EP1906996A2 - Procédé d'immunisation génétique par électrotransfert contre une toxine et antisérum susceptible d'être obtenu par ledit procédé - Google Patents

Procédé d'immunisation génétique par électrotransfert contre une toxine et antisérum susceptible d'être obtenu par ledit procédé

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EP1906996A2
EP1906996A2 EP06778059A EP06778059A EP1906996A2 EP 1906996 A2 EP1906996 A2 EP 1906996A2 EP 06778059 A EP06778059 A EP 06778059A EP 06778059 A EP06778059 A EP 06778059A EP 1906996 A2 EP1906996 A2 EP 1906996A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
toxin
sequence
fragment
clostridium botulinum
electrotransfer
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP06778059A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Daniel Scherman
Pascal Bigey
Capucine Trollet
Michel R. Popoff
Yannick Pereira
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Université Paris Descartes
Institut Pasteur
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Université Paris Descartes
Institut Pasteur
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Institut Pasteur filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique
Publication of EP1906996A2 publication Critical patent/EP1906996A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/08—Clostridium, e.g. Clostridium tetani
    • A—HUMAN NECESSITIES
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
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    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
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    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration

Definitions

  • the invention relates to a method for obtaining an antiserum directed against a protein toxin by administering to an animal a solution comprising a genetic construct encoding an immunogenic fragment of toxin, followed by the application of an electric field. in the administration area, and serum isolation.
  • the antiserum obtainable by the process and the use of the solution for the manufacture of a medicament for preventing or treating a toxic effect related to the absorption in a mammal of a toxin, characterized in that that said drug is formulated for electrotransport administration in the patient is also included in the invention.
  • the most currently used means of obtaining antisera against a protein antigen is to perform repetitive injections of recombinant or purified native proteins in order to induce an immune response. in animals.
  • the protein can also be expressed on a capsid or viral envelope, or in a virosome-type particle.
  • botulinum toxin or other lethal toxins one can not immunize with the whole toxin.
  • toxin must be produced from the bacterium, purified, and then modified to inactivate its lethality, while retaining its antigenicity. This is achieved, for example, by purifying a subunit of the toxin, which is therefore not fully functional.
  • such a recombinant subunit can be produced, for example from E. coli. This may be essential in the absence of a reliable method of inactivation of the toxin. In both cases, production of inactivated native protein or recombinant fragments, the techniques are cumbersome and expensive. This explains, for example, that only one multivalent serum stock against various serotypes of botulinum toxins have been produced to date.
  • An alternative route for obtaining antiserum is genetic immunization, wherein a DNA encoding the toxin is administered to the animal to be immunized.
  • the coding DNA in which the coding gene is preceded by a suitable promoter and comprises a polyadenylation sequence, may be carried either by a viral vector (adenovirus, AAV, retrovirus, lentivirus, etc.) or by a plasmid bacterial. It can also be produced by acellular synthesis in vitro, for example by PCR.
  • a single intramuscular injection of a plasmid encoding an HBV virus (hepatitis B) envelope protein causes the production of antibodies for at least 74 weeks (Davis et al., Gene Ther., 1997 Mar; 4 (3): 181). -8), in a title compatible with effective protection.
  • HBV virus hepatitis B envelope protein
  • Electrotransfer is a simple and efficient gene transfer technique, consisting of an intramuscular injection of a DNA solution followed by the application of a series of electrical pulses, using electrodes connected to a generator ( Aihara et al., Nat Biotechnol 1998 Sep; 16 (9): 867-70; Mir et al., CR Acad Sci III. 1998 Nov; 321 (11): 893-9 .; Mir et al., Proc Natl Acad Sci US A, 1999 Apr 13; 96 (8): 4262-7.).
  • the antibody titre produced increases by a factor of 100 in the mouse after electrotransfer of a plasmid encoding a surface antigen of the HBV virus (Widera et al., J. Immunol 2000 May 1 164 (9): 4635-40). This increase factor is of the order of 10 in the case of rabbits or guinea pigs. High antibody titers were also obtained in mice and rabbits after intramuscular electrotransfer of a plasmid encoding a hepatitis C virus envelope glycoprotein (Zucchelli et al., J.
  • the genetic immunization techniques mentioned above can be combined with conventional protein immunization methods. For example, a first genetic immunization can be performed, followed after several weeks by 1 to 2 genetic immunizations, followed finally after several weeks or months of several protein immunizations against the same antigen. It will also be possible, alternatively, to vaccinate first against the protein then to carry out a genetic immunization.
  • Botulinum and tetanus (Clostridium tetani) neurotoxins have a common organization. They are synthesized as a single protein chain ( ⁇ 150 kDa), which is then activated by a proteolytic cleavage determining two protein chains: the N-terminal light chain or L ( ⁇ 50 kDa) and the heavy chain in C -terminal or H ( ⁇ 100 kDa), which remain joined by a disulfide bridge. Three functional domains have been defined on these neurotoxins. The C-terminal half of the H chain (called Hc) is the recognition domain of a specific receptor on the surface of neurons.
  • Hc The C-terminal half of the H chain (called Hc) is the recognition domain of a specific receptor on the surface of neurons.
  • the N-terminal half of the H (HN) chain is involved in the internalisation of the L-chain neuron.
  • the latter contains the enzymatic site of proteolysis against SNARE proteins and is responsible for the intraneuronal activity of neurotoxins. which results in a blockage of neuro-exocytosis.
  • Each of these three functional domains is associated with a particular three-dimensional structure.
  • the Hc domain contains two beta-sheet rich structures, the HN domain is formed of two very long alpha helices, and the L chain forms a compact, beta-sheet rich structure (Kozaki et al., Infect Immun 1986 Jun; 52 (3 ): 786-91, Kozaki et al., Infect Immun 1987 Dec, 55 (12): 3051-6).
  • the set of genes for botulinum and tetanus neurotoxins was sequenced and the crystallographic structure was determined for botulinum neurotoxins A and B and tetanus neurotoxin.
  • Various studies have been carried out to determine the immunogenic fragment of these neurotoxins. It was first shown that the Hc fragment of tetanus toxin, obtained by proteolysis by papain and purified by chromatography, is nontoxic and protects by anti-Hc immunization mice against a toxin challenge dose (Kozaki et al. al., Infect Immun., 1989 Sep; 57 (9): 2634-9.). Then, this fragment was produced as a recombinant protein in Escherichia coli and was also an excellent immunogen (Halpern et al., Infect Immun, 1989 Jan; 57 (1): 18-22.).
  • the neutralizing monoclonal antibodies obtained with whole botulinum neurotoxin A as immunogen were all directed against the Hc fragment.
  • the analysis of antibodies generated by vaccination with the whole botulinum neurotoxin formulated in humans showed that most were directed against the light chain and little against the Hc fragment.
  • This study concluded that a vaccine based on the Hc fragment is more protective than a vaccine prepared with the whole toxin (Brown et al., Hybridoma, 1997 Oct; 16 (5): 447-56).
  • the second generation of USAMRIID-engineered anti-bacterial vaccine consists of recombinant and purified Hc fragments of the seven toxinotypes of botulinum neurotoxins A, B, C, D, E, F and G.
  • the Hc fragment is shown to be a better immunogen than the entire neurotoxin and detoxified to induce neutralizing antibodies.
  • the method currently used involves the production of native or recombinant proteins, which is a time consuming and expensive process.
  • the native or recombinant protein is toxic, it must be denatured before injection into animals. This can result in low neutralizing antisera, since only epitope antibodies can be obtained.
  • the inventors have developed a new method for obtaining antisera directed against a protein toxin, the antiserum obtained with this method having a high titre neutralizing antibodies against botulinum toxins.
  • the new method also has the advantage of being easy to implement and inexpensive.
  • the subject of the invention is a process for obtaining an antiserum directed against at least one protein toxin comprising the following steps: a) obtaining a solution comprising at least one genetic construct, said construct comprising a nucleic acid encoding at least one immunogenic fragment of said toxin, b) administration by injection into an animal of the solution obtained in step a), c) application of an electric field in the injection zone, and d) subsequent collection of whole blood and serum isolation.
  • Protein toxin is understood to mean any animal, plant or bacterial substance which produces toxic effects and which is generally antigenic.
  • immunogenic fragment of protein toxin is meant any fragment of said toxin that has the ability to induce a reaction or an immune response.
  • protein, polypeptide or peptide are used interchangeably in the present description to designate an amino acid sequence or, for their derivatives, containing an amino acid sequence.
  • step (d) in the sense of the present application is meant a sampling which is performed within a minimum period of time after step (c) (application of an electric field) necessary to obtain immunization. In general, this period of time is at least 15 days after the application of the electric field.
  • step (c) The conditions for applying an electric field in the injection zone according to step (c) are now well known to those skilled in the art, and are described in particular in the international patent applications published on January 14, 1999. under the numbers WO 99/01157 and WO 99/01158. Those skilled in the art will know how to adapt these conditions according to each case.
  • the electric field has an intensity of between 1 and 800 V / cm in the form of 1 to 100,000 square pulses with a duration greater than 100 microseconds and a frequency between 0.1 and 1000 Hertz. More preferably, the electric field has an intensity of between 80 and 250 V / cm in the form of 1 to 20 square-wave pulses with a duration of between 1 and 50 milliseconds and a frequency of 1 to 10 Hertz. .
  • the injection is an intradermal or intramuscular injection.
  • step b) of administering the solution is preceded by a step of injecting a solution containing an enzyme that degrades the extracellular matrix, such as hyaluronidase.
  • this enzyme is responsible for the degradation of hyaluronic acid, major constituent of the extracellular matrix of the muscle.
  • Hyaluronidase thus makes it possible to increase the accessibility of plasmids to muscle cells.
  • a solution containing between 0.1 and 2 U / ⁇ l of hyaluronidase is injected.
  • Even more preferably, approximately 25 .mu.l of a 0.4U / .mu.l solution of hyaluronidase in NaCl are injected.
  • the toxin is selected from the group consisting of toxin Clostridium botulinum, Clostridium tetani, Bacillus anthracis, ricin, diphtheria toxin and cholera toxin.
  • the immunogenic fragment of said toxin is the C-terminal fragment (Hc) selected from the group consisting of the Hc fragment of the Clostridium botulinum serotype A toxin of sequence SED ID No. 1, the Hc fragment.
