EP2013328A2 - Prozessanalysensystem mit steriler probenahme von mechanisch empfindlichem material aus einem bioreaktor - Google Patents

Prozessanalysensystem mit steriler probenahme von mechanisch empfindlichem material aus einem bioreaktor

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Publication number
EP2013328A2
EP2013328A2 EP07724279A EP07724279A EP2013328A2 EP 2013328 A2 EP2013328 A2 EP 2013328A2 EP 07724279 A EP07724279 A EP 07724279A EP 07724279 A EP07724279 A EP 07724279A EP 2013328 A2 EP2013328 A2 EP 2013328A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
transport
sampling valve
analysis system
sampling
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07724279A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan Steigmiller
Hans Tups
Karsten Sommer
Sonja Danstedt
Martin Schiffhauer
Sebastian Schmidt
Jörg KAULING
Arndt Braun
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Bayer AG
Original Assignee
Bayer Technology Services GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Bayer Technology Services GmbH filed Critical Bayer Technology Services GmbH
Publication of EP2013328A2 publication Critical patent/EP2013328A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/04—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by injection or suction, e.g. using pipettes, syringes, needles
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M37/00—Means for sterilizing, maintaining sterile conditions or avoiding chemical or biological contamination
    • C12M37/02—Filters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/02—Devices for withdrawing samples
    • G01N1/10—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state
    • G01N1/20—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state for flowing or falling materials
    • G01N1/2035—Devices for withdrawing samples in the liquid or fluent state for flowing or falling materials by deviating part of a fluid stream, e.g. by drawing-off or tapping
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/25—Chemistry: analytical and immunological testing including sample preparation
    • Y10T436/2575—Volumetric liquid transfer

Definitions

  • the invention relates to a sampling valve for taking samples containing mechanically sensitive material from a reactor and a process analysis system with analysis stations, in particular chromatography systems, biosensors, cell determination devices, the automated, ste ⁇ le removal of a sample from a reactor and gentle transport of the sample containing mechanically sensitive material, in particular cells to the analysis station allows.
  • Sterile sampling is a standard procedure in fermentation processes. It is the first step on the way to sample analysis to determine the condition and quality of a bioprocess and especially the resulting products. For this purpose, it has been necessary in many cases for a laboratory technician to manually take a sample. After sample delivery to a central analysis station, sample preparation, i. the biomass separation and aliquoting, and finally the analysis on several different analyzers. The analysis results are printed out to document product quality and manually entered into databases and recorded. In addition, appropriately marked restoring patterns are stored for later detection procedures at low temperatures. The analysis results are checked in quality assurance in order to release the product obtained in a bioprocess or to discard it due to quality deficiencies. All of these steps are very resource-intensive and therefore entail high costs. The control and regulation of the process in the reactor usually takes place after manually entering the analysis results obtained. A complete automation of the process control and regulation is therefore not possible.
  • a process chromatography for Bioapphkationen is described in US 2004259241 Al (Groton Biosystems).
  • the described apparatus for sampling is limited to bioreactors on a laboratory scale, as not ste ⁇ hsierbar with steam, which is the usual Ste ⁇ hsationsmethode in production.
  • Dionex Corporation also offers the process chromatograph DX-800 (product brochure "DX-800 Process Analyzer, Process Analytical Liquid Chromatography”), which can be used for process control of bio-aphcations, providing automated chromatography but no sampling.
  • this system is limited to the analysis of cell-free media.
  • the two systems are designed to determine several parameters, but they do not provide an integrated sampling solution, especially shear-sensitive material such as cells and materials also no control and regulation of a bioprocess over the obtained data, since important automation units are missing for the connection to a process control system.
  • Sampling devices and in particular sampling valves for bioprocesses for the removal of biological material and in particular cells are known in the art and some even commercially available.
  • WO 1990012972 A1 by the company Keof ⁇ tt a / s describes a sampling valve, which consists of two parts - a valve body, and a valve head. Within the valve body, two ports are connected by an annular channel around a rubber diaphragm. This design allows the valve to be sterilized before and after use.
  • WO 2004044119 A1 of the Sarto ⁇ us BBI Systems GmbH describes a coolable sampling valve with a cylindrical flow channel and a plunger to block the flow channel, wherein the walls of the sampling valve from a Mate ⁇ al germangerer strength usually made of metal, in particular stainless steel, to rapid cooling of the valve, for example to allow for Dampfste ⁇ lisation.
  • WO 1990012972 A1 and WO 2004044119 A1 do not describe the transport of the sample taken.
  • the disadvantage of the two abovementioned sampling valves from WO 1990012972 A1 and WO 2004044119 A1 is that both metal-metal contact interfaces are located between the head of the sampling valve and the bioreactor.
  • the sampling valve which causes a local heating of the medium in the bioreactor in a Dampfste ⁇ lisation the sampling valve, so that at the place of sampling increased cell aggregates may occur (so-called Biofouhng).
  • Such aggregates which are also produced in the normal operation of a bioreactor, can be swirled up when opening the sample-free sampling valves and enter the valve. To avoid blockages, transport lines with relatively large diameters are therefore necessary for the transport of the removed cell suspension.
  • the volume of the sample is determined solely by adjusting the opening time of the sampling valve. The solution does not allow the precise acquisition of a predefined volume and in particular a small volume. Moreover, so far no sample transport of a small cell-containing volume over a longer distance is known, without that this sample is further falsified during transport, for example by sedimentation during transport or destruction of cells by shearing.
  • a first subject of the present invention is a sampling valve which can remove a sample of a defined volume, in particular of biological material, and in particular living cell material under reduced mechanical stress, in particular by shearing forces.
  • a particular embodiment of the sampling valve has a preferably cylindrical sample chamber defined volume limited by a front and a rear sealing element.
  • the front sealing element is actuated by a connecting shaft.
  • the front sealing element m is opened in the direction of the interior of the bioreactor and the rear sealing element is closed against the sample chamber. In this open valve state, the air bubble trapped in the sample chamber escapes into the reactor, with a sample of defined volume flowing from the bioreactor into the sample chamber.
  • the rear sealing element limits the volume of the sampling and allows the removal of a defined volume.
  • the closing force can be achieved by biasing a spring, preferably a spiral spring, from a pressure plate via a connecting rod to the rear one Sealing element are transmitted, which seals via surface pressure by means of a sealing device, preferably an O-ring, against a valve stem.
  • the bias voltage is usually set to a differential pressure between the sample chamber and the reactor of at least + 1.5 bar. Underpressure or vacuum in the bioreactor leads to the said spring preload so little to an unintentional valve opening as compared to the external pressure increased internal pressure in the reactor (eg autoclaving), which can additionally strengthen the closing force in the same direction of force.
  • the sampling valve is preferably opened by actuation of a lifting cylinder.
  • a control which can be pneumatically (control via compressed air) or electrically (via a pulse) preferably pneumatically, closes the valve in fractions of a second after the issuing of the closing command, this small delay secures the exact volume of the sample.
  • a control which can be pneumatically (control via compressed air) or electrically (via a pulse) preferably pneumatically, closes the valve in fractions of a second after the issuing of the closing command, this small delay secures the exact volume of the sample.
  • For secure positioning of the sealing surfaces can serve a mounted on the connecting shaft guide rod.
  • a membrane On this guide rod usually a membrane is attached, which can be held squeezed between two holding plates.
  • the pressure force on the guide rod leads to the deflection of the membrane, which hermetically seals the sample chamber and a rear valve interior against the environment.
  • the rear valve interior to reduce the membrane load has a relation to the sample chamber enlarged diameter.
  • the sampling valve on the probe head (the opening to the reactor) is protected by a self-cleaning filter, so that no larger aggregates can get into the sample chamber and into the transport line.
  • the width of the pores of this filter is usually 0.02 ⁇ m to 2 mm, but preferably 0.45 ⁇ m to 1 mm.
  • the filter has a cavity which is filled from inside by a cap around the front sealing element, in the closed state, i. The pores are closed by the cap from the inside. The cap is moved out in the open state in the direction of the reactor, so that forms an open area.
  • the membrane preferably consists of a material which is resistant to water vapor, preferably EPDM, silicones, HNBR or PFR plastics.
  • the probe head preferably consists of a plastic approved for pharmaceutical applications, preferably of PVDF, PEEK or POM, which has a lower thermal conductivity than stainless steel and adhere to the cells particularly bad. So there is no metal-metal interface with the connected bioreactor, so that a local heating of the bioreactor and Fouling layers on the sealing device, which is preferably an O-ring can be avoided during the cleaning process, for example in a steam sterilization.
  • the sampling valve according to the invention is usually analogous to standard probes e.g. installed by means of a screw in standardized fermenter neck, preferably with the diameter of DN25, usually with the aid of a sealing device, preferably with a so-called O-ring.
  • a downwardly inclined installation of the sampling valve to the bioreactor wall is advantageous.
  • Favorable installation angles are between 0 ° and 90 ° to the horizontal, preferably between 1 ° and 15 °.
  • the cylindrical sample chamber can be mounted inclined even against the nozzle axis, preferably between 1 ° and 15 ° to the horizontal.
  • the sampling valve according to the invention can be tempered if necessary, preferably for this purpose, the sampling valve is sheathed and tempered with a Peltier element.
  • the path to a connected transport line is released.
  • the sample is then assayed as a substantially contiguous plug to the target site, e.g. a sample preparation and / or analysis station transported.
  • gas or liquid are usually introduced via an addition opening and a channel and slowly displace the sample from the sample chamber into a rear valve interior and to a discharge connection.
  • the addition opening can be protected by a valve, preferably a check valve.
  • the sampling valve is usually coupled to transport and supply lines, in particular cleaning lines.
  • the coupling is preferably carried out by autoclaving and steam sterilizable quick-release couplings, which have a locking mechanism in the decoupled state, which protects the sterile inner surfaces of the two coupling pieces from contamination.
  • a cock is integrated between the sampling valve and the transport line, preferably a three-way cock, with which a sample can be manually can be removed, which preferably has a control unit and can be controlled decentrally.
  • a further subject matter of the present invention is a process analysis system which has at least one apparatus for taking a sample from a reactor, a sample transport device and at least one sample analysis station, which allows a volume of sample material to be removed from the reactor and transported to the analysis station, wherein the sample material is a suspension of mechanically sensitive, in particular shear-sensitive material, which is subjected to reduced mechanical stress, in particular reduced shear forces.
  • the volume is precisely defined and / or free of aggregates.
  • Mechanically sensitive, in particular shear-sensitive material in the sense of the present invention is, in particular, biological material, such as e.g. Cells, Bakte ⁇ en, unicellular fungi such as yeasts, viruses, agglomerates of protein precipitates, Protemk ⁇ stalle, native proteins, antibodies, liposomes and especially living tie ⁇ sche and / or plant cells.
  • biological material such as e.g. Cells, Bakte ⁇ en, unicellular fungi such as yeasts, viruses, agglomerates of protein precipitates, Protemk ⁇ stalle, native proteins, antibodies, liposomes and especially living tie ⁇ sche and / or plant cells.
  • the process analysis system usually has at least one device for sampling and sample transport connected to at least one sample preparation and / or sample analysis station.
  • the device for automatic sampling is a sampling valve according to the invention.
  • the process analysis system usually controls at least one sample analysis station and has a connection to an automation system, preferably a process control system or programmable logic controllers for guiding, controlling and / or regulating the process in a reactor and in particular a bioreactor.
  • an automation system preferably a process control system or programmable logic controllers for guiding, controlling and / or regulating the process in a reactor and in particular a bioreactor.
  • the sampling and Probenentransportvor ⁇ chtoder, the sample preparation and the process analysis station are modular.
  • the sample preparation station typically includes sample valves, reservoirs, burettes, valves, valves, metering valves, and the like, which are interconnected by transport lines and allow treatment of the sample in one or more ports.
  • the process analysis system preferably has at least one sample preparation station.
