EP1996606A1 - Tropolon- und hydroxybenzol-substituierte oligopeptide zur depigmentierung - Google Patents

Tropolon- und hydroxybenzol-substituierte oligopeptide zur depigmentierung

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EP1996606A1
EP1996606A1 EP07726729A EP07726729A EP1996606A1 EP 1996606 A1 EP1996606 A1 EP 1996606A1 EP 07726729 A EP07726729 A EP 07726729A EP 07726729 A EP07726729 A EP 07726729A EP 1996606 A1 EP1996606 A1 EP 1996606A1
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EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
acid
skin
oxo
compounds according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP07726729A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Klaus-Heinrich RÖHM
Catrin Scherner
Bernd Schwarz
Michael Wendt
Rainer Wolber
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Beiersdorf AG
Original Assignee
Beiersdorf AG
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Filing date
Publication date
Application filed by Beiersdorf AG filed Critical Beiersdorf AG
Publication of EP1996606A1 publication Critical patent/EP1996606A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • A61K38/05—Dipeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
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    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the pigmentation of the skin is essentially determined by the skin's own pigment melanin. This is formed by specialized cells of the epidermis, the melanocytes. In melanin synthesis, tyrosinase plays a crucial role as a pacemaker enzyme.
  • Lactic acid, glycolic acid, but also vitamin A acid used Lactic acid, glycolic acid, but also vitamin A acid used.
  • Skin-lightening treatments are also known in which antioxidants such as vitamin C and its derivatives are used, or those in which the intracellular stability of the pacemaker enzyme tyrosinase is reduced (for example by linolenic acid).
  • tyrosinase inhibitors are phenolic or catecholic structures.
  • Commonly known tyrosinase inhibitors such as koji acid, arbutin and hydroquinone are used.
  • Hydroquinone is often described in the literature as the "gold standard.” However, effective concentrations in vivo also often have significant side effects.
  • Tropolone and its derivatives are already described in the patent literature as tyrosinase inhibitors and skin lightening agents.
  • JP 63033313 describes the use of tropolone for treating skin spots and freckles.
  • JP 1979-82213 and US 4361581 describe the skin lightening effect of isopropyltropolone, a naturally occurring tropolone derivative also called thujaplicin.
  • EP 308919 describes the use of tropolone in combination with other whitening agents.
  • n can assume the values 1, 2, 3,
  • R 2 is a group chosen from p-hydroxyphenyl, 4-hydroxyhepta-1, 3,6-trien-5-one-1-yl or 2,4-dihydroxyphenyl, 4 [(hydroxyamino) carbonyl] phenyl, ( 5-hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2-yl) -, (3 Hydroxy-4-oxopyridin-1 - (4H) -yl) -, (2-thioxo-1,3-oxazolidin-5-yl) -, 4-
  • R 3 is a group chosen from -OH, NH 2 , remedy the disadvantages of the prior art.
  • this relates to the reduction of unwanted pigmentation, which may naturally occur quite naturally in the respective skin type (whitening) as well as in the various forms of local hyperpigmentation (pigmentation disorders such as age spots, melasma, chlosma, freckles, liver spots, various forms of postinflammatory hyperpigmentation, such as after sunburn, ingrown (beard) hair, after removal of body hair, shaving and inflammatory lesions of the skin (for example, acne) etc).
  • n 1 or 2 in the compounds according to the invention.
  • R 1 is H, tert-butyloxycarbonyl or benzyloxycarbonyl.
  • R 1 H or benzyloxycarbonyl.
  • the compounds according to the invention are oligopeptides which are C-terminally terminal of tyrosine, its tropolone analog or 2,4-dihydroxytyrosine, which is peptidically linked to 2,4-diaminobutyric acid or orinithin.
  • the compounds according to the invention are tri-, preferably dipeptides.
  • the invention also encompasses the use of compounds according to the invention for inhibiting human tyrosinase and for reducing skin pigmentation at a use concentration of 0.0001 to 15% by weight, preferably 0.01 to 1% by weight.
  • the invention also encompasses cosmetic preparations containing a compound according to the invention.
  • the invention also encompasses the use of compounds according to the invention in preparations or the non-therapeutic use of preparations according to the invention to lighten the natural hair color, to reduce the post-reactions of the skin to UV light (sunburn), the after-reaction of the skin to the shave (razor burn). to reduce the skin's own protective and repair mechanisms (for example, for dysfunctional enzymes, DNA, lipids, proteins), as well as for the pre- and post-treatment in topical application of laser and Ableifnessen, z. B. the reduction of skin wrinkles and Scars are used to counteract the resulting skin irritation and to promote the regeneration processes in the injured skin.
  • the compounds according to the invention may be oligopeptides, in particular dipeptides in which a C-terminal tyrosine residue or its analogue, which is derived from the various residues R 2 according to FIG. 2, are orinithin or preferably 2,4-diaminobutyric acid or especially preferably linked to 2,3-diaminopropanoic peptidic act.
  • Figure 1 shows the general structure of these compounds.
  • the particular effectiveness consists in the combination of the peptide structure with a radical R 2 which acts in complex with tyrosinase as a ligand of the essential copper ions of the enzyme.
  • a sterically large, hydrophobic substituent R 1 can improve the inhibitory effect. • In addition to an unprotected N-terminal amino function, this can also be protected by various protective groups.
  • the N-terminal protecting group can be selected from hydrophobic aliphatic linear, aliphatic branched or cyclic and particularly preferably aromatic radicals.
  • C O-cyclohexyl, Coc, N- (4,4-dimethyl-1-oxopentyl), N- (1-oxo-4-pentenyl), N- (4,6-dimethyl-1-oxo-2, 4-dodecadienyl), N- (1-oxo-9, 12,15-octadecatrienyl), N- (4-methyl-1-oxopentyl).
  • N- (1-oxo-10-undecenyl N- (2-methyl-1-oxopropyl) and Fmoc, homo-Z, Moz,
  • the stereochemistry (L- or D-configuration of the two amino acids) has to be taken into account, which has a decisive influence on the effectiveness of the structures. In most cases, L configuration is preferred, but in case of ornithine it is D configuration.
  • preparations according to the present invention can advantageously also contain more than one peptide according to the invention.
  • the preparations according to the present invention may also advantageously contain self-tanning substances such as, for example, dihydroxyactone, melanin derivatives and erythrulose, these substances being used in concentrations of 0.1% by weight up to 8% by weight, preferably 0.4-2% by weight. % based on the total weight of the preparation.
  • the formulations according to the invention can also advantageously contain, in addition to dihydroxyacetone, also nu- tus extracts, as well as other substances which are intended to obtain or produce or additionally strengthen the tan.
  • Moisturizers are substances or mixtures of substances which give cosmetic or dermatological preparations the property of reducing the moisture release of the horny layer (also called transepidermal water loss (TEWL) after application or spreading on the skin surface) and / or hydrating the skin Horny layer to influence positively.
  • TEWL transepidermal water loss
  • the moisturizer (s) are selected from the group: glycerol, lactic acid and / or lactates, in particular sodium lactate, butylene glycol, propylene glycol, biosaccharide Gu ⁇ m-1, glycine soy, ethylhexyloxyglycerol, pyrrolidone carboxylic acid and urea.
  • polymeric moisturizers from the group of water-soluble, water-swellable or water-gellable polysaccharides.
  • glycerol as a moisturizer, preferably in a concentration of 0.05 to 30 wt .-%, particularly preferably 1 to 10 wt .-%, each based on the total weight of the preparation.
  • active ingredients to be used in the context of the present invention are those which have a positive effect on the condition of the skin, in particular active ingredients for positively influencing the aging skin, which reduce the formation of wrinkles or even existing wrinkles.
  • biochinones in particular ubiquinone (Q10), ubiquinol, folic acid and its derivatives (in particular tetrahydrofolic acid and dihydrofolic acid), niacin and its derivatives (especially niacinamide), creatine and creatinine, carnitine, biotin, isoflavone, cardiolipin, lipoic acid, anti-freezing proteins , Hops and hops malt extracts.
  • agents that promote the restructuring of the connective tissue such as natural and synthetic isoflavo noids and isoflavonoid-containing plant extracts - such.
  • soy and clover extracts - can be used very well in the formulations of the invention.
  • the formulations are particularly suitable as active ingredients for supporting the skin functions in dry skin (such as, for example, vitamin C, biotin, carnitine, propionic acid, green tea extracts, eucalyptus oil, urea and mineral salts (such as, for example, NaCl, Marine minerals) as well as osmolytes (such as inositol, betaine, quaternary ammonium compounds)).
  • agents such as sericosides, various extracts of licorice, licochalcone, especially licochalcone A, silymarin, silyphos, dexpanthenol, inhibitors of prostaglandin metabolism, in particular cyclooxygenase and leukotriene metabolism, in particular the 5-lipoxygenase, but also the 5-lipoxvgenase inhibitor protein , FLAP.
  • active compounds are furthermore particularly suitable for applying or renewing an (energy) depot and for activating the repair of various cellular structures, in particular of the DNA.
  • rosin sulphate dioic acid (8-hexadecene-1, 16-dicarboxylic acid) as well as lipoic acid and liponamide, glabridin, various extracts of licorice, mulberry, beech, horse chestnut, witch hazel, as well as baikal helmet, pantethein sulphonates , Kojic acid, Hydroquinone, arbutin, alpha-arbutin, deoxyarbutin, fruit acids, especially alpha-hydroxy acids (AHAs), bearberry extracts (Bearberry or Uvae ursi), ursolic acid, rucinol, deoxyarbutin, Bio377, H-Tyr-Gly-Trp- OH, tropolone, thujaplicin ascorbic acid, green tea extracts, aminoguanidine, pyridoxamine, niacinamide and its derivatives, inhibitors of proteinase activated receptor 2 (PAR-2).
  • PAR-2 proteinase
  • formulations according to the invention which comprise further active ingredients which bring about increased or faster tanning of the skin, whether with or without the influence of UV light. This is extremely true for such formulations of the invention, which serve to reduce local hyperpigmentation (including age spots, freckles, melasma).
  • active ingredients for example, advanced glycation end products (AGE), lipofuscins, glycerrhetin and glycyrrhetinic acid, nucleic acid oligonucleotides, purines and pyrimidines, NO-releasing substances, tyrosine and its derivatives (especially N-acetyl-tyrosine), phenylalanine and its derivatives in particular N-acetyl-phenylalanine and activators of Proteinase Activated Receptor 2 (PAR-2) are used.
  • AGE advanced glycation end products
  • lipofuscins for example, lipofuscins, glycerrhetin and glycyrrhetinic acid, nucleic acid oligonucleotides, purines and pyrimidines, NO-releasing substances, tyrosine and its derivatives (especially N-acetyl-tyrosine), phenylalanine and its derivatives
  • compositions are also obtained when antioxidants are used as additives or active ingredients.
  • the preparations advantageously contain one or more antioxidants.
  • antioxidants As favorable, but nevertheless optional to be used antioxidants all suitable or common for cosmetic and dermatological applications or conventional antioxidants can be used.
  • water-soluble antioxidants can be used, such as vitamins, eg. As ascorbic acid and its derivatives - in particular ascorbyl palmitate, Na and Mg ascorbyl phosphate and ascorbyl acetate - and rutinic acid and derivatives thereof in particular alpha glucosylrutin, quercetin and isoquercetin.
  • vitamins eg. As ascorbic acid and its derivatives - in particular ascorbyl palmitate, Na and Mg ascorbyl phosphate and ascorbyl acetate - and rutinic acid and derivatives thereof in particular alpha glucosylrutin, quercetin and isoquercetin.
  • antioxidants are also vitamin E and its derivatives (in particular vitamin E acetate), vitamin A and its derivatives (in particular vitamin A palmitate) and carnosine, lipoic acid and its derivatives (in particular dihydrolipoic acid and liponamide), butylhydroxytoluene, butylated hydroxyanisole , beta-alanine and carotenoids (especially beta-carotene) and phytoene.
