EP1848276A1 - Tetrazinderivate mit antimykotischer wirkung und ihre verwendung - Google Patents

Tetrazinderivate mit antimykotischer wirkung und ihre verwendung

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Publication number
EP1848276A1
EP1848276A1 EP06706788A EP06706788A EP1848276A1 EP 1848276 A1 EP1848276 A1 EP 1848276A1 EP 06706788 A EP06706788 A EP 06706788A EP 06706788 A EP06706788 A EP 06706788A EP 1848276 A1 EP1848276 A1 EP 1848276A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
tetrazine
aryl
alkyl
heteroaryl
alkenyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06706788A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Dietmar Eschrich
Jürgen RECKTENWALD
Karl-Dieter Entian
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Phenion GmbH and Co KG
Original Assignee
Phenion GmbH and Co KG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Phenion GmbH and Co KG filed Critical Phenion GmbH and Co KG
Publication of EP1848276A1 publication Critical patent/EP1848276A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D257/00—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D257/02—Heterocyclic compounds containing rings having four nitrogen atoms as the only ring hetero atoms not condensed with other rings
    • C07D257/08—Six-membered rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N43/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds
    • A01N43/713—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing heterocyclic compounds having rings with four or more nitrogen atoms as the only ring hetero atoms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics

Definitions

  • the present invention relates to substituted tetrazine derivatives - more specifically substituted hexahydro [1, 2,4,5] -tetrazine derivatives, synonymously also referred to as [1, 2,4,5] -tetrazinanes - and their use, in particular in the field of crop protection, medicine (human and veterinary medicine), pharmacy, hygiene and the like. More particularly, the present invention relates to tetrazine derivatives having, inter alia, antifungal activity (i.e., fungistatic and / or antifungal activity) and their use.
  • antifungal activity i.e., fungistatic and / or antifungal activity
  • Another object of the present invention is the use of the aforementioned tetrazine derivatives as active pharmaceutical ingredients (both in the field of human and veterinary medicine) and as active ingredients in crop protection products.
  • compositions in particular pharmaceutical compositions or crop protection compositions, which in addition to at least one carrier (excipients) contain at least one of the aforementioned tetrazine derivatives.
  • Another object of the present invention is the use of the aforementioned tetrazine derivatives for the manufacture of a medicament or a pharmaceutical composition for the curative and / or prophylactic treatment of diseases, in particular fungal diseases (mycoses); Infertility or fertility disorders; Cardiovascular and metabolic diseases, especially hyperlipidemia, such as
  • Hypercholesterolemia and cardiovascular diseases such as arteriosclerosis (atherosclerosis), hypertension, apoplexy and infarcts, e.g. B. Heart attack.
  • Mushrooms also called fungi, mycota or mycobionts, count - in contrast to the bacteria - to the eukaryotes.
  • Eukaryotes are living organisms whose cells (Eucytes), in contrast to those of the so-called prokaryotes (Procytes) on have a cell nucleus delimited by nuclear envelope from the rest of the cytoplasm. The nucleus contains the genetic information stored in chromosomes.
  • Fungi are not plant organisms, but like these they have a cell wall, cellulosic vacuoles, and a microscopically visible plasma flow. They contain no photosynthesis apparatus and are C-heterotrophic. They grow under aerobic conditions and gain energy through oxidation of organic substances. However, some representatives, such as yeasts, are facultative anaerobes and capable of producing energy through fermentation processes.
  • Dermatomycoses are diseases in which certain types of fungi, especially dermatophytes, invade the skin and hair follicles.
  • the symptoms of dermatomycoses include blisters, exfoliation, rhagades and erosion, usually associated with itching or eczema.
  • Dermatomycoses can essentially be subdivided into the following four groups: dermatophytoses (eg, epidermophytia, favus, microspore, trichophytia), yeast mycoses (eg, pityriasis and other pyrogenic mycoses, candidiasis, blastomycosis, buses) Buschke's disease, torulosis, Piedra alba, torulopsidosis, trichosporosis), mold mycoses (eg aspergillosis, cephalosporidosis, phycomycosis and scopular isopidemias), systemic mycoses (eg chromomycosis, coccidiomycosis, histoplasmosis).
  • dermatophytoses eg, epidermophytia, favus, microspore, trichophytia
  • yeast mycoses eg, pityriasis and other
  • the pathogenic and facultative pathogens include, for example, those from the group of the yeast Candida species (for example Candida albicans) and those from the family Pityrosporum.
  • the involvement of Pityrosporum ovale in the development of psoriasis is discussed by experts. All areas of human skin can be affected by dermatomycoses. Dermatophytoses almost exclusively affect the skin, hair and nails. Yeast mycoses can also affect mucous membranes and internal organs, systemic mycoses regularly extend to whole organ systems.
  • Such superinfections are found in a variety of dermatological diseases, eg. Atopic dermatitis, eczema, acne, seborrhoeic dermatitis or psoriasis.
  • dermatological diseases eg. Atopic dermatitis, eczema, acne, seborrhoeic dermatitis or psoriasis.
  • medical and therapeutic measures such. Radiotherapy or chemotherapy, drug-induced immunosuppression, systemic antibiotic treatment, as well as external chemical or physical influences (eg, environmental pollution, Smog) promote the occurrence of superinfections of the external and internal organs, especially the skin and mucous membranes. Although it is in some cases readily possible to combat superinfections by medication, but often unpleasant side effects occur.
  • Candida albicans is best known as the main causative agent of vaginitis, which occurs in large parts of the female population at some point in the course of life. The mortality rate from systemic infections caused by this yeast in tumor patients, and in particular in neutropenic patients, is unacceptably high.
  • Candida albicans has also become known as a serious causative agent of infections of the mucous membranes of HIV-infected people.
  • the Candida infection of oropharynx or esophagus in HIV-positive patients is often the first manifestation of AIDS.
  • mycoses other than other species such as C. tropicalis, C. lusitaniae and C. glabrata.
  • These yeasts are also important pathogens of "opportunistic" mycoses in immunosuppressed patients.
  • fungi are also important harmful organisms in the field of crop protection and material protection and here cause enormous damage.
  • 162 most important infectious diseases of Central European crops, 83% are caused by fungi. The damages amount annually to billions.
  • the object of the present invention is thus the provision of active substances which are suitable for a broad pharmacological application.
  • substituted tetrazine derivatives of the general formula (I) described below possess a valuable and broad pharmacological and phytosanitary (active) spectrum and in particular have an efficient antifungal, in particular fungicidal and / or fungistatic action.
  • the active compounds according to the invention also have other valuable pharmacological and phytosanitary effects and properties, which are described in more detail below and make the substances of the general formula (I) into valuable active ingredients, in particular for medicines and pesticides.
  • the present invention accordingly provides, according to a first aspect of the present invention, tetrazine derivatives of the general formula (I)
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or heteroaryl in the context of the present invention in connection with the general formula (I) denotes in particular an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or heteroaryl radical, which is substituted with one or more of the following groups or substituents: alkyl; alkenyl; alkynyl; aryl; heteroaryl; Halogen; -NH 2 ; -NHR with R is alkyl, aryl or heteroaryl; -NR 1 R "with R 1 and R", each independently, is alkyl, aryl or heteroaryl; -COOR with R as previously defined; -COR with R as previously defined, -OR with R as previously defined; -SR with R as previously defined.
  • substituted tetrazine derivatives of the abovementioned formula (I) according to the present invention preferably correspond in particular to the tetrazine derivatives of the general formula (Ia)
  • alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or heteroaryl in the context of the present invention in connection with the abovementioned formula (Ia) denotes in particular an alkyl, alkenyl, alkynyl, aryl or heteroaryl radical, which is substituted with one or more of the following groups or substituents: alkyl; alkenyl; alkynyl; aryl; heteroaryl; Halogen; -NH 2 ; -NHR with R is alkyl, aryl or heteroaryl; -NR'R "with R 'and R", each independently, is alkyl, aryl or heteroaryl; -COOR with R as previously defined; -COR with R as previously defined, -OR with R as previously defined; -SR with R as previously defined.
  • tetrazine derivatives according to the invention of the above formula (I) including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine have a broad pharmacological and / or phytosanitary activity spectrum.
  • tetrazine derivatives according to the invention of the above formula (I) including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine have a broad pharmacological and / or phytosanitary activity spectrum.
  • antifungal or fungicidal and / or fungistatic action they can also be used for the curative and / or prophylactic treatment of a number of other diseases.
  • the present invention - according to a further aspect of the present invention - is therefore also a composition, in particular a pharmaceutical composition or a
  • a crop protection composition which, in addition to at least one carrier or excipient, contains at least one tetrazine derivative of the general formula (I) as hereinbefore defined, including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine.
  • compositions according to the present invention which, in addition to at least one carrier or excipient, contain at least one tetrazine derivative of the general formula (Ia) as defined above, including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] Tetrazin included.
  • compositions according to the present invention which, in addition to at least one support or Excipients - 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine of the formula (Ib), as defined above.
  • the excipient should be selected to be compatible with the application and / or ingredients.
  • a pharmaceutically acceptable carrier or excipient is selected which is compatible, in particular, application and / or compositionally related.
  • composition according to the invention may, for example, be an antimycotic, in particular a fungicidal and / or fungistatic agent, which, in addition to a pharmaceutically acceptable carrier or excipient, contains at least one tetrazine derivative, as defined above, including 1,4-diphenyl- hexahydro [1, 2,4,5] tetrazine.
  • an antimycotic is suitable for use in both human and veterinary medicine.
  • Another object of the present invention - according to a still further aspect of the present invention - is the use of the tetrazine derivatives according to the present invention as defined above, including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine for curative and or prophylactic treatment of diseases or for the manufacture of a medicament or a pharmaceutical composition for the curative and / or prophylactic treatment of diseases.
  • these may be the following diseases or clinical pictures which can be curatively and / or prophylactically treated with the compounds according to the invention, including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine, such as, for example, B.
  • tetrazine derivatives according to the invention can in principle be carried out topically and / or systemically.
