EP1846574A1 - Procede de determination de la diversite des lymphocytes t dans un echantillon biologique - Google Patents

Procede de determination de la diversite des lymphocytes t dans un echantillon biologique

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Publication number
EP1846574A1
EP1846574A1 EP06709239A EP06709239A EP1846574A1 EP 1846574 A1 EP1846574 A1 EP 1846574A1 EP 06709239 A EP06709239 A EP 06709239A EP 06709239 A EP06709239 A EP 06709239A EP 1846574 A1 EP1846574 A1 EP 1846574A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
δrec
diversity
rearrangement
signal
resulting
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP06709239A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Serge Candeias
Cédric TOUVREY
Evelyne Jouvin-Marche
Patrice Marche
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Publication of EP1846574A1 publication Critical patent/EP1846574A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnosis of possible disorders of the immune system or having repercussions on the immune system.
  • the invention relates to a method for determining T cell diversity in a biological sample.
  • a mature T lymphocyte has on its surface a unique receptor for the antigen (TCR), formed by the association of two ⁇ and ⁇ or Y and ⁇ chains.
  • TCR provides the antigen recognition function of T cells, which is the starting point for the activation and proliferation of these cells.
  • the TCR is expressed clonally: each T lymphocyte carries on its surface a different TCR, specific for a given antigen.
  • the term "repertoire" refers to the set of T lymphocytes with different antigenic specificities, and therefore distinct TCRs. The analysis of the diversity of the TCRs in a given sample thus makes it possible to determine the diversity of the T lymphocytes in this sample.
  • the genes encoding the V domain of the TCR chains are formed by the juxtaposition of V and J genes, for the TCR ⁇ and TCRy chains, and V, D and J for the TCR ⁇ and TCR ⁇ chains. They are assembled during T cell differentiation by a directed somatic recombination mechanism, called "V (D) J recombination".
  • the TCR genes are grouped into several loci.
  • the TCRB locus contains the BV, BD and BJ genes whose recombination will give the genes encoding the TCR ⁇ chain.
  • the TCRAD locus is unique: it includes both the genes encoding the TCR ⁇ chain and the genes encoding the TCR ⁇ chain.
  • This locus contains several dozen ADV / DV genes, many of which can be used for either an ⁇ chain or a chain ⁇ .
  • This ADV / DV region is followed by the DD and DJ genes, followed by the AJ genes.
  • a rearrangement between an ADV / DV gene, a DD gene and a DJ gene will encode a TCR ⁇ chain.
  • a rearrangement between an ADV / DV gene and an AJ gene will encode a TCR ⁇ chain.
  • the recombination V (D) J makes it possible to generate an extremely vast repertoire of TCR.
  • the TCRs differ first of all by the combination of the rearranged V, D or J segments (combinatorial diversity).
  • the TCRA genes encoding the TCR ⁇ chain, there exists, for example, in the mouse, approximately 100 V genes and 60 J genes. There are therefore potentially 6000 possible combinations (see FIG. 1).
  • the TCRB genes encoding the TCR ⁇ chain
  • there are approximately 450 possible combinations 25 V genes, 2 D genes and 12 J genes).
  • V (D) J recombination introduce junctional diversity.
  • the V, D and J genes are flanked by short conserved nucleotide sequences termed sequence signal recombination (JRSS) sequences.
  • JRSS sequence signal recombination
  • These RSS are nucleotide motifs composed of a conserved heptamer and a semi - preserved nonamer, separated by 12 or 23 bases. Recombination is performed by a complex that comprises three proteins specifically expressed in lymphocytes: RAG 1 and 2 proteins (recombination activating genes), and TdT (terminal nucleotidyl transferase).
  • the other enzymatic activities involved in V (D) J recombination are provided by ubiquitous proteins involved in DNA repair by end religation or non-homologous end joining (or NHEJ).
  • V (D) J Recombination V (D) J is initiated by the introduction of a single - strand cut by RSS - bound RAG proteins. This cut, located exactly at the junction between the gene and the RSS, generates a free end 3 '-0H. A nucleophilic attack of this free end, on the opposite strand, then generates a double-strand break; the coding end of the gene is closed in a hairpin structure, while the end of the RSS is frank and phosphorylated. During the next phase of V (D) J recombination, the coding ends undergo a primer before being ligated together by the NHEJ participating proteins.
  • nucleotides P bases may also be removed from the free ends of the coding DNA.
  • TdT can add to these free ends additional bases, called “N nucleotides”, independently of a template.
  • JC coding junctions
  • V (D) J recombination does not result in the formation of TREC, but leads to the inversion of the DNA fragment separating the genes; in this case only, the signal junction is retained on the chromosome and replicated during cell divisions.
  • the genes encoding the TCR ⁇ chain are rearranged and expressed before those encoding the TCR ⁇ chain. These two periods of rearrangement are separated by an intense proliferation during which the lymphocytes having succeeded in expressing a TCR ⁇ chain will be very strongly amplified (up to 9 division cycles). There can therefore be up to 1000 cells ( 29 ) carrying the same TCRB rearrangement, which can potentially rearrange and express different TCRA genes.
  • the ADV and AJ genes are separated on the TCRAD locus by the TCRD genes. In humans, it is generally accepted that during the maturation of ⁇ T cells, TCRD genes are excised from the locus before the ADV and AJ genes rearrange.
  • junctional diversity resulting from the processing of the coding ends is one of the essential features of the V (D) J recombination process, which is at the root of the immense diversity of TCRs.
  • RSSs are ligated without being primed / modified, and therefore that the signal junctions (JS) carried by the TRECs are invariant.
  • JS signal junctions
  • the level of heterogeneity of circulating T cells may be useful for detecting immune system deficiencies (less or no new lymphocyte production) due to acquired or congenital immune deficiency.
  • immune system deficiencies less or no new lymphocyte production
  • the presence of a clonal or paucioclonal population may be a sign of an immune reaction under development, either against tumor cells or in response to an infection.
  • this reconstitution leads to the de novo production of lymphocytes, possibly with the possibility of clonal expansions due to graft versus host (GvH) or rejection and graft reactions.
  • the presence of a clonal or pauci - clonal population would then be indicative of the abnormal expansion of a particular lymphocyte pool, which may be indicative of GvH or rejection.
  • the flow cytometry analysis of the TCR diversity is therefore at best only indicative of the homogeneity of a T cell population: it only concerns the expression of the V ⁇ genes, without even taking into account the functional diversity. CDR3 TCR ⁇ chains. In addition, this analysis requires a large amount of cells (at least a few million T cells).
  • TCRA and TCRB genes expressed by T cells by different PCR - based techniques, by amplifying the rearranged genes either from transcripts or from genomic DNA.
  • the complete sequence of the TCRB and TCRA loci being available, it is possible to choose oligonucleotide primers specific for each gene (or gene family) BV and ADV, BJ and AJ genes, and BC and AC genes coding for the different domains of the TCR ⁇ and TCR ⁇ chains, respectively. From transcripts, we can therefore analyze the rearrangements of the different ADV and BV families by quantitative PCR in real time.
  • an "immunoscope" type test makes it possible to determine the size distribution of the CDR3s of the rearranged TCRA and TCRB genes (International Application WO 02/084567).
  • This test requires the realization of two PCR reactions for each family: the first to amplify the transcripts using a given ADV or BV gene and to obtain enough material, the second to produce, by elongation of a labeled primer, DNA. labeled single strand which will then be deposited on an acrylamide gel.
  • This test makes it possible to analyze the heterogeneity CDR3 of the TCR ⁇ and TCR ⁇ chains expressed in the analyzed population.
  • Sekaly et al. propose to analyze the circles of excision generated during the rearrangement of the genes coding for the TCR ⁇ chain.
  • the diversity observed by Sekaly et al. is limited to the combinatorial diversity of rearrangements; the possibility of observing a functional diversity during a given rearrangement is not mentioned at all.
  • the methods described today for determining the diversity of a lymphocyte population are therefore all based on the analysis of TCRB gene rearrangements and, possibly, TCRA. None of these methods take into account the rearrangement that leads to the inactivation of the TCRD locus. In this respect, it is known that the ⁇ Rec-1 rearrangement occurs after the rearrangement of the TCRB genes, but before the TCRA rearrangement, during the differentiation of the T lymphocytes. Recombination at the ⁇ Rec-1 level is considered as the initiating event. of TCRA gene recombination.
  • This rearrangement excises from the locus the DD, DJ and DC genes encoding a TCR ⁇ chain and thus prevents the recombination and expression of the genes encoding a TCR ⁇ chain. It thus definitely binds T cells in the ⁇ pathway.
  • the analysis of this rearrangement thus makes it possible to specifically determine the diversity of ⁇ T cells, excluding T ⁇ .
  • ⁇ Rec-1 also rearranges with at least AJ60 and AJ59.
  • the signal junctions resulting from the rearrangement of ⁇ Rec-1 with an AJ gene are not invariant.
  • a significant proportion (10 to 30%) of the junctions show signs of treatment (addition of nucleotides by TdT and / or deletion of some bases) of the signal ends before ligation.
  • the inventors have demonstrated that the signal junction produced during the recombination of ⁇ Rec-1 constitutes, as well as the junction of the TCR genes, an element of the molecular signature of a T lymphocyte, and that the rearrangement of the ⁇ Rec-1 element generates a repertoire of signal junctions with both combinatorial diversity and functional diversity.
  • a particular advantage of the analysis of signal junctions resulting from the excision of all or part of the TCRD locus is that these junctions are carried by a circle of excision which does not replicate during cellular proliferation. They therefore do not undergo any of the variations due to the selective events that shape the repertoire of T lymphocytes as a function of the antigenic specificity of their TCRs.
  • This rearrangement is therefore a molecular marker characteristic of the emergence of new T lymphocytes in the thymus, before the TCR repertoire is set up.
  • Such a marker which is then neither qualitatively nor quantitatively modified, makes it possible to analyze, from peripheral T lymphocytes, events which occurred during the emergence of new T lymphocytes in the body (especially in the thymus).
  • the present invention therefore firstly relates to a method for determining the diversity of T lymphocytes in a biological sample of a human patient or of an animal, characterized in that it comprises a step of analysis of combinatorial diversity. and / or the functional diversity of the excision circles (TREC) resulting from the excision of all or part of the TCRD locus during V (D) J recombination.
  • a method for determining the diversity of T lymphocytes in a biological sample of a human patient or of an animal characterized in that it comprises a step of analysis of combinatorial diversity. and / or the functional diversity of the excision circles (TREC) resulting from the excision of all or part of the TCRD locus during V (D) J recombination.
  • Patients for whom this procedure will be particularly useful are those for whom a defect of the immune system or a disease affecting the immune system is either suspected or proven, as well as the recipients of a hematopoietic cell transplant, for which wish to follow the reconstitution of the immune system.
  • This method can be used in addition to the flow cytometry analysis method described above, but it can also be used independently. It makes it possible to simply analyze a later rearrangement stage than the TCRB rearrangement, and much less complicated than the TCRA rearrangement.
  • the method of the invention can also be used in animals.
  • An example of implementation in the mouse is described below, but this method is also transferable to other animals, in particular to mammals such as cattle, monkey, pig, cat, dog, chicken
  • the method of the invention may be useful for experimental purposes to study animal models of pathologies involving the immune system.
  • SIV simian immunodeficiency virus
  • FV feline infections
  • Sequence data have been published for some species of monkeys, and show sequences of RSS ⁇ Rec-1 and AJ very close to those of the human and the mouse.
  • the method of the invention is therefore directly applicable to the monkey.
  • the monkey is used as an animal model to study different human pathologies.
  • pathologies include infections, in particular by the virus of hepatitis C, or by the immunodeficiency virus (HIV in humans, SIV in monkeys).
  • HIV immunodeficiency virus
  • the above method can be used to study, from biopsies, the diversity of T lymphocytes present at different stages of the infection, corresponding for example to the recruitment and then the proliferation of T lymphocytes.
  • the biopsy will be chosen by those skilled in the art to reflect the evolution of the pathology and / or the immune response.
  • biopsies will be advantageously performed in the liver.
  • the method of the invention may be carried out from any biological sample comprising T cells.
  • any biological sample comprising T cells.
  • usable biological samples mention may be made of whole blood, total mononuclear cells, a biopsy containing T cells, or a population of T cells sorted by flow cytometry on the basis of the expression of different membrane markers, including their TCR or a given VR region.
  • the combinatorial diversity of the excision circles resulting from the ⁇ Rec - 1 rearrangement is analyzed by performing at least three amplification reactions of a fragment of the excision circles, each amplification reaction being specific for a signal junction resulting from the ⁇ Rec - 1 rearrangement with an AJ region capable of being ligated with ⁇ Rec - 1.
  • the inventors have shown that these AJ regions are essentially the regions AJ61 (also noted ⁇ J ⁇ ), AJ58, AJ57, and AJ56. It can also be regions AJ60 and AJ59.
  • the amplification reactions are aimed at rearrangements with at least 3, preferably 4, and optionally 5 or 6 distinct AJ regions. It is important to note also that the analysis of signal junctions corresponding to other rearrangements is not excluded from the methods according to the invention, with a view to a more exhaustive study of the diversity of a population of T lymphocytes. . Indeed, ⁇ Rec-1 can rearrange at least up to AJ18 in the mouse (signal junctions resulting from this rearrangement have been demonstrated), and at least up to AJ2 in humans (resulting coding junctions of this rearrangement have been highlighted).
  • amplification reaction refers to any method of amplification of nucleic acids known to those skilled in the art.
  • Nonlimiting examples include Polymerase Chain Amplification (PCR), more commonly referred to by those skilled in the art as its English acronym, PCR (Polymerase Chain Reaction), TMA ( Transcription Mediated Amplification), NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), 3SR (Self Sustained Sequence Replication), Strand Displacement Amplification (SDA), and LCR (Ligase Chain Reaction).
  • the nucleic acid amplification reactions are polymerase chain reaction (PCR) reactions, carried out with pairs of primers each consisting of a specific primer. of ⁇ Rec-1 and a primer specific for an AJ region selected from AJ ⁇ 1, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, and AJ56. These reactions are preferably carried out in separate tubes. Whatever the technique used to carry out the amplification reactions, the analysis of the results consists in examining what reactions have allowed to obtain an amplification product.