  • the amount of the antioxidants (one or more compounds) in the preparations is preferably 0.001 to 30 wt .-%, particularly preferably 0.05 to 20 wt .-%, in particular 0.1 to 10 wt .-%, based on the total weight the preparation. If vitamin E and / or its derivatives represent the antioxidant (s), it is advantageous to choose their respective concentrations from the range from 0.001 to 10% by weight, based on the total weight of the formulation.
  • vitamin A or vitamin A derivatives, or carotenes or derivatives thereof are the antioxidant (s), it is advantageous if their respective concentrations are in the range from 0.001 to 10% by weight, based on the total weight of the formulation choose.
  • the cosmetic preparations according to the present invention contain cosmetic or dermatological active ingredients, where preferred active ingredients are antioxidants which can protect the skin against oxidative stress.
  • the preparations according to the invention preferably contain at least one further UV-A, UV-B and / or broadband filter substance.
  • the formulations may, although not necessary, optionally also contain one or more organic and / or inorganic pigments as UV filter substances, which may be present in the water and / or the oil phase.
  • Such UV filter substance may be: phenylene-1,4-bis (2-benzimidazyl) -3,3'-5,5'-tetrasulfonic acid salts; 2-phenylbenzimidazole-5-sulfonic acid salts; 1,4-di (2-oxo-10-sulfo-3-bomylidenemethyl) benzene and its salts; 4- (2-oxo-3-bomylidenemethyl) benzenesulfonic acid salts; 2-methyl-5- (2-oxo-3-bomylidenemethyl) sulfonic acid salts; 2,2'-methylene-bis (6- (2H-benzotriazol-2-yl) -4- (1,1,3,3-tetramethylbutyl) -phenol); 2- (2H-Benzotriazol-2-yl) -4-methyl-6- [2-methyl-3- [1,3,3,3-tetramethyl-1 - [(trimethylsilyl) oxy] disiloxanyl
  • Preferred inorganic pigments are metal oxides and / or other sparingly water-soluble or insoluble metal compounds, in particular oxides of titanium (TiO 2 ), zinc (ZnO), iron (eg Fe 2 O), zirconium (ZrO 2 ), silicon (SiO 2 ) 2 ), manganese (eg MnO), aluminum (Al 2 Os), cerium (eg Ce 2 O 3 ), mixed oxides of the corresponding metals as well as mixtures of such oxides and the barium sulfate (BaSO 4 ).
  • the pigments can also be used advantageously in the form of commercially available oily or aqueous predispersions.
  • dispersants and / or solubilizers can be added to these predispersions.
  • the pigments can advantageously be treated superficially, in which case, for example, a hydrophilic, amphiphilic or hydrophobic character is to be formed or retained.
  • This surface treatment may consist in providing the pigments with a thin hydrophilic and / or hydrophobic inorganic and / or organic layer by processes known per se.
  • the various surface coatings may also contain water for the purposes of the present invention.
  • Inorganic surface coatings in the context of the present invention may consist of aluminum oxide (Al 2 O 3 ), aluminum hydroxide Al (OH) 3 or aluminum oxide hydrate (also: alumina, CAS No .: 1333-84-2), sodium hexametaphosphate (NaPO 3 ) 6 , sodium metaphosphate (NaPOs) n , silica (SiO 2 ) (also: silica, CAS No .: 7631-86-9), or iron oxide (Fe 2 O 3 ).
  • Al 2 O 3 aluminum oxide
  • Al aluminum hydroxide Al
  • Al oxide hydrate also: alumina, CAS No .: 1333-84-2
  • sodium hexametaphosphate (NaPO 3 ) 6 sodium metaphosphate (NaPOs) n
  • silica (SiO 2 ) also: silica, CAS No .: 7631-86-9
  • iron oxide Fe 2 O 3
  • Organic surface coatings for the purposes of the present invention may consist of vegetable or animal aluminum stearate, vegetable or animal stearic acid, lauric acid, dimethylpolysiloxane (also: dimethicone), methylpolysiloxane (methicone), simethicone (a mixture of dimethylpolysiloxane with an average chain length of 200 to 350 Dimethylsiloxane units and silica gel) or alginic acid.
  • These organic surface coatings may be present alone, in combination and / or in combination with inorganic coating materials.
  • Zinc oxide particles which are suitable according to the invention and predispersions of zinc oxide particles are obtainable from the following companies under the following commercial names:
  • Suitable titanium dioxide particles and predispersions of titanium dioxide particles are available from the following companies under the following trade names:
  • Latex particles which are advantageous according to the invention are those described in the following documents: US Pat. No. 5,663,213 or EP 0 761 201. Particularly advantageous latex particles are those which are formed from water and styrene / acrylate copolymers and, for. B. under the trade name "AHiance SunSphere" at the company. Rohm & Haas are available.
  • the total amount of inorganic pigments, in particular hydrophobic inorganic micropigments, in the finished cosmetic or dermatological preparations is advantageously from the range from 0.1 to 30% by weight, preferably from 0.1 to 10.0, in particular from 0.5 to 6.0 % By weight, based on the total weight of the preparations.
  • the cosmetic and / or dermatological sunscreen formulations may be composed as usual and serve for cosmetic and / or dermatological sunscreen, furthermore for the treatment, care and cleansing of the skin and / or the hair and as a make-up product in decorative cosmetics.
  • the cosmetic and dermatological preparations are applied according to the invention in the usual manner for cosmetics on the skin and / or hair in sufficient quantity.
  • cosmetic and dermatological preparations which are in the form of a sunscreen.
  • these may additionally comprise at least one further UVA filter and / or at least one further UVB filter and / or at least one inorganic pigment, preferably an inorganic micropigment.
  • Very particularly preferred organic UV filters are ethylhexyl methoxycinnamate, ethylhexyl salicylate, butylmethoxydibenzoylmethane, phenylbenzimidazole sulfonic acid, phenyldibenzimidazole tetrasulfonic acid, benzophenone-3 (oxybenzone) and 4 (2-hydroxy-4-methoxybenzophenone-5-sulfonic acid), terephthalalidenedicamphor sulfonic acid, ethylhexyltriazone, bis (benzyl) Ethylhexyloxyphenolmethoxyphenyltriazine, 3- (4-methylbenzylidene) camphor, 2-ethylhexyl-2-cyano-3,3-diphenylacrylate, homomenthylsalicylate.
  • metal oxides and / or other water-insoluble or insoluble metal compounds in particular oxides of titanium (TiOa), zinc (ZnO), iron (eg Fe 2 O 3), zirconium (ZrOa), silicon ( SiO 2), manganese (for example MnO), aluminum (Al 2 O 3 ), cerium (for example Ce 2 O 3 ), mixed oxides of the corresponding metals and mixtures of such oxides and the barium sulfate (BaSO 4 ) ,
  • the pigments can advantageously be treated superficially, in which case, for example, a hydrophilic, amphiphilic or hydrophobic character is to be formed or retained.
  • This surface treatment can consist in providing the pigments with a thin hydrophilic and / or hydrophobic inorganic and / or organic layer by processes known per se.
  • the various surface coatings may also contain water for the purposes of the present invention.
  • Inorganic surface coatings for the purposes of the present invention may consist of aluminum oxide (Al 2 O 3 ), aluminum hydroxide Al (OH) 3 , or aluminum oxide hydrate (also: alumina, CAS No .: 1333-84-2), sodium hexametaphosphate (NaPO 3 ).
  • sodium metaphosphate (NaPOs) n silicon dioxide (SiO 2 ) (also: silica, CAS No .: 7631-86-9), or iron oxide (Fe 2 Os).
  • SiO 2 silicon dioxide
  • Fe 2 Os iron oxide
  • Organic surface coatings for the purposes of the present invention may consist of vegetable or animal aluminum stearate, vegetable or animal stearic acid, lauric acid, dimethylpolysiloxane (also: dimethicone), methylpolysiloxane (methicone), simethicone (a mixture of dimethylpolysiloxane with an average chain length of 200 to 350 Dimethylsiloxane units and silica gel) or alginic acid.
  • These organic surface coatings may be present alone, in combination and / or in combination with inorganic coating materials.
  • icylate, homosalate ( 3,3,5-trimethylcyclohexyl-2-hydroxybenzoate)
  • the cosmetic and dermatological preparations according to the invention may contain cosmetic adjuvants, such as are commonly used in such preparations, for.
  • cosmetic adjuvants such as are commonly used in such preparations, for.
  • Preservatives, bactericides, perfumes, foaming inhibitors, dyes, pigments having a coloring effect, thickeners, moisturizing and / or moisturizing substances, fats, oils, waxes or other common ingredients of a cosmetic or dermatological formulation such as alcohols, Polyols, polymers, foam stabilizers, electrolyte ⁇ , organic solvents or silicone derivatives.
  • the K values shown in Table 1 are based on a novel tyrosinase assay for which previously recombinant human tyrosinase is recovered in a eukaryotic expression system (see Appendix 1).
  • this assay the principle of which is published, the tyrosinase L-DOPA oxidase activity is exploited, converting L-DOPA to dopaquinone.
  • the formed dopachinone is reacted with MBTH (Besthorn 's Hydrazone).
  • the pink reaction product can be measured photometrically.
  • the main advantage of this assay for drug development is that it allows the inhibitor properties of drug candidates to be screened for the first time on human tyrosinase, which has been shown to differ structurally from any currently available fungal tyrosinase.
  • Table 1 shows some compounds that have been found to be particularly effective (+++).
  • the structures mentioned in Table 1 also take into account the stereochemistry, which has a decisive influence on the effectiveness of the structures.
  • tyrosinase 70% confluent, adherent Sf9 cells were used at a MOI (multiplicity of infection, number of infectious particles per cell) of 10-15. The highest dopaoxidase activity was detectable three days after infection. At this time also the cell harvest took place. The cells were detached, washed twice with PBS (4 ° C) and the pellets stored at -80 ° C until further use. To prepare the cell extracts, the pellets are thawed on ice and resuspended in Lysis buffer (50 mM HEPES, 200 mM NaCl, 1% TritonX-100 or Chaps) and disrupted by ultrasound.
  • Lysis buffer 50 mM HEPES, 200 mM NaCl, 1% TritonX-100 or Chaps
  • the lysate is centrifuged for 15 minutes at 15,000 xg to remove debris and dialyzed (or rebuffered via Sephadex 25) to PBS (20 mM KP 1 , 150 mM NaCl, pH 7.3-7.4) 0.5% Triton X-100) Lysate can be stored for up to 2 weeks at 4 ° C and used for activity measurements become. Due to the observed stability of the enzyme, the addition of protease inhibitors was dispensed with. The recombinant enzyme was glycosylated and showed the kinetic properties and inhibition described in the literature by classical tyrosinase inhibitors such as kojic acid and mimosine.
  • the human tyrosinase was expressed by infecting the insect cells (Sf9) with the recombinant virus at a MOI (multiplicity of infection) of 10-15.
  • both adherently growing Sf9 cells and Sf9 suspension cultures can be used.
  • the infection took place in adherently growing cells at 70% confluence and in cells growing in suspension cultures at a cell density of 2 ⁇ 10 6 cells / ml.
  • the highest dopa oxidase activity was detectable three days after infection, at which time the cell harvest was also performed.
  • the cells were detached or harvested by centrifugation, washed twice with PBS and the pellets stored at -80 ° C until further use.
  • the cells were taken up in 25 mM Tris pH 8.0 and disrupted by pressing three times through a 27 ⁇ l gauge cannula.
  • the cell fragments were separated by centrifugation at 18,000 rpm (Beckman, Ja-20 rotor) for 15 minutes, and the supernatant containing the soluble proteins was discarded.
  • the pellet was taken up in PBS 2% chaps, suspended by means of a Potter homogenizer and incubated with stirring for one hour. Subsequently, the cell debris was separated by another 15-minute centrifugation at 18,000 rpm in the Ja-20 rotor. The supernatant, after reprecipitation (Amersham, G-25) on PBS 0.1% CHAPS, could be used directly for activity measurements or subjected to prepurification by ion exchange chromatography.
  • the extract was rebuffered to 25 mM Tris pH 8.0, 0.1% CHAPS and bound to Q-Sepharose (Amersham) equilibrated in the same buffer and eluted with 25 mM Tris pH8.0, 300 mM NaCl, 0.1% CHAPS , The eluate could be used after transient buffering (G-25) on PBS 0.1% CHAPS for activity measurements.