  • Hc C-terminal fragment selected from the group consisting of the Hc fragment of the Clostridium botulinum serotype A toxin of sequence SED ID No. 1, the Hc fragment.
  • Clostridium botulinum serotype B toxin of sequence SED ID NO: 2 Clostridium botulinum serotype C toxin Hc fragment SED ID No. 3
  • Clostridium botulinum serotype D toxin Hc fragment SED sequence ID No. 4 the Hc fragment of the Clostridium botulinum serotype E toxin of SED ID No.
  • the nucleic acid encoding the Hc fragment of toxin A of Clostridium botulinum is of sequence SED ID No. 17, or one of its variants.
  • variant of a protein sequence refers to a sequence exhibiting only modifications at the level of amino acids or nucleotides having no influence on its function by not diminishing its immunogenicity .
  • variant is intended to mean when used herein with reference to a nucleotide sequence, a nucleotide sequence corresponding to a reference nucleotide sequence, the corresponding sequence encoding a polypeptide having substantially the same structure and the same function. than the polypeptide encoded by the reference nucleotide sequence. It is desirable that the substantially similar nucleotide sequence encode the polypeptide encoded by the reference nucleotide sequence.
  • the percentage of identity between the sequence substantially similar nucleotide and the reference nucleotide sequence is at least 90%, more preferably at least 95%, still more preferably at least 99%.
  • Sequence comparisons are performed using the Smith-Waterman sequence alignment algorithm (see, for example, Waterman, MS Introduction to Computational Biology: Maps, Sequences and Genomes, Chapman & Hall, London: 1995. ISBN 0412 -99391-0 or at http://www-hto.usc.edu/ software / seqahi / index.html).
  • the localS version 1.16 program is used with the following parameters: "match”: 1, "mismatch penalty”: 0.33, "open-gap penalty”: 2, "extended-gap penalty”: 2.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the genetic construct comprises 5 'nucleic acid encoding at least one fragment of said toxin, the cytomegalovirus (CMV) promoter.
  • CMV cytomegalovirus
  • CMV promoter The structure of the CMV promoter is described in particular in Hennighausen et al. (EMBO J. 5 (6), 1367-1371, 1986).
  • the genetic construct comprises a sequence encoding an extracellular secretion signal.
  • extracellular secretion signals which are well known to those skilled in the art, make it possible to obtain higher antibody titers.
  • the sequence coding for the extracellular secretion signal is chosen from the sequences SEQ ID No. 9, which codes the extracellular secretion signal of mouse erythropoietin, and SEQ ID No. 10, which codes the extracellular secretion signal. of human alkaline phosphatase, and one of their variants.
  • the genetic construct comprises, in 5 'of the promoter, a translation initiation site nucleic sequence, called KOZAK sequence, of sequence SEQ ID No. 11.
  • At least one initial codon of the nucleic acid sequence which encodes at least one fragment of said toxin is replaced by a different codon encoding the same amino acid and whose frequency in eukaryotic cells is higher than the frequency in Clostridium botulinum, as defined in Table 1.
  • botulinum toxins are naturally produced by the organism Clostridium, the genetic code used by this organism is not necessarily adapted to a good expression of the protein in mammals.
  • the inventors have therefore used a synthetic gene designed according to the codon optimization technique, that is, the use of synonymous codons corresponding to the most common tRNAs (transfer RNA) in eukaryotic cells.
  • the genetic construct further comprises a nucleic acid encoding at least one cytokine.
  • step (a) comprises another genetic construct that contains a nucleic acid encoding a cytokine, said two genetic constructs being co-administered in step (b).
  • the nucleic acid sequence encoding the cytokine is selected from the group consisting of SEQ ID NO: 12, which encodes the hematopoietic growth factor (GM-CSF), SEQ ID NO: 13, which encodes the subunit.
  • SEQ ID NO: 12 which encodes the hematopoietic growth factor (GM-CSF)
  • SEQ ID NO: 13 which encodes the subunit.
  • GM-CSF hematopoietic growth factor
  • SEQ ID NO: 13 which encodes the subunit.
  • p3 unit of mouse interleukin 12 SEQ ID No. 14, which encodes the mouse subtilute p40 of mouse interleukin 12, SEQ ID No. 15, which encodes mouse interleukin-4, and SEQ ID No. 16, which encodes human interleukin 10.
  • the genetic construct further comprises a non-methylated immunostimulation sequence rich in guanine and cytosine bases, with a size of between 10 and 10,000 nucleotides.
  • CpG sequence Such a sequence, called CpG sequence, is well known to those skilled in the art. It should be understood that in the present invention the immunostimulatory sequence may also be a particular oligonucleotide which will be co-administered with the plasmid encoding the toxin fragment. (Mutwiri et al., Veterinary Immunology and Immunopathology, 2003, 91, 89-103, R. Rankin, et al., Vaccine 2002, 20, 3014-3022).
  • the antiserum is directed against at least two protein toxins and in that the solution of step a) comprises a mixture of at least two genetic constructs, each said constructs comprising a nucleic acid encoding at least one immunogenic fragment of said toxins.
  • the animal is selected from the mouse, the rabbit, the horse and the pig.
  • steps b) and c) are repeated at least once before step d).
  • steps b) and c) are repeated at an interval of at least 15 days, preferably at least 3 weeks, and particularly preferably at least 1 month.
  • step c) is followed by administration in the animal of the recombinant immunogenic fragment of said toxin. Generally this administration is carried out at least 15 days after step c). The serum is then isolated in step d).
  • Serum isolation can be achieved by any method known to those skilled in the art.
  • the serum is isolated in step d) by centrifugation.
  • the subject of the present invention is an antiserum directed against a protein toxin obtainable by the method according to any one of the preceding claims, characterized in that its anti-toxin antibody titre is greater than or equal to 100, and in that its neutralizing power is greater than or equal to 100.
  • the antibody titre can be determined by carrying out dilutions, for example two-fold dilutions of the sera from the 1/100 th dilution, then an ELISA assay is performed, and a curve giving the optical density is obtained. given wavelength, for example at 492 nm when the peroxidase / orthophenylenediamine system is used as a function of dilution.
  • the title Antibody is the reciprocal of the dilution factor that gives an optical density of at least 0.2 above naive sera.
  • the presence of neutralizing antibodies is determined by a mouse lethality test: for example, botulinum neurotoxin type A is produced and calibrated at 10 Doses.
  • mice per ml Serum dilutions are then incubated with a toxin preparation, and injected into mice. The survival of the mice is then observed for a few days. The results are expressed as neutralizing units per ml (a neutralizing unit corresponding to the volume of serum neutralizing 10 lethal mouse doses).
  • the subject of the invention is also the antiserum according to the present invention, for its use as a preventive serum or as an antidote intended to neutralize in a mammal the toxic effects related to the absorption of the toxin in said mammal.
  • the absorption of the toxin may result from bacterial contamination in said mammal.
  • the present invention further relates to the use of an antiserum according to the present invention, for the manufacture of a medicament for preventing or treating a toxic effect related to the absorption in a mammal of a toxin chosen from group consisting of a Clostridium botulinum toxin, a Clostridium tetani toxin, a Bacillus anthracis toxin, ricin, diphtheria toxin and cholera toxin.
  • a toxin chosen from group consisting of a Clostridium botulinum toxin, a Clostridium tetani toxin, a Bacillus anthracis toxin, ricin, diphtheria toxin and cholera toxin.
  • the subject of the invention is also the antiserum according to the present invention, for its use as reagent in an immunological test, such as for example, but not limited to, an enzyme immunoassay ELISA, an immunotransfer, an immunoluminescent titration, etc.
  • an immunological test such as for example, but not limited to, an enzyme immunoassay ELISA, an immunotransfer, an immunoluminescent titration, etc.
  • an immunological test such as for example, but not limited to, an enzyme immunoassay ELISA, an immunotransfer, an immunoluminescent titration, etc.
  • the subject of the invention is the use of a solution containing at least one genetic construct according to the present invention, for the manufacture of a medicament intended to prevent or treat a toxic effect linked to absorption.
  • a toxin selected from the group consisting of a Clostridium botulinum toxin, a Clostridium tetani toxin, a Bacillus anthracis toxin, ricin, diphtheria toxin and cholera toxin, characterized in that said drug is formulated for administration by electrotransfer.
  • electroporation conditions applicable for the electrotransfer administration, the mode and the number of injections are as defined above.
  • the drug prepared from the solution containing the at least one genetic construct must be formulated in the absence of cationic lipids to allow electrotransfer. It can be formulated in the presence of any acceptable pharmaceutical excipient known to those skilled in the art, such as a saline solution, a phosphate buffer, a glucose buffer, etc.
  • the use according to the invention is characterized in that the solution additionally contains an immunostimulatory adjuvant.
  • immunostimulatory adjuvants include, but are not limited to, Freund's adjuvant and alum.
  • the "*" sign in certain figures corresponds to an antibody titre of less than 100.
  • Figure 1 ELISA assay sera 3 weeks after electrotransfer.
  • Figure 2 ELISA assay sera 70 days after electrotransfer. Dilutions of 2 2 sera from the dilution 1/100.
  • FIG. 4 Comparison of injection-only / injection + electrotransfer with plasmids pVaxFcBoNTA and pVaxFc * BoNTA
  • Figure 7 Effect of hyaluronidase on the antibody titre (plasmid pVaxFc * BoNTA-Master)
  • Figure 8 Anti-FcBoNTB antibody titers with the plasmids pVaxFc * BoNTA and pVaxFc * BoNTA-Master (injection + electrotransfer)
  • FIG. 9 Anti-FcBoNTE antibody titers with plasmids pVaxFcBoNTE, pVaxFc * BoNTE, pVaxFc * BoNTE-Master and pVaxFc * BoNTE-Variant
  • FIG. 10 Anti-FcBoNTA, antiFcBoNTB and anti-antibody titres
  • FIG. 11 Anti-FcBoNTA antibody titres in rabbits
  • FIG. 12 Anti-FcBoNTA antibody titers with or without reinjection of plasmid pVaxFc * BoNTA-Master in mice ("id.” For intradermal and igui e ⁇ J; Naked anti-FcBoNTA antibody with or without reinjection of plasmid pVaxFc * BoNTA in mice.