  • PCR polymerase chain reaction
  • ⁇ Rec - 1 and a given AJ region correspond to the rearrangements present in the lymphocyte population examined, whereas the absence of amplification of a signal junction between ⁇ Rec - 1 and a given AJ region indicates that the corresponding rearrangement is absent from this population.
  • positive controls are preferably used when carrying out the process of the invention.
  • the amplification can be followed in real time, for example by carrying out quantitative PCRs. This makes it possible to quantify the TREC present in the biological sample and, if the latter is appropriate (for example, a blood sample), to evaluate the quantity of T lymphocytes recently produced by the thymus.
  • a probe at least 5 to 10, and preferably at least 15 nucleotides apart from the signal junction resulting from the perfect (unchanged) rearrangement of ⁇ Rec-1 with at least one AJ region selected from the group consisting of AJ61 , AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, and AJ56.
  • This method is advantageously implemented by quantifying the TREC resulting from the rearrangement of ⁇ Rec-1 with at least 2, 3, or 4 different AJ regions. This quantification can of course be carried out in addition to the analysis, according to the invention, of the combinatorial and / or functional diversity of the excision circles.
  • the distance between the probe and the signal junction is measured with respect to the "junction" proper between the two merged RSSs, and therefore with respect to the center of the GTGCAC pattern resulting from the perfect rearrangement ⁇ Rec- 1 / AJ, when this pattern is created.
  • the invention also relates to a method for determining the diversity of a population of T cells present in a sample, comprising at least one step of analyzing the functional diversity of at least one signal junction. ⁇ Rec-1 / AJ.
  • the junctional diversity of the most common signal junction ie the ⁇ Rec-1 / AJ ⁇ 1 junction, is examined. Even more preferably, the JS functional diversity analysis is performed in addition to the combinatorial diversity analysis described above.
  • the signal junctions correspond to the merging of the RSSs bordering the rearranged fragments.
  • These RSS consist of a conserved heptamer and a semi - preserved nonamer, separated by 12 or 23 bases.
  • the first three bases of heptamer have a very high degree of conservation, so that the great majority of RSS starts with a CAC triplet.
  • the "perfect" ligation of two RSSs, by NHEJ, during the creation of a signal junction generates a 5'-GTGCAC-3 'sequence, which corresponds to the restriction site of the ApaL1 enzyme. This makes it easy to distinguish signal junctions which have not been added or deleted because they are sensitive to ApaL1 restriction, unlike modified signal junctions.
  • the analysis of the junctional diversity at the level of signal junctions involving these RSS therefore requires the use of other techniques, for example to sequence the junctions in question.
  • the analysis of the junctional diversity therefore comprises, for each signal junction ⁇ Rec-1 / AJ analyzed, a step of amplifying a fragment of the excision circle, comprising the signal junction in question.
  • This amplification cation is preferably followed, for each signal junction, ⁇ Rec-1 / AJ analyzed resulting from the rearrangement of ⁇ Rec-1 with a region AJ selected from the group consisting of AJ ⁇ 1, AJ59, AJ58, AJ57, and AJ56 in humans, or AJ ⁇ 1, AJ58, AJ57, and AJ56 in the mouse, a step of analysis of the restriction profile by ApaL1 of the amplified fragment.
  • a region AJ selected from the group consisting of AJ ⁇ 1, AJ59, AJ58, AJ57, and AJ56 in humans, or AJ ⁇ 1, AJ58, AJ57, and AJ56 in the mouse
  • a step of analysis of the restriction profile by ApaL1 of the amplified fragment Various techniques for analyzing a restriction profile of a given DNA fragment by a specific enzyme are well known to those skilled in the art. Of course, the fragment is incubated in the presence of the enzyme in an ad hoc buffer.
  • the result of the digestion can then be analyzed by agarose gel migration and visualization by any available technique, for example by staining with bromide of ethydium (BET) or SybrGreen®, or by transfer on membrane and hybridization with a labeled probe (radioactive, coupled to peroxidase, Texas Red® or other).
  • BET bromide of ethydium
  • SybrGreen® ethydium
  • a labeled probe radioactive, coupled to peroxidase, Texas Red® or other.
  • the same product of amplification of a fragment of the TREC can be used for both aspects.
  • the interpretation of the result of the digestion of the fragment by ApaL1 is as follows: if the fragment is completely digested, it means that all the JS corresponding to the analyzed ⁇ Rec-1 / AJ junction are identical and correspond to the "canonical" JS , unmodified; if the fragment is completely resistant to restriction by ApaL1, all the JS corresponding to the analyzed ⁇ Rec-1 / AJ junction are modified (which does not mean that they are identical); the hybrid profile (fragment partially sensitive to ApaL1) is indicative of the presence, in the sample studied, of at least two lymphocyte populations comprising TREC resulting from the ⁇ Rec - 1 rearrangement with the AJ region. analyzed, one with a modified JS and the other not.
  • This qualitative analysis can be performed by various techniques known to those skilled in the art, such as sequencing, or extension of labeled primer. It is preferably made from only fragments totally or partially resistant to ApaL1, but if necessary, from an automation perspective, it can be carried out systematically on all the fragments.
  • a particular method according to the invention comprises the following steps: a. preparing the DNA from the biological sample; b. performing at least 3 or 4 PCRs, using pairs of primers each consisting of a ⁇ Rec - 1 specific primer and a specific AJ region primer selected from the group consisting of AJ61. AJ58, AJ57, and AJ56; vs . restriction of PCR products with enzymepaL1 restriction enzyme; d. analysis of the restriction profiles obtained in step c. e. where appropriate, qualitative analysis of ApaL1 restriction-resistant signal junctions by extension of labeled primer.
  • step “a” of this process the preparation of the DNA can be carried out by any technique known to those skilled in the art, such as the techniques described in Chapter 6 of the Sambrook and Russel Manual (Molecular Clonlng, 3rd edition, CSHL press), or using DNA preparation kits commercially available.
  • An intermediate step may, if necessary, be carried out between steps “b” and “c” of this process, consisting of analyzing the products of the amplifications carried out in step "b", for example by agarose gel migration. and coloring. This makes it possible to restrict the analysis of ApaL1 restriction profiles to only those functions for which a fragment has actually been amplified.
  • Another aspect of the invention is a reagent kit for determining lymphocyte diversity. T present in a biological sample, by a process such as those described above.
  • Such a kit comprises a set of at least four primers of which at least one is specific for ⁇ Rec-1, and at least three are each specific for a different AJ region selected from the group consisting of AJ ⁇ 1, AJ60, AJ59, AJ58. , AJ57, and AJ56.
  • such a kit comprises a set of at least five primers of which at least one is specific for ⁇ Rec-1, at least one is specific for AJ61, and at least three are each specific for a different AJ region, selected from the group consisting of AJ60, AJ59, AJ58, AJ57, and AJ56.
  • these primers are of course chosen so as to allow PCR amplification of the signal junctions resulting from the ⁇ Rec-1 rearrangement with the selected AJ regions.
  • additional reagents that may be present in the kits of the invention, mention may be made of the various buffers and / or enzymes required for amplification reactions and / or digestion with ApaL1, samples that can serve as controls for extractions reactions. DNA and / or amplification and / or restriction, etc.
  • oligonucleotides As primers and probes that can be used in the methods and kits of the invention, mention may be made of the following oligonucleotides:
  • the oligonucleotides whose name ends with a "p" can be used as probes when they are labeled, but can also be used as primers, in particular to perform nested or semi-nested PCRs (that is, from a PCR amplified product, using two or one primer (s), respectively , internal to the product of the first amplification).
  • Figures 1 and 2 Explanatory Schemes for V (D) J Recombination.
  • Figure 3 Amplification and ApaL1 Digestion Analysis of Signal Junctions Present in a T Cell Population Isolated from a Patient.
  • the signal junctions ⁇ Rec-1 / AJ61, ⁇ Rec-1 / AJ58 and ⁇ Rec-1 / AJ57 were amplified from DNA extracted from peripheral CD4 + CD8 + V ⁇ 1 + lymphocytes (sorted by
  • ApaL1 were separated on agarose gel, then transferred to a nylon membrane and hybridized with a radioactive probe specific for ⁇ Rec-1.
  • Figure 4 Analysis of the diversity of the ⁇ Rec-1 / AJ58 junctions In order to determine whether the PCR product ⁇ Rec-1 / AJ58
  • Figure 6 Sequencing result of ADV2 / AJ signal junctions from wild mouse and TdT 0/0 mouse samples.
  • ⁇ and AA indicate two sequences with the same amplification amplified from thymocyte DNA of two different mice.
  • Figure 7 Result of the sequencing of DV102 / DD2 and ADV2 / DD2 murine signal junctions.
  • Thymocyte DNA samples from two patients 10 days (A) and 6 days (B) were used to amplify the JS resulting from the ⁇ Rec-1 rearrangement with AJ61, AJ58, AJ57 and AJ56.
  • a fraction of PCR products were digested with ApaL1; the digested and undigested products were then separated on agarose gel, transferred to a nylon membrane and hybridized with a radiolabelled ⁇ Rec-1 probe.
  • the signal junctions were amplified by PCR and then analyzed on agarose gel without (-) or after (+) prior digestion with the restriction enzyme ApaL1. After transfer on a nylon membrane, the products are revealed by the hybridization of a h ⁇ Rec - 1 specific radioactive probe.
  • the asterisk indicates the position of a band corresponding to a signal junction h ⁇ Rec-1 / AJ59, which can sometimes be amplified with the AJ60 specific oligonucleotide. because of the proximity of these genes.
  • the profile of the products obtained is different in each sample of blood leukocytes, indicating the diversity of the repertoires in these patients.
  • Figure 10 Result of sequencing of ApaL1 restriction-resistant ⁇ Rec-1 / AJ signal junctions for h ⁇ Rec-1 rearrangements with AJ61, AJ59, AJ58, AJ57 and AJ56, and total signal junctions, for rearrangements h ⁇ Rec-1 / AJ60 present in a human sample.
  • Figure 11 Amplification of the JS resulting from the rearrangement of ⁇ Rec-1 with AJ61, AJ58, AJ57 and AJ56, from murine thymocyte DNA.
  • the PCR products were separated on an agarose gel, then transferred to a nylon membrane and hybridized with a radiolabelled ⁇ Rec-1 probe.
  • Figure 12 Sequencing result of the ⁇ Rec-1 / AJ61 signal junctions present in a murine sample.
  • Example 1 Determination of the degree of heterogeneity of a T cell population in a patient.
  • the Machery Nagel ® Nucleospln Tissue Extraction Kit was used, following the instructions provided.
  • the cells are pelleted by 5 minutes of centrifugation at 1200 rpm (corresponding to 300 g).
  • the dry pellet (up to 10 million cells) is taken up in 185 .mu.l of Tl lysis buffer mixed with 25 .mu.l of proteinase K provided in the kit.
  • the sample is vigorously vortexed and digested overnight at 56 ° C.
  • the column is vortexed at 11000 g for one minute (fixation of the DNA on the silica)
  • the column is then washed with 500 ⁇ l of BW and then 600 ⁇ l of B5 with a centrifugation of 1 minute at 11,000 g each time.
  • the silica is dried by centrifugation for 3 minutes at 11000 g
  • the DNA is then eluted with a volume of 50 to 200 ⁇ l of BE depending on the amount of cells initially lysed. For this, the BE preheated to 70 0 C is deposited on the column and the whole is incubated for 2 minutes at 70 ° C in an oven. The DNA is recovered by centrifugation for 1 minute at 11000 gl.
  • A.2. Amplification of Signal Junctions This step aims at amplifying by PCR the signal junctions of interest, in order to obtain enough material to study their structure.
  • PCR reaction 100 to 200 ng of total DNA is used for each PCR reaction.
  • a second PCR (nested PCR) may be required.
  • the amplifications are carried out using TaqGold enzyme (Applied Biosystem), in the provided "Master Mix” buffer.
  • Second PCR with more internal AJ-specific oligonucleotide (nested PCR): SEQ ID No: 4 for AJ ⁇ 1, SEQ ID No: 10 for AJ58, SEQ ID No: 12 for AJ57, and SEQ ID No: 14 for AJ 56 and, still, SEQ ID No: 1 for ⁇ Rec-1.
  • 35 cycles having the following sequence: 30 "to 94 ° C, 30" to 64 ° C and 30 "to 72 ° C, then
  • the purpose of this step is to determine if the signal junctions amplified in the previous step are diversified.
  • the RSS of the selected genes ( ⁇ Rec-1, AJ ⁇ 1, AJ58, AJ57, AJ56) correspond to the consensus RSS sequence and therefore start with the three GTG or CAC nucleotides. Therefore, perfect ligation of both RSSs to form a signal junction creates a (5'-GTGCAC-3 ') site recognized by the restriction enzyme ApaL1.
  • a large fraction (up to 30%) of the signal junctions resulting from the V (D) J recombination of genes carried by the TCRAD locus are not formed by the perfect ligation of the RSS rearranged genes, but show signs of deletion and / or addition of nucleotides to the RSS ends before ligation.
  • the resulting junctional diversity prevents the formation of the ApaII restriction site, and these modified junctions are thus resistant to digestion by this enzyme.
  • the presence of two molecular species after digestion of the PCR products with ApaL1, a sensitive and a resistant, is therefore indicative of the diversity of the amplified moieties. This diversity reveals the presence of T cells that have performed different V (D) J recombination events.
  • Digestion is carried out in a final volume of 20 .mu.l at 37.degree. C. for 3 hours with 5U of ApaL1 enzyme.
  • the DNA is then transferred by capillarity to Nylon Hybond N + membrane (Amersham) and then fixed under UV (700 J).
  • the membrane is then prehybridized with Rapid Hyb buffer (Amersham) for 30 min at 42 ° C. and then hybridized at 42 ° C. for 4 hours with a 32 P-labeled ⁇ Rec-I specific oligonucleotide probe by incubation with phage polynucleotide kinase. T4 and ATP ⁇ 32 P, under the conditions indicated by the supplier. Detection of the radioactive signal is done by means of a phosphorimager. l. A.4. Qualitative analysis of human signal junctions by labeled primer extension This technique allows to determine the length of the different amplified ⁇ Rec - 1 / AJ signal junctions from a population of T lymphocytes.