  • the Sch ⁇ tte required for the use of the sample for the analysis are carried out, such as dilution, addition of internal standard, addition of stabilizers (eg Glycerm), marker or detergent, tempering before- Cooling to 4 to 37 0 C, pH adjustment, stripping, Umpuff für für, filtration or De ⁇ va- üstechnik.
  • sensors such as pH electrode, conductivity probe, sensors for measuring the optical density, turbidity, pressure, temperature, flow are called.
  • the process analysis system includes a sensor-controlled test of the sample which examines whether the properties of the sample (e.g., cell density) are compatible with the given workflow and, in particular, the usage instructions of a required analyzer. Is e.g. If the cell density is too high, an analyzer can become clogged. In addition, the cell density may be outside the range of the analyzer. In this case, the sample is diluted by means of a sensor control until a reliable quantification of the sample is possible. If, in the opposite case, the cell density is too low for a quantification, a sample concentration program is started under sensor control.
  • the properties of the sample e.g., cell density
  • the sample preparation station preferably has a central collecting vessel in which a sensor for monitoring the sample is integrated in order to regulate and / or control the work-up of the sample in the sample preparation station. If the sample is very diluted, a concentration program is started; if the concentration is too high, a dilution step is initiated. This will prevent measurements from being made on samples or aliquots that are outside the measurement range, specifications, and / or validated area of the analysis station.
  • this type of sample preparation can be used to prepare the sample so that an exact analysis in an analyzer in the most sensitive range can be performed. This allows a more sensitive determination of parameters over a larger concentration span of the sample and thus an improved control of bioprocesses.
  • the sampling device and the sample analysis stations are connected via transport lines to the sample preparation stations.
  • This modular structure has the particular advantage that the automatic sample preparation for different analyzers can be configured without much effort.
  • the sample is divided into several aliquots in an aliquoting station. These aliquots either pass through one sample preparation station in succession, alternatively they are transported in parallel to several sample preparation stations and are processed there differently.
  • the aliquoting is carried out after sample preparation such as filtration, decantation, concentration or dilution.
  • the process analysis system has a central sample preparation station that passes through the aliquots one at a time.
  • sample preparation After sample preparation, the sample or aliquot is transported to the various sample analysis stations through the transport lines.
  • the process analysis system preferably has self-monitoring, which records and monitors the properties of the sample, preferably temperature, pressure, pH, flow, optical density, conductivity, turbidity, in at least one of the various modules.
  • the transport of the sample and in particular flow, optical density or turbidity in the transport lines is monitored and controlled in order to prevent clogging of the lines.
  • the process analysis system is designed to be in a safe condition in the event of a power outage or malfunction that prevents the contents of connected bioreactors from being contaminated.
  • the sample analysis station may include a variety of sample analyzers (analyzers), e.g. Cell counter, biosensors, spectroscopy systems, chromatography systems such as HPLC, ion, affinity and / or gel permeation chromatography systems, which serve to examine the sample or aliquots.
  • sample analyzers e.g. Cell counter
  • biosensors e.g., biosensors
  • spectroscopy systems e.g. Cell counter
  • chromatography systems such as HPLC, ion, affinity and / or gel permeation chromatography systems
  • HPLC ion, affinity and / or gel permeation chromatography systems
  • the sample analyzer performs biochemical analysis of reaction products or minor components.
  • Reaction products are usually the proteins to be prepared, while examples of secondary components are cell state parameters such as mentimine, lactate dehydrogenase or DNA.
  • biosensors are incorporated for the control of nutrients and metabolic products such as glucose and lactate.
  • biofunctional surfaces such as microtiter plate, glass, biosensor, bead or magnetic bead surfaces are preferably biologically, chemically or biochemical recognition elements such as DNA, RNA, aptamers, receptors to which an analyte specifically binds upon detection by a recognition reaction.
  • biochemical analysis using biochemical recognition elements can also be carried out in homogeneous formats in solution, for example in the context of homogeneous time-resolved fluorescence (HTRF).
  • the biochemical recognition elements are coupled with signal-generating molecules such as fluorescent dyes or nanoparticles.
  • recognition reactions are the binding of ligands to complexes, the complexation of ions, the binding of ligands to (biological) receptors, membrane receptors or ion channels, of antigens or haptens to antibodies (immunoassays), of substrates to enzymes, of DNA or RNA to specific proteins, aptamers or aptmer to their targets, the hybridization of DNA / RNA / PNA or other nucleic acid analogues (DNA assays) or the processing of substrates by enzymes.
  • the method of the polymerase chain reaction (PCR) particularly preferably the method of kinetic PCR, can be used with advantage.
  • signal amplification for immunoassays can advantageously be used the method of immuno-PCR.
  • analytes to be detected are DNA, RNA, PNA, nucleic acid analogs, enzyme substrates, peptides, proteins, potential drugs, drugs, cells, viruses.
  • recognition elements to which the analytes to be detected bind are DNA, RNA, PNA, nucleic acid analogs, aptamers, spiegelmers, peptides, proteins, complexing agents for metals / metalhones, cyclodextrins, crown ethers, antibodies or their fragments, anticalme, enzymes , Receptors, Membrane Receptors, Ion Channels, Cell Adhesion Proteins, Ganghosides, Mono- or Oligosaccharides.
  • the detection of the detection reaction of the biochemical detection system can be carried out by using optical, electrical, mechanical or magnetic signal conversion methods. Particular preference is given to optical methods such as chemo-cumimensis, electrochemiluminescence, absorption detection of an enzymatically induced color change, fluorescence detection of a enzymatically induced turnover of a fluorogenic substrate, alpha screen or homogeneous time-resolved fluorescence.
  • Alpha Screen stands for a homogeneous detection method in which light-induced smglet oxygen is produced on a first bead, which after diffusion to a second bead, which is coupled to the first bead via a biochemical binding reaction, stimulates the chemiluminescence.
  • an autosampler which collects samples and cools.
  • this modular structure is also reflected in the control program of the process analysis system.
  • a driver software with local operation is preferably stored in a decentralized control and supply unit for each module.
  • the control program of the automation unit accesses this driver software in order to carry out the steps of sterile sampling, automatic sample preparation, analysis and cleaning according to a user-defined workflow.
  • the control and supply unit ensures and regulates the supply of compressed air, steam, cleaning fluids and transport fluids to the sampling valve through the supply and transport lines.
  • a plurality of reactors in particular bioreactors, are operated, which operate independently of one another.
  • Each sampling device can be controlled remotely via its own control unit and thus independently.
  • the process analysis system has a decentralized automation unit with on-site operation on each sampling device, which are coupled to the central PLC via all standard bus systems. This makes it easy to switch off and on individual units.
  • the sequence of the control program is defined by user-definable parameters.
  • the user can select modules available via a graphical user interface of a standard personal computer and select actions to be performed by them.
  • sequence sequences for sampling, sample preparation and sample analysis can be defined in tabular form with the aid of the modules.
  • the parameters describing this procedure are then exported from a PC and transmitted to the control unit of the control system. There, these parameters determine the program sequence of the control program. The parameters thus determine the sequence in which the control program calls individual driver programs as well as the control parameters which the control program sends to the driver software in order to cause a specific module to perform a specific action.
  • an automation component such as a Simatic S7 from Siemens AG.
  • Such an automation component is designed for trouble-free continuous use in an industrial environment and therefore can not "crash” like a conventional PC, in which case the PC, with the aid of which the user enters the sequence, and the control unit during operation of the PC That is, after the parameters defining the program flow have been transferred from the PC to the control unit, the PC can be disconnected from the control unit, thereby enabling operation of the control unit independently of the PC.
  • a further element of the process analysis system according to the invention is the transport device whose task is to forward the sensitive sample of a defined volume from the sampling device to the preparation or analysis station smoothly, without clogging and lossless.
  • the transport device usually has transport lines, and at least one system for smooth acceleration of the sample or aliquots through the transport lines.
  • the subject of the present invention is therefore also a transport device for transporting suspensions containing mechanically sensitive material and in particular ivy cells, comprising transport lines and at least one system for accelerating the sample or aliquots through the transport line from at least two burettes, wherein the burets following steps are operated ' a) a first burette is raised,
  • the burets are connected to at least one valve terminal to the transport lines, the burettes and valve terminal are controlled by the automation system, so that an accurate adjustment of the transport speed is guaranteed.
  • suspensions of mechanically sensitive material and in particular of living cells adherence to a defined transport speed is preferred because the material at too high transport speed, for. due to shearing forces and could sediment at too low transport speed in the horizontal laid pipe.
  • the transport is preferably carried out pneumatically or with liquids.
  • the burettes also ensure the aliquoting of the sample.
  • cell separation can be accomplished via filtration by adjusting the pore size of the filter directly on the probe head of the sampling valve.
  • the sample may be filtered in the preparation station or collected in a vessel to sediment there. After sedimentation can from the supernatant a cell-poor Sampled, filtered and fed to an analyzer.
  • a filterless and therefore low-maintenance alternative is the sample transport at a speed of ⁇ 1 m / mm. In the case of lines longer than 5 m, all cells in the pipeline sediment during transport, so that a cell-free sample can be collected in a sample vessel, which does not have to be further filtered for further processing.
  • the transport lines can be tempered, preferably with a Peltier element, to a temperature between 0 0 C and 100 0 C, preferably between 4 ° C and 37 ° C.
  • a temperature control over a heated double sheathed cable is realized.
  • the sample transport device has two burettes, which are each connected by a valve island to the transport lines, which in turn connected to one or more sampling valve, the preparation or analysis stations and sources for air or transport and / or cleaning fluids are.
  • the transport lines preferably have at least one control unit, which in particular monitors and controls flow, pressure, optical density or turbidity in the transport lines in order to prevent clogging of the lines.
  • the sampling valve can be autoclaved together with the reactor, in particular bioreactor, and its supply lines are closed by means of silicon compounds.
  • the device for sampling and sample transport is preferably cleaned with steam, sterilized water or sterilizing solutions.
  • the sampling valve and the transport line are preferably rinsed with steam and heated to temperatures usually between 100 to 135 ° C to remove any cell debris and sterilize the system and clean.
  • the cleaning can also be done with sterile water or sterilizing rinse solution.
  • sterile, dry air is typically delivered through the sampling valve and conduit to cool and dry the sample transport system.
  • the sampling valve at the rear valve interior additionally has an attached auxiliary connection, which serves for better in-situ cleanability of the sampling process.
  • the auxiliary connection can be used to ensure that no air bubble that is unfavorable for cleaning and thus a dead space forms in the upper part of the rear valve interior.
  • the device for sampling and sample transport and especially the sampling valve and transport line are thoroughly cleaned with Clean-m-place media and dried with ste ⁇ ler air. It is important to rinse thoroughly with demineralized water at the last clean-in-place or sterilization-in-place cleaning cycle to prevent the formation of deposits on the areas in contact with the product during the subsequent drying process.
  • the present invention enables a fully automated sample analysis including sterile sampling, transport, preparation and analysis under sterile conditions with integration of the obtained analysis values by direct connection to a process control system and / or a PLC for controlling and controlling the process.
  • a process control system and / or a PLC for controlling and controlling the process.
  • the removal of small, defined sample volumes and gentle transport, in particular cell-containing samples, possibly cell separation and liquid sample preparation and analysis are guaranteed.
  • the present invention allows for flexible workflow design and automatic adjustment of sample preparation or aliquoting to the requirements of both the workflows and the analyzers available in the system.
  • bioprocess process analysis system Another major advantage of the bioprocess process analysis system described here is the ability to control multiple bioreactors that operate independently of each other. Each valve can be controlled decentrally and thus independently. Furthermore, it is conceivable to operate several reactors, which work with different cell lines and produce different products, with a single process analysis system and thus particularly cost-effectively, since a sophisticated cleaning management prevents the mutual contamination of the individual bioreactors.
