EP1838877A1 - Methode de detection, non invasive, prenatale, in vitro de l'etat sain normal, de l'etat de porteur sain ou de l'etat de porteur malade de la mucoviscidose - Google Patents

Methode de detection, non invasive, prenatale, in vitro de l'etat sain normal, de l'etat de porteur sain ou de l'etat de porteur malade de la mucoviscidose

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Publication number
EP1838877A1
EP1838877A1 EP06709125A EP06709125A EP1838877A1 EP 1838877 A1 EP1838877 A1 EP 1838877A1 EP 06709125 A EP06709125 A EP 06709125A EP 06709125 A EP06709125 A EP 06709125A EP 1838877 A1 EP1838877 A1 EP 1838877A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
primers
cells
dna
cystic fibrosis
Prior art date
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Ceased
Application number
EP06709125A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Patrizia Paterlini
Jean-Paul Bonnefont
Isabelle Desitter
Ali Saker
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Original Assignee
Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Universite Paris Descartes
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP, Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM, Universite Paris Descartes filed Critical Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
Priority to EP10184553A priority Critical patent/EP2345744A3/fr
Publication of EP1838877A1 publication Critical patent/EP1838877A1/fr
Ceased legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for the non-invasive, prenatal detection of normal healthy state, healthy carrier state or cystic fibrosis carrier state, from fetal cell (s) ( s) from a maternal sample, including the test DNA of an individual.
  • the method according to the invention can be used in an in vitro diagnostic protocol for cystic fibrosis.
  • the invention also relates to oligonucleotide primers and their use in the context of a non-invasive, prenatal detection method of the normal healthy state, the healthy carrier state or the sick carrier state of the invention. Cystic fibrosis.
  • the invention also relates to primers and their use in the context of a method for the identification, on a DNA preparation derived from the genome of at least one cell collected from a maternal sample, from one or several markers of genetic polymorphism, demonstrating the bi-parental contribution to the DNA and, consequently, the fetal origin of said at least one cell.
  • the invention also relates to a polynucleotide and a combination of
  • polynucleotides useful as primers for amplifying a quantity of DNA from a biological sample as well as a kit for the noninvasive, prenatal detection of cystic fibrosis.
  • Cystic fibrosis is the most common life-threatening autosomal recessive disorder among white children, affecting a newborn in 3500 in the United States (Kosorok Disease, 1996), with a carrier frequency ranging from 1 20 to 1 in 40 or more (Bobadilla, 2002).
  • the disease is characterized by an imperfection of the chlorine channel that is attributable to alterations, specifically to mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene (CFJR) (Cystic Fibrosis Foundation, 2003). About 1000 mutations have been discovered, including that corresponding to Paliawning deltaF508 which represents 68% of the mutated alleles in the world (Karem, 1989).
  • the imperfection of the chloride channel involves abnormalities in electrolytes and macromolecular secretions of the exocrine glands, inducing clogging "pancreatic ductal in utero, pancreatic insufficiency, chronic obstructive pulmonary disease and recurrent respiratory infections.
  • the Average life expectancy of patients is around 30 years, but the survival of CF patients has increased over the last 4 decades.
  • CFTR associated with cystic fibrosis and about 80% of infants born with cystic fibrosis are conceived by parents who have no family history of the disease (Fink, Collins, 1997). As the disease is relatively common, its early signs are early. The costs of treating this disease are high, it is ultimately fatal. Cystic fibrosis is one of the most promising diseases for genetic screening (Balinsky, 2004, Garber, Fenerty, 1991).
  • WO02 / 088736 describes a non-invasive prenatal diagnosis method implemented from a maternal blood sample, in particular allowing the early detection of the genetic sex of the fetus.
  • the inventors have been interested in a method of non-invasive, prenatal cystic fibrosis detection, reliable and sufficiently effective to be routinely applied, which does not involve the removal of tissue or fetal cells by biopsy and / or intrusion of the placental barrier.
  • the invention defines means adapted to the detection of known genetic abnormalities, in particular known mutations of the CFTR gene, or means adapted to the detection of unknown or indeterminate mutations of the CFTR gene.
  • the fetal cells are taken from a sample taken from the pregnant woman.
  • the subject of the invention is therefore a method for prenatally non-invasive, in vitro, detection of the normal healthy state, the healthy carrier state or the sick patient state of cystic fibrosis, from a sample fetal cell (s) isolated from a sampled maternal sample comprising the test DNA of an individual, said method comprising the steps of: a. enrichment in fetal cells of a maternal sample taken, pure or diluted, which may comprise cells of fetal origin; b. the analysis of the retained cells and the selection of the presumed cells of fetal origin; vs. demonstration by genetic analysis of the fetal origin of one or more cells selected in step b and d.
  • step c the search for alleles of the CFTR gene carrying the ⁇ F508 mutation or other known mutations, or the search for alleles of a locus carrying a genotypic polymorphism genetically linked to an unidentified morbid mutation of the CFTR gene, by means of the following steps:
  • the individual is the unborn individual represented for the purposes of the detection according to the invention, by its fetal cells.
  • the detection method according to the invention offers sufficient performance in terms of specificity and sensitivity to be considered as an alternative method of prenatal diagnosis to invasive methods, or at least to be included in diagnostic protocols.
  • the method according to the invention thus makes it possible, from the DNA of one or a small number of fetal cells, to identify the presence or absence, heterozygous or homozygous, of alleles carrying abnormalities of the gene. CFTR responsible, in the individual born, for cystic fibrosis.
  • the presence of homozygous alleles mutated at the level of the CFTR gene accounts for an individual who will be normal, healthy carrier or affected (sick carrier) by cystic fibrosis.
  • health carrier state means that the individual is a single heterozygote for the mutated allele of the CFTR gene.
  • slow carrier state means that the individual is homozygous affected or heterozygous composite for the mutated allele of the CFTR gene.
  • abnormal healthy state means that the individual has two normal alleles.
  • This detection is carried out by a method of direct search for a known mutation, or when the mutation of the CFTR gene responsible for cystic fibrosis is not known or has not been identified in the parents of the tested individual, by a indirect method, of detecting one or more polymorphic markers having a genetic linkage with the CFTR gene, said marker being inherited by co-segregation with said CFTR gene, during generations.
  • an alteration in particular a known mutation of the CFTR gene, is for example that which affects the position 508 of the corresponding amino acids, resulting in the deletion of three nucleotides identified as delta F508.
  • control sample is meant, in relation to the biological sample giving access to the fetal cells, one or more biological samples coming respectively from the father and the mother when the desired mutation of the CFTR gene is a known mutation, for example the mutation of the delta locus F508.
  • Control samples are one or more biological samples from the father and the mother, respectively, and a biological sample from a child of the same sibship affected by cystic fibrosis (index case) must be added. These samples are processed to give access to the genomic DNA respectively of the father, the mother and the child of the same sibship.
  • maternal sample any biological sample, taken from the mother of the individual to be tested, by a non-invasive method, said sample comprising fetal cells as well as other types of cells.
  • the maternal sample may be maternal blood taken from the pregnant woman, including fetal cells as well as other circulating cells, such as leukocytes. Stage a of the method according to the invention will consist in this case in separating the fetal cells from the other circulating cells.
  • the maternal sample is taken from the pregnant woman in the cervix, either by washing with a solution (for example physiological) or by taking mucous without washing, without breaking the amniotic sac. The sample thus taken contains, in principle, fetal cells.
  • the method for detecting cystic fibrosis according to the invention can be understood as a non-invasive in vitro method for assessing the susceptibility of an individual to cystic fibrosis, by identifying in this individual the presence or absence, heterozygous or homozygous of alleles carrying abnormalities of the CFTR gene responsible for cystic fibrosis. Except to have the required DNA information of the control samples before taking the detection according to the invention on the fetal DNA taken, the control samples are treated, for the steps c. and D. of the method of the invention, such as the fetal DNA sample.
  • the amount of DNA that is amplified is a small amount of DNA, preferably less than 5 ⁇ g, for example of the order of 2 ⁇ g.
  • the amplification primers must therefore be defined to allow the amplification of a small amount of DNA, for example a quantity of DNA corresponding to that of a single cell or a reduced number of fetal cells.
  • the amplification step of step c. and / or the amplification step of step d. comprises at least one amplification phase, for example, it comprises a first amplification phase carried out with external primers and a second amplification phase carried out with internal primers.
  • I 1 DNA of the sample of the tested individual derived from the genome of at least one fetal cell.
  • the DNA of the cell sample derives from the genome of at least one isolated fetal cell, in particular the genome of a small number of cells, ranging from 1 to 20 cells, more particularly from 1 to 10 cells.
  • cells for example the genome (s) of 1, 2 or 3 cells, preferably at least three cells (see Example 4 below) and advantageously genome individually isolated cells.
  • the sample DNA is derived from the genome of a single fetal cell or a number of fetal cells equal to or less than 20, more preferably 10.
  • the number of fetal cells is less than three cells.
  • the detection on the DNA of a single cell does not provide a relevant result, in particular if the amplification is carried out by PCR and that one of the two alleles of the gene carrying the desired marker is not amplified or not detected
  • Allele Drop Out situation because of the amount of DNA used, it is possible to increase the number of fetal cells from which the DNA to be tested is recovered, which is then used in the form of a pool.
  • use will be made of 2, 3, or for example between 2 and 20 cells, preferably at least three cells, advantageously between 3 and 20 cells (inclusive), cf. example 4 below (absence of ADO).
  • step c. of the method of the invention In order to be able to detect cystic fibrosis in vitro in the individual whose fetal DNA is tested, it is necessary, in a first phase of the detection, in accordance with step c. of the method of the invention, establish the demonstration of the fetal origin of the DNA. This determination of the fetal character of the DNA is still called genotyping in the present application.
  • This step is performed using markers of genetic polymorphism. It is necessary that the markers of genetic polymorphism used be informative, in that they make it possible to differentiate the allele of each marker brought by the father and that brought by the mother. The markers of maternal and paternal polymorphism must therefore be distinct from each other.
  • the invention relates to a method for detecting the state of healthy carrier or sick patient of cystic fibrosis, characterized in that the informative primers used in step c. are derived from the sequence of a chromosome selected from chromosome 16, chromosome 21 or chromosome 7.
  • the primers used in step c. are derived from the chromosome 7 sequence and are close to the morbid cystic fibrosis allele.
  • the morbid allele referred to here is the allele of the CFTR gene (located on chromosome 7) that carries the defect responsible for cystic fibrosis.
  • the invention Prior to the genotyping step c. and in the step of searching alleles of the CFTR gene or alleles of a locus carrying a genetic polymorphism genetically linked to an abnormal allele of the CFTR gene, the invention requires the implementation of the following steps: a. enrichment in fetal cells of a maternal sample taken, pure or diluted, which may comprise cells of fetal origin; b. analyzing the cells retained during step a) in order to obtain a presumption of their fetal or maternal origin;
  • any type of technique can be used, on the one hand, for the enrichment in fetal cells of a maternal sample taken, pure or diluted, which may comprise cells of fetal origin (step a)), on the other hand, for the analysis of the cells retained during step a) in order to obtain a presumption of their fetal or maternal origin (step b)).
  • the cell genomes are analyzed individually in step c.
  • step d. The analysis of the cellular genomes is either carried out on the genome of each cell taken individually or on the pooled genomes of several fetal cells.
  • step c. of genotyping comprises or consists of identifying, on a DNA preparation derived from the genome of the single cell collected (individual cell), one or more markers of genetic polymorphism, or a combination of these markers, demonstrating the bi-parental contribution to the DNA and accordingly, the fetal origin of said at least one cell.
  • genetic polymorphism marker any identifiable feature on the DNA, the presence of which is correlated with a particular genotype and, where appropriate, with a particular phenotype.
  • the markers used in step c. to distinguish paternal DNA from maternal DNA and thus to demonstrate the bi-parental composition of fetal DNA. It may therefore be sufficient that they correlate to a particular genotype.
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • SNP Single Nucleotide Polymorphism
  • VNTRs Variable Number of Tandem Repeats
  • STRs Short Tandem Repeats
  • Micro-satellite markers are particularly preferred for cell characterization and the implementation of prenatal diagnosis.
  • at least one polymorphic marker to be identified is a microsatellite marker, a Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) marker, a Single Nucleotide Polymorphism (SNP) marker, or a Short Tandem Repeats (STR) marker. ). These have the advantage of being identifiable by amplification using specific primers.
  • Micro-satellite markers, VNTR or STR are composed of repetitions in tandem, usually polyCA / GT patterns.
  • allelic variations due to the variation of the number of repeats, are easily detected by PCR amplification, thanks to the use of primers corresponding to the unique sequences flanking the microsatellite.
  • a physical map of these microsatellite markers and the sequence of their associated primers are described by Dib et al. (Dib, C, Faure, S., Fizames, C, Samson, D., Drouot, N., Vignal, A., Missasseau, P., Mark, S., Hazan, J., Seboun, E., Lathrop , M., Gyapay, G., Morissette, J., and Weissenbach, J.
  • step c In order to demonstrate the fetal or maternal origin of a single cell collected, in a particular embodiment, it may be sufficient to perform the search for a marker or a combination of markers or an assay. allelic of these markers which are distinguished from those of the genome of maternal cells. In particular the genome research of said collected cell may be carried on a marker or a combination of markers specific for paternal cell DNA. Their presence is necessarily the signature of a fetal origin of the cell in question. According to a particular embodiment of the invention, step c.
  • amplification of the DNA taken individually from one or more selected cells using so-called informative primers, capable of amplifying previously determined genetic polymorphisms to distinguish the maternal alleles from the alleles paternal so as to recognize the fetal genome by the presence of a paternal allele and a maternal allele in each selected cell; ii) - comparing the alleles of the DNA of said cells with the corresponding parental alleles; iii) - the selection of the DNA of cell (s) comprising a maternal allele and a paternal allele for the identified genetic polymorphism (s), demonstrating the fetal origin of the DNA of the cell (s).
  • the conditions for carrying out the amplifications are, for example, 5 min 94 ° C., 40 ° C. (30 sec, 94 ° C., 30 to 45 sec, 55 ° to 61 ° C., 30 ° C., 72 ° C.), 5 min. .
  • two amplification phases may be performed as follows: a first phase of amplification of the DNA preparation derived from the genome of a single cell collected is carried out with one or more nucleotide primers said to be external with respect to the target sequence and a second amplification phase on the amplification product obtained by the preceding step is carried out with one or more nucleotide primers called internal or nested with respect to said external primers.
  • the external and internal primers above are said to be informative, ie capable of amplifying genetic polymorphisms previously determined to be distinct and characteristic on maternal alleles on the one hand and paternal on the other hand, so as to to identify the desired genetic polymorphisms typical of fetal alleles.
  • the primers are synthetic oligonucleotides whose sequence is determined to allow the amplification of a DNA sequence comprising informative markers of the fetal character of the tested cell.
  • the primers that can be used to carry out step c. are said to be informative of the fetal nature of the cell or, according to a particular embodiment of the invention, these primers are said to be informative of the bi-parental contribution to the tested cell.
  • Informative primers advantageously lead to amplification of DNA fragments comprising several polymorphisms, preferably a large number of polymorphisms.
  • the polymorphisms are identified on the DNA sequences of interest, notably on chromosome 7, in the available databases (NCBI for example). From these data, oligonucleotides are identified that allow amplification under the conditions of the invention, so as to allow the genotyping or detection effective, sensitive and specific.
  • These informative primers can be identified specifically for a family (father and mother of the tested individual) by a comparative genetic analysis of the genomes of the father and the mother.
  • these informative primers may be primers which have been shown to be capable of amplifying DNA sequences comprising markers of genetic polymorphism shared by several families, or even consensual, with regard to the informative nature of the invention. paternal or maternal origin of an allele of a gene.
  • the external primers called informative primers usable in step c. are selected from the following primer pairs where F is "forward” and hybridizes to the 3 '- 5' oriented DNA strand in the target sequence and R is "reverse", and hybridizes to the DNA strand oriented 5 '- 3' in the target sequence:
  • -F 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '(SEQ ID NO: 1); R: 5'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 2); -F: ⁇ '-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S '(SEQ ID NO: 5); R: 5'-
  • F 5'-GAATTATAACCGTAACTGATTC-3 '(SEQ ID NO: 33); R: 5'-GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 34).
  • the internal or nested primers called informative primers used in step c. are chosen from the following pairs of primers:
  • F 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 31); R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3 '(SEQ ID NO: 32);
  • F 5'-CTGATTCATAGCAGCACTTG -3 '(SEQ ID NO: 35); R: 5'-AAAACATTTCCATTACCACTG-3 '(SEQ ID NO: 36).
  • Step d. following the completion of step c. must make it possible to detect cystic fibrosis from the fetal cells retained at the end of step c.
  • oligonucleotides usable as amplification primers for performing step d., Which make it possible to amplify a DNA sequence comprising the F508 locus, and to detect the mutation of said locus.
  • oligonucleotide primers capable of amplifying DNA sequences carrying a genetic polymorphism forming a linkage (or genetic linkage) with a locus carrying other so-called "unidentified" mutations associated with cystic fibrosis. This amplification is done in the context of the method of detection of cystic fibrosis. These primers were identified from chromosome 7 DNA. Step d. of the method of the invention can therefore be implemented using pairs of primers chosen from the following:
  • TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 28)) used during the second amplification phase of step d. or only in case of single amplification in step d. ;
  • primers identified on chromosome 7 amplifying a DNA fragment forming a linkage with the CFTR gene:
  • F 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '(SEQ ID NO: 1); R: 5'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 2);
  • F ⁇ '-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S '(SEQ ID NO: 5); R: ⁇ '-TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-S '(SEQ ID NO: 6);
  • F 5'-GAATTATAACCGTAACTGATTC-3 '(SEQ ID NO: 33); R: 5'-GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 34); F: 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3 '(SEQ ID NO: 3); R: 5'-
  • F 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 31); R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3 '(SEQ ID NO: 32);
  • amplification primers capable of amplifying a locus comprising a genotypic polymorphism genetically linked (linkage) to the CFTR gene during segregation, for example the primers identified in the present application on chromosome 7 and • comparison with the control samples in step d. involves the comparison of the identified alleles of fetal DNA with the corresponding paternal alleles, the corresponding maternal alleles and the corresponding alleles of a child of the cystic fibrosis-affected siblings.
  • the at least one amplification phase of the fetal DNA, the maternal DNA, the paternal DNA and the DNA of the child of the siblings is carried out with one or more pairs of primers chosen from:
  • the primers used make it possible both to demonstrate the fetal origin of the cell tested and to detect cystic fibrosis, by identifying the presence or absence of at least one allele. carrying a genetic polymorphism, forming a linkage with the morbid allele of cystic fibrosis.
  • primers than the foregoing can be defined and used to identify markers sought in step c. of the method of invention.
  • the primers used to carry out the amplification in step c. are chosen to amplify DNA sequences outside of chromosome 7. These primers are designed to be informative according to the description given above in order to make it possible to discriminate paternal alleles and maternal alleles in fetal cells. Then, for carrying out step d., The primers chosen for amplification can be primers identified from the DNA of chromosome 7, within the framework of what is described in the present application.
  • oligonucleotides capable of amplifying, for example by PCR, sequences comprising distinct genetic polymorphism markers in the cells of the father and the mother are selected: the amplification products revealed are represented by peaks of the relevant gene in the fetal cell DNA distinct for the paternal allele and for the maternal allele.
  • the oligonucleotides are remote on the sequence to be amplified so that the size of the amplification product comprises less than 1000, or even less than 800 bp.
  • the limitation of the size of the amplified sequence takes into account that the DNA of the tested cell, when this cell is unique, is low in quantity and is obtained from a fixed cell so can be altered.
  • the primers chosen must allow amplification of small amounts of DNA, for example amounts less than 5 ⁇ g, especially about 2 ⁇ g.
  • primers capable of amplifying the deltaF508 locus may also, or alternatively, be used to search for the deltaF508 allele characteristic of the most frequent mutations of the CFTR gene in cases of cystic fibrosis.
  • primers capable of amplifying the deltaF508 locus are: the external primer pair DeltaF508 out (F: 5'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-3 'SEQ ID NO: 25; R: 5'-
  • the pair of internal primers deltaF508 in (F: 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3 'SEQ ID NO: 27; R: 5'-TCTTACCTCTTCTAGTTGGC3' SEQ ID NO: 28) used during the second amplification phase of the step d).
  • primers that can be used to carry out the invention may consist of variant oligonucleotides derived from the polynucleotides which have been given the above sequences.
  • a variant oligonucleotide has, for example, at least 60% identity, preferably 80%, preferably 95% identity, or more, with the primer from which its sequence is derived.
  • Said variant oligonucleotide has one or more sequence modifications with respect to the primer from which its sequence derives, as in particular one or more deletion, addition or substitution type modifications.
  • said variant oligonucleotide has the same size as the primer from which its sequence derives.