  • Fig. 14 Interest of codon optimization for obtaining higher antiserum titers: using pVaxFcNoNTA (dark) or the codon-optimized sequence of the Hc fragment of botulinum toxin serotype A (plasmid A pVaxFc * BoNTA, quadrille).
  • Figure 15 Obtaining antisera by the method of the invention, assayed at three times after electrotransfer, using an optimized genetic sequence encoding a fragment of botulinum toxin A, not associated (Fc * BoNTA) or associated (Fc * BoNTA secreted, column squared) to a protein secretion sequence.
  • Figure 16 Obtaining antisera by the method of the invention, assayed at three times after electrotransfer, using an optimized genetic sequence encoding a fragment of botulinum toxin B, not associated (Fc * BoNTB) or associated (Fc * BoNTB secreted) to a protein secretion sequence
  • FIG. 17 Obtaining antisera by the method of the invention, assayed at three times after electrotransfer, using an optimized genetic sequence coding for a codon-optimized fragment of botulinum toxin E: - codon-optimized (FcBoNTE) not associated or associated with a codon-optimized protein secretion sequence (Fc * BoNTE) associated with or associated with a secreted protein secretion sequence (Fc * BoNTE) EXAMPLES I- Materials and methods
  • FcBoNTA the C-terminal fragment of botulinum toxin A
  • FcBoNTA a fragment known as the most immunogenic part of the toxin.
  • the different constructs tested are: pVaxFcBoNTA: this plasmid contains the FcBoNTA fragment under the control of a CMV promoter.
  • pVaxFc * BoNTA this plasmid contains the FcBoNTA fragment whose sequence has been optimized so that the expression of the protein is optimal in the mouse (denoted Fc * BoNTA).
  • This plasmid contains the Fc * BoNTA fragment fused to the secretion signal of human secreted alkaline phosphatase, and preceded by a Kozak sequence which improves the translation.
  • the muscles or the skin are then subjected to an electric field of 200V / cm in the form of 8 square pulses of 20 ms of a frequency of 2 Hz using two electrodes plates connected to a Genetronics EC 830 electric generator. If necessary, a solution of hyaluronidase (25 ⁇ l at 0.4U / ⁇ L in 15OmM NaCl) is injected into the cranial tibial muscle two hours before injection and electrotransfer.
  • Blood samples (approximately 150 ⁇ l) are taken by retro-orbital puncture on anesthetized mice.
  • the samples are centrifuged for 10 minutes at 4 ° C. at 3000 rpm.
  • the plasma is removed and the sera are stored at -80 ° C.
  • FcBoNTE in the serum of the mice an ELISA test is carried out.
  • the recombinant protein FcBoNTA, FcBoNTB or FcBoNTE is deposited on the bottom of a 96-well plate, the sera are then incubated with the plate: if antibodies are present in the serum, they will bind to the protein. Washings remove anything that is not attached to the recombinant protein and the presence of anti-Fc antibodies is then detected by the combination of a biotinylated anti-mouse Ig secondary antibody and streptavidin coupled to the peroxidase. It is then sufficient to reveal with a peroxidase substrate and read the plate at 492 nm.
  • mice lethality test botulinum neurotoxin type A is produced and calibrated at 10 mouse lethal doses per ml. Serum dilutions are then incubated with 2 ml of toxin preparation 30 minutes at 37 °, and injected into mice intraperitoneally (2 mice per dilution, ImI per mouse). The survival of the mice is then observed for four days. The results are expressed as neutralizing units per ml (a neutralizing unit corresponding to the volume of serum neutralizing 10 lethal mouse doses).
  • the inventors have performed an experiment to validate the interest of electrotransfer.
  • the inventors have for this purpose compared the antibody titres obtained on batches of mice injected with the same plasmid (pVaxFcBoNTA or pVaxFc * BoNTA) but with or without electrotransfer following the injection.
  • mice tested the neutralizing power of these antibodies obtained by injection alone or injection + electrotransfer: The inventors thus performed a neutralization test or lethality test in the mouse. The sera were tested at 45 days and the sera of the same condition were "pooled” to limit the number of mice. The results presented in Table 2 give the number of live mice on the number of total mice for each dilution of serum and for each condition. The neutralizing titer is deduced as the reciprocal of the highest dilution for which mice are alive:
  • Samples were taken at 15 days, 30 days and 45 days after injection and electrotransfer.
  • the inventors have tested the co-injection + electrotransfer of several plasmids encoding several C-terminal fragments: FcBoNTA, FcBoNTB, and FcBoNTE.
  • the three plasmids encode the C-terminal fragments preceded by the secretion signal of mouse Epo and a Kozak sequence. 40 ⁇ g of each plasmid, ie 20 ⁇ g of each in each mouse paw, were injected to make a total of 60 ⁇ g of DNA per paw.
  • the anti-FcBoNTA antibody titers are given in Figure 10 (A).
  • the anti-FcBoNTB antibody titers are given in Figure 10 (B).
  • the anti-FcBoNTE antibody titers are given in Figure 10 (E).
  • the inventors have tested the injection or injection + electrotransport of 500 ⁇ g of plasmid pVaxFc * BoNTA-Master in rabbits.
  • the electrotransfer conditions are: 8 pulses of 125V / cm; of 20ms; a frequency of 2Hz with needle electrodes.
  • mice tested in mice the effect of a second reinjection + electrotransfer: two injections + electrotransfer in each muscle at 0 with the plasmid pVaxFc * BoNTA-Master (notation im, 80 ⁇ g) (FIG.
  • the inventors compared different constructs and different procedures (4 mice per condition): injection alone (injection + electrotransfer) intramuscular injection + electrotransfer of 40 ⁇ g of pVaxFcBoNTA injection + electrotransfer with intramuscular 40 ⁇ g of pVaxFc * BoNTA (optimized sequence) - intracuscular injection + electrotransfer of 40 ⁇ g of pVaxFc * BoNTA-Master (optimized sequence + signal of secretion of murine erythropoietin + Kozak sequence) intracuscular injection + electrotransfer of 40 ⁇ g of pVaxFc * BoNTA-Variant (optimized sequence + secretion signal of secreted human alkaline phosphatase + Kozak sequence) intracutaneous injection + electrotransfer of 40 ⁇ g of pVaxFc * BoNTA (optimized sequence) treatment with hyaluronidase + intramuscular injection + electrotransfer of 40 ⁇
  • the inventors thus detect, as early as three weeks, anti-FcBoNTA antibodies in all the sera of the mice treated under the various conditions described, and not in the sera of the naive mice. It may be noted, however, that the antibody titre varies according to the conditions: the mice treated with hyaluronidase have an antibody titre higher than the others. This enzyme is responsible for the breakdown of hyaluronic acid, a major component of the extracellular matrix of the muscle. Hyaluronidase thus makes it possible to increase the accessibility of plasmids to muscle cells. Intradermal electrotransfer also makes it possible to obtain antibodies. Samples were then taken every 15 days, and the results obtained with the ELISA 70 days after injection are given in FIG.
  • the appearance of the 70-day ELISA assay is similar to that obtained at 21 days. It may be noted, however, that antibody titers increased under all conditions except the intradermal condition. This can be explained by the fact that the inventors have shown that the expression of a protein after intradermal electrotransport only lasts about fifteen days, compared to kinetics of expression in the muscle that last up to a year. . To obtain a more global view of antibody titers during kinetics, Figure 3 presents the set of titles obtained by condition over time.
  • mice The results presented in Table 3 give the number of live mice on the number of mice treated for each dilution of serum and for each condition.
  • the neutralizing titer is deduced as the inverse of the highest dilution for which the mice are alive:
  • the first conclusion of this test is that the antibodies obtained by plasmid electrotransfer are neutralizing.
  • the inventors then performed an experiment to validate the interest of electrotransfer. For this purpose, they compared the antibody titres obtained on batches of mice injected with the same plasmid (pVaxFcBoNTA or pVaxFc * BoNTA) but with or without electrotransfer following the injection.
  • the inventors obtained, after a single injection and electrotransfer of plasmid encoding the C-terminal FcBoNTA fragment of botulinum toxin A, strong titers of neutralizing antibodies. This result suggests that this simple method can be used to obtain mono or multivalent botulinum antitoxin antisera for therapeutic use.
  • a multivalent antiserum can be obtained by genetic immunization to several plasmids, because it has been shown that cotransfection led with the electrotransfer technique to coexpression.
  • a multivalent antiserum can be obtained by simple mixing of univalent antisera.

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Abstract

L'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un antisérum dirigé contre une toxine protéique par administration chez un animal d'une solution comprenant une construction génétique codant un fragment immunogène de toxine, suivie de l'application d'un champ électrique dans la zone d'administration, et isolement du sérum. L'antisérum susceptible d'être obtenu par le procédé ainsi que l'utilisation de la solution pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une administration par électrotransfert, sont également compris dans l'invention.

Description

PROCEDE D'IMMUNISATION GENETIQUE PAR ELECTROTRANSFERT CONTRE UNE TOXINE ET ANTISERUM SUSCEPTIBLE D'ETRE OBTENU PAR LEDIT PROCEDE
L'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un antisérum dirigé contre une toxine protéique par administration chez un animal d'une solution comprenant une construction génétique codant un fragment immunogène de toxine, suivie de l'application d'un champ électrique dans la zone d'administration, et isolement du sérum. L'antisérum susceptible d'être obtenu par le procédé ainsi que l'utilisation de la solution pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une administration par électrotransfert chez le patient, sont également compris dans l'invention.
Le moyen le plus utilisé à l'heure actuelle qui permet d'obtenir des antisérums contre un antigène protéique, par exemple une toxine ou un poison, est d'effectuer des injections répétitives de protéines recombinantes ou natives purifiées afin d'induire une réponse immunitaire chez l'animal. Alternativement, on peut aussi faire exprimer la protéine sur une capside ou enveloppe virale, ou dans une particule de type virosome. Pour la toxine botulinique ou d'autres toxines létales, on ne peut pas immuniser avec la toxine entière. Classiquement, il faut produire de la toxine à partir de la bactérie, la purifier, puis modifier cette protéine de façon à inactiver sa létalité, tout en gardant son pouvoir antigénique. Ceci s'obtient, par exemple, en purifiant une sous-unité de la toxine, qui n'est donc pas entièrement fonctionnelle. Alternativement, on peut produire une telle sous-unité recombinante, par exemple chez E.coli. Ceci peut se révéler indispensable en l'absence de procédé fiable d'inactivation de la toxine. Dans les deux cas, production de protéine native inactivée ou de fragments recombinants, les techniques sont lourdes et coûteuses. Ceci explique par exemple, qu'un seul stock de sérum multivalent contre les divers sérotypes de toxines botuliniques aient été produits à ce jour.