  • Fig. Ia Sampling valve in the open state on a bioreactor
  • Fig. Ib Sampling valve in the closed state on a bioreactor
  • Fig. 2 Side view of the sampling valve in the open state
  • Fig. 3a Downwardly inclined installation of the sampling valve
  • Fig. 3b horizontal installation of the sampling valve with inclined to the nozzle axis
  • Fig. 3c 90 ° downwardly inclined installation of the sampling valve
  • Fig. 4 Connection of several bioreactors to a central analysis station
  • Fig. 5 sample transport, preparation and analysis and control and regulation of a
  • Fig.la shows the in a bioreactor (1) built open sampling valve (2) with a sample chamber (3) defined volume into which the sample initially flows when valve opening.
  • the rear sealing element (17) limits the volume of the sampling and allows the removal of a small, defined volume.
  • the front sealing element (16) prevents further liquid from flowing out of the bioreactor into the sampling valve.
  • Fig. Ib After closing the valve (Fig. Ib), the path to a connected transport line (4) is released.
  • the sample is then transported as a substantially continuous plug (6) to the target site (7), a central sample preparation and / or analysis station.
  • the preferred use of two burettes (8) allows, by suitable interaction, a continuous transport speed and thus particularly gentle and loss-free transport through the line.
  • the cell suspension is collected in a sample vessel.
  • the sampling valve (2) is installed analogously to standard probes by means of a screw connection (27) into standardized fermenter stubs (14) with the diameter of DN25.
  • the sampling valve (2) is closed in the energy-free state to the reactor chamber with a sealing, rear sealing element (16).
  • the closure force is transmitted by biasing the spring (15), preferably a coil spring, from the pressure plate (21) via the Verbmdungsstange (18) on the rear sealing element (17).
  • the rear sealing element (17) seals via surface pressure by means of a sealing device (30), preferably an O-arm, against the valve stem (42).
  • the air bubble enclosed in the sample chamber (3) escapes into the bioreactor (1), with a sample of defined volume flowing from the bioreactor into the sample chamber (3).
  • the sampling valve is replaced by a self-cleaning filter (39) protected, so that no larger aggregates can get into the sample chamber (3) and in the transport line (4).
  • This filter (39) surrounds part of the probe head and prevents aggregates from entering the valve.
  • the width of the pores (43) of the filter is 0.5 mm to 2 mm, preferably 1 mm.
  • a filter surface with a pore width of 0.02-2 ⁇ m, preferably 0.45 ⁇ m, can be used.
  • a cap (41) has moved out in the open state in the direction of the fermenter, so forms an open area. Some pores (43) are shown as white boxes, through which a sample can enter the valve from all directions. After relieving the Hubzylmders (22) via a control (33), which is pneumatic, the valve closes. The cap (41) is moved in the direction of the valve and fills the cavity of the filter (39) from the inside, ie the pores (43) are closed by the cap (41) from the inside.
  • the guide (34) mounted on the connecting shaft serves to secure the sealing surfaces. For sample transport, gas or liquid is introduced via the feed opening (24) and an inlet channel (31) and slowly displaces the sample from the sample chamber (3) into the rear valve chamber (36) and to the outlet pipe (25).
  • the addition opening is protected by a valve (35), preferably a non-return valve.
  • the additional valve crevices (36) additionally attached auxiliary cusps (26) serves for better m-situ cleanability.
  • the rear Ventilmnenraum (36) has a relation to the sample chamber (3) has an enlarged diameter to reduce the membrane load.
  • the auxiliary connection (26) ensures that no unfavorable for the cleaning air bubble and thus a dead space in the upper part of the rear Ventilmnenraums (36) form.
  • the sample is fed under gas pressure or with a liquid via a drainage spigot (25) into the transport line (4).
  • Fig. 3a shows a preferred embodiment with downwardly inclined installation of the sampling valve (2) to the bioreactor wall.
  • Fig. 3b shows a further preferred embodiment of the valve, wherein the cylindrical sample chamber (3) is mounted inclined even against the nozzle axis.
  • Fig. 3c shows a further preferred embodiment of the valve with a 90 ° downwardly inclined installation of Probe Spotifyventiis (2) on the bioreactor wall.
  • sampling valve 4 shows a possibility of coupling the sampling valve to the line system, consisting of supply, remaning and transport line by autoclaving and steam-adjustable quick-release couplings (37), which have a closing mechanism in the decoupled state, the sterile inner surfaces the two coupling pieces (38) protects against contamination.
  • the sample is transported to a central sample preparation and / or sample analysis station (7).
  • bioreactors can be controlled, which operate on each other depending on each other.
  • Each valve can be controlled decentrally and thus independently.
  • the process analysis system has a decentralized control and supply unit (46) with decentralized local operation (47) on each sampling system. This communicates via a central automation unit (48).
  • the decentralized control and supply unit (46) regulates the supply of compressed air, steam, cleaning fluids and transport fluids.
  • a control unit (49) is integrated in the transport line between the sampling system (2) and a three-way cock (44).
  • the three-way cock (44) allows manual sampling (50).
  • Two burettes (51, 52) are controlled by the automation system to ensure the transport and aliquoting (70) of the sample.
  • the sample is transported to a central collection vessel (53).
  • a probe (54) characterizes the sample
  • a stirrer (55) is additionally integrated.
  • a signal is sent to the automation system to decide whether the sample can be further diluted, concentrated or untreated for further processing.
  • the sample is distributed to different analyzers: an unfiltered sample is analyzed in a cell number determiner (56) or in analyzer 1 (57). Another portion of the sample passes through a filter (62) and is distributed to analyzer 2 (58), chromatography (59) and / or biosensor (60).
  • Fig. 6 shows a flowchart. After sampling from the bioreactor, the entire sample is gently transported to a central collection vessel. In a preliminary examination, a sensor characterizes the sample. If the concentration is too high, a sensor-controlled sample dilution program will be started. This is repeated until the sample is in the desired concentration range. Thereafter, the sample preparation program is started and the sample is measured in the various analyzers. The analysis results are transferred to a process control system. After completion of all measurements, the steam sterilization and the cleaning of the valve and the lines started. The process control system uses the analysis results to adjust the process.
  • a 12 ml sample of SF9 insect cells was removed from a bioreactor using the sample valve according to the invention and transported through a tube (1.5 mm inner diameter, 10 m length) at a speed of 3 m / min in the sample analysis system according to FIG.
  • a sample was taken by hand from the bioreactor and measured, a sample was taken with the sampling valve, transported by the sample transport device in and measured.
  • the CEDEX analyzer Innovatis company
  • the cell determination station 56
  • the aid of the analyzer CEDEX it was found that the reuse rate of the cells was> 90%. This proved the applicability of the sample analysis system according to the invention for the removal and transport of living cells.
  • a 10 ml sample of hybridoma cells was produced by means of the inventive sampling valve, which produce antibodies for the control of tumors, and through a tube (1.5 mm inner diameter, 5 m length) at a speed of 3 m / min in the Pro analysis system according to Fig. 5 transported.
  • One sample was removed by hand from the bioreactor and measured, another sample was taken with the sampling valve, transported by the sample transport device in the process analysis system and measured.
  • the analyzer CEDEX Innovatis AG
  • the cell determination station 56) with the aid of the analyzer CEDEX, it was found that the recovery rate of the cells was> 95%. This proved the applicability of the sample analysis system according to the invention for the removal and transport of living cells.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Probenahmeventil zur sterilen Entnahme von Proben enthaltend mechanisch empfindliches Material aus einem Bioreaktor sowie ein Prozessanalysesystem mit Analysestationen insbesondere Chromatographiesysteme, Biosensoren, Zellbestimmungsgeräte, das eine automatisierte, sterile Entnahme einer Probe aus einem Bioreaktor und das schonende Transport der Probe enthaltend mechanisch empfindliches Material insbesondere Zellen zur Analysestation ermöglicht.

Description

Prozessanalysensystem mit steriler Probenahme von mechanisch empfindlichem Material aus einem Bioreaktor
Die Erfindung betrifft ein Probenahmeventil zur Entnahme von Proben enthaltend mechanisch empfindliches Material aus einem Reaktor sowie ein Prozessanalysesystem mit Analysestationen insbesondere Chromatographiesysteme, Biosensoren, Zellbestimmungsgeräte, das eine automatisierte, steπle Entnahme einer Probe aus einem Reaktor und schonenden Transport der Probe enthaltend mechanisch empfindliches Material insbesondere Zellen zur Analysestation ermöglicht.
Die steπle Probennahme ist eine Standardprozedur bei Fermentationsprozessen. Sie ist der erste Arbeitsschritt auf dem Weg zur Probenanalyse, um den Zustand und die Qualität eines Bioprozesses und besonders der daraus hervorgehenden Produkte festzustellen bzw. nachzuweisen. Hierzu ist es bislang in vielen Fällen erforderlich, dass em Laborant manuell eine Probe entnimmt. Nach der Probenauslieferung an eine zentrale Analysenstation erfolgen eine Probenvorbereitung, d.h. die Biomasseabtrennung und Aliquotierung, und schließlich die Analyse auf mehreren unterschiedlichen Analysegeräten. Die Analysenergebnisse werden zur Dokumentation der Produktqualität ausgedruckt und manuell in Datenbanken eingegeben und festgehalten. Außerdem werden entsprechend gekennzeichnete Rückstellmuster für spätere Nachweisverfahren bei tiefen Temperaturen eingelagert. Die Analyseergebnisse werden in der Qualitätssicherung geprüft, um das bei einem Bioprozess gewonnene Produkt freizugeben oder aufgrund von Qualitätsmangeln zu verwerfen. All diese Schritte sind sehr personalmtensiv und verursachen demzufolge hohe Kosten. Die Steuerung und Regelung des Prozesses im Reaktor erfolgt üblicherweise nach manueller Eingabe der gewonnenen Analyseergebnisse. Eine komplette Automatisierung der Prozesssteuerung und Regelung ist daher nicht möglich.
Zur Reduzierung des Personalbedarfes sind inzwischen auf dem Markt zahlreiche automatisierbare Einzelkomponenten, z.B. steπle Probeentnahmevorπchtungen, Pipettiersysteme und Analyseautomaten verfügbar. Eine vollständige Automatisierung der Probenentnahme und -analyse scheitert jedoch am bisher ausschließlich durch Personalemsatz durchführbaren Probentransport von der Produktionsstätte in ein separates Labor für die Qualitätskontrolle und dem dadurch hervorgerufenen Bruch m der Automatisierungskette. Desweiteren erhält man bei einer Laboranalyse keine zeitnahen Informationen, welche eine Steuerung des Prozesses erlauben würden.
Eine automatische Prozessanalyse, -Steuerung und -regelung - insbesondere durch Prozesschromatographie - in der Chemie und im Polymerbereich, wo keine besonderen Anforderungen an Steπhtät gestellt werden, ist in EP 1439472 Al beschrieben. Die beschriebene Lösung erfüllt die Anforderungen der Behandlung von mechanisch empfindlichem Mateπal insbesondere biologischem Mateπal und insbesondere von lebendigen Zellen nicht. Das beschriebene Prozessanalysesystem ist für die meisten Bioapphkationen ungeeignet.
Eine Prozesschromatographie für Bioapphkationen ist in US 2004259241 Al (Firma Groton Biosystems) beschrieben. Die beschriebene Vorrichtung zur Probenahme ist auf Bioreaktoren im Labormaßstab beschränkt, da nicht mit Dampf steπhsierbar, was in der Produktion die übliche Steπhsationsmethode ist. Ferner bietet die Firma Dionex Corporation den Prozess-Chromatographen DX-800 (Produktbroschüre „DX-800 Process Analyser, Process Analytical Liquid Chromatography") an, der zur Prozesskontrolle von Bioapphkationen betrieben werden kann. Dieses System bietet eine automatisierte Chromatographie aber kein Probenahme an, das höchsten steπlen Anforderungen der Steπlisationstechnik an Bioreaktoren entspπcht. Dieses System ist darüber hinaus auf die Analyse zellfreier Medien begrenzt. Beide Systeme sind auf die Bestimmung von mehreren Parametern konzipiert. Sie bieten jedoch keine integrierte Lösung einer Probenahme, insbesondere von scherempfindliches Mateπal wie z.B. Zellen und auch keine Steuerung und Regelung eines Bioprozesses über die gewonnenen Daten, da wichtige Automatisierungseinheiten zur Anbindung an em Prozessleitsystem fehlen.