  • This method consists in amplifying single-stranded DNA by PCR with a primer comprising a fluorochrome: Texas red. These fragments are then resolved on a polyacrylamide gel.
  • T lymphocytes in blood samples in one patient showed a highly altered distribution of the use of different V ⁇ genes.
  • the T cells of this patient very extensively use the V ⁇ 1 gene.
  • this patient has been detected in Unusual T cell population, which expresses both CD4 and CD8 molecules.
  • T cells in this population also use the V ⁇ 1 gene almost exclusively.
  • CD4 + CD8 + V ⁇ 1 + T cells were sorted by flow cytometry and their prepared DNA. This DNA served as a template for amplifying the ⁇ Rec-1 / AJ61 signal junctions, ⁇ Rec-1 / AJ58, and ⁇ Rec-1 / AJ57 (the fourth combination, ⁇ Rec-1 / AJ56, was not performed in this example. ).
  • PCR products were digested with the restriction enzyme ApaL1 and those from the patient were found to be resistant (Fig 1, lanes 2, 4 and 6). This result indicates that all the amplified signal junctions are modified in the patient, whereas in the control sample amplified from thymocytes, the majority of the signal junctions are unmodified, and therefore sensitive products and products resistant to ApaL1 digestion (FIG. 1, lanes 2, 4 and 6). This result indicates that the junctional diversity of the amplified signal junctions from the patient's CD4 + CD8 + V ⁇ 1 + T cells is limited.
  • mice were raised in the pet shop of the Atomic Energy Commissariat in Grenoble. The mice were sacrificed by inhalation of CO 2 and their thymus was removed at 4-8 weeks of age. 2. A.2. Preparation of the DNA
  • C57BL / 6 mouse thymocyte DNA was prepared from 10 7 cells using the Machery Nagel ® nucleospin tissue extraction kit, following the manufacturer's instructions. TdT 0/0 thymocyte DNA was obtained from TdT 0/0 mice.
  • Thymocyte DNA (100 ng) was amplified with appropriate primers using the AmpliTaqGold PCR mixture as follows: 10 minutes at 94 0 C, followed by 35 cycles with the following sequence: 30 sec. at 94 ° C., 30 sec. at 60 0 C and 30 sec. at 72 ° C followed by 10 min. at 72 ° C.
  • the PCR reactions were carried out on a "GenAmp PCR System 9600" device from Perkin-Elmer, in a final volume of 25 ⁇ l.
  • the sequences of the primers are shown in Tables 1 and 2 above.
  • the PCR products were gel purified, cloned into the pGEM-T Easy vector (Promega®) according to the manufacturer's instructions, and transformed into competent bacteria. After plating, positive colonies were identified by hybridization with AJ-specific oligonucleotide probes.
  • the plasmids were prepared from the colonies containing the signal junctions, either with the Wizard Miniprep Kit (Promega®) or with the Montage Plasmid system. Miniprep 96 (Millipore Corporation®). Plasmids containing the JS were then digested individually with ApaL1.
  • the plasmid pGEM-T easy contains 2 sites for this enzyme.
  • the recombinant plasmid contains an unmodified signal junction, formed by the perfect fusion of RSS, an additional ApaL1 site is introduced and the digestion gives 3 bands after agarose gel migration. If the recombinant plasmid contains a modified signal junction, such an additional site is not introduced and the digestion gives only 2 bands. Plasmids with unexpected patterns in number or size of DNA fragments were excluded from further analysis. Plasmids containing modified signal junctions were sequenced (Genome Express, Meylan, France), to identify the nature of the modifications. Identical signal junctions obtained from the same sample were counted once, as it is impossible to determine whether these multiple occurrences result from independent events or over amplification of a single signal junction.
  • ADV2 and ADV8 with AJ61, AJ58, AJ57 and AJ56 were amplified from C57BL / 6 mouse thymocyte DNA.
  • the undigested and digested ApaL1 PCR products were then analyzed by agarose gel migration, followed by diffusion and hybridization revelation with radiolabeled AJ - specific probes.
  • a significant fraction of PCR products were resistant to ApaL1 restriction. This resistance indicates that some signal junctions are modified and do not consist of a simple splicing of RSS.
  • the ADV2 / AJ signal junctions were amplified from wild-type and cloned thymocyte DNA, so that each JS could be independently analyzed by ApaL1 digestion of the plasmid. corresponding recombinant.
  • Table 3 the frequency of ApaL1-R SJ ranged from 9.7% for ADV2 / AJ58 to 39.1% for ADV2 / AJ61, with an average of 33.6%.
  • a significant fraction of the JS ADV2 / AJ are modified, although the frequency of the modifications seems to vary slightly according to the rearranged AJ gene.
  • nucleotides were deleted from the two signals carried on ADV2 and AJ56 (1 and 3 nucleotides, respectively). In the other, 4 bases were deleted from the heptamer AJ56, while the signal on ADV2 is complete. This junction also contains an additional nucleotide ( Figure 6, last lines).
  • the inventors then further analyzed the structure of signal junctions produced by recombination of the ⁇ Rec-1 element with AJ genes.
  • JS produced by recombination of ⁇ Rec-1 with AJ ⁇ 1, AJ60, AJ59, AJ58, AJ57 and AJ56 were amplified from human thymocyte DNA, and the products of these amplifications were digested with ApaL1.
  • the figures 8 and 9A show that in the thymus, a large fraction of the PCR products are resistant to ApaL1 restriction, revealing the existence of modified signal junctions for all rearrangements tested except those involving AJ60.
  • FIGS. 9B-9E show that, when this analysis is applied to samples of purified blood leukocytes from different donors, the profile obtained is different for each patient, indicating that each patient possesses a repertoire of signal junctions which is his own. .
  • the ⁇ Rec-1 / AJ signal junctions in human thymocytes therefore have a functional diversity.
  • the inventors then sought to determine whether the rearrangement of the murine ⁇ Rec - 1 element is restricted to the AJ61 pseudogene or whether, as in the human thymus, other AJ genes can also be used.
  • the same approach was used, and the JS resulting from recombination of ⁇ Rec-1 with AJ ⁇ 1, AJ58, AJ57 and AJ56 were amplified from murine thymocyte DNA. These JS were easily detectable, as shown in FIG. 11.
  • the inventors detected ⁇ Rec-1 rearrangements with other genes.

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Abstract

La présente invention concerne le domaine du diagnostic d'éventuels désordres du système immunitaire et l'analyse des réponses immunitaires. L'invention porte en particulier sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique, basé sur l'analyse, au niveau moléculaire, de la structure des jonctions résultant du réarrangement par recombinaison V(D)J de l'élément dRec-1 avec un gène AJ. Plus spécifiquement, la présente invention propose d'analyser la diversité combinatoire et/ou la diversité jonctionnelle des cercles d'excision (TREC) résultant du réarrangement de dRec-1, afin de déterminer l'hétérogénéité d'une population donnée de lymphocytes T.

Description

PROCEDE DE DETERMINATION DE LA DIVERSITE DES LYMPHOCYTES T DANS UN ECHANTILLON BIOLOGIQUE
La présente invention concerne le domaine du diagnostic d ' éventuels désordres du système immunitaire ou ayant des répercussions sur le système immunitaire . L ' invention porte en particulier sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique .
Un lymphocyte T mature présente à sa surface un récepteur pour l ' antigène (TCR) unique, formé par l ' association de deux chaînes α et β ou Y et δ . Le TCR assure la fonction de reconnaissance antigénique des lymphocytes T, qui représente le point de départ de l ' activation et de la prolifération de ces cellules . Le TCR est exprimé de manière clonale : chaque lymphocyte T porte à sa surface un TCR différent , spécifique d ' un antigène donné . On appelle "répertoire" l ' ensemble des lymphocytes T ayant des spécificités antigéniques différentes , et donc des TCR distincts . L ' analyse de la diversité des TCR dans un échantillon donné permet donc de déterminer la diversité des lymphocytes T dans cet échantillon .
Les gènes codant pour le domaine V des chaînes TCR sont formés par la juxtaposition de gènes V et J, pour les chaînes TCRα et TCRy, et V, D et J pour les chaînes TCRβ et TCRδ . Ils sont assemblés durant la différenciation des lymphocytes T par un mécanisme de recombinaison somatique dirigée, appelé "recombinaison V ( D) J" . Les gènes TCR sont regroupés en plusieurs loci . Le locus TCRB comporte les gènes BV, BD et BJ dont la recombinaison donnera les gènes codant pour la chaîne TCRβ . Le locus TCRAD est particulier : il comporte à la fois les gènes codant pour la chaîne TCRα et les gènes codant pour la chaîne TCRδ . Ce locus comporte plusieurs dizaines de gènes ADV/DV, dont une grande partie peut être utilisée soit pour une chaîne α soit pour une chaîne δ . Cette région ADV/DV est suivie par les gènes DD et DJ, puis par les gènes AJ. Un réarrangement entre un gène ADV/DV, un gène DD et un gène DJ codera pour une chaîne TCRδ . Un réarrangement entre un gène ADV/DV et un gène AJ codera pour une chaîne TCRα .
La recombinaison V ( D) J permet de générer un répertoire de TCR extrêmement vaste . Les TCR diffèrent tout d' abord par la combinaison des segments V, D ou J réarrangés (diversité combinatoire) . Pour les gènes TCRA, codant pour la chaîne TCRα, il existe par exemple chez la souris environ 100 gènes V et 60 gènes J. Il y a donc potentiellement 6000 combinaisons possibles (voir figure 1 ) . Pour les gènes TCRB (codant pour la chaîne TCRβ) il existe environ 450 combinaisons possibles (25 gènes V, 2 gènes D et 12 gènes J) .
De plus , les mécanismes moléculaires de la recombinaison V (D) J introduisent une diversité j onctionnelle . Les gènes V, D et J sont bordés par de courtes séquences nucléotidiques conservées appelées séquences signal de recombinaison {recombina tion signal séquences, ou JRSS) . Ces RSS sont des motifs nucléotidiques composés d ' un heptamère conservé et d ' un nonamère semi-conservé, séparés par 12 ou 23 bases . La recombinaison est effectuée par un complexe qui comprend trois protéines exprimées spécifiquement dans les lymphocytes : les protéines RAG 1 et 2 ( recombina tion activating gènes) , et la TdT { terminal nucleotidyl transferase) . Les autres activités enzymatiques impliquées dans la recombinaison V ( D) J sont fournies par des protéines ubiquitaires participant à la réparation de l ' ADN par religature des extrémités ou recombinaison non homologue (non-homologous end joining, ou NHEJ) .
La recombinaison V ( D) J est initiée par l ' introduction d ' une coupure simple brin par les protéines RAG liées aux RSS . Cette coupure, située exactement à la j onction entre le gène et la RSS , génère une extrémité libre 3 ' -0H . Une attaque nucléophile de cette extrémité libre , sur le brin opposé, génère alors une cassure double brin ; l ' extrémité codante du gène est fermée en une structure en épingle à cheveux, tandis que l' extrémité des RSS est franche et phosphorylée . Pendant la phase suivante de la recombinaison V ( D) J, les extrémités codantes subissent un apprêtement avant d ' être ligaturées entre elles par les protéines participant à la NHEJ. Ceci implique notamment l ' ouverture de la structure en épingle à cheveux, qui est imprécise et peut générer des répétitions inversées de quelques bases , appelées "nucléotides P" . Des bases peuvent également être enlevées des extrémités libres de 1 ' ADN codant . Enfin, la TdT peut aj outer à ces extrémités libres des bases supplémentaires , appelées "nucléotides N" , indépendamment d ' une matrice .
En conséquence, les j onctions codantes ( JC) présentent une diversité très importante, tant du point de vue de la séquence de la j onction que de sa longueur . Pratiquement chaque j onction réalisée dans un lymphocyte T est unique et cette j onction constitue donc la signature moléculaire d ' un lymphocyte T . Structurellement, au sein du domaine V des chaînes TCR, les acides aminés codés par la j onction V ( D) J sont au centre d ' un motif appelé " complémentary determining région 3" (CDR3 ) , bordé par des résidus codés par les gènes V et J. Chaque lymphocyte T exprime une combinaison unique de chaînes TCRα et TCRβ ou TCRy et TCRδ , et les CDR3 de ces deux chaînes dictent la spécificité antigénique du TCR.
L 'ADN compris entre les segments fusionnés lors de la recombinaison V (D) J est dans la plupart des cas excisé, et ses extrémités comportant les RSS sont ligaturées, formant ainsi un cercle d' excision (voir figure 2 ) . Ces cercles ou TREC ( T cell Receptor Excision Circles) ne se répliquent pas et sont dilués au cours de la division cellulaire . Chaque TREC est donc le marqueur d ' un événement de réarrangement, et contrairement au réarrangement codant pour les chaînes du TCR, sa quantité absolue ne varie pas en fonction de la prolifération cellulaire . Lors de la formation des TREC, les RSS sont ligaturées par les facteurs impliqués dans la réparation de l ' ADN par religature des extrémités ou recombinaison non homologue (NHEJ) . Les jonctions résultant de cette fusion des RSS des gènes réarrangés sont appelées "j onctions signal" (JS) .
Dans quelques cas , lorsque les gènes réarrangés sont en orientation de transcription inverse, la recombinaison V ( D) J n ' entraîne pas la formation de TREC, mais conduit à l ' inversion du fragment d ' ADN séparant les gènes ; dans ce cas uniquement , la j onction signal est retenue sur le chromosome et répliquée lors des divisions cellulaires .