Une voie alternative pour l'obtention d'un antisérum est l'immunisation génétique, dans laquelle un ADN codant la toxine est administré chez l'animal à immuniser. L'ADN codant, dans lequel le gène codant est précédé d'un promoteur adéquat et comporte une séquence de polyadénylation, peut être porté, soit par un vecteur viral (adénovirus, AAV, rétrovirus, lentivirus, etc.), soit par un plasmide bactérien. Il peut être aussi produit par synthèse acellulaire in vitro, par exemple par PCR. La possibilité d'obtenir une immunisation par injection d'un ADN plasmidique a été démontrée pour la première fois il y a une dizaine d'années (Tang et al., Nature. 1992 Mar 12 ; 356(6365): 152-4; Ulmer et al., Science. 1993 Mar 19;259(5102): 1745-9). L'immunisation génétique consiste à injecter directement dans le muscle squelettique ou la peau, ou encore dans d'autres tissus, les gènes codant les protéines antigéniques et insérés sur un fragment circulaire d'ADN bactérien (plasmide). L'organisme lui-même produit les antigènes qui vont induire la réaction immunitaire. Il est maintenant bien établi que l'immunisation par ADN induit une réponse durable à la fois cellulaire et humorale (Gurunathan et al., Annu Rev Immunol. 2000; 18:927-74. Review; Quinn et al., Vaccine. 2002 Aug 19;20(25-26):3187-92).
De nombreuses publications récentes font état de cette réponse humorale, dont on peut citer quelques exemples :
- Une injection intramusculaire unique de plasmide codant une protéine de l'enveloppe du virus HBV (hépatite B) provoque la production d'anticorps pendant au moins 74 semaines (Davis et al., Gène Ther. 1997 Mar;4(3):181-8), à un titre compatible avec une protection efficace.
- Lorsqu'un plasmide codant un génome muté du virus de Kunjin est injecté intramusculairement chez la souris, des anticorps sont produits avec un titre variant de 10 à 40. Si ces souris sont soumises au virus sauvage de Kunjin, ou au très ressemblant virus West NiIe, elles sont protégées (0 à 20% de mortalité) (Hall et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Sep 2;100(18):10460-4. Epub 2003 Aug l3).
- L'injection intramusculaire chez la souris de plasmide codant la partie membranaire de la protéine humaine PSMA (prostate spécifie membrane antigen) conduit à la production d'anticorps contre cette protéine (Kuratsukuri et al., Eur Urol. 2002 Jul;42(l):67-73).
Ces quelques exemples montrent qu'il est possible d'obtenir des anticorps neutralisants avec des titres satisfaisants chez l'animal par immunisation par l'ADN. Ceci est surtout vrai chez la souris, et la méthode est un peu moins efficace chez les animaux plus gros (Babiuk et al., Vaccine. 2003 Jan 30;21(7- 8):649-58. Review; Dupuis et al., J Immunol. 2000 Sep l;165(5):2850-8).
Une bien meilleure efficacité de transfert de gène peut être obtenue en utilisant la technique physique. Par exemple, la méthode balistique de "gène gun" utilisant des particules d'or recouvertes d'ADN, qui sont projetées à très grande vitesse sur la peau ou les muqueuses de l'animal conduisant à l'administration d'ADN aux noyaux des cellules de ces tissus. Une autre technique utilise les ultrasons. Une autre technique, appelée méthode "hydrodynamique ou hydrostatique" d'injection d'ADN, utilise l'injection rapide intraveineuse ou intraartérielle d'un grand volume de liquide contenant l'ADN codant, ce qui permet la pénétration de l'ADN dans les cellules, par exemple les hépatocytes, les cellules endothéliales, ou les cellules musculaires. Une dernière méthode physique très efficace d'administration d'ADN est l'électrotransfert, que les inventeurs ont développée au laboratoire. L'électrotransfert est une technique simple et efficace de transfert de gènes, consistant en une injection intramusculaire d'une solution d'ADN suivie de l'application d'une série d'impulsions électriques, au moyen d'électrodes reliées à un générateur (Aihara et al., Nat Biotechnol. 1998 Sep; 16(9): 867-70.; Mir et al., C R Acad Sci III. 1998 Nov;321(l l):893-9.; Mir et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Apr 13;96(8):4262-7.). Ceci permet d'améliorer l'expression des protéines de plusieurs ordres de grandeur (Lee et al., Mol Cells. 1997 Aug 31;7(4):495-501; Kirman et al., Curr Opin Immunol. 2003 Aug;15(4):471-6. Re vie w).
Plusieurs études récentes montrent l'intérêt de la technique d'électrotransfert lors de l'immunisation par ADN: par exemple, le titre en anticorps produit augmente d'un facteur 100 chez la souris après électrotransfert d'un plasmide codant un antigène de surface du virus HBV (Widera et al., J Immunol. 2000 May l;164(9):4635-40). Ce facteur d'augmentation est de l'ordre de 10 dans le cas de lapins ou de cochons d'Inde. Des titres élevés en anticorps ont également été obtenus chez la souris et le lapin après électrotransfert intramusculaire d'un plasmide codant une glycoprotéine de l'enveloppe du virus de l'hépatite C (Zucchelli et al., J Virol. 2000 Dec;74(24): 11598-607), et chez la souris après électrotransfert d'un plasmide codant une protéine du bacille de la tuberculose (Tollefsen et al., Vaccine. 2002 Sep 10;20(27-28):3370-8). Cette technique est également applicable à des animaux plus gros tels que la chèvre ou les bovins, (Tollefsen et al., Scand J Immunol. 2003 Mar;57(3):229-38). Les inventeurs ont eux-même montré au laboratoire que l'électrotransfert d'un plasmide codant l'hémagglutinine de la grippe induisait une meilleure réponse immune chez la souris qu'une simple injection intramusculaire (Bachy et al., Vaccine. 2001 Feb 8;19(13-14):1688-93). Enfin, on peut noter qu'il a été possible de générer des anticorps monoclonaux contre des allergènes de mites après immunisation de souris par électrotransfert (Yang et al., Clin Exp Allergy. 2003 May;33(5):663-8). La technique d'électrotransfert est simple, facile à mettre en œuvre, et ne requiert pas la purification de protéines recombinantes, étape généralement longue, fastidieuse et de coût élevé nécessaire lors de l'immunisation classique. Elle permet donc de tester rapidement plusieurs épitopes.
Les techniques d'immunisation génétiques citées plus haut (méthodes balistiques, ultrasoniques, hydrodynamiques, hydrostatiques ou électriques) peuvent être combinées avec des méthodes d'immunisation classique par protéine. Par exemple, on pourra pratiquer une première immunisation génétique, suivie après plusieurs semaines de 1 à 2 immunisations génétiques, suivies enfin après plusieurs semaines ou plusieurs mois de plusieurs immunisations protéiques contre le même antigène. On pourra aussi, alternativement, vacciner d'abord contre la protéine puis effectuer une immunisation génétique.
Les neurotoxines botuliques (Clostridium botulinum) et tétaniques (Clostridium tetani) présentent une organisation commune. Elles sont synthétisées sous forme d'une seule chaîne protéique (~ 150 kDa), qui est ensuite activée par un clivage protéolytique déterminant deux chaînes protéiques : la chaîne légère en N- terminal ou L (~ 50 kDa) et la chaîne lourde en C-terminal ou H (~ 100 kDa), qui restent réunies par un pont disulfure. Trois domaines fonctionnels ont été définis sur ces neurotoxines. La moitié C-terminale de la chaîne H (dénommée Hc) est le domaine de reconnaissance d'un récepteur spécifique à la surface des neurones. La moitié N-terminale de la chaîne H (H-N) est impliquée dans Finternalisation dans le neurone de la chaîne L. Cette dernière contient le site enzymatique de protéolyse vis-à-vis des protéines SNAREs et est responsable de l'activité intraneuronale des neurotoxines qui se traduit par un blocage de la neuro- exocytose. Chacun de ces trois domaines fonctionnels est associé à une structure tridimensionnelle particulière. Le domaine Hc contient deux structures riches en feuillets bêta, le domaine H-N est formé de deux très longues hélices alpha, et la chaîne L forme une structure compacte riche en feuillets bêta (Kozaki et al., Infect Immun. 1986 Jun;52(3):786-91; Kozaki et al., Infect Immun. 1987 Dec;55(12):3051-6).
L'ensemble des gènes des neurotoxines botuliques et tétaniques a été séquence et la structure cristallographique a été déterminée pour les neurotoxines botuliques A et B et la neurotoxine tétanique. Divers travaux ont été réalisés pour déterminer le fragment immunogène de ces neurotoxines. Il a d'abord été montré que le fragment Hc de la toxine tétanique, obtenu par protéolyse par la papaïne et purifié par chromatographie, est non toxique et protège par immunisation anti-Hc les souris contre une dose d'épreuve de toxine (Kozaki et al., Infect Immun. 1989 Sep;57(9):2634-9.). Puis, ce fragment a été produit en tant que protéine recombinante chez Escherichia coli et s'est également révélé un excellent immunogène (Halpern et al., Infect Immun. 1989 Jan;57(l): 18-22.).