Ein weiterer gemeinsamer Nachteil der beiden zuletzt beschriebenen Systeme für biotechnologische Applikationen ist neben der fehlenden Möglichkeit der Dampfsteπlisation die Einschränkung, dass diese nur für die Probenvorbereitung für eine spezielle Bio-Chromatographie geeignet sind. Solche Systeme sind nicht flexibel auch für andere Analyseverfahren einsetzbar, sondern aus- schließlich für die jeweils beschriebene Bio-Chromatographie verwendbar.
Probenahmevorrichtungen und insbesondere Probenahmeventile für Bioprozesse zur Entnahme von biologischem Material und insbesondere Zellen sind als Stand der Technik bekannt und einige sogar kommerziell erhältlich. z.B. WO 1990012972 Al von der Firma Keofϊtt a/s beschreibt ein Probenahmeventil, das aus zwei Teilen - einem Ventilkörper, und einem Ventilkopf - besteht. Innerhalb des Ventilkörpers sind zwei Anschlüsse durch einen ringförmigen Kanal um eine Gummimembran verbunden. Diese Konstruktion ermöglicht es, das Ventil vor und nach der Verwendung zu sterilisieren. WO 2004044119 Al von der Sartoπus BBI Systems GmbH beschreibt ein kühlbares Probenahmeventil mit einem zylindrischen Strömungskanal und einen Stößel zur Sperrung der Strömungskanal, wobei die Wände des Probenahmeventils aus einem Mateπal geπngerer Stärke üblicherweise aus Metall, insbesondere Edelstahl sind, um eine schnelle Kühlung des Ventils z.B. nach einer Dampfsteπlisation zu ermöglichen. WO 1990012972 Al und WO 2004044119 Al beschreiben den Transport der entnommenen Probe nicht. Nachteil der beiden o. g. Probenahmeventile aus WO 1990012972 Al und WO 2004044119 Al ist, dass beide Metall-Metall- Berührungsschnittstelle zwischen dem Kopf des Probenahmeventils und dem Bioreaktor aufwei- sen, die bei einer Dampfsteπlisation des Probenahmeventils eine lokale Erwärmung des Mediums im Bioreaktor verursacht, so dass am Ort der Probenahme vermehrt Zellenaggregate auftreten können (so genanntes Biofouhng). Solche Aggregate, die auch im Normalbetπeb eines Bioreaktors entstehen, können beim Öffnen der beschriebebenen Probenahmeventile aufgewirbelt werden und in das Ventil gelangen. Um Verstopfungen zu vermeiden, sind deshalb für den Transport der entnommenen Zellsuspension Transportleitungen mit relativ großen Durchmessern nötig. Außerdem wird das Volumen der Probe ausschließlich durch die Einstellung der Öffnungszeit des Probenah- meventils bestimmt. Die Lösung ermöglicht die präzise Aufnahme eines vordefϊnierten Volumens und insbesondere eines kleinen Volumens nicht. Darüberhinaus ist bisher kein Probentransport eines kleinen zellhaltigen Volumens über eine längere Strecke bekannt, ohne dass bei dem Transport diese Probe z.B. durch Sedimentation beim Transport bzw. Zerstörung von Zellen durch Scherung weiter verfälscht wird.
Es bestand daher Bedarf, ein automatisches flexibles Prozessanalysesystem zur Steuerung und Regelung von Bioprozessen mit integrierter Anbindung an Automatisierungssysteme bereitzustel- len, das eine Probenahme, schonenden Probetransport und Probevorbereitung kiemer Probevolumina, die mechanisch empfindliches Material wie biologisches Mateπal und insbesondere lebendige Zellen enthalten, ermöglicht, in das eine klassischen Biochromatographie und / oder weitere Analysatoren integriert werden können. Das Prozessanalysesystem sollte unter sterilen Bedingungen betrieben werden können und Ventile und Transportleitungen sollten möglichst mit Dampf steπli- sierbar sein, ohne eine Erwärmung des Reaktormediums zu verursachen.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Probenahmeventil, das eine Probe eines definierten Volumens insbesondere von biologischem Mateπal und insbesondere lebendiges Zellma- teπal unter reduzierter mechanischer Beanspruchung insbesondere durch Scherkräfte entnehmen kann.
Eine besondere Ausführungsform des Probenahmeventils weist eine vorzugsweise zylindrische Probenkammer definierten Volumens begrenzt durch ein vorderes und ein hinteres Dichtelement auf. Üblicherweise wird das vordere Dichtelement durch eine Verbindungswelle betätigt. Vorzugsweise gleichzeitig werden das vordere Dichtelement m Richtung des Innenraums des Bioreaktors geöffnet und das hintere Dichtelement mit gegen die Probenkammer verschlossen. In diesem geöffneten Ventilzustand entweicht die in der Probenkammer eingeschlossene Luftblase in den Reaktor, wobei eine Probe definierten Volumens aus dem Bioreaktor in die Probenkammer einströmt. Das hintere Dichtelement begrenzt das Volumen der Probenahme und ermöglicht die Entnahme eines definierten Volumens. Die Verschlusskraft kann durch Vorspannung einer Feder, bevorzugt einer Spiralfeder, von einer Druckplatte über eine Verbindungsstange auf das hintere Dichtelement übertragen werden, das über Flächenpressung mittels einer Abdichtvorrichtung, bevorzugt eines O-Rings, gegen einen Ventilschaft abdichtet. Die Vorspannung wird üblicherweise auf einen Differenzdruck zwischen Probenkammer und Reaktor von mindestens + 1.5 bar eingestellt. Unterdruck oder Vakuum im Bioreaktor führt bei der genannten Federvorspannung damit ebenso wenig zu einer unbeabsichtigten Ventilöffnung wie ein gegenüber dem Außendruck erhöhter Innendruck im Reaktor (z.B. beim Autoklavieren), der bei gleicher Kraftrichtung die Verschlusskraft zusätzlich verstärken kann. Das Probenahmeventil wird vorzugsweise durch Betätigung eines Hubzylinders geöffnet. Nach Entlasten des Hubzylinders über eine Ansteuerung, das pneumatisch (Ansteuerung über Druckluft) oder elektrisch (über einen Impuls) bevorzugt pneuma- tisch erfolgen kann, schließt das Ventil in Sekundenbruchteilen nach der Erteilung des Schließungsbefehls, diese geringe Verzögerung sichert das genaue Volumen der Probe. Zur sicheren Positionierung der Dichtflächen kann eine auf der Verbindungswelle montierte Führungstange dienen. Bei der Öffnung des Probenahmeventils wird eine gegen die Rückstellkraft der Feder gerichtete Druckkraft auf die Führungsstange übertragen. Auf dieser Führungsstange wird üblicher- weise eine Membran angebracht, welche zwischen zwei Halteplatten eingequetscht festgehalten werden kann. Die Druckkraft auf die Führungsstange führt zur Auslenkung der Membran, die die Probenkammer und einen hinteren Ventilinnenraum hermetisch gegen die Umgebung abdichtet. Vorzugsweise besitzt der hintere Ventilinnenraum zur Verringerung der Membranbelastung einen gegenüber der Probenkammer vergrößerten Durchmesser.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung wird das Probenahmeventil am Sondenkopf (der Öffnung zum Reaktor) von einem selbstreinigenden Filter geschützt, so dass keine größeren Aggregate in die Probenkammer und in die Transportleitung gelangen können. Die Weite der Poren dieses Filters beträgt üblicherweise 0,02 μm bis 2 mm vorzugsweise jedoch 0,45 μm bis 1 mm. In einer besonderen Ausführungsform des Probenahmeventils weist das Filter einen Hohlraum auf, die von einer Kappe um das vordere Dichtelement herum, im geschlossenen Zustand von innen gefüllt wird d.h. die Poren werden durch die Kappe von innen verschlossen. Die Kappe wird im geöffneten Zustand in Richtung des Reaktors herausgefahren, so dass sich ein geöffneter Bereich bildet.
Die Membran besteht vorzugsweise aus einem Material, welches gegenüber Wasserdampf bestän- dig ist, bevorzugt EPDM, Silicone, HNBR bzw. PFR-Kunststoffe. Der Sondenkopf besteht vorzugsweise aus einem für pharmazeutische Applikationen zugelassenen Kunststoff, bevorzugt aus PVDF, PEEK bzw. POM, welcher eine geringere Wärmeleitfähigkeit als Edelstahl besitzt und an dem Zellen besonders schlecht haften bleiben. So besteht keine Metall-Metall-Berührungsschnittstelle mit dem angeschlossenen Bioreaktor, so dass eine lokale Erwärmung des Bioreaktors und Foulingschichten auf der Abdichtvorrichtung, welche bevorzugt ein O-Ring ist, während des Reinigungsprozesses z.B. bei einer Dampfsterilisierung vermieden werden kann.
Für häufige Probenahme ist ein kleines Entnahmevolumen unerlässlich. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Probenahmeventils können exakt definierte Entnahmevolumina von 2 mL bis 200 mL, bevorzugt zwischen 5 mL und 20 mL entnommen werden.
Das erfindungsgemäße Probenahmeventil wird üblicherweise analog zu Standardsonden z.B. mit Hilfe einer Verschraubung in genormte Fermenterstutzen eingebaut, bevorzugt mit dem Durchmesser von DN25, üblicherweise mit Hilfe einer Abdichtvorrichtung, bevorzugt mit einem so genannter O-Ring. Zur Verbesserung des Ablaufverhaltens der Probe und der zu einem späteren Zeitpunkt aufzugebenden Reinigungsflüssigkeiten ist ein abwärts geneigter Einbau des Probenahmeventils an die Bioreaktorwand vorteilhaft. Günstige Einbauwinkel liegen zwischen 0° und 90° zur Waagrechten, bevorzugt zwischen 1° und 15°.
In einer weiteren bevorzugen Ausführungsform des Ventils kann die zylindrische Probenkammer selbst gegen die Stutzenachse geneigt angebracht werden, bevorzugt zwischen 1° und 15° zur Waagrechten.
Das erfindungsgemäße Probenahmeventil kann bei Bedarf temperiert werden, vorzugsweise wird hierfür das Probenahmeventil ummantelt und mit einem Peltier-Element temperiert.
Nach dem Schließen des Ventils wird der Weg zu einer angeschlossenen Transportleitung freigegeben. Die Probe wird anschließend als weitgehend zusammenhängender Pfropfen zum Zielort, z.B. einer Probenvorbereitungs- und /oder -analysestation, transportiert. Zum Probentransport werden üblicherweise Gas bzw. Flüssigkeit über eine Zugabeöffhung und einen Kanal eingeleitet und verdrängen dabei langsam die Probe aus der Probenkammer in einen hinteren Ventilinnenraum und zu einem Ablaufstutzen. Die Zugabeöffhung kann über ein Ventil, bevorzugt ein Rückschlagventil, geschützt werden.
Das Probenahmeventil wird üblicherweise an Transport- und Versorgungsleitungen, insbesondere Reinigungsleitungen, gekoppelt. Die Ankopplung erfolgt vorzugsweise durch autoklavier- und dampfsterilisierbare Schnellverschlusskupplungen, die im entkoppelten Zustand über einen Schließmechanismus verfügen, der die sterilen Innenflächen der beiden Kupplungsstücke vor Kontamination schützt.
Nach einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist zwischen dem Probenahmeventil und der Transportleitung ein Hahn integriert, bevorzugt ein Dreiwegehahn, mit dem eine Probe manu- ell entnommen werden kann, der vorzugsweise einer Kontrolleinheit verfugt und dezentral angesteuert werden kann.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Prozessanalysesystem , dass mindestens eine Vorrichtung zur Entnahme einer Probe aus einem Reaktor, eine Probetransportvorπchtung und mindestens eine Probenanalysestation aufweist, welches ermöglicht, dass ein Volumen von Proben- mateπal aus dem Reaktor entnommen und zur Analysestation transportiert wird, wobei das Proben- mateπal eine Suspension von mechanisch empfindlichem, insbesondere scherempfindlichem Mateπal ist, das reduzierter mechanischer Beanspruchung insbesondere reduzierten Scherkräften ausgesetzt wird. Bevorzugt ist das Volumen präzis definiert und / oder aggregatfrei.