  • Another object of the present invention is the use of the previously defined tetrazine derivatives according to the present invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine in the field of crop protection, medicine (human and veterinary medicine), pharmacy, hygiene and the like.
  • Yet another object of the present invention is the use of the previously defined tetrazine derivatives according to the present invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine as active pharmaceutical ingredients (ie as pharmaceutical agents) or as active ingredients in Plant protection products (ie as phytosanitary agents).
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine, can in principle be used topically and / or systemically.
  • Yet another object of the present invention is the use of the previously defined tetrazine derivatives according to the present invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine in disinfectants, detergents, cleaning agents and the like or as an ingredient and / or active in disinfectants, detergents, detergents and the like.
  • disinfectants, detergents, cleaning compositions and the like which contain the previously defined tetrazine derivatives according to the present invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine.
  • tetrazine derivatives according to the present invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine contain disinfectants according to the invention, Detergents, cleaning agents and the like also per se conventional ingredients (eg, inter alia, surfactants in the case of detergents and cleaning agents, etc.); this is familiar to the skilled worker as such, so that need not be discussed in the context of the present invention on this.
  • the tetrazine derivatives of the general formula (Ia) according to the invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine are preferably used and the compound 1,4-diphenyl-hexahydro [ 1, 2,4,5] -tetrazine very particularly preferred.
  • the antifungal, in particular fungistatic and / or fungicidal action of the tetrazine derivatives according to the invention may possibly be due to an interaction in explain the ergosterol synthesis of fungi.
  • Fungal ergosterol synthesis has proven to be a suitable target pathway for inhibiting growth of fungi by inhibiting individual reaction steps. Although some inhibitors are known to attack away at the most diverse sites in this metabolism, in particular only the azoles are in clinical use. These inhibit the enzyme sterol-14-alpha-demethylase in the conversion of lanosterol to ergosterol and consequently act fungistatically. Allylamines (terbinafine and naftifine) are used exclusively against dermatophytes. Their site of action is squalene epoxidase (Erg1), which blocks the conversion of squalene into lanosterol. Morpholine derivatives (amorolfin) are used topically only.
  • PF1163A a novel antifungal agent, inhibit ergosterol biosynthesis at C-4 Sterol Methyloxidase
  • C-4 Sterol Methyloxidase (Erg25)
  • C-4 Sterol Methyloxidase is a very interesting one Target for the development of antifungal substances, however, this enzyme occurs not only in fungi but also in all higher organisms (including plants and humans).
  • C-4 sterol-methyl oxidase is not only an interesting enzyme for the development of new antimycotics, but also as a target for the control of other human diseases of high interest, thereby increasing the other pharmaceutical or pharmacological effects of tetrazine derivatives of the invention including 1, 4 -Diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazin can be explained without wishing to be bound by any particular theory.
  • inhibition of cholesterol metabolism between lanosterol and cholesterol may result in decreased cholesterol blood levels, making this pathway an interesting target for the development of atherosclerosis drugs.
  • azoles for example ketoconazole
  • AY9944-A-7 the inhibition of delta-14 reductase by the substance AY9944-A-7 leads to reduced cholesterol synthesis and finally to the lowering of the cholesterol concentration in the blood. This substance was used in the 1950s to lower blood cholesterol.
  • C-4-Sterol-Methyloxidase catalyzes the reaction following the delta-14-reductase and represents another point of attack for the lowering of the cholesterol blood level.
  • C-4 sterol methyl oxidase may accumulate hormones (or hormone-like substances) called meioseactivating sterols (MAS).
  • MAS meioseactivating sterols
  • a substance which consequently inhibits human C-4-sterol-methyloxidase and thereby leads to the accumulation of meiosis activating sterols therefore, represents a potential drug for the treatment of infertility.
  • in vivo luteinizing hormone mediates the signal for the resumption of meiosis via communication channels such as "gap junctions" via the increased production of FF-MAS in the cumulus cells of the oocyte.
  • FF-MAS but also T-MAS, stimulates the resumption of meiotic egg maturation in mouse and rat both in vitro and in the ex vivo perfused ovary in the presence of meio-inhibitors such.
  • B. hypoxanthine The synchronization of meiotic division and cytoplasmic maturation of mouse oocytes, enhanced by FF-MAS culture, is accompanied by an improved in vitro fertilization rate.
  • FF-MAS represents a new interesting method for the treatment of infertility in vitro.
  • substances which Inhibiting enzyme steps in cholesterol synthesis downstream of the sterol 14-alpha-demethylase are very interesting as they can potentially improve the fertilization rate in the / nv / fro fertilization.
  • they can be used to treat infertility caused by insufficient stimulation of meiosis in men or women.
  • the tetrazine derivatives according to the invention described above including 1, 4-diphenyl-hexahydro [1, 2,4,5] -tetrazine, inter alia, antifungal, in particular fungistatic or fungicidal, and thus can be used to combat fungal infections be used.
  • Preference is given to the use of the fungicides according to the invention for the inhibition of, among other things of human pathogenic fungi.
  • Conceivable is the use of inventive fungicides against z.
  • Trichophyton spp. Microsporum spp., Epidermophyton spp., Alternaria spp., Blastomyces dermatidis, Candida spp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans, Candida albicans, Candida dublinensis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida lustaniae, Candida parapsilopsis, Candida tropicalis, Coccidiodes immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Exophalia dermatiditis, Fusarium beigelii oxysporum, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carnii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var granulosum, Trichoph
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine can also be used for controlling phytopathogenic fungi. They are distinguished by outstanding activity against a broad spectrum of phytopathogenic fungi, in particular from the classes of the Ascomycetes, Deuteromycetes, Phycomycetes and Basidiomycetes. They are in part systemically effective and can be used in crop protection as foliar and soil fungicides.
  • the tetrazine derivatives according to the invention are also suitable for controlling harmful fungi such as Paecilomyces variotii in the protection of materials (eg wood, paper, paint dispersions, fibers or tissue) and in the protection of stored products.
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine can be used, for example, by the fungi or the plants, seeds, materials or the soil to be protected from fungal attack with a fungicidally active Treated amount of these agents. The application can be done both before and after the infection of the materials, plants or seeds by the fungi.
  • tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine can also be present in the application form as fungicides together with other active ingredients, for. As with herbicides, insecticides, growth regulators, fungicides, etc., or with fertilizers. When mixing the substances according to the invention or the agents containing them in the application form as fungicides with other fungicides, enlargement of the fungicidal activity spectrum is obtained in many cases.
  • tetrazine derivatives of the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine against z.
  • Puccinia recondita Puccinia striiformis, Tilletia caries, Tilletia controversa, Tilletia indica, Tilletia tritici, Tilletia foetida, Ustilago maydis, Ustilago hordeii
  • the above list is to be understood only as an example and is not intended to limit the application of the invention in any case exclusively to the mushrooms mentioned.
  • tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine inhibit the C-4-sterol-Methyloxidase, among others of fungi and therefore have antifungal or fungicidal.
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine also inhibit the human C-4-sterol-methyloxidase and are therefore of interest for other fields of use in human medicine, as described above , Application, the tetrazine derivatives of the invention including 1, 4-diphenyl hexahydro [1, 2,4,5] tetrazine z. Both in the treatment of high blood pressure and atherosclerosis as well as in increasing the fertility of men and women or to improve the fertilization rate in the / ⁇ -fertilization fertilization.
  • tetrazine derivatives of the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro [1, 2,4,5] -tetrazine can serve as a penetration enhancer.
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine, reduce the epithelial barrier function of the skin and thus make it easier to penetrate topically administered active substances.
  • 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine reduce the epithelial barrier function of the skin and thus make it easier to penetrate topically administered active substances.
  • the present invention has a number of advantages, some of which are outlined below:
  • tetrazine derivatives of the present invention inhibit the growth of human pathogenic fungi and yeasts such as Candida albicans or Candida glabrata as well as the growth of non-human pathogenic fungi and yeasts such as about Saccaromyces cerevisiae.
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine inhibit the growth z.
  • B. the yeast form of Candida Albicans ZeWen and act in particular fungistatic.
  • z. B the hyphal Growth form of Candida albicans, which represents the pathogenic growth form, the substances act fungicidal and thus fungicidal.
  • the tetrazine derivatives according to the invention including 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine thus do not act cytotoxic.
  • tetrazine derivatives of the present invention do not inhibit the growth of bacteria (neither Gram positive, such as Bacillus subtilis, nor Gram negative, such as Escherichia coli). Thus, the bacterial balance of humans (intestinal flora, skin flora, oral flora, etc.) is not disturbed by both systemic and topical application.
  • tetrazine derivatives according to the invention including 1,4-diphenyl-hexahydro- [1,2,4,5] -tetrazine inhibit C-4-sterol-methyloxidase.
  • inhibiting substances for this enzyme which are used in any way as "antifungals” (neither in clinical use nor in plant protection). It is therefore a substance class with a completely new target, which is of particular importance in combating already resistant pathogenic organisms (eg resistance to azoles).
  • a Candida albicans strain strain (SC5314) is grown overnight in YEPD 3 medium (1% Yeast Extract, 1% peptone, 3% dextrose). Fresh YEPD 3 medium is inoculated with 10 4 cells / ml. Each 150 ul of this Zeil / medium suspension are placed in a 96-well microtiter plate.
  • 1, 5 .mu.l of different solutions of 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine are pipetted in each case in duplicate (stock solutions 3200 .mu.g / ml DMSO, 1600 .mu.g / ml DMSO, 800 .mu.g / ml DMSO, 400 ⁇ g / ml DMSO, 200 ⁇ g / ml DMSO, 100 ⁇ g / ml DMSO, 50 ⁇ g / ml DMSO, 25 ⁇ g / ml DMSO, 12.5 ⁇ g / ml DMSO, 6.25 ⁇ g / ml DMSO).