  • the length of said variant oligonucleotide has a size smaller than that of the primer whose sequence is derived, for example 10 to 20% shorter, or possibly a larger size, for example from 10 to 40%, in particular 30 to 40% longer than the sequence of the primer from which it derives.
  • Variant primers of the oligonucleotides mentioned above may, for example, be derived from these oligonucleotides by the addition of one or more nucleotides in 5 'of the aforementioned sequences.
  • Said oligonucleotide has the same properties as the primer from which it is derived if it can be used as a primer to amplify the DNA of a sample in particular for amplifying sequences comprising markers of the fetal origin of a cell, or for amplifying sequences comprising markers of genetic polymorphism forming a linkage with the altered CFTR gene characteristic of cystic fibrosis.
  • the oligonucleotides that can be used in the context of the invention may be associated with markers, for example added 5 'or 3' to their sequence.
  • the couples of Primers used primarily in Step d. will be primers capable of amplifying the deltaF508 locus to search for the deltaF508 allele or other known mutations detectable directly by the method according to the invention.
  • said collected cell prior to the demonstration of the fetal or maternal origin of a collected cell, said collected cell is lysed and its entire genome is pre-amplified, for example with the aid of generic primers covering all possible sequences according to known primer extension preamplification (PEP) methods (Zhang, L., Cui, X., Schmitt, K., Hubert, R.WN., Arnheim Whole genomic amplification from a single cell: implications for genetic analysis, PNAS 1992 89: 5847-5851) or the DOP-PCR method. These methods make it possible to amplify the entire genome of a single cell.
  • PEP primer extension preamplification
  • the pre-amplified DNA preparation thus obtained and derived from the DNA of a single cell can then be purified and used as genetic material for the specific detection of genetic markers or polymorphism under steps c) and or d) of the method according to the invention.
  • the fetal or maternal origin of a cell collected is demonstrated by amplification of genetic markers or polymorphism or a combination of these markers, starting from preparation of pre-amplified DNA derived from the DNA of a single cell.
  • Genetic polymorphism markers capable of demonstrating the bi-parental contribution to fetal DNA are identified by prior analysis of paternal and maternal DNA using primers specifically identified to characterize paternal DNA and to characterize maternal DNA or, where consensus primers exist to determine the paternal or maternal origin of an allele of a gene, after verification that the primers in question are relevant for the analysis of the available controlled samples.
  • any technique allowing the specific amplification of a given nucleic acid can be used.
  • PCR Polymerase Chain Reaction
  • isothermal amplification methods such as TMA (transcription mediated amplification), NASBA (nucleic acid sequence based amplification), 3SR (self sustained replication sequence) or strand displacement amplification.
  • each pre-amplified DNA preparation of a collected cell can be used for the amplification of at least five different markers.
  • the amplifications carried out by PCR allow the detection of markers of genetic polymorphisms (for example 1, 2, 3, 4 or 5 markers), for the demonstration of the fetal origin of isolated cells.
  • the PCR amplification also makes it possible to detect genetic markers located upstream, downstream or on the CFTR gene characteristic of cystic fibrosis.
  • the sequences likely to carry the mutation, and in particular the deletion or the repetition of a DNA sequence, are amplified and the amplification products are separated according to their size, for example by electrophoresis.
  • the presence of deletions or conversely repetitions is detected by the presence of an amplification product of smaller or greater size than amplification products not carrying a deletion or repetition, which can be represented by a difference in the size of the peaks corresponding to said amplification products.
  • the amplification products can also be sequenced, in particular to precisely characterize the genetic markers, or to highlight point mutations.
  • the steps c. and D. are carried out by the hybridization of all or part of the preparation pre-amplified or amplified DNA with specific DNA probes.
  • the DNA probes are chosen to hybridize specifically on the markers for their identification or on the sequences bearing the markers to be searched. Hybridization of the probes on the markers can be detected according to standard detection techniques for nucleic acid hybridization complexes of slot-blot, Southern blot or, advantageously, today by microarray or microarray chips. networks (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2001 3rd Ed., Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York).
  • the DNA probes specific for the markers to be identified are fixed on a support forming a DNA chip or micro-array or macro-array.
  • the preamplified or amplified DNA preparation is, for example, labeled with a radioactive or fluorescent label, and brought into contact with the DNA chip or microarray or macro-array comprising the specific probes.
  • the intensity of hybridization is measured for each spot containing a specific probe, thus determining with great sensitivity the presence of the desired markers on the DNA of a collected cell.
  • a sample is taken from the pregnant woman.
  • a maternal sample is taken early during pregnancy (for example around the fifth week of pregnancy).
  • the collection of the maternal sample and the diagnostic method according to the invention can be carried out at any time, from the beginning to the end of the pregnancy.
  • sampling and diagnostic methods are carried out between the 7 th and I5 th week of pregnancy.
  • the specimen and the diagnostic method are performed between the 10th and 15th weeks of pregnancy.
  • 3 to 20 milliliters of maternal blood should be taken, preferably between 5 and 10 milliliters. If, for practical reasons, we take between 3 and 20 milliliters of maternal blood, it must be understood that the subsequent analysis of the cells Isolated fetuses described in the context of the invention may be carried out on a more limited volume of blood sample taken, for example between 1 and 10 milliliters, preferably between 2 and 5 milliliters. To increase the sensitivity of the diagnosis, it is possible to perform several independent samples to repeat the diagnosis on different independent samples.
  • a sample in parallel from the father and a sample of cells from the mother, for example by removing oral cells by "scraping" or sampling. of blood, possibly before pregnancy, and to carry out from the material taken, a search for markers specific to the paternal genome and the maternal genome.
  • This parallel study makes it possible to identify specific genetic markers of the father and the mother, which can be used to demonstrate the fetal origin of the isolated cells according to the embodiments described in the present application.
  • fetal cell enrichment of a maternal sample taken, pure or diluted may include cells of fetal origin, any technique may be used, including: filtration; gradient separation; immunologically based selection (positive, immunologically labeled cells are the cells of interest, i.e., fetal cells, or negative, immunologically labeled cells are irrelevant cells); the proliferation of the cells of interest, that is to say the fetal cells; lysis of irrelevant cells.
  • the circulating epithelial (trophoblastic) fetal cells in the blood have a diameter greater than the maternal leukocyte and erythrocyte cells and can be isolated by filtration methods adapted from those described for the isolation of circulating pathogenic cells in the blood such as those described in US Pat. FR 2782730.
  • the teaching of this patent application is incorporated by reference in the present application.
  • step a) consists in the filtration of a maternal sample taken, pure or diluted, which may comprise cells of fetal origin, so as to concentrate on a filter, according to their size, certain cells therein. including cells of fetal origin and, step b) consists of the analysis of the cells retained on the filter and the selection of the presumed cells of fetal origin.
  • filtration can enrich and separate fetal cells from blood cells, especially maternal leukocytes.
  • any method allowing the enrichment of the cell population from the sample taken, in cells of fetal origin can be implemented.
  • an enrichment of the population in fetal cells is achieved by sorting the cells according to the expression of surface markers expressed by the fetal cells to decrease the proportion of cells of maternal origin.
  • Cell sorting techniques are, for example, FACS, immunoaffinity or immunomagnetic column sorting (MACS) or any technique capable of providing enrichment of a cell type on the basis of physical (density) or structural (antigenic) characteristics. particular).
  • a dilution of the sample taken from a filtration solution can be carried out, said filtration solution consisting of a reagent for fixing the cells nucleated and / or lysed red blood cells.
  • An exemplary filtration solution includes a detergent capable of degrading the red blood cell membrane, such as saponin, and a fixative capable of stabilizing the membrane of nucleated cells such as formaldehyde.
  • the maternal sample taken is diluted about 10 to 100 times in the filtration solution.
  • the filtration of the pure or diluted sample is performed using a porous filter to separate the cells according to their size.
  • the porosity of the filter is chosen so as to let the figured elements of the blood, in particular the erythrocytes, the platelets and the maternal leucocytes, and to retain certain nucleated cells and in particular cells. large (epithelial or hematopoietic precursors) of maternal and fetal origin.
  • a porosity filter between 6 and 15 ⁇ m and a density adapted to the selected porosity and able to retain the cells while avoiding the clogging thereof during filtration, may be used in particular.
  • the filter has substantially cylindrical pores of a diameter approximately 8 ⁇ m and with a density of between 5.10 4 and 5.10 5 pores / cm 2 .
  • the filter used is calibrated so that all the pores have a substantially identical diameter.
  • a filter that can be used in the process of the invention is a calibrated filter membrane of "Track-Etched membrane" type polycarbonate having a pore density of 1 ⁇ 10 5 pores / cm 2 , a thickness of 12 ⁇ m and a thickness of a pore size of 8 ⁇ m, such as that marketed by Whatman®.
  • Step a. of the method according to the invention is based on the existence and the development of a specific device called ISET (Acronym for Insulation by Size of Epithelial Tumor CeIIs) and described in EP 0513 139 and comprising on a frame:
  • ISET Acronym for Insulation by Size of Epithelial Tumor CeIIs
  • porous filter capable of retaining certain cells (circulating in the framework of a maternal blood sample) according to their size, mounted between two clamping devices, respectively upstream and downstream of the filtration direction, and intended for sealing filtration,
  • the upstream block comprising means for storing and / or pre-treating the samples to be analyzed
  • downstream block comprising perforations facing the storage means for collecting the waste; forced filtration means.
  • the invention also relates to the adaptation and use of a device of this type to the filtration of fetal cells present in the maternal sample taken for the purposes of the method of detection, non-invasive, prenatal of the cystic fibrosis.
  • adaptation and use we mean:
  • a porosity filter preferably calibrated, capable of retaining cells with an average diameter greater than 8 microns, and better, greater than 10 microns, preferably greater than 15 microns.
  • An average porosity filter of 8 ⁇ m has been shown to meet these desired characteristics;
  • Step a. of the method according to the invention may comprise the use of an ISET type filtration device, for the isolation of fetal cells from the sampled maternal cell sample and comprising a filter with a mean porosity of between 6 ⁇ m and 15 ⁇ m, and preferably about 8 ⁇ m.
  • Step a. may also include the use of an ISET device in which the filter has pores with a diameter of about 8 microns and a pore density between 5.10 4 and 5.10 5 .
  • Step a. may finally include the use of a type of filtration device
  • ISET in which the filtration depression applied is between 0.05 bar and 0.8 bar, and preferably about 0.1 bar.
  • cells retained on the filter during step a. are collected individually. By individual collection of cells, it is necessary to understand any method which makes it possible to collect a specific individual cell selected during step a) for subsequent analysis independently of the other cells retained during step a).
  • cells retained during step a) can be collected individually, in particular by microdissection.
  • step a) consists of a filtration
  • the microdissection consists for example in laser cutting the portion of a filter membrane on which a cell is held or to take off the cell using the laser and then recovering the single cell collected in a suitable tube. This is then able to undergo the various analyzes of steps b), c) and d) described in the context of the invention.
  • the cells retained during step a) can be analyzed "in situ" during step b), without individual collection of cells.
  • This analysis is performed by a cytological, immunological or molecular method, for example one of the following:
  • FISH FISH, in situ PCR, PNA, PRINS.
  • step a) The cells retained during step a) are collected and then analyzed in situ during step b).
  • the individual collection of cells makes it possible to advantageously target genetic analysis on the genome of a single cell. It also makes it possible to detect cystic fibrosis on the genome of a single cell whose fetal origin has been previously demonstrated by genetic analysis.
  • this embodiment of the invention one obtains pure genetic material, that is to say, derived from a single cell, and usable both for the steps c. and D. of the method according to the invention.
  • primers suitable for carrying out step c has been illustrated. or step d., see two steps.
  • other primers may be implemented which consist, for example, of variant oligonucleotides whose sequence is derived from that of a primer chosen from:
  • F 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '(SEQ ID NO: 1); R: 5'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 2); or
  • F ⁇ '-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S '(SEQ ID NO: 5); R: 5'-TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3 '(SEQ ID NO: 6); or
  • F 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3 '(SEQ ID NO: 9); R: 5'-ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3 '(SEQ ID NO: 10); or -F: 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3 '(SEQ ID NO: 13); R: 5'-
  • F ⁇ '-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S '(SEQ ID NO: 17); R: 5'-AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3 '(SEQ ID NO: 18) or
  • F ⁇ '-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S '(SEQ ID NO: 21); R: 5'-ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3 '(SEQ ID NO: 22); or
  • F ⁇ '-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S '(SEQ ID NO: 25); R: 5'-TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3 '(SEQ ID NO: 26) or
  • F 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3 '(SEQ ID NO: 3); R: 5'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3 '(SEQ ID NO: 4); or F: 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3 '(SEQ ID NO: 7); R: 5'-GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3 '(SEQ ID NO: 8); or
  • F 5'-CCCTCTCAATTGT ⁇ GTCTACC-3 '(SEQ ID NO: 19); R: 5'-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3 '(SEQ ID NO: 20); or
  • F 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3 '(SEQ ID NO: 27); R: (5'-TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3 '(SEQ ID NO: 28);
  • F 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 31); R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3 '(SEQ ID NO: 32); F: 5'-CTGATTCATAGCAGCACTTG -3 '(SEQ ID NO: 35); R: 5'-
  • a variant oligonucleotide has, for example, at least 60% identity, preferably 80%, preferably 95% identity, or more, with the primer from which its sequence is derived.
  • Said variant oligonucleotide has one or more sequence modifications with respect to the primer from which its sequence derives, as in particular one or more deletion, addition or substitution type modifications. Nucleotides added are particularly at the 3 'end. In a specific example, said variant oligonucleotide has the same size as the primer from which its sequence derives.
  • the length of said variant oligonucleotide has a smaller size, for example from 10 to 20% relative to that of the primer from which its sequence is derived or optionally, a larger size, for example from 10 to 40%, in particular 30 to 40% relative to the sequence of the primer from which it derives.
  • the oligonucleotide has the same properties as the primer from which it is derived if it can be used as a primer to amplify the DNA of a biological cell sample, in particular to amplify sequences comprising markers of the fetal origin of a cell, or to amplify sequences comprising genetic markers located upstream, downstream or on the CFTR gene characteristic of cystic fibrosis.
  • the cells retained on the filter can be observed under a microscope, for example after staining with hematoxylin and eosin so as to analyze their morphology in order to determine a presumption of their fetal origin.
  • Their epithelial nature can be identified, for example, by immunostaining with an anti-cytokeratin antibody (type KL-i).
  • cytotrophoblastic cells mononucleated, presenting a large nucleus, a condensed chromatin and a reduced cytoplasm, of a diameter between 14 and 20 ⁇ m and syncytiotrophoblastic cells with a larger diameter (44-47 ⁇ m or more) and plurinucleate.
  • Presumption or "presumed” in step (b) thus indicates the high probability of being in the presence of a cell of fetal origin.
  • step a) reinforces the presumption by obtaining indications on the fetal or maternal origin of each of these cells.
  • step a) will be repeated if no presumed cell of fetal origin is observed thereupon.
  • the genetic analysis will be established on all the cells retained during step a) and comprising certain cells whose fetal origin is presumed, in particular on the genome of a small number of cells, ranging from 1 to 20 cells, more particularly from 1 to 10 cells, or on the contrary the analysis will be carried out on, for example, the genome (s) of 1, 2 or 3 cells and advantageously on the genome of individually isolated cells.
  • the presumptive analysis of the fetal or maternal origin of the cells retained on the filter is carried out by the search for the presence of immunological (s) or cytological (s) markers ( s) fetal cells.
  • immunological marker characteristic of fetal cells is meant any antigen or combination of antigens whose expression is normally significantly different between the fetal cells and the maternal cells, and which can be detected using an antibody or a combination of antibodies directed specifically against said antigen or combination of antigens.
  • immunological markers are in particular the antigens associated with trophoblastic cells described in the patent application WO 90/06509. The teaching of this patent application is incorporated by reference in the present application.
  • the search for the presence of immunological markers characteristic of fetal cells consists, for example:
  • the selected antibodies may be of the polyclonal or monoclonal type.
  • An example of an antigen characteristic of fetal cells is the placental alkaline phosphatase antigen.
  • the presumptive analysis of the fetal origin of the cells can be carried out by the determination of cytological markers specific for cytotrophoblastic and / or syncyciotrophoblastic cells.
  • the cytological markers that can be used include all the cytological characteristics of the fetal cells making it possible to differentiate them from other types of circulating cells that may be retained on the filter, in particular, the size of the cells, the shape of the cells, the presence and particular organelle size, nucleus size and number, chromatin structure, etc., or any particular combinations of these cytological characteristics.
  • the cytological characters can be observed by staining the cells using dyes conventionally used in cytology, in particular hematoxylin-eosin and by observation of the labeled cells by optical microscopy.
  • the subject of the invention also relates to a polynucleotide that can be used as a primer to amplify a quantity of DNA of a biological sample characterized in that it comprises or consists of a nucleotide sequence chosen from the following: F: 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '; R: 5'-
  • R ⁇ '-GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-S '; or F: ⁇ '-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S '; R: 5'-AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3 'or
  • F 5'-GAATTATAACCGTAACTGATTC-3 '(SEQ ID NO: 33); R: 5'-GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 34).
  • a variant oligonucleotide has, for example, at least 60% identity, preferably 80%, preferably 95% identity, or more, with the primer from which its sequence is derived.
  • Said variant oligonucleotide has one or more sequence modifications with respect to the primer from which its sequence derives, as in particular one or more deletion, addition or substitution type modifications.
  • said variant oligonucleotide has the same size as the primer from which its sequence derives.
  • the length of said variant oligonucleotide has a size of 10 to 20% less than that of the primer whose sequence is derived from it or, if appropriate, a larger size, for example from 10 to
  • Variant primers of the oligonucleotides mentioned above may, for example, be derived from these oligonucleotides by the addition of one or more nucleotides in 5 'of the aforementioned sequences.
  • the oligonucleotide has the same properties as the primer from which it is derived if it is useful as a primer for amplifying the DNA of a biological cell sample, in particular for amplifying sequences comprising markers of the fetal origin of a cell. or to amplify sequences comprising a mutation of the F508 locus or sequences comprising markers of genetic polymorphism forming a linkage with the CFTR gene characteristic of cystic fibrosis.
  • the subject of the invention also relates to a pair of polynucleotides that can be used as a pair of primers to amplify an amount of DNA of a biological sample, characterized in that it is chosen from the pairs of polynucleotides whose sequences include or consist of: - F: 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '; R: 5'-
  • the subject of the invention also relates to the combination of a pair of so-called external primers, with respect to the target sequence, used in a first amplification phase of a DNA preparation and another pair of primers, called internal or nested with respect to said external primers, used in a second amplification phase on the amplification product obtained by said first amplification phase, said pairs being chosen from:
  • TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3 'as external primers and -F 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3'; R: ⁇ '-GCCCAGGTGATTGATAGTGC-S 'as internal primers; or
  • ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3 'as external primers and -F 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3'; R: ⁇ '-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-S 'as internal primers; or
  • F ⁇ '-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S '; R: 5'-TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3 'as external primers and F: 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3'; R: 5'-TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3 'as internal primers; or
  • F 5'-AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3 '(SEQ ID NO: 29); R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3 '(SEQ ID NO: 30) as external primers and F: 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31); R: 5'-
  • F 5'-CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35)
  • R 5'-AAAACATTTCCATTACCACTG-3 '(SEQ ID NO: 36) as internal primers.
  • the invention also relates to the use of primers in the context of a prenatal, in vitro non-invasive detection method of normal healthy state, healthy carrier state or ill carrier state of cystic fibrosis from the genomic DNA of fetal cells isolated from the maternal sample taken, characterized in that the primers are chosen from: - F: 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3 '; R: 5'-
  • F 5'-GAATTATAACCGTAACTGATTC-S '(SEQ ID NO: 33); R: 5'-GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 34); F: 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 31); R: 5'-
  • the invention also relates to the use of primers in the context of an in vitro method for identifying the fetal character of a single cell collected from the maternal sample taken from a DNA preparation derived from the genome of the single cell collected, characterized in that the primers are chosen from:
  • F 5'-GAATTATAACCGTAACTGATTC-S '(SEQ ID NO: 33); R: 5'-GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3 '(SEQ ID NO: 34); -F: 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3 '; R: 5'-
  • F 5'-CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3 '(SEQ ID NO: 31); R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-S '(SEQ ID NO: 32); F: 5'-CTGATTCATAGCAGCACTTG -3 '(SEQ ID NO: 35); R: 5'-
  • the subject of the invention also relates to a kit for the non-invasive, prenatal detection of the normal healthy state, the healthy carrier state or the cystic fibrosis patient condition comprising one or more primers mentioned above, and where appropriate instructions for performing cystic fibrosis detection.
  • the methods and means (in particular the primers) used in the context of the present invention can be used in the context of the detection of cystic fibrosis and may, where appropriate, be considered, as such, or supplemented by other tests. , as methods and means of diagnosis.