Mechanisch empfindliches insbesondere scherempfindhches Mateπal im Sinne der vorliegenden Erfindung ist insbesondere biologisches Mateπal wie z.B. Zellen, Bakteπen, einzellige Pilze wie Hefen, Viren, Agglomerate aus Proteinpräzipitaten, Protemkπstalle, native Proteine, Antikörper, Liposomen und insbesondere lebendige tieπsche und /oder pflanzliche Zellen.
Das Prozessanalysesystem weist üblicherweise mindestens eine Vorπchtung zum Probenahme und Probetransport verbunden mit mindestens einer Probenvorbereitungs- und / oder Probenanalysesta- tion auf.
In einer besonderen Ausfuhrungsform Prozessanalysesystem ist die Vorπchtung zur automatischen Probenahme ein erfindungsgemäßes Probenahmeventil.
Das erfindungsgemäße Prozessanalysesystem steuert üblicherweise mindestens eine Probenanalyse- Station an und hat eine Anbmdung an ein Automatisierungssystem, bevorzugt an ein Prozessleitsys- tem oder speicherprogrammierbare Steuerungen zur Führung, Steuerung und / oder Regelung des Prozesses in einem Reaktor und insbesondere Bioreaktor.
Vorzugsweise sind die Probenahme- und Probentransportvorπchtungen, die Probenvorbereitung- sowie die Prozessanalysestation modular aufgebaut.
Die Probenvorbereitungstation beinhalten üblicherweise Probenventile, Reservoiren, Büretten, Ventile, Ventilmseln, Dosierventile und dergleichen, die durch Transportleitungen miteinander verbunden sind und die Behandlung der Probe in ein oder mehreren Schπtten ermöglichen. Durch entsprechende Ansteuerung der einzelnen Module von einer Steuereinheit wird die automatische Probenvorbereitung durchgeführt und kontrolliert. Vorzugsweise weist das Prozessanalysesystem mindestens eine Probenvorbereitungsstation auf. Dort werden die zur Verwendung der Probe für die Analyse erforderlichen Schπtte durchgeführt, wie z.B. Verdünnung, Zugabe von internem Standard, Zugabe von Stabilisatoren (z.B. Glycerm), Marker oder Detergens, Temperierung bevor- zugt Kühlung auf 4 bis 370C, pH-Werteinstellung, Strippen, Umpufferung, Filtration oder Deπva- üsierung. Diese Schritte werden vollautomatisiert durchgeführt und mit mehreren Sensoren überwacht bzw. gesteuert. Als Sensoren sind z.B. pH-Elektrode, Leitfähigkeitssonde, Sensoren zur Messung der optischen Dichte, Trübung, Druck, Temperatur, Fluss genannt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet das Prozessanalysesystem und insbesondere die Probenvorbereitungsstation einen sensorgesteuerten Test der Probe, der untersucht, ob sich die Eigenschaften der Probe (z.B. Zelldichte) mit dem im vorgegebenen Arbeitsablauf und insbesondere den Benutzungsanweisungen eines benötigten Analysators kompatibel ist. Ist z.B. die Zelldichte zu hoch, so kann ein Analysator verstopfen. Außerdem kann die Zelldichte außerhalb des Messbereiches des Analysators liegen. In diesem Fall wird die Probe sensorgesteuert so lange verdünnt, bis eine zuverlässige Quantifizierung der Probe möglich ist. Ist im umgekehrten Fall die Zelldichte zu niedrig für eine Quantifizierung, so wird sensorgesteuert ein Proben- aufkonzentπerungsprogramm gestartet.
Vorzugsweise weist die Probenvorbereitungsstation ein zentrales Sammelgefäß auf, in dem ein Sen- sor zur Überwachung der Probe integriert ist, um die Aufarbeitung der Probe in der Probenvorbereitungsstation zu regeln und/oder zu steuern. Ist die Probe sehr verdünnt, wird ein Aufkonzentrationsprogramm gestartet, bei zu hoher Konzentration wird ein Verdünnungsschritt eingeleitet. So wird verhindert, dass Messungen von Proben oder Aliquoten durchgeführt werden, die außerhalb des Messbereichs, der Spezifikationen und/oder des validierten Bereichs der Analysestation liegen.
Vorzugsweise kann diese Art der Probenvorbereitung dazu verwendet werden, die Probe so vorzubereiten, dass eine exakte Analyse in einem Analysator im empfindlichsten Messbereich durchgeführt werden kann. Dies erlaubt eine empfindlichere Bestimmung von Parametern über eine größere Konzentrationsspanne der Probe und somit eine verbesserte Steuerung von Bioprozessen.
Vorzugsweise sind die Probenahmevorrichtung sowie die Probenanalysestationen über Transport- leitungen mit den Probenvorbereitungstationen verbunden. Dadurch wird ein modular aufgebautes und integriertes System zur Entnahme der Proben, Transport der Proben, zur Probenvorbereitung und zur Probenanalyse geschaffen. Dieser modulare Aufbau hat insbesondere den Vorteil, dass die automatische Probenvorbereitung für unterschiedliche Analysatoren ohne großen Aufwand konfi- guπerbar ist.
In einer besonderen Ausführungsform des Prozessanalysesystems wird die Probe in einer Aliquo- tierungsstation in mehrere Aliquote aufgeteilt. Diese Aliquote durchlaufen entweder nacheinander eine Probenvorbereitungsstation, alternativ werden sie parallel in mehrere Probenvorbereitungssta- tionen transportiert und werden dort unterschiedlich aufbereitet. In einer weiteren Ausführungs- form des Prozessanalysesystems wird die Aliquotierung nach der Probevorbereitung wie z.B. Filtration, Dekantierung, Konzentration oder Verdünnung durchgeführt.
Vorzugsweise weist das Prozessanalysesystem eine zentrale Probenvorbereitungsstation auf, die die Aliquote nacheinander durchlaufen.
Nach der Probenvorbereitung wird die Probe bzw. die Aliquote in die verschiedenen Probenanalysestationen durch die Transportleitungen transportiert.
Vorzugsweise verfügt das Prozessanalysesystem über eine Selbstüberwachung, die die Eigenschaften der Probe, bevorzugt Temperatur, Druck, pH- Wert, Fluss, optische Dichte, Leitfähigkeit, Trübung, in mindestens einen den verschiedenen Module erfasst und überwacht.
In einer besonderen Ausführungsform des Prozessanalysesystems wird der Transport der Probe und insbesondere Fluss, optischen Dichte oder Trübung in den Transportleitungen überwacht und kontrolliert, um eine Verstopfung der Leitungen zu verhindern.
Vorzugsweise ist das Prozessanalysesystem so konstruiert, dass es sich bei einem Stromausfall oder einer Betriebsstörung in einem sicheren Zustand fährt, der verhindert, dass der Inhalt von angeschlos- senen Bioreaktoren kontaminiert wird.
Die Probenanalysestation kann verschiedene Probenanalysegeräte (Analysatoren) wie z.B. Zellzähler, Biosensoren, Spektroskopiesysteme, Chromatographiesysteme wie HPLC-, Ionen-, Affinitäts- und/oder Gelpermeations-Chromatographiesysteme aufweisen, die zur Untersuchung der Probe bzw. Aliquote dienen. Die Analysenergebnisse werden über eine speicherprogrammierbare Steue- rung (SPS) übertragen und beispielsweise über einen Feldbus an eine Automatisierungseinheit (z.B. ein Prozessleitsystem) übermittelt. Dieses kann dann den Prozess entsprechend steuern und/oder regeln. Die Dokumentation wird gemäß den Anforderungen der Qualitätssicherung durchgeführt.
In einer besonderen Ausführungsform führt das Probenanalysegerät biochemische Analyse von Reaktionsprodukten bzw. Nebenkomponenten durch. Reaktionsprodukte sind in der Regel die herzustellenden Proteine, während Beispiele für Nebenkomponenten Zellzustandsparameter wie Vi- mentin, Laktatdehydrogenase oder DNA darstellen.
In einer besonderen Ausführungsform des Prozessanalysesystems werden Biosensoren für die Kontrolle von Nährstoffen und Stoffwechselprodukten wie Glukose und Laktat eingebaut.
Für die biochemische Analyse, werden bevorzugt an biofunktionelle Oberflächen wie z.B. an Mikrotiterplatten-, Glas-, Biosensor-, Bead- oder Magnetbeadoberflächen biologische, chemische oder biochemische Erkennungselemente wie z.B. DNA, RNA, Aptamere, Rezeptoren gebunden, an die ein Analyt beim Nachweis mittels einer Erkennungsreaktion spezifisch bindet. Eine weit verbreitete Methode stellt hier die ELISA Methode dar. Die biochemische Analyse mittels biochemischer Erkennungselemente kann jedoch auch in homogenen Formaten in Lösung wie z.B. im Rah- men der homogenen zeitaufgelösten Fluoreszenz (HTRF) erfolgen. Hierbei werden die biochemischen Erkennungslelemente mit signalgenerierenden Molekülen wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffen oder Nanopartikeln gekoppelt.
Beispiele für Erkennungsreaktionen sind die Bindung von Liganden an Komplexe, die Komplexie- rung von Ionen, die Bindung von Liganden an (biologische) Rezeptoren, Membranrezeptoren oder Ionenkanäle, von Antigenen oder Haptenen an Antikörper (Immunoassays), von Substraten an Enzyme, von DNA oder RNA an bestimmte Proteine, von Aptameren oder Spiegelmeren an ihre Targets, die Hybridisierung von DNA/RNA/PNA oder anderen Nuklemsäure-Analoga (DNA- Assays) oder die Prozessierung von Substraten durch Enzyme. Im Rahmen von DNA-Assays kann vorteilhaft die Methode der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) besonders bevorzugt die Methode der kinetischen PCR verwendet werden. Als Signalverstärkung für Immunoassays kann vorteilhaft die Methode der Immuno-PCR eingesetzt werden.
Beispiele für nachzuweisende Analyten sind DNA, RNA, PNA, Nukleinsäure-Analoga, Enzymsubstrate, Peptide, Proteine, potentielle Wirkstoffe, Medikamente, Zellen, Viren.
Beispiele für Erkennungselemente, an die die nachzuweisenden Analyten binden, sind DNA, RNA, PNA, Nukleinsäure-Analoga, Aptamere, Spiegelmere, Peptide, Proteine, Komplexbildner für Me- talle/Metalhonen, Cyclodextrine, Kronenether, Antikörper oder deren Fragmente, Anticalme, Enzyme, Rezeptoren, Membranrezeptoren, Ionenkanäle, Zelladhäsionsproteine, Ganghoside, Mono- oder Oligosaccharide.
Werden an die biofuntionelle Oberfläche des biochemischen Detektionssystems verschiedene Er- kennungselemente räumlich voneinander getrennt gebunden, so kann eine große Zahl von Erkennungsreaktionen mit einer zu untersuchenden Probe zeitgleich durchgeführt werden. Diese sogenannten Arraytechnologien sind sowohl für die Nuklemsäurecharakteπsierung als auch zur Bestimmung von Proteinen mit Antikörperarrays bekannt und können zur Lösung der erfindungsgemäßen Aufgabe eingesetzt werden.