  • the control is DMSO without dissolved substance. After incubation for 48 h at 30 ° C., the growth in the individual wells is evaluated on a photometer (OD 590 nm).
  • the minimum inhibitory concentration is the 1,4-diphenyl-hexahydro [1, 2,4,5] -tetrazine final concentration, which does not detect any growth of Candida albicans. For Candida albicans in YEPD 3 medium, this is 8 ⁇ g / ml (equivalent to 33 ⁇ M).
  • the effect of the substance is fungistatic in the concentrations and media tested above, since residual growth is observed after prolonged incubation even at the highest concentration.
  • FCS fetal calf serum
  • RPMI Roswell Park Memorial
  • the MIC for Candida albicans is 2 ⁇ g / ml (corresponding to 8.3 ⁇ M), which is significantly lower than in the non-hyphae-inducing YEPD 3 medium.
  • a Candida albicans ⁇ NMtyp strain (SC5314) is grown overnight in YEPD 3 medium (1% Yeast Extract; 1% peptone, 3% dextrose). Fresh RPMI medium is inoculated at 3.3 - 10 3 cells / ml. Each 150 ul of this cell / medium suspension are placed in a 96-well microtiter plate (each cavity contains about 500 cells).
  • Table 1 shows the inactivation assay as the number of colony-forming cells as a function of the substance incubation period.
  • HaCaT cells / 96-well wells are seeded in 100 ⁇ l culture medium (Hanks 1 basal medium, 2 mM L-glutamine, 5% (v / v) fetal calf serum) and incubated for 24 h.
  • the medium is removed, the cell lawn washed once with phosphate buffered saline (PBS) and incubated for 24 h with culture medium containing the substance concentrations to be tested (100 ⁇ M final concentration).
  • PBS phosphate buffered saline
  • 20,000 HeLa cells / 96-well-cavity are seeded in 100 ul culture medium (DMEM medium, 10% (v / v) fetal calf serum) and incubated for 24 h.
  • the medium is removed, the cell lawn washed once with phosphate buffered saline (PBS) and incubated for 24 h with culture medium containing the substance concentrations to be tested (100 ⁇ M final concentration).
  • PBS phosphate buffered saline
  • 20,000 MM6 cells / 96 ⁇ l cavity are dissolved in 100 ⁇ l culture medium (RPMI medium, 10 ⁇ g / ml insulin, MEM non-essential amino acids, 1 mM sodium pyruvate, 1 mM oxaloacetate, 2 mM L-glutamine, 10% (v / v ) fetal calf serum) and incubated for 24 h.
  • the medium is removed, the cells washed once with phosphate buffered saline (PBS) and for 24 h with culture medium containing the substance concentrations to be tested (100 ⁇ M final concentration), incubated.
  • PBS phosphate buffered saline
  • 20,000 cells / 96-well-cavity are seeded in culture medium as in A) and incubated for 24 h.
  • the medium is removed, the cells are washed once with phosphate buffered saline (PBS) and incubated for 24 h with culture medium containing the substance concentrations to be tested (100 ⁇ M final concentration).
  • 10 ⁇ l of WST1 reagent (Roche, Cat No 1644807) are added to the culture medium and the cells are incubated for 1 h under culture conditions.
  • the plate is shaken thoroughly and the absorbance at 450 nm measured against a reference of 620 nm.
  • the substance 1, 4-diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine acts on all tested Zeil lines neither proliferation inhibiting nor worsens the vitality of cell cultures. The substance thus does not act cytotoxic on cell cultures.
  • Figure 2 shows the vitality or proliferation in% compared to untreated control cultures.
  • Bacillus subtilis and Escherichia coli DH ⁇ alpha are grown overnight in LB medium (1% peptone, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCl) medium. Fresh LB medium is inoculated with about 10 3 cells / ml. Each 150 ul of this cell / medium suspension are placed in a 96-well microtiter plate.
  • the control is DMSO without dissolved substance. After incubation for 48 h at 30 ° C., the growth in the individual wells on the photometer (OD 590 nm) is evaluated. 1, 4-Diphenyl-hexahydro- [1, 2,4,5] -tetrazine does not inhibit the growth of Bacillus subtilis and Escherichia coli at any of the concentrations tested.

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Abstract

Gegenstand der Erfindung sind Zusammensetzungen, welche mindestens ein Tetrazinderivat der allgemeinen Formel (I) enthalten, wobei in der allgemeinen Formel (I) die Reste R<SUB>1</SUB> bis R<SUB>8</SUB>, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen, sowie die Verwendung dieser Tetrazinderivate im Bereich des Pflanzenschutzes, der Medizin, der Pharmazie, der Hygiene und dergleichen. Aufgrund ihres unter anderem fungistatischen und fungiziden Wirkpotentials eignen sich die Verbindungen der Formel (I) insbesondere zur Verwendung in Pflanzenschutzmitteln und Arzneimitteln.

Description

Tetrazinderivate mit antimykotischer Wirkung und ihre Verwendung
Die vorliegende Erfindung betrifft substituierte Tetrazinderivate - genauer gesagt subsituierte Hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazinderivate, synonym auch als [1 ,2,4,5]- Tetrazinane bezeichnet - und deren Verwendung, insbesondere im Bereich des Pflanzenschutzes, der Medizin (Human- und Veterinärmedizin), der Pharmazie, der Hygiene und dergleichen. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Tetrazinderivate unter anderem mit antimykotischer Wirkung (d. h. fungistatischer und/oder fungizider Wirkung) und ihre Verwendung.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der vorgenannten Tetrazinderivate als Arzneimittelwirkstoffe (sowohl im Bereich der Human- wie auch der Veterinärmedizin) und als Wirkstoffe in Pflanzenschutzmitteln.
Wiederum ein weiterer Gegenstand sind Zusammensetzungen, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzungen oder Pflanzenschutzmittelzusammensetzungen, welche neben mindestens einem Träger (Exzipienten) mindestens eines der vorgenannten Tetrazinderivate enthalten.
Schließlich ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung der vorgenannten Tetrazinderivate zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur kurativen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen, insbesondere Pilzerkrankungen (Mykosen); Infertilität oder Fertilitätsstörungen; HerzVKreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, insbesondere Hyperlipidämie, wie
Hypercholesterinämie, und kardiovaskulären Erkrankungen, wie Arteriosklerose (Atherosklerose), Hypertonie, Apoplexie und Infarkte, z. B. Herzinfarkt.
Pilze, auch Fungi, Mykota oder Mykobionten genannt, zählen - im Gegensatz zu den Bakterien - zu den Eukaryonten. Eukaryonten sind Lebewesen, deren Zellen (Eucyten) im Gegensatz zu denen der sogenannten Prokaryonten (Procyten) über einen durch Kemhülle vom restlichen Cytoplasma abgegrenzten Zellkern verfügen. Der Zellkern enthält die Erbinformation in Chromosomen gespeichert.
Pilze sind keine pflanzlichen Organismen, haben aber wie diese eine Zellwand, zellsaftgefüllte Vakuolen und eine mikroskopisch gut sichtbare Plasmaströmung. Sie enthalten keinen Photosynthese-Apparat und sind C-heterotroph. Sie wachsen unter aeroben Bedingungen und gewinnen Energie durch Oxidation organischer Substanzen. Einige Vertreter, beispielsweise Hefen, sind allerdings fakultative Anaerobier und zur Energiegewinnung durch Gärungsprozesse befähigt.
Dermatomykosen sind Krankheiten, bei der gewisse Pilzarten, insbesondere Dermatophyten, in die Haut und Haarfollikel eindringen. Die Symptome von Dermatomykosen sind beispielsweise Bläschen, Exfoliation, Rhagaden und Erosion, meist verbunden mit Juckreiz oder Ekzem.
Dermatomykosen können im wesentlichen in folgende vier Gruppen unterteilt werden: Dermatophytien (z. B. Epidermophytie, Favus, Mikrosporie, Trichophytie), Hefemykosen (z. B. Pityriasis und andere P/ϊyrosporurπ-bedingte Mykosen, Candida-] nfektionen, Blastomykose, Busse-Buschke-Krankheit, Torulose, Piedra alba, Torulopsidose, Trichosporose), Schimmelmykosen (z. B. Aspergillose, Kephalosporidose, Phycomykose und Skopulariopsidose), Systemmykosen (z. B. Chromomykose, Coccidiomykose, Histoplasmose).
Zu den pathogenen und fakultativ pathogenen Keimen gehören beispielsweise solche aus der Gruppe der Hefen Candida-Arten (z. B. Candida albicans) und solche aus der Familie Pityrosporum. Pityrosporum-Aήen, insbesondere Pityrosporum ovale, sind für Hauterkrankungen, wie Pityriasis versicolor, Seborrhoe in den Formen Seborrhoea oleosa und Seborrhoea sicca, welche sich vor allem als Seborrhoea capitis (= Kopfschuppen) äußern, seborrhoisches Ekzem und Pityrosporum-Follikulitis, verantwortlich zu machen. Eine Beteiligung von Pityrosporum ovale an der Entstehung von Psoriasis wird von der Fachwelt diskutiert. Alle Bereiche der menschlichen Haut können von Dermatomykosen befallen werden. Dermatophytien befallen fast ausschließlich Haut, Haare und Nägel. Hefemykosen können auch Schleimhäute und innere Organe befallen, Systemmykosen erstrecken sich regelmäßig auf ganze Organsysteme.
Besonders häufig sind die Körperbereiche betroffen, auf welchen sich durch Kleidung, Schmuck oder Schuhwerk Feuchtigkeit und Wärme stauen können. So gehört der Fußpilz zu den bekanntesten und am weitesten verbreiteten Dermatomykosen. Besonders unangenehm sind weiterhin Pilzerkrankungen der Finger- und Fußnägelbereiche.