  • Figure 1 Noninvasive prenatal diagnosis in couples with deltaF508 allele
  • STR genotyping in pair 1 (A) with marker D16S539 and pair 6 (A 1 ) with marker D16S3018 In the couple 1 (A), the father (P) is homozygote for the targeted allele, while the mother (M) is heterozygous. Two fetal cells (CF) are shown, characterized by a paternal allele (left) and a maternal allele (right). In pair 6 (A 1 ), both parents are heterozygous with the STR marker used and the two fetal cells (CF) have one maternal allele (left) and one paternal allele (right).
  • Genotyping deltaF508 (B and B ') performed on the fetal cells of pair 1 (B) and 6 (B') shows that the fetus of pair 1 is carrying the deltaF508 allele, having a mutated allele (AM) and a normal allele (AN), while the fetus of the pair 6 is completely normal (homozygous for the normal allele).
  • C and C sequencing of the deltaF508 locus in fetal cells confirms the diagnosis by showing both the mutated and normal pattern in the fetus of pair 1 (C), and the homozygous presence of normal Pallele in the fetus of pair 6 ( VS).
  • Figure 2 Noninvasive prenatal diagnosis in pair 11
  • A Genotyping DNA with the D7S486 marker on chromosome 7, showing that parents (P and M) are heterozygous and that the affected child (Cl: case index) carries mutated alleles d and a. Both fetal cells (CF) of the current pregnancy carry a single mutated allele (d), demonstrating that the fetus is carrier but unaffected.
  • B DNA genotyping of the deltaF508 locus showing that the father carries a mutated allele (AM) and a normal allele (AN). The index case carries the mutated deltaF508 allele, while the two fetal cells of the current pregnancy are homozygous for the normal allele.
  • the fetus carries a mutation on chromosome 7 that is not the deltaF508 mutation.
  • C Schematic representation of the two chromosomes 7 in the paternal DNA (P), the maternal DNA (M), the index case (Cl) and the circulating fetal cells (CF): the father carries a deltaF508 allele, while the mother carries an unknown mutation.
  • the index case carries both mutations and the fetal cells carry only the unknown mutation.
  • Figure 3 Noninvasive prenatal diagnosis in pair 11 A. Genotyping of DNA with the D7S486 information marker on chromosome 7, showing that the parents (P and M) are heterozygous and that the index case (Cl) bears the mutated alleles d and a. The two fetal cells (CF) of pregnancy in courses carry non-mutated alleles (c and b), demonstrating that the fetus is completely normal.
  • FIG. 4 Non-invasive Prenatal Diagnosis (NI-PND) Protocol Diagram for Cystic Fibrosis
  • STR short tandem repeat
  • ISET Insertion by Size of Epithelial Tumor / Trophoblastic cells
  • LCM laser capture microdissection
  • PEP primer extension preamplification
  • MC maternal cells
  • CFC circulating fetal cells
  • A, B, C STR genotyping in pair 1 with marker D16S539 (A), pair 6 with marker D16S3018 (B) and pair 8 with marker D21S1435 (C).
  • the father (P) is homozygous for the target allele (one peak), while the mother (M) is heterozygous (two peaks).
  • Two circulating fetal cells (CFC) in this pair are characterized by a paternal allele (left) and a maternal allele (right).
  • pair 6 (B), and pair 8 (C) both parents are heterozygous with the STR marker used and both fetal cells (CFCs) have one maternal allele (left) and one paternal allele (right) .
  • a ', B', C The deltaF508 genotyping performed on the circulating fetal cells (CFC) of the pair 1 (A '), the pair 6 (B'), and the pair 8 (C) shows that the fetus of the couple 1 is carrying the deltaF508 allele, having a mutated allele (AM) and a normal allele (AN), whereas the fetus of pair 6 is completely normal (homozygous for the normal allele), and the fetus of pair 8 is affected by cystic fibrosis (CF) (homozygous for the allele). mutated).
  • AM mutated allele
  • AN normal allele
  • CF cystic fibrosis
  • a “, B”, C “: sequencing of the F508 locus in fetal cells of the pair 1 (A"), the pair 6 (B ") and the pair 8 (C") confirms the diagnosis by showing both the profile mutated and normal in the fetus of the pair 1 (A "), and the homozygous presence of the normal allele in the fetus of the pair 6 (B”), and the homozygous presence of the mutated allele in the fetus of the pair 8 ( VS").
  • A, B, C DNA genotyping of the pair 11 and their affected child with the D7S486 information marker on chromosome 7, showing that the father (P) and the mother (M) are heterozygous.
  • the father carries the alleles c and a, while the mother carries the alleles d and b.
  • Their affected child (Cl: index case) carries the alleles d and a, which must therefore be linked to the mutated CFTR alleles.
  • Two CFCs of current pregnancy carry alleles d and c, demonstrating that the fetus is CF-positive, but unaffected.
  • A DNA genotyping of the F508 locus showing that the father carries a mutated allele (AM) and a normal allele (AN).
  • the index case has compound heterozygosity, and carries the paternal Fdelta508 allele and a maternal CFTR mutation.
  • Two fetal cells are homozygous for the normal F508 allele.
  • data from A and B show that the fetus carries the maternal CFTR mutation.
  • C Schematic representation of CFTR alleles and CFTR-related STR alleles (a, b, c, d).
  • grayed block unknown CFTR mutation.
  • D, E STR 12
  • DNA genotyping with D7S486 marker on chromosome 7 shows that the father and mother are heterozygous and the index case carries the a and d alleles D7S486, which must therefore be linked to the alleles CFTR mutated.
  • Two CFCs in the current pregnancy carry the D7S486 c and d alleles linked to mutated CFTR alleles, demonstrating that the fetus is completely normal.
  • Example 1 Non-invasive diagnosis of cystic fibrosis predisposition by efficient enrichment of trophoblastic cells and mutation analysis limited to genomes of fetal revealed single cells by genotyping. 1-1 Method
  • ISET isolation according to the size of the epithelial / trophoblastic tumor cells.
  • the paternal DNA and maternal DNA were extracted from 1 ml of blood and 1.5 ng were used for allelotyping with specific primers of the microsatellite markers (STRs) D7S480, D7S486, D16539, D16S3018, D21S1435 and D21S1437.
  • STRs microsatellite markers
  • a set of external primers (out) and one of internal primers (in) (fluoresceinated) were used for each STR marker (see Table 1 for the sequence of primers and PCR profiles).
  • lysis buffer Tris-HCl 100 mmol / l, pH 8, proteinase K 400 ⁇ g / ml
  • PEP amplification primer extension
  • 2 ⁇ l of the first PCR product were amplified again in 40 ⁇ l using the internal primers and the same protocol (see Table 1 for the sequence of primers and PCR profiles).
  • 1 ⁇ l of the PCR product diluted 1:20 was then mixed with 13.5 ⁇ l of deionized Hi-Di Formamide, 0.5 ⁇ l of Genescan 400 HD (ROX) marker (Applied Biosystems, Foster City, CA), and loaded on an ABI Prism 3100 Automatic Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA).
  • the profiles were analyzed using the Genescan and Genotypersoftware programs (Perkin Elmer, Foster City, CA).
  • SEQ ID NO: 1 F 5'-S AAAAACCCTGGCTTATGC 1 5 minutes 94 ° C, 40 x (30 s 94 0 C 30s 58 0 C, SEQ ID NO: 2 A: ⁇ '-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-S 30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • SEQ ID NO: 9 F 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3 '5 min 94 ° C, 40x (30s 94 ° C, 45s 60 ° C, o SEQ ID NO: 10 R: 5'-ATACCATTTACGTTTGTGTGTG- 3 '30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • SEQ ID NO: 13 F 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3 '5 min 94 ° C, 40x (30s 94 ° C, 30s 61 0 C, SEQ ID NO: 14 R: 5'-GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT -3 30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • D16S3018 in SEQ ID NO: 15 F ⁇ '-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S '5 min 94 ° C, 40x (30s 94 ° C, 30s 58 ° C, SEQ ID NO: 16 R: 5'-AGACAGAGTCCCAGGCATT-3 30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • SEQ ID NO: 17 F ⁇ '-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S '5 min 94 ° C, 40 x (30 s 94 ° C, 30 s 58 ° C, SEQ ID NO: 18 R: 5'-AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3 45 sec 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • SEQ ID NO: 21 F 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3 '5 min 94 ° C, 40 x (30 sec 94 ° C, 45 sec 60 ° C, SEQ ID NO: 22 R: 5 1 -ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3 30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • SEQ ID NO: 29 F 5'-AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3 '5 min 94 ° C, 40x (30s 94 ° C, 30s 58 ° C, SEQ ID NO: 30 R: 5'-AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3 30 s 72 ° C), 5 min 72 ° C.
  • At least two informative markers (Table 2), identified from those tested on paternal and maternal DNA isolated from PBL cells (Table 1), were used for allelotyping of microdissected cells. This allowed us to identify at least two fetal cells from only 2 ml of maternal blood.
  • L 1 DNA unique fetal cells was then analyzed with nested primers comprising the deltaF508 locus.
  • This analysis can reveal the deltaF508 allele, which is characterized by a deletion of 3 bp (CTT) (a product of PCR of 117 bp instead of 120 bp, see figure 1), allowing to know if the fetus is affected by the cystic fibrosis (homozygous presence of the deltaF508 allele), carrier of the deltaF508 allele (heterozygous presence of the deltaF508 allele), or normal (homozygous absence of the deltaF508 allele).
  • CTT 3 bp
  • I 1 ADO is no longer a limitation to our dosage.
  • the genotyping step of single cells even if ADO occurs (we have actually observed it twice), the only consequence is the loss of a fetal cell, without the risk of making a wrong diagnosis.
  • For the amplification of cystic fibrosis mutation in single fetal cells we obtained consistent results in the fetal cells analyzed. At this stage, it is possible to mix PEP products obtained from two or more fetal cells, a procedure that is known to eliminate the risk of ADO.
  • EXAMPLE 2 Filtration of a Sample of Pure or Diluted Maternal Blood, in order to Concentrate on a Filter According to Their Size Certain Circulating Cells and in Particular Fetal Origin Cells and Analysis of Fetal cells retained on the filter to obtain a presumption of their fetal or maternal origin.
  • the blood samples were diluted 10-fold in filtration buffer containing 0.175% saponin, 0.2% paraformaldehyde, 0.0372% EDTA and 0.1% BSA, then filtered using a calibrated polycarbonate filter having cylindrical calibrated pores 8 ⁇ m in diameter.
  • the cells retained on the filter were grouped on a circular spot of 0.6 cm in diameter. After staining with eosin and hematoxylin, the spots were analyzed under a microscope and a photograph of each cell was taken at high and low magnification. The size of the cells was determined using the Adobe Photoshop software, taking as reference the size of 8 ⁇ m of the pores. Photos are used to find the cells using the Arcturus Pixcell II microscope (Mountain View, CA).
  • FIG. 2 illustrates the microscopic analysis obtained by this method.
  • Microdissection of each cell was performed by laser capture without any prior filter treatment.
  • photographs of the filter before and after microdissection and the microdissected cell deposited on the capsule were taken.
  • the cell was then lysed in 15 ⁇ l of lysis buffer (100 mM Tris-HCl pH 8, 400 ⁇ g / ml proteinase K) for 16 hours at 37 ° C.
  • the lysate was collected after centrifugation and proteinase K was inactivated at 90 0 C for 10 minutes.
  • primer extension preamplification PEP
  • the DNA was precipitated with ethanol and resuspended in 10 .mu.l of water.
  • Each sample was then tested on the one hand with the primers described in this application.
  • PCRs were carried out on a reaction mixture volume of 20 ⁇ l containing 2 ⁇ l of PEP product (preamplification by primer extension), 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 , 01% gelatin, 200 mM each deoxynucleotide, 20 picomoles of each primer used and 1 U Taq polymerase (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA).
  • 40 amplification cycles 94 ° C. 30 s, 55 ° to 61 ° C. 30 to 45 s, 72 ° C.
  • Example 4 Detection of mutations in the CFTR gene inherited from father and mother in fetal cells isolated from maternal blood allow for safe prenatal diagnosis of cystic fibrosis
  • a multi-marker STR approach was developed to accelerate the genotyping step on a single cell, and the F508 mutation analysis was conducted on the genomes of three trophoblastic cells put together (pooled genomes), so to avoid the problems of allelic loss (allele drop out, ADO).
  • the remaining 5 mL of maternal blood was treated with ISET up to 3 hours after collection, as previously described, using the ISET device (Metagenex, Paris, France, www.metagenex.fr) and stored at -20 ° C. (Beroud et al., 2003, Vona et al., 2002). Three mL of each ISET-treated maternal blood sample (i.e., three spots - spots - on the filter) were analyzed. After immunohistochemical analysis with the KL1 antibody (Vona et al., 2002) to identify epithelial cells, a single-cell laser microdissection was performed using the Nikon TE 2000 U laser-equipped microscope (Nikon, Paris, France and MMI, Zurich, Switzerland).
  • ISET enriches epithelial cells from the blood but also retains about 0.02% of peripheral blood leukocytes (Vona et al 2002, Vona et al 2000).
  • the blood of 5 known carriers of Fdelta508 was treated with ISET, and 75 single cells of leukocytes were microdissected.
  • Each microdissected cell was lysed in 15 ⁇ l of lysis buffer (Tris-HCl 100 mmol / L, pH 8, proteinase K 400 ⁇ g / ml) for 2 hours at 60 ° C., followed by the inactivation of proteinase K at 94 ° C for 15 minutes.
  • lysis buffer Tris-HCl 100 mmol / L, pH 8, proteinase K 400 ⁇ g / ml
  • PEP primer extension primer amplification
  • PCR buffer 25 mM MgCl 2 / gelatin (1 mg / ml), 100 mM tris-HCl, pH 8.3, 500 Mm KCl
  • STR amplifications were carried out in 40 ⁇ l containing 4 ⁇ l of PEP product, 10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2 , 200 ⁇ M of each deoxynucleotide. 0.5 ⁇ M of each primer and 2 U of Taq GoId (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • One ⁇ l of the PCR product diluted 1: 20 was then mixed with 13.5 ⁇ l of Hi-Di deionized formamide and 0.5 ⁇ l of Genescan 400 HD marker (ROX) (Applied Biosystems), and placed in a ABI Prism 3100 Automatic Sequencer (Applied Biosystems). The profiles were analyzed using the Genescan and Genotyper (Applied Biosystems) programs.
  • STR Short Tandem Repeat
  • PA amplification accuracy
  • ADO allele drop out allic loss
  • the genomes of individual cells were individually tested (4 ⁇ L of PEP product by amplification), and in groups of three, by mixing 30 ⁇ L of the PEP product and taking 12 ⁇ L (from 90 ⁇ L) for the amplification of F508.
  • the amplifications were carried out in 40 ⁇ l containing 4 ⁇ l of the PEP product (or 100 ⁇ l containing 12 ⁇ l of the PEP product), 10 mM of Tris-HCl, 50 mM of KCl, 2.5 mM of MgCl 2 , 200 ⁇ l of each deoxynucleotide, 0.5 ⁇ l of each primer. and 2 U of Taq GoId (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).
  • ISET Insertion by Size of Epithelial Tumor / Trophoblastic that isolation according to the size of the epithelial / trophoblastic tumor cells; CVS (chorionic villus sampling) chorionic villus sampling; F508del / N, with heterozygous Fdelta508 allele; N / N, with homozygous normal alleles; F508del / F508del, with homozygous Fdelta508 alleles;
  • fetal cell analysis was performed by an indirect method, using polymorphic polymorphic STR markers linked to the CFTR locus on chromosome 7, thus making it possible to compare the index case and the haplotypes of the fetus.
  • Noninvasive tests were performed in the Biochemistry Department of Necker Hospital - Sick Children using a completely blinded approach by operators who were not informed of the results of the invasive analysis, which was performed in the Department of Medical Genetics of the same Hospital.
  • allelic loss (ADO) is a stochastic event, and affects either allele at a frequency of about 1 in 10 (0.1) assays, it will affect the same allele at a frequency of 1/20 (0.05).
  • allelic loss (ADO) is a stochastic event, and affects either allele at a frequency of about 1 in 10 (0.1) assays, it will affect the same allele at a frequency of 1/20 (0.05).
  • We therefore deduced that if we mixed the DNA of 3 or more fetal cells, the frequency of allelic loss affecting the same allele would drop to 0.0001 (0.05 x 0.05 x 0.05 0.000125) .
  • DNAs extracted from maternal blood (1 mL) and paternal blood (1 mL) are compared using STR primers to identify informative STR markers.
  • ISET is used to enrich feto-circulating trophoblasts from maternal blood (5 mL).
  • the trophoblastic cells, identified by immunolabeling with KL1 and by cell morphology, are then individually harvested from the ISET filter by laser capture microdissection (LCM), and their DNA is then analyzed after cell lysis.
  • the complete genome of the individual cells is first amplified by preamplification by random primer extension (PEP) (final volume: 60 ⁇ L).
  • Genotyping analyzes allowed us to identify at least three fetal cells from 3 mL of each maternal blood (see for example in Figure 5, elements A, B and C). These fetal cells have been individually tested, and also in groups. In groups 1 to 10 (see Table 4 above, see Figure 5) where both parents carry deltaF508, we studied the DNA extracted from fetal cells with primers covering the F508 locus (see Figure 5). ). This assay identified the deltaF508 mutation that is characterized by a three base pair deletion (CTT) that yields a 117 bp PCR product instead of 120 bp (see FIGS.
  • CTT three base pair deletion
  • allelic in the PEP product groups from the product groups PEP of three fetal cells.
  • the method involves the isolation of circulating fetal cells (CFCs) by ISET and laser microdissection, genotyping to determine the presence of paternal markers (ie to confirm the fetal origin of these cells), and the analysis of the mutation of a pool of three cells whose fetal character had been genetically proven. Fetal cells can be isolated from all mothers without additional risk of miscarriage, and mutation analysis can be performed on pools of cells that have been proven fetal, reducing to almost zero, and significantly, the probability of ADO (allelic loss). These features make the test reliable, and potentially clinically applicable as a safe alternative to invasive prenatal diagnostic procedures.
  • CFCs circulating fetal cells
  • Fetal DNA lacking cells in maternal plasma corresponds to 3-5% of total plasma DNA (Lo, et al., 1998), and allows determination of fetal sex, fetal Rh status, and fetal point mutations inherited from the father since this DNA does not exist in the maternal genetic inheritance (Li, et al., 2005, Li, et al., 2004).
  • This approach can not be applied routinely for the prenatal diagnosis of recessive disorders such as cystic fibrosis which, by definition, requires the study of mutations inherited from the mother and father.
  • Our new approach overcomes all the obstacles of non-invasive prenatal diagnosis of cystic fibrosis.
  • the rare circulating trophoblasts which are considered not to persist after delivery (Bianchi, et al., 1996) are enriched by ISET because they are larger than peripheral blood leukocytes. This enrichment is so effective that fetal cells, 3 or more, have been found in a single sample of only 2-4 mL of blood taken from all mothers in the 51-member group tested to date in our laboratory.
  • Individual cell genotyping after laser microdissection allows unequivocal identification of fetal cells by bi-parental contribution to their genome. At the individual cell genotyping stage, even if ADO occurs, the consequence is that the DNA of the individual cell is incompletely characterized, and therefore discarded. There is no risk of making an incorrect diagnosis.
  • the optimized PEP protocol includes the degree of preservation of DNA (we retain ISET filters for non-invasive prenatal diagnosis at -20 0 C), treatment with proteinase K to lyse cell proteins (several protocols were compared), and the quality of the degenerate primers used for PEP (all primer lots are checked prior to their use in the non-invasive prenatal diagnostic protocol).
  • This optimized strategy which can be accelerated by automated laser microdissection and the development of kits for specific PCR analysis, should allow access of non-invasive prenatal diagnosis of cystic fibrosis in clinical application.
  • Bianchi DW Simpson JL, LG Jackson, Elias S, Holzgreve W, Evans Ml, KA Dukes, Sullivan LM, Klinger KW, Bischoff FZ and others. 2002. Fetal gender and aneuploidy detection using fetal cells in maternal blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal CeII Isolation Study. Prenat Diagn 22 (7): 609-15. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. 1996. MaIe fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci USA 93 (2): 705-8.
  • Ciarleglio LJ Bennett J RL 1 Williamson, Mandell JB, JH Marks. 2003. Genetic counseling throughout the life cycle. J Clin Invest 112 (9): 1280-6.
  • Lacour B Paterlini-Brechot P. 2002. Enrichment, immunomorphological, and genetic characterization of fetal cells circulating in maternal blood.

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Abstract

La présente invention est relative à une méthode de détection, non invasive, prénatale in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose, à partir de cellule (s) foetale (s) issues d'un échantillon maternel, comprenant l'ADN à tester d'un individu. L'invention porte également sur des amorces oligonucléotidiques et sur leur utilisation dans le cadre d'une méthode de détection, non invasive, prénatale in vitro de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose .

Description

Méthode de détection, non invasive, prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose
La présente invention est relative à une méthode de détection, non invasive, prénatale de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose, à partir de cellule(s) fœtale(s) issues d'un échantillon maternel, comprenant l'ADN à tester d'un individu. La méthode selon l'invention est utilisable dans un protocole de diagnostic in vitro de la mucoviscidose.
L'invention porte également sur des amorces oligonucléotidiques et sur leur utilisation dans le cadre d'une méthode de détection, non invasive, prénatale de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose. L'invention concerne aussi des amorces et leur utilisation dans le cadre d'une méthode pour l'identification, sur une préparation d'ADN dérivée du génome d'au moins une cellule collectée à partir d'un échantillon maternel, d'un ou plusieurs marqueurs de polymorphisme génétique, démontrant la contribution bi-parentale à l'ADN et, en conséquence, l'origine fœtale de ladite au moins une cellule. L'invention porte également sur un polynucléotide et une association de
1 polynupléotides utilisables comme amorces pour amplifier une quantité d'ADN d'un échantillon biologique, ainsi que sur un kit pour la détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose.
La mucoviscidose est la maladie récessive autosomique mettant en danger la vie des malades la plus répandue parmi les enfants blancs, affectant un nouveau-né sur 3500 aux, Etats-Unis (Kosorok, Disease, 1996), avec une fréquence des porteurs variant de 1 sur 20 à 1 sur 40 ou plus (Bobadilla, 2002). La maladie est caractérisée par une imperfection du canal chlore qui est imputable à des altérations, précisément à des mutations dans le gène régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFJR) (Cystic Fibrosis Foundation, 2003). Environ 1000 mutations ont été découvertes, notamment celle correspondante à Palièle deltaF508 qui représente 68% des allèles mutés dans le monde (Karem, 1989). L'imperfection du canal chlore entraîne des anomalies au niveau des électrolytes et des sécrétions macromoléculaires des glandes exocrines, induisant un risque d'obstruction "canalaire pancréatique in utero, d'insuffisance pancréatique, de bronchopneumopathie chronique obstructive et d'infections respiratoires récurrentes. L'espérance de vie moyenne des patients est d'environ 30 ans, mais la survie des patients atteints de mucoviscidose a augmenté lors des 4 dernières décennies.
Plus de 10 millions d'américains portent la mutation delta F508 du gène
CFTR associée à la mucoviscidose et environ 80% des nourrissons nés avec la mucoviscidose sont conçus par des parents qui n'ont pas d'antécédents familiaux de la maladie (Fink, Collins, 1997). Comme la maladie est relativement commune, ses premiers signes sont précoces. Les coûts de traitement de cette maladie sont élevés, elle est finalement fatale. La mucoviscidose fait partie des maladies les plus prometteuses pour un criblage génétique (Balinsky, 2004, Garber, Fenerty, 1991).
Un diagnostic généjtiquejïable est réalise sur des cellules foetales obtenues par amniocentèse, prélèvement de villosités choriales (PVC) ou prise de sang fœtal, lesquels comportent un risque non négligeable de fausse couche respectivement égal à 0,5%, 1% et 3% (Ciarleglio, 2003). Il y a donc un intérêt à rechercher des méthodes de diagnostic alternatives, de préférence non invasives.
La demande de ..brevet WO02/088736 décrit une méthode de diagnostic prénatal non-invasiye mise en œuvre à partir d'un échantillon de sang maternel permettant en particulier la détection précoce du sexe génétique du fœtus.
L'enseignement de cette demande de brevet est incorporé par référence dans la présente demande.
Des efforts antérieurs pour enrichir les cellules fœtales circulantes et les utiliser à des fins de diagnostic prénatal de la mucoviscidose ont été réalisés (Martel-Petit, 2001 ), et l'ADN fœtal issu du plasma maternel a été utilisé pour détecter une mutation paternelle héréditaire (Gonzalez-Gonzalez, 2002). Aucune méthode pour le diagnostic de la mucoviscidose ne s'est cependant révélée fiable et suffisamment efficace pour être appliquée de façon routinière en remplacement des protocoles invasifs.
Les inventeurs se sont intéressés à une méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose, fiable et suffisamment efficace pour être appliquée de façon routinière, laquelle n'implique pas de prélèvement de tissus ou cellules fœtales par biopsie et/ou effraction de la barrière placentaire.
L'invention définit des moyens adaptés à la détection d'anomalies génétiques connues, en particulier de mutations connues du gène CFTR, ou des moyens adaptés à la détection de mutations inconnues ou indéterminées du gène CFTR.
Dans le cadre de l'invention, les cellules foetales sont prélevées à partir d'un échantillon prélevé chez la femme enceinte.
L'invention a donc pour objet une méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose, à partir d'un échantillon de cellule(s) fœtale(s) isolée(s) d'un échantillon maternel prélevé comprenant l'ADN à tester d'un individu, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. l'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale; b. l'analyse des cellules retenues et la sélection des cellules présumées d'origine fœtale ; c. la démonstration par analyse génétique, de l'origine fœtale d'une ou plusieurs cellules sélectionnées à l'étape b et, d. sur l'ADN fœtal de cellule(s) sélectionnée(s) à l'étape c, la recherche d'allèles du gène CFTR porteurs de la mutation ΔF508 ou d'autres mutations connues ou, la recherche d'allèles d'un locus portant un polymorphisme génotypique génétiquement lié à une mutation morbide non identifiée du gène CFTR, au moyen des étapes suivantes:
• l'amplification de l'ADN fœtal au moyen de couples d'amorces choisis pour leur capacité à amplifier le locus susceptible de porter la mutation connue recherchée sur le gène CFTR ou un locus comprenant, un polymorphisme génotypique génétiquement lié (linkage) à la mutation du gène CFTR lors de la ségrégation,
• l'identification sur les allèles correspondant aux fragments d'ADN amplifiés, de la présence ou de l'absence de la mutation connue recherchée du gène CFTR ou du locus polymorphique génétiquement lié au gène CFTR et
• la comparaison des allèles fœtaux avec les allèles correspondant d'échantillons contrôle et la détermination à partir de l'observation des allèles amplifiés, de la détection de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose chez l'individu testé.
Dans le cadre de la présente demande, l'individu est l'individu à naître représenté pour les besoins de la détection selon l'invention, par ses cellules fœtales. La méthode de détection selon l'invention offre des performances suffisantes en termes de spécificité et de sensibilité pour être considérée comme une méthode de diagnostic prénatal alternative aux méthodes invasives, ou à tout le moins pour être inclue dans des protocoles de diagnostic. La méthode selon l'invention permet ainsi, à partir de l'ADN d'une ou d'un petit nombre de cellules fœtales, d'identifier la présence ou l'absence, hétérozygote ou homozygote, d'allèles portant des anomalies du gène CFTR responsables, chez l'individu né, de la mucoviscidose.
La présence d'allèles homozygotes mutés au niveau du gène CFTR rend compte d'un individu qui sera normal, porteur sain ou affecté (porteur malade) par la mucoviscidose.
Il existe quatre statuts : -homozygote sain : 2 allèles normaux ;
-hétérozygote simple : 1 allèle normal / 1 allèle muté (deltaF508 ou mutation inconnue) ;
-homozygote atteint : 2 allèles mutés (deltaF508) -hétérozygote composite : soit 1 allèle muté deltaF508 / 1 allèle muté mutation inconnue soit 1 allèle muté mutation inconnue / 1 allèle muté mutation inconnue.
Il y a absence de la maladie dans les cas « homozygote sain » et « hétérozygote simple ». II y a présence de la maladie dans les cas « homozygote atteint » et « hétérozygote composite ».
L'expression « état de porteur sain » signifie que l'individu est hétérozygote simple pour l'allèle muté du gène CFTR.
L'expression « état de porteur malade » signifie que l'individu est homozygote atteint ou hétérozygote composite pour l'allèle muté du gène CFTR.
L'expression « état sain normal » signifie que l'individu comporte deux allèles normaux.
Cette détection est réalisée par une méthode de recherche directe d'une mutation connue, ou lorsque la mutation du gène CFTR responsable de la mucoviscidose n'est pas connue ou n'a pas été identifiée chez les parents de l'individu testé, par une méthode indirecte, consistant à détecter un ou plusieurs marqueurs de polymorphisme ayant un lien génétique (linkage) avec le gène CFTR, ledit marqueur se trouvant être hérité par co-ségrégation avec ledit gène CFTR, au cours de générations.
Dans le cadre de cette méthode de détection, non invasive, prénatale in vitro de la mucoviscidose, une altération en particulier une mutation connue du gène CFTR, est par exemple celle qui affecte la position 508 des acides aminés correspondants, résultant en la délétion de trois nucléotides identifiée sous la désignation delta F508.
Lorsque la méthode selon l'invention est mise en œuvre pour rechercher une mutation inconnue ou qui n'a pas été identifiée chez les parents de l'individu testé, on a recours à la recherche de polymorphismes génétiques, en particulier de polymorphismes génotypiques situés en amont ou en aval du gène CFTR, sur le chromosome 7, qui sont caractérisés par leur coségrégation avec le gène CFTR au cours des générations. Un allèle d'un tel marqueur est en principe toujours associé au même allèle du gène CFTR. Par l'expression « échantillon de contrôle » on entend, par rapport à l'échantillon biologique donnant accès aux cellules fœtales, un ou plusieurs échantillons biologiques provenant respectivement du père et de la mère lorsque la mutation recherchée du gène CFTR est une mutation connue, par exemple la mutation du locus delta F508. Lorsque la mutation n'est pas connue ces échantillons de contrôle sont un ou plusieurs échantillons biologiques provenant respectivement du père et de la mère et on doit y ajouter un échantillon biologique d'un enfant de la même fratrie qui est affecté par la mucoviscidose (cas index). Ces échantillons sont traités pour donner accès à l'ADN génomique respectivement du père, de la mère et de l'enfant de la même fratrie.
Par l'expression « échantillon maternel», on entend tout échantillon biologique, prélevé chez la mère de l'individu à tester, par une méthode non invasive, ledit échantillon comprenant des cellules fœtales ainsi que d'autres types de cellules. Dans un exemple spécifique, l'échantillon maternel peut être du sang maternel prélevé chez la femme enceinte, comprenant des cellules fœtales ainsi que d'autres cellules circulantes, telles que les leucocytes. L'étape a de la méthode selon l'invention, consistera dans ce cas à séparer les cellules fœtales des autres cellules circulantes. Dans un autre mode de réalisation de l'invention, l'échantillon maternel est prélevé chez la femme enceinte au niveau du col de l'utérus, soit par lavage avec une solution (par exemple physiologique), soit par prélèvement de glaire sans lavage, sans effraction du sac amniotique. L'échantillon ainsi prélevé contient en principe des cellules fœtales. La méthode de détection de la mucoviscidose selon l'invention peut être entendue comme une méthode in vitro non invasive permettant d'évaluer la prédisposition d'un individu à la mucoviscidose, en identifiant chez cet individu la présence ou l'absence, hétérozygote ou homozygote, d'allèles portant des anomalies du gène CFTR responsables de la mucoviscidose. Sauf à disposer des informations requises sur l'ADN des échantillons de contrôle avant d'entreprendre la détection selon l'invention sur l'ADN fœtal prélevé, les échantillons de contrôle sont traités, pour les étapes c. et d. de la méthode de l'invention, comme l'échantillon d'ADN fœtal.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la quantité d'ADN qui est amplifiée est une petite quantité d'ADN, avantageusement inférieure à 5pg, par exemple de l'ordre de 2pg. Les amorces d'amplification doivent donc être définies pour permettre l'amplification d'une petite quantité d'ADN, par exemple une quantité d'ADN correspondant à celle d'une cellule unique ou un nombre réduit de cellules foetales. Selon un exemple spécifique de la méthode de détection, l'étape d'amplification de l'étape c. et/ou l'étape d'amplification de l'étape d. comprend au moins une phase d'amplification, par exemple, elle comprend une première phase d'amplification réalisée avec des amorces externes et une deuxième phase d'amplification réalisée avec des amorces internes.
Dans un exemple spécifique de l'invention, I1ADN de l'échantillon de l'individu testé dérive du génome d'au moins une cellule fœtale.
Dans un exemple spécifique, l'ADN de l'échantillon cellulaire dérive du génome d'au moins une cellule fœtale isolée, en particulier du génome d'un petit nombre de cellules, allant de 1 à 20 cellules, plus particulièrement de 1 à 10 cellules, par exemple le(s) génome(s) d'1 , 2 ou 3 cellules, préférentiellement au moins trois cellules (cf. exemple 4 ci-dessous) et avantageusement du génome de cellules isolées individuellement.
Dans un exemple spécifique, l'ADN de l'échantillon dérive du génome d'une cellule fœtale unique ou d'un nombre de cellules fœtales égal ou inférieur à 20, plus particulièrement à 10. De préférence, le nombre de cellules fœtales est au moins de trois cellules.
Si la détection sur l'ADN d'une cellule unique n'offre pas un résultat pertinent, en particulier si l'amplification est réalisée par PCR et que l'un des deux allèles du gène portant le marqueur recherché n'est pas amplifié ou pas détecté
(situation dite d'Allele Drop Out) du fait de la quantité d'ADN mise en œuvre, on peut augmenter le nombre de cellules fœtales à partir desquelles on récupère l'ADN à tester qui est alors utilisé sous forme de pool. En particulier, on aura recours à 2, 3, ou par exemple entre 2 et 20 cellules, préférentiellement au moins trois cellules, avantageusement entre 3 et 20 cellules (bornes incluses), cf. exemple 4 ci-dessous (absence d'ADO).
Après avoir déterminé les allèles du gène CFTR de l'ADN fœtal ou les allèles du locus portant le ou les marqueurs de polymophisme ayant un linkage avec le gène CFTR, une comparaison est réalisée avec les allèles du père, de la mère et lorsque cela s'avère nécessaire, de l'enfant de la fratrie affecté par la mucoviscidose (appelé Cas Index) afin de savoir si, dans l'échantillon d'ADN étudié de l'individu testé, il y a présence homozygote d'un allèle caractéristique d'une altération génétique liée à la mucoviscidose, présence hétérozygote d'un allèle caractéristique d'une altération génétique liée à la mucoviscidose ou absence homozygote d'un allèle caractéristique d'une altération génétique liée à la mucoviscidose.
Pour pouvoir détecter in vitro la mucoviscidose chez l'individu dont on teste l'ADN fœtal, il faut, dans une première phase de la détection, conformément à l'étape c. de la méthode de l'invention, établir la démonstration de l'origine fœtale de l'ADN. Cette détermination du caractère fœtal de l'ADN est encore appelée génotypage dans la présente demande. Cette étape est réalisée au moyen de marqueurs de polymorphisme génétique. Il est nécessaire que les marqueurs de polymorphisme génétique utilisés soient informatifs, en ce sens qu'ils permettent de différencier l'allèle de chaque marqueur apporté par le père et celui apporté par la mère. Il faut donc que les marqueurs de polymorphisme maternel et paternel soient distincts l'un de l'autre.
Dans un mode de réalisation particulier, l'invention concerne une méthode de détection de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose, caractérisée en ce que les amorces informatives utilisées à l'étape c. sont dérivées de la séquence d'un chromosome choisi parmi le chromosome 16, le chromosome 21 ou le chromosome 7.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, les amorces utilisées à l'étape c. sont dérivées de la séquence du chromosome 7 et sont proches de l'allèle morbide de la mucoviscidose. L'allèle morbide désigné ici est l'allèle du gène CFTR (situé sur le chromosome 7) qui porte l'anomalie responsable de la mucoviscidose.
Préalablement à l'étape de génotypage c. et à l'étape de recherche des allèles du gène CFTR ou des allèles d'un locus portant un polymorphisme génétique génétiquement lié à un allèle anormal du gène CFTR, l'invention requiert la mise en œuvre des étapes suivantes : a. l'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale; b. l'analyse des cellules retenues pendant l'étape a) afin d'obtenir une présomption de leur origine fœtale ou maternelle ;
Dans le cadre de la méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose selon l'invention, tout type de technique peut être utilisé, d'une part, pour l'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale;(étape a)), d'autre part, pour l'analyse des cellules retenues pendant l'étape a) afin d'obtenir une présomption de leur origine fœtale ou maternelle (étape b)).
Différentes méthodes utilisables pour ces étapes a. et b. seront envisagées et illustrées ci-dessous, après la description des étapes c. et d. Dans un exemple spécifique de l'invention, les génomes cellulaires sont analysés individuellement au cours de l'étape c. Au cours de l'étape d., l'analyse des génomes cellulaires est soit effectuée sur le génome de chaque cellule pris individuellement, soit sur les génomes réunis (poolés) de plusieurs cellules fœtales.
Plus particulièrement, l'étape c. de génotypage comprend ou consiste en l'identification, sur une préparation d'ADN dérivée du génome de la cellule unique collectée (cellule individuelle), d'un ou plusieurs marqueurs de polymorphisme génétique, ou d'une combinaison de ces marqueurs, démontrant la contribution bi-parentale à l'ADN et en conséquence, l'origine fœtale de ladite au moins une cellule. Dans le cadre de la présente méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose, par marqueur de polymorphisme génétique, il faut comprendre toute caractéristique identifiable sur l'ADN, dont la présence est corrélée à un génotype particulier et le cas échéant, à un phénotype particulier. Les marqueurs utilisés au cours de l'étape c. permettent de distinguer l'ADN paternel de l'ADN maternel et donc de démontrer la composition bi-parentale de l'ADN fœtal. Il peut donc être suffisant qu'ils soient corrélés à un génotype particulier.
On peut citer par exemple les marqueurs de polymorphisme de longueur de fragments de restriction (RFLP), les marqueurs SNP (Single Nucleotide Polymorphism), les marqueurs micro-satellites, les marqueurs VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) ou STR (Short Tandem Repeats).
Les marqueurs micro-satellites sont particulièrement préférés pour la caractérisation des cellules et la mise en œuvre du diagnostic prénatal. Dans un mode de réalisation de l'invention, au moins un marqueur de polymorphisme à identifier est un marqueur microsatellite, un marqueur VNTR (Variable Number of Tandem Repeats), un marqueur SNP (Single Nucleotide Polymorphism) ou un marqueur STR (Short Tandem Repeats). Ceux-ci présentent en effet l'avantage d'être identifiables par l'amplification à l'aide d'amorces spécifiques. Les marqueurs micro-satellites, VNTR ou STR, sont composés de répétitions en tandem, le plus souvent de motifs polyCA/GT. Les variations alléliques, dues à la variation du nombre des répétitions, sont aisément détectées par amplification de type PCR, grâce à l'utilisation d'amorces correspondant aux séquences uniques flanquant le microsatellite. Une carte physique de ces marqueurs microsatellites et la séquence de leurs amorces associées sont décrits par Dib et al. (Dib, C, Faure, S., Fizames, C, Samson, D., Drouot, N., Vignal, A., Missasseau, P., Marc, S., Hazan, J., Seboun, E., Lathrop, M., Gyapay, G., Morissette, J., and Weissenbach, J. A comprehensive genetic map of the human génome based on 5.264 microsatelites. Nature 1996 380 : 152-154). Par cette méthodologie, la mise en évidence d'une contribution biparentale au génotype des cellules analysées permet d'établir de manière certaine l'origine fœtale des cellules analysées.
Afin de démontrer l'origine fœtale ou au contraire maternelle d'une cellule unique collectée, dans un mode de mise en oeuvre particulier, il peut être suffisant d'effectuer la recherche d'un marqueur ou d'une combinaison de marqueurs ou un dosage allélique de ces marqueurs qui se distinguent de ceux du génome de cellules maternelles. En particulier la recherche sur le génome de ladite cellule collectée, peut être portée sur un marqueur ou d'une combinaison de marqueurs spécifique de l'ADN de cellules paternelles. Leur présence est nécessairement la signature d'une origine fœtale de la cellule en cause. Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, l'étape c. peut comprendre : i) - l'amplification de l'ADN pris individuellement, d'une ou plusieurs cellules sélectionnées, à l'aide d'amorces dites informatives, capables d'amplifier des polymorphismes génétiques préalablement déterminés pour distinguer les allèles maternels des allèles paternels de façon à reconnaître le génome fœtal par la présence d'un allèle paternel et d'un allèle maternel dans chaque cellule sélectionnée ; ii) - la comparaison des allèles de l'ADN desdites cellules avec les allèles parentaux correspondants; iii) - la sélection de l'ADN de cellule(s) comportant un allèle maternel et un allèle paternel pour le ou les polymorphismes génétiques identifiés, démontrant l'origine fœtale de l'ADN de la(les) cellule(s). Les conditions de réalisation des amplifications sont par exemple les suivantes : 5 min 94°C, 4Ox (30 s, 94°C ; 30 à 45 s, 55 à 610C ; 30 s 72°C), 5 min 72°C.