Die Detektion der Erkennungsreaktion des biochemischen Detektionssystems kann durch Anwendung optischer, elektrischer, mechanischer oder magnetischer Signalwandlungsverfahren erfolgen. Besonders bevorzugt sind optische Methoden wie Chemolumimszenz, Elektrochemolumimszenz, Absorptionsdetektion eines enzymatisch induzierten Farbumschlags, Fluoreszenzdetektion eines enzymatisch induzierten Umsatzes eines fluorogenen Substrats, Alpha Screen oder homogene zeit- aufgelöste Fluoreszenz. Alpha Screen steht für eine homogene Detektionsmethode, bei der an einem ersten Bead lichtinduzierter Smglet-Sauerstoff produziert wird, der nach Diffusion zu einem zweiten Bead, das über eine biochemische Bindungsreaktion an das erste Bead gekoppelt ist, die- ses zur Chemoluminiszenz anregt.
In einer weiteren besonderen Ausführungsform ist die Integration eines Autosampiers eingebaut, welcher Proben sammelt und kühlt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung spiegelt sich dieser modulare Aufbau auch in dem Steuerungsprogramm des Prozessanalysesystems wider. In der Steuereinheit des Sys- tems ist vorzugsweise für jedes Modul eine Treibersoftware mit Vorortbedienung in einer dezentrale Steuer- und Versorgungsemheit hinterlegt. Auf diese Treibersoftware greift das Steuerungsprogramm der Automatisierungseinheit zu, um nach einem vom Nutzer vorgegebenen Arbeitsab- lauf die Schritte der sterilen Probenentnahme, der automatischen Probenvorbereitung, Analyse und Reinigung vorzunehmen. Durch die Steuer- und Versorgungseinheit wird die Zufuhr von Druck- luft, Dampf, Reinigungsflüssigkeiten und Transportflüssigkeiten an das Probenahmeventil durch die Versorgungs- und Transportleitungen gewährleistet und geregelt.
In einer besonderen Ausführungsform des Prozessanalysesystems werden mehrere Reaktoren insbesondere Bioreaktoren angesteuert, die unabhängig von einander operieren. Jede Probenahmevorrichtung kann dezentral über eine eigene Steuerungseinheit und somit unabhängig angesteuert wer- den. Des weiteren ist es möglich, mehrere Reaktoren, die mit unterschiedlichen Zelllmien arbeiten und verschiedene Produkte produzieren, mit einem einzigen Prozessanalysesystem und somit besonders kostengünstig zu betreiben, da ein ausgeklügeltes Reinigungsmanagement die gegenseitige Kontamination der einzelnen Reaktoren verhindert. Das Prozessanalysesystem verfügt über eine dezentrale Automatisierungseinheit mit Vorortbedienung an jedem Probenahmevorrichtung, die über alle gängigen Bussysteme an die zentrale SPS gekoppelt sind. Damit lassen sich problemlos einzelne Einheiten ab- und zuschalten.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausfuhrungsform der Erfindung wird der Ablauf des Steuerungsprogramms durch vom Nutzer definierbare Parameter festgelegt. Beispielsweise kann der Nutzer über eine grafische Nutzerschnittstelle eines üblichen Personalcomputers zur Verfügung stehende Module und von diesen auszuführende Aktionen auswählen. Dadurch können in tabellarischer Form Ablaufsequenzen für die Probenentnahme, Probenvorbereitung und Probenanalyse mit Hilfe der Module definiert werden. Die diesen Ablauf beschreibenden Parameter werden dann von einem PC exportiert und an die Steuereinheit des Regelungssystems übertragen. Dort legen diese Parameter den Programmablauf des Steuerungsprogramms fest. Die Parameter bestimmen also die Reihenfolge in der das Steuerungsprogramm einzelne Treiberprogramme aufruft sowie auch die Steuerungsparameter, die das Steuerungsprogramm an die Treibersoftware übergibt, um ein bestimmtes Modul zu einer bestimmten Aktion zu veranlassen.
Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass zur Festlegung eines Programmablaufs des Steuerungsprogramms kein Computerexperte erforderlich ist, da der Programmablauf in intuitiver Art und Weise über die grafische Benutzerschnittstelle durch Auswahl von Modulen und den durchzufüh- renden Aktionen erfolgen kann. Insbesondere kann so ein Laborant oder Techniker die zuvor von ihm manuell durchgeführten Schritte über die grafische Benutzerschnittstelle beschreiben und verfolgen Diese Beschreibung dient dann als Parametπerung für das Steuerungsprogramm, sodass dieses die jeweils erforderliche Treibersoftware in der benötigten Reihenfolge anspricht.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dient als Steuereinheit eine Automatisie- rungskomponente, wie beispielsweise eine Simatic S7 der Firma Siemens AG. Eine solche Automatisierungskomponente ist für den störungsfreien Dauereinsatz in einer industriellen Umgebung ausgelegt und kann daher nicht wie ein üblicher PC „abstürzen". Von besonderem Vorteil ist hierbei, dass der PC, mit Hilfe dessen der Benutzer den Ablauf eingibt, und die Steuereinheit beim Betrieb des Systems voneinander getrennt werden können. D. h. nachdem die Parameter, die den Programmablauf festlegen, vom PC an die Steuereinheit übertragen worden sind, kann der PC von der Steuereinheit getrennt werden. Dadurch ist ein Betrieb der Steuereinheit unabhängig vom PC möglich.
Em weiteres Element des erfindungsgemäßen Prozessanalysesystem ist die Transportvorrichtung, deren Aufgabe ist, die empfindliche Probe eines definierten Volumens von der Probenahmevorπch- tung zu der Vorbereitung bzw. Analysestation sanft, ohne Verstopfung und verlustfrei weiterzuleiten.
Die Transportvorrichtung weist üblicherweise Transportleitungen, und mindestens ein System zu sanften Beschleunigung der Probe bzw. Aliquote durch die Transportleitungen.
Ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Transportvorrichtung zum Transport von Suspensionen enthaltend mechanisch empfindlichem Material und insbesondere von Ie- bendigen Zellen, umfassend Transportleitungen und mindestens ein System zur Beschleunigung der Probe bzw. Aliquote durch die Transportleitung aus mindestens zwei Büretten, wobei die Büretten mit folgenden Schritten betrieben werden' a) eine erste Bürette wird aufgezogen,
b) kurz bevor die erste Bürette am Anschlag angekommen ist, wird eine zweite Bürette aufgezogen und übernimmt den Transport, wobei die Probe weder eine zusätzliche Beschleunigung noch einen kurzen Zwischenstopp erfährt,
c) die erste Bürette wird von den Transportleitungen abgekoppelt und wieder entspannt, so dass sie wieder zur Verfügung steht,
d) Schritte a) bis c) werden wiederholt.
Bevorzugt werden die Büretten mit mindestens einer Ventilinsel an die Transportleitungen verbunden, wobei die Büretten und Ventilinsel vom Automatisierungssystem angesteuert werden, so dass eine exakte Einstellung der Transportgeschwindigkeit gewährleisten wird.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass bei einem üblichen Durchmesser der Transportleitung von 0,5 bis 3 mm vorzugsweise jedoch 1 bis 2 mm eine exakt eingestellten bevorzugt konstant gehaltene Transportgeschwindigkeit von 1 bis 10 m/min vorzugsweise jedoch auf 2,5 bis 3,5 m/min einen schonenden Probentransport von biologischem Material und insbesondere lebendi-. gern Zellmaterial ermöglicht. Erlaubte Variation der Transportgeschwindigkeit ist 30%, bevorzugt maximal 2%.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren konnte der Transport von biologischem Material und insbesondere von lebendigem Zellmaterial aus mehreren Reaktoren über eine längere Strecke bei geringeren Variation der Transportgeschwindigkeit, ohne Unterbrechung und somit besonders schonend und verlustfrei durch die Leitungen erreicht. Dies wurde für Hydridomazellen und SF9- Insektenzellen gezeigt. Bei Suspensionen von mechanisch empfindlichem Material und insbesondere von lebendigen Zellen ist die Einhaltung einer definierten Transportgeschwindigkeit bevorzugt, da das Material bei zu großer Transportgeschwindigkeit z.B. wegen Scherkräften zerstört wird und bei zu kleiner Transportgeschwindigkeit in der horizontal verlegten Leitung sedimentie- ren könnte. Der Transport erfolgt vorzugsweise pneumatisch oder mit Flüssigkeiten.
In einer besonderen Ausführungsform gewährleisten die Büretten auch die Aliquotierung der Probe.
Ist die Analyse einer zellfreien Probe erwünscht, kann die Zellabtrennung über Filtration durch Anpassung der Porenweite des Filters direkt am Sondenkopf des Probenahmeventils erfolgen. Al- ternativ kann die Probe in der Vorbereitungsstation filtriert oder in einem Gefäß aufgefangen werden, um dort zu sedimentieren. Nach der Sedimentation kann aus dem Überstand eine zellarme Probe entnommen, filtriert und einem Analysator zugeführt werden. Eine filterlose und somit wartungsarme Alternative ist der Probentransport mit einer Geschwindigkeit von <1 m/mm. Bei Leitungen, die länger als 5 m sind, sedimentleren beim Transport sämtliche Zellen in der Leitung, so dass in einem Probengefäß eine zellfreie Probe aufgefangen werden kann, die für eine Weiterver- arbeitung nicht weiter filtriert werden muss.
Vorzugsweise können die Transportleitungen temperiert werden, bevorzugt mit einem Peltier- Element, auf eine Temperatur zwischen 00C und 1000C, bevorzugt zwischen 4°C und 37°C. Alternativ wird eine Temperierung über eine beheizte Doppelmantelleitung realisiert.
Vorzugsweise weist die Probetransportvorrichtung zwei Büretten auf, die jeweils durch eine Ven- tilinsel an die Transportleitungen angebunden sind, die wiederum an einem oder mehreren Probe- nahmeventil, die Vorbereitungs- bzw. Analysestationen und Quellen für Luft bzw. Transport- und / oder Reinigungsflüssigkeiten angebunden sind.
Vorzugsweise weisen die Transportleitungen mindestens eine Kontrolleinheit auf, die insbesondere Fluss, Druck, optische Dichte oder Trübung in den Transportleitungen überwacht und kontrol- liert, um eine Verstopfung der Leitungen zu verhindern.
Die Sterilität ist für eine zuverlässige, länger dauernde Fermentation von außerordentlicher Bedeutung. Em Vorteil des erfindungsgemäßen Prozessanalysesystems besteht dann, dass das Probenahmeventil zusammen mit dem Reaktor insbesondere Bioreaktor autoklaviert werden kann und dessen Versorgungsleitungen durch Steπlverbindungen verschlossen werden. Bevorzugt wird au- ßerdem die Vorrichtung zur Probenahme und Probetransport mit Wasserdampf, sterilisiertem Wasser oder sterilisierenden Lösungen gereinigt. Nach der Analyse werden üblicherweise das Probe- nahmeventil und die Transportleitung bevorzugt mit Wasserdampf gespült und auf Temperaturen üblicherweise zwischen 100 bis 135°C erhitzt, um eventuelle Zellreste zu entfernen und das System zu sterilisieren und reinigen. Alternativ kann die Reinigung auch mit sterilem Wasser oder sterilisierender Spüllösung erfolgen. Anschließend wird üblicherweise sterile, trockene Luft durch das Probenahmeventil und die Leitung gefördert, um das Probentransport-System abzukühlen und zu trocknen. Vorzugsweise weist das Probenahmeventil am hinteren Ventilmnenraum zusätzlich einen angebrachten Hilfsstutzen auf, der zur besseren in-situ Reinigbarkeit des Probenahmeventiis dient. Durch den Hilfsstutzen kann sichergestellt werden, dass sich keine für die Reinigung un- günstige Luftblase und damit ein Totraum im oberen Teil des hinteren Ventilinnenraums bildet.