Ferner sind Superinfektionen der Haut durch Pilze und Bakterien nicht selten. Bei bestehendem Primärinfekt, d. h. wenn bei normaler Keimbesiedelung der Haut eine Neuinfektion mit hohen Keimzahlen eines oder mehrerer oft physiologischer Erreger - beispielsweise Staphylokokken - oft aber auch unphysiologischer Erreger - beispielsweise Candida albicans - eintritt, kann bei Zusammentreffen ungünstiger Einflüsse eine "Superinfektion" der befallenen Haut auftreten. Die normale Mikroflora der Haut bzw. der Schleimhäute wird dabei von dem Sekundärerreger regelrecht überwuchert.
Solche Superinfektionen können sich - in Abhängigkeit vom betreffenden Keim - in günstig verlaufenden Fällen in unangenehmen Hauterscheinungen (Juckreiz, unschönes äußeres Erscheinungsbild) äußern. In ungünstig verlaufenden Fällen können sie aber zu großflächiger Zerstörung der Haut führen, im schlimmsten Falle sogar im Tode des Patienten gipfeln.
Derartige Superinfektionen werden bei einer Vielzahl dermatologischer Erkrankungen, z. B. atopischem Ekzem, Neurodermitis, Akne, seborrhoischer Dermatitis oder Psoriasis, beobachtet. Auch viele medizinische und therapeutische Maßnahmen, z. B. Radio- oder Chemotherapie, medikamentös induzierte Immunsuppression, systemische Antibiotikabehandlung, ebenso wie externe chemische oder physikalische Einflüsse (z. B. Umweltverschmutzung, Smog) fördern das Auftreten von Superinfektionen der äußeren und inneren Organe, insbesondere der Haut und der Schleimhäute. Zwar ist es im Einzelfall ohne weiteres möglich, Superinfektionen medikamentös zu bekämpfen, oftmals treten jedoch unangenehme Nebenwirkungen auf.
Gehören Dermatomykosen schon immer zu den häufigsten Infektionen der Bevölkerung, so steigt in den letzten Jahren auch ständig die Zahl sowie Schwere von systemischen Mykosen. Dies liegt insbesondere an der Ausbreitung der HIV- Epidemie und der Zunahme aggressiver medizinischer Maßnahmen, wie Transplantationen, Cytostatikabehandlung, Bestrahlung usw., in deren Folge die körpereigene Immunabwehr geschwächt wird und opportunistische Pilzinfektionen begünstigt werden. Candida albicans ist vor allem als Haupterreger der Vaginitis bekannt, die bei großen Teilen der weiblichen Bevölkerung irgendwann im Laufe des Lebens einmal auftritt. Die Sterblichkeitsrate bei systemischen Infektionen, die diese Hefe bei Tumorpatienten und insbesondere bei neutropenischen Patienten verursacht, ist unakzeptabel hoch. Neuerdings ist Candida albicans auch als ernst zu nehmender Erreger von Infektionen der Schleimhäute von HlV-Infizierten bekannt geworden. Die CandidaA nfektion von Oropharynx oder Ösophagus bei HIV-positiven Patienten ist oftmals die erste Manifestation von AIDS. Gegenwärtig wird zudem eine steigende Inzidenz von Mykosen, die von anderen Spezies, wie z. B. C. tropicalis, C. lusitaniae und C. glabrata, verursacht werden, beobachtet. Diese Hefen sind ebenfalls wichtige Erreger von "opportunistischen" Mykosen bei immunsupprimierten Patienten.
Für die Behandlung bakterieller Infektionen steht ein großes Spektrum an Wirkstoffen mit den verschiedensten Wirkorten innerhalb der Zellen zur Verfügung. Dies gilt nicht im gleichen Maße für Pilzinfektionen. Obwohl eine Vielzahl antimykotisch wirksamer Stoffe existiert, können diese aufgrund starker Nebenwirkungen, die sie im Menschen auslösen, nicht als Medikamente eingesetzt werden. Von Bedeutung für die Behandlung systemischer Mykosen und im klinischen Einsatz sind zur Zeit nur Amphotericin B (in unterschiedlicher Formulierung), Flucytosin, verschiedene Azole und Caspofungin, eine Substanz der Klasse der Echinocandine. Keine der Substanzen überzeugt jedoch in Pharmakodynamik bzw. Pharmakokinetik, so daß bis heute kein oral angewendetes Antimykotikum mit fungizider Wirkung zur Verfügung steht.
Zudem sind Pilze auch wichtige Schadorganismen im Bereich Pflanzenschutz und Materialschutz und sorgen hier für enorme Schäden. Von den 162 wichtigsten Infektionskrankheiten mitteleuropäischer Nutzpflanzen werden 83 % durch Pilze verursacht. Die Schäden belaufen sich jährlich auf Milliardenbeträge.
Dies und das zunehmende Auftreten von Resistenzen verdeutlicht die Notwendigkeit neuer Wirkstoffe mit neuen Wirkorten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung von Wirksubstanzen, welche sich für eine breite pharmakologische Anwendung eignen. Insbesondere ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung von Wirkstoffen, insbesondere pharmazeutischen und phytosanitären Wirkstoffen, mit antimykotischer, insbesondere fungizider und/oder fungistatischer Wirkung.
Die Anmelderin hat überraschenderweise herausgefunden, daß substituierte Tetrazinderivate der nachfolgend beschriebenen allgemeinen Formel (I) ein wertvolles und breites pharmakologisches und phytosanitäres (Wirk-)Spektrum besitzen und insbesondere über eine effiziente antimykotische, insbesondere fungizide und/oder fungistatische Wirkung verfügen. Darüber hinaus besitzen die erfindungsgemäßen Wirkstoffe aber auch noch andere wertvolle pharmakologische und phytosanitäre Wirkungen und Eigenschaften, welche nachfolgend noch näher beschrieben werden und die Substanzen der allgemeinen Formel (I) zu wertvollen Wirkstoffen insbesondere für Arzneimittel und Pflanzenschutzmittel machen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung - sind somit Tetrazinderivate der allgemeinen Formel (I)
wobei in der allgemeinen Formel (I) die Reste Ri bis Rs, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen, ausgenommen jedoch die Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4-Diphenyl-[1 ,2,4,5]- tetrazinan). Der Begriff "gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet im Zusammenhang mit der allgemeinen Formel (I) insbesondere einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -NR1R" mit R1 und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
Bevorzugterweise entsprechen die substituierten Tetrazinderivate der vorgenannten Formel (I) nach der vorliegenden Erfindung insbesondere den Tetrazinderivaten der allgemeinen Formel (Ia)
wobei in der allgemeinen Formel (Ia) die Substituenten X und Y, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen und die Indizes n bzw. m die Anzahl der Substituenten X bzw. Y im Phenylring bezeichnen und, jeweils unabhängig voneinander, ganze Zahlen von 1 bis 5 darstellen, ausgenommen jedoch die Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4-Diphenyl-[1 ,2,4,5]-tetrazinan). Der Begriff "gegebenenfalls substituierter Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet im Zusammenhang mit der vorgenannten Formel (Ia) insbesondere einen Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryi oder Heteroaryl; -NR'R" mit R' und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
Die vorgenannten Verbindungen der vorstehenden allgemeinen Formeln (I) und (Ia), einschließlich der Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4-Diphenyl-[1 ,2,4,5]-tetrazinan), sind durch Kombination bzw. Abfolge an sich gängiger, dem Fachmann an sich geläufiger Syntheseschritte, beispielsweise durch Umsetzung der entsprechenden Ketoverbindung mit dem entsprechenden Hydrazinderivat im letzten Verfahrensschritt, erhältlich. Dies wird im nachfolgenden Retrosysnthese-Schema 1 beispielhaft anhand der Synthese bzw. Herstellung der zuvor definierten Verbindung der allgemeinen Formel (Ia) veranschaulicht, welche durch Umsetzung der Ketoverbindung (III) (hier: Formaldehyd bzw. eine Formaldehyd generierende Verbindung, wie z. B. Paraformaldehyd) mit den Hydrazinderivaten (IIa) und (IIb) erhalten werden kann: Schema 1 :
Die vorgenannte Herstellung bzw. Synthese ist insbesondere dann anwendbar, wenn die Substituenten X und Y nichtreaktive bzw. nichtreaktionsempfindliche Reste darstellen, wie z. B. Alkyl, Alkoxy, Alkenyl, Aryl etc.
Für den Fall, daß die Substituenten X und Y dagegen reaktive bzw. reaktionsempfindliche Reste, wie z. B. -NH^, -COOH etc., darstellen, können entsprechend dem nachfolgendem Retrosysnthese-Schema 2 die Substituenten X und Y vorteilhafterweise durch eine sogenannte Schutzgruppe PG ("Protection Group") geschützt werden, welche dann beispielsweise im letzten Verfahrensschritt abgespalten werden kann.
