden Ausführungsbeispiel bezeichnet, wobei der betreffenden Bezugszahl der Buchstabe a bzw. b beigefügt ist.
Ein in Fig.3 gezeigtes Ausführungsbeispiel für einen Probenträger 1 a weist anstelle von Rohransätzen 9 Gefäße 17 zum Einfüllen einer Probengesamtmenge auf. An einen mit einem Auslasskanal 7a verbundenen Rohransatz 10a lässt sich bei 18 eine Saugpumpe anschließen, welche dafür sorgt, dass ein Messkammern 5a umfassender Mikrokanal 20a schnell vollständig mit Probenflüssigkeit ausgefüllt wird.
Bei dem Ausführungsbeispiel von Fig.4 ist eine im Querschnitt quadratische Messkammer 5b gebildet. Auf ihrer der Messkammer abgewandten Seite weist ein plat- tenförmiges Teil 4b ein Gitternetz 19 auf, welches die Zählung an einem Wandab- schnitt 16b der Messkammer 5b anhaftender Thrombozyten im Mikroskop erleichtert. Innerhalb der Kanalabschnitte 6 bis 8 kann die durch das Teil 4 gebildete Kanalwand derart behandelt sein, dass die Anhaftung von Thrombozyten vermieden ist. Fehler durch Mitzählen innerhalb der Kanalabschnitte anhaftender Thrombozyten sind so ausgeschlossen.
Die vorangehend beschriebenen Ausführungsformen weisen zwei plattenförmige Bauteile auf, die fest miteinander verbunden sind. Es wäre ferner möglich, beide Komponenten fluiddicht aber dennoch lösbar miteinander zu verbinden, z.B. mit Hilfe einer Klemmvorrichtung.
Ein Glasobjektträger könnte ein stabiles Unterteil bilden und ein darauf festgeklemmtes Oberteil die Kanäle und Messkammern aufweisen. Zur Anpassung des Adhäsionsverhaltens ließe sich die Glasoberfläche modifizieren, wozu sich nasschemische und physikalische Verfahren eignen. Vorteilhaft weist das Oberteil eine gewisse Duktilität auf und kann z.B. aus einem Elastomer oder Silikon bestehen. So lassen sich die Kanäle und Messkammern durch die Glasplatte leicht fluiddicht verschließen. Vorteilhaft bleibt im Fall einer gewünschten Archivierung ein ausgehärtetes Fixiermedium nach Lösen der Klemmverbindung auf dem Glasobjektträger, der dann wie andere Mikroskopierproben archiviert werden kann. Das Oberteil mit den Messkammern und Kanälen steht für weitere Analysen zur Verfügung.

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombozyten in eine
Messkammer (5) geleitet wird und die nach einer vorgegebenen Inkubationsdauer an der Wand der Messkammer (5) durch Adhäsion anhaftenden Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachtet werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Suspension in einen die Messkammer (5) umfassenden Mikrokanal (5-8) injiziert wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Beobachtung der Thrombozyten im Hellfeld eines Lichtmikroskops eine Färbung oder zur Beobachtung der Thrombozyten unter einem Fluoreszenzmikroskop eine Markierung der Thrombozyten mit einem Fluoro- marker erfolgt.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die an der Wand der Messkammer (5) anhaftenden Thrombozyten durch ein in der Messkammer aushärtendes Mittel fixiert werden.
5. Vorrichtung zur Untersuchung des Adhäsionsverhaltens von Thrombozyten, gekennzeichnet durch einen Probenträger (1 ), der eine Messkammer (5) für die Aufnahme einer Suspension aus einer Blutprobe separierter Thrombo- zyten aufweist, wobei der Probenträger im Bereich der Messkammer von wenigstens einer Seite her transparent ist, um an der Wand der Messkammer (5) durch Adhäsion anhaftende Thrombozyten mit Hilfe eines Mikroskops beobachten zu können.
6. Vorrichtung nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (5) einen Teil eines durch den Probenträger (1) hindurch verlaufenden, einen Einlasskanalabschnitt (6) und einen Auslasskanalabschnitt (7) umfassenden Mikrokanals (5-8) bildet.
7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrokanal (5-8) zwischen zwei aneinander anliegenden, den Probenträger bildenden Teilen (2,4) angeordnet ist.
8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens eines der Teile (2,4) eine Platte umfasst.
9. Vorrichtung nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, dass in einem der Teile (2,4) zur Bildung des Mikrokanals (5-8) Vertiefungen vorgesehen und die Vertiefungen durch das andere Teil (4) fluiddicht verschlossen sind.
10. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Einlasskanalabschnitt (6) oder/und der Auslasskanalabschnitt (7) in Fluidverbindung mit einem von einem der Teile (2,4) vorstehenden Rohransatz (9,10) steht/stehen.
1 1. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Einlasskanalabschnitt (6) in Fluidverbindung mit einem an dem Probenträger (I a) gebildeten Gefäß (17) für die Aufnahme der Suspension steht.
12. Vorrichtung nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass der mit dem Auslasskanalabschnitt (7) verbundene Rohransatz (10) über eine Überlaufrinne (1 1 ) in Fluidverbindung mit einem an dem Probenträger gebildeten Auffanggefäß (12) steht.
13. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Mikrokanal (5-8) eine Reihenanordnung mehrerer Messkammern (5) umfasst.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger (1 ) mehrere, jeweils wenigstens eine Messkammern (5) umfassende Mikrokanäle (5-8) in paralleler Anordnung aufweist.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Kontur des Probenträgers (1 ) in Draufsicht im wesentlichen der Kontur eines Mikroskop-Objektträgers entspricht.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Messkammer (5) einen, vorzugsweise ebenen, Wandabschnitt (16) aufweist, dessen Adhäsionsvermögen in bezug auf Thrombozyten gegen- über der übrigen Messkammerwand erhöht ist.
17. Vorrichtung nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass sich der Wandabschnitt (16) der Messkammerwand parallel zur Ebene der von wenigstens einem der Teile (2,4) umfassten Platten erstreckt.
18. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 5 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass der Probenträger (1 ) verschiedene Materialien mit unterschiedlichem Adhäsionsvermögen in bezug auf Thrombozyten aufweist.
19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden, den Probenträger (1 ) bildenden Teile (2,4) im Material ver- schieden sind.
20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 16 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass der Wandabschnitt (16) oder/und die daran angrenzenden Teile der Messkammerwand einer das Adhäsionsvermögen beeinflussenden Oberflächenbehandlung unterzogen sind.
21. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 6 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass das Adhäsionsvermögen der Wände des Mikrokanals (4-8) außerhalb der Messkammer bzw. Messkammern für eine Anhaftung von Thrombozyten zu gering ist.
22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 7 bis 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die den Probenträger bildenden Teile lösbar, z.B. durch eine Klemmvorrichtung, miteinander verbindbar sind.
23. Vorrichtung nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass eines der lösbar miteinander verbindbaren Teile durch eine ebene Glasplatte, z.B. einen Glasobjektträger gebildet ist und das andere Teil als Vertiefung die Messkammer aufweist.
24. Vorrichtung nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das andere Teil aus einem duktilen Material, z.B. einem Elastormer oder Silikon, besteht.
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