  • the step of anion exchange chromatography serves to enrich the tyrosinase in the protein extract.
  • the dopa oxidase assay used is based essentially on the protocol described by Winder and Harris [Winder AJ, Harris H (1991) "New assays for the tyrosine hydroxylase and dopa oxidase activities of tyrosinase" Eur J Biochem 198 (2),
  • the reactions were carried out in 50 mM potassium phosphate buffer pH 7.0, [pH 6.9 in Winder and Harris] 12% DMSO [2% DMF], 6 mM MBTH (Besthorn's hydrazone) and various concentrations of the substrate L-Dopa (0 - 7.5 mM) at 37 ° C in 96-well plates.
  • the volume per reaction mixture was 250 ⁇ l and depending on the activity of the respective preparation, 10 to 30 ⁇ l of the tyrosine extract from infected insect cells were used.
  • Tyrosinase catalyzes the oxidation of L-dopa to L-dopaquinone, which reacts in a further reaction with the MBTH used to form a stable, pink dye which can be measured photometrically at a wavelength of 505 nm (microplate photometer: 490 nm filter) ,
  • the standard use of 12% DMSO in the reaction mixtures ensures the solubility of the MBTH used even at elevated salt concentrations and significantly improves the solubility of many inhibitors tested with the assay.
  • Glycyrrhiza Glabra 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05
  • Phenylbenzimidazole sulfonic acid 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
  • Diazolidinyl urea 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
  • Diazolidinyl urea 0, 25 0, 25 0, 25 0.25
  • Trisodium EDTA 0.5 0, 5 0, 5 0, 5
  • Diazolidinyl urea 0, 2 0, 2 0, 2 0, 2

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Abstract

Verbindungen der Formel R<SUP>1</SUP>-NH-C*H((CH<SUB>2</SUB>)<SUB>n</SUB>-NH<SUB>3</SUB> <SUP>+</SUP>)

Description

Beiersdorf AG Hamburg
Tropolon- und Hydroxybenzol-substituierte Oligopeptide zur Depigmentierung
Lokale Hyperpigmentierungen sowie eine zu starke konstitutive Pigmentierung werden als kosmetischer Makel empfunden. Die Pigmentierung der Haut wird ganz wesentlich durch das haut- eigene Pigment Melanin bestimmt. Dieses wird von spezialisierten Zellen der Epidermis, den Melanozyten, gebildet. Bei der Melaninsynthese spielt die Tyrosinase als Schrittmacherenzym eine ganz entscheidende Rolle.
Neben der gleichmäßigen Pigmentierung der Haut, die sich im so genannten Phototyp wider- spiegelt, kann es auch zu verstärkten lokalen Pigmentierungen kommen, die unterschiedliche Ursachen haben können. Als Beispiele für diese lokalen Hyperpigmentierungen wären zu nennen: Sommersprossen, Altersflecken, Melasma, Chloasma, postinflammatorische Hyperpigmentierung, Leberflecken und viele mehr. Allen Formen der Pigmentierung ist gemeinsam, dass (zu viel) Melanin auftritt.
Lokale Hyperpigmentierungen wie auch eine an sich dem Hauttyp durchaus angemessene Pigmentierung werden häufig als kosmetische Makel wahrgenommen. Es wurden daher unterschiedliche Strategien entwickelt, die Pigmentierung der Haut zu vermindern. Neben der Inhibition der Melaninsynthese, die maßgeblich durch das Schrittmacherenzym Tyrosinase gesteuert wird, sind auch Angänge bekannt, die den Transfer des Melanins aus den Melanozyten in die umgebenden Keratinozyten verhindern. So werden Serinprotease-Inhibitoren beispielsweise aus Sojabohnen beschrieben, die diesen Transfer unterbinden. Niacinamid soll in ähnlicher Weise die Pigmentierung vermindern. Auch eine verstärkte Erneuerung der Haut, die mit einer erhöhten Abschilferung der melaninhaltigen Korneozyten der Haut einhergeht, wird zur Hautaufhellung beschrieben. Für diese Vorgehensweise werden u. a. Milchsäure, Glykolsäure, aber auch Vitamin-A-Säure eingesetzt. Auch sind hautaufhellende Behandlungsweisen bekannt, bei denen Antioxidantien wie Vitamin C und seine Derivate zum Einsatz kommen, oder solche, bei denen die intrazelluläre Stabilität des Schrittmacherenzyms Tyrosinase vermindert wird (beispielsweise durch Linolensäure).
Neben den zuvor beschriebenen Vorgehensweisen zur Hautaufhellung steht eine direkte Inhibition der Tyrosinase im Vordergrund vieler Strategien. Die meisten Inhibitoren sind phenolische oder catechole Strukturen. Hierbei kommen allgemein bekannte Tyrosinaseinhibitoren wie Koji- säure, Arbutin und Hydrochinon zum Einsatz. Hydrochinon wird in der Literatur oftmals als „Goldstandard" beschrieben. Allerdings zeigen in vivo wirksame Konzentrationen auch häufig deutliche Nebenwirkungen. Aufgrund dieser toxikologischen Probleme, die bei fast allen hautaufhellenden Ansätzen auftreten können, fehlt es nach wie vor an wirksamen pigmentie- rungsvermindernden Wirkprinzipien, die toxikologisch unbedenklich sind. Die bislang verfügbaren Tyrosinase-Inhibitoren wurden für eine Pilztyrosinase optimiert. Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es weiterhin, Inhibitoren für die menschliche Tyrosinase zu entwickeln, die diese hocheffizient inhibieren, um die Hautpigmentierung zu minimieren.
Tropolon und seine Derivate werden in der Patentliteratur bereits als Tyrosinase-Inhibitoren und Substanzen zur Hautaufhellung beschrieben. So beschreibt beispielsweise JP 63033313 die Verwendung von Tropolon zur Behandlung von Hautflecken und Sommersprossen. JP 1979- 82213 sowie US 4361581 beschreiben die hautaufhellende Wirkung von Isopropyltropolon, einem natürlich vorkommenden Tropolon-Derivat, das auch Thujaplicin genannt wird. EP 308919 beschreibt die Verwendung von Tropolon in Kombination mit anderen Whitening-Wirkstoffen.
Auch werden in der Patentliteratur peptidische Strukturen zur Tyrosinase-lnhibition beschrieben (z. B. WO 2000064926, US 5126327). Keine dieser Strukturen zeigt Übereinstimmungen mit den erfindungsgemäßen Verbindungen. Bestandteil der Erfindung sind somit sowohl der neuartige Enzymassay wie auch die mit seiner Hilfe identifizierten Strukturen.
Überraschenderweise hat es sich gezeigt, dass erfindungsgemäße Verbindungen der Formel
R1-NH-C*H((CH2)n-NH3+)-C=O-NH-C*H(CH2R2)-C=O-R3
wobei n die Werte 1 , 2, 3 annehmen kann,
R1 eine Gruppe gewählt unter H, Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-, Acetyl, eine geradkettige aliphatische Acylgruppe mit 3 bis 24 Kohlenstoffatomen, Voc (Vinyloxycarbopnyl), Alloc (Allyloxycarbonyl), Ipaoc (1-lsopropylallyloxycarbonyl), - C=O-Cyclohexyl, Coc (Cinnamy- loxycarbonyl), N-(4,4-dimethyl-1-oxopentyl), N-(1-oxo-4-pentenyl), N-(4,6-dimethyl-1-oxo-2,4- dodecadienyl), N-(1-oxo-9,12,15-octadecatrienyl), N-(4-methyl-1-oxopentyl), N-(1-oxo-10- undecenyl), N-(2-methyl-1-oxopropyl), Fmoc (9-Fluorenylmethoxycarbonyl), homo-Z (homo- Benzyloxycarbonyl), Moz (p-Methoxybenzyloxycarbonyl), 9-Anthrylmethyl, N-phenylethyl und Tri (Triphenylmethyl) darstellt,
R2 eine Gruppe gewählt unter p-Hydroxyphenyl-, 4-Hydroxyhepta-1 ,3,6-trien-5-on-1-yl- oder 2,4-Dihydroxyphenyl-, 4[(Hydroxyamino)carbonyl]phenyl- , (5-Hydroxy-4-oxo-4H-pyran-2yl)-, (3- Hydroxy-4-oxopyridin-1 -(4H)-yl)-, (2-Thioxo-1 ,3-oxazolidin-5-yl)-, 4-
[(Aminocarbonothioyl)amino]phenyl)-, (2,2'Bipyridin-4-yl)-, (5-Butyl-2,4-dihydroxy-phenyl)- , 2,4- Dihydroxy-5-(1 -phenylethyl)phenyl-, (4-Hydroxy-5-thioxocyclohepta-1 ,3,6-trien-1 -yl)- darstellt,
R3 eine Gruppe gewählt unter -OH, NH2 ist, den Nachteilen des Standes der Technik abhelfen.
Diese sind hervorragend geeignet, die menschliche Tyrosinase zu inhibieren und somit eine Verminderung der Hautpigmentierung herbeizuführen. Insbesondere betrifft dies die Verminderung unerwünschter Pigmentierung wie sie beim jeweiligen Hauttyp natürlicherweise durchaus angemessen auftreten kann (Whitening) sowie bei den verschiedenen Formen von lokaler Hyperpigmentierung (Pigmentierungsstörungen wie z.B. Altersflecken, Melasma, Chlosma, Sommersprossen, Leberflecken, verschiedene Formen der postinflammatorischen Hyperpigmentierung, wie sie nach Sonnenbränden, eingewachsenen (Bart-) Haaren, nach Entfernen von Körperbehaarung, Rasur und bei entzündlichen Läsionen der Haut (beispielsweise Akne) etc auftreten).
Ferner sind die erfindungsgemäßen Verbindungen hervorragend geeignet, um
• die natürliche Haarfarbe aufzuhellen. • die Nachreaktionen der Haut auf UV-Licht (Sonnenbrand) zu mindern
• die Nachreaktionen der Haut auf die Rasur (Rasurbrand) zu mindern
• die hauteigenen Schutz- und Reparaturmechanismen (beispielsweise für dysfunktionelle Enzyme, DNA, Lipide, Proteine) zu steigern
• sowie zur Vor- und Nachbehandlung bei topischer Anwendung von Laser- und Abschleif- behandlungen, die z. B. der Reduzierung von Hautfalten und Narben dienen, um den resultierenden Hautreizungen entgegenzuwirken und die Regenerationsprozesse in der verletzten Haut zu fördern.
Darüber hinaus weisen erfindungsgemäße Verbindungen und Formulierungen hieraus folgende weitere Vorteile auf:
• Sehr gute Hautverträglichkeit
• Gute Formulierbarkeit und hohe Stabilität in den Formulierungen
• Verbesserte Durchblutung und Revitalisierung und Zellerneuerung der Haut, wodurch ein gesunder Hautteint herbeigeführt wird • Straffung der Haut und Verminderung von Cellulite
• Verminderung von (UV-bedingten) Zeichen der Hautalterung und Hautschädigung, d. h. Verminderung von Hautfältchen und Hautfalten sowie Teleangiektasien
• Stimulation und Verbesserung der Hautfestigkeit
• Verbesserung der Hautfeuchtigkeit
• Verminderung von Juckreiz
und zwar sowohl präventiv als auch im Sinne einer Behandlung.
Bevorzugt ist es, wenn in den erfindungsgemäßen Verbindungen n = 1 oder 2 ist.
Weiter bevorzugt ist es, wenn R1 = H, tert.-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonyl- ist.
Besonders bevorzugt ist es, wenn R1 = H oder Benzyloxycarbonyl ist.
Ganz besonders bevorzugt ist es, wenn es sich bei den erfindungsgemäßen Verbindungen um Oligopeptide, die C-terminal endständig aus Tyrosin, seinem Tropolonanalogon oder 2,4- Dihydroxytyrosin bestehen, welches mit 2,4-Diaminobuttersäure oder Orinithin peptidisch verknüpft ist.