Parmi tous les fragments recombinants de neurotoxine botulique A testés, le seul qui induise une protection complète des souris est le domaine C-terminal de la chaîne lourde, qui correspond au domaine Hc de la neurotoxine tétanique (Clayton et al., Infect Immun. 1995 Jul;63(7):2738-42; Dertzbaugh et West, Vaccine. 1996 Nov;14(16):1538-44; Kubota et al., Appl Environ Microbiol. 1997 Apr;63(4): 1214-8; LaPenotiere et al., Toxicon. 1995 Oct;33(10):1383-6. Review). Les anticorps monoclonaux neutralisants obtenus avec la neurotoxine botulique A entière comme immunogène étaient tous dirigés contre le fragment Hc. L'analyse des anticorps générés par vaccination avec la neurotoxine botulique entière formulée chez l'homme a montré que la plupart étaient dirigés contre la chaîne légère et peu contre le fragment Hc. Cette étude a conclu qu'un vaccin basé sur le fragment Hc est plus protecteur qu'un vaccin préparé avec la toxine entière (Brown et al., Hybridoma. 1997 Oct;16(5):447-56). De ce fait, la deuxième génération de vaccin antibotulique développée par l'USAMRIID consiste en des fragments Hc recombinants et purifiés des sept toxinotypes de neurotoxines botuliques A, B, C, D, E , F et G. II a été noté que le fragment recombinant Hc serait plus efficace que l'anatoxine correspondante préparée de façon classique. La protection à l'aide d'anticorps neutralisants de neurotoxine consiste essentiellement dans le blocage de la reconnaissance du récepteur cellulaire par le fragment Hc (Brown et al., 1997). Par ailleurs, de nombreux travaux ont été réalisés pour obtenir des anticorps monoclonaux neutralisants contre les neurotoxines botuliques. Les essais réalisés avec la neurotoxine botulique A entière se sont fréquemment révélés infructueux alors que ceux produits en immunisant des souris avec la protéine recombinante Hc ont permis d'obtenir un nombre significatif d'anticorps monoclonaux neutralisants (Amersdorfer et al., Infect Immun. 1997 Sep;65(9):3743-52; Middlebrook, Adv Exp Med Biol. 1995;383:93-8). Ainsi, le fragment Hc se révèle être un meilleur immunogène que la neurotoxine entière et détoxifiée pour induire des anticorps neutralisants. La méthode actuellement utilisée implique la production de protéines natives ou recombinantes, ce qui est un processus long et coûteux. De plus, si la protéine native ou recombinante est toxique, elle doit être dénaturée avant l'injection chez des animaux. Il peut en résulter des antisérums à faible pouvoir neutralisant, puisque seul des anticorps d'épitopes peuvent être obtenus.
Ainsi, il existe aujourd'hui un réel besoin de posséder des antisérums protecteurs contre des toxines botuliques (ou autres), notamment en cas de bioterrorisme.
Les inventeurs ont mis au point une nouvelle méthode d'obtention d'antisérum dirigé contre une toxine protéique, l'antisérum obtenu avec cette méthode possédant un titre élevé en anticorps neutralisants contre les toxines botuliques. La nouvelle méthode présente en outre l'avantage d'être facile à mettre en œuvre et d'être peu coûteuse.
Ainsi, selon un premier aspect, l'invention a pour objet un procédé d'obtention d'un antisérum dirigé contre au moins une toxine protéique comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'une solution comprenant au moins une construction génétique, ladite construction comprenant un acide nucléique codant au moins un fragment immunogène de ladite toxine, b) administration par injection chez un animal de la solution obtenue à l'étape a), c) application d'un champ électrique dans la zone d'injection, et d) prélèvement ultérieur de sang total et isolement du sérum.
Par toxine protéique on entend désigner toute substance d'origine animale, végétale ou bactérienne qui produit des effets toxiques et qui est généralement antigénique. Par « fragment immunogène de toxine protéique » on entend désigner tout fragment de ladite toxine qui possède la capacité d'induire une réaction ou une réponse immunitaire.
Les termes protéine, polypeptide ou peptide sont utilisés indifféremment dans la présente description pour désigner une séquence d'acides aminés ou, pour leurs dérivés, contenant une séquence d'acides aminés.
Par « prélèvement ultérieur » (étape (d)) au sens de la présente demande on entend un prélèvement qui est effectué dans un laps de temps minimum après létape (c) (application d'un champ électrique) nécessaire pour obtenir une immunisation. De manière générale, ce laps de temps est d'au moins 15 jours après l'application du champ électrique.
Pour la mise en pratique de la présente invention, on utilise de nombreuses techniques classiques en biologie moléculaire, en microbiologie et en génie génétique. Ces techniques sont bien connues et sont expliquées, par exemple, dans Current Protocols in Molecular Biology, Volumes I, II et III, 1997 (F. M. Ausubel, éd.) ; Sambrook et coll., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2*°* édition, CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, N.Y. ; DNA Cloning : A Practical Approach, Volumes I et II, 1985 (D.N. Glover, éd.) ; Oligonucleotide Synthesis, 1984 (M.L. Gait, éd.) ; Nucleic Acid Hybridization, 1985 (Hames et Higgins) ; Transcription and Translation, 1984 (Hames et Higgins, éd.) ; Animal CeIl Culture, 1986 (R.I. Freshney, éd.) ; Immobilized Cells and Enzymes, 1986 (IRL Press) ; Perbal, 1984, A Pratical Guide to Molecular Cloning ; la série, Methods in Enzymology (Académie Press, Inc.) ; Gène Transfer Vectors for Mammalian Cells, 1987 (J.H. Miller et M.P. Calos, éds., CoId Spring Harbor Laboratory) ; et Methods in Enzymology Vol. 154 et Col. 155 (Wu et Grossmann, et Wu, éd. respectivement).
Les conditions d'application d'un champ électrique dans la zone d'injection selon l'étape (c) sont maintenant bien connues de l'homme l'art, et sont notamment décrites dans les demandes de brevet internationales publiées le 14 janvier 1999 sous les numéros WO 99/01157 et WO 99/01158. L'homme de l'art saura adapter ces conditions selon chaque cas.
De préférence, le champ électrique possède une intensité comprise entre 1 et 800 V/cm sous la forme de 1 à 100 000 impulsions carrées d'une durée supérieure à 100 microsecondes et d'une fréquence comprise entre 0,1 et 1000 Hertz. De manière encore préférée, le champ électrique possède une intensité comprise entre 80 et 250 V/cm sous la forme de 1 à 20 impulsions à ondes carrées d'une durée comprise entre 1 et 50 millisecondes et d'une fréquence de 1 à 10 Hertz.
Avantageusement, l'injection est une injection intradermique ou intramusculaire.
Selon un mode de réalisation préféré, l'étape b) d'administration de la solution est précédée d'une étape d'injection d'une solution contenant une enzyme dégradant la matrice extracellulaire, telle que la hyaluronidase. En effet, cette enzyme est responsable de la dégradation de l'acide hyaluronique, constituant majeur de la matrice extracellulaire du muscle. La hyaluronidase permet donc d'augmenter l'accessibilité des plasmides aux cellules musculaires. De préférence, on injecte entre 5 et 200 μl d'une solution contenant entre 0,1 à 2 U/μl de hyaluronidase. De manière encore plus préférée, on injecte environ 25 μl d'une solution à 0.4U/μl de hyaluronidase dans du NaCl. De manière avantageuse, la toxine est choisie dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, de Clostridium tetani, de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra.
De manière encore plus avantageuse, le fragment immunogène de ladite toxine est le fragment C-terminal (Hc) choisi dans le groupe constitué par le fragment Hc de la toxine de sérotype A de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 1, le fragment Hc de la toxine de sérotype B de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 2, le fragment Hc de la toxine de sérotype C de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 3, le fragment Hc de la toxine de sérotype D de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 4, le fragment Hc de la toxine de sérotype E de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 5, le fragment Hc de la toxine de sérotype F de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 6, le fragment Hc de la toxine de sérotype G de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 7, et le fragment Hc de la toxine de Clostridium tetani de séquence SED ID N° 8, ainsi que leurs variants.
De préférence, l'acide nucléique codant le fragment Hc de la toxine A de Clostridium botulinum est de séquence SED ID N° 17, ou l'un de ses variants.
Dans son sens le plus large, le terme "variant" d'une séquence protéique désigne une séquence ne présentant de modifications qu'au niveau d'aminoacides ou de nucléotides n'ayant pas d'influence sur sa fonction en ne diminuant pas son immunogénicité. De même, on entend désigner par « variant » quand elle est utilisée ici en référence à une séquence nucléotidique, une séquence de nucléotides correspondant à une séquence de nucléotides de référence, la séquence correspondante codant un polypeptide ayant sensiblement la même structure et la même fonction que le polypeptide codé par la séquence nucléotidique de référence. Il est souhaitable que la séquence nucléotidique sensiblement similaire code le polypeptide codé par la séquence nucléotidique de référence. Il est souhaitable que le pourcentage d'identité entre la séquence nucléotidique sensiblement similaire et la séquence nucléotidique de référence soit d'au moins 90 %, plus préférablement d'au moins 95 %, encore plus préférablement d'au moins 99 %. Les comparaisons de séquences sont réalisées en utilisant l'algorithme d'alignement des séquences de Smith-Waterman (se reporter par exemple à Waterman, M.S. Introduction to Computational Biology : Maps, séquences and génomes. Chapman & Hall. Londres : 1995. ISBN 0412-99391-0 ou à http://www-hto.usc.edu/ software/seqahi/index.html). Le programme localS version 1.16 est utilisé avec les paramètres suivants : "match" : 1, "mismatch penalty" : 0,33, "open-gap penalty" : 2, "extended-gap penalty" : 2. Une séquence nucléotidique "sensiblement similaire" à la séquence nucléotidique de référence s'hybride avec la séquence nucléotidique de référence dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA ImM à 50°C avec lavage dans 2 x SSC, SDS à 0,1 % à 50°C, de façon plus souhaitable dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA ImM à 50°C avec lavage dans 1 x SSC, SDS à 0,1 % à 50°C, de façon encore plus désirable dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA ImM à 50°C avec lavage dans 0,5 x SSC, SDS à 0,1 % à 50°C, de préférence dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA ImM à 50°C avec lavage dans 0,1 x SSC, SDS à 0,1 % à 50°C, plus préférablement dans dodécylsulfate de sodium (SDS) à 7 %, NaPO4 0,5M, EDTA ImM à 50°C avec lavage dans O5Ix SSC, SDS à 0,1 % à 65°C, et code encore pour un produit de gène fonctionnellement équivalent.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend en 5' de l'acide nucléique codant au moins un fragment de ladite toxine, le promoteur du cytomégalovirus (CMV).
La structure du promoteur du CMV est notamment décrite dans Hennighausen et al. (EMBO J. 5 (6), 1367-1371, 1986).