Nach dem Transport der Probe und deren Analyse und Dokumentation werden üblicherweise die Vorrichtung zur Probenahme und Probentransport und insbesondere das Probennahmeventil und Transportleitung gründlich mit Clean-m-place-Medien gereinigt und mit steπler Luft getrocknet. Wichtig ist ein ausreichendes Nachspülen mit entmineralisiertem Wasser beim letzten Clean-in- place- bzw. Sterilisation-in-place-Reinigungsgang, um einer Belagbildung auf den produktberührten Flächen beim anschließenden Trocknungsprozess vorzubeugen.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht eine vollautomatisierte Probenanalyse inklusive steriler Probenahme, -transport, -Vorbereitung und -analyse unter Sterilbedingungen mit Integration der gewonnenen Analysenwerte durch direkte Anbindung an ein Prozessleitsystem und/oder eine SPS zur Regelung und Steuerung des Prozesses. Insbesondere werden die Entnahme kleiner, definierter Probevolumen und schonender Transport insbesondere von zellenhaltigen Proben, ggf. Zellseparation und Flüssigprobenvorbereitung und -analyse gewährleistet. Die vorliegende Erfindung ermög- licht eine flexible Gestaltung der Arbeitsabläufe und eine automatische Anpassung der Probenvorbereitung bzw. Aliquotierung an die Anforderungen sowohl der Arbeitabläufe als auch an die im System verfügbaren Analysatoren.
Ein großer Vorteil des hier beschriebenen Prozessanalysensystems für Bioprozesse besteht außerdem darin, dass mehrere Bioreaktoren angesteuert werden können, die unabhängig voneinander operieren. Jedes Ventil kann dezentral und somit unabhängig angesteuert werden. Des Weiteren ist es vorstellbar, mehrere Reaktoren, die mit unterschiedlichen Zelllinien arbeiten und verschiedene Produkte produzieren, mit einem einzigen Prozessanalysesystem und somit besonders kostengünstig zu betreiben, da ein ausgeklügeltes Reinigungsmanagement die gegenseitige Kontamination der einzelnen Bioreaktoren verhindert.
Dies ist eine deutlich kostengünstigere, flexiblere und sicherere Alternative zu den bisher sich auf dem Markt befindlichen Systemen, da in einer zentralen „Intelligenz" verschiedene Proben von mehreren Bioreaktoren gesammelt, verarbeitet und ausgewertet werden, und nicht für jeden einzelnen Bioreaktor ein teures Analysensystem zur Verfügung gestellt werden muss. Zudem ist durch integrierte Automatisierungseinheiten die Regelung und Steuerung von Bioprozessen mög- lieh.
Abbildungen:
Folgende Abbildungen illustrieren die Erfindung ohne sie zu begrenzen.
Fig. Ia: Probenahmeventil in geöffnetem Zustand an einem Bioreaktor
Fig. Ib: Probenahmeventil in geschlossenem Zustand an einem Bioreaktor
Fig. 2: Seitenansicht des Probenahmeventils im geöffneten Zustand
Fig. 3a: abwärts geneigter Einbau des Probenahmeventils Fig. 3b: waagrechter Einbau des Probenahmeventils mit gegen die Stutzenachse geneigter
Probenkammer
Fig. 3c: 90° abwärts geneigter Einbau des Probenahmeventils
Fig. 4: Anschluss mehrerer Bioreaktoren an eine zentrale Analysenstation
Fig. 5: Probentransport, -Vorbereitung und -analyse sowie Steuerung und Regelung eines
Bioprozesses
Fig. 6: Ablaufschema
Bezugzeichen:
1. Bioreaktor
2. Probenahmeventil
3. Probenkammer 4. Transportleitung
5. moderater Gasdruck
6. zusammenhängender Pfropfen
7. Zielort
8. Bürette 9. Rückstellproben
10. Probenanalyse
11. Datenausgabe und Datenbankablage
12. Rechnersystem
13. Automatisierungssystem 14. genormter Fermenterstutzen
15. Feder
16. vorderes Dichtelement
17. hinteres Dichtelement
18. Verbindungswelle 19. Membran
20. Halteplatte
21. Druckplatte
22. Hubzylinder
23. Abdichtvorrichtung 24. Zugabeöffhung
25. Ablaufstutzen
26. Hilfsstutzen
27. Verschraubung
28. Abdichtvorrichtung 29. Abdichtvorrichtung
30. Abdichtvorrichtung
31. Zulaufkanal
32. Sondenkopf
33. Ansteuerung 34. auf Verbindungswelle montierte Führung
35. Ventil 36. hmterer Ventihnnenraum
37. Schnellverschlusskupplung
38. Kupplungsstücke
39. Filter
40. Abdichtvorrichtung
41. Kappe
42. Ventilschaft
43. Poren
44. Dreiwegehahn
45. Probenahmeventil
46. dezentrale Steuer- und Versorgungseinheit
47. dezentrale Vor-Ort-Steuerung der Handprobe
48. zentrale Automatisierungseinheit
49. Kontrolleinheit
50. Handprobe
51. Bürette 1
52. Bürette 2
53. zentrales Sammelgefäß
54. Sonde
55. Rührer
56. Zellzahlbestimmungsgerät
57. Analysator 1
58. Analysator 2
59. Chromatographiesystem
60. Biosensor
61. Abfallgefäß
62. Filter
63. Druckluft
64. Wasser
65. Reinigungsmedium
66. Transportmedium
67. Dampferzeuger
68. Ventil
69. Ventil
70. Aliquotierung Fig.la zeigt das in einen Bioreaktor (1) eingebaute geöffnete Probenahmeventil (2) mit einer Probenkammer (3) definierten Volumens, in die die Probe bei Ventilöffnung zunächst einströmt. Das hintere Dichtelement (17) begrenzt das Volumen der Probenahme und ermöglicht die Entnahme eines kleinen, definierten Volumens. Das vordere Dichtelement (16) verhindert, dass weitere Flüs- sigkeit aus dem Bioreaktor in das Probenahmeventil strömen kann. Nach dem Schließen des Ventils (Fig. Ib) wird der Weg zu einer angeschlossenen Transportleitung (4) freigegeben. Die Probe wird anschließend als weitgehend zusammenhängender Pfropfen (6) zum Zielort (7), einer zentralen Probenvorbereitungs- und /oder -analysestation, transportiert. Die bevorzugte Verwendung zweier Büretten (8) erlaubt durch geeignetes Zusammenspiel eine kontinuierliche Transportge- schwindigkeit und somit besonders schonenden und verlustfreien Transport durch die Leitung. Die Zellsuspension wird in einem Probengefäß gesammelt. Anschließend erfolgen dort die verschiedenen Maßnahmen zur Probenanalyse (10), wie z.B. die Ahquotierung, die Zellseparation, die Anwendung verschiedener Analyseverfahren oder das Verschließen, Kennzeichnen und Einfrieren der Rύckstellproben (9). Nach Abfrage der Messergebmsse erfolgt schließlich eine der Quahtätssi- cherung gerechten Datenausgabe und Datenbankablage in einem Rechnersystem (12). Dann werden die Analyseergebnisse an ein Automatisierungssystem (13) übergeben.
Wie an dem Ausführungsbeispiel in Fig. 2 gezeigt, wird das Probenahmeventil (2) analog zu Standardsonden mit Hilfe einer Verschraubung (27) in genormte Fermenterstutzen (14) mit dem Durchmesser von DN25 eingebaut. Die Abdichtung des Probenahmeventiis (2) innerhalb des Stut- zens erfolgt über eine Abdichtvorrichtung (29), bevorzugt ein so genannter O-Rmg. Das Probenahmeventil (2) ist im energielosen Zustand zum Reaktorraum mit einem abdichtenden, hinteren Dichtelement (16) geschlossen. Die Verschlusskraft wird durch Vorspannung der Feder (15), bevorzugt einer Spiralfeder, von der Druckplatte (21) über die Verbmdungsstange (18) auf das hintere Dichtelement (17) übertragen. Das hintere Dichtelement (17) dichtet über Flächenpressung mit- tels einer Abdichtvorrichtung (30), bevorzugt eines O-Rmgs, gegen den Ventilschaft (42) ab. Bei einer Öffnung des Ventils durch Betätigung des autoklavierbaren Hubzylinders (22) wird eine gegen die Rückstellkraft der Feder (15) gerichtete Druckkraft auf die Führungsstange (18) übertragen. Auf dieser Führungsstange (18) ist eine Membran (19) angebracht, welche zwischen zwei Halteplatten (20) eingequetscht ist Die Druckkraft auf die Führungsstange führt zur Auslenkung der Membran (19), die die Probenkammer (3) und den hinteren Ventilinnenraum (36) hermetisch gegen die Umgebung abdichtet. Gleichzeitig werden das vordere Dichtelement (16) in Richtung des Innenraums des Bioreaktors geöffnet und das hintere Dichtelement (17) gegen die zylindrische Probenkammer (3) verschlossen und durch eine Abdichtvorrichtung (40) abgedichtet. In diesem geöffneten Ventilzustand entweicht die m der Probenkammer (3) eingeschlossene Luftblase in den Bioreaktor (1), wobei eine Probe definierten Volumens aus dem Bioreaktor in die Probenkammer (3) einströmt. Am Sondenkopf (32) wird das Probenahmeventil von einem selbst reinigenden Filter (39) geschützt, so dass keine größeren Aggregate in die Probenkammer (3) und in die Transportleitung (4) gelangen können. Dieser Filter (39) umgibt einen Teil des Sondenkopfs und verhindert, dass Aggregate ins Ventil gelangen. Die Weite der Poren (43) des Filters beträgt dabei 0,5 mm bis 2 mm, bevorzugt lmm. Zur Entnahme zellfreier Proben kann eine Filterfläche mit einer Porenwei- te von 0,02-2 μm, bevorzugt 0,45 μm eingesetzt werden. Eine Kappe (41) ist im geöffneten Zustand in Richtung des Fermenters herausgefahren, so sich ein geöffneter Bereich bildet. Einige Poren (43) sind als weiße Kästchen dargestellt, durch die aus allen Richtungen eine Probe in das Ventil gelangen kann. Nach Entlasten des Hubzylmders (22) über eine Ansteuerung (33), welche pneumatisch erfolgt, schließt das Ventil. Dabei wird die Kappe (41) in Richtung des Ventils be- wegt und füllt von innen den Hohlraum des Filters (39), d.h. die Poren (43) sind durch die Kappe (41) von innen verschlossen. Zur sicheren Positionierung der Dichtflächen dient die auf der Ver- bmdungswelle montierte Führung (34). Zum Probentransport wird Gas bzw. Flüssigkeit über die Zugabeöffnung (24) und einen Zulaufkanal (31) eingeleitet und verdrängt dabei langsam die Probe aus der Probenkammer (3) in den hinteren Ventilmnenraum (36) und zum Ablaufstutzen (25). Die Zugabeöffhung wird über ein Ventil (35), bevorzugt ein Rückschlagventil, geschützt. Der am hinteren Ventilmnenraum (36) zusätzlich angebrachte Hilfssturzen (26) dient der besseren m-situ Reinigbarkeit. Der hintere Ventilmnenraum (36) besitzt zur Verringerung der Membranbelastung einen gegenüber der Probenkammer (3) einen vergrößerten Durchmesser. Durch den Hilfsstutzen (26) wird sichergestellt, dass sich keine für die Reinigung ungünstige Luftblase und damit ein Totraum im oberen Teil des hinteren Ventilmnenraums (36) bilden. Zum Probentransport wird die Probe unter Gasdruck bzw. mit einer Flüssigkeit über einen Ablaufstutzen (25) in die Transportlei- tung (4) geleitet.
Fig. 3a zeigt eine bevorzugte Ausführungsform mit abwärts geneigtem Einbau des Probenahmeventils (2) an die Bioreaktorwand.
Fig. 3b zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Ventils, wobei die zylindrische Probenkammer (3) selbst gegen die Stutzenachse geneigt angebracht wird.
Fig. 3c zeigt eine weitere bevorzugte Ausführungsform des Ventils mit einem 90° abwärts geneigtem Einbau des Probenahmeventiis (2) an der Bioreaktorwand.