Lors de la différenciation des lymphocytes T dans le thymus , les gènes codant pour la chaîne TCRβ sont réarrangés et exprimés avant ceux codant pour la chaîne TCRα . Ces deux périodes de réarrangement sont séparées par une intense prolifération au cours de laquelle les lymphocytes ayant réussi à exprimer une chaîne TCRβ vont être très fortement amplifiés (jusqu ' à 9 cycles de division) . Il peut donc y avoir jusqu ' à 1000 cellules (29) portant le même réarrangement TCRB, qui peuvent potentiellement réarranger et exprimer des gènes TCRA différents . Les gènes ADV et AJ sont séparés sur le locus TCRAD par les gènes TCRD. Chez l ' homme, il est générale- ment admis que lors de la maturation des lymphocytes T αβ, les gènes TCRD sont excisés du locus avant que les gènes ADV et AJ se réarrangent . Cette excision résulte de la recombinaison d ' une RSS particulière, δRec-1 , avec le gène AJ le plus proche, AJ61. Aucune séquence codante n' est associée à cette RSS . Le mécanisme de délétion des segments de gène codant pour la chaîne δ des TCR, qui marque l ' engagement des lymphocytes T dans la lignée αβ, a notamment été étudié par Shutter et al ( Shutter, Cain et al . 1995) , en utilisant des souris transgéniques dans lesquelles ont été intégrées les séquences humaines correspondant aux éléments de délétion δ et à des gènes de la chaîne δ des TCR. Les résultats décrits dans cette étude confirment que la délétion δ intervient avant la recombinaison Vα-Jα, et montrent que cette délétion implique la j onction de l ' élément δRec avec différents segments AJ. Ces auteurs ont également montré, à partir d ' ADN provenant d ' un échantillon de thymus humain, que δRec-1 se recombine avec AJ 61 , 60 , 59, 58 et 57.
La diversité j onctionnelle résultant de l ' apprêtement des extrémités codantes est une des caractéristiques essentielles du processus de recombinaison V (D) J, à l ' origine de l ' immense diversité des TCR . En revanche, il est généralement admis que les RSS sont ligaturées sans être apprêtées/modifiées , et donc que les jonctions signal (JS ) portées par les TREC sont invariantes . Cette idée reste maj oritairement répandue , malgré quelques publications décrivant une diversité au niveau de certaines JS . Ainsi, Candéias et al ont montré qu ' une fraction significative (jusqu ' à 24% ) des j onctions signal résultant du réarrangement des gènes TCRB et TCRD chez la souris sont modifiées (Candéias , Muegge et al . 1996 ) . Un article plus récent , étudiant également les j onctions signal résultant des recombinaisons Vβ-Dβ, montre que l ' apparition de nucléotides N au niveau des j onctions signal dépend apparemment du locus Vβ utilisé pour la recombinaison, ce qui conduit les auteurs à suggérer que la configuration locale des chromosomes influe sur l ' accessibilité à la recombinase (Kanari, Nakagawa et al . 1998 ) . Ces articles restent toutefois limités au réarrangement de la chaîne β et, concernant l ' article de Candéias et al, également au réarrangement de la chaîne δ . Rien ne suggère que les mécanismes à l ' origine de la diversité des JS au niveau des réarrangements des chaînes β et δ agissent également pour les gènes codant pour la chaîne TCRα .
Le dogme dominant, selon lequel les j onctions signal ne possèdent pas de diversité j onctionnelle - dogme illustré notamment par la figure 5 de l ' article de synthèse récent de Jung et al . (Jung and Alt 2004 ) - n ' a jamais été remis en question concernant le réarrangement des gènes codant pour la chaîne TCRα . Au contraire, plusieurs auteurs ont récemment décrit des méthodes de quantification des TREC résultant de l ' excision des gènes TCRD, pour évaluer l ' activité thymique chez des patients , basées sur l ' amplification en temps réel de la j onction signal δRecl/AJβl , en utilisant une sonde recouvrant cette j onction signal (Hochberg, Chillemi et al . 2001 ; Schônland, Zimmer et al . 2003 ) , ou située juste en bordure (Hazenberg, Otto et al . 2000) . Le choix d ' une telle sonde indique que ces auteurs sont convaincus que cette j onction signal est invariante . Ces méthodes , comme celle décrite par Douek et al . ( 1998 ) , sont mises en œuvre pour quantifier la production de nouveaux lymphocytes T par le thymus .
Dans certaines situations , il peut être intéressant de déterminer le niveau d ' hétérogénéité des lymphocytes T circulants . Ceci peut être utile pour détecter des insuffisances du système immunitaire (moins ou pas de production de nouveaux lymphocytes ) en raison de déficits immunitaires acquis ou congénitaux . Par exemple, la présence d ' une population clonale ou pauci- clonale peut être le signe d ' une réaction immunitaire en cours de - développement , soit contre des cellules tumorales , soit en réponse à une infection . Il est également utile de connaître le niveau d ' hétérogénéité des lymphocytes T circulants pour suivre la reconstitution du système immunitaire après greffe de cellules hématopoiétiques (moelle osseuse ou cellules souches ) . En effet, cette reconstitution entraîne la production de novo de lymphocytes , avec éventuellement possibilité d ' expansions clonales en raison de réactions du greffon contre l ' hôte (GvH) ou de rej et de greffe . La présence d ' une population clonale ou pauci-clonale serait alors la marque de l ' expansion anormale d ' un pool lymphocytaire particulier, ce qui peut être révélateur d ' une GvH ou d ' un rejet .
Plusieurs méthodes visant à déterminer la diversité d ' une population de lymphocytes T ont déj à été décrites . La plupart d ' entre elles sont passées en revue dans l ' article de synthèse de Hodges et al (Hodges , Krishna et al . 2003 ) .
Au niveau cellulaire, il est possible d ' analyser la diversité d ' une population lymphocytaire par cytométrie de flux (FACS) , en utilisant une batterie d ' anticorps monoclonaux dirigés contre les produits des différents gènes Vβ (région Vβ) . Par comparaison avec des valeurs normales , ce test permet de déterminer si la distribution des lymphocytes est ou non altérée . Néanmoins , l ' expression d ' une région Vβ ne représente qu ' un des paramètres caractéristiques d ' un lymphocyte donné car, comme exposé plus haut, les gènes codant pour la chaîne TCRβ sont réarrangés et exprimés avant ceux codant pour la chaîne TCRα, ces deux périodes de réarrangement étant séparées par une intense prolifération des lymphocytes exprimant une chaîne TCRβ . Il n ' existe que peu d ' anticorps dirigés contre les produits des gènes Va, rendant les analyses de ce paramètre par FACS impossibles . L ' analyse par cytométrie de flux de la diversité des TCR est donc au mieux seulement indicative de l ' homogénéité d ' une population de lymphocytes T : elle ne concerne que l ' expression des gènes Vβ, sans même prendre en compte la diversité j onctionnelle des CDR3 des chaînes TCRβ . En outre, cette analyse nécessite une quantité importante de cellules (au minimum quelques millions de lymphocytes T) .
Au niveau moléculaire, il est possible d ' analyser la structure des gènes TCRA et TCRB exprimés par les lymphocytes T par différentes techniques basées sur la PCR, en amplifiant les gènes réarrangés soit à partir de transcrits , soit à partir d ' ADN génomique . La séquence complète des loci TCRB et TCRA étant disponible, il est possible de choisir des amorces oligo- nucléotidiques spécifiques de chaque gène (ou famille de gènes ) BV et ADV, des gènes BJ et AJ, et des gènes BC et AC codant pour les différents domaines des chaînes TCRβ et TCRα, respectivement . A partir de transcrits, on peut donc analyser les réarrangements des différentes familles ADV et BV par PCR quantitative en temps réel . La comparaison pour chaque famille ( 41 familles ADV et 30 familles BV, chez l ' homme) avec le profil d ' expression obtenu à partir d ' échantillons contrôles permet de déterminer si un ou plusieurs gènes sont sur-représentés , indiquant une expansion lymphocytaire . Ce test permet de définir le niveau d ' expression de chaque famille ADV ou BV dans un échantillon donné . Il ne donne cependant aucune information quant à la diversité des réarrangements de chaque gène ou famille de gènes ADV ou BV.
Touj ours à partir de transcrits , un test de type "immunoscope" (élongation d ' amorce marquée) permet de déterminer la distribution des tailles des CDR3 des gènes TCRA et TCRB réarrangés (Demande internationale WO 02/084567 ) . Ce test nécessite la réalisation de deux réactions de PCR pour chaque famille : la première pour amplifier les transcrits utilisant un gène ADV ou BV donné et obtenir assez de matériel, la deuxième pour produire, par élongation d ' une amorce marquée, de l' ADN simple brin marqué qui sera ensuite déposé sur un gel d ' acrylamide . Ce test permet d ' analyser l ' hétérogénéité des CDR3 des chaînes TCRα et TCRβ exprimées dans la population analysée . En revanche , il ne permet pas de déterminer la distribution des différents gènes ADV et BV dans la population analysée . Les tests décrits ci-dessus sont relativement lourds à mettre en œuvre, car ils nécessitent la préparation d 'ARN, puis la synthèse d 'ADNc à partir de l' échantillon, ainsi que la réalisation d ' un nombre important de réactions de PCR pour analyser toutes les familles ADV et BV. De plus , le travail à partir d' ARN nécessite la mise en place de précautions élaborées pour prévenir sa dégradation, et donc maintenir la représentativité de l ' échantillon .
Une autre méthode visant à déterminer la diversité des lymphocytes T circulants est décrite dans la Demande de Brevet US 2003/0228586. Dans cette Demande, Sekaly et al . proposent d' analyser les cercles d' excision générés lors du réarrangement des gènes codants pour la chaîne TCRβ . La diversité observée par Sekaly et al . est limitée à la diversité combinatoire des réarrangements ; la possibilité d' observer une diversité j onctionnelle, lors d' un réarrangement donné, n' est nullement évoquée .
Les méthodes décrites à ce j our pour déterminer la diversité d ' une population de lymphocytes reposent donc toutes sur l ' analyse des réarrangements des gènes TCRB et, éventuellement, TCRA. Aucune de ces méthodes ne prend en compte le réarrangement qui conduit à l' inactivation du locus TCRD . A cet égard, il est connu que le réarrangement de δRec-1 intervient après le réarrangement des gènes TCRB, mais avant le réarrangement TCRA, durant la différenciation des lymphocytes T. La recombinaison au niveau de δRec-1 est considérée comme l ' événement initiateur de la recombinaison des gènes TCRA. Ce réarrangement excise du locus les gènes DD, DJ et DC codant pour une chaîne TCRδ et empêche ainsi la recombinaison et l ' expression des gènes codant pour une chaîne TCRδ . Il engage ainsi définitivement les lymphocytes T dans la voie αβ . L ' analyse de ce réarrangement permettrait donc de déterminer spécifiquement la diversité des lymphocytes T αβ , en excluant les T γδ .
Les inventeurs ont maintenant démontré que : - outre le réarrangement de δRecl avec un gène AJ, qui conduit à l' excision de l' intégralité du locus TCRD, il existe d' autres réarrangements conduisant à 1' inactivation des gènes TCRD . Les inventeurs ont notamment observé, chez la souris, des réarrangements δRec-l/DJ2 et DD/AJ, qui conduisent à l ' excision, respectivement , de tous les gènes DD, et du gène DC, rendant ainsi impossible l' expression d' une chaîne TCRδ . - chez l ' homme comme chez la souris , δRec-1 se réarrange non seulement avec AJ61, mais également avec (au moins ) AJ58 , AJ57 et AJ56. Chez l ' homme, δRec-1 se réarrange également avec au moins AJ60 et AJ59. chez l ' homme comme chez la souris , les j onctions signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec un gène AJ ne sont pas invariantes . Une proportion significative (de 10 à 30% ) des jonctions montre des signes d ' apprêtement (aj out de nucléotides par la TdT et/ou délétion de quelques bases) des extrémités signal avant ligation . Il en résulte qu ' il est possible de déterminer un profil caractéristique d ' hétérogénéité de j onction signal pour chaque type de réarrangement δRec- 1/AJ.
Ces nouveaux résultats impliquent qu ' il existe une diversité combinatoire et j onctionnelle au niveau des j onctions signal présentes sur les TREC résultant de l ' excision de gènes TCRD. Ces cercles d' excision constituent donc un nouveau critère pour analyser la diversité des lymphocytes T dans un échantillon . Ce critère, absent des méthodes actuelles d' analyse de la diversité des lymphocytes T, décrites plus haut, est particulièrement intéressant , car l' excision des gènes TCRD intervient après le réarrangement des gènes TCRB, mais avant le réarrangexnent TCRA, durant la différenciation des lymphocytes T . En particulier, les inventeurs ont démontré que la jonction signal produite lors de la recombinaison de δRec-1 constitue, au même titre que la j onction des gènes TCR, un élément de la signature moléculaire d' un lymphocyte T, et que le réarrangement de l' élément δRec-1 génère un répertoire de j onctions signal présentant à la fois une diversité combinatoire et une diversité j onctionnelle .
Un avantage particulier lié à l ' analyse des j onctions signal résultant de l' excision de tout ou partie du locus TCRD est que ces j onctions sont portées par un cercle d ' excision qui ne se réplique pas durant la prolifération cellulaire . Elles ne subissent donc aucune des variations dues aux événements sélectifs qui façonnent le répertoire des lymphocytes T en fonction de la spécificité antigénique de leurs TCR. Ce réarrangement est donc un marqueur moléculaire caractéristique de l ' émergence de nouveaux lymphocytes T dans le thymus , avant que le répertoire des TCR ne soit mis en place . Un tel marqueur, qui n ' est ensuite modifié ni qualitativement, ni quantitativement, permet d' analyser, à partir de lymphocytes T périphériques, des événements qui se sont déroulés lors de l ' émergence de nouveaux lymphocytes T dans l' organisme (notamment dans le thymus ) .
La présente invention porte donc en premier lieu sur un procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique d ' un patient humain ou d ' un animal, caractérisé en ce qu ' il comprend une étape d ' analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diversité j onctionnelle des cercles d ' excision (TREC) résultant de l ' excision de tout ou partie du locus TCRD, lors de la recombinaison V (D) J. Ce procédé peut avantageusement être mis en œuvre en analysant la diversité combinatoire et/ou la diversité j onctionnelle des cercles d ' excision (TREC) résultant du réarrangement de δRec-1. Les patients pour lesquels ce procédé sera particulièrement utile sont ceux pour lesquels un défaut du système immunitaire ou une maladie ayant des répercussions sur le système immunitaire est soit soupçonné, soit avéré, ainsi que les receveurs d' une greffe de cellules hématopoïétiques, pour lesquels on souhaite suivre la reconstitution du système immunitaire . Ce procédé peut être utilisé en complément du procédé d ' analyse par cytométrie de flux décrit plus haut, mais il peut également être utilisé indépendamment . Il permet d ' analyser simplement un stade de réarrangement plus tardif que le réarrangement de TCRB, et beaucoup moins compliqué que le réarrangement de TCRA.