Weiter bevorzugt ist es, wenn es sich bei den erfindungsgemäßen Verbindungen um Tri-, bevorzugt Dipeptide handelt. Die Erfindung umfasst auch die Verwendung von erfindungsgemäßen Verbindungen zur Inhibierung der menschliche Tyrosinase und zur Verminderung der Hautpigmentierung in einer Einsatzkonzentration von 0,0001 bis 15 Gew.-%, bevorzugt 0,01 bis 1 Gew.%. Die Erfindung umfasst auch kosmetische Zubereitungen enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung.
Die Erfindung umfasst auch die Verwendung erfindungsgemäßer Verbindungen in Zubereitungen bzw. die nicht therapeutische Verwendung erfindungsgemäßer Zubereitungen um die natürliche Haarfarbe aufzuhellen, die Nachreaktionen der Haut auf UV-Licht (Sonnen- brand) zu mindern, die Nachreaktionen der Haut auf die Rasur (Rasurbrand) zu mindern, die hauteigenen Schutz- und Reparaturmechanismen (beispielsweise für dysfunktionelle Enzyme, DNA, Lipide, Proteine) zu steigern, sowie zur Vor- und Nachbehandlung bei topischer Anwendung von Laser- und Abschleifbehandlungen, die z. B. der Reduzierung von Hautfalten und Narben dienen, um den resultierenden Hautreizungen entgegenzuwirken und die Regenerationsprozesse in der verletzten Haut zu fördern.
Bei den erfindungsgemäßen Verbindungen kann es sich um Oligopeptide, insbesondere Dipeptide, in denen ein C-terminaler Tyrosinrest bzw. sein Analogon, dass sich gemäß Abbildung 2 aus den verschiedenen Resten R2 ableitet, mit Orinithin oder bevorzugt mit 2,4- Diaminobuttersäure oder besonders bevorzugt mit 2,3-Diaminopropansäure peptidisch verknüpft ist, handeln. In Abbildung 1 ist die allgemeine Struktur dieser Verbindungen dargestellt. Die besondere Wirksamkeit besteht in der Kombination der Peptidstruktur mit einem Rest R2 der im Komplex mit Tyrosinase als Ligand der essentiellen Kupferionen des Enzyms fungiert. Bevorzugte Reste R2 sind 2/1 , 2/2, 2/3, 2/5 2/9, hiervon besonders bevorzugt 2/1 mit R6, R4 = -H und R5 = -OH sowie 2/2.
Abb. 1 Allgemeine Struktur der Wirkstoffe
2/1 2/2 2/3 2/4 2/5
2/6 2/7 2/8 2/9
Abb. 2: Gruppen in Position R2
(R4, R5 = -H oder -OH, R6 = H, OH, -(CH2)n-CH3 mit n= 0-15, -CH(Me)(Ph), Ph, OAc):
2/1 : Phenole und Catechole;
2/2: Tropolon ; 2/3: Salicylhydroxamsäure;
2/4: 5-Hydroxy-4-pyron;
2/5: 3-Hydroxy-4-oxopyridine;
2/6: Thiooxazolidon;
2/7: Phenylthioharnstoff; 2/8: alph.alpha'-Dipyridyl
2/9: 2-Hydroxythiotropolon
Ergänzend zu den Abbildungen 1 und 2 lassen sich folgende Merkmale festhalten:
• Bei der N-terminalen Aminosäure ist eine freie Aminogruppe in der Seitenkette essentiell, ferner gilt: n = 1 ist wirksamer als n = 2; n = 2 ist wirksamer als n = 3 (siehe Abb.1 )
Ein sterisch großer, hydrophober Substituent R1 kann die Hemmwirkung verbessern. • Neben einer ungeschützen N-terminalen Aminofunktion kann diese auch durch verschiedene Schutzgruppen geschützt sein. Die N-terminale Schutzgruppe kann aus hydrophoben aliphatisch linearen, aliphatisch verzweigten bzw. cyclischen und besonders bevorzugt aromatischen Resten gewählt werden.
• Bevorzugte Reste sind - Ac, - C=O (CH2)nCH3 wobei n= 1-22, Voc, Alloc, Ipaoc.
• C=O-Cyclohexyl, Coc, N-(4,4-dimethyl-1-oxopentyl), N-(1-oxo-4-pentenyl), N-(4,6- dimethyl-1 -oxo-2,4-dodecadienyl), N-(1 -oxo-9, 12,15-octadecatrienyl), N-(4-methyl-1 - oxopentyl). N-(1-oxo-10-undecenyl), N-(2-methyl-1-oxopropyl) sowie Fmoc, homo-Z, Moz,
9-Anthrylmethyl, N-phenylethyl, Boc und Trt.
• Besonders bevorzugt ist Cbz (Carbobenzoxy)
• Als Substituent R2 sind gute Kupferliganden besonders wirksam.
• C-terminal amidierte Peptide (R3 = -NH2) sind wirksamer als die freien Säuren
Tabelle 1 zeigt Verbindungen der in Abb. 1a dargestellten allgemeinen Struktur (R2 = 4-Hydroxybenzyl-) , die sich als besonders wirksame Inhibitoren erwiesen haben (+++). Dabei ist auch die Stereochemie (L- bzw. D-Konfiguration der beiden Aminosäuren) zu berücksichtigen, die einen entscheidenden Einfluss auf die Wirksamkeit der Strukturen hat. In den meisten Fällen ist L-Konfiguration bevorzugt, im Falle von Ornithin aber D-Konfiguration.
Als besonders wirksam haben sich folgende erfindungsgemäße Strukturen herausgestellt:
Peptid 1
Λ/-[(2S)-2,4-diaminobutanoyl]-L-tyrosine Peptid 2
L-ornithyl-L-tyrosine
Peptid 3
/^-[(benzyloxyJcarbonyll-D-ornithyl-L-tyrosine
Peptid 4
W-((2R)-4-amino-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butanoyl)-L-tyrosine Peptid 5
Λ/-[(2S)-2,4-diaminobutanoyl]-2-hydroxy-L-tyrosine
Peptid 6
L-ornithyl-2-hydroxy-L-tyrosine
Peptid 7
Λ/2-[(benzyloxy)carbonyl]-D-ornithyl-2-hydroxy-L-tyrosine Peptid 8
/V-((2R)-4-amino-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butanoyl)-2-hydroxy-L-tyro sine
Peptid 9
3-amino-L-alanyl-2-hydroxy-L-tyrosine
Peptid 10
(2S)-2-{[(2S)-2,4-diaminobutanoyl]amino}-3-(4-hydroxy-5-oxocyclohepta-1,3 ,6-trien-1-yl)propanoic acid Peptid 11
L-ornithyl-3-(4-hydroxy-5-oxocyclohepta-1,3,6-trien-1-yl)-L-alanine
Peptid 12
S-amino-L-alanyl-S^-hydroxy-S-oxocyclohepta-I.S.e-trien-i-yO-L-alanine
Peptid 13
^-[(benzyloxyJcarbonyll-D-ornithyl-S^-hydroxy-S-oxocyclohepta-I.S.e-trie n-1-yl)-l_ -alanine Peptid 14
(2S)-2-[((2R)-4-amino-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butanoyl)amino]-3-(4- hydroxy-5-oxocyclohepta-1 ,3,6-trien-1 -yl)propanoic acid
Peptid 15
S-amino-L-alanyl-S^-hydroxy-S-thioxocyclohepta-ijSjθ-trien-i-y^-L-alanin e
Peptid 16
(2S)-2-[((2R)-4-amino-2-{[(benzyloxy)carbonyl]amino}butanoyl)amino]-3-(4- hydroxy-5-thioxocyclohepta-1,3,6-trien-1-yl)propanoic acid Die genannten Substanzen können teilweise von der Firma Bachern käuflich erworben werden, wobei die Aminosäure Tropolonylalanin mit Hilfe des Enzyms Tyrosin_Phenollyase analog zur Herstellung von Dopa aus Tropolon bzw. 2-Hydroxythiotropolon und Ammoniak hergestellt werden kann (Foor F.Morin N, Bostian KA (1993) Production of L-dihydroxyphenylalanine in Esche- richia coli with the tyrosine phenol-lyase gene cloned from Erwinia herbicola. Appl Environ Mic- robiol 59, 3070-3075 sowie „Verfahren zur enzymatischen Herstellung von Troponolylalanin mit Tyrosin-Phenol-Lyase": JP 08070878). Das Peptid wird dann als Sondersynthese mit den gebräuchlichen Peptidsyntheseverfahren hergestellt.
Die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung können vorteilhaft auch mehr als ein erfindungsgemäßes Peptid enthalten.
Die Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung können ferner vorteilhaft auch Selbstbräunungssubstanzen wie beispielsweise Dihydroxyacteon, Melaninderivate und Erythrulose enthalten, wobei diese Substanzen in Konzentrationen von 0,1 Gew.-% bis zu 8 Gew.-%, bevorzugt 0,4 - 2 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung eingesetzt werden. Die erfindungsgemäßen Formulierungen können ferner vorteilhaft neben Dihydroxyaceton auch Nussextrakte enthalten sowie weitere Substanzen, welche die Bräune erhalten oder erzeugen oder zusätzlich verstärken sollen. Als extrem vorteilhaft hat sich die Kombination von Selbstbräunern, insbesondere Dihydroxyaceton und Erythrulose, mit den erfindungsgemäßen Verbindungen in kosmetischen Zubereitungen erwiesen, um unerwünschte Hyperpigmentierungen (Melasma, Altersflecken, Sommersprossen etc.) zu behandeln.
Als Moisturizer werden Stoffe oder Stoffgemische bezeichnet, welche kosmetischen oder der- matologischen Zubereitungen die Eigenschaft verleihen, nach dem Auftragen bzw. Verteilen auf der Hautoberfläche die Feuchtigkeitsabgabe der Hornschicht (auch transepidermal water loss (TEWL) genannt) zu reduzieren und/oder die Hydratation der Hornschicht positiv zu beeinflussen.
Vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung werden der oder die Moisturizer gewählt aus der Gruppe: Glycerin, Milchsäure und/oder Lactate, insbesondere Natriumlactat, Butylenglykol, Propylenglykol, Biosaccaride Guιm-1 , Glycine Soja, Ethylhexyloxyglycerin, Pyrrolidoncarbon- säure und Harnstoff. Ferner ist es insbesondere von Vorteil, polymere Moisturizer aus der Gruppe der wasserlöslichen, in Wasser quellbaren oder mit Hilfe von Wasser gelierbaren PoIy- saccharide zu verwenden. Insbesondere vorteilhaft sind beispielsweise Hyaluronsäure, Chi- tosan und ein fucosereiches Polysaccharid, welches in den Chemical Abstracts unter der Registraturnummer 178463-23-5 abgelegt und z. B. unter der Bezeichnung Fucogel®1000 von der Gesellschaft SOLABIA S.A. erhältlich ist. Moisturizer können vorteilhaft auch als Antifaltenwirk- Stoffe zur Prophylaxe und Behandlung kosmetischer oder dermatologischer Hautveränderungen, wie sie z. B. bei der Hautalterung auftreten, verwendet werden. Es ist besonders vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung, Glycerin als Moisturizer zu verwenden, bevorzugt in einer Konzentration von 0,05 bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt 1 bis 10 Gew.-%, jeweils bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
Weitere vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung einzusetzende Wirkstoffe sind solche, die den Zustand der Haut positiv beeinflussen, wie insbesondere Wirkstoffe zur positiven Beeinflussung der Altershaut, die die Entstehung von Falten oder auch bestehende Falten vermin- dem. Vorteilhaft sind insbesondere Biochinone, insbesondere Ubichinon (Q10), Ubichinol, Folsäure und ihre Derivate (insbesondere Tetrahydrofolsäure und Dihydrofolsäure), Niacin und seine Derivate (insbesondere Niacinamid), Kreatin und Kreatinin, Carnitin, Biotin, Isoflavon, Cardiolipin, Liponsäure, Anti Freezing Proteine, Hopfen- und Hopfen-Malz-Extrakte. Auch Mittel, die die Restrukturierung des Bindegewebes fördern, wie natürliche und synthetische Isoflavo- noide sowie Isoflavonoid-haltige Pflanzenextrakte - wie z. B. Soja- und Klee-Extrakte - können in den erfindungsgemäßen Formulierungen sehr gut verwendet werden. Auch zeigt sich, dass sich die Formulierungen in besonderer Weise eignen, Wirkstoffe zur Unterstützung der Hautfunktionen bei trockener Haut (wie beispielsweise Vitamin C, Biotin, Carnitin, Propionsäure, Grüntee-Extrakte, Eucalyptusöl, Harnstoff und Mineralsalze (wie z. B. NaCI, Meeresmineralien) sowie Osmolyte (wie z. B. Inositol, Betain, quartäre Ammoniumverbindungen)) zu verwenden. In ähnlicher Weise erwies sich die Einarbeitung von Wirkstoffen zur Linderung bzw. positiven Beeinflussung von irritativen Hautzuständen, sei es bei empfindlicher Haut im allgemeinen oder bei durch Noxen gereizter Haut (UV-Licht, Chemikalien), als vorteilhaft. Hier sind Wirkstoffe zu nennen wie Sericoside, verschiedene Extrakte des Süßholzes, Licochalcone, insbesondere Licochalcon A, Silymarin, Silyphos, Dexpanthenol, Inhibitoren des Prostaglandinstoffwechsels, insbesondere der Cyclooxygenase und des Leukotrienstoffwechsels, insbesondere der 5- Lipoxyaenase, aber auch des 5-Lipoxvgenase Inhibitor Proteins, FLAP. Die zuvor genannten Wirkstoffe sind ferner insbesondere geeignet, um ein (Energie-) Depot anzulegen oder zu erneuern sowie die Reparatur (Repair) unterschiedlicher zellulärer Strukturen, insbesondere der DNA zu aktivieren.