Dans un exemple spécifique, deux phases d'amplification peuvent être réalisées comme suit : une première phase d'amplification de la préparation d'ADN dérivée du génome d'une cellule unique collectée est effectuée avec une ou plusieurs amorces nucléotidiques dites externes par rapport à la séquence cible et une deuxième phase d'amplification sur le produit d'amplification obtenu par l'étape précédente est effectuée avec une ou plusieurs amorces nucléotidiques dites internes ou emboîtées par rapport aux dites amorces externes. Les amorces externes et internes ci-dessus, sont dites informatives, c'est à dire capables d'amplifier des polymorphismes génétiques préalablement déterminés comme étant distincts et caractéristiques sur des allèles maternels d'une part et paternel d'autre part, de façon à permettre d'identifier les polymorphismes génétiques recherchés typiques des allèles fœtaux.
Les amorces sont des oligonucléotides synthétiques dont la séquence est déterminée pour permettre l'amplification d'une séquence d'ADN comprenant les marqueurs informatifs du caractère fœtal de la cellule testée.
En conséquence, les amorces utilisables pour réaliser l'étape c. sont dites informatives du caractère fœtal de la cellule ou, selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ces amorces sont dites informatives de la contribution bi- parentale à la cellule testée.
Des amorces informatives conduisent avantageusement à amplifier des fragments d'ADN comportant plusieurs polymorphismes, de façon préférée un grand nombre de polymorphismes. Les polymorphismes sont identifiés sur les séquences d'ADN d'intérêt, notamment sur le chromosome 7, dans les bases de données disponibles (NCBI par exemple). A partir de ces données, on identifie des oligonucléotides qui permettent l'amplification dans les conditions de l'invention, de façon à permettre le génotypage ou la détection efficace, sensible et spécifique.
Ces amorces informatives peuvent être identifiées spécifiquement pour une famille (père et mère de l'individu testé) par une analyse génétique comparée des génomes du père et de la mère. Alternativement, ces amorces informatives peuvent être des amorces dont on a montré qu'elles sont capables d'amplifier des séquences d'ADN comprenant des marqueurs de polymorphisme génétique partagés par plusieurs familles, voir consensuels, pour ce qui est du caractère informatif de l'origine paternelle ou maternelle d'un allèle d'un gène.
Tel est le cas des amorces identifiées ci-dessous qui ont permis de révéler la contribution bi-parentale à l'ADN de la cellule testée pour démontrer son origine fœtale.
Les amorces externes dites amorces informatives utilisables à l'étape c. sont choisies parmi les couples d'amorces suivants où F signifie « forward » et s'hybride au brin d'ADN orienté 3' - 5' dans la séquence cible et R signifie « reverse », et s'hybride au brin d'ADN orienté 5' - 3' dans la séquence cible:
-F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' (SEQ ID NO : 1) ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 2) ; -F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' (SEQ ID NO : 5) ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' (SEQ ID NO : 6) ;
-F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' (SEQ ID NO : 9) ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-S' (SEQ ID NO : 10) ;
-F : 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' (SEQ ID NO : 13) ; R : 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' (SEQ ID NO : 14) ;
-F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' (SEQ ID NO : 17) ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' (SEQ ID NO : 18) ;
-F : 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3' (SEQ ID NO : 21 ) ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' (SEQ ID NO : 22) ; - F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34).
Les amorces internes ou emboîtées dites amorces informatives utilisées à l'étape c. sont choisies parmi les couples d'amorces suivants :
-F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' (SEQ ID NO : 3) ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 4) ;
-F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' (SEQ ID NO : 7) ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' (SEQ ID NO : 8) ; -F : 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' (SEQ ID NO : 11) ; R : 5'- ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' (SEQ ID NO : 12) ;
-F : 5'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' (SEQ ID NO : 15) ; R : 5'- AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' (SEQ ID NO : 16) ; -F : 5'-CCCτCTCAATTGTTTGTCTACC-3' (SEQ ID NO : 19) ; R : 5'-
GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' (SEQ ID NO : 20) ;
-F : δ'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-S' (SEQ ID NO : 23) ; R : 5'- TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' (SEQ ID NO : 24) ;
- F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ;
- F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36).
L'étape d. qui suit la réalisation de l'étape c. doit permettre de détecter la mucoviscidose à partir des cellules fœtales retenues à l'issue de l'étape c. On recherche donc des mutations connues du gène CFTR ou des marqueurs de polymorphisme formant un linkage avec l'allèle muté du gène CFTR, dont la présence témoigne d'altérations de l'ADN du gène CFTR.
On sait dans l'art antérieur, que ces mutations affectent le gène CFTR, majoritairement dans la région dite du locus F508 où une mutation par délétion de trois nucléotides conduit à l'obtention d'un gène CFTR muté en position « 508 ». En conséquence, des fragments amplifiés du gène CFTR, au moyen des amorces selon l'invention, sont ceux qui englobent la mutation ΔF508. Les inventeurs ont donc défini des oligonucléotides, utilisables en tant qu'amorces d'amplification pour effectuer l'étape d., qui permettent d'amplifier une séquence d'ADN comportant le locus F508, et de détecter la mutation dudit locus.
D'autres mutations peuvent cependant avoir lieu sur le gène CFTR, dans d'autres régions que le locus F508. Les inventeurs ont donc défini d'autres oligonucléotides amorces, capables d'amplifier des séquences d'ADN portant un polymorphisme génétique formant un linkage (ou liaison génétique) avec un locus portant d'autres mutations dites « non identifiées » associées à la mucoviscidose. Cette amplification se fait dans le cadre de la méthode de détection de la mucoviscidose. Ces amorces ont été identifiées à partir de l'ADN du chromosome 7. L'étape d. de la méthode de l'invention peut donc être mise en œuvre en utilisant des couples d'amorces choisis parmi les suivants :
- pour les mutations de type ΔF508 :
- le couple d'amorces externes DeltaF508 out (F : 5'- TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-3' (SEQ ID NO : 25) ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' (SEQ ID NO : 26)), utilisé seul ou lors de la première phase d'amplification de l'étape d.quand elle est effectuée, et
- le couple d'amorces internes deltaF508 in (F : 5'- TCTGTTCTCAGTTTTCÇTGG-3' (SEQ ID NO : 27) ; R : 5 -
TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' (SEQ ID NO : 28)) utilisé lors de la deuxième phase d'amplification de l'étape d. ou seul en cas d'amplification unique à l'étape d. ;
- pour les autres mutations indéterminées du locus deltaF508, des amorces identifiées sur la chromosome 7 amplifiant un fragment d'ADN formant un linkage avec le gène CFTR:
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' (SEQ ID NO : 1) ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 2) ;
- F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' (SEQ ID NO : 5) ; R : δ'-TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-S' (SEQ ID NO : 6) ;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ; - F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' (SEQ ID NO : 3) ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 4) ;
- F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' (SEQ ID NO : 7) ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' (SEQ ID NO : 8) ;
- F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ;
- F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36). Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, dans le cadre de la méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose selon la voie dite indirecte, dans laquelle l'anomalie du gène CFTR recherchée n'est pas connue, les étapes c et d sont réalisées dans les conditions suivantes : • l'amplification selon les étapes c. et d. est confondue et réalisée au moyen d'amorces informatives d'amplification capables d'amplifier un locus comprenant un polymorphisme génotypique génétiquement lié (linkage) au gène CFTR lors de la ségrégation, par exemple les amorces identifiées dans la présente demande sur le chromosome 7 et, • la comparaison avec les échantillons contrôles à l'étape d. comporte la comparaison des allèles identifiés de l'ADN fœtal avec les allèles correspondants paternels, les allèles correspondants maternels et les allèles correspondants d'un enfant de la fratrie affecté par la mucoviscidose. Selon ce mode de détection dit indirect, dans le cadre de l'invention, l'au moins une phase d'amplification de l'ADN fœtal, de l'ADN maternel, de l'ADN paternel et de l'ADN de l'enfant de la fratrie est réalisée avec un ou plusieurs couples d'amorces choisis parmi :
(F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO : 1 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2),
(F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO : 5 ; R : 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO : 6),
(F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30)) ; (F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34)) ;
(F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ ID NO : 3 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 4),
(F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ ID NO : 7 ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO : 8),
(F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-S1 (SEQ ID NO: 31 ) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-S' (SEQ ID NO: 32)) ; (F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-S1 (SEQ ID NO: 36)).
En d'autres termes, dans ce cas de figure, les amorces utilisées permettent à la fois de démontrer l'origine fœtale de la cellule testée et de détecter la mucoviscidose, en identifiant la présence ou l'absence, d'au moins un allèle portant un polymorphisme génétique, formant un linkage avec l'allèle morbide de la mucoviscidose.
D'autres amorces que celles qui précèdent peuvent être définies et utilisées pour identifier des marqueurs recherchés à l'étape c. de la méthode d'invention.
En particulier, dans un autre mode de réalisation de la méthode de détection indirecte selon l'invention, pour notamment contourner le risque qu'un des deux allèles du gène portant le marqueur recherché ne soit pas amplifié ou pas détecté (risque d'Allele Drop Out ou ADO), les amorces utilisées pour réaliser l'amplification à l'étape c. sont choisies pour amplifier des séquences d'ADN en dehors du chromosome 7. Ces amorces sont conçues pour être informatives selon la description donnée ci-dessus afin de permettre de discriminer des allèles paternels et des allèles maternels dans des cellules fœtales. Ensuite, pour la réalisation de l'étape d., les amorces choisies pour l'amplification peuvent être des amorces identifiées à partir de l'ADN du chromosome 7, dans le cadre de ce qui est décrit dans la présente demande.
Pour définir les amorces informatives pour le génotypage de la cellule testée on choisit des oligonucléotides capables d'amplifier, par exemple par PCR, des séquences comportant des marqueurs de polymorphisme génétique distincts dans les cellules du père et de la mère : les produits d'amplification révélés sont représentés par des pics du gène concerné dans l'ADN de la cellule fœtale distincts pour l'allèle paternel et pour l'allèle maternel.
De préférence, les oligonucléotides sont éloignés sur la séquence à amplifier de telle façon que la taille du produit d'amplification comporte moins de 1000, voir moins de 800 pb. La limitation de la taille de la séquence amplifiée tient compte du fait que l'ADN de la cellule testée, lorsque cette cellule est unique, est faible en quantité et est obtenue à partir d'une cellule fixée donc peut être altéré. Les amorces choisies doivent permettre l'amplification de faibles quantités d'ADN, par exemple de quantités inférieures à 5 pg, notamment d'environ 2 pg. Dans le cadre de la méthode de détection de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose selon l'invention pour la réalisation de l'étape d. des amorces capables d'amplifier le locus deltaF508 peuvent aussi, ou alternativement être utilisées pour rechercher l'allèle deltaF508 caractéristique des mutations les plus fréquentes du gène CFTR dans les cas de mucoviscidose.
Ces amorces capables d'amplifier le locus deltaF508 sont : -le couple d'amorces externes DeltaF508 out (F : 5'- TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-3' SEQ ID NO :25 ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO : 26), utilisé lors de la première phase d'amplification de l'étape d), et
-le couple d'amorces internes deltaF508 in (F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG- 3' SEQ ID NO : 27 ; R : 5'-TCTTACCTCTTCTAGTTGGC3' SEQ ID NO : 28) utilisé lors de la deuxième phase d'amplification de l'étape d).
De façon générale, des amorces utilisables pour réaliser l'invention peuvent être constituées d'oligonucléotides variants dérivés des polynucléotides dont on a donné les séquences ci-dessus.
Un oligonucléotide variant présente par exemple au moins 60 % d'identité, de préférence 80 %, de manière préférée 95 % d'identité ou plus, avec l'amorce dont sa séquence dérive. Ledit oligonucléotide variant présente une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à l'amorce dont sa séquence dérive, comme en particulier une ou plusieurs modifications du type délétion, addition ou substitution.
Dans un exemple spécifique, ledit oligonucléotide variant possède la même taille que l'amorce dont sa séquence dérive. Dans un autre exemple spécifique, la longueur dudit oligonucléotide variant possède une taille inférieure à celle de l'amorce dont sa séquence dérive, par exemple 10 à 20 % plus courte, ou éventuellement, une taille supérieure, par exemple de 10 à 40 %, en particulier de 30 à 40 % plus longue que la séquence de l'amorce dont il dérive. Des amorces variantes des oligonucléotides cités ci-dessus peuvent par exemple être dérivées de ces oligonucléotides par addition d'un ou plusieurs nucléotides en 5' des susdites séquences.
Ledit oligonucléotide possède les mêmes propriétés que l'amorce dont il dérive s'il est utilisable comme amorce pour amplifier l'ADN d'un échantillon biologique, en particulier pour amplifier des séquences comprenant des marqueurs de l'origine fœtale d'une cellule, ou pour amplifier des séquences comprenant des marqueurs de polymorphisme génétique formant un linkage avec le gène CFTR altéré caractéristique de la mucoviscidose. Le cas échéant les oligonucléotides utilisables dans le cadre de l'invention peuvent être associés à des marqueurs, par exemple ajoutés en 5' ou en 3' de leur séquence.
Dans le cadre de la méthode de détection de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose selon l'invention, lorsqu'il n'y a pas d'enfant affecté par la mucoviscidose dans la même fratrie, les couples d'amorces utilisés en priorité au cours de l'étape d. seront des amorces capables d'amplifier le locus deltaF508 pour rechercher l'allèle deltaF508 ou d'autres mutations connues détectables directement par la méthode selon l'invention.
Dans un mode particulier de l'invention, préalablement à la démonstration de l'origine fœtale ou maternelle d'une cellule collectée, ladite cellule collectée est lysée et l'ensemble de son génome est pré-amplifié, par exemple à l'aide d'amorces génériques couvrant toutes les séquences possibles selon les méthodes connues de préamplification par extension d'amorces (PEP, Primer Extension Preamplification) (Zhang, L., Cui, X., Schmitt, K., Hubert, R.WN., Arnheim, M. Whole genomic amplification from a single cell : implications for genetic analysis. PNAS 1992 89 : 5847-5851 ) ou encore la méthode DOP-PCR. Ces méthodes permettent d'amplifier la totalité du génome d'une seule cellule. La préparation d'ADN pré-amplifié ainsi obtenue et dérivée de l'ADN d'une cellule unique peut alors être purifiée et utilisée en tant que matériel génétique pour la détection spécifique de marqueurs génétiques ou de polymorphisme dans le cadre des étapes c) et/ou d) de la méthode selon l'invention.
Dans un exemple spécifique de l'invention, il est procédé à la démonstration de l'origine fœtale ou maternelle d'une cellule collectée par l'amplification de marqueurs génétiques ou de polymorphisme ou d'une combinaison de ces marqueurs, à partir de la préparation d'ADN pré-amplifié dérivée de l'ADN d'une cellule unique. Les marqueurs de polymorphismes génétiques capables de mettre en évidence la contribution bi-parentale à l'ADN fœtal sont identifiés par l'analyse préalable de l'ADN paternel et maternel au moyen d'amorces spécifiquement identifiées pour caractériser l'ADN paternel et pour caractériser l'ADN maternel ou, lorsque des amorces consensuelles existent pour déterminer l'origine paternelle ou maternelle d'un allèle d'un gène, après vérification que les amorces en question sont pertinentes pour l'analyse des échantillons contrôlés disponibles. Dans le cadre de la présente invention, toute technique permettant l'amplification spécifique d'un acide nucléique donné peut être utilisée. Citons à titre d'exemple la méthode d'amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou les méthodes d'amplification isotherme telles que la TMA (transcription mediated amplification), la NASBA (nucleic acid séquence based amplification), la 3SR (self sustained séquence replication) ou l'amplification par déplacement de brin (strand displacement amplification).
Les méthodes d'amplification et en particulier, la méthode PCR, sont suffisamment sensibles pour être mises en œuvre à partir de moins d'un cinquième de la préparation d'ADN pré-amplifié. Par conséquent, chaque préparation d'ADN pré-amplifié d'une cellule collectée peut être utilisée pour l'amplification de cinq marqueurs différents au moins.
En particulier, les amplifications réalisées par PCR permettent la détection de marqueurs de polymorphismes génétiques (par exemple 1 , 2, 3, 4 ou 5 marqueurs), pour la démonstration de l'origine fœtale de cellules isolées. L'amplification PCR permet aussi de détecter des marqueurs génétiques situés en amont, en aval ou sur le gène CFTR caractéristique de la mucoviscidose. Les séquences susceptibles de porter la mutation, et en particulier la délétion ou la répétition d 'une séquence d'ADN, sont amplifiées et les produits d'amplification sont séparés selon leur taille, par exemple par électrophorèse. La présence de délétions ou au contraire de répétitions est détectée par la présence d'un produit d'amplification de taille inférieure ou respectivement supérieure à celle des produits d'amplification ne portant pas de délétion ou de répétition, qui peut être représentée par une différence dans la taille des pics correspondant aux dits produits d'amplification. Les produits d'amplification peuvent aussi être séquences, en particulier pour caractériser de manière précise les marqueurs génétiques, ou pour mettre en évidence des mutations ponctuelles.
Dans un autre mode de mise en œuvre de la méthode de l'invention, les étapes c. et d. sont réalisées par l'hybridation de tout ou partie de la préparation d'ADN pré-amplifié ou amplifié avec des sondes d'ADN spécifiques. Les sondes d'ADN sont choisies de manière à s'hybrider spécifiquement sur les marqueurs pour leur identification ou sur les séquences portant les marqueurs à rechercher. L'hybridation des sondes sur les marqueurs peut être détectée selon les techniques classiques de détection des complexes d'hybridation d'acides nucléiques de type slot blot, Southern blot ou avantageusement aujourd'hui par des puces à ADN ou micro-réseaux ou macro-réseaux (Sambrook et al. Molecular Cloning : A laboratory Manual. 2001 3rd Ed., CoId Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, New York). Ainsi, dans un mode de réalisation de l'invention, les sondes d'ADN spécifiques des marqueurs à identifier sont fixées sur un support formant une puce à ADN ou micro-réseaux ou macro-réseaux. La préparation d'ADN préamplifié ou amplifié est par exemple marquée à l'aide d'un marqueur radioactif ou fluorescent, et mise en contact avec la puce à ADN ou micro-réseaux ou macro- réseaux comportant les sondes spécifiques. L'intensité d'hybridation est mesurée pour chaque spot contenant une sonde spécifique, déterminant ainsi avec une grande sensibilité la présence des marqueurs recherchés sur l'ADN d'une cellule collectée.
Lorsque la méthode de détection de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose selon l'invention est réalisée de manière prénatale, un échantillon est prélevé chez la femme enceinte. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, un échantillon maternel est prélevé précocement au cours de la grossesse (par exemple autour de la cinquième semaine de grossesse). Cependant, le prélèvement de l'échantillon maternel et la méthode de diagnostic selon l'invention peuvent être réalisés à tout moment, du début jusqu'à la fin de la grossesse. Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, le prélèvement et la méthode de diagnostic sont réalisés entre la 7eme et la I5eme semaine de grossesse. Dans un autre mode de réalisation, le prélèvement et la méthode de diagnostic sont réalisés entre la ioeme et la I 5eme semaine de grossesse.
Dans le cadre d'un prélèvement de sang maternel, on prélèvera généralement entre 3 et 20 millilitres de sang maternel, de préférence entre 5 et 10 millilitres. Si, pour des raisons pratiques, on prélève entre 3 et 20 millilitres de sang maternel, il faut bien comprendre que l'analyse ultérieure des cellules fœtales isolées décrite dans le cadre de l'invention, peut être réalisée sur un volume d'échantillon de sang prélevé plus limité, par exemple compris entre 1 et 10 millilitres, de préférence entre 2 et 5 millilitres. Pour augmenter la sensibilité du diagnostic, il est possible de réaliser plusieurs prélèvements indépendants afin de répéter le diagnostic sur différents échantillons indépendants. En outre, dans un mode de réalisation préféré de l'invention, il est possible de prélever en parallèle un échantillon chez le père, et un échantillon de cellules chez la mère, par exemple par prélèvement de cellules buccales par « scraping » ou par prélèvement de sang, éventuellement avant la grossesse, et de réaliser à partir du matériel prélevé, une recherche de marqueurs spécifiques du génome paternel et du génome maternel. Cette étude parallèle permet d'identifier des marqueurs génétiques spécifiques du père et de la mère, qui pourront être utilisés pour démontrer l'origine fœtale des cellules isolées selon les modes de réalisation décrits dans la présente demande. Dans le cadre de l'étape a) d'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale, toute technique peut être employée, et notamment : la filtration ; la séparation sur gradient ; la sélection sur base immunologique (positive, les cellules marquées immunologiquement sont les cellules d'intérêt, c'est-à-dire les cellules foetales ; ou négative, les cellules marquées immunologiquement sont les cellules non pertinentes) ; la prolifération des cellules d'intérêt, c'est-à-dire les cellules foetales ; la lyse des cellules non pertinentes.
Les cellules fœtales épithéliales (trophoblastiques) circulantes dans le sang ont un diamètre supérieur aux cellules leucocytaires et érythrocytaires maternelles et peuvent être isolées selon des procédés de filtration adaptés de ceux décrits pour l'isolement de cellules pathogéniques circulantes dans le sang tels que ceux décrits dans la demande de brevet FR 2782730. L'enseignement de cette demande de brevet est incorporé par référence dans la présente demande.