Le procédé de l ' invention peut aussi être utilisé chez l ' animal . Un exemple de mise en œuvre chez la souris est décrit ci-dessous , mais ce procédé est également transposable à d ' autres animaux, en particulier aux mammifères tels que les bovins , le singe, le porc, le chat, le chien, le poulet... Le procédé de l ' invention peut être utile à des fins expérimentales , pour étudier des modèles animaux de pathologies impliquant le système immunitaire . A ce titre, on peut citer les infections par les virus d' immunodéficience simien ( SIV) ou félin (FIV) , qui constituent des modèles animaux de l' infection par HIV chez l ' homme . Des données de séquences ont été publiées pour certaines espèces de singes , et montrent des séquences de RSS δRec-1 et AJ très proches de celles de l' homme et de la souris . Le procédé de l ' invention est donc directement applicable au singe . Le singe est utilisé comme modèle animal pour étudier différentes pathologies humaines . Parmi ces pathologies , on peut citer les infections, notamment par le virus de l ' hépatite C, ou par le virus d' immunodéficience (HIV chez l ' homme, SIV chez le singe) . Dans ce cadre, le procédé ci-dessus peut être utilisé pour étudier, à partir de biopsies, la diversité des lymphocytes T présents à différents stades de l ' infection, correspondant par exemple au recrutement, puis à la prolifération des lymphocytes T . La biopsie sera choisie par l' homme du métier de façon à refléter l' évolution de la pathologie et/ou de la réponse immunitaire . Ainsi, pour étudier la réponse immunitaire au cours d' une infection par le virus de l' hépatite C, les biopsies seront avantageusement effectuées dans le foie .
Le procédé de l ' invention peut être mis en œuvre à partir de n ' importe quel échantillon biologique comportant des lymphocytes T . A titre d ' exemples non limitatifs d ' échantillons biologiques utilisables , on peut citer des échantillon de sang total, de cellules mononucléées totales , une biopsie contenant des lymphocytes T, ou encore une population de lymphocytes T triés par cytométrie de flux sur la base de l ' expression de différents marqueurs membranaires, y compris leur TCR ou une région VR donnée .
Dans une mise en œuvre préférée du procédé de l ' invention, la diversité combinatoire des cercles d ' excision résultant du réarrangement de δRec-1 est analysée en effectuant au moins trois réactions d ' amplification d' un fragment des cercles d' excision, chaque réaction d ' amplification étant spécifique d ' une j onction signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec une région AJ susceptible d ' être ligaturée avec δRec-1. Les inventeurs ont montré que ces régions AJ sont essentiellement les régions AJ61 (aussi notée ψJα) , AJ58 , AJ57 , et AJ56. Il peut également s ' agir des régions AJ60 et AJ59. Bien entendu, dans cette mise en œuvre de l ' invention, les réactions d ' amplification visent des réarrangements avec au moins 3 , de préférence 4 , et éventuellement 5 ou 6 régions AJ distinctes . Il est important de noter également que l ' analyse de j onctions signal correspondant à d' autres réarrangements n ' est pas exclue des procédés selon l ' invention, dans une perspective d' étude plus exhaustive de la diversité d ' une population de lymphocytes T . En effet, δRec-1 peut se réarranger au moins jusqu' à AJ18 chez la souris (des jonctions signal résultant de ce réarrangement ont été mises en évidence) , et au moins jusqu' à AJ2 chez l' homme (des j onctions codantes résultant de ce réarrangement ont été mises en évidence) .
Dans le procédé ci-dessus, le terme "réaction d ' amplification" fait référence à n ' importe quelle méthode d ' amplification d ' acides nucléiques connue de l ' homme du métier . On peut citer, à titre d' exemples et de façon non restrictive , l 'Amplification en Chaîne par Polymérase (ACP) , plus souvent désignée par l ' homme du métier sous son acronyme anglophone, PCR ( Polymérase Chain Reaction) , la TMA ( Transcription Mediated Amplification) , la NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification) , la 3SR ( Self Sustained Séquence Replication) , l ' amplification par déplacement de brin, ou SDA (Strand Displacement Amplification) et la LCR (Ligase Chain Reaction) .
Selon une mise en œuvre préférée du procédé de l ' invention, les réactions d ' amplification d ' acide nucléique sont des réactions d ' amplification en chaîne par polymérase (PCR) , effectuées avec des couples d ' amorces constitués chacun d ' une amorce spécifique de δRec-1 et d ' une amorce spécifique d ' une région AJ choisie parmi AJβl , AJ60 , AJ59 , AJ58 , AJ57 , et AJ56. Ces réactions sont effectuées de préférence dans des tubes séparés . Quelle que soit la technique utilisée pour réaliser les réactions d ' amplification, l ' analyse des résultats consiste à examiner quelles réactions ont permis d ' obtenir un produit d ' amplification . Elles correspondent aux réarrangements présents dans la population de lymphocytes examinée , alors que l ' absence d ' amplification d ' une j onction signal entre δRec-1 et une région AJ donnée indique que le réarrangement correspondant est absent de cette population . Bien entendu, des contrôles positifs sont de préférence utilisés lors de la mise en œuvre du procédé de 1 ' invention . Le cas échéant, l ' amplification peut être suivie en temps réel, par exemple en réalisant des PCR quantitatives . Ceci permet de quantifier les TREC présents dans l ' échantillon biologique et, si ce dernier est approprié (par exemple, un échantillon de sang) , d ' évaluer la quantité de lymphocytes T récemment produits par le thymus . Des méthodes de quantification de la synthèse récente de lymphocytes T, basées sur la quantification des TREC dans un échantillon biologique, sont notamment décrites dans les articles de Schônland et al, Hazenberg et al, et Hochberg et al, cités plus haut . Toutefois , ces auteurs utilisent, pour quantifier les TREC présents dans un échantillon, une sonde située soit sur la j onction signal δRec-l/AJ61, soit en bordure immédiate de cette j onction . Une telle sonde ne permet donc de détecter efficacement que les JS non modifiées (dans le cas de la sonde en bordure de la JS, elle permet également de détecter les JS modifiées uniquement de l ' autre côté de la j onction) . Ceci peut peut-être expliquer la dispersion des résultats observés par ces auteurs, même chez les suj ets sains (voir notamment la Figure 1 de l ' article de Hochberg et al) . L' utilisation d' une sonde capable de s ' hybrider avec les TREC portant des JS modifiées permettra de réduire cette dispersion, et donnera donc des résultats plus faciles à interpréter par le clinicien . II est donc proposé,, selon un aspect de la présente invention, une méthode pour évaluer la production récente de lymphocytes T en quantifiant les TREC dans un échantillon biologique approprié,. en utilisant une sonde distante d ' au moins 5 à 10 , et de préférence au moins 15 nucléotides de la j onction signal résultant du réarrangement parfait ( sans modification) de δRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ60 , AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56. Cette méthode est avantageusement mise en œuvre en quantifiant les TREC résultant du réarrangement de δRec-1 avec au moins 2 , 3 , ou 4 régions AJ différentes . Cette quantification peut bien entendu être menée en complément de l ' analyse, selon l ' invention, de la diversité combinatoire et/ou j onctionnelle des cercles d ' excision . Selon cet aspect de l' invention, la distance entre la sonde et la j onction signal est mesurée par rapport à la "j onction" proprement dite entre les deux RSS fusionnées , donc par rapport au centre du motif GTGCAC résultant du réarrangement parfait δRec-1/AJ, lorsque ce motif est créé .
Un autre aspect important de l ' invention est l ' analyse de la diversité j onctionnelle au niveau des j onctions signal présentes sur les cercles d ' excision (TREC) résultant du réarrangement de δRec-1. En effet , les inventeurs ont mis en évidence qu ' une proportion significative de ces jonctions signal , allant jusqu ' à 40% , présente des "imperfections" , et notamment des additions de nucléotides N . Cette propriété, insoupçonnée avant les travaux exposés ci-dessous , peut également être exploitée pour déterminer le degré d ' hétérogénéité d ' une population de lymphocytes T . Ainsi, l ' invention porte également sur un procédé pour déterminer la diversité d ' une population de lymphocytes T présents dans un échantillon, comprenant au moins une étape d ' analyse de la diversité j onctionnelle d ' au moins une j onction signal δRec-1/AJ. De préférence, la diversité j onctionnelle de la j onction signal la plus fréquente , c ' est-à-dire la j onction δRec-1/AJβl , est examinée . De manière encore préférée, l ' analyse de la diversité j onctionnelle des JS est effectuée en complément de l ' analyse de la diversité combinatoire décrite ci-dessus .
Comme décrit ci-dessus , les j onctions signal correspondent à la fusion des RSS bordant les fragments réarrangés . Ces RSS sont constituées d ' un heptamère conservé et d ' un nonamère semi-conservé, séparés par 12 ou 23 bases . Les trois premières bases de l ' heptamère présentent un degré de conservation très élevé, si bien que la grande maj orité des RSS commencent par un triplet CAC . De ce fait , la ligature "parfaite" de deux RSS, par NHEJ, lors de la création d ' une jonction signal, génère une séquence 5 ' -GTGCAC-3 ' , qui correspond au site de restriction de l ' enzyme ApaLl . Ceci permet de distinguer facilement les j onctions signal n ' ayant subi aucune addition ni délétion, car elles sont sensibles à la restriction par ApaLl , contrairement aux j onctions signal modifiées .
Certaines RSS présentent toutefois des variations par rapport aux séquences conservées . Ceci est le cas , notamment des RSS de AJ60 , chez l ' homme et chez la souris , et de AJ59 , chez la souris . L ' analyse de la diversité j onctionnelle au niveau des j onctions signal impliquant ces RSS nécessite donc d ' utiliser d ' autres techniques, par exemple de séquencer les j onctions en question . Selon un mode de réalisation préféré des procédés de l ' invention impliquant une analyse de la diversité j onctionnelle au niveau des JS , l ' analyse de la diversité j onctionnelle comprend donc, pour chaque j onction signal δRec-1/AJ analysée, une étape d ' amplification d ' un fragment du cercle d ' excision, comportant la j onction signal en question . Cette amplifi- cation est de préférence suivie, pour chaque j onction signal , δRec-1/AJ analysée résultant du réarrangement de δRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJβl, AJ59 , AJ58 , AJ57 , et AJ56 chez l ' homme, ou AJβl, AJ58 , AJ57 , et AJ56 chez la souris , d ' une étape d ' analyse du profil de restriction par ApaLl du fragment amplifié . Différentes techniques pour analyser un profil de restriction d ' un fragment d' ADN donné, par une enzyme déterminée, sont bien connues de l ' homme du métier . Bien entendu, le fragment est incubé en présence de l ' enzyme dans un tampon ad hoc. Le résultat de la digestion peut ensuite être analysé par migration sur gel d ' agarose et visualisation par n ' importe quelle technique disponible, par exemple par coloration au bromure d ' éthydium (BET) ou au SybrGreen®, ou encore par transfert sur membrane et hybridation avec une sonde marquée (radioactive , couplée à la peroxydase, au Texas Red® ou autre) .
Lorsque l ' analyse de la diversité j onctionnelle intervient en complément de l ' analyse de la diversité combinatoire des TREC, le même produit d ' amplification d ' un fragment du TREC peut être utilisé pour les deux aspects .
L ' interprétation du résultat de la digestion du fragment par ApaLl est la suivante : si le fragment est complètement digéré, cela signifie que toutes les JS correspondant à la j onction δRec-1/AJ analysée sont identiques et correspondent à la JS "canonique" , non modifiée; si le fragment est complètement résistant à la restriction par ApaLl , toutes les JS correspondant à la jonction δRec-1/AJ analysée sont modifiées (ce qui ne signifie pas qu ' elles sont identiques ) ; le profil hybride ( fragment partiellement sensible à ApaLl ) est indicatif de la présence, dans l ' échantillon étudié , d ' au moins deux populations de lymphocytes comportant des TREC résultant du réarrangement de δRec-1 avec la région AJ analysée, l ' une comportant une JS modifiée et l ' autre non .
Dans le cas où une modification est mise en évidence par l ' apparition d ' un fragment résistant à ApaLl, ainsi que pour les JS qui ne présentent pas de site de restriction ApaLl , même en l ' absence de modification (par exemple, les JS δRec-l/AJ60 ) , il peut être intéressant d' effectuer une analyse qualitative des j onctions signal , notamment pour déterminer si la population des lymphocytes portant des TREC résistants à la restriction par ApaLl est homogène ou non . Par "analyse qualitative" , on entend une analyse permettant de déterminer la nature ( addition, délétion, substitution) des modifications apportées aux extrémités avant leur ligature pour former la j onction signal . Des procédés tels que décrits ci-dessus , comportant en outre une étape d ' analyse qualitative des jonctions signal résistantes à la restriction par ApaLl , font donc également partie de la présente invention . Cette analyse qualitative peut être effectuée par différentes techniques connues de l ' homme du métier, telles que le séquençage , ou l ' extension d ' amorce marquée . Elle est de préférence effectuée à partir des seuls fragments totalement ou partiellement résistants à ApaLl , mais le cas échéant, dans une perspective d ' automatisation, elle peut être effectuée de façon systématique sur tous les fragments .
Un procédé particulier selon l ' invention comprend les étapes suivantes : a . préparation de l 'ADN à partir de l ' échantillon biologique ; b . réalisation d ' au moins 3 ou 4 PCR, à l ' aide de couples d ' amorces dont chacun est constitué d ' une amorce spécifique de δRec-1 et d' une amorce spécifique d ' une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ58 , AJ57 , et AJ56 ; c . restriction des produits des PCR avec l ' enzyme de restriction ΛpaLl ; d. analyse des profils de restriction obtenus à l ' étape c . e . le cas échéant, analyse qualitative des j onctions signal résistantes à la restriction par ApaLl , par extension d ' amorce marquée .