Schema 2:
Die Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1,4-Diphenyl- [1 ,2,4,5]-tetrazinan) der Formel (Ib)
ist gleichermaßen über die vorgenannte Synthese erhältlich und zudem über die Fa. SPECS in den Niederlanden zu beziehen. Deshalb wurde sie per Disclaimer vom absoluten Stoffschutz ausgenommen. Eine technische Verwendung, insbesondere eine Verwendung im Bereich der Medizin, Pharmazie, des Pflanzenschutzes, der Hygiene etc., ist für diese Verbindung aber bislang noch nicht beschrieben worden. 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin mit der Summenformel C14Hi6N4 und einem Molekulargewicht von 240,31 g/mol (Beilstein-Registriernummer: 384552; CAS-Registriernummer: 37046-82-5) ist die erfindungsgemäß besonders bevorzugte eingesetzte Verbindung. Für weitere Einzelheiten über ihre Herstellung sowie ihre physikochemischen Eigenschaften kann beispielsweise auf die folgende Literatur verwiesen, deren gesamter Offenbarungsgehalt hiermit durch Bezugnahme eingeschlossen ist: Aust. J. Chem., Vol. 24, 1971 , Seiten 1859 - 1871 ; Justus Liebigs Ann. Chem., Vol. 635, 1960, Seiten 82 - 91 ; Acta Chem. Scand., Vol. 26, 1972, Seiten 1258 - 1268; Chem. Ber., Vol. 77/79, 1944/1946, Seiten 95 - 98 und Vol. 103, 1970, Seite 986.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate der vorstehenden Formel (I) einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin besitzen ein breites pharmakologisches und/oder phytosanitäres Wirkspektrum. Neben ihrer antimykotischen bzw. fungiziden und/oder fungistatischen Wirkung können sie auch zur kurativen und/oder prophylaktischen Behandlung einer Reihe weiterer Erkrankungen eingesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist daher auch eine Zusammensetzung, insbesondere eine pharmazeutische Zusammensetzung oder eine
Pflanzenschutzmittelzusammensetzung, welche - neben mindestens einem Träger oder Exzipienten - mindestens ein Tetrazinderivat der allgemeinen Formel (I), wie zuvor definiert, einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthält. Erfindungsgemäß bevorzugt sind Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung, welche - neben mindestens einem Träger oder Exzipienten - mindestens ein Tetrazinderivat der allgemeinen Formel (Ia), wie zuvor definiert, einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthalten. Erfindungsgemäß ganz besonders bevorzugt sind Zusammensetzungen nach der vorliegenden Erfindung, welche - neben mindestens einem Träger oder Exzipienten - 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin der Formel (Ib), wie zuvor definiert, enthalten. Der Träger bzw. Exzipient sollte derart ausgewählt sein, daß er in bezug auf die Anwendung und/oder die Inhaltsstoffe kompatibel ist. Für den Fall, daß es sich bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung um eine pharmazeutische Zusammensetzung handelt, wird ein pharmazeutisch unbedenklicher Träger oder Exzipient ausgewählt, welcher kompatibel ist, insbesondere anwendungs- und/oder zusammensetzungsbezogen.
Bei der erfindungsgemäßen Zusammensetzung kann es sich beispielsweise um ein Antimykotikum, insbesondere ein fungizid und/oder fungistatisch wirkendes Mittel, handeln, welches neben einem pharmazeutisch unbedenklichen bzw. kompatiblen Träger oder Exzipienten mindestens ein Tetrazinderivat, wie zuvor definiert, einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthält. Ein derartiges Antimykotikum eignet sich zur Anwendung sowohl in der Human- wie in der Veterinärmedizin.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung - gemäß einem wiederum weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung - ist die Verwendung der wie zuvor definierten Tetrazinderivate nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin zur kurativen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen bzw. zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur kurativen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen. Insbesondere kann es sich hierbei um folgende Erkrankungen bzw. Krankheitsbilder handeln, welche sich mit den erfindungsgemäßen Verbindungen einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin kurativ und/oder prophylaktisch behandeln lassen, so z. B. Pilzerkrankungen (Mykosen); Infertilität oder Fertilitätsstörungen; Herz-/Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, insbesondere Hyperlipidämie (z. B. Hypercholesterinämie) und kardiovaskuläre Erkrankungen (z. B. Arteriosklerose (Atherosklerose), Hypertonie, Apoplexie und Infarkte, wie Herzinfarkt). Diese Aufzählung ist nicht abschließend. Die Anwendung bzw. Verwendung der erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin kann dabei grundsätzlich topisch und/oder systemisch erfolgen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der zuvor definierten Tetrazinderivate nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin im Bereich des Pflanzenschutzes, der Medizin (Human- und Veterinärmedizin), der Pharmazie, der Hygiene und dergleichen.
Wiederum ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der zuvor definierten Tetrazinderivate nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin als Arzneimittelwirkstoffe (d. h. als pharmazeutische Wirkstoffe) oder als Wirkstoffe in Pflanzenschutzmitteln (d. h. als phytosanitäre Wirkstoffe).
Bei allen vorgenannten Anwendungen und Verwendungen können die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin grundsätzlich topisch und/oder systemisch eingesetzt werden.
Wiederum ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung der zuvor definierten Tetrazinderivate nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin in Desinfektionsmitteln, Waschmitteln, Reinigungsmitteln und dergleichen bzw. als Inhaltsstoff und/oder Aktivstoff in Desinfektionsmitteln, Waschmitteln, Reinigungsmitteln und dergleichen.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind gleichermaßen Desinfektionsmittel, Waschmittel, Reinigungsmittel und dergleichen, welche die zuvor definierten Tetrazinderivate nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthalten. Neben den zuvor definierten Tetrazinderivaten nach der vorliegenden Erfindung einschließlich 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthalten die erfindungsgemäßen Desinfektionsmittel, Waschmittel, Reinigungsmittel und dergleichen außerdem an sich übliche Inhaltsstoffe (z. B. unter anderem Tenside im Fall von Wasch- und Reinigungsmitteln etc.); dies ist dem Fachmann als solches geläufig, so daß im Rahmen der vorliegenden Erfindung hierauf nicht näher eingegangen zu werden braucht.
Bei allen vorgenannten Anwendungen und Verwendungen werden die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate der allgemeinen Formel (Ia) einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin bevorzugt eingesetzt und die Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin ganz besonders bevorzugt.
Ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen, läßt sich die antimykotische, insbesondere fungistatische und/oder fungizide Wirkung der erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin möglicherweise durch eine Interaktion in der Ergosterol-Synthese der Pilze erklären.
Die Ergosterol-Synthese bei Pilzen hat sich als geeigneter Target- Stoffwechselweg erwiesen, um über die Hemmung einzelner Reaktionsschritte Pilze im Wachstum zu hemmen. Obgleich einige Hemmstoffe bekannt sind, die an den unterschiedlichsten Stellen in diesem Stoffwechsel weg angreifen, sind insbesondere nur die Azole im klinischen Einsatz. Diese hemmen bei der Umwandlung von Lanosterol zu Ergosterol das Enzym Sterol-14-alpha- demethylase und wirken infolgedessen fungistatisch. Allylamine (Terbinafin und Naftifin) werden ausschließlich gegen Dermatophyten eingesetzt. Ihr Wirkort ist die Squalenepoxidase (Erg1), wodurch die Umwandlung von Squalen zu Lanosterol blockiert wird. Morpholinderivate (Amorolfin) werden ausschließlich topisch angewendet. Sie hemmen die Sterσl-C-14-Reduktase (Erg24) sowie die Sterol-C-8-lsomerase (Erg2). Für die meisten weiteren Enzyme des Ergosterol- Syntheseweges sind keine potenten Hemmstoffe im klinischen Einsatz oder als Pflanzenschutzmittel auf dem Markt. Jüngst wurde eine weitere Substanz (PF1163A) in der Literatur beschrieben (vgl. Nose H., Fushimi H., Seki A., Sasaki T., Watabe H., Hoshiko S. (2002) "PF1163A, a novel antifungal agent, inhibit ergosterol biosynthesis at C-4 Sterol-Methyloxidase", J. Antibiot, 55(11 ): 969-74), welche die C-4 Sterol-Methyloxidase (Erg25) hemmt. Die C-4-Sterol- Methyloxidase ist ein sehr interessantes Target für die Entwicklung von antifungalen Substanzen. Dieses Enzym kommt jedoch nicht nur in Pilzen vor, sondern auch bei allen höheren Organismen (unter anderem Pflanzen und Menschen).
Die C-4 Sterol-Methyloxidase ist nicht nur ein interessantes Enzym für die Entwicklung von neuen Antimykotika, sondern auch als Target zur Bekämpfung anderer Krankheiten beim Menschen von hohem Interesse, wodurch sich die anderen pharmazeutischen bzw. pharmakologischen Effekte der erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin erklären lassen, ohne sich auf eine bestimmte Theorie festlegen zu wollen. Beim Menschen kann eine Hemmung des Cholesterin-Stoffwechsels zwischen Lanosterol und Cholesterol zu einer verminderten Cholesterol-Blut- Konzentrationen führen, was diesen Stoffwechselweg zu einem interessanten Target für die Entwicklung von Medikamenten gegen Arteriosklerose macht. Für Azole (z. B. Ketokonazol), die relativ unspezifisch sowohl die pilzliche als auch die humane 14-alpha-Demethylase hemmen, konnte bereits gezeigt werden, daß bei sehr hoher Dosierung der Cholesterol-Blutspiegel sinkt. Auch die Hemmung der delta-14-Reduktase durch die Substanz AY9944-A-7 führt zur verminderten Cholesterolsynthese und schließlich zur Erniedrigung der Cholesterol- Konzentration im Blut. Diese Substanz wurde in den 1950er Jahren zur Senkung des Cholesterin-Blutspiegels eingesetzt. Die C-4-Sterol-Methyloxidase katalysiert die der delta-14-Reduktase nachfolgende Reaktion und stellt einen weiteren Angriffspunkt für die Senkung des Cholesterin-Blutspiegels dar.