Dans un exemple spécifique, l'étape a) consiste en la filtration d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale, de façon à concentrer sur un filtre, selon leur taille, certaines cellules y compris des cellules d'origine fœtale et, l'étape b) consiste en l'analyse des cellules retenues sur le filtre et la sélection des cellules présumées d'origine foetale. Lorsque l'échantillon cellulaire provient du sang maternel, la filtration permet d'enrichir et de séparer les cellules fœtales des cellules sanguines, en particulier des leucocytes maternels.
Préalablement à l'étape (a) de filtration, tout procédé permettant l'enrichissement de la population cellulaire issue de l'échantillon prélevé, en cellules d'origine fœtale peut être mis en œuvre. Dans une forme de réalisation de l'invention, un enrichissement de la population en cellules fœtales est réalisé par le tri des cellules en fonction de l'expression de marqueurs de surfaces exprimés par les cellules fœtales pour diminuer la proportion de cellules d'origine maternelle. Les techniques de tri des cellules sont par exemple le FACS, le tri sur colonne d'immunoaffinité ou immunomagnétique (MACS) ou toute technique susceptible de fournir un enrichissement d'un type cellulaire sur la base de caractéristiques physiques (densité) ou structurelles (antigènes spécifiques notamment). Afin de faciliter la filtration, dans un mode de mise en œuvre particulier, avant l'étape de filtration, une dilution de l'échantillon prélevé dans une solution de filtration peut être réalisée, ladite solution de filtration consistant en un réactif de fixation des cellules nucléées et/ou de lyse des globules rouges. Un exemple de solution de filtration comprend un détergent capable de dégrader la membrane des globules rouges, tel que la saponine, et un fixateur capable de stabiliser la membrane des cellules nucléées tel que le formaldéhyde.
Dans un mode de mise en œuvre préféré, l'échantillon maternel prélevé est dilué de 10 à 100 fois environ dans la solution de filtration.
La filtration de l'échantillon pur ou dilué est réalisée à l'aide d'un filtre poreux permettant de séparer les cellules selon leur taille. Dans le cadre d'un échantillon provenant du sang maternel, la porosité du filtre est choisie de manière à laisser passer les éléments figurés du sang, notamment les érythrocytes, les plaquettes et les leucocytes maternels et à retenir certaines cellules nucléées et en particulier des cellules larges (épithéliales ou précurseurs hématopoïétiques) d'origine maternelle et fœtale.
Un filtre de porosité, comprise entre 6 et 15 μm et d'une densité adaptée selon la porosité choisie et apte à retenir les cellules tout en évitant le colmatage de celles-ci lors de la filtration, peut être notamment utilisé. Selon un exemple spécifique, le filtre présente des pores sensiblement cylindriques d'un diamètre d'environ 8 μm et de densité comprise entre 5.104 et 5.105 pores/cm2. Selon un exemple spécifique, le filtre utilisé est calibré de façon à ce que l'ensemble des pores présente un diamètre sensiblement identique. Un exemple de filtre utilisable dans le procédé de l'invention est une membrane filtrante calibrée de polycarbonate de type « Track-Etched membrane » d'une densité de pores de 1x105 pores/cm2, d'une épaisseur de 12μm et d'une taille des pores de 8μm, telle que celle commercialisée par Whatman®.
L'étape a. de la méthode selon l'invention repose sur l'existence et la mise au point d'un dispositif spécifique nommé ISET (acronyme anglais pour Isolation by Size of Epithelial Tumor CeIIs) et décrit dans EP 0513 139 et comprenant sur un bâti :
- un filtre poreux apte à retenir certaines cellules (circulantes dans le cadre d'un prélèvement de sang maternel) selon leur taille, monté entre deux dispositifs de serrage, respectivement en amont et en aval du sens de filtration, et destiné à l'étanchéité de la filtration,
- le bloc amont comprenant des moyens de stockage et/ou de pré-traitement des échantillons à analyser,
- le bloc aval comprenant des perforations en regard des moyens de stockage pour collecter les déchets, - des moyens de filtration forcée.
Ainsi, l'invention porte également sur l'adaptation et l'utilisation d'un dispositif de ce type à la filtration de cellules fœtales présentes dans l'échantillon maternel prélevé pour les besoins de la méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose. Par adaptation et utilisation, on entend :
- l'incorporation dans le dispositif d'un filtre de porosité, de préférence calibré, apte à retenir les cellules d'un diamètre moyen supérieur à 8 μm, et mieux, supérieur à 10 μm, de préférence supérieur à 15 μm. Un filtre de porosité moyenne de 8 μm a été démontré comme répondant à ces caractéristiques recherchées ;
- l'adaptation de la densité des pores sur le filtre, en fonction de la taille des pores afin d'optimiser la capacité de filtration,
- l'adaptation de la pression appliquée sur les moyens de filtration à la conservation de l'intégrité physique des cellules fœtales recherchées ; - l'adaptation du milieu de dilution de l'échantillon maternel prélevé à la conservation de l'intégrité et de la viabilité des cellules recherchées. L'étape a. de la méthode selon l'invention peut comporter l'utilisation d'un dispositif de filtration de type ISET, pour l'isolement de cellules fœtales de l'échantillon cellulaire maternel prélevé et comportant un filtre de porosité moyenne comprise entre 6μm et 15 μm, et de préférence d'environ 8 μm.
L'étape a. peut comporter également l'utilisation d'un dispositif de type ISET dans lequel le filtre présente des pores d'un diamètre d'environ 8 μm et une densité de pores comprise entre 5.104 et 5.105. L'étape a. peut comporter enfin l'utilisation d'un dispositif de filtration de type
ISET dans lequel la dépression de filtration appliquée est comprise entre 0,05 bars et 0,8 bars, et de préférence environ 0,1 bars.
Dans un exemple spécifique de l'invention, des cellules retenues sur le filtre pendant l'étape a. sont collectées individuellement. Par collecte individuelle des cellules, il faut comprendre toute méthode qui permet de collecter une cellule individuelle spécifique retenue pendant l'étape a) en vue de son analyse ultérieure indépendamment des autres cellules retenues pendant l'étape a).
Plus particulièrement, des cellules retenues pendant l'étape a) peuvent être collectées individuellement notamment par microdissection.
Dans un exemple spécifique, l'étape a) consiste en une filtration, et la microdissection consiste par exemple à découper au laser la partie d'une membrane filtrante sur laquelle est retenue une cellule ou à décoller la cellule à l'aide du laser puis à récupérer la cellule unique collectée dans un tube approprié. Celle-ci est alors apte à subir les différentes analyses des étapes b), c) et d) décrites dans le cadre de l'invention.
Dans un exemple spécifique, les cellules retenues pendant l'étape a) peuvent être analysées « in situ » au cours de l'étape b), sans collecte individuelle des cellules. Cette analyse est effectuée par une méthode cytologique, immunologique ou moléculaire, par exemple une méthode parmi les suivantes :
FISH, PCR in situ, PNA, PRINS.
Les cellules retenues pendant l'étape a) sont collectés, puis analysées in situ au cours de l'étape b). La collecte individuelle des cellules permet de cibler avantageusement l'analyse génétique sur le génome d'une cellule unique. Elle permet aussi de réaliser la détection de la mucoviscidose sur le génome d'une cellule unique dont l'origine fœtale a été préalablement démontrée par analyse génétique. Ainsi, par ce mode de réalisation de l'invention, on obtient du matériel génétique pur, c'est à dire, dérivé d'une cellule unique, et utilisable à la fois pour les étapes c. et d. de la méthode selon l'invention.
Dans le cadre de la présente méthode de détection, non invasive, prénatale de la mucoviscidose, on a illustré l'utilisation de différentes amorces appropriées pour la réalisation de l'étape c. ou de l'étape d., voir des deux étapes. Selon une variante de réalisation de cette méthode, d'autres amorces peuvent être mises en œuvre qui consistent par exemple en des oligonucléotides variants dont la séquence est dérivée de celle d'une amorce choisie parmi :
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' (SEQ ID NO : 1 ) ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 2) ; ou
- F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' (SEQ ID NO : 5) ; R : 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' (SEQ ID NO : 6) ; ou
- F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' (SEQ ID NO : 9) ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' (SEQ ID NO : 10) ; ou -F : 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' (SEQ ID NO : 13) ; R : 5'-
GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' (SEQ ID NO : 14) ; ou
- F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' (SEQ ID NO : 17) ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' (SEQ ID NO : 18) ;ou
- F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' (SEQ ID NO : 21 ) ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' (SEQ ID NO : 22) ; ou
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' (SEQ ID NO : 25) ; R : 5'- TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' (SEQ ID NO : 26) ;ou
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ; - F: 51- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'-
GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ;
- F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' (SEQ ID NO : 3) ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' (SEQ ID NO : 4) ; ou - F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' (SEQ ID NO : 7) ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' (SEQ ID NO : 8) ; ou
- F : δ'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-S' (SEQ ID NO : 11) ; R : 5'- ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' (SEQ ID NO : 12) ; ou - F : δ'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' (SEQ ID NO : 15) ; R : 5'-
AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' (SEQ ID NO : 16) ;ou
- F : 5'-CCCTCTCAATTGTπGTCTACC-3' (SEQ ID NO : 19); R : 5'- GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' (SEQ ID NO : 20) ; ou
- F : δ'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-S' (SEQ ID NO : 23) ; R : 5'- TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3/ (SEQ ID NO : 24) ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' (SEQ ID NO : 27) ; R : (5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' (SEQ ID NO : 28) ;
- F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31 ) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ; - F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'-
AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36).
Un oligonucléotide variant présente par exemple au moins 60 % d'identité, de préférence 80 %, de manière préférée 95 % d'identité ou plus, avec l'amorce dont sa séquence dérive.
Ledit oligonucléotide variant présente une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à l'amorce dont sa séquence dérive, comme en particulier une ou plusieurs modifications du type délétion, addition ou substitution. Les nucléotides ajoutés le sont en particulier à l'extrémité 3'. Dans un exemple spécifique, ledit oligonucléotide variant possède la même taille que l'amorce dont sa séquence dérive.
Dans un autre exemple spécifique, la longueur dudit oligonucléotide variant possède une taille inférieure, par exemple de 10 à 20 % par rapport à celle de l'amorce dont sa séquence dérive ou éventuellement, une taille supérieure, par exemple de 10 à 40 %, en particulier de 30 à 40 % par rapport à la séquence de l'amorce dont il dérive.
Ledit oligonucléotide possède les mêmes propriétés que l'amorce dont il dérive s'il est utilisable comme amorce pour amplifier l'ADN d'un échantillon cellulaire biologique, en particulier pour amplifier des séquences comprenant des marqueurs de l'origine fœtale d'une cellule, ou pour amplifier des séquences comprenant des marqueurs génétiques situés en amont, en aval ou sur le gène CFTR caractéristique de la mucoviscidose.
Au cours de l'étape b. de la méthode selon l'invention, les cellules retenues sur le filtre peuvent être observées sous microscope, par exemple après coloration à l'hématoxyline et l'éosine de manière à analyser leur morphologie dans le but de déterminer une présomption de leur origine foetale. Leur nature épithéliale peut être identifiée, à titre d'exemple, par immunomarquage avec un anticorps anti-cytokeratines (type KL-i). Il est à ce stade possible d'envisager de reconnaître sur la base de caractères morphologiques les cellules d'origine fœtale et en particulier, les cellules cytotrophoblastiques, mononucléées, présentant un grand noyau, une chromatine condensée et un cytoplasme réduit, d'un diamètre compris entre 14 et 20 μm et les cellules syncytiotrophoblastiques d'un plus grand diamètre (44-47 μm ou plus) et plurinucléées. Le terme « présomption » ou « présumée » à l'étape (b) indique donc la forte probabilité d'être en présence d'une cellule d'origine fœtale.
L'analyse génétique des cellules retenues pendant l'étape a) permet de conforter la présomption, par l'obtention des indications sur l'origine fœtale ou maternelle de chacune de ces cellules. En particulier, en vue d'une détection ou d'un diagnostic sensible et spécifique, l'étape a) sera répétée si aucune cellule présumée d'origine fœtale n'est observée suite à celle-ci. Selon les modes de réalisation, l'analyse génétique sera établie sur l'ensemble des cellules retenues pendant l'étape a) et comprenant certaines cellules dont l'origine fœtale est présumée, en particulier sur le génome d'un petit nombre de cellules, allant de 1 à 20 cellules, plus particulière de 1 à 10 cellules, ou au contraire l'analyse sera réalisée sur, par exemple, le(s) génome(s) d'1 , 2 ou 3 cellules et avantageusement sur le génome de cellules isolées individuellement.
Dans un mode de mise en oeuvre particulier, on procède à l'analyse de présomption de l'origine fœtale ou maternelle des cellules retenues sur le filtre par la recherche de la présence de marqueurs) immunologique(s) ou cytologique(s) caractéristique(s) des cellules fœtales.
On entend par marqueur immunologique caractéristique des cellules fœtales tout antigène ou combinaison d'antigènes dont l'expression est normalement significativement différente entre les cellules fœtales et les cellules maternelles, et qui peut être détectée à l'aide d'un anticorps ou d'une combinaison d'anticorps dirigés spécifiquement contre ledit antigène ou combinaison d'antigènes. Des exemples de tels marqueurs immunologiques sont en particulier les antigènes associés aux cellules trophoblastiques décrits dans la demande de brevet WO 90/06509. L'enseignement de cette demande de brevet est incorporé par référence dans la présente demande. La recherche de la présence de marqueurs immunologiques caractéristiques des cellules fœtales consiste par exemple :
- en la mise en contact des cellules contenues dans l'échantillon maternel prélevé avec au moins un anticorps dirigé contre un antigène caractéristique des cellules fœtales ; et,
- la détermination sur les cellules retenues sur le filtre d'une liaison spécifique dudit anticorps avec un antigène exprimé à la surface desdites cellules, Ladite mise en contact des cellules avec l'anticorps peut être réalisée avant ou après l'étape de filtration. Les anticorps choisis peuvent être du type polyclonal ou monoclonal.
Un exemple d'antigène caractéristique des cellules fœtales est l'antigène de la phosphatase alcaline placentaire.
Dans un autre mode de mise en œuvre, on peut procéder à l'analyse de présomption de l'origine fœtale des cellules par la détermination de marqueurs cytologiques spécifiques des cellules cytotrophoblastiques et/ou syncyciotrophoblastiques. Les marqueurs cytologiques utilisables comprennent l'ensemble des caractéristiques cytologiques des cellules fœtales permettant de les différencier des autres types de cellules circulantes susceptibles d'être retenues sur le filtre, en particulier, la taille des cellules, la forme des cellules, la présence et la taille d'organites particuliers, la taille et le nombre de noyau, la structure de la chromatine, etc., ou toutes combinaisons particulières de ces caractéristiques cytologiques. Les caractères cytologiques peuvent être observés par coloration des cellules à l'aide de colorants classiquement utilisés en cytologie, en particulier l'hématoxyline-éosine et par l'observation des cellules marquées en microscopie optique.
L'objet de l'invention porte également sur un polynucléotide utilisable comme amorce pour amplifier une quantité d'ADN d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il comprend ou consiste en une séquence de nucléotides choisie parmi les suivants: F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' ; ou
F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' ; ou - F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' ; R : 5'-
ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3', ou
F : 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' ;
R : δ'-GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-S' ; ou F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' ;ou
F : 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3' ; R : 5'-
ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' ; ou
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' ; ou - F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' ; R : (5'-
TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' ; ou
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34).
Un oligonucléotide variant présente par exemple au moins 60 % d'identité, de préférence 80 %, de manière préférée 95 % d'identité ou plus, avec l'amorce dont sa séquence dérive.
Ledit oligonucléotide variant présente une ou plusieurs modifications de séquence par rapport à l'amorce dont sa séquence dérive, comme en particulier une ou plusieurs modifications du type délétion, addition ou substitution.
Dans un exemple spécifique, ledit oligonucléotide variant possède la même taille que l'amorce dont sa séquence dérive.
Dans un autre exemple spécifique, la longueur dudit oligonucléotide variant possède une taille inférieure de 10 à 20 % par rapport à celle de l'amorce dont sa séquence dérive ou éventuellement, une taille supérieure, par exemple de 10 à
40 %, en particulier de 30 à 40 % par rapport à la séquence de l'amorce dont il dérive. Des amorces variantes des oligonucléotides cités ci-dessus peuvent par exemple être dérivées de ces oligonucléotides par addition d'un ou plusieurs nucléotides en 5' des susdites séquences.
Ledit oligonucléotide possède les mêmes propriétés que l'amorce dont il dérive s'il est utilisable comme amorce pour amplifier l'ADN d'un échantillon cellulaire biologique, en particulier pour amplifier des séquences comprenant des marqueurs de l'origine foetale d'une cellule, ou pour amplifier des séquences comprenant une mutation du locus F508 ou des séquences comprenant des marqueurs de polymorphisme génétique formant un linkage avec le gène CFTR caractéristique de la mucoviscidose.
L'objet de l'invention porte également sur un couple de polynucléotides, utilisable comme couple d'amorces pour amplifier une quantité d'ADN d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples de polynucléotides dont les séquences comprennent ou consistent en : - F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' ;
F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' ;
F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3';
F : 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3\ R : 5'-
GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' ;,
F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' ; R : 5'-
AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' ; - F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' ; R : 5'-
ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' ;
F : 5'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-3I ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' ; R : (5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' ;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34). L'objet de l'invention porte également sur l'association d'un couple d'amorces dites externes, par rapport à la séquence cible, utilisé dans une première phase d'amplification d'une préparation d'ADN et d'un autre couple d'amorces, dites internes ou emboîtées par rapport aux dites amorces externes, utilisé dans une deuxième phase d'amplification sur le produit d'amplification obtenu par ladite première phase d'amplification, lesdits couples étant choisis parmi :
-F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' en tant qu'amorces externes et F : 5'- CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' ; R : δ'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-S' en tant qu'amorces internes ; ou
-F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' en tant qu'amorces externes et -F : 5'- AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' ; R : δ'-GCCCAGGTGATTGATAGTGC-S' en tant qu'amorces internes ; ou
-F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' ; R : 5'-
ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' en tant qu'amorces externes et -F : 5'- GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' ; R : δ'-ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-S' en tant qu'amorces internes ; ou
-F : δ'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-S' R : 5'-
GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' ; en tant qu'amorces externes et -F : 5'- GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-3' ; R : δ'-AGACAGAGTCCCAGGCATT-S' en tant qu'amorces internes ; ou
-F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' ; R : 5'-
AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' en tant qu'amorces externes et -F : 5'- CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' ; R : 5'-GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3I en tant qu'amorces internes ; ou
F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' ; R : 5'-
ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' en tant qu'amorces externes et F : 5'- ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-3' ; R : δ'-TTCTCTACATATTTACTGCCAACA- 3' en tant qu'amorces internes, ou
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' ; R : 5'- TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' en tant qu'amorces externes et F : 5'- TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' ; R : 5'-TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' en tant qu'amorces internes ; ou
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) en tant qu'amorces externes et F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) en tant qu'amorces internes ; ou
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'-
GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) en tant qu'amorces externes, et F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36) en tant qu'amorces internes.
L'invention concerne également l'utilisation d'amorces dans le cadre d'une méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose à partir de l'ADN génomique de cellules fœtales isolées de l'échantillon maternel prélevé, caractérisée en ce que les amorces sont choisies parmi : - F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-S' ;
-F : 5'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' ;
-F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-31 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' ;
F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-S' ; R : 5'-
GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' ; - F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-S' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ; - F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ;
- F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36) ;
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' ; R : 5'- TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' ; R : (5'-
TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' .
L'invention concerne également l'utilisation d'amorces dans le cadre d'une méthode in vitro pour l'identification du caractère fœtal d'une cellule unique collectée à partir de l'échantillon maternel prélevé, sur une préparation d'ADN dérivée du génome de la cellule unique collectée, caractérisée en ce que les amorces sont choisies parmi :
-F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' ;
-F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' ;
-F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' ; R : 5'-
ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' ; - F : δ'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-S' ; R : 5'-
GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' ; ou
-F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' ; R : 5'-
AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' ;
-F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' ;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-S' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-S' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ; -F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' ;
-F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' ; R : 5'-
GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' ; - F : 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' ; R : 5'-
ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' ;
-F : δ'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' ; R : 5'-
AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' ;
-F : 5'-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' ; R : 5'- GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' ;
-F : δ'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-S' ; R : 5'-
TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' ;
- F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-S' (SEQ ID NO: 32) ; - F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'-
AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36).
L'objet de l'invention porte également sur un kit pour à la détection, non invasive, prénatale de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose comprenant une ou plusieurs amorces citées ci-dessus, et le cas échéant des instructions pour effectuer la détection la mucoviscidose.