A l ' étape "a" de ce procédé, la préparation de l 'ADN peut être effectuée par n ' importe quelle technique connue de l ' homme du métier, telles que les techniques décrites au chapitre 6 du manuel de Sambrook et Russel {Molecular Clonlng, 3eme édition, CSHL press ) , ou en utilisant des trousses de préparation d ' ADN disponibles dans le commerce . Une étape intermédiaire peut, le cas échéant , être effectuée entre les étapes "b" et "c" de ce procédé, consistant à analyser les produits des amplifications réalisées à l ' étape "b" , par exemple par migration sur gel d' agarose et coloration. Cela permet de restreindre l ' analyse des profils de restriction par ApaLl aux seules j onctions pour lesquelles un fragment a effectivement été amplifié .
Comme mentionné plus haut, la formation des j onctions signal est assurée par des protéines ubiquitaires participant à la réparation de l 'ADN . Il est donc probable que si l ' une de ces protéines n ' est pas complètement fonctionnelle, la proportion de j onctions signal modifiées augmentera . Les procédés décrits ci- dessus peuvent donc être utilisés pour détecter un éventuel désordre du mécanisme de réparation de l 'ADN, qu' il s' agisse d' un défaut touchant une des enzymes impliquées dans la réparation par recombinaison non homologue [NHEJ) , ou d' un facteur agissant en amont ou en aval de la recombinaison non homologue . Un autre aspect de l ' invention est une trousse de réactifs pour déterminer la diversité des lymphocytes T présents dans un échantillon biologique, par un procédé tel que ceux décrits ci-dessus . Une telle trousse comprend un ensemble d ' au moins quatre amorces dont au moins une est spécifique de δRec-1 , et au moins trois sont spécifiques chacune d ' une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJβl , AJ60, AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56. Selon une réalisation particulière, une telle trousse comprend un ensemble d' au moins cinq amorces dont au moins une est spécifique de δRec-1 , au moins une est spécifique de AJ61 , et au moins trois sont spécifiques chacune d ' une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJ60, AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56. Dans les trousses décrites ci-dessus , ces amorces sont bien sûr choisies de façon à permettre l ' amplification par PCR des j onctions signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec les régions AJ sélectionnées . Parmi les réactifs additionnels éventuellement présents dans les trousses de l ' invention, on peut citer les divers tampons et/ou enzymes nécessaires aux réactions d ' amplification et/ou à la digestion par ApaLl, des échantillons pouvant servir de contrôles aux réactions d ' extractions de l ' ADN et/ou d ' amplification et/ou de restriction, etc .
A titre d' amorces et sondes utilisables dans les procédés et trousses de l ' invention, on peut citer les oligonucléotides suivants :
Tableau 1 : Amorces et sondes pour amplifier des jonctions signal chez l' homme
Tableau 2 : Amorces et sondes pour amplifier des jonctions signal chez la souris
Dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessus, les oligonucléotides dont le nom se termine par un "p" peuvent être utilisés comme sondes lorsqu ' ils sont marqués, mais peuvent également être utilisés comme amorces , notamment pour effectuer des PCR nichées ou semi-nichées ( c ' est-à-dire, à partir d ' un produit amplifié par PCR, en utilisant deux ou une amorce ( s ) , respectivement , internes au produit de la première amplification) .
Outre les dispositions qui précèdent , l' invention comprend encore d' autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se réfère à des exemples de mise en œuvre du procédé obj et de la présente invention ainsi qu' aux dessins annexés, dans lesquels :
Figures 1 et 2 : Schémas explicatifs de la recombinaison V ( D) J. Figure 3 : Analyse par Amplification et digestion par ApaLl des j onctions signal présentes dans une population de lymphocytes T isolée d ' un patient .
Les j onctions signal δRec-l/AJ61 , δRec-l/AJ58 et δRec-l/AJ57 ont été amplifiées à partir d 'ADN extrait des lymphocytes périphériques CD4+CD8+Vβl+ (triés par
FACS ) d ' un patient et d ' un échantillon de thymus humain
(contrôle polyclonal) . Les produits de PCR, non digérés
(pistes 1 , 3 et 5 ) et digérés (pistes 2 , 4 et 6) par
ApaLl ont été séparés sur gel d ' agarose, puis transférés sur une membrane de Nylon et hybrides avec une sonde radioactive spécifique de δRec-1.
Chez le patient , seules les amplifications δRec-l/AJ61 et δRec-l/AJ58 (pistes 1 et 3 ) donnent un produit, alors que chez le contrôle, les 3 réactions sont positives (pistes 1 , 3 et 5 ) . La diversité du répertoire des jonctions signal δRec-1 est donc réduite chez le patient . De plus , les j onctions signal δRec-l/AJ61 et δRec-l/AJ58 amplifiées chez le patient sont entièrement résistantes à la digestion par l ' enzyme de restriction ApaLl (pistes 2 et 4 ) , ce qui indique que les extrémités signal des gènes réarrangés ont été remaniées avant d ' être ligaturées . En revanche, toutes les jonctions signal amplifiées à partir de l' ADN contrôle contiennent à la fois des produits sensibles et des produits résistants à la digestion (pistes 2 , 4 et 6 ) . Les j onctions amplifiées chez le patient sont donc moins diversifiées que dans l' échantillon contrôle, puisqu ' elles ne comprennent pas de j onctions non modifiées . Les lymphocytes CD4+CD8+Vβl+ isolés chez le patient possèdent donc un répertoire de réarrangements δRec-1 réduit : il y a moins de réarrangements δRec-1, et leur diversité j onctionnelle est restreinte, par rapport à un échantillon polyclonal contrôle .
Figure 4 : Analyse de la diversité des jonctions δRec-l/AJ58 Afin de déterminer si le produit de PCR δRec-
1/AJ58 (résistant à la digestion par ApaLl ) amplifié à partir de la population CD4+CD8+Vβl+ du patient contient une ou plusieurs espèces moléculaires , une analyse de diversité a été effectuée . Le produit de PCR δRec-l/AJ58 a servi de matrice dans une réaction de PCR destinée à produire de l ' ADN simple brin marqué à partir d ' une amorce δRec-1 couplée au Texas Red®. Cet ADN simple brin a ensuite été déposé sur un gel d ' acrylamide, avec le produit correspondant amplifié à partir de l' échantillon contrôle . Cette méthode permet de séparer les différentes espèces moléculaires selon leurs longueurs, chaque taille donnant un pic de fluorescence . Dans l ' échantillon contrôle (courbe en trait plein) , on observe un pic majoritaire à la taille attendue pour une j onction non modifiée . Ces espèces moléculaires correspondent en grande partie aux j onctions sensibles à la digestion par ΛpaLl . On observe également plusieurs pics correspondant a des tailles supérieures , qui représentent des espèces moléculaires comprenant des j onctions modifiées au moins par addition de nucléotides (encadrés ) . Ces pics correspondent aux j onctions modifiées présentes dans ce produit de PCR, résistantes à la digestion par ApaLl .
Dans le produit de PCR δRec-I/AJ58 amplifié à partir de la population CD4+CD8+Vβl+ du patient, on observe un seul pic . Ce produit ne contient donc qu ' une seule espèce moléculaire . Il migre à la position correspondant à la taille attendue pour une j onction non modifiée, bien qu ' il soit résistant à la digestion par ApaLl (voir figure 1 ) . On peut donc en conclure que cette j onction a été modifiée par délétion puis aj out de nucléotide ( s ) .
Figure 5 : Mise en évidence des modifications N au niveau des JS ADV/AJ
Les jonctions signal résultant des réarrangements de ADV2 et ADV8 avec AJ61 , AJ58 , AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d ' ADN de thymocytes de souris C57BL/6 (wt) et déficientes en TdT (TdT) . Les produits des PCR ont été digérés (+) ou non (-) par Apahl avant migration sur gel et hybridation avec des sondes AJ internes .
Figure 6 : Résultat du séquençage des j onctions signal ADV2 /AJ à partir d ' échantillons de souris sauvages et de souris TdT0/0.
* indique deux séquences présentant la même j onction mais utilisant des gènes ADV2 différents ; Λ et A A indiquent deux séquences ayant la même j onction amplifiées à partir d' ADN de thymocytes de deux souris différentes .
Figure 7 : Résultat du séquençage des jonctions signal murines DV102/DD2 et ADV2/DD2.
Figure 8 : Analyse de jonctions signal δRec-1 /AJ humaines
Des échantillons d 'ADN de thymocytes de deux patients âgés de 10 j ours (A) et 6 j ours (B) ont été utilisés pour amplifier les JS résultant du réarrangement de δRec-1 avec AJ61 , AJ58 , AJ57 et AJ56. Une fraction des produits PCR a été digérée par ApaLl ; les produits digérés et non digérés ont ensuite été séparés sur gel d' agarose, transférés sur une membrane de nylon et hybrides avec une sonde δRec-1 radiomarquée . Figure 9 : Amplification et analyse des j onctions signal produites lors de la recombinaison de hδRec-1 avec les gènes AJ61 , 60 , 59 , 58 , 57 et 56 dans un échantillon d'ADN de thymocytes (A) et 4 échantillons d' ADN de leukocytes purifiés à partir du sang (B, C, D et E) de 4 patients différents .
Les j onctions signal ont été amplifiées par PCR puis analysées sur gel d' agarose sans ( -) ou après (+) une digestion préalable par l' enzyme de restriction ApaLl . Après transfert sur membrane de nylon, les produits sont révélés par l' hybridation d' une sonde radioactive spécifique de hδRec-1.
Pour les échantillons Thy et PBL#1 (A et B) , l' astérisque indique la position d' une bande correspondant à une j onction signal hδRec-l/AJ59, que l ' on peut parfois amplifier avec l ' oligonucléotide spécifique de AJ60 en raison de la proximité de ces gènes .
Le profil des produits obtenus est différent dans chaque échantillon de leukocytes sanguins , indiquant la diversité des répertoires chez ces patients .
Figure 10 : Résultat du séquençage des j onctions signal δRec-1/AJ résistantes à la restriction par ApaLl , pour les réarrangements de hδRec-1 avec AJ61 , AJ59 , AJ58 , AJ57 et AJ56, et des j onctions signal totales , pour les réarrangements hδRec-l/AJ60 présentes dans un échantillon humain .
Figure 11 : Amplification des JS résultant du réarrangement de δRec-1 avec AJ61 , AJ58 , AJ57 et AJ56, à partir d ' ADN de thymocytes murins . Les produits PCR ont été séparés sur un gel d ' agarose , puis transférés sur une membrane de nylon et hybrides avec une sonde δRec-1 radiomarquée .
Figure 12 : Résultat du séquençage des j onctions signal δRec-l/AJ61 présentes dans un échantillon murin .
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d' illustration de l' obj et de l' invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation . EXEMPLES
Exemple 1 : détermination du degré d' hétérogénéité d' une population de lymphocytes T chez un patient l .A. Mode opératoire l . A. l . Préparation de l 'ADN
Pour l ' extraction de l' ADN le kit d ' extraction nucleospln tissue de Machery Nagel® a été utilisé, en suivant les instructions fournies .
• Les cellules sont culottées par 5 minutes de centrifugation à 1200 rpm (correspondant à 300 g) . Le culot sec (j usqu ' à 10 millions de cellules) est repris dans 185 μl de tampon de lyse Tl mélangé à 25μl de protéinase K fournie dans le kit .
L ' échantillon est vigoureusement vortexé et mis à digérer toute la nuit à 56°C .
• 200 μl de tampon B3 sont ensuite aj outés, le lysat est vortexé et mis à incuber à 700C pendant 10 minutes
• 210 μl d ' éthanol absolu sont aj outés et l' ensemble est déposé sur une colonne fournie dans le kit
La colonne est vortexée à 11000 g pendant une minute ( fixation de l' ADN sur la silice)
La colonne est ensuite lavée avec 500 μl de BW puis 600 μl de B5 avec une centrifugation de 1 minute à 11000 g à chaque fois La silice est séchée par centrifugation de 3 minutes à 11000 g
• L 'ADN est ensuite élue avec un volume de 50 à 200 μl de BE selon la quantité de cellules lysées au départ . Pour cela, le BE préchauffé à 700C est déposé sur la colonne et l ' ensemble est incubé 2 minutes à 70 °C dans une étuve . L ' ADN est récupéré par centrifugation de 1 minute à 11000 g l . A.2. Amplification des Jonctions Signal Cette étape a pour but d ' amplifier par PCR les j onctions signal d ' intérêt, afin d ' obtenir assez de matériel pour étudier leur structure .
100 à 200 ng d 'ADN total sont utilisé pour chaque réaction de PCR. Selon l ' échantillon, une deuxième PCR (PCR nichée, ou nested PCR) peut être nécessaire .
Les amplifications sont réalisées à l ' aide de l ' enzyme TaqGold (Applied Biosystem) , dans le tampon "Master Mix" fourni . Des amorces spécifiques de δRec-1 (SEQ ID No : 1) d' une part, et de AJ61 (SEQ ID No : 3) , AJ58 ( SEQ ID No : 9) , AJ57 ( SEQ ID No : 11 ) et AJ56 ( SEQ ID No : 13 ) d' autre part, ont été utilisées . Ces amorces sont choisies de manière à amplifier les jonctions signal uniquement . Quatre réactions de PCR sont réalisées par échantillon .
Pour 25 μl de réaction •
ADN : 100 ou 200 ng
Master MIX 2X ; 12, 5 μl
Oligo sens à 5 μM : 2 μl
Oligo réverse à 5 μM : 2 μl
H2O : qsp 25 μl
Conditions de PCR : 10 ' à 94 °C
35 cycles comportant la séquence suivante :
30" à 94 °C, 30" à 6644 °°CC et 30 " à 720C,
10 ' à 72 °C . Deuxième PCR avec un oligonucléotide spécifique de la région AJ plus interne ( PCR nichée ) : SEQ ID No : 4 pour AJβl, SEQ ID No : 10 pour AJ58 , SEQ ID No : 12 pour AJ57 , et SEQ ID No : 14 pour AJ 56 et , touj ours , SEQ ID No : 1 pour δRec-1.