Auch erwies sich die Einarbeitung von weiteren Modulatoren der Pigmentierung als ganz besonders vorteilhaft. Hier sind zum einen Wirkstoffe zu nennen, die die Pigmentierung der Haut vermindern und so zu einer kosmetisch gewünschten Aufhellung der Haut führen, das Auftreten von Altersflecken reduzieren oder bestehende Altersflecken aufhellen. Hervorgehoben sei Ty- rosinsulfat, Dioic acid (8-Hexadecen-1 ,16-dicarbonsäure) sowie Liponsäure und Liponamid, Glabridin, verschiedene Extrakte des Süßholzes, des Maulbeerbaums, der Rotbuche, der Rosskastanie, der Zaubernuss, sowie des Baikal-Helmkrautes, Pantetheinsulfonate, Kojisäure, Hydrochinon, Arbutin, Alpha-Arbutin, Deoxyarbutin, Fruchtsäuren, insbesondere Alpha- Hydroxy-Säuren (AHAs), Bärentrauben-Extrakte (Bearberry oder Uvae ursi), Ursolsäure, Ruci- nol, Deoxyarbutin, Bio377, H-Tyr-Gly-Trp-OH, Tropolon, Thujaplicin Ascorbinsäure, Grüntee- Extrakte, Aminoguanidin, Pyridoxamin, Niacinamid und seine Derivate, Inhibitoren des Protei- nase Activated Receptors 2 (PAR-2). Ganz besonders bevorzugt sind ferner erfindungsgemäße Formulierungen, die weitere Wirkstoffe enthalten, die eine verstärkte oder schnellere Bräunung der Haut herbeiführen, sei es mit oder ohne Einfluss von UV-Licht. Dies gilt ganz extrem für derartige erfindungsgemäße Formulierungen, die der Verminderung lokaler Hyperpigmentierungen dienen (u. a. Altersflecken, Sommersprossen, Melasma). Als solche Wirkstoffe können beispielsweise Advanced Glycation Endproducts (AGE), Lipofuscine, Glycerrhetin und GIy- cyrrhetinsäure, Nukleinsäure Oligonukleotide, Purine und Pyrimidine, NO-freisetzende Substanzen, Tyrosin und seine Derivate (insbesondere N-Acetyl-Tyrosin), Phenylalanin und seine Derivate insbesondere N-Acetyl-Phenylalanin sowie Aktivatoren des Proteinase Activated Receptors 2 (PAR-2) eingesetzt werden.
Besonders vorteilhafte Zubereitungen werden ferner erhalten, wenn als Zusatz- oder Wirkstoffe Antioxidantien eingesetzt werden. Erfindungsgemäß enthalten die Zubereitungen vorteilhaft eines oder mehrere Antioxidantien. Als günstige, aber dennoch fakultativ zu verwendende Antioxidantien können alle für kosmetische und dermatologische Anwendungen geeigneten oder gebräuchlichen Antioxidantien verwendet werden.
Ganz besonders vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung können wasserlösliche Antioxidantien eingesetzt werden, wie beispielsweise Vitamine, z. B. Ascorbinsäure und deren Derivate - insbesondere Ascorbylpalmitat, Na- und Mg-Ascorbylphosphat und Ascorbylacetat - sowie Rutinsäure und deren Derivate insbesondere alpha Glucosylrutin, Quercetin und Isoquer- cetin.
Besonders bevorzugte Antioxidantien sind ferner Vitamin E und dessen Derivate (insbesondere Vitamin E-Acetat), Vitamin A und dessen Derivate (insbesondere Vitamin-A-Palmitat) sowie Carnosin, Liponsäure und ihre Derivate (insbesondere Dihydroliponsäure und Liponamid), Bu- tylhydroxytoluol, Butylhydroxyanisol, beta-Alanin sowie Carotinoide (insbesondere beta-Carotin) und Phytoen.
Die Menge der Antioxidantien (eine oder mehrere Verbindungen) in den Zubereitungen beträgt vorzugsweise 0,001 bis 30 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,05 bis 20 Gew.-%, insbesondere 0,1 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung. Sofern Vitamin E und/oder dessen Derivate das oder die Antioxidantien darstellen, ist vorteilhaft, deren jeweilige Konzentrationen aus dem Bereich von 0,001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung, zu wählen.
Sofern Vitamin A bzw. Vitamin-A-Derivate, bzw. Carotine bzw. deren Derivate das oder die Antioxidantien darstellen, ist vorteilhaft, deren jeweilige Konzentrationen aus dem Bereich von 0,001 bis 10 Gew.-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Formulierung, zu wählen.
Es ist insbesondere vorteilhaft, wenn die kosmetischen Zubereitungen gemäß der vorliegenden Erfindung kosmetische oder dermatologische Wirkstoffe enthalten, wobei bevorzugte Wirkstoffe Antioxidantien sind, welche die Haut vor oxidativer Beanspruchung schützen können.
Vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung enthalten die Zubereitungen im Sinne der vorliegenden Erfindung vorzugsweise mindestens eine weitere UV-A-, UV-B- und/oder Breitbandfil- tersubstanz. Die Formulierungen können, obgleich nicht notwendig, gegebenenfalls auch ein oder mehrere organische und/oder anorganische Pigmente als UV-Filtersubstanzen enthalten, welche in der Wasser- und/oder der Ölphase vorliegen können.
Solche UV-Filtersubstanz kann sein: Phenylen-1 ,4-bis-(2-benzimidazyl)-3,3'-5,5'-tetrasulfonsäuresalze; 2-Phenylbenzimidazol-5- sulfonsäuresalze; 1 ,4-di(2-oxo-10-Sulfo-3-bornylidenmethyl)-Benzol und dessen Salze; 4-(2- Oxo-3-bornylidenmethyl)benzolsulfonsäuresalze; 2-Methyl-5-(2-oxo-3-bornylidenmethyl)sulfon- säuresalze; 2,2'-Methylen-bis-(6-(2H-benzotriazol-2-yl)-4-(1 ,1 ,3,3-tetramethylbutyl)-phenol); 2- (2H-benzotriazol-2-yl)-4-methyl-6-[2-methyl-3-[1 ,3,3,3-tetramethyl-1-[(trimethylsilyl)oxy]disiloxa- nyl]propyl]-phenol; 3-(4-Methylbenzyliden)campher; 3-Benzylidencampher; Ethylhexylsalicylat; Terephthalidendicamphersulfonsäure; 4-(Dimethylamino)-benzoesäure(2-ethylhexyl)ester; 4- (Dimethylamino)benzoesäure-amylester; 4-Methoxybenzalmalon-säuredi(2-ethylhexyl)ester; 4- Methoxyzimtsäure(2-ethylhexyl)ester; 4-Methoxyzimtsäureisoamylester; 2-Hydroxy-4- methoxybenzophenon, 2-Hydroxy-4-methoxy-4'-methylbenzophenon; 2,2'-Dihydroxy-4- methoxybenzophenon; 2-(4'-Diethylamino-2'-hydoxybenzoyl)-benzoesäurehexylester; 4-(tert- Butyl)-4'-methoxydibenzoylmethan; Homomenthylsalicylat; 2-Ethylhexyl-2-hydroxybenzoat; 2- Ethylhexyl-2-cyano-3,3-diphenylacrylat; Dimethicodiethylbenzalmalonat; 3-(4-(2,2-bis Ethoxy- carbonylvinyl)-phenoxy)propenyl)-methoxysiloxan / Dimethylsiloxan - Copolymer; 2,4-Bis-{[4-(2- ethyl-hexyloxy)-2-hydroxy]-phenyl}-6-(4-methoxyphenyl)-1 ,3,5-triazin (INCI :Bis- Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazin); Dioctylbutylamidotriazon (INCI: Diethylhexyl- Butamidotriazone); 2,4-bis-[5-1 (dimethylpropyl)benzoxazol-2-yl-(4-phenyl)-imino]-6-(2- ethylhexyl)-imino-1 ,3,5-triazin mit der (CAS Nr. 288254-16-0); 4,4',4"-(1 ,3,5-Triazin-2,4,6- triyltriimino)-tris-benzoesäure-tris(2-ethylhexylester) (auch: 2,4,6-Tris-[anilino-(p-carbo-2'-ethyl- 1 '-hexyloxy)]-1 ,3,5-tιϊazin (INCI: Ethylhexyl Triazone); 2,4,6-Tribiphenyl-4-yl-1 ,3,5-triazin; 2-(4'- (Diethylamino)-2'-hydoxybenzoyl)-benzoesäurehexylester Merocyanine, Titiandioxid; Zinkoxid in einer Konzentration von 0,01 bis 40 Gewichts-% und bevorzugt in einer Konzentration von 1 bis 20 Gewichts-%, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
Bevorzugte anorganische Pigmente sind Metalloxide und/oder andere in Wasser schwerlösliche oder unlösliche Metallverbindungen, insbesondere Oxide des Titans (TiO2), Zinks (ZnO), Eisens (z. B. Fe2Os), Zirkoniums (ZrO2), Siliciums (SiO2), Mangans (z. B. MnO), Aluminiums (AI2Os), Cers (z. B. Ce2O3), Mischoxide der entsprechenden Metalle sowie Abmischungen aus solchen Oxiden sowie das Sulfat des Bariums (BaSO4).
Die Pigmente können vorteilhaft im Sinne der vorliegenden Erfindung auch in Form kommerziell erhältlicher öliger oder wässriger Vordispersionen zur Anwendung kommen. Diesen Vordispersionen können vorteilhaft Dispergierhilfsmittel und/oder Solubilisationsvermittler zugesetzt sein.
Die Pigmente können erfindungsgemäß vorteilhaft oberflächlich behandelt sein, wobei beispielsweise ein hydrophiler, amphiphiler oder hydrophober Charakter gebildet werden bzw. erhalten bleiben soll. Diese Oberflächenbehandlung kann darin bestehen, dass die Pigmente nach an sich bekannten Verfahren mit einer dünnen hydrophilen und/oder hydrophoben anorganischen und/oder organischen Schicht versehen werden. Die verschiedenen Oberflächenbe- schichtungen können im Sinne der vorliegenden Erfindung auch Wasser enthalten.
Anorganische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können be- stehen aus Aluminiumoxid (AI2Os), Aluminiumhydroxid AI(OH)3, bzw. Aluminiumoxidhydrat (auch: Alumina, CAS-Nr.: 1333-84-2), Natriumhexametaphosphat (NaPO3)6, Natriummetaphosphat (NaPOs)n, Siliciumdioxid (SiO2) (auch: Silica, CAS-Nr.: 7631-86-9), oder Eisenoxid (Fe2O3). Diese anorganischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit organischen Beschichtungsmaterialien vorkommen.