Les méthodes et moyens (notamment les amorces) mis en œuvre dans le cadre de la présente invention sont utilisables dans le cadre de la détection de la mucoviscidose et peuvent le cas échéant être considérés, en tant que tels, ou complétés par d'autres tests, comme des méthodes et moyens de diagnostic.
LEGENDE DES FIGURES
Figure 1 : Diagnostic prénatal non invasif chez des couples de porteurs de l'allèle deltaF508
Génotypage par STR chez le couple 1 (A) avec le marqueur D16S539 et le couple 6 (A1) avec le marqueur D16S3018. Chez le couple 1 (A), le père (P) est homozygote pour l'allèle ciblé, tandis que la mère (M) est hétérozygote. Deux cellules fœtales (CF) sont montrées, caractérisées par un allèle paternel (à gauche) et un allèle maternel (à droite). Chez le couple 6 (A1), les deux parents sont hétérozygotes avec le marqueur STR utilisé et les deux cellules fœtales (CF) présentent un allèle maternel (à gauche) et un allèle paternel (à droite). Le génotypage de deltaF508 (B et B') effectué sur les cellules fœtales du couple 1 (B) et 6 (B') montre que le fœtus du couple 1 est porteur de l'allèle deltaF508, ayant un allèle muté (AM) et un allèle normal (AN), tandis que le fœtus du couple 6 est totalement normal (homozygote pour l'allèle normal). C et C : le séquençage du locus deltaF508 dans des cellules fœtales confirme le diagnostic en montrant à la fois le profil muté et normal chez le fœtus du couple 1 (C), et la présence homozygote de Pallèle normal chez le fœtus du couple 6 (C).
Figure 2 : Diagnostic prénatal non invasif chez le couple n°11 A. Génotypage d'ADN avec le marqueur informatif D7S486 sur le chromosome 7, montrant que les parents (P et M) sont hétérozygotes et que l'enfant affecté (Cl : cas index) porte les allèles mutés d et a. Les deux cellules fœtales (CF) de la grossesse en cours portent un seul allèle muté (d), démontrant que le fœtus est porteur mais non affecté. B. Génotypage d'ADN du locus deltaF508 montrant que le père est porteur d'un allèle muté (AM) et d'un allèle normal (AN). Le cas index est porteur de l'allèle deltaF508 muté, tandis que les deux cellules fœtales de la grossesse en cours sont homozygotes pour l'allèle normal. Ainsi, le fœtus est porteur d'une mutation sur le chromosome 7 qui n'est pas la mutation deltaF508. C. Représentation schématique des deux chromosomes 7 dans l'ADN paternel (P), l'ADN maternel (M), le cas index (Cl) et les cellules fœtales circulantes (CF) : le père est porteur d'un allèle deltaF508, tandis que la mère est porteuse d'une mutation inconnue. Le cas index porte les deux mutations et les cellules fœtales portent uniquement la mutation inconnue.
Figure 3 : Diagnostic prénatal non invasif chez le couple n°11 A. Génotypage d'ADN avec le marqueur informatif D7S486 sur le chromosome 7, montrant que les parents (P et M) sont hétérozygotes et que le cas index (Cl) porte les allèles mutés d et a. Les deux cellules fœtales (CF) de la grossesse en cours portent les allèles non mutés (c et b), démontrant que le fœtus est totalement normal.
B. Représentation schématique des deux chromosomes 7 dans I1ADN paternel (P), I1ADN maternel (M), le cas index (Cl) et les cellules fœtales circulantes (CF) : le père est porteur de l'allèle muté a, tandis que la mère est porteuse de l'allèle muté d. L'enfant affecté porte les deux allèles mutés et les deux cellules fœtales circulantes portent les deux allèles normaux.
Figure 4 : Schéma de protocole pour le diagnostic prénatal non invasif (NI- PND) de la mucoviscidose
STR (short tandem repeat) courtes séquences répétées en tandem ; ISET (isolation by Size ofEpithelial Tumor/Trophoblastic cells), isolement selon la taille des cellules tumorales épithéliales/trophoblastiques ; LCM (laser capture microdissection) microdissection par capture au laser ; PEP (primer extension preamplification) pré-amplification par élongation d'amorces ;
MC (maternai cells) cellules maternelles ; CFC (circulating fetal cells) cellules fœtales circulantes.
Figure 5 : Diagnostic prénatal non invasif chez des couples de porteurs de l'allèle deltaF508
A, B, C : Génotypage par STR chez le couple 1 avec le marqueur D16S539 (A), chez le couple 6 avec le marqueur D16S3018 (B) et chez le couple 8 avec le marqueur D21S1435 (C). Chez le couple 1 (A), le père (P) est homozygote pour l'allèle ciblé (un pic), tandis que la mère (M) est hétérozygote (deux pics). Deux cellules fœtales circulantes (CFC) de ce couple sont caractérisées par un allèle paternel (à gauche) et un allèle maternel (à droite). Chez le couple 6 (B), et le couple 8 (C), les deux parents sont hétérozygotes avec le marqueur STR utilisé et les deux cellules fœtales (CFC) présentent un allèle maternel (à gauche) et un allèle paternel (à droite).
A', B', C : Le génotypage de deltaF508 effectué sur les cellules fœtales circulantes (CFC) du couple 1 (A'), du couple 6 (B'), et du couple 8 (C) montre que le fœtus du couple 1 est porteur de l'allèle deltaF508, ayant un allèle muté (AM) et un allèle normal (AN), tandis que le fœtus du couple 6 est totalement normal (homozygote pour l'allèle normal), et le foetus du couple 8 est affecté par le mucoviscidose (CF) (homozygote pour l'allèle muté).
A", B", C" : séquençage du locus F508 dans des cellules foetales du couple 1 (A"), du couple 6 (B") et du couple 8 (C") confirme le diagnostic en montrant à la fois le profil muté et normal chez le fœtus du couple 1 (A"), et la présence homozygote de l'allèle normal chez le fœtus du couple 6 (B"), et la présence homozygote de l'allèle muté chez le fœtus du couple 8 (C").
Figure 6 : Diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose (CF) chez des couples présentant des mutations CFTR inconnues
A, B, C : Génotypage d'ADN du couple 11 et de leur enfant affecté avec le marqueur informatif D7S486 sur le chromosome 7, montrant que le père (P) et la mère (M) sont hétérozygotes. Le père porte les allèles c et a, tandis que la mère porte les allèles d et b. Leur enfant affecté (Cl : cas index) porte les allèles d et a, qui doit donc être lié aux allèles CFTR mutés. Deux CFCs de la grossesse en cours portent les allèles d et c, démontrant que le foetus est porteur de la mucoviscidose, mais est non affecté. B : génotypage d'AND du locus F508 montrant que le père porte un allèle muté (AM) et un allèle normal (AN). Le cas index présente une hétérozygotie composée, et porte l'allèle Fdelta508 paternel et une mutation CFTR maternelle. Deux cellules foetales sont homozygotes pour l'allèle F508 normal. Prises ensemble, les données de A et B montrent que le foetus est porteur de la mutation CFTR maternelle. C : représentation schématique des allèles CFTR et des allèles STR liés à CFTR (a, b, c, d). bloc grisé = mutation CFTR inconnue.
D, E : le génotypage STR d'ADN du couple 12 avec le marqueur D7S486 sur le chromosome 7 montre que le père et la mère sont hétérozygotes et que le cas index porte les allèles a et d D7S486, qui doivent donc être liés aux allèles CFTR mutés. Deux CFCs de la grossesse en cours portent les allèles c et d D7S486 liés aux allèles CFTR mutés, démontrant que le foetus est complètement normal.
E. représentation schématique des allèles CFTR et des allèles STR liés à CFTR (a, b, c, d). Blocs grisés = allèles CFTR mutés.
EXEMPLES Exemple 1 : Diagnostic non invasif de la prédisposition à la mucoviscidose par l'enrichissement efficace de cellules trophoblastiques et l'analyse de mutations limitée aux génomes de cellules uniques révélées fœtales par génotypage. 1-1 Méthode
Le sang périphérique de 12 femmes, à 11 à 13 semaines de grossesse, nécessitant un diagnostic prénatal de la mucoviscidose a été étudié par ISET (isolement selon la taille des cellules tumorales épithéliales/trophoblastiques). Six ml de sang maternel (avant PVC) et 2 ml de sang paternel ont été collectés sur un tampon acide éthylènediaminetétraacétique. L'ADN paternel et l'ADN maternel ont été extraits à partir de 1 ml de sang et 1 ,5 ng ont été utilisés pour un allélotypage avec des amorces spécifiques des marqueurs microsatellites (STR) D7S480, D7S486, D16539, D16S3018, D21S1435 et D21S1437. Un ensemble d'amorces externes (out) et un d'amorces internes (in) (fluorescéinées) a été utilisé pour chaque marqueur STR (Cf. tableau 1 pour la séquence des amorces et les profils de PCR). Quatre ml de sang maternel ont été traités par ISET jusqu'à 3 heures après collecte, comme décrit antérieurement (Vona et al., 2000, 2002). Brièvement, les prélèvements sanguins ont été dilués à 1:10 avec le tampon ISET et traités par l'appareil d'ISET (Metagenex, Paris, France). Les grandes cellules de chaque ml de sang ont été concentrées sur une tache circulaire de 0,6 cm de diamètre sur la membrane d'ISET. Deux ml de chaque prélèvement de sang maternel traité par ISET ont été analysés. Après analyse immunohistochimique avec l'anticorps KL1 (Vona et al., 2002) pour identifier les cellules épithéliales et coloration à l'hématoxyline, une microdissection au laser d'une unique cellule a été effectuée à l'aide d'un Leica (AS LMD) et d'un microscope équipé d'un laser Nikon (TE 2000 U, Nikon France SA). Pour s'assurer qu'une seule cellule avait été collectée, nous avons pris des photographies de la cellule avant et après microdissection, et de la cellule microdisséquée sur le culot. Chaque cellule collectée a été lysée dans 15 μl de tampon de lyse (Tris-HCI 100 mmol/l, pH 8, protéinase K 400 μg/ml) pendant 16 heures à 37°C, suivi de l'inactivation de la protéinase K à 94°C pendant 15 minutes. Après préamplification par extension des amorces (PEP) effectuée comme décrit antérieurement (Vona et al., 2000, 2002) dans un volume de 60 μl, nous avons utilisé des aliquotes de 6 μl pour des amplifications supplémentaires. Un génotypage des cellules uniques a été réalisé à l'aide d'amorces spécifiques des STR présentés comme informatifs par le génotypage de l'ADN maternel et paternel. Une autre aliquote de 6 μl de produit de PEP, obtenue à partir de cellules uniques, révélées fœtales par génotypage par STR, a été utilisée pour rechercher l'allèle deltaF508 à l'aide d'amorces comportant le locus deltaF508. Une amplification a été effectuée dans 40 μl contenant 6 μl de produit de PEP, 10 mmol/l de Tris-HCI, 50 mmol/l de KCI, 25 mmol/l de MgCI2, 200 μmol/l de chaque désoxynucléotide, 0,5 μM de chaque amorce externe et 2 U de Taq GoId (Applied Biosystems, Foster City, CA). 2 μl du premier produit de PCR ont de nouveau été amplifiés dans 40 μl à l'aide des amorces internes et du même protocole (Cf. tableau 1 pour la séquence des amorces et les profils de PCR). 1 μl du produit de PCR dilué à 1:20 a ensuite été mélangé à 13,5 μl de Hi-Di Formamide déionisé, 0,5 μl de marqueur Genescan 400 HD (ROX) (Applied Biosystems, Foster City, CA), et chargé sur un séquenceur automatique ABI Prism 3100 (Applied Biosystems, Foster City, CA). Les profils ont été analysés à l'aide des programmes Genescan et Genotypersoftware (Perkin Elmer, Foster City, CA).
Tableau 1 : Amorces et Profils de PCR
Nom de Numéro de la Séquence de l'amorce Profils de PCR l'amorce séquence
D7S480 ouf SEQ ID NO: 1 F: 5'- AAAAACCCTGGCTTATGC-S1 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 30 s 58 0C, SEQ ID NO: 2 R : δ'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-S' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D7S480 in* SEQ ID NO: 3 F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 45 s 55 0C, SEQ ID NO: 4 R : δ'-AGCTACCATAGGGCTGGAGG-S' 30 s 72 °C),5 min 720C.
D7S486 ouf SEQ ID NO: 5 F: 5'- GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 45 s 55 °C, SEQ ID NO: 6 R: 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' 30 s 72 °C),5 min 720C.
D7S486 in* SEQ ID NO: 7 F: 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 55 0C, SEQ ID NO: 8 R: 5'GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' 30 s 72 °C),5 min 720C.
D16S539 out SEQ ID NO: 9 F: 5'- CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 45 s 60 °C, o SEQ ID NO: 10 R: 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D16S539 in SEQ ID NO: 11 F: 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 58 °C, SEQ ID NO: 12 R: 5'- ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D16S3018 out SEQ ID NO: 13 F: 5'- TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 61 0C, SEQ ID NO: 14 R: 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT -3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D16S3018 in SEQ ID NO: 15 F: δ'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 58 0C, SEQ ID NO: 16 R: 5'- AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D21S1435 out SEQ ID NO: 17 F: δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 30 s 58 °C, SEQ ID NO: 18 R: 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' 45 s 72 °C),5 min 72°C.
Amorces utilisées pour le diagnostic indirect
Tableau 1 (suite et fin) : Amorces et Profils de PCR
Nom de Numéro de la Séquence de l'amorce Profils de PCR l'amorce séquence
D21S1435 in SEQ ID NO: 19 F: 5'-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 30 s 58 0C, SEQ ID NO: 20 R: 5' GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D21S1437 out SEQ ID NO: 21 F: 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 45 s 60 0C, SEQ ID NO: 22 R: 51 -ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D21S1437 in SEQ ID NO: 23 F: 5'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 45 s 58 0C, SEQ ID NO: 24 R: 5' -TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' 30 s 72 °C),5 min 720C.
Delta F508 out SEQ ID NO: 25 F: 5'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 30 s 55°C, SEQ ID NO: 26 R: 5'- TGCATAATCAAAAAG TTT TCACA-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
Delta F508 in SEQ ID NO: 27 F: 5'-TCT GTT CTCAGT TTT CCTGG-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 57°C, SEQ ID NO: 28 R: 5'- TCT TAC CTC TTC TAG TTG GC-3' 30 s 72 °C),5 min 720C.
D7S490 out SEQ ID NO: 29 F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 58 0C, SEQ ID NO: 30 R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D7S490 in SEQ ID NO: 31 F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 940C, 30 s 55 0C, SEQ ID NO: 32 R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D7S523 out SEQ ID NO: 33 F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 58 °C, SEQ ID NO: 34 R:5J- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
D7S523 in SEQ ID NO: 35 F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' 5 min 94°C,40 x (30 s 94°C, 30 s 58 0C, SEQ ID NO: 36 R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' 30 s 72 °C),5 min 72°C.
Amorces utilisées pour le diagnostic indirect
2-2 Résultats
Chez les couples où aucun ou un seul des parents était porteur de l'allèle deltaF508, nous avons demandé des informations au Laboratoire de Génétique Médicale concernant un premier enfant affecté (cas index) et les amorces de STR informatifs situés sur le chromosome 7. Nous avons ensuite utilisé ces amorces pour amplifier I1ADN des cellules fœtales et effectuer un diagnostic par la méthode indirecte (Cf. figures 2 et 3). Les analyses de séquences ont été effectuées à l'aide d'un kit de séquençage Big Dye-Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA) (Vona et al., 2002) après purification du produit de PCR sur colonnes Microspin S-400RH (Amersham Bioscience, Buckinghamshire, GB). Les prélèvements sanguins des mères des couples n°4 à n°12 (tableau 2) ont été analysés selon une approche totalement en aveugle par des chercheurs ignorant les résultats des PVC.
Au moins deux marqueurs informatifs (tableau 2), identifiés parmi ceux testés sur l'ADN paternel et maternel isolé à partir de cellules PBL (tableau 1), ont été utilisés pour l'allélotypage des cellules microdisséquées. Ceci nous a permis d'identifier au moins deux cellules foetales à partir de seulement 2 ml de sang maternel.
L1ADN des cellules fœtales uniques a ensuite été analysé avec des amorces emboîtées comportant le locus deltaF508. Cette analyse peut révéler l'allèle deltaF508, qui est caractérisé par une délétion de 3 bp (CTT) (produit de PCR de 117 bp au lieu de 120 bp, Cf. figure 1), permettant de savoir si le fœtus est affecté par la mucoviscidose (présence homozygote de l'allèle deltaF508), porteur de l'allèle deltaF508 (présence hétérozygote de l'allèle deltaF508), ou normal (absence homozygote de l'allèle deltaF508). Comme l'indique le tableau 2, la présence hétérozygote de l'allèle deltaF508 a été découverte dans toutes les cellules fœtales isolées à partir du sang maternel de 7 femmes appartenant aux couples de porteurs de l'allèle deltaF508. Dans 6 cellules fœtales, ce résultat a été confirmé par séquençage du produit de PCR spécifique de deltaF508 (figure 1). Les cellules fœtales isolées à partir du sang maternel des 3 autres couples de porteurs de l'allèle deltaF508 se sont révélées être homozygotes pour l'absence de l'allèle deltaF508. Les cellules fœtales isolées à partir du couple n°11 (figure 2) ont révélé l'absence homozygote de l'allèle deltaF508. La présence d'une mutation inconnue dans l'allèle paternel a été recherchée par amorces de STR informatifs sur le chromosome 7 (diagnostic indirect). L'analyse a prouvé la présence de l'allèle muté dans les cellules fœtales analysées. Les cellules fœtales isolées à partir du sang maternel du couple n°12 ont été testées avec des amorces de STR informatifs sur le chromosome 7 (Cf. tableau 2) afin de réaliser un diagnostic indirect. Les résultats ont montré que le fœtus avait hérité des allèles non mutés à la fois maternel et paternel (figure 3 et tableau 2). Tous les résultats que nous avons obtenus sur des cellules fœtales étaient cohérents avec les résultats obtenus par PVC.
Tableau 2 : Diagnostic prénatal de la mucoviscidose sur des cellules fœtales circulantes (méthode non invasive)
»uple Marqueurs informatifs Nombre Diagnostic prénatal de cellules fœtales Invasif (PVC) Non invasif (ISET) testées
1 D7S486/ D16S539 3 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
2 D16S539/ D21S1435 2 Homozygote NL Homozygote NL
3 D7S486/ D16S3018 2 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
4 D16S3018/ D21S1435 1 Homozygote NL Homozygote NL
5 D16S3018/ D21S1437 2 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
6 D16S539 / D16S3018 2 Homozygote NL Homozygote NL Ê
7 D16S539/ D21S1437 1 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
8 D16S3018/ D21S1435 1 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
9 D16S539/ D16S3018 3 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
10 D7S486/ D16S3018 2 Hétérozygote Δ F508 Hétérozygote Δ F508
11 D7S486/ D16S3018/ D21S1435 2 Hétérozygote MU 2 Hétérozygote MU 2
12 D7S480/ D7S486/ D16S3018 2 Homozygote NL 2 Homozygote NL 2
: " Diagnostic indirect ; PVC : prélèvement de villosités choriales ; NL : normal ; MU : mutation inconnue
3-3 Discussion
Nous prouvons ici la faisabilité d'un diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose par l'enrichissement efficace de cellules trophoblastiques et l'analyse de mutations limitée aux génomes de cellules uniques révélées fœtales par génotypage. Les résultats montrent que cette approche est valide à la fois pour des couples de porteurs de l'allèle deltaF508 et de porteurs de mutations inconnues à condition, dans ce dernier cas, que des informations sur un premier enfant affecté (cas index) soient disponibles. D'un point de vue technique, l'application d'analyses de cellules uniques à un diagnostic prénatal est limitée par le risque de perte d'allèle (ADO, allele drop out), l'incapacité de la PCR à amplifier l'une des deux séquences alléliques. Nos tests ont confirmé que l'ADO est strictement liée à la séquence des amorces et au profil de PCR. Une fois que ces paramètres ont été définis, I1ADO n'est plus une limitation à notre dosage. Lors de l'étape de génotypage des cellules uniques, même si une ADO se produit (nous l'avons en fait observée deux fois), la seule conséquence est la perte d'une cellule fœtale, sans risque d'effectuer un diagnostic erroné. Nous avons en fait confirmé le génotype fœtal de toute la cellule micro-disséquée par deux marqueurs STR. Pour l'amplification de la mutation de la mucoviscidose dans des cellules fœtales uniques, nous avons obtenu des résultats cohérents dans les cellules fœtales analysées. A ce stade, il est possible de mélanger les produits de PEP obtenus à partir de deux cellules fœtales ou plus, une procédure qui est connue pour éliminer le risque d'ADO. Cependant, dans ce travail, les résultats ont été obtenus sur des cellules fœtales uniques, sans avoir à mélanger I1ADN de plusieurs cellules fœtales uniques. Les données décrites ici dévoilent pour la première fois une approche fiable pour effectuer un diagnostic prénatal de la mucoviscidose sur des cellules fœtales circulantes, offrant de manière sûre des choix prénataux aux parents risquant d'avoir un enfant affecté par la mucoviscidose.