Ein weiterer interessanter Aspekt ist, daß durch die Hemmung der C-4 Sterol- Methyloxidase möglicherweise Hormone (bzw. hormonähnliche Substanzen), sogenannte meioseaktivierende Sterole (MAS), angehäuft werden. Für solche Hormone konnte bereits ΘX vivo gezeigt werden, daß sie die Wiederaufnahme der meiotischen Eizellteilung stimulieren. Eine Substanz, welche folglich die menschliche C-4-Sterol-Methyloxidase hemmt und dadurch zur Anhäufung von meioseaktivierenden Sterolen führt, stellt daher einen potentiellen Wirkstoff für die Behandlung von Infertilität dar. Hashimoto et al. (Hashimoto F. und Hayashi H. (1991) "Identification of intermediates after inhibition of cholesterol synthesis by aminotriazole treatment in vivo", Biochem. Biophys. Acta, 1086(1 ): 115-124) fanden heraus, daß Aminotriazole die Cholesterinsynthese ausgehend von Mevalonat hemmen. Insbesondere die C-4-Sterol-Methyloxidase scheint gehemmt zu werden, wodurch es zu einer Akkumulation von 4-alpha-Methyl-5-alpha- cholest-7-en-3-beta-ol und 4,4-Dimethyl-5-alpha-cholest-8-en-3-beta-ol kommt. Leonardsen et al. (Leonardsen L., Stromstedt M., Jacobsen D., Kristensen K. S., Baltsen M., Andersen C. Y., Byskov A. G. (2000) "Effect of inhibition of sterol delta 14-reductase on accumulation of meiosis-activating sterol and meiotic resumption in cumulus-enclosed mouse oocytes in vitro", J. Reprod Fertil., 118(1 ): 171-179) konnten zeigen, daß die Hemmung der Sterol-C-14-Reduktase (Erg24) mit AY9944-A-7 zur Akkumulation von FF-MAS führt, was wiederum eine dosisabhängige Wiederaufnahme der Meiose in Eizellen bewirkt. Auch 17-alpha- OH-Progesteron hemmt die C-4-Sterol-Methyloxidase und führt zur Akkumulation der gleichen Methyl- und Dimethyl-Vorläufer wie bei Hemmung mit Aminotriazol. Zusätzlich konnten Lindenthal et al. (Lindenthal B., Holleran A. L., Aldaghlas T. A., Ruan B., Schroepfer J. J., Wilson W. K., Kelleher J. K. (2001) "Progestins block cholesterol synthesis to produce meiosis-activating sterols", FASEB J., 15(3): 775- 784) auch noch die Anhäufung von T-MAS (4,4-Dimethyl-5-alpha-cholesta-8,24- dien-3-beta-ol) und FF-MAS (4,4-Dimethyl-5-alpha-cholesta-8,14,24-trien-3-beta- ol) nachweisen. Es kann angenommen werden, daß in vivo luteinisierendes Hormon (LH) über die gesteigerte Produktion von FF-MAS in den Kumuluszellen der Eizelle das Signal für die Wiederaufnahme der Meiose über Kommunikationskanäle wie "gap junctions" vermittelt. FF-MAS, aber auch T-MAS, stimuliert die Wiederaufnahme der meiotischen Eizellreifung in Maus und Ratte sowohl in vitro wie auch im ex vivo perfundierten Ovar in der Anwesenheit von Meioseinhibitoren, wie z. B. Hypoxanthin. Die durch die FF-MAS Kultur verbesserte Synchronisierung der meiotischen Teilung sowie cytoplasmatischen Reifung von Mäuseeizellen geht einher mit einer verbesserten Befruchtungsrate in vitro. Die Steigerung von FF-MAS stellt somit ein neues interessantes Verfahren für die Behandlung der Infertilität in vitro dar. Somit sind Substanzen, welche Enzymschritte in der Cholesterolsynthese hemmen, die der Sterol-14-alpha- Demethylase nachgeschaltet sind, sehr interessant, da sie potentiell die Befruchtungsrate bei der /n-v/fro-Fertilisation verbessern können. Zudem können sie zur Behandlung von Unfruchtbarkeit eingesetzt werden, die durch eine unzureichende Stimulierung der Meiose beim Mann oder der Frau hervorgerufen wird.
Es wurde weiter entdeckt, daß Formulierungen von Cholesterol-Synthese- hemmenden Substanzen effektiv die epitheliale Barrierefunktion eines Organismus beeinträchtigen und dadurch gute Penetrationsverbesserer für topisch aufgetragene aktive Substanzen sind (US 6,562,606 A). Durch Hemmung der C-4-Sterol-Methyloxidase mittels der erfindungsgemäßen Substanzen wird die Barrierefunktion der Epidermis beeinträchtigt, was zu einer Penetrations- Verbesserung für andere aktive Substanzen führt.
Wie zuvor beschrieben, wirken die zuvor beschriebenen erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin unter anderem antimykotisch, insbesondere fungistatisch bzw. fungizid (Fungizide), und können folglich zur Bekämpfung pilzlicher Infektionen eingesetzt werden. Bevorzugt vorgesehen ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Fungizide zur Hemmung unter anderem von humanpathogenen Pilzen. Denkbar ist der Einsatz erfindungsgemäßer Fungizide gegen z. B. folgende humanpathogene bzw. tierpathogene Pilze:
Trichophyton spp., Microsporum spp., Epidermophyton spp., Alternaria spp., Blastomyces dermatidis, Candida spp., Aspergillus fumigatus, Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Aspergillus nidulans, Candida albicans, Candida dublinensis, Candida glabrata, Candida krusei, Candida lustaniae, Candida parapsilopsis, Candida tropicalis, Coccidiodes immitis, Paracoccidioides brasiliensis, Exophalia dermatiditis, Fusarium oxysporum, Histoplasma capsulatum, Pneumocystis carnii, Cryptococcus neoformans, Trichosporon beigelii, Trichophyton rubrum, Trichophyton mentagrophytes var interdigitale, Trichophyton mentagrophytes var granulosum, Trichophyton mentagrophytes var erinacei, Trichophyton mentagrophytes var quinckeanum, Trichophyton schoenleinii, Trichophyton tonsurans, Trichophyton violaceum, Trichophyton concentricum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton gallinae, Trichophyton simii, Epidermophyton floccosum, Microsporum audouinii, Microsporum ferrugineum, Microsporum canis, Microsporum equinum, Microsporum gypseum, Microsporum fulvum, Microsporum nanum, Malassezia furfur, Absidia corymbifera, Mucor rouxii, Rhizomucor pusillus, Rhizopus arrhizus, Sporothrix schenckii, Phialophora verrucosa, Fonsecaea pedrosoi, Cladosporium carrionii, Madurella mycetomi, Madurella grisea, Allescheria boydii.
Die vorstehende Aufzählung ist nur beispielhaft zu verstehen und soll die Anwendung der Erfindung keinesfalls ausschließlich auf die genannten Pilze beschränken.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin können weiterhin zur Bekämpfung pflanzenpathogener Pilze eingesetzt werden. Sie zeichnen sich durch eine hervorragende Wirksamkeit gegen ein breites Spektrum von pflanzenpathogenen Pilzen, insbesondere aus der Klasse der Ascomyceten, Deuteromyceten, Phycomyceten und Basidiomyceten, aus. Sie sind zum Teil systemisch wirksam und können im Pflanzenschutz als Blatt- und Bodenfungizide eingesetzt werden. Besondere Bedeutung haben sie insbesondere für die Bekämpfung einer Vielzahl von Pilzen an verschiedenen Kulturpflanzen wie Weizen, Roggen, Gerste, Hafer, Reis, Mais, Gras, Bananen, Baumwolle, Soja, Kaffee, Zuckerrohr, Wein, Obst- und Zierpflanzen und Gemüsepflanzen wie Gurken, Bohnen, Tomaten, Kartoffeln und Kürbisgewächsen sowie an den Samen dieser Pflanzen.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin eignen sich außerdem zur Bekämpfung von Schadpilzen wie Paecilomyces variotii im Materialschutz (z. B. Holz, Papier, Dispersionen für den Anstrich, Fasern bzw. Gewebe) und im Vorratsschutz. Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin können beispielsweise angewendet werden, indem man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Pflanzen, Saatgüter, Materialien oder den Erdboden mit einer fungizid wirksamen Menge dieser Wirkstoffe behandelt. Die Anwendung kann sowohl vor als auch nach der Infektion der Materialien, Pflanzen oder Samen durch die Pilze erfolgen.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin können in der Anwendungsform als Fungizide auch zusammen mit anderen Wirkstoffen vorliegen, z. B. mit Herbiziden, Insektiziden, Wachstumsregulatoren, Fungiziden etc., oder auch mit Düngemitteln. Beim Vermischen der erfindungsgemäßen Substanzen bzw. der sie enthaltenden Mittel in der Anwendungsform als Fungizide mit anderen Fungiziden erhält man in vielen Fällen eine Vergrößerung des fungiziden Wirkungsspektrums.
Denkbar ist der Einsatz der erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin gegen z. B. folgende phytopathogenen Pilze:
Pyrenophora spp., Fusarium spp., Phytophthora spp., Bortytis spp., Magnaporthe spp. Penicillium spp., Aspergillus spp., Rhizoctonia spp., Septoria spp., Puccinia spp., Tilletia spp., Alternaria solanii, Gaeumannomyces graminis, Cercospora zeae-maydis, Botrytis cinerea, Claviceps purpurea, Corticum rolfsii, Endothia parasitica, Sclerotina sclerotiorum, Erysiphe gramini, Erysiphe triticii, Magnaporthe grisea, Plasmopara viticola, Penicillium digitatum, Ophiostoma ulmi, Rhizoctonia oryzae, Septoria avenae, Septoria nodorum, Septoria passerinii, Septoria triticii, Venturia inequalis, Verticillium dahliae, Verticillium albo-atrum, Puccinia coronata, Puccinia graminis, Puccinia recondita, Puccinia striiformis, Tilletia caries, Tilletia controversa, Tilletia indica, Tilletia tritici, Tilletia foetida, Ustilago maydis, Ustilago hordeii Die vorstehende Aufzählung ist nur beispielhaft zu verstehen und soll die Anwendung der Erfindung keinesfalls ausschließlich auf die genannten Pilze beschränken.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen die C-4-Sterol-Methyloxidase unter anderem von Pilzen und wirken daher antimykotisch bzw. fungizid. Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen aber auch die humane C-4-Sterol-Methyloxidase und sind somit von Interesse für andere Einsatzgebiete in der Humanmedizin, wie zuvor beschrieben. Anwendung können die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin z. B. sowohl bei der Behandlung von hohem Blutdruck und Atherosklerose als auch in der Steigerung der Fertilität von Mann und Frau oder zur Verbesserung der Befruchtungsrate bei der /π-wϊro-Fertilisation finden. Zudem können die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin als Penetrationsverbesserer dienen. Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin vermindern die epitheliale Barrierefunktion der Haut und ermöglichen so ein leichteres Eindringen topisch verabreichter aktiver Substanzen. Für weitere Einzelheiten zu den erfindungsgemäßen Anwendungsbzw. Verwendungsmöglichkeiten kann auf obige Ausführungen werden.