Organische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bestehen aus pflanzlichem oder tierischem Aluminiumstearat, pflanzlicher oder tierischer Stearinsäure, Laurinsäure, Dimethylpolysiloxan (auch: Dimethicone), Methylpolysiloxan (Methicone), Simethi- cone (einem Gemisch aus Dimethylpolysiloxan mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 200 bis 350 Dimethylsiloxan-Einheiten und Silicagel) oder Alginsäure. Diese organischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit anorganischen Beschichtungsmaterialien vorkommen. Erfindungsgemäß geeignete Zinkoxidpartikel und Vordispersionen von Zinkoxidpartikeln sind unter folgenden Handelsbezeichnungen bei den aufgeführten Firmen erhältlich:
Geeignete Titandioxidpartikel und Vordispersionen von Titandioxidpartikeln sind unter folgenden Handelsbezeichnungen bei den aufgeführten Firmen erhältlich:
Weitere vorteilhafte Pigmente sind Latexpartikel. Erfindungsgemäß vorteilhafte Latexpartikel sind die in den folgenden Schriften beschriebenen: US 5,663,213 bzw. EP 0 761 201. Besonders vorteilhafte Latexpartikel sind solche, welche aus Wasser und Styrol/Acrylat-Copolymeren gebildet werden und z. B. unter der Handelsbezeichnung „AHiance SunSphere" bei der Fa. Rohm & Haas erhältlich sind.
Die Gesamtmenge an anorganischen Pigmenten, insbesondere hydrophoben anorganischen Mikropigmenten in den fertigen kosmetischen oder dermatologischen Zubereitungen wird vorteilhaft aus dem Bereich von 0,1 - 30 Gew.-%, bevorzugt 0,1 - 10,0, insbesondere 0,5 - 6,0 Gew.-% gewählt, bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitungen. Erfindungsgemäß können die kosmetischen und/oder dermatologischen Lichtschutzformulierungen wie üblich zusammengesetzt sein und dem kosmetischen und/oder dermatologischen Lichtschutz, ferner zur Behandlung, der Pflege und der Reinigung der Haut und/oder der Haare und als Schminkprodukt in der dekorativen Kosmetik dienen.
Zur Anwendung werden die kosmetischen und dermatologischen Zubereitungen erfindungsgemäß in der für Kosmetika üblichen Weise auf die Haut und/oder die Haare in ausreichender Menge aufgebracht.
Besonders bevorzugt sind solche kosmetischen und dermatologischen Zubereitungen, die in der Form eines Sonnenschutzmittels vorliegen. Vorteilhaft können diese zusätzlich mindestens einen weiteren UVA-Filter und/oder mindestens einen weiteren UVB-Filter und/oder mindestens ein anorganisches Pigment, bevorzugt ein anorganisches Mikropigment, enthalten.
Ganz besonders bevorzugte organische UV-Filter sind Ethylhexylmethoxycinnamat, Ethylhexyl- salicylat Butylmethoxydibenzoylmethane, Phenylbenzimidazolsulfonsäure, Phenyldibenzimida- zoltetrasulfonsäure, Benzophenon-3 (Oxybenzon) und -4 (2-Hydroxy-4-methoxybenzophenon- 5-sulfonsäure), Terephtalylidendicamphersulfonsäure, Ethylhexyltriazon, Bis- Ethylhexyloxyphenolmethoxyphenyltriazin, 3-(4-Methylbenzyliden)campher, 2-Ethylhexyl-2- cyano-3,3-diphenylacrylat, Homomenthylsalicylat.
Alle als Säuren aufgeführten Stoffe können auch in gelöster Form als Alkali-, Ammonium oder Alkylammoniumsalze vorliegen oder verwendet werden.
Ebenfalls ganz besonders bevorzugte anorganische Pigmente sind Metalloxide und/oder andere in Wasser schwerlösliche oder unlösliche Metallverbindungen, insbesondere Oxide des Titans (TiOa), Zinks (ZnO), Eisens (z. B. Fe2θ3), Zirkoniums (ZrOa), Siliciums (SiOa), Mangans (z. B. MnO), Aluminiums (AI2O3), Cers (z. B. Ce2O3), Mischoxide der entsprechenden Metalle sowie Abmischungen aus solchen Oxiden sowie das Sulfat des Bariums (BaSO4).
Die Pigmente können erfindungsgemäß vorteilhaft oberflächlich behandelt sein, wobei beispielsweise ein hydrophiler, amphiphiler oder hydrophober Charakter gebildet werden bzw. erhalten bleiben soll. Diese Oberflächenbehandlung kann darin bestehen, dass die Pigmente nach an sich bekannten Verfahren mit einer dünnen hydrophilen und/oder hydrophoben anor- ganischen und/oder organischen Schicht versehen werden. Die verschiedenen Oberflächenbe- schichtungen können im Sinne der vorliegenden Erfindung auch Wasser enthalten. Anorganische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bestehen aus Aluminiumoxid (AI2O3), Aluminiumhydroxid AI(OH)3, bzw. Aluminiumoxidhydrat (auch: Alumina, CAS-Nr.: 1333-84-2), Natriumhexametaphosphat (NaPO3)6, Natriummetaphosphat (NaPOs)n, Siliciumdioxid (SiO2) (auch: Silica, CAS-Nr.: 7631-86-9), oder Eisenoxid (Fe2Os). Diese anorganischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit organischen Beschichtungsmaterialien vorkommen.
Organische Oberflächenbeschichtungen im Sinne der vorliegenden Erfindung können bestehen aus pflanzlichem oder tierischem Aluminiumstearat, pflanzlicher oder tierischer Stearinsäure, Laurinsäure, Dimethylpolysiloxan (auch: Dimethicone), Methylpolysiloxan (Methicone), Simethi- cone (einem Gemisch aus Dimethylpolysiloxan mit einer durchschnittlichen Kettenlänge von 200 bis 350 Dimethylsiloxan-Einheiten und Silicagel) oder Alginsäure. Diese organischen Oberflächenbeschichtungen können allein, in Kombination und/oder in Kombination mit anorganischen Beschichtungsmaterialien vorkommen. icylat, Homosalat (=3,3,5-Trimethylcyclohexyl-2- hydroxybenzoat),
Die kosmetischen und dermatologischen Zubereitungen können erfindungsgemäß kosmetische Hilfsstoffe enthalten, wie sie üblicherweise in solchen Zubereitungen verwendet werden, z. B. Konservierungsmittel, Bakterizide, Parfüme, Substanzen zum Verhindern des Schäumens, Farbstoffe, Pigmente, die eine färbende Wirkung haben, Verdickungsmittel, anfeuchtende und/oder feuchhaltende Substanzen, Fette, Öle, Wachse oder andere übliche Bestandteile einer kosmetischen oder dermatologischen Formulierung wie Alkohole, Polyole, Polymere, Schaumstabilisatoren, Elektrolyt^, organische Lösungsmittel oder Silikonderivate.
I. INHIBITOREN DER MENSCHLICHEN TYROSINSE
Die in Tabelle 1 gezeigten K-Werte basieren auf einem neuartigen Tyrosinase-Assay, für den zuvor rekombinante menschliche Tyrosinase in einem eukaryotischen Expressionssystem gewonnen wird (siehe Anhang 1 ). Bei diesem Assay, dessen Prinzip publiziert ist, wird die L-DOPA-Oxidase-Aktivität der Tyrosinase genutzt, wobei L-DOPA zu Dopachinon umgesetzt wird. Das gebildete Dopachinon wird mit MBTH (Besthorn's Hydrazon) umgesetzt. Das pinkfarbene Reaktionsprodukt kann photometrisch vermessen werden. Der Vorteil dieses Assays für die Wirkstoffentwicklung besteht vor allem darin, dass, dass damit die Inhibitoreigenschaften von Wirkstoffkandidaten erstmals an der menschlichen Ty- rosinase untersucht werden können, von der nachgewiesen ist, dass sie die sich strukturell deutlich von der bislang einzig verfügbaren Pilztyrosinase unterscheidet. Die in Tabelle 1 gezeigten Ki-Werte sind beispielhaft gezeigt für die erfindungsgemäßen Substanzen mit R2 = 2/1.
Tabelle 1 : Inhibitoren der menschlichen Tyrosinase
Tabelle 1 zeigt einige Verbindungen, die sich als besonders wirksam erwiesen haben (+++). Bei den in Tabelle 1 genannten Strukturen ist zudem noch die Stereochemie berücksichtigt, die einen entscheidenden Einfluss auf die Wirksamkeit der Strukturen hat.
II. TYROSINASE-ASSAY
A) Klonierung und Expression der menschlichen Tyrosinase
Zur Expression der Tyrosinase wurden zu 70% konfluente, adhärente Sf9-Zellen bei einer MOI (multiplicity of infection, Anzahl infektiöser Partikel je Zelle) von 10-15 eingesetzt. Die höchte Dopaoxidase-Aktivität war drei Tage nach Infektion feststellbar. Zu diesem Zeitpunkt erfolgte auch die Zellernte. Die Zellen wurden abgelöst, zweimal mit PBS (4 °C) gewaschen und die Pellets bis zur Weiterverwendung bei -80 °C gelagert. Zur Präparation der Zellextrakte werden die Pellets auf Eis aufgetaut und in Lysis- Puffer (50 mM HEPES, 200 mM NaCI, 1 % TritonX-100 oder Chaps) resuspendiert und durch Ultraschall aufgeschlossen. Das Lysat wird zur Entfernung des Debris 15 Minuten bei 15.000 x g zentrifugiert und gegen PBS (20 mM KP1, 150 mM NaCI; pH 7.3-7.4) 0,5 % Triton X-100) dialysiert (oder umgepuffert über Sephadex 25. Das dialysierte Lysat kann bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert und für Aktivitätsmessungen verwendet werden. Aufgrund der beobachteten Stabilität des Enzyms wurde auf den Zusatz von Proteaseinhibitoren verzichtet. Das rekombinante Enzym war glycosyliert und zeigte die in der Literatur beschriebenen kinetischen Eigenschaften und Hemmbarkeit durch klassische Tyrosinase-Inhibitoren wie Kojic Acid und Mimosin.
Die Expression der humanen Tyrosinase erfolgte durch Infektion der Insektenzellen (Sf9) mit dem rekombinanten Virus bei einer MOI (multiplicity of infection, Anzahl der Infektiösen Partikel pro Zelle) von 10-15.
Zur Expression können sowohl adhärent wachsende Sf9-Zellen als auch Sf9 Suspensionskulturen verwendet werden. Die Infektion erfolgte bei adhärent wachsenden Zellen bei 70%iger Konfluenz und bei in Suspensionkulturen wachsende Zellen bei einer Zelldichte von 2x106 Zellen / ml.
Die höchste Dopa-Oxidase-Aktivität war drei Tage nach Infektion feststellbar, zu diesem Zeitpunkt erfolgte auch die Zellernte. Die Zellen wurden abgelöst, bzw. durch Zentrifugation geerntet, zweimal mit PBS gewaschen und die Pellets bis zur Weiterverwendung bei -80°C gelagert.
Zur Präparation der Zellextrakte wurden die Zellen in 25 mM Tris pH 8,0 aufgenommen und durch dreimaliges pressen durch eine 27 l^ gauge Kanüle aufgeschlossen. Die Zellfragmente wurden durch eine 15-minütige Zentrifugation bei 18.000 rpm (Beckman, Ja-20 Rotor) abgetrennt und der die löslichen Proteine enthaltende Überstand wurde verworfen.