Exemple 2 : Filtration d'un échantillon de sang maternel pur ou dilué, de façon à concentrer sur un filtre selon leur taille certaines cellules circulantes et en particulier des cellules d'origine fœtale et analyse des cellules retenues sur le filtre afin d'obtenir une présomption de leur origine fœtale ou maternelle.
Les échantillons de sang ont été dilués 10 fois dans un tampon de filtration contenant 0,175% de saponine, 0,2% de paraformaldéhyde, 0,0372% d'EDTA et 0,1% de BSA, puis filtrés à l'aide d'un filtre calibré de polycarbonate présentant des pores calibrés cylindriques de 8 μm de diamètre. Les cellules retenues sur le filtre ont été regroupées sur un spot circulaire de 0,6 cm de diamètre. Après coloration à l'éosine et à l'hématoxyline, les spots ont été analysés au microscope et une photographie de chaque cellule a été prise à fort et faible agrandissement. La taille des cellules a été déterminée à l'aide du logiciel Adobe Photoshop, en prenant comme référence la taille de 8 μm des pores. Les photos permettent de retrouver les cellules au microscope Pixcell II Arcturus (Mountain View, CA). La figure 2 illustre l'analyse microscopique obtenue par cette méthode. On a réalisé la microdissection de chaque cellule par capture au laser sans aucun traitement préalable du filtre. Afin de s'assurer qu'une seule cellule est collectée à chaque fois, on a pris des photographies du filtre avant et après la microdissection et de la cellule microdisséquée déposée sur la capsule (CapSure™ HS). La cellule a ensuite été lysée dans 15 μl de tampon de lyse (100 mM Tris-HCI pH 8, 400 μg/ml proteinase K) pendant 16 heures à 37°C. Le lysat a été collecté après centrifugation et la proteinase K a été inactivée à 900C pendant 10 minutes. Après une préamplification par extension d'amorces (PEP) comme décrit par Zhang et al. (voir plus haut), l'ADN a été précipité à l'éthanol et resuspendu dans 10 μl d'eau. Chaque échantillon a ensuite été testé, d'une part, avec les amorces décrites dans la présente demande.
Exemple 3 : Etapes d'amplification.
Des PCR ont été mises en œuvre sur un volume de mélange réactionnel de 20 μl contenant 2 μl de produit PEP (préamplification par extension d'amorces), 10 mM Tris-HCI, 50 mM KCI, 1 ,5 mM MgCI2, 0,01% gélatine, 200 mM de chaque désoxynucléotide, 20 picomoles de chaque amorce utilisée et 1 U de Taq polymérase (Perkin-Elmer Cetus, Emeryville, CA). Après une étape de dénaturation initiale à 940C pendant 5 minutes, on a procédé à 40 cycles d'amplification (940C 30 s, 55 à 61 °C 30 à 45 s, 72°C 30 s) à l'aide des amorces externes selon l'invention et ce produit amplifié a de nouveau été amplifié à l'aide des amorces internes selon l'invention et du même protocole, puis on a réalisé une étape finale d'élongation à 72°C pendant 5 minutes dans un thermocycleur Perkin Elmer 9700 (cf tableau 1).
Example 4 : la détection de mutations dans le gène CFTR héritées du père et de la mère dans des cellules foetales isolées du sang maternel permettent un diagnostic prénatal sûr de la mucoviscidose
Une approche multi-marqueurs STR a été développée, de sorte à accélérer l'étape de génotypage sur une seule cellule, et l'analyse de la mutation F508 a été menée sur les génomes de trois cellules trophoblastiques mis ensemble (pooled génomes), de sorte à éviter les problèmes de perte allélique (allele drop out, ADO).
1-1 Matériels et Méthode
Prélèvement du sang et ISET
Six ml_ de sang maternel (avant PVC) et 1 ml_ de sang paternel ont été collectés sur un tampon acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA). L1ADN paternel et l'ADN maternel ont été extraits à partir de 1 ml_ de sang et 1 ,5 ng ont été utilisés pour un allélotypage avec des amorces qui portent un marqueur fluorescéine, et qui sont spécifiques de marqueurs STR liés au locus CFTR (D7S480, D7S486, D7S490, D7S523) ou à d'autres loci génomiques (D16539, D16S3018, D21S1435 et D21S1437, cf. tableau 1 ci-dessus). Les 5 mL restants de sang maternel ont été traités par ISET jusqu'à 3 heures après prélèvement, comme décrit précédemment, en utilisant l'appareil ISET (Metagenex, Paris, France ; www.metagenex.fr) et conservés à -200C (Beroud et al., 2003 ; Vona et al. 2002). Trois mL de chaque échantillon de sang maternel traité par ISET (c'est-à-dire trois tâches - spots - sur le filtre) ont été analysés. Après analyse immunohistochimique avec l'anticorps KL1 (Vona et al., 2002) pour identifier des cellules épithéliales, une microdissection au laser sur cellule unique a été réalisée en utilisant le microscope équipé de laser Nikon TE 2000 U (Nikon, Paris, France et MMI, Zurich, Suisse). L'ISET enrichit en cellules épithéliales à partir du sang, mais aussi retient environ 0,02% de leucocytes du sang périphérique (Vona et al. 2002 ; Vona et al. 2000). Ainsi, pour développer le protocole moléculaire pour le diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose, le sang de 5 porteurs connus de Fdelta508 a été traité par ISET, et 75 cellules uniques de leucocytes ont été microdisséquées.
Lyse cellulaire, pré-amplification par élongation des amorces et génotypage STR
Chaque cellule microdisséquée a été lysée dans 15 μl de tampon de lyse (Tris- HCI 100 mmol/L, pH 8, protéinase K 400 μg/ml) pendant 2 heures à 600C, suivi de l'inactivation de la protéinase K à 94°C pendant 15 minutes. Après pré- amplification par extension des amorces (PEP) (Zhang et al., 1992), à la cellule lysée, ont été ajoutés 5μl_ d'une solution 400 μM d'amorces aléatoires (Kit genPEPtm 75 OD, Genetix, Boston, USA), 6 μl_ de tampon PCR (25 mM MgCI2/gélatine (1 mg/mL), 100 mM tris-HCI, pH 8,3, 500 Mm KCL), 3 μl_ d'un mélange des 4 dNTPs (chacun à 2 mM) et 1 μl_ (5 U) of Taq polymérase (Applied Biosystem, Foster City, CA, USA) dans un volume final de 60 μl_.
D'autres amplifications STR (cf. tableau 1 ci-dessus) ont été réalisées dans 40 μl_ contenant 4 μl_ de produit PEP, 10 mM de Tris-HCI, 5OmM de KCI, 2,5 mM MgCI2, 200 μM de chaque désoxynucleotide, 0,5 μM de chaque amorce et 2 U de Taq GoId (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Un μl_ du produit PCR dilué au 1 :20 a alors été mélangé à 13,5 μl_ de formamide déionisé Hi-Di et à 0,5 μL de marqueur Genescan 400 HD (ROX) (Applied Biosystems), et a été placé dans un séquenceur automatique ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Les profils ont été analysés en utilisant les programmes Genescan et Genotyper (Applied Biosystems).
Tableau 3 : Taux d'effica< ;ité PCR et de précision d'amplification (PA) en utilisant des amorces STR- et F508-spécifiques
Nombre de tests Amorces Efficacité PCR Valeur p PA (%) ADO (%) Valeur p
PCR cellule individuelle 75 F508 67(90%) 61(91%) 6 (9%)
PCR sur groupes a 30 F508 30 (100%) <0,001 b 30 (100%) 0 (0%) <0,001c
PCR cellule individuelle 75 M1 58 (77%) 0,1d 42 (72%) 16 (28%) 0,2d M2 54 (72%) 0,9e 38 (70%) 16 (30%) M3 52 (69%) 0,6f 39 (75%) 13 (25%) °o;9; δ M1+M2+M39 71 (95%) <0,001 d ef 67(94%) 4 (6%) <0,001 d e f
Abréviations: STR, Short Tandem Repeat ; PA, précision d'amplification; ADO (allele drop out) perte alléiique;
M1 , D16S3018; M2, D16S539; M3, D21S1435. a mélange (pooling) de 3 produits PEP à partir de génomes de cellules individuelles amplifiables ; b vs. efficacité PCR F508 sur cellule individuelle ; cvs. précision PCR F508 sur cellule individuelle; d vs. M2 ; evs. M3 ; fvs. M1 ;
9 marqueurs testés en amplifications indépendantes.
Nous avons testé l'efficacité du génotypage sur cellule individuelle en calculant le taux d'échec PCR et le taux de perte allélique (ADO) dans des tests STR réalisés sur 75 leucocytes micro-disséqués. Nous avons utilisé trois marqueurs hétérozygotes (cf. tableau 3 ci-dessus), donnant deux allèles distinguables. Le taux d'efficacité PCR a été calculé comme étant le taux de cellules qui donnent un produit PCR, et le taux de précision PCR a été calculé comme le taux de cellules qui présente les deux allèles avec au moins un des trois marqueurs STR utilisés. Protocole pour l'amplification du locus F508 sur cellule individuelle Des fractions aliquotes de 4μL ont été prélevées des 60μL du produit PEP pour amplifications par PCR en utilisant des amorces fluorescéinées couvrant le locus F508 (cf. tableau 1 ci-dessus). Les génomes de cellules individuelles ont été testés de manière individuelle (4μL de produit PEP par amplification), et par groupes de trois, en mélangeant 30μL du produit PEP et en prenant 12μL (à partir des 90μL) pour l'amplification de F508. Les amplifications ont été réalisées dans 40μL contenant 4μL du produit PEP (ou 100μL contenant 12μL du produit PEP), 1OmM de Tris-HCI, 5OmM de KCI, 2,5mM de MgCI2, 200μL de chaque désoxynucléotide, 0,5μL de chaque amorce et 2 U de Taq GoId (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Ce protocole permet d'éviter les étapes de purification d'ADN qui présentent un haut risque de perdre des copies d'ADN. 1 μL du produit PCR dilué à 1 :20 a alors été mélangé avec 13,5μL de formamide déionisé Hi-Ti et 0,5μL de marqueurs (ROX) Genescan 400 HT (Applied biosystems) et placé dans un séquenceur automatique ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Les profils ont été analysés en utilisant les programmes Genescan et Genotyper (Applied Biosystems).
Application du protocole pour le diagnostique prénatal non invasif de la mucoviscidose à 12 femmes enceintes
Nous avons testé le sang périphérique de 12 femmes qui présentaient une grossesse de 11 à 13 semaines, et qui avaient demandé un diagnostic prénatal de la mucoviscidose, y compris deux femmes qui avaient eu un précédent enfant présentant une hétérozygotie composée pour la mucoviscidose (1 cas dit d'index ; couples 11 et 12, tableau 4). Toutes les femmes ont donné leur consentement éclairé à cette étude, qui a été approuvé par le comité local d'éthique. Tableau 4 : diagnostic pré-natal de la mucoviscidose (fibrose cystique, CF) par analyse génétique de cellules fœtales circulantes et par prélèvement de villosités choriales
Couple Marqueurs STR Nbre de Génotype CF Génotype CF Génotype CF Statut foetal informatifs CFCs sur CFC sur groupes par CVS testées individuelles de 3 CFCs c la D7S486/ D16S539/D21S1435 4 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF 2a D16S539/D21S1435/ D21S1437 3 N/N N/N N/N sain 3a D7S486/D16S3018/ D21S1437 3 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF 4a D16S539/D16S3018/D21S1435 4 N/N N/N N/N sain 5a D16S3018/D21S1437/D21S1435 3 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF 6a D7S480/D16S539/D16S3018 3 N/N N/N N/N sain T D16S539/D21S1437/D21S1435 4 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF en 8a D7S480/D16S3018/D21S1435 3 F508del/F508del F508del/F508del - F508del/F508del affecté 9a D16S539/D16S3018/ D21S1435 3 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF 10a D7S486/ D21S1435/ D21S1437 3 F508del/N F508del/N F508del/N porteur CF
11 d e D7S486/D7S490/D7S523 4 Mut/N Mut/N porteur CF 12 ' D7S480/D7S486/D7S523 3 N/N N/N sain
Abréviations:
ISET (Isolation by Size ofEpithelial Tumor/Trophoblastic celle) isolement selon la taille des cellules tumorales épithéliales / trophoblastiques ; CVS (chorionic villus sampling) prélèvement de villosités choriales ; F508del/N, avec allèle Fdelta508 hétérozygote ; N/N, avec allèles normaux homozygotes ; F508del/F508del, avec allèles Fdelta508 homozygotes ;
Mut/N, avec allèle muté hétérozygote. a porteurs Fdelta508 ; b une amplification précise et des résultats cohérents ont été obtenus dans toutes les CFCs testées ; c mélange (pooling) des produits de pré-amplification par élongation d'amorces (PEP) de trois CFCs ; d porteurs de mutations inconnues ; e un parent est un porteur Fdelta508.
Dans des cellules épithéliales circulantes qui se sont révélées être fœtales par génotypage STR, on a recherché de manière individuelle, et par groupe de trois cellules, la présence de mutations DeltaF508. Les tests de groupes ont été réalisés, comme décrits ci-dessus, en mélangeant 30μL du produit PEP de trois cellules fœtales par échantillon sanguin, et ensuite en prenant 12μL (à partir des 90μL pour l'amplification F508). Les analyses de séquences ont été réalisées en utilisant le kit de séquençages Big Dye Terminator (Applied Biosystems) (Vona et al. 2002) après purification du produit PCR sur des colonnes MicroSpin S-400RH (Amerscham Bioscience, Buckinghamshire, UK). Chez les couples dans lequel aucun, ou seulement un des parents, était porteur de la mutation deltaF508, l'analyse de cellules fœtales a été réalisée par une méthode indirecte, en utilisant des marqueurs polymorphes STR informatifs liés au locus CFTR sur le chromosome 7, permettant ainsi de comparer le cas index et les haplotypes du fœtus. Les tests non invasifs ont été réalisés dans le département de Biochimie de l'Hôpital Necker - enfants malades en utilisant une approche complètement à l'aveugle par des opérateurs qui n'étaient pas informés des résultats de l'analyse invasive, qui a été réalisée dans le département de Génétique Médicale du même Hôpital. Analyses statistiques
Le test du Chi2 a été utilisé pour les analyses statistiques de fréquences entre groupes. Une valeur p de moins de 0,05 a été considérée comme significative. 2-2 Résultats Génotypage STR sur cellule unique Pour optimiser le protocole de génotypage STR, nous avons analysé les génomes de 75 leucocytes individuels, en utilisant un ou trois marqueurs STR hétérozygotes (M1 , M2 et M3 (cf. tableau 3 ci-dessus)). Ceci nous a permis de distinguer les deux allèles, et de déterminer le taux de perte allélique (ADO) à l'étape de génotypages (cf. tableau 3). En utilisant seulement un marqueur, M1 ou M2 ou M3, nous avons obtenu une efficacité PCR (taux de cellules donnant un produit PCR) de 77%, 72%, 69% respectivement, et une précision PCR (taux de cellules présentant les deux allèles) de 72%, 70% et 75%, respectivement. Lorsque nous avons combiné les résultats obtenus avec les trois marqueurs STR, l'efficacité PCR (taux de cellules donnant un produit PCR avec au moins un des trois marqueurs STR utilisés) était de 95%, et la précision PCR (taux de cellules présentant les deux allèles avec au moins un des trois marqueurs STR utilisés) a augmenté significativement à 94% (cf. tableau 3). Ces données montrent que, à l'étape de génotypage de cellules micro-disséquées individuelles, l'efficacité et la précision PCR sont significativement augmentées en réalisant un génotypage STR informatif multi-marqueurs. Amplification du locus F508 du gène CFTR
Pour développer un protocole qui surmonte le problème de la perte allélique (ADO), nous avons utilisé l'ADN de 75 leucocytes individuels provenant de porteurs deltaF508 prouvés. Dans ce cas, l'allèle normal et l'allèle muté sont distinguables car ils ont une taille différente (120pb et 117pb, respectivement) (voir par exemple figure 5A') dans les amplifications sur cellule individuelle, nous avons détecté au moins un allèle F508 dans 67 des 75 cellules. Dans les 8 autres cellules, il n'y avait pas de signal, ce qui indique que l'étape de pré-amplification était insuffisante. Ainsi, l'efficacité PCR était de 90%. Parmi les 67 cellules positives à la PCR, nous avons observé une perte allélique (ADO) dans six de ces cellules (9%), et une amplification précise des deux allèles dans les 61 cellules restantes, ce qui donne une précision PCR de 91 % (cf. tableau 3). Comme la perte allélique (ADO) est un événement stochastique, et affecte l'un ou l'autre allèle à une fréquence d'environ 1 sur 10 analyses (0,1 ), elle affectera le même allèle à une fréquence de 1/20 (0,05). Nous en avons donc déduit que si nous mélangions l'ADN de 3 cellules fœtales ou plus, la fréquence de perte allélique affectant le même allèle tomberait à 0,0001 (0,05 x 0,05 x 0,05 = 0,000125). Nous avons donc mélangé en aveugle (par un opérateur ne connaissant pas les résultats précédents) les produits PEP de 67 échantillons d'ADN de leucocytes dans 30 bains aléatoires de trois, et avons réalisé l'amplification F508 et l'analyse de fragment comme décrit ci-dessus. Dans ce cas, nous avons observé de manière cohérente l'absence de perte allélique (cf. tableau 3 ci-dessus) dans l'ensemble des 30 tests. Lorsque nous avons comparé les résultats des cellules individuelles avec ceux des échantillons mélangés, nous avons observé que, dans 3 cas, nous avions mélangé l'ADN de deux cellules qui, lorsqu'elles étaient analysées individuellement donnaient une perte ailélique, et l'ADN d'une cellule, qui lorsqu'elle était analysée de manière individuelle, présentait les deux allèles. Le résultat du mélange des trois échantillons correspond à une absence de perte allélique. Dans un cas, nous avons mélangé trois cellules qui individuellement conduisaient à une perte allélique dans le test sur cellule individuelle, mais qui lorsqu'elles sont mélangées ensemble, ne conduisaient pas à une perte allélique. Nous avons alors mélangé l'ADN de six cellules présentant une perte allélique dans neuf bains de trois. Les résultats montrent une absence de perte allélique dans tous les tests réalisés. Nous expliquons cette observation par le fait que, dans les analyses en groupes, les probabilités d'inclure des séquences d'ADN provenant d'un seul (et du même) des deux allèles dans le mélange complet est, comme calculé précédemment, très faible (1/10 000). Nous en avons conclu que, en mélangeant 30 μl de produits PEP de trois cellules provenant d'un fœtus individuel et en prenant 12 μl pour la PCR, nous pouvons augmenter de manière très marquée la probabilité d'avoir des séquences bi-alléliques et d'avoir un test fiable pour détecter la présence d'un allèle deltaF508 dans le diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose.
Protocole pour le diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose (Figure 4).
En se basant sur les résultats obtenus, nous avons défini le protocole suivant pour le diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose. Les ADN extraits du sang maternel (1 mL) et du sang paternel (1 mL) sont comparés en utilisant des amorces STR pour identifier des marqueurs STR informatifs. L'ISET est utilisé pour enrichir en trophoblastes foeto-circulants à partir du sang maternel (5 mL). Les cellules trophoblastiques, identifiées par immunomarquage au KL1 et par morphologie cellulaire, sont ensuite récoltées de manière individuelle à partir du filtre ISET par microdissection à capture laser (LCM, laser capture microdissection), et leur ADN est ensuite analysé après lyse cellulaire. Le génome complet des cellules individuelles est tout d'abord amplifié par préamplification par élongation d'amorces aléatoires (PEP) (volume final : 60 μL). Des fractions aliquotes du produit PEP (4μL) ont été utilisées pour le génotypage avec 3 marqueurs STR informatifs pour déterminer si l'ADN est d'origine fœtale (ayant à la fois les allèles maternels et paternels) ou d'origine maternelle. Les marqueurs STR informatifs sur le chromosome 7 permettent un diagnostic indirect de la mucoviscidose (si un cas d'index est disponible). Des fractions aliquotes (30 μL) du produit PEP de trois cellules fœtales sont mélangées, et 12 μL sont utilisés pour l'amplification avec des amorces spécifiques de F508 ce qui permet d'éviter le risque de perte allélique (ADO) et de réaliser de manière fiable le diagnostic de la mucoviscidose.
Application du protocole à 12 couples présentant un risque d'avoir un enfant avec la mucoviscidose.
Nous avons ensuite appliqué cette méthode améliorée aux cellules sanguines prélevées de mères qui présentaient un risque d'avoir un fœtus affecté par la mucoviscidose. Les analyses de génotypage nous ont permis d'identifier au moins trois cellules fœtales à partir de 3 mL de chaque sang maternel (voir par