Gegenüber dem bekannten Stand der Technik weist die vorliegende Erfindung eine Reihe von Vorteilen auf, von denen einige nachfolgend skizziert sind:
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen sowohl das Wachstum humanpathogener Pilze und Hefen, wie etwa Candida albicans oder Candida glabrata, als auch das Wachstum nichthumanpathogener Pilze und Hefen, wie etwa Saccaromyces cerevisiae.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen das Wachstum z. B. der Hefeform von Candida- albicans-ZeWen und wirken insbesondere fungistatisch. Gegen z. B. die hyphale Wachstumsform von Candida albicans, welche die pathogene Wachstumsform darstellt, wirken die Substanzen pilzabtötend und somit fungizid.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen weder bei der minimalen Hemmkonzentration (MHK) für Candida albicans noch bei Konzentrationen, die deutlich darüber liegen, die Proliferation (BrdU-Assay) humaner HaCaT-Zellen (=> spontan immortalisierte Keratinozyten), humaner Heia-Zellen (=> Zervixkarzinom-Zell-Linie) und humaner Mono-Mac-6-Zellen (=> Monσzyten-Zell-Linie). Auch die Vitalität (WST1-Assay) dieser Zeil-Linien bleibt unbeeinflußt. Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin wirken folglich nicht cytotoxisch.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen nicht das Wachstum von Bakterien (weder Grampositiv, wie beispielsweise Bacillus subtilis, noch Gram-negativ, wie beispielsweise Escherichia coli). Somit wird das bakterielle Gleichgewicht des Menschen (Darmflora, Hautflora, Mundflora etc.) sowohl bei systemischer als auch topischer Anwendung nicht gestört.
Die erfindungsgemäßen Tetrazinderivate einschließlich 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin hemmen die C-4-Sterol-Methyloxidase. Für dieses Enzym existieren keine Hemmsubstanzen, die in irgendeiner Weise als "Antifungals" eingesetzt werden (weder im klinischen Einsatz noch im Pflanzenschutz). Es handelt sich also um eine Substanzklasse mit völlig neuem Target, was insbesondere von Bedeutung bei der Bekämpfung bereits resistenter pathogener Organismen ist (z. B. Resistenz gegen Azole).
Weitere Ausgestaltungen, Abwandlungen und Variationen sowie Vorteile der vorliegenden Erfindung sind für den Fachmann beim Lesen der Beschreibung ohne weiteres erkennbar und realisierbar, ohne daß er dabei den Rahmen der vorliegenden Erfindung verläßt. Aυsführunqsbeispiele:
Beispiel 1 :
//i-Wfro-Tests zur Bestimmung der wachstumshemmenden Eigenschaften auf verschiedene Hefepilze von 1,4-Diphenyl-hexahydro-[1,2,4,5]-tetrazin (= 1,4-Diphenyl-[1,2,4,5]-tetrazinan oder 1,4-Diphenylhexahydro-s-tetrazin) der Formel (Ib)
Ein Candida albicans-WΛdtyp-Stamm (SC5314) wird über Nacht in YEPD3- Medium (1 % Yeast Extract [Hefeextrakt]; 1 % Pepton, 3 % Dextrose) angezogen. Frisches YEPD3-Medium wird mit 104 Zellen/ml beimpft. Jeweils 150 μl dieser Zeil/Medium-Suspension werden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte vorgelegt. Es werden in doppeltem Ansatz je 1 ,5 μl verschiedener Lösungen von 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin zupipettiert (Stammlösungen 3200 μg/ml DMSO, 1600 μg/ml DMSO, 800 μg/ml DMSO, 400 μg/ml DMSO, 200 μg/ml DMSO, 100 μg/ml DMSO, 50 μg/ml DMSO, 25 μg/ml DMSO, 12,5 μg/ml DMSO, 6,25 μg/ml DMSO). Als Kontrolle dient DMSO ohne gelöste Substanz. Nach Inkubation für 48 h bei 30 0C wird das Wachstum in den einzelnen Kavitäten an einem Photometer (OD 590 nm) ausgewertet. Als minimale Hemmkonzentration wird die 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin-Endkonzentration bezeichnet, bei der kein Wachstum von Candida albicans feststellbar ist. Diese liegt für Candida albicans in YEPD3-Medium bei 8 μg/ml (entspricht 33 μM). Die Wirkung der Substanz ist in den oben getesteten Konzentrationen und Medien fungistatisch, da nach längerer Inkubation selbst in der höchsten Konzentration ein Restwachstum zu verzeichnen ist. Ähnliche Ergebnisse können für einen Candida g/ajbrate-Wildtyp-Stamm sowie einen Saccharomyces cerews/ae-Wildtyp-Stamm erzielt werden. Die MHK für Candida glabrata sowie Saccharomyces cerevisiae beträgt 32 μg/ml (entspricht 133 μM).
Durch Zugabe von FCS (Fötales Kälberserum) in das YEPD3-Medium kann das hyphale Wachstum bei Candida albicans induziert werden. Ein YEPD3-Medium, welches FCS enthält, führt interessanterweise zu einer Erniedrigung der MHK für Candida albicans. Dies deutet darauf hin, daß hyphal wachsende Candida albicans-ZeWen anfälliger für die Substanz 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]- tetrazin sind.
Überprüft werden kann dies, indem die gleichen Versuche wie oben für Candida albicans in dem Hyphen induzierenden RPMI-Medium (RPMI = Roswell Park Memorial) durchgeführt werden. Hier liegt die MHK für Candida albicans bei 2 μg/ml (entspricht 8,3 μM) und damit deutlich tiefer als in dem nichthypheninduzierenden YEPD3-Medium.
Beispiel 2:
Fungizide Wirkung auf hyphal wachsende Candida albicans
Ein Candida albicansΛNMtyp-Stamm (SC5314) wird über Nacht in YEPD3- Medium (1 % Yeast Extract; 1 % Pepton, 3 % Dextrose) angezogen. Frisches RPMI-Medium wird mit 3,3 - 103 Zellen/ml beimpft. Jeweils 150 μl dieser Zell/Medium-Suspension werden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte vorgelegt (jede Kavität enthält ca. 500 Zellen). Es werden im 10fachen Ansatz je 1 ,5 μl DMSO bzw. 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin-Stammlösungen der Konzentration 1600 μg/ml DMSO (Endkonzentration 16 μg/ml) sowie 400 μg/ml DMSO (Endkonzentration 4 μg/ml) zugegeben. Unmittelbar nach Zugabe der Substanz sowie zu den Zeitpunkten 4 h, 6 h, 24 h und 48 h nach Zugabe der Substanz werden je 2 Kavitäten jeder Konzentration auf YEPD3-Platten ausplattiert. Nach Inkubation für 48 h bei 30 0C werden die entstandenen Kolonien ausgezählt. Zum Zeitpunkt Null, d. h. unmittelbar nach Zugabe der Substanzen bzw. des DMSO, enthalten alle Kavitäten gleich viele Zellen. Es zeigt sich, daß bereits nach 4 h Inkubation die Zahl der teilungsfähigen Zellen in den Kavitäten, welche 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin enthalten, deutlich sinkt, wohingegen in den Kontrollkavitäten (DMSO-Zugabe) die Zahl der lebensfähigen Zellen ansteigt und deutlich > 500 liegt. Nach 48 h Inkubation enthalten die Kavitäten mit 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin keine lebensfähigen Zellen mehr.
Die Ergebnisse des Inaktivierungsassays sind in Abbildung 1 wiedergegeben und sind dort als Anzahl koloniebildender Zellen in Abhängigkeit der Substanzinkubationsdauer dargestellt.
Tabelle 1 zeigt den Inaktivierungsassay als Anzahl koloniebildender Zellen in Abhängigkeit der Substanzinkubationsdauer.
Tab. 1
Beispiel 3:
Toxizitätsuntersuchung von 1,4-Diphenyl-hexahydro-[1,2,4,5]-tetrazin auf humane Zeil-Linien
Um den Einfluß von 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin auf humane Zellen zu untersuchen, wird die Wirkung der Substanz (100 μM Endkonzentration) auf die Proliferation (BrdU-Assay) sowie die Vitalität (WST1-Assay) von HaCaT-Zellen (immortalisierte Keratinozyten), HeLa-Zellen (Zervixkarzinom-Zellen) sowie MM6- Zellen (Monozyten-Zellen) untersucht. Die Kultivierung der Zellen erfolgt im Inkubator bei 37 0C, 5 % (v/v) CO2 und wasserdampfgesättigter Atmosphäre.
A) Proliferation
20.000 HaCaT-Zellen/96-Well-Kavität werden in 100 μl Kulturmedium (Hanks1 Basalmedium, 2 mM L-Glutamin, 5 % (v/v) fötales Kälberserum) ausgesät und für 24 h inkubiert. Das Medium wird entfernt, der Zellrasen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und für 24 h mit Kulturmedium, welches die zu testenden Substanzkonzentrationen (100 μM Endkonzentration) enthält, inkubiert.
20.000 HeLa-Zellen/96-Well-Kavität werden in 100 μl Kulturmedium (DMEM Medium, 10 % (v/v) fötales Kälberserum) ausgesät und für 24 h inkubiert. Das Medium wird entfernt, der Zellrasen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und für 24 h mit Kulturmedium, welches die zu testenden Substanzkonzentrationen (100 μM Endkonzentration) enthält, inkubiert.
20.000 MM6-Zellen/96-We!l-Kavität werden in 100 μl Kulturmedium (RPMI- Medium, 10μg/ml Insulin, MEM nichtessentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 1 mM Oxalacetat, 2mM L-Glutamin, 10% (v/v) fötales Kälberserum) ausgesät und für 24 h inkubiert. Das Medium wird entfernt, die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und für 24 h mit Kulturmedium, welches die zu testenden Substanzkonzentrationen (100 μM Endkonzentration) enthält, inkubiert.
Sämtliche folgende Arbeitsschritte werden, falls nicht gesondert darauf hingewiesen wird, bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln auf dem Kippschüttler (Heidolph, Kelheim, Stufe 4) durchgeführt. Die angegebenen Volumina beziehen sich auf eine Kavität einer 96-Well-Platte. Lösungen werden durch Umdrehen der ELISA-Platte mit anschließendem kräftigen Ausschlagen auf saugfähigem Papier entfernt.