Fig. 4 zeigt eine Möglichkeit der Ankopplung des Probenahmeventils an das Leitungssystem, be- stehend aus Versorgungs-, Remigungs- und Transportleitung durch autoklavier- und dampfsteπh- sierbare Schnellverschlusskupplungen (37), die im entkoppelten Zustand über einen Schließmechanismus verfügen, der die sterilen Innenflächen der beiden Kupplungsstücke (38) vor Kontamination schützt. Die Probe wird in eine zentrale Probenvorbereitungs- und/oder Probenanalysestati- on (7) transportiert. Außerdem können mehrere Bioreaktoren angesteuert werden können, die un- abhängig von einander operieren. Jedes Ventil kann dezentral und somit unabhängig angesteuert werden.
Fig. 5 zeigt eine zentrale Probenvorbereitungs- und/oder Probenanalysestation, aus Gründen der Übersichtlichkeit nur mit einem Probenahmesystem (45). Versorgungsleitungen sind als durchge- zogene Linien, Ansteuerung von Komponenten ist mit gestrichelten Linien dargestellt. Die Pfeile auf diesen Linien geben dabei die Richtung der Kommunikation an. Das Prozessanalysesystem verfügt über eine dezentrale Steuer- und Versorgungseinheit (46) mit dezentraler Vorortbedienung (47) an jedem Probenahmesystem. Diese kommuniziert über eine zentrale Automatisierungseinheit (48). Die dezentrale Steuer- und Versorgungseinheit (46) regelt die Zufuhr von Druckluft, Dampf, Reinigungsflüssigkeiten und Transportflüssigkeiten. In der Transportleitung zwischen dem Probenahmesystem (2) und einem Dreiwegehahn (44) ist eine Kontrolleinheit (49) integriert. Der Dreiwegehahn (44) erlaubt eine manuelle Probenentnahme (50). Zwei Büretten (51, 52) werden vom Automatisierungssystem angesteuert, um den Transport und die Aliquotierung (70) der Probe zu gewährleisten. Die Probe wird in ein zentrales Sammelgefäß (53) transportiert. Dort charakterisiert eine Sonde (54) die Probe, ein Rührer (55) ist zusätzlich integriert. Es wird ein Signal an das Automatisierungssystem übertragen, um zu entscheiden, ob die Probe für eine weitere Aufarbeitung verdünnt, aufkonzentriert oder unbehandelt weiter verwendet werden kann. Aus dem Sammelgefäß heraus wird die Probe auf verschiedene Analysatoren verteilt: eine unfiltrierte Probe wird in ein Zellzahlbestimmungsgerät (56) oder in Analysator 1 (57) untersucht. Ein anderer Teil der Probe durchläuft einen Filter (62) und wird auf Analysator 2 (58), eine Chromatographie (59) und/oder an einen Biosensor (60) verteilt. Alle Analysatoren (56-60) sind an ein Abfallgefäß (61) angeschlossen, die Anbindung ist Gründen der Übersichtlichkeit nicht dargestellt. Analysatoren sind in ihrer Anzahl und Anordnung beliebig kombinierbar. Sind für verschiedene Analysatoren unterschiedliche Vorbereitungsschritte nötig, so kann die Probe im zentralen Sammelgefäß (53) für jeden einzelnen Analysator entsprechend vorbereitet werden. Alle Messwerte werden an das Automatisierungssystem übergeben, um den Bioprozess zu regeln und/oder steuern. Alle Proben werden in einem Abfallgefäß (61) gesammelt.
Fig. 6 zeigt ein Flussdiagramm. Nach der Probenentnahme aus dem Bioreaktor wird die gesamte Probe schonend in ein zentrales Sammelgefäß transportiert. In einer Voruntersuchung charakteri- siert ein Sensor die Probe. Bei einer zu hohen Konzentration wird ein sensorgesteuertes Probenverdünnungsprogramm gestartet. Dies wird so lange wiederholt, bis die Probe sich im gewünschten Konzentrationsbereich befindet. Danach wird das Probenvorbereitungsprogramm gestartet und die Probe in den verschiedenen Analysatoren gemessen. Die Analysenergebnisse werden an ein Prozessleitsystem übergeben. Nach Abschluss aller Messungen werden die Dampfsterilisation und die Reinigung des Ventils und der Leitungen gestartet. Das Prozessleitsystem verwendet die Analysenergebnisse zur Nachregelung des Prozesses.
Beispiele:
Folgende Beispiele belegen die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Probeanalysesystems ohne das System auf diese Anwendung zu begrenzen.
Beispiel 1
Aus einem Bioreaktor wurde mit Hilfe des erfindungsgemäßen Probeventils eine 12 ml Probe von SF9-Insektenzellen entnommen und durch einen Schlauch (1,5 mm Innendurchmesser, 10 m Länge) mit einer Geschwindigkeit von 3 m/min in dem Probeanalysesystems nach Fig. 5 transportiert. Eine Probe wurde per Hand aus dem Bioreaktor entnommen und vermessen, eine Probe wurde mit dem Probenahmeventil entnommen, von der Probetransportvorrichtung in transportiert und ver- messen. Mit Hilfe des Analysators CEDEX (Firma Innovatis) wurde dort ermittelt, dass der Anteil der lebenden zu abgestorbenen Zellen vor und nach dem Transport gleich war. Darüber hinaus wurde in der Zellbestimmungsstation (56) mit dem Hilfe des Analysators CEDEX festgestellt, dass der Wiederfϊndungsrate der Zellen >90% betrug. Hiermit wurde die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Probeanalysesystems zur Entnahme und Transport von lebendigen Zellen bewie- sen.
Beispiel 2
Aus einem Bioreaktor wurde mit Hilfe des erfmdungsgemäßen Probeventils eine 10 ml Probe von Hybridomazellen entnommen, welche Antikörper zur Bekämpfung von Tumoren produzieren, und durch einen Schlauch (1,5 mm Innendurchmesser, 5 m Länge) mit einer Geschwindigkeit von 3 m/min in dem Probeanalysesystems nach Fig. 5 transportiert. Eine Probe wurde per Hand aus dem Bioreaktor entnommen und vermessen, eine weitere Probe wurde mit dem Probenahmeventil entnommen, von der Probetransportvorrichtung in das Prozessanalysesystem transportiert und vermessen. Mit Hilfe des Analysators CEDEX (Firma Innovatis AG) wurde dort ermittelt, dass der Anteil der lebenden zu abgestorbenen Zellen vor und nach dem Transport gleich war. Darüber hinaus wurde in der Zellbestimmungsstation (56) mit dem Hilfe des Analysators CEDEX festgestellt, dass der Wiederfindungsrate der Zellen >95% betrug. Hiermit wurde die Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Probeanalysesystems zur Entnahme und Transport von lebendigen Zellen bewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Probenahmeventil zur Entnahme einer Probe eines definierten Volumens aus einem Bioreaktor unter reduzierter mechanischer Beanspruchung der Probe umfassend eine Probenkammer definierten Volumens, ein vorderes Dichtelement und ein hinteres Dichtelement, wobei das vordere Dichtelement über eine Verbindungswelle in Richtung des Innenraums des Bioreaktors geöffnet und gleichzeitig das hintere Dichtelement gegen die Probenkammer verschlossen wird.
2. Probenahmeventil gemäß Anspruch 1, wobei das Probenahmeventil durch die Betätigung eines Hubzylinders geöffnet wird.
3. Probenahmeventil gemäß Anspruch 2, wobei der Hubzylinder pneumatisch oder elektrisch angesteuert wird.
4. Probenahmeventil gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei eine Verschlusskraft durch eine Feder, bevorzugt eine Spiralfeder von einer Druckplatte über eine Verbindungswelle auf das hintere Dichtelement übertragen wird.
5. Probenahmeventil gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei zur sicheren Positionierung der Dichtelemente auf der Verbindungswelle eine Führungsstange montiert ist.
6. Probenahmeventil gemäß Anspruch 5, wobei an der Führungsstange eine Membran angebracht ist.
7. Probenahmeventil gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Probenahmeventil an der Öffnung zum Innenraums des Reaktors durch einen selbstreinigenden Filter vor dem Eindringen größerer Aggregate geschützt ist.
8. Probenahmeventil gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das definierte Volumen 2 bis 200 mL beträgt.
9. Prozessanalysesystem , umfassend eine Vorrichtung zur Entnahme einer Probe aus einem Reaktor, eine Probetransportvorrichtung gegebenenfalls eine Aliquotisierungs- und/oder Probevorbereitungsstation und mindestens ein Probenanalysegerät, vorzugsweise Zellzahlbe- stimmungsgeräte, Chromatographiesysteme, Biosensoren, dadurch gekennzeichnet, dass Vorrichtung zur Entnahme einer Probe ein Probenahmeventil gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8 ist.
10. Prozessanalysesystem gemäß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass es an ein Automatisierungssystem, bevorzugt an ein Prozessleitsystem oder eine speicherprogrammierbare Steuerung zur Führung, Steuerung und/oder Regelung des Prozesses in einem Reaktor angebunden ist.
11. Prozessanalysesystem nach einem der Ansprüche 8 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass das Prozessanalysesystem über eine Selbstüberwachung verfugt.
12. Prozessanalysesystem nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Selbstüberwachung die Eigenschaften der Probe mit den Anforderungen der Analysestation vergleicht und eine Vorbereitung der Probe steuert.
13. Prozessanalysesystem nach einem der Ansprüche 8 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Probentransportvorrichtung zum Transport von Suspensionen enthaltend mechanisch empfindlichem Material und insbesondere von lebendigen Zellen, Transportleitungen und mindestens ein System zur Beschleunigung der Probe bzw. Aliquote durch die Transportleitung aus mindestens zwei Büretten umfasst, wobei die Büretten mit folgenden Schritten betrieben werden:
a) eine erste Bürette wird aufgezogen,
b) kurz bevor die erste Bürette am Anschlag angekommen ist, wird eine zweite Bürette aufgezogen und übernimmt den Transport, wobei die Probe weder eine zusätzliche Beschleunigung noch einen kurzen Zwischenstopp erfährt,
c) die erste Bürette wird von den Transportleitungen abgekoppelt und wieder entspannt, so dass sie wieder zur Verfügung steht,
d) Schritte a) bis c) werden wiederholt, wobei die Probe bzw. Aliquote bei einem Durchmesser der Transportleitung von 0.5 bis 3 mm mit einer vordefinierten Transportgeschwindigkeit von 1 bis 10 m/min befördert wird.
14. Verwendung des Prozessanalysesystems nach einem der Ansprüche 8 bis 13 zur Steuerung von einem oder mehreren unabhängig voneinander operierenden Reaktoren insbesondere Bioreaktoren mit unterschiedlichen Zelllinien.
15. Prozessanalysesystem nach einem der Ansprüche 8 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass das Probenanalysegerät biochemische Analyse von Reaktionsprodukten bzw. Nebenkomponen- ten durchführt.
16. Verfahren zum Transport Suspensionen enthaltend mechanisch empfindlichem Material und insbesondere von lebendigen Zellen, wobei der Transport durch eine Probetransportvorrichtung beinhaltend Transportleitungen und mindestens ein System zur Beschleunigung der Probe bzw. Aliquote durch die Transportleitung aus mindestens zwei Büretten stattfindet, wobei die Büretten mit folgenden Schritten betrieben werden:
a. eine erste Bürette wird aufgezogen,
b. kurz bevor die erste Bürette am Anschlag angekommen ist, wird eine zweite Bürette aufgezogen, die den Transport übernimmt, wobei die Probe weder eine zusätzliche Beschleunigung noch einen kurzen Zwischenstopp erfährt,
c. die erste Bürette wird von den Transportleitungen abgekoppelt und wieder entspannt, so dass sie wieder zur Verfügung steht,
d. Schritte a) bis c) werden wiederholt, wobei die Probe bzw. Aliquote bei einem Durchmesser der Transportleitung von 0.5 bis 3 mm mit einer vordefinierten Transportgeschwindigkeit von 1 bis 10 m/min befördert wird.
EP07724279A 2006-04-21 2007-04-17 Prozessanalysensystem mit steriler probenahme von mechanisch empfindlichem material aus einem bioreaktor Withdrawn EP2013328A2 (de)

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WO (1) WO2007121887A2 (de)

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