Zur Extraktion der membranständigen Proteine wurde das Pellet in PBS 2% Chaps aufgenommen, mittels eines Potter Homogenisators suspendiert und unter Rühren für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde die Zelldebris durch erneute 15-minütige Zentrifugation bei 18.000 rpm im Ja-20-Rotor abgetrennt. Der Überstand konnte nach Umpuffern (Amersham, G-25) auf PBS 0,1 % CHAPS direkt für Aktivitätsmessungen eingesetzt werden oder wurde einer Vorreinigung durch lonenaustauschchroma- tographie unterworfen. Dazu wurde der Extrakt auf 25 mM Tris pH 8,0, 0,1 % CHAPS umgepuffert und an im gleichen Puffer äquilibrierte Q-Sepharose (Amersham) gebunden und mit 25mM Tris pH8,0, 300 mM NaCI, 0,1 % CHAPS eluiert. Das Eluat konnte nach Umpuffern (G-25) auf PBS 0,1 % CHAPS für Aktivitätsmessungen eingesetzt werden. Der Schritt der der Anionenaustauschchromatographie dient der Anreicherung der Tyrosinase im Proteinextrakt. B) Tyrosinase Assay
Der verwendete Dopa-Oxidase-Assay beruht im Wesentlichen auf dem von Winder und Harris beschriebenen Protokoll [Winder AJ, Harris H (1991 ) „New assays for the tyrosine hydroxylase and dopa oxidase activities of tyrosinase" Eur J Biochem 198(2),
317-26]. Die Reaktionen wurden in 50 mM Kalium-Phosphatpuffer pH 7,0, [pH 6,9 bei Winder und Harris] 12% DMSO [2% DMF], 6 mM MBTH (Besthorns Hydrazon) und verschiedenen Konzentrationen des Substrates L-Dopa (0 - 7,5 mM) bei 37°C in 96- Loch-Platten durchgeführt. Das Volumen je Reaktionsansatz betrug 250 μl und es wurden abhängig von der Aktivität der jeweiligen Präparation 10 - 30 μl des Tyrosina- seextraktes aus infizierten Insektenzellen eingesetzt. Tyrosinase katalysiert die Oxida- tion von L-Dopa zu L-Dopachinon, welches in einer weiteren Reaktion mit dem eingesetzten MBTH zu einem stabilen, pinken Farbstoff reagiert, welcher photometrisch bei einer Wellenlänge von 505 nm (Mikroplattenphotometer: 490 nm Filter) gemessen werden kann. Der standardmäßige Einsatz von 12% DMSO in den Reaktionsansätzen gewährleistet die Löslichkeit des eingesetzten MBTH auch bei erhöhten Salzkonzentrationen und verbessert die Löslichkeit vieler mit dem Assay getesteter Inhibitoren deutlich. Eine zeitabhängige Inaktivierung der Pilz-Tyrosinase in Gegenwart von L-Dopa als alleinigem Substrat sowie die Inaktivierung der Dopa-Oxidase-Aktivität durch DMSO [Chen QX, Liu XD, Huang M (2003) „Inactivation kinetics of mushroom tyrosinase in the dimethyl sulfoxide Solution"] ist in der Literatur beschrieben. In den durchgeführten Assays konnte auch bei höheren DMSO-Konzentrationen (bis 20 %) keine Minderung der Aktivität der Tyrosinase festgestellt werden. Eine zeitabhängige Inaktivierung der rekombinanten humanen Tyrosinase konnte im Assay nicht festgestellt werden und der Reaktionsverlauf ist für > 15 Minuten linear, während Pilztyrosinase (Sigma) zeitabhängig einen deutlichen Aktivitätsverlust zeigte und der Reaktionsverlauf nur für Messzeiten < 5 Minuten linear verlief.
BEISPIELE Toner:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Alcohol Denat. 10 10 10 10
Glycerin 3 3 3 3
PEG-8 1 1 1 1
PEG-40 Hydrogenated Castor OiI 1 ,5 1 ,5 1 ,5 1 ,5
Methylparaben 0,4 0,4 0,4 0,4
Panthenol 0,4 0,4 0,4 0,4
Parfüm 0,2 0,2 0,2 0,2
Benzophenone-4 0,05 0,05 0,05 0,05
Peptid 5 0,05
Peptid 12 0,01
Peptid 10 0,02
Peptid 15 0,01
Reinigungsschaum:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Stearic Acid 15 15 15 15
Myristic Acid 15 15 15 15
Glycerin 6 6 6 6
PEG-150 5 5 5 5
Propylene Glycol 5 5 5 5
Lauric Acid 2,5 2,5 2,5 2,5
PEG-8 2 2 2 2
Sodium Methyl Cocoyl Taurate 1 ,5 1 ,5 1 ,5 1 ,5
Glyceryl Stearate 1 ,5 1 ,5 1 ,5 1 ,5
Cera Alba 1 1 1 1
Parfüm 0,5 0,5 0,5 0,5
Etidronic Acid 0,5 0,5 0,5 0,5
Octadecenedioic Acid 0,5 0,5 0,5 0,5
Tocopheryl Acetate 0,5 0,5 0,5 0,5
BHT 0,2 0,2 0,2 0,2
Disodium EDTA 0,2 0,2 0,2 0,2
Peptid 14 0,02
Peptid 12 0,03
Peptid 15 0,02
Peptid 16 0,05
Reinigungscrubs:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Stearic Acid 20 20 20 20
Myristic Acid 10 10 10 10
Propylene Glycol 8 8 8 8
Glycerin 8 8 8 8
Lauric Acid 3 3 3 3
PEG-150 3 3 3 3
Polyethylene 3 3 3 3
PEG-8 2 2 2 2
Sodium Methyl Cocoyl Taurate 1 1 1 1
Glyceryl Stearate 1 1 1 1
Parfüm 0,5 0,5 0,5 0,5
Etidronic Acid 0,5 0,5 0,5 0,5
BHT 0,2 0,2 0,2 0,2
Disodium EDTA 0,1 0,1 0,1 0,1
Peptid 9 0,02
Peptid 5 0,02
Peptid 16 0,01
Peptid 15 0,02 0,0
Seifengel:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Stearic Acid 16 16 16 16
Myristic Acid 16 16 16 16
Propylene Glycol 8 8 8 8
Glycerin 8 8 8 8
Lauric Acid 4 4 4 4
PEG-150 4 4 4 4
PEG-8 4 4 4 4
Sodium Methyl Cocoyl Taurate 1 1 1 1
Glyceryl Stearate 1 1 1 1
Tocopheryl Acetate 0,5 0,5 0,5 0,5
Disodium EDTA 0,5 0,5 0,5 0,5
Parfüm 0,4 0,4 0,4 0,4
Etidronic Acid 0,4 0,4 0,4 0,4
BHT 0,2 0,2 0,2 0,2
Peptid 1 0,03
Peptid 10 0,01
Peptid 14 0,02
Peptid 16 0,01 0,0
Shampoo:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Sodium Laureth Sulfate 30 30 30 30
Cocamidopropyl Betaine 10 10 10 10
PEG-3 Distearate 2 2 2 2
Disodium PEG-5 Laurylcitrate Sulfosuccinate 2 2 2 2
Sodium Chloride 1 1 1 1
Sodium Benzoate 0,5 0,5 0,5 0,5
Sodium Salicylate 0,5 0,5 0,5 0,5
PEG-40 Hydrogenated Castor OiI 0,5 0,5 0,5 0,5
Polyquaternium-10 0,5 0,5 0,5 0,5
Panthenol 0,5 0,5 0,5 0,5
Citric Acid 0,5 0,5 0,5 0,5
Hydrolyzed SiIk 0,5 0,5 0,5 0,5
Guar Hydroxypropyltrimonium Chloride 0,5 0,5 0,5 0,5
Parfüm 0,5 0,5 0,5 0,5
Peptid 15 0,02
Peptid 1 0,02
Peptid 12 0,02
Peptid 16 0,02
Deo Aerosol:
Butane 53,35 53,35 53,35 53,35
Isobutane 15 15 15 15
Propane 15 15 15 15
Cyclomethicone 15 15 15 15
Aluminum Chlorohydrate 5 5 5 5
Parfüm 1 1 1 1
Dimethicone 1 1 1 1
Disteardimonium Hectorite 1 1 1 1
Octyldodecanol 0,2 0,2 0,2 0,2
Glycyrrhiza Glabra 0,05 0,05 0,05 0,05
Tocopheryl Acetate 0,05 0,05 0,05 0,05
Peptid 9 0,05
Peptid 13 0,05
Peptid 3 0,05
Peptid 16 0,05
Deo Stift:
Cyclomethicone 40,48 40,48 40,48 40,48
Stearyl Alcohol 18 18 18 18
Aluminum Zirconium Tetrachlorohydrex GLY 18 18 18 18
PPG-14 Butyl Ether 17 17 17 17
TaIc 3 3 3 3
Hydrogenated Castor OiI 1 1 1 1
Parfüm 1 1 1 1
Glyceryl Stearate SE 1 1 1 1
Octyldodecanol 0,5 0,5 0,5 0,5
Peptid 14 0,02
Peptid 15 0,02
Peptid 3 0,02
Peptid 8 0,02
Sonnenschutzlotion:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad
Homosalate 8 8 8 8
Ethylhexyl Methoxycinnamate 8 8 8 8
Alcohol Denat. 8 8 8 8
Titanium Dioxide 4 4 4 4
Cetearyl Alcohol 4 4 4 4
Ethylhexyl Salicylate 4 4 4 4
Distarch Phosphate 4 4 4 4
Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine 4 4 4 4
Benzophenone-3 2 2 2 2
Butyl Methoxydibenzoylmethane 2 2 2 2
Dimethicone 2 2 2 2
Phenylbenzimidazole Sulfonic Acid 2 2 2 2
Glycerin 2 2 2 2
PEG-40 Castor OiI 1 1 1 1
Cetyl Alcohol 1 1 1 1
Trisodium EDTA 1 1 1 1
Glyceryl Stearate SE 1 1 1 1
Hydrogenated Coco-Glycerides 1 1 1 1
Ethylhexylglycerin 1 1 1 1
Xanthan Gum 1 1 1 1
Sodium Cetearyl Sulfate 1 1 1 1
Glycyrrhiza Glabra 0,5 0,5 0,5 0,5
Phenoxyethanol 0,4 0,4 0,4 0,4
Parfüm 0,4 0,4 0,4 0,4
Methylparaben 0,3 0,3 0,3 0,3
BHT 0,2 0,2 0,2 0,2
Ethylparaben 0,1 0,1 0,1 0,1
Propylparaben 0,1 0,1 0,1 0,1
Peptid 1 1 0,1
Peptid 12 0,1
Peptid 14 0,2
Peptid 16 0,1 0,1 Sonnenschutzspray:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Glycerin 4 4 4 4
Ethylhexyl Methoxycinnamate 3 3 3 3
C12-15 Alkyl Benzoate 3 3 3 3
Butylene Glycol Dicaprylate/Dicaprate 3 3 3 3
Ceteareth-20 3 3 3 3
Glyceryl Stearate 2 2 2 2
Ethylhexyl Triazone 2 2 2 2
Bis-Ethylhexyloxyphenol Methoxyphenyl Triazine 2 2 2 2
Ceteareth-20 1 1 1 1
Cetearyl Alcohol 0,5 0,5 0,5 0,5
Cetyl Palmitate 0,5 0,5 0,5 0,5
Ceteareth-12 0,5 0,5 0,5 0,5
Trisodium EDTA 0,5 0,5 0,5 0,5
Dicaprylyl Ether 0,5 0,5 0,5 0,5
Diethylhexyl Butamido Triazone 0,5 0,5 0,5 0,5
Tocopheryl Acetate 0,5 0,5 0,5 0,5
Phenylbenzimidazole Sulfonic Acid 0,5 0,5 0,5 0,5
VP/Hexadecene Copolymer 0,5 0,5 0,5 0,5
Phenoxyethanol 0,4 0,4 0,4 0,4
DMDM Hydantoin 0,4 0,4 0,4 0,4
Parfüm 0,4 0,4 0,4 0,4
Peptid 11 0,05
Peptid 12 0,05
Peptid 14 0,05
Peptid 16 0,05
Körperlotion:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Stearic Acid 2 2 2 2