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend une séquence codant un signal de sécrétion extracellulaire. Ces signaux de sécrétion extracellulaires, qui sont bien connus de l'homme de l'art, permettent d'obtenir des titres en anticorps plus élevés. De préférence, la séquence codant le signal de sécrétion extracellulaire est choisie parmi les séquences SEQ ID N° 9, qui code le signal de sécrétion extracellulaire de l'érythropoietine de souris, et SEQ ID N° 10, qui code le signal de sécrétion extracellulaire de la phosphatase alcaline humaine, et l'un de leur variants.
Selon encore un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend en 5' du promoteur une séquence nucléique de site d'initiation de la traduction, dite séquence KOZAK, de séquence SEQ ID N° 11.
Selon encore un nouveau mode de réalisation préféré, au moins un codon initial de la séquence d'acide nucléique qui code au moins un fragment de ladite toxine, est remplacé par un codon différent codant le même acide aminé et dont la fréquence dans les cellules eucaryotes est plus élevée que la fréquence dans Clostridium botulinum, comme défini dans le tableau 1.
Tableau 1 :
Génome Mus mυscυlυs
Les toxines botuliques étant produites naturellement par l'organisme Clostridium, le code génétique utilisé par cet organisme n'est pas nécessairement adapté à une bonne expression de la protéine chez les mammifères. Les inventeurs ont donc utilisé un gène synthétique conçu selon la technique d'optimisation de codons, c'est-à-dire l'utilisation de codons synonymes correspondant aux ARNt (ARN de transfert) les plus fréquents dans les cellules eucaryotes.
Selon un autre mode de réalisation préféré, la construction génétique comprend en outre un acide nucléique codant au moins une cytokine.
Avantageusement, la solution de l'étape (a) comprend une autre construction génétique qui contient un acide nucléique codant une cytokine, lesdites deux constructions génétiques étant co-administrées à l'étape (b).
De préférence, la séquence de l'acide nucléique codant la cytokine est choisie dans le groupe constitué par SEQ ID N° 12, qui code le facteur de croissance hématopoïétique (GM-CSF), SEQ ID N° 13, qui code la sous-unité p35 de Finterleukine 12 de souris, SEQ ID N° 14, qui code la sous-unité p40 de Finterleukine 12 de souris, SEQ ID N° 15, qui code l'interleukine 4 de souris, et SEQ ID N° 16, qui code l'interleukine 10 humaine.
Selon un autre mode de réalisation avantageux, la construction génétique comprend en outre une séquence d'immunostimulation non méthylée riche en bases guanine et cytosine, d'une taille comprise entre 10 et 10000 nucléotides.
Une telle séquence, dite séquence CpG, est bien connue de l'homme de l'art. Il doit être entendu que dans la présente invention la séquence d'immunostimulation peut aussi être un oligonucléotide particulier qui sera co-administré avec le plasmide codant le fragment de toxine. (Mutwiri et al., Veterinary Immunology and immunopathology, 2003, 91, 89-103 ; R. Rankin, et al., Vaccine 2002, 20, 3014-3022).
Selon un mode de réalisation particulièrement avantageux, l'antisérum est dirigé contre au moins deux toxines protéiques et en ce que la solution de l'étape a) comprend un mélange d'au moins deux constructions génétiques, chacune desdites constructions comprenant un acide nucléique codant au moins un fragment immunogène desdites toxines.
De préférence, l'animal est choisi parmi la souris, le lapin, le cheval et le porc.
Selon un mode de réalisation tout particulièrement préféré, les étapes b) et c) sont répétées au moins une fois avant l'étape d). De manière générale, ces étapes sont répétées à un intervalle d'au moins 15 jours, de préférence d'au moins 3 semaines, et de manière particulièrement préférée, d'au moins un mois.
De manière encore plus préférée, l'étape c) est suivie d'une administration chez l'animal du fragment immunogène recombinant de ladite toxine. De manière générale cette administration est effectuée au moins 15 jours après l'étape c). On isole ensuite le sérum à l'étape d).
L'isolement du sérum peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier. De préférence, le sérum est isolé à l'étape d) par centrifugation.
Selon un deuxième aspect, la présente invention a pour objet un antisérum dirigé contre une toxine protéique susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce son titre en anticorps anti-toxine est supérieur ou égal à 100, et en ce que son pouvoir neutralisant est supérieur ou égal à 100.
Le titre en anticorps peut être déterminé en effectuant des dilutions, par exemple des dilutions de deux en deux des sérums à partir de la dilution 1/100e puis, on effectue un dosage ELISA, et on obtient une courbe donnant la densité optique à une longueur d'onde donnée, par exemple à 492 nm lorsqu'on utilise le système peroxydase/orthophénylènediamine en fonction de la dilution. Le titre en anticorps correspond à la réciproque du facteur de dilution qui donne une densité optique d'au moins 0,2 au dessus des sérums naïfs.
Pour la détermination du pouvoir neutralisant, ou titre neutralisant, la présence d'anticorps neutralisants est déterminée par un test de létalité chez la souris : par exemple, la neurotoxine botulique de type A est produite et calibrée à 10 Doses
Létales Souris par ml. Des dilutions de sérum sont ensuite incubées avec une préparation de toxine, et injectées à des souris. La survie des souris est ensuite observée pendant quelques jours. Les résultats sont exprimés par unités neutralisantes par ml (une unité neutralisante correspondant au volume de sérum neutralisant 10 Doses Létales Souris).
L'invention a également pour objet l'antisérum selon la présente invention, pour son utilisation comme sérum préventif ou comme antidote destiné à neutraliser chez un mammifère les effets toxiques liés à l'absorption de la toxine chez ledit mammifère.
Dans la présente demande, l'absorption de la toxine peut résulter de la contamination par bactéries chez ledit mammifère.
La présente invention a encore pour objet l'utilisation d'un antisérum selon la présente invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine choisie dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, une toxine de Clostridium tetani, une toxine de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra.
L'invention a encore pour objet l'antisérum selon la présente invention, pour son utilisation comme réactif dans un test immuno logique, tel que par exemple, sans toutefois s'y limiter, un titrage immuno-enzymatique ELISA, un immunotransfert, un titrage immunoluminescent, etc.. L'homme du métier connaît bien ces différents tests immunologiques et saura y appliquer l'antisérum selon l'invention.
Selon un dernier aspect, l'invention a pour objet l'utilisation d'une solution contenant au moins une construction génétique selon la présente invention, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine choisie dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, une toxine de Clostridium tetani, une toxine de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une administration par électrotransfert.
Les conditions d'électroporation applicables pour l'administration par électrotransfert, le mode et le nombre d'injections sont tels que définis précédemment.
Le médicament, préparé à partir de la solution contenant ladite au moins une construction génétique, doit être formulé en l'absence de lipides cationiques pour permettre l' électrotransfert. Il peut être formulé en présence de tout excipient pharmaceutique acceptable connu de l'homme de l'art, tel qu'une solution saline, un tampon phosphate, un tampon glucose, etc...
De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la solution contient en outre un adjuvant immunostimulant. On pourra citer comme exemples d'adjuvants immunostimulants, sans toutefois s'y limiter, l'adjuvant de Freund et l'alun.
Les exemples et figures qui suivent servent à illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
LEGENDES DES FIGURES
Le signe « * » dans certaines figures correspond à un titre en anticorps inférieur à 100.
Figure 1 : Dosage ELISA des sérums 3 semaines après électrotransfert.
Dilutions de 2 en 2 des sérums à partir de la dilution 1/100e.
Figure 2 : Dosage ELISA des sérums 70 jours après électrotransfert. Dilutions de 2 en 2 des sérums à partir de la dilution 1/100e.
Figure 3 : Titres en anticorps obtenus à partir des dosages ELISA de 21 à 70 jours après électrotransfert (titre en anticorps = réciproque du facteur de dilution qui donne une DO490 de 0.3 au dessus des sérums naïfs).
Figure 4 : Comparaison injection seule/injection + électrotransfert avec les plasmides pVaxFcBoNTA et pVaxFc*BoNTA
Figure 5 : Apport de l'optimisation des codons au niveau de la séquence FcBoNTA (FcBoNTA/Fc*BoNTA).
Figure 6 : Effet de la hyaluronidase sur le titre en anticorps (plasmide pVaxFcBoNTA et pVaxFc*BoNTA)
Figure 7 : Effet de la hyaluronidase sur le titre en anticorps (plasmide pVaxFc*BoNTA-Master) Figure 8 : Titres en anticorps anti-FcBoNTB avec les plasmides pVaxFc*BoNTA et pVaxFc*BoNTA-Master (injection+électrotransfert)
Figure 9 : Titres en anticorps anti FcBoNTE avec les plasmides pVaxFcBoNTE, pVaxFc*BoNTE, pVaxFc*BoNTE-Master et pVaxFc*BoNTE- Variant Figure 10 : Titres en anticorps anti-FcBoNTA, antiFcBoNTB et anti-
FcBoNTE dans ABE (avec les plasmides pVaxFc*BoNTA-Master, pVaxFc*BoNTB-Master et pVaxFc*BoNTE-Master co-injectés et électrotransférés : sérum multivalent ABE)
Figure 11: Titres en anticorps anti-FcBoNTA chez le lapin Figure 12 : Titres en anticorps anti-FcBoNTA avec ou sans réinjection du plasmide pVaxFc*BoNTA-Master chez la souris (« id. » pour intradermique et r igui e ±J ; nues eu ainicorps anti-FcBoNTA avec ou sans réinjection du plasmide pVaxFc*BoNTA chez la souris.
Figure 14 : Intérêt de l'optimisation de codon pour l'obtention de titres plus élevés en antisérum : en utilisant pVaxFcNoNTA (foncé) ou la séquence optimisée en codons du fragment Hc de la toxine botulinique de sérotype A (plasmide A pVaxFc*BoNTA, quadrillé).
Figure 15 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique optimisée codant pour un fragment de la toxine botulinique A, non associée ( Fc*BoNTA) ou associée (Fc*BoNTA sécrétée, colonne quadrillée) à une séquence de sécrétion protéique.
Figure 16 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique optimisée codant pour un fragment de la toxine botulinique B , non associée ( Fc*BoNTB) ou associée (Fc*BoNTB sécrétée) à une séquence de sécrétion protéique
Figure 17 : Obtention d'antisérums par le procédé de l'invention, dosée à trois temps après électrotransfert, en utilisant une séquence génétique optimisée codant pour un fragment de la toxine botulinique E : - non codon-optimisé (FcBoNTE), codon-optimisé non associée ou associée à une séquence de sécrétion protéique (Fc*BoNTE), codon-optimisé et associé ou associée à une séquence de sécrétion protéique (Fc*BoNTE sécrétée) EXEMPLES I- Matériels et méthodes
Matériel génétique
Les inventeurs ont injecté et électrotransféré différentes constructions plasmidiques codant le fragment C-terminal de la toxine botulique A, noté FcBoNTA dans la suite, fragment connu comme étant la partie la plus immunogène de la toxine. Les différentes constructions testées sont : pVaxFcBoNTA : ce plasmide contient le fragment FcBoNTA sous contrôle d'un promoteur CMV. pVaxFc*BoNTA : ce plasmide contient le fragment FcBoNTA dont la séquence a été optimisée pour que l'expression de la protéine soit optimale chez la souris (notée Fc*BoNTA). En effet, la fréquence des codons chez Clostridium Botulinum et chez la souris est très différente : ce qui signifie que le pool des ARN de transfert chez ces deux espèces est différent et pourrait être un facteur limitant. La séquence a entièrement été modifiée pour donner au final la même protéine, en utilisant les codons les plus fréquents chez la souris. Le fragment Fc* est sous contrôle d'un promoteur CMV. pVaxFc*BoNTA-Master: ce plasmide contient le fragment Fc*BoNTA fusionné au signal de sécrétion de Férythropoïétine murine, et précédé d'une séquence Kozak qui améliore la traduction. pVaxFc*BoNTA-Variant: ce plasmide contient le fragment Fc*BoNTA fusionné au signal de sécrétion de la phosphatase alcaline sécrétée humaine, et précédé d'une séquence Kozak qui améliore la traduction.
Mode opératoire Ces différentes constructions ont été injectées et électrotransférées sur des souris SWISS à raison de 40μg par injection dans 30μl de NaCl 15OmM dans le muscle tibial cranial dans lOOμl de NaCl 15OmM dans la peau en intradermique Dans tous les cas, le mode opératoire est le suivant : les souris sont anesthésiées (injection intrapéritonéale d'un mélange Ketamine/Xylazine), leurs pattes postérieures sont rasées puis la solution de plasmide est injectée dans le muscle tibial cranial ou dans la peau. Les muscles ou la peau sont ensuite soumis à un champ électrique de 200V/cm sous la forme de 8 impulsions carrées de 20 ms d'une fréquence de 2 Hz à l'aide de deux électrodes plaques reliées à un générateur électrique Genetronics EC 830. Si nécessaire, une solution de hyaluronidase (25μl à 0.4U/μL dans NaCl 15OmM) est injectée dans le muscle tibial cranial deux heures avant injection et électrotransfert.
Des prélèvements de sang (environ 150 μl) sont réalisés par ponction rétro-orbitale sur souris anesthésiées. Pour le dosage dans le sérum les prélèvements sont centrifugés 10 minutes à 4°C à 3000 rpm. Le plasma est retiré et les sérums sont conservés à -80°C.
Dosage des anticorps anti-FcBoNTA, anti-FcBoNTB et anti- FcBoNTE (dosage Elisa) Pour doser les anticorps anti-FcBoNTA (ou anti-FcBoNTB ou anti-
FcBoNTE) dans le sérum des souris on réalise un test ELISA. Concrètement la protéine recombinante FcBoNTA, FcBoNTB ou FcBoNTE est déposée au fond d'une plaque 96 puits, les sérums sont ensuite incubés avec la plaque : si des anticorps sont présents dans le sérum, ils se fixeront à la protéine. Des lavages permettent de retirer tout ce qui ne s'est pas fixé à la protéine recombinante et la présence d'anticorps anti-Fc est ensuite détectée par la combinaison d'un anticorps secondaire anti-Ig de souris biotinylé et de streptavidine couplée à la peroxydase. Il suffit ensuite de révéler avec un substrat de la peroxydase et de lire la plaque à 492 nm. Pour déterminer le titre en anticorps, on effectue des dilutions de deux en deux des sérums à partir de la dilution 1/100e. La courbe donnant la densité optique à 492 nm en fonction de la dilution permet de déterminer le titre en anticorps qui correspond à la réciproque du facteur de dilution qui donne une DO490 de 0.3 au dessus des sérums naïfs.
Dosage des anticorps neutralisants (test de lέtalitέ)
La présence d'anticorps neutralisants est déterminée par un test de létalité chez la souris : la neurotoxine botulique de type A est produite et calibrée à 10 Doses Létales Souris par ml. Des dilutions de sérum sont ensuite incubées avec 2 ml de préparation de toxine 30 minutes à 37°, et injectées à des souris par voie intrapéritonéale (2 souris par dilution, ImI par souris). La survie des souris est ensuite observée pendant quatre jours. Les résultats sont exprimés par unités neutralisantes par ml (une unité neutralisante correspondant au volume de sérum neutralisant 10 Doses Létales Souris).
II- Expériences complémentaires :
1) Comparaison injection seule/iniection+électrotransfert
Les inventeurs ont effectué une expérience pour valider l'intérêt de l'électrotransfert. Les inventeurs ont pour cela comparé les titres en anticorps obtenus sur des lots de souris injectés avec le même plasmide (pVaxFcBoNTA ou pVaxFc*BoNTA) mais avec ou sans électrotransfert suite à l'injection.
Les titres en anticorps obtenus 30 jours après traitement sont donnés à la figure 4.
Suite à cette expérience, les inventeurs ont testé le pouvoir neutralisant de ces anticorps obtenus par injection seule ou injection+électrotransfert : Les inventeurs ont donc effectué un test de neutralisation ou test de létalité chez la souris. Les sérums ont été testés à 45 jours et les sérums d'une même condition ont été « poolés » pour limiter le nombre de souris. Les résultats présentés dans le tableau 2 donnent le nombre de souris vivantes sur le nombre de souris totales pour chaque dilution de sérum et pour chaque condition. On en déduit le titre neutralisant comme la réciproque de la dilution la plus forte pour laquelle les souris sont vivantes :
Tableau 2 :
On constate donc que les anticorps obtenus avec une injection seule ne sont pas neutralisants alors qu'avec électrotransfert on retrouve des résultats comparables aux précédents.
1) Diverses comparaisons
a) apport de l'optimisation : Les inventeurs ont comparé l'apport de l'optimisation des codons au niveau de la séquence administrée par électrotransfert (Figure 5) ou sans électrotransfert (Figure 4) .
On observe bien que l'optimisation au niveau des codons de la séquence FcBoNTA augmente très fortement le titre en anticorps (grisé par rapport à hachuré).
b) apport de la hyaluronidase dans le procédé utilisant l'électrotransfert Les inventeurs ont étudié l'effet de la hyaluronidase sur le titre en anticorps : Les résultats obtenus avec le plasmide pVaxFcBoNTA sont donnés à la figure 6.
Les résultats obtenus avec le plasmide pVaxFc*BoNTA sont donnés à la figure 6. Les résultats obtenus avec le plasmide pVAxFc*BoNTA-Master sont donnés figure 7.
2) Toxines B et E :
Les inventeurs ont suivi exactement le même protocole qu'avec la toxine A.
Injection + électrotransfert de 40μg de plasmide pVaxFc*BoNTB et pVaxFc*BoNTB-Master (fragment C-terminal de BoNTB + signal de sécrétion de l'Epo+ séquence Kozak).
Des prélèvements ont été effectués à 15 jours, 30 jours et 45 jours après injection et électrotransfert.
Les résultats obtenus pour les titres en anticorps anti-FcBoNTB sont donnés à la figure 8.
Il est donc possible d'obtenir des anticorps anti-FcBoNTB par électrotransfert de plasmide. Titre en anticorps anti-FcBoNTE
Même protocole avec la toxine E (40μg de plasmide). Les inventeurs ont comparé pVaxFcBoNTE : fragment C-terminal non sécrété, non optimisé pVaxFc*BoNTE : fragment C-terminal optimisé (codons) - pVaxFc*BoNTE-Master : fragment C-terminal optimisé + signal de sécrétion mEpo+ séquence Kozak p VaxFc*BoNTE- Variant : fragment C-terminal optimisé+ signal de sécrétion hSeAP + séquence Kozak
Des prélèvements ont été effectués à 15 , 28 et 42 jours. Les résultats sont donnés à la figure 9.
3) Sérums multivalcnts :
Les inventeurs ont testé la co-injection + électrotransfert de plusieurs plasmides codant plusieurs fragments C-terminaux : FcBoNTA, FcBoNTB, et FcBoNTE. Les trois plasmides codent les fragments C-terminaux précédés du signal de sécrétion de l'Epo de souris et d'une séquence Kozak. On a injecté 40μg de chaque plasmide soit 20μg de chaque dans chaque patte de la souris pour faire un total de 60μg d'ADN par patte.
Les titres en anticorps anti-FcBoNTA sont donnés à la figure 10 (A).
Les titres en anticorps anti-FcBoNTB sont donnés à la figure 10 (B). Les titres en anticorps anti-FcBoNTE sont donnés à la figure 10 (E).
4) Chez le lapin :
Les inventeurs ont testé l'injection ou injection + électrotransfert de 500μg de plasmide pVaxFc*BoNTA-Master chez le lapin. Les conditions d' électrotransfert sont : 8 impulsions de 125V/cm; de 20ms ; d'une fréquence de 2Hz avec des électrodes aiguilles.
Les résultats sont présentés figure 11.
5) Effet de réinjections :
Les inventeurs ont testé chez la souris l'effet d'un second réinjection + électrotransfert : - deux injections + électrotransfert dans chaque muscle à JO avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master (notation im. 80μg) (figure 12)
- deux injections + électrotransfert à 3 semaines d'intervalle en intramusculaire chaque fois avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master (notation im. + im. 40μg) (figure 12) - deux injections + électrotransfert à 3 semaines d'intervalle, le 1er traitement en intradermique, le 2e"16 en intramusculaire, avec le plasmide pVaxFc*BoNTA-Master (notation id. + im. 40μg) (figure 12)
- deux injections + électrotransfert à 1 mois d'intervalle en intramusculaire à chaque fois avec le pVaxFc*BoNTA (figure 13)
III- RESULTATS
Les inventeurs ont comparé différentes constructions et différents modes opératoires (4 souris par condition) : injection seule (injection + Electrotransfert) injection + électrotransfert en intramusculaire de 40μg de pVaxFcBoNTA injection + électrotransfert en intramusculaire de 40μg de pVaxFc* BoNTA(séquence optimisée) - injection + électrotransfert en intramusculaire de 40μg de pVaxFc*BoNTA-Master (séquence optimisée +signal de sécrétion de l'érythropoïetine murine +séquence Kozak) injection + électrotransfert en intramusculaire de 40μg de pVaxFc*BoNTA-Variant (séquence optimisée +signal de sécrétion de la phosphatase alcaline humaine sécrétée +séquence Kozak) injection + électrotransfert en intradermique de 40μg de pVaxFc*BoNTA (séquence optimisée) traitement à la hyaluronidase + injection + électrotransfert en intramusculaire de 40μg de pVaxFc*BoNTA (séquence optimisée) - aucun traitement
Les résultats obtenus avec le dosage ELISA des sérums 3 semaines après l'électrotransfert sont donnés à la figure 1.
Les inventeurs détectent donc dès trois semaines des anticorps anti- FcBoNTA dans l'ensemble des sérums des souris traitées dans les différentes conditions décrites, et pas dans les sérums des souris naïves. On peut cependant remarquer que le titre en anticorps varie selon les conditions : les souris traitées à la hyaluronidase ont un titre en anticorps supérieur aux autres. Cette enzyme est responsable de la dégradation de l'acide hyaluronique, constituant majeur de la matrice extracellulaire du muscle. La hyaluronidase permet donc d'augmenter l'accessibilité des plasmides aux cellules musculaires. L'électrotransfert en intradermique permet aussi d'obtenir des anticorps. Des prélèvements ont ensuite été effectués tous les 15 jours, et les résultats obtenus avec le dosage ELISA à 70 jours après injection sont donnés à la figure 2.
L'allure du dosage ELISA à 70 jours ressemble à celle obtenue à 21 jours. On peut cependant remarquer que les titres en anticorps ont augmenté dans toutes les conditions sauf la condition intradermique. Ceci peut s'expliquer par le fait que les inventeurs ont montré que l'expression d'une protéine après électrotransfert intradermique ne dure qu'une quinzaine de jours, comparée à des cinétiques d'expression dans le muscle qui perdurent jusqu'à un an. Pour avoir une vue plus globale des titres en anticorps au cours de la cinétique, la figure 3 présente l'ensemble des titres obtenus par condition au cours du temps.
Ces résultats nous donnent une information sur le titre en anticorps dans le sérum des souris de chaque condition mais ne donnent pas d'information quand au pouvoir neutralisant de ces anticorps. Les inventeurs ont donc effectué un test de neutralisation ou test de létalité chez la souris. Les sérums prélevés à 40 jour sont été testés et les sérums d'une même condition ont été regroupés pour limiter le nombre de souris à utliser.
Les résultats présentés dans le Tableau 3 donnent le nombre de souris vivantes sur le nombre de souris traitées pour chaque dilution de sérum et pour chaque condition. On en déduit le titre neutralisant comme l'inverse de la dilution la plus forte pour laquelle les souris sont vivantes :
Tableau 3: souris survivantes après un challenge létal (10 doses létales) de toxine BoNTA
pVaxFc*intradermique | ID | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0/2 | 0
La première conclusion de ce test est que les anticorps obtenus par électrotransfert de plasmide sont neutralisants.
La deuxième conclusion est que certaines conditions donnent un titre neutralisant très convainquant, la condition pVAxFc*BoNTA-Master en particulier donne un titre neutralisant de 10000 au moins.
Les inventeurs ont ensuite effectué une expérience pour valider l'intérêt de l'électrotransfert. Ils ont pour cela comparé les titres en anticorps obtenus sur des lots de souris injectés avec le même plasmide (pVaxFcBoNTA ou pVaxFc*BoNTA) mais avec ou sans électrotransfert suite à l'injection.
Les titres en anticorps obtenus 30 jours après traitement sont donnés à la figure 4.
Dans les deux cas on observe une forte augmentation du titre en anticorps dans les lots injectés ET électrotransférés comparés aux lots injectés seulement.
IV- CONCLUSION
Les inventeurs ont obtenu après une simple injection et électrotransfert de plasmide codant le fragment C-terminal FcBoNTA de la toxine botulique A, de forts titres en anticorps neutralisants. Ce résultat permet de penser qu'il est possible d'obtenir par cette méthode simple des antisérums antitoxine botulique mono ou multivalents à usage thérapeutique. En effet, un antisérum multivalent peut être obtenu par immunisation génétique à plusieurs plasmides, car il a été démontré que la cotransfection conduisait avec la technique d'électrotransfert à une coexpression. Alternativement, un antisérum multivalent peut être obtenu par simple mélange d'antisérums univalents.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'un antisérum dirigé contre au moins une toxine protéique comprenant les étapes suivantes : a) obtention d'une solution comprenant au moins une construction génétique, ladite construction comprenant un acide nucléique codant au moins un fragment immunogène de ladite toxine, b) administration par injection chez un animal de la solution obtenue à l'étape a), c) application d'un champ électrique dans la zone d'injection, et d) prélèvement ultérieur de sang total et isolement du sérum.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le champ électrique possède une intensité comprise entre 1 et 800 V/cm sous la forme de 1 à 100 000 impulsions carrées d'une durée supérieure à 100 microsecondes et d'une fréquence comprise entre 0,1 et 1000 Hertz.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que le champ électrique possède une intensité comprise entre 80 et 250 V/cm sous la forme de 1 à 20 impulsions à ondes carrées d'une durée comprise entre 1 et 50 millisecondes et d'une fréquence de 1 à 10 Hertz.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'injection est une injection intradermique ou intramusculaire.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'étape b) d'administration de la solution est précédée d'une étape d'injection d'une solution contenant une enzyme dégradant la matrice extracellulaire, telle que la hyaluronidase.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'on injecte entre 5 et 200 μl d'une solution contenant entre 0,1 à 2 U/μl de hyaluronidase.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la toxine est choisie dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, de Clostridium tetani, de Bacillus anthrads, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra.
8. Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que le fragment immunogène de ladite toxine est le fragment C-terminal (Hc) choisi dans le groupe constitué par le fragment Hc de la toxine de sérotype A de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 1, le fragment Hc de la toxine de sérotype B de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 2, le fragment Hc de la toxine de sérotype C de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 3, le fragment Hc de la toxine de sérotype D de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 4, le fragment Hc de la toxine de sérotype E de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 5, le fragment Hc de la toxine de sérotype F de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 6, le fragment Hc de la toxine de sérotype G de Clostridium botulinum de séquence SED ID N° 7, et le fragment Hc de la toxine de Clostridium tetani de séquence SED ID N° 8, ainsi que leurs variants.
9 Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction génétique comprend en 5' de l'acide nucléique codant au moins un fragment de ladite toxine, le promoteur du cytomégalo virus (CMV).
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction génétique comprend une séquence codant un signal de sécrétion extracellulaire.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que la séquence codant le signal de sécrétion extracellulaire est choisie parmi les séquences SEQ ID N° 9, qui code le signal de sécrétion extracellulaire de l'érythropoïétine de souris, et SEQ ID N° 10, qui code le signal de sécrétion extracellulaire de la phosphatase alcaline humaine, et l'un de leur variants.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisé en ce que la construction génétique comprend en 5' du promoteur une séquence nucléique de site d'initiation de la traduction, dite séquence KOZAK, de séquence SEQ ID N0 I l.
13. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'au moins un codon initial de la séquence d'acide nucléique qui code au moins un fragment de ladite toxine, est remplacé par un codon différent codant le même acide aminé et dont la fréquence dans les cellules eucaryotes est plus élevée que la fréquence dans Clostridium botulinum, comme défini dans le tableau 1.
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction génétique comprend en outre un acide nucléique codant au moins une cytokine.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que la solution de l'étape (a) comprend une autre construction génétique qui contient un acide nucléique codant une cytokine, lesdites deux constructions génétiques étant co-administrées à l'étape (b).
16. Procédé selon la revendication 14 ou 15, caractérisé en ce que la séquence de l'acide nucléique codant la cytokine est choisie dans le groupe constitué par SEQ ID N° 12, qui code le facteur de croissance hématopoïétique (GM-CSF), SEQ ID N° 13, qui code la sous-unité p35 de l'interleukine 12 de souris, SEQ ID N° 14, qui code la sous-unité p40 de l'interleukine 12 de souris, SEQ ID N° 15, qui code l'interleukine 4 de souris, et SEQ ID N° 16, qui code l'interleukine 10 humaine.
17. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la construction génétique comprend en outre une séquence d'immunostimulation non méthylée riche en bases guanine et cytosine, d'une taille comprise entre 10 et 10000 nucléotides.
18. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'antisérum est dirigé contre au moins deux toxines protéiques et en ce que la solution de l'étape a) comprend un mélange d'au moins deux constructions génétiques, chacune desdites constructions comprenant un acide nucléique codant au moins un fragment immunogène desdites toxines.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'animal est choisi parmi la souris, le lapin et le cheval et le porc.
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que les étapes b) et c) sont répétées au moins une fois avant l'étape d).
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'étape c) est suivie d'une administration chez l'animal du fragment immunogène recombinant de ladite toxine.
22. Antisérum dirigé contre une toxine protéique susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce son titre en anticorps anti-toxine est supérieur ou égal à 100, et en ce que son pouvoir neutralisant est supérieur ou égal à 100.
23. Antisérum selon la revendication 22, pour son utilisation comme sérum préventif ou comme antidote destiné à neutraliser chez un mammifère les effets toxiques liés à l'absorption de la toxine chez ledit mammifère.
24. Utilisation d'une solution contenant au moins une construction génétique telle que définie dans les revendications 1 et 7 à 18, pour la fabrication d'un médicament destiné à prévenir ou à traiter un effet toxique lié à l'absorption chez un mammifère d'une toxine choisie dans le groupe constitué par une toxine de Clostridium botulinum, une toxine de Clostridium tetani, une toxine de Bacillus anthracis, la ricine, la toxine diphtérique et la toxine du choléra, caractérisée en ce que ledit médicament est formulé en vue d'une administration par électrotransfert.
25. Utilisation selon la revendication 24, caractérisée en ce que la solution contient en outre un adjuvant immunostimulant.
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