Pour 25 μl de réaction : Produit de la 1ère PCR : 4μl Master MIX 2X : 12 , 5 μl Oligo sens à 5 μM : 2 μl Oligo reverse à 5 μM : 2 μl H2O : qsp 25 μl
Conditions de PCR : 10 ' à 940C Ix
35 cycles comportant la séquence suivante : 30" à 94 °C, 30" à 64 °C et 30" à 72 °C, puis
10 ' à 72 °C .
Dépôt des produits de PCR sur gel d ' agarose . Une première indication du degré d ' hétérogénéité des lymphocytes contenus dans l' échantillon est obtenue à ce stade, selon que les 4 réactions sont positives ou non . l . A.3. Détection de la diversité des jonctions signal par digestion avec l 'enzyme ApaLl :
Cette étape a pour but de déterminer si les j onctions signal amplifiées à l ' étape précédente sont diversifiées . Les RSS des gènes choisis ( δRec-1, AJβl , AJ58 , AJ57 , AJ56) correspondent à la séquence RSS consensus et donc débutent par les 3 nucléotides GTG ou CAC . En conséquence, la ligature parfaite des deux RSS pour former une j onction signal crée un site ( 5 ' -GTGCAC- 3 ' ) reconnu par l ' enzyme de restriction ApaLl .
Une fraction importante ( jusqu ' à 30% ) des j onctions signal résultant de la recombinaison V ( D) J des gènes portés par le locus TCRAD ne sont pas formées par la ligature parfaite des RSS des gènes réarrangés , mais montrent des signes d ' apprêtement par délétion et/ou addition de nucléotides aux extrémités RSS avant ligature . La diversité j onctionnelle qui en résulte empêche la formation du site de restriction ApaLl , et ces j onctions modifiées sont donc résistantes à la digestion par cette enzyme . La présence de deux espèces moléculaires après digestion des produits de PCR par ApaLl , une sensible et une résistante, est donc indicative de la diversité des j onctions amplifiées . Cette diversité révèle la présence de lymphocytes T ayant réalisé des événements de recombinaison V (D) J différents .
Si au contraire seule une espèce moléculaire est détectée , alors la diversité de l' échantillon analysé est réduite par rapport à un échantillon contrôle .
La digestion est réalisée dans un volume final de 20 μl à 37 °C pendant 3h avec 5U d ' enzyme ApaLl .
Produit de PCR : 10 μl
Tampon de digestion 10X : 2 μl
Enzyme lOϋ/μl : 0 , 5 μl
H2O : 7 , 5 μl Un contrôle est réalisé dans les mêmes conditions , en omettant l ' enzyme de restriction :
Produit . de PCR : 10 μl
Tampon de digestion 1OX : 2 μl
H2O : 8 μl Séparation des produits digérés ou non par électrophorèse sur gel d ' agarose à 2% en tampon TBE IX en présence de BET .
L 'ADN est ensuite transféré par capillarité sur membrane de Nylon Hybond N+ (Amersham) , puis fixé sous UV ( 700 J) .
La membrane est ensuite préhybridée avec du Rapid Hyb buffer (Amersham) 30 min à 420C, puis hybridée à 420C pendant 4 heures avec une sonde oligonucléotidique spécifique de δRec-I marquée au 32P par incubation avec la polynucléotide kinase du phage T4 et de l 'ATPγ32P, dans les conditions indiquées par le fournisseur . La détection du signal radioactif se fait grâce à un phosphorimager . l . A.4. Analyse qualitative des jonctions signal humaines par extension d 'amorce marquée Cette technique permet de déterminer la longueur des différentes j onctions signal δRec-1/AJ amplifiées à partir d ' une population de lymphocytes T . Il est ainsi possible de déterminer qualitativement les modifications introduites au niveau de la j onction signal . La distribution des fragments obtenus permet d ' estimer la diversité de la population analysée . Cette méthode consiste à amplifier de l' ADN simple brin par PCR avec une amorce comportant un fluorochrome : le Texas- red . Ces fragments sont ensuite résolus sur un gel de polyacrylamide .
Volume final : 12, 5 μl avec le kit master Mix amplitaq GoId de Applied biosytem Produit de PCR : 0, 5 μl Master mix 2X : 6, 25 μl Oligo 1 μM : 0, 5 μl H2O : 5 , 25 μl
Cycles de PCR : 6 ' à 940C
12 cycles comportant la séquence suivante : 2 ' à 94 °C, l ' à 64 °C, et 7 ' à 72 °C, puis 12 ' à 72 °C .
9 μl de produit de PCR ont ensuite été mélangés avec 16 μl de formamide et 1 μl de marqueur fluorescent . Le mélange a été chauffé 5 ' a 96 °C, puis inj ecté dans un séquenceur ABI Prism 310. l . B . Résultats
L ' analyse par cytométrie de flux des lymphocytes T dans des prélèvements sanguins chez un patient a montré une distribution très altérée de l' utilisation des différents gènes Vβ . Les lymphocytes T de ce patient utilisent de manière très maj oritaire le gène Vβl . De plus , on a détecté chez ce patient une population de lymphocytes T inhabituelle, qui exprime à la fois les molécules CD4 et CD8. Les lymphocytes T de cette population utilisent aussi de manière quasi- exclusive le gène Vβl . Ces lymphocytes T CD4+CD8+Vβl+ ont été triés par cytométrie de flux et leur ADN préparé . Cet ADN a servi de matrice pour amplifier les j onctions signal δRec-l/AJ61, δRec-l/AJ58 , et δRec-l/AJ57 (la quatrième combinaison, δRec-l/AJ56, n' a pas été réalisée dans cet exemple) . Seules les amplifications δRec-l/AJ61 et δRec- 1/AJ58 ont donné un produit, alors qu ' un échantillon contrôle d 'ADN extrait de thymocytes totaux (population normalement diversifiée) a donné un produit pour les 3 réactions ( Fig 1 , pistes 1, 3 et 5 ) . Ce résultat indique que les lymphocytes T CD4+CD8+Vβl+ purifiés à partir du sang du patient présentent un répertoire de réarrangements δRec-1 restreint .
Les produits de PCR ont été soumis à une digestion par l ' enzyme de restriction ApaLl et ceux provenant du patient ont été trouvés résistants ( Fig 1, pistes 2 , 4 et 6) . Ce résultat indique que toutes les j onctions signal amplifiées sont modifiées chez le malade, alors que dans l' échantillon contrôle amplifié à partir de thymocytes, la maj orité des j onctions signal sont non-modifiées , et on distingue donc des produits sensibles et des produits résistants à la digestion par ApaLl ( Fig 1 , pistes 2 , 4 et 6) . Ce résultat indique que la diversité j onctionnelle des j onctions signal amplifiées à partir des lymphocytes T CD4+CD8+Vβl+ du patient est limitée .
Pour déterminer si les j onctions signal amplifiées à partir de la population CD4+CD8+Vβl+ sont poly ou mono-clonales , un test d ' élongation d ' amorce marquée de type "immunoscope" a été réalisé sur le produit de PCR δRec-l/AJ58. Une seule espèce moléculaire a été trouvée dans ce produit de PCR (figure 2 ) . Ces expériences indiquent 1) que le répertoire des réarrangements δRec-1 est limité dans la population analysée ( seuls 2 réarrangements sur 3 testés ) , et 2 ) que les j onctions qui sont retrouvées présentent un degré de diversité très restreint par rapport à un échantillon polyclonal contrôle .
Ces résultats suggèrent donc que la population de lymphocytes T CD4+CD8+Vβl+ résulte de la prolifération d ' un faible nombre de lymphocytes initiaux .
Exemple 2 : Modifications des jonctions signal lors de la recombinaison V (D) J des gènes du locus TCRAD chez la souris
2.A. Matériels et méthodes 2.A.I. Souris
Les souris C57BL/6 ont été élevées dans l ' animalerie du Commissariat à l ' Energie Atomique, à Grenoble . Les souris ont été sacrifiées par inhalation de CO2 et leur thymus a été prélevé à l ' âge de 4-8 semaines . 2. A.2. Préparation de l 'ADN
L 'ADN des thymocytes de souris C57BL/6 a été préparé à partir de 107 cellules en utilisant le kit d ' extraction nucleospin tissue de Machery Nagel®, en suivant les instructions du fabricant . L ' ADN de thymo- cytes TdT0/0 a été obtenu à partir de souris TdT0/0
(Gilfillan, Dierich et al . 1993 ) .
2. A.3. Amplification et digestion des jonctions signal
L ' ADN de thymocytes (100 ng) a été amplifié avec des amorces appropriées en utilisant le mélange AmpliTaqGold PCR comme \suit : 10 minutes à 940C, puis 35 cycles comportant la séquence suivante : 30 sec . à 940C, 30 sec . à 600C et 30 sec . à 72 °C, suivis de 10 min . à 72 °C . Les réactions de PCR ont été réalisées sur un appareil "GenAmp PCR System 9600" de Perkin-Elmer, dans un volume final de 25 μl . Les séquences des amorces sont indiquées dans les Tableaux 1 et 2 ci-dessus .
Après amplification, 5 à 10 μl des produits de l ' amplification PCR ont été digérés avec 5 unités d ' enzyme de restriction ApaLl (Amersham Pharmacia Biotech) pendant 3 heures à 370C dans le tampon fourni avec l ' enzyme . Des contrôles ont été incubés de la même façon, mais sans ApaLl . Les produits digérés et non digérés ont été résolus côte à côte sur gel d ' agarose 2%, transférés sur membrane N-Hybond+ (Amersham Biosciences ) et hybrides avec un mélange de sondes oligonucléotidiques radiomarquées, spécifiques des régions AJ des j onctions signal amplifiées présentées dans les Tableaux 1 et 2 ci- dessus (sondes de SEQ ID Nos : 16, 18 , 20 et 24 ) . L ' analyse des blots hybrides avec ces sondes a été réalisée sur un "Personal FX Imager" (Biorad) , en utilisant le logiciel "'Quanti ty One" .
2. A.4. Clonage et séquençage des jonctions signal
Les produits PCR ont été purifiés sur gel, clones dans le vecteur pGEM-T Easy (Promega®) selon les instructions du fabricant, et transformés dans des bactéries compétentes . Après étalement, les colonies positives ont été identifiées par hybridation avec des sondes oligonucléotidiques spécifiques des régions AJ. Les plasmides ont été préparés à partir des colonies contenant les jonctions signal, soit avec le kit Wizard miniprep ( Promega®) , soit avec le système Montage Plasmid Miniprep 96 (Millipore Corporation®) . Les plasmides contenant les JS ont ensuite été digérés individuellement par ApaLl . Le plasmide pGEM-T easy contient 2 sites pour cette enzyme . Si le plasmide recombinant contient une j onction signal non modifiée, formée par la fusion parfaite des RSS, un site ApaLl additionnel est introduit et la digestion donne 3 bandes après migration sur gel d ' agarose . Si le plasmide recombinant contient une jonction signal modifiée, un tel site additionnel n ' est pas introduit et la digestion donne seulement 2 bandes . Les plasmides présentant des profils inattendus , dans le nombre ou dans la taille des fragments d 'ADN, ont été exclus des analyses ultérieures . Les plasmides contenant des j onctions signal modifiées ont été séquences ( Génome Express, Meylan, France) , pour identifier la nature des modifications . Les j onctions signal identiques obtenues à partir d' un même échantillon ont été comptées une seule fois, car il est impossible de déterminer si ces occurrences multiples résultent d ' événements indépendants ou d ' une sur-amplification d ' une j onction signal unique .
2. B . Résultats
2. B. I . Les jonctions signal ADV/AJ présentent une diversité jonctionnelle liée à 1 'action de la TdT Les JS résultant de la recombinaison des gènes
ADV2 et ADV8 avec AJ61, AJ58 , AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d 'ADN de thymocytes de souris C57BL/6. Les produits PCR non digérés et digérés par ApaLl ont ensuite été analysés par migration sur gel d ' agarose, suivie d ' une révélation par transfert et hybridation avec des sondes radiomarquées spécifiques des régions AJ. Pour toutes les combinaisons ADV-AJ testées , une fraction significative des produits PCR était résistante à la restriction par ApaLl . Cette résistance indique que certaines j onctions signal sont modifiées et ne consistent pas en un simple raboutage des RSS . L ' implication potentielle de la TdT dans la génération des j onctions signal résistantes à la restriction par ApaLl (SJ ApaLl-R) a été analysée en effectuant les mêmes expériences à partir d' ADN de thymocytes déficients en TdT . Cela a révélé de façon nette qu ' en l ' absence d' expression de la TdT, les SJ ApaLl-R sont quasiment inexistantes , pour toutes les combinaisons testées (figure 5) .
Des résultats similaires ont été obtenus en analysant les SJ produites après le réarrangement de ADVl , ADV20 et ADV6 avec les mêmes gènes AJ. La modification des SJ intervient donc lors du réarrangement d ' au moins 5 des 21 familles de gènes ADV situées dans la région ADV/DV en 5 ' de δRec-1. Ces résultats montrent que ( i ) les j onctions signal ADV-AJ présentent une diversité j onctionnelle, et (ii) cette diversité résulte presque totalement de l ' addition de nucléotides N par la TdT .
2. B.2. Quantification et structure des jonctions signal modifiées
Afin de déterminer précisément le pourcentage des j onctions signal modifiées , les j onctions signal ADV2/AJ ont été amplifiées à partir de d ' ADN de thymocytes sauvages et clones , de telle sorte que chaque JS puisse être analysée indépendamment par digestion par ApaLl du plasmide recombinant correspondant . Comme montré dans le Tableau 3 ci-dessous , la fréquence des SJ ApaLl-R varie de 9 , 7% pour ADV2/AJ58 à 39, 1% pour ADV2/AJ61 , avec une moyenne de 33 , 6% . Ainsi, une fraction significative des JS ADV2/AJ sont modifiées , même si la fréquence des modifications semble varier légèrement selon le gène AJ réarrangé .