Dimethicone 2 2 2 2
Octyldodecanol 2 2 2 2
Cetyl Alcohol 2 2 2 2
Cetearyl Ethylhexanoate + Isopropyl Myristate 2 2 2 2
Glycerin 2 2 2 2
Ethylhexyl Methoxycinnamate 2 2 2 2
Cetyl Palmitate 1 1 1 1
Glyceryl Stearate 1 1 1 1
Phenoxyethanol 0,4 0,4 0,4 0,4
Butyl Methoxydibenzoylmethane 0,2 0,2 0,2 0,2
Parfüm 0,2 0,2 0,2 0,2
Disodium EDTA 0,2 0,2 0,2 0,2
Carbomer 0,2 0,2 0,2 0,2
Magnesium Aluminum Silicate 0,2 0,2 0,2 0,2
Methylparaben 0,1 0,1 0,1 0,1
Tocopheryl Acetate 0,1 0,1 0,1 0,1
Peptid 7 0,1
Peptid 1 0,1
Peptid 14 0,1
Peptid 16 0 ,1
Propylparaben 0 ,05 0 ,05 0 ,05 0 ,05
BHT 0 ,05 0 ,05 0 ,05 0 ,05
Tagescreme 1 :
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Ethylhexyl Methoxycinnamate 8 8 8 8
Glycerin 6 6 6 6
Tapioca Starch + Aqua 5 5 5 5
Benzophenone-3 4 4 4 4
Glyceryl Stearate 3 3 3 3
Cetearyl Alcohol 3 3 3 3
C12-15 Alkyl Benzoate 1 1 1 1
PEG-40 Stearate 1 1 1 1
Octyldodecanol 1 1 1 1
Titanium Dioxide 1 1 1 1
Tocopheryl Acetate 0,5 0,5 0,5 0,5
TaIc 0,3 0,3 0,3 0,3
Phenoxyethanol 0,3 0,3 0,3 0,3
Parfüm 0,3 0,3 0,3 0,3
Diazolidinyl Urea 0,2 0,2 0,2 0,2
Tetrasodium Iminodisuccinate 0,2 0,2 0,2 0,2
Carbomer 0,2 0,2 0,2 0,2
Peptid 1 1 0,1
Peptid 12 0,1
Peptid 9 0,1
Peptid 6 0,1
Tagescreme 2:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Ethylhexyl Methoxycinnamate 6 6 6 6
Alcohol Denat. 3 3 3 3
Polyglyceryl-3 Methylglucose Distearate 3 3 3 3
Tapioca Starch + Aqua 3 3 3 3
Glycerin 2 2 2
Dicaprylyl Carbonate 2 2 2 2
Phenylbenzimidazole Sulfonic Acid 2 2 2 2
Dihydroxyacetone 1 1 1 1
Cetyl Alcohol 1 1 1 1
Trisodium EDTA 1 1 1 1
C12-15 Alkyl Benzoate 1 1 1 1
Butyl Methoxydibenzoylmethane 1 1 1 1
Phenoxyethanol l C 0N,4 0,4 0,4 0,4
Carbomer 0,4 0,4 0,4 0,4
Parfüm 0,4 0,4 0,4 0,4
Peptid 16 0,25
Peptid 6 0,25
Peptid 14 0,25
Peptid 10 0,25
Diazolidinyl Urea 0 ,25 0 ,25 0 ,25 0,25
Sodium Ascorbyl Phosphate 0 ,1 0 ,1 0 ,1 0,1
BHT 0 ,04 0 ,04 0 ,04 0,04
Tagescreme 3:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Glycerin 10 10 10 10
Cyclomethicone 5 5 5 5
Ethylhexyl Methoxycinnamate 4 4 4 4
Dicaprylyl Ether 4 4 4 4
Methylpropanediol 4 4 4 4
Glyceryl Stearate Citrate 3 3 3 3
Cetyl Alcohol 2 2 2 2
Stearyl Alcohol 2 2 2 2
Isopropyl Palmitate 1 1 1 1
Hydrogenated Coco-Glycerides 1 1 1 1
Dicaprylyl Carbonate 1 1 1 1
Caprylic/Capric Triglyceride 1 1 1 1
Butyl Methoxydibenzoylmethane 1 1 1 1
Tridecyl Stearate 0,5 0,5 0,5 0,5
Tridecyl Trimellitate 0,5 0,5 0,5 0,5
Carbomer 0,5 0,5 0,5 0,5
Ethylhexylglycerin 0,5 0,5 0,5 0,5
Phenoxyethanol 0,4 0,4 0,4 0,4
Dipentaerythrityl Hexacaprylate/Hexacaprate 0,2 0,2 0,2 0,2
Sodium Acrylates Copolymer 0,2 0,2 0,2 0,2
Methylparaben 0,2 0,2 0,2 0,2
PPG-1 Trideceth-6 0,2 0,2 0,2 0,2
Ethylparaben 0,1 0,1 0,1 0,1
Propylparaben 0,1 0,1 0,1 0,1
Peptid 9 0,1 0,1
Peptid 12 0,1
Peptid 15 0,1
Peptid 14 0,1 Tagescreme 4:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Alcohol Denat. 8 8 8 8
Ethylhexyl Methoxycinnamate 6 6 6 6
Homosalate 6 6 6 6
Glycerin 6 6 6 6
Ethylhexyl Salicylate 4 4 4 4
Benzophenone-3 4 4 4 4
Butyl Methoxydibenzoylmethane 3 3 3 3
Cetearyl Alcohol 3 3 3 3
Dimethicone 3 3 3 3
Distarch Phosphate 2 2 2 2
Phenylbenzimidazole Sulfonic Acid 2 2 2 2
Cetyl Alcohol 1 1 1 1
Glyceryl Stearate SE 1 1 1 1
Xanthan Gum 1 1 1 1
PEG-40 Castor OiI 0,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5
Sodium Cetearyl Sulfate 0,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5
Trisodium EDTA 0,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5
Hydrogenated Coco-Glycerides 0,5 0 ,5 0 ,5 0 ,5
Phenoxyethanol 0,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4
DMDM Hydantoin 0,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4
Parfüm 0,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4
Peptid 3 0,05
Peptid 12 0,05
Peptid 16 0,05
Peptid 14 0,05
Nachtcreme:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Glycerin 6 6 6 6
Tapioca Starch 3 3 3 3
Stearic Acid 3 3 3 3
Alcohol Denat. 2
Dimethicone 2
Cera Microcristallina 1 1 1 1
Paraffinum Liquidum 1 1 1 1
Myristyl Alcohol 1 1 1 1
Glyceryl Stearate 1 1 1 1
Hydrogenated Coco-Glycerides 1 1 1 1
Myristyl Myristate 1 1 1 1
C12-15 Alkyl Benzoate 1 1 1 1
Parfüm 0 ,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4
Phenoxyethanol 0 ,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4
Carbomer 0 ,4 0 ,4 0 ,4 0 ,4 lI C CNN
Diazolidinyl Urea 0 ,2 0 ,2 0 ,2 0 ,2
Retinyl Palmitate 0 ,2 0 ,2 0 ,2 0 ,2
Peptid 3 0 ,2 l CN
K5
Peptid 14 0,2
Peptid 15 0,2 l CN
K5
Peptid 10 0,2
Handcreme:
Aqua ad 100 ad 100 ad 100 ad 100
Cetyl Alcohol 4 4 4 4
Glycerin 4 4 4 4
Myristyl Alcohol 3 3 3 3
Sorbitan Stearate 3 3 3 3
Cera Microcristallina + Paraffinum Liquidum 2 2 2
Isopropyl Palmitate 2 2 2
Trilaureth-4 Phosphate 2 2 2 2
Octyldodecanol 2 2 2
Panthenol 2 2 2
Dimethicone 2 2 2 2
Paraffinum Liquidum 0,5 0,5 0,5 0,5
Phenoxyethanol 0,5 0,5 0,5 0,5
Methylparaben lI C CIINN C C 0NN,25 0,25 0,25 0,25
Ethylparaben 0,25 0,25 0,25 0,25
Sodium Citrate 0,25 0,25 0,25 0,25
Carbomer 0,25 0,25 0,25 0,25
Peptid 5 0,05
Peptid 16 0,05
Peptid 14 0,05
Peptid 12 0,05

Claims

Patentansprüche
1. Verbindungen der Formel
R1-NH-C*H((CH2)n-NH3+)-C=O-NH-C*H(CH2R2)-C=O-R3
wobei n die Werte 1 , 2, 3 annehmen kann,
R1 eine Gruppe gewählt unter H, Benzyloxycarbonyl-, tert.-Butyloxycarbonyl-, Acetyl, eine geradkettige aliphatische Acylgruppe mit 3 bis 24 Kohlenstoffatomen, Vinyloxycar- bopnyl- (Voc), Allyloxycarbonyl- (Alloc), 1-lsopropylallyloxycarbonyl- (Ipaoc), - C=O- Cyclohexyl, Cinnamyloxycarbonyl- (Coc), N-(4,4-dimethyl-1-oxopentyl), N-(1-oxo-4- pentenyl), N-(4,6-dimethyl-1-oxo-2,4-dodecadienyl), N-(1-oxo-9,12,15-octadecatrienyl), N- (4-methyl-1-oxopentyl), N-(1-oxo-10-undecenyl), N-(2-methyl-1-oxopropyl), 9- Fluorenylmethoxycarbonyl- (Fmoc), homo-Benzyloxycarbonyl- (homo-Zeile), p-
Methoxybenzyloxycarbonyl- (Moz), 9-Anthrylmethyl, N-phenylethyl und Triphenylmethyl- (Trt) darstellt,
R2 eine Gruppe gewählt unter p-Hydroxyphenyl-, 4-Hydroxyhepta-1 ,3,6-trien-5-on-1- yl-, 2,4-Dihydroxyphenyl-, 4[(Hydroxyamino)carbonyl]phenyl- , (5-Hydroxy-4-oxo-4H- pyran-2yl)-, (3-Hydroxy-4-oxopyridin-1-(4H)-yl)-, (2-Thioxo-1 ,3-oxazolidin-5-yl)-, 4- [(Aminocarbonothioyl)amino]phenyl)-, (2,2'Bipyridin-4-yl)-, (5-Butyl-2,4-dihydroxy- phenyl)-, 2,4-Dihydroxy-5-(1-phenylethyl)phenyl-, (4-Hydroxy-5-thioxocyclohepta-1 ,3,6- trien-1-yl)- darstellt,
R3 eine Gruppe gewählt unter -OH, NH2 ist.
2. Verbindungen nach Patentanspruch 1 dadurch gekennzeichnet, dass n = 1 oder 2 ist.
3. Verbindungen nach einem der vorangehenden Patentansprüche dadurch gekennzeichnet, dass R1 = H, tert.-Butyloxycarbonyl- oder Benzyloxycarbonyl- ist.
4. Verbindungen nach einem der vorangehenden Patentansprüche dadurch gekennzeichnet, dass R1 = H oder Benzyloxycarbonyl ist.
5. Verbindungen nach einem der vorangehenden Patentansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Oligopeptide, die C-terminal endständig aus Tyrosin bzw. seinem Tropolon-oder 2,4-Dihydroxyanalogon-Analogon bestehen, welches mit 1 ,3- Diaminopropansäure, 2,4-Diaminobuttersäure oder Ornithin peptidisch verknüpft ist, wobei der C-Terminus eine Carboxylfunktion oder eine Amidfunktion, bevorzugt eine Amidfunktion, darstellt.
6. Verbindungen nacheinem der vorangehenden Patentansprüche dadurch gekennzeichnet, dass es sich um Dipeptide handelt.
7. Nicht therapeutische Verwendung von Verbindungen nach einem der vorangehenden Patentansprüche zur Inhibierung der menschliche Tyrosinase und zur Verminderung der Hautpigmentierung in einer Einsatzkonzentration von 0.0001 bis 15 Gew.-%, bevorzugt
0,01 bis 1 Gew.-%.
8. Kosmetische Zubereitungen enthaltend eine Verbindung nach einem der vorangehenden Patentansprüche.
9. Zubereitungen nach Patentanspruch 8 dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich Dihydro- xyacteon, Melaninderivate, Nussextrakte oder Erythrulose enthalten sind, bevorzugt in Konzentrationen von 0,1 Gew.-% bis zu 8 Gew.-%, besonders bevorzugt 0,4 - 2 Gew.-% bezogen auf das Gesamtgewicht der Zubereitung.
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