10 μl der 1 :100 BrdU-Lösung (Endkonzentration 10 μM BrdU) werden dem Kulturmedium zugegeben und die Zellen für 1 h unter Kulturbedingungen inkubiert. Das Kulturmedium wird entfernt, 200 μl der Fixierlösung aufgetragen und die Ansätze für 16 h bei 4 °C inkubiert. Nach einmaligem Waschen mit 200 μl PBS folgt die Behandlung der Ansätze mit Anti-BrdU-POD1-Lösung (1 : 100 in "Antibody Dilution Solution") für 90 min. Die Antikörperlösung wird entfernt, dreimal mit jeweils 200 μl "Washing Solution" gewaschen und 100 μl der Substratlösung aufgetragen. Der Verlauf der Farbreaktion wird beobachtet und gegebenenfalls durch Zugabe von 25 μl 1 M H2SO4 abgestoppt. Die Messung der Absorption erfolgt im ELISA-Reader bei einer Wellenlänge von 450 nm gegen eine Referenz von 690 nm.
B) Vitalität
20.000 Zellen/96-Well-Kavität werden wie in A) in Kulturmedium ausgesät und für 24 h inkubiert. Das Medium wird entfernt, die Zellen einmal mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen und für 24 h mit Kulturmedium, welches die zu testenden Substanzkonzentrationen (100 μM Endkonzentration) enthält, inkubiert. 10 μl WST1 -Reagenz (Roche, Cat. No 1644807) werden dem Kulturmedium zugegeben und die Zellen für 1 h unter Kulturbedingungen inkubiert. Die Platte wird gründlich geschüttelt und die Absorption bei 450 nm gegen eine Referenz von 620 nm gemessen. Die Substanz 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin wirkt auf alle getesteten Zeil-Linien weder proliferationshemmend noch verschlechtert sie die Vitalität der Zellkulturen. Die Substanz wirkt folglich auf Zellkulturen nicht cytotoxisch.
Abbildung 2 zeigt die Vitalität bzw. Proliferation in % im Vergleich zu unbehandelten Kontrollkulturen.
Beispiel 4:
In-vitro Tests zur Bestimmung der wachstumshemmenden Eigenschaften auf Bacillus subtilis und Escherichia coli von 1,4-Diphenyl-hexahydro-
[1,2,4,5]-tetrazin
Bacillus subtilis sowie Escherichia coli DHδalpha werden über Nacht in LB- Medium (1 % Pepton, 0,5 % Yeast Extract, 0,5 % NaCI) Medium angezogen. Frisches LB-Medium wird mit ca. 103 Zellen/ml beimpft. Jeweils 150 μl dieser Zell/Medium-Suspension werden in einer 96-Well-Mikrotiterplatte vorgelegt. Es werden in doppeltem Ansatz je 1 ,5 μl verschiedener 1 ,4-Diphenyl-hexahydro- [1 ,2,4,5]-tetrazin-Lösungen zupipettiert (Stammlösungen 3200 μg/ml DMSO, 1600 μg/ml DMSO, 800 μg/ml DMSO, 400 μg/ml DMSO, 200 μg/ml DMSO, 100 μg/ml DMSO, 50 μg/ml DMSO, 25 μg/ml DMSO, 12,5 μg/ml DMSO, 6,25 μg/ml DMSO). Als Kontrolle dient DMSO ohne gelöste Substanz. Nach Inkubation für 48 h bei 30 0C wird das Wachstum in den einzelnen Kavitäten am Photometer (OD 590 nm) ausgewertet. 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin hemmt in keiner der getesteten Konzentrationen das Wachstum von Bacillus subtilis sowie Escherichia coli.
Beispiel 5:
Der Wirkort von 1,4-Diphenyl-hexahydro-[1,2,4,5]-tetrazin in der Hefe
Saccharomyces cerevisiae
Die Hypothese, daß die Substanz 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin in den Ergosterol-Stoffwechsel von Pilzen eingreift, soll untersucht werden. Exemplarisch kann dies in der Hefe Saccharomyces cerevisiae erfolgen. Dazu werden die Enzyme des Ergosterol-Stoffwechsels in Hefe-Überexpressionsvektoren kloniert und in die Hefe Saccharomyces cerevisiae transformiert. Als Kontrolle dient die gleiche Hefe, allerdings wird hier nur der leere Überexpressionsvektor eingebracht. Anschließend werden für die einzelnen Stämme die MHKs für 1 ,4- Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin gemäß Beispiel 1 bestimmt. Es zeigt sich, daß nur der Stamm, welcher Erg25p (C-4-Sterol-Methyloxidase) überexprimiert, deutlich resistenter gegen 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin ist. Dies ist ein deutlicher Hinweis, daß dieses Enzym der Wirkort der Substanz 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin ist.

Claims

Patentansprüche
1. Zusammensetzung, insbesondere pharmazeutische Zusammensetzung oder Pflanzenschutzmittelzusammensetzung, enthaltend - neben mindestens einem Träger oder Exzipienten - mindestens ein Tetrazinderivat der allgemeinen Formel (I)
wobei in der allgemeinen Formel (I) die Reste Ri bis Rs, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen.
2. Zusammensetzung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, daß der gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ist, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -NR1R" mit R' und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
3. Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Tetrazinderivate der allgemeinen Formel (Ia) entsprechen:
wobei in der allgemeinen Formel (Ia) die Substituenten X und Y, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen und die Indizes n bzw. m die Anzahl der Substituenten X bzw. Y im Phenylring bezeichnen und, jeweils unabhängig voneinander, ganze Zahlen von 1 bis 5 darstellen.
4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ist, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -NR1R" mit R1 und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Tetrazinderivat die Verbindung 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4-Diphenyl-[1 ,2,4,5]-tetrazinan) der Formel (Ib)
ist.
6. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Zusammensetzung eine pharmazeutische Zusammensetzung ist und der Träger oder Exzipient ein pharmazeutisch unbedenklicher und kompatibler Träger oder Exzipient ist.
7. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, im Bereich des Pflanzenschutzes, der Medizin (Human- und Veterinärmedizin), der Pharmazie, der Hygiene und dergleichen.
8. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, als Arzneimittelwirkstoff oder als Wirkstoff in Pflanzenschutzmitteln.
9. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, als antimykotisch, insbesondere fungizid und/oder fungistatisch wirkender Arzneimittelwirkstoff oder als fungizider und/oder fungistatischer Wirkstoff in Pflanzenschutzmitteln.
10. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung.
11. Verwendung nach Anspruch 10 zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur kurativen und/oder prophylaktischen Behandlung von Erkrankungen aus der Gruppe der folgenden Erkrankungen: Pilzerkrankungen (Mykosen); Infertilität oder Fertilitätsstörungen; Herz-/Kreislauf- und Stoffwechselerkrankungen, insbesondere Hyperlipidämie, wie Hypercholesterinämie, und kardiovaskulären Erkrankungen, wie Arteriosklerose (Atherosklerose), Hypertonie, Apoplexie und Infarkte, insbesondere Herzinfarkt.
12. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, als C-4-Sterol-Methyloxidase-lnhibitor und/ oder zur Herstellung eines Arzneimittels oder einer pharmazeutischen Zusammensetzung mit inhibitorischer Wirkung in bezug auf C-4-Sterol- Methyloxidase.
13. Verwendung nach einem der Ansprüche 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Anwendung des Tetrazinderivates topisch und/oder systemisch erfolgt.
14. Verwendung mindestens eines Tetrazinderivates, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, als Inhaltsstoff und/oder Aktivstoff in Desinfektionsmitteln, Waschmitteln und Reinigungsmitteln.
15. Antimykotikum, enthaltend mindestens ein Tetrazinderivat, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert, und einen pharmazeutisch unbedenklichen und/oder kompatiblen Träger oder Exzipienten, insbesondere zur systemischen und/oder topischen Anwendung in der Human- oder Veterinärmedizin.
16. Desinfektionsmittel, Waschmittel oder Reinigungsmittel, enthaltend mindestens ein Tetrazinderivat, wie in einem der Ansprüche 1 bis 6 definiert.
17. Tetrazinderivate der allgemeinen Formel (I)
wobei in der allgemeinen Formel (I) die Reste Ri bis R8, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen, ausgenommen jedoch die Verbindung 1 ,4-Diphenyl-hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4- Diphenyl-[1 ,2,4,5]-tetrazinan).
18. Tetrazinderivate nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß der gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ist, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -NR1R" mit R' und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
19. Tetrazinderivate nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß die Tetrazinderivate der allgemeinen Formel (Ia) entsprechen
wobei in der allgemeinen Formel (Ia) die Substituenten X und Y, jeweils unabhängig voneinander, ein Wasserstoffatom oder einen gegebenenfalls substituierten Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest darstellen und die Indizes n bzw. m die Anzahl der Substituenten X bzw. Y im Phenylring bezeichnen und, jeweils unabhängig voneinander, ganze Zahlen von 1 bis 5 darstellen, ausgenommen jedoch die Verbindung 1 ,4-Diphenyl- hexahydro-[1 ,2,4,5]-tetrazin (= 1 ,4-Diphenyl-[1 ,2,4,5]-tetrazinan).
20. Tetrazinderivate nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der gegebenenfalls substituierte Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ein Alkyl-, Alkenyl-, Alkinyl-, Aryl- oder Heteroarylrest ist, der mit einem oder mehreren der folgenden Gruppen oder Substituenten substituiert ist: Alkyl; Alkenyl; Alkinyl; Aryl; Heteroaryl; Halogen; -NH2; -NHR mit R gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -NR1R" mit R' und R", jeweils unabhängig voneinander, gleich Alkyl, Aryl oder Heteroaryl; -COOR mit R wie zuvor definiert; -COR mit R wie zuvor definiert, -OR mit R wie zuvor definiert; -SR mit R wie zuvor definiert.
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