Tableau 3 : Analyse des jonctions signal produites durant le réarrangement des gènes TCRA chez la souris
La maj orité de ces JS ApaLl-R ont été séquencées , pour identifier précisément la nature des modifications . Ces modifications consistaient essentiellement en addition de nucléotides N . Il a été trouvé que ces séquences contenaient entre 1 et 7 nucléotides sans support sur une matrice, avec une moyenne de 2 , 8 par séquence . Ces additions de nucléotides N correspondent principalement en des nucléotides G et C, qui représentent ensemble plus de 70% des bases ajoutées (Figure 6) . Ceci constitue un biais typique de l ' activité de la TdT . A deux exceptions près , les JS ADV2/AJ résistantes à ApaLl étaient uniques , ce qui indique que le répertoire des SJ modifiées présente une grande diversité .
Il est important de noter qu ' une JS ADV2/AJ57 dans laquelle 4 nucléotides N ont été insérés montre également une délétion de 3 bases de l ' heptamère ADV2 , ce qui suggère qu ' une perte de nucléotides des extrémités RSS peut contribuer à la diversité des SJ. Cette observation a conduit les inventeurs à examiner la structure des SJ en l ' absence d ' expression de la TdT . Des SJ ADV2/AJ56 amplifiées à partir de souris déficientes en TdT ont été clonées, et les plasmides recombinants obtenus ont été analysés . La fréquence des plasmides ΛpaLl-R a été trouvée de 2 , 7% (2 sur 74 ) . Dans une de ces séquences , des nucléotides ont été délétés des deux signaux portés sur ADV2 et AJ56 ( 1 et 3 nucléotides , respectivement) . Dans l ' autre, 4 bases ont été délétées de l ' heptamère de AJ56, tandis que le signal sur ADV2 est complet . Cette j onction contient également un nucléotide additionnel ( Figure 6, dernières lignes) .
Il apparaît donc que la perte de bases des RSS est rare, et que la plupart des modifications observées dans les SJ du TCRA résultent d ' additions de nucléotides N .
2. B.3. Les jonctions signal du TCRD sont modifiées par des additions de nucléotides N et par une activité exonucléolytique
Une étude précédente de Candéias et al ( supra) a montré que le réarrangement, des gènes TCRD génère des j onctions signal modifiées tant par addition de nucléotides N que par perte de base ( s ) . Ces données ont été obtenues après analyse du réarrangement de DV105 avec DD2. Cependant , DV105 se réarrange par inversion et la formation de SJ est donc cruciale pour maintenir l ' intégrité chromosomique et assurer la survie cellulaire . Il est théoriquement possible que, lors de recombinaison par inversion, les RSS soient plus étroitement liées avec le complexe de recombinaison V ( D) J, incluant l' activité exonucléolytique, afin d' assurer la formation de la SJ. Ceci pourrait expliquer la présence de délétions au niveau des extrémités RSS de DV105 et DD2. Par conséquent, afin de déterminer si la délétion de bases des éléments signaux (ES) est une caractéristique générale du réarrangement des gènes TCRD, ou si cela constitue au contraire une spécificité du réarrangement par inversion, les inventeurs ont analysé la structure des JS produites pendant le réarrangement qui se produit par délétion entre DV102 et DD2.
La digestion par ApaLl des plasmides recombinants obtenus après l ' amplification des SJ DV102/DD2 et le clonage à partir d' ADN de thymocytes de souris C57BL/6 a révélé la présence de 34% de SJ ApaLl-R (Tableau 4 ) . De façon remarquable, l ' analyse par séquençage a montré que 4 de ces j onctions signal modifiées (sur 17 j onctions différentes ) ont perdu des nucléotides au niveau des extrémités terminales des RSS des DV102 et/ou DD2 ( Figure 7 ) . La perte de nucléotides des ES avant leur ligature n ' est donc pas dépendante du fait que les gènes TCRD se réarrangent par délétion ou inversion .
La même analyse a ensuite été réalisée sur les JS ADV2/DD2 amplifiées à partir d 'ADN de thymocytes de C57BL/6. La proportion des plasmides recombinants ApaLl-R a été trouvée de 44 , 7% (Tableau 4 ) . L ' analyse par séquençage a révélé 21 j onctions modifiées différentes . Dans 5 d ' entre elles, les modifications ont consisté à la fois en l ' addition de nucléotides N et en la délétion de bases des extrémités signal ( Figure 7 ) . Cette proportion est similaire à celle trouvée dans les SJ DV102/DD2. Cependant, elle est statistiquement différente (p=0 , 01 par le test de Mann-Whitney) de celle des délétions trouvées dans les JS ADV2/AJ résistantes à ApaLl ( 1 délétion sur 34 j onctions signal dans des thymocytes sauvages ) , ce qui indique que davantage de délétions sont introduites dans les JS produites pendant le réarrangement des gènes TCRD que lors du réarrangement des gènes TCRA, même lorsque la même famille de gènes ADV est utilisée dans les deux types de réarrangements .
Tableau 4 : Analyse des jonctions signal produites durant le réarrangement des gènes TCRD chez la souris
II apparaît donc que les mécanismes responsables de la diversité des j onctions signal diffèrent suivant que les JS en question résultent du réarrangement des gènes TCRA ou TCRD .
2. B .4. Le réarrangement de l ' élément δRec-1 présente une diversité combina toire et jonctionnelle
Les inventeurs ont ensuite analysé plus en détail la structure des j onctions signal produites par la recombinaison de l ' élément δRec-1 avec les gènes AJ. Les JS produites par la recombinaison de δRec-1 avec AJβl , AJ60 , AJ59 , AJ58 , AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d ' ADN de thymocytes humains , et les produits de ces amplifications ont été digérés par ApaLl . Les figures 8 et 9A montrent que dans le thymus, une fraction importante des produits PCR est résistante à la restriction par ApaLl , ce qui révèle l ' existence, pour tous les réarrangements testés sauf ceux impliquant AJ60 , de j onctions signal modifiées . En ce qui concerne les j onctions signal hδRec-l/AJ60, toutes ces j onctions sont résistantes à la digestion par l' enzyme de restriction ApaLl , puisque la séquence signal de recombinaison de AJ60 ne se conforme pas au motif consensus établi et commence par un triplet CAT et non par un triplet CAC . Il n' y a donc pas création d' un site de restriction ApaLl lors de la formation de la jonction signal .
Les figures 9B à 9E montrent que, lorsque cette analyse est appliquée à des échantillons de leukocytes sanguins purifiés à partir de différents donneurs , le profil obtenu est différent pour chaque patient , indiquant que chaque patient possède un répertoire de j onctions signal qui lui est propre .
Pour déterminer la nature des modifications, les produits résistants à ApaLl ont été purifiés sur gel et clones , sauf ceux issus de la recombinaison de AJ60 qui, pour les raisons évoquées ci-dessus, ont été clones sans digestion préalable . Des plasmides présents dans des colonies sélectionnées au hasard ont été séquences (figure 10 ) . La présence de nucléotides N était évidente dans toutes les JS ApaLl-R analysées et dans certaines des JS hDRec-l/AJ60. En moyenne, 5.35 nucléotides ont été aj outés par séquence, leur nombre variant de 1 à 11. Dans six cas ( 19% ) , des bases d ' un des éléments signaux ont été perdues . Ces délétions varient de 1 à 13 bases . Cette fois encore, seulement deux séquences ont été trouvée deux fois, ce qui montre la diversité du répertoire des JS modifiées .
Les j onctions signal δRec-1/AJ dans les thymocytes humains présentent donc une diversité j onctionnelle . Les inventeurs ont ensuite cherché à déterminer si le réarrangement de l ' élément δRec-1 murin est restreint au pseudogène AJ61 ou si, comme dans le thymus humain, d ' autres gènes AJ peuvent également être utilisés . La même approche a été utilisée, et les JS résultant de la recombinaison de δRec-1 avec AJβl , AJ58 , AJ57 et AJ56 ont été amplifiées à partir d ' ADN de thymocytes murins . Ces JS étaient facilement détectables , comme montré à la figure 11. En outre, les inventeurs ont détecté des réarrangements de δRec-1 avec d ' autres gènes
AJ plus distants , jusqu ' à AJ18. Ces résultats démontrent que les JS impliquant l ' élément δRec-1 murin présentent, comme chez l ' homme, une diversité combinatoire . Comme la
• RSS de l ' élément δRec-1 murin comporte un site Apa'Ll , la diversité j onctionnelle de ces JS ne peut pas être testée directement par- restriction . Les JS δRec-l/AJ61 ont en conséquence été directement clonées et séquencées . Sur 34 JS analysées , 11 (31, 42% ) étaient modifiées (figure 12 ) . Elles contiennent toutes des nucléotides N, de 2 à 12 par séquence, avec une moyenne de 4 , 4 par séquence . Dans une des JS, 3 bases ont en outre été délétées de δRec-1. Une fois de plus , l ' absence de séquences redondantes illustre la diversité du répertoire murin des JS impliquant δRec- 1. Ces résultats montrent que la recombinaison de l ' élément δRec-1 murin dans les thymocytes sauvages génère un répertoire de JS qui présente une diversité combinatoire et j onctionnelle . REFERENCES
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Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de détermination de la diversité des lymphocytes T dans un échantillon biologique d ' un patient humain ou d ' un animal , caractérisé en ce qu ' il comporte une étape d' analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diversité j onctionnelle des cercles d ' excision (TREC) résultant de l' excision de tout ou partie du locus TCRD .
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu ' il comporte une étape d ' analyse de la diversité combinatoire et/ou de la diversité jonctionnelle des cercles d ' excision (TREC) résultant du réarrangement de δRec-1.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la diversité combinatoire des cercles d ' excision résultant du réarrangement de δRec-1 est analysée en effectuant au moins trois réactions d' amplification d ' un fragment des cercles d ' excision, chaque réaction d ' amplification étant spécifique d' une j onction signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60 , AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56.
4. Procédé selon la revendication 3, caractérisé en ce que les réactions d ' amplification d ' acide nucléique sont des réactions d ' amplification en chaîne par polymérase ( PCR) , effectuées avec des couples d ' amorces constitués chacun d ' une amorce spécifique de δRec-1 et d ' une amorce spécifique d ' une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58 , AJ57, et AJ56.
5. Procédé selon la revendication 3 ou 4, caractérisé en ce que trois ou quatre réactions d ' amplification sont effectuées, chaque" réaction d ' amplification étant spécifique d ' une j onction signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ58 , AJ57 , et AJ56.
6. Procédé selon l ' une quelconque des revendications l à 5 , comportant une étape d ' analyse de la diversité des j onctions signal présentes sur les cercles d ' excision résultant du réarrangement de δRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61, AJ60, AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que, pour chaque j onction signal δRec-
1/AJ analysée, l ' analyse de la diversité j onctionnelle comporte une étape d ' amplification d ' un fragment du cercle d ' excision, ledit fragment comportant ladite j onction signal .
8. Procédé selon la revendication 7 , caractérisé en ce que, pour chaque j onction signal δRec- 1 /AJ analysée et résultant du réarrangement de δRec-1 avec une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ59 , AJ58 , AJ57 , et AJ56 chez l ' homme, ou AJ61 , AJ58 , AJ57 , et AJ56 chez la souris , l ' analyse de la diversité j onctionnelle comporte en outre une étape d ' analyse du profil de restriction, par l ' enzyme ApaLl , du fragment du cercle d ' excision amplifié .
9. Procédé selon l ' une quelconque des revendications 6 à 8 , caractérisé en ce qu ' il comporte une étape d ' analyse qualitative des jonctions signal présentes sur les cercles d ' excision résultant du réarrangement de δRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ60 , AJ59 , AJ58 , AJ57 , et AJ56.
10. Procédé selon la revendication 8 , caractérisé en ce qu ' il comporte, en outre, une étape d ' analyse qualitative des j onctions signal partiellement ou totalement résistantes à la restriction par ApaLl .
11. Procédé selon la revendication 9 ou la revendication 10, caractérisé en ce que l ' analyse qualitative des jonctions signal est effectuée par extension d ' amorce marquée .
12. Procédé selon l ' une quelconque des revendications l à 11 , caractérisé en ce qu ' il comporte les étapes suivantes : a . préparation de l ' ADN à partir de l ' échantillon biologique; b . réalisation d ' au moins 3 ou 4 PCR, à l ' aide de couples d ' amorces dont chacun est constitué d' une amorce spécifique de δRec-1 et d ' une amorce spécifique d ' une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ58 , AJ57 , et AJ56; c . restriction des produits des PCR avec l ' enzyme de restriction ApaLl; d . analyse des profils de restriction obtenus à l ' étape c; e . le cas échéant, analyse qualitative des j onctions signal résistantes à la restriction par ApaLl .
13. Procédé selon l ' une quelconque des revendications 1 à 12 , comportant une étape de quantification des cercles d ' excision résultant du réarrangement de δRec-1 avec au moins une région AJ choisie dans le groupe constitué de AJ61 , AJ60, AJ59, AJ58 , AJ57, et AJ56.
14. Utilisation d ' un procédé selon l ' une quelconque des revendications 1 à 12 , pour détecter un éventuel désordre du mécanisme de réparation de l ' ADN .
15. Trousse de réactifs pour déterminer la diversité des lymphocytes T présents dans un échantillon biologique, caractérisée en ce qu ' elle comprend un ensemble d ' au moins quatre amorces dont au moins une est spécifique de δRec-1, et au moins trois sont spécifiques chacune d ' une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJβl , AJ60 , AJ59 , AJ58 , AJ57 , et AJ56, lesdites amorces étant choisies de façon à permettre l ' amplification par PCR des j onctions signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec les régions AJ sélectionnées .
16. Trousse de réactifs selon la revendication 15, caractérisée en ce qu' elle comprend un ensemble d ' au moins cinq amorces dont au moins une est spécifique de δRec-1, au moins une est spécifique de AJ61 , et au moins trois sont spécifiques chacune d ' une région AJ différente, sélectionnée dans le groupe constitué de AJ60 , AJ59, AJ58 , AJ57 , et AJ56, lesdites amorces étant choisies de façon à permettre l ' amplification par PCR des j onctions signal résultant du réarrangement de δRec-1 avec les régions AJ sélectionnées .
17. Procédé selon la revendication 4 ou la revendication 12 ou trousse selon la revendication 15 ou la revendication 16, caractérisés en ce que les amorces sont choisies parmi les amorces de séquences SEQ ID Nos 1 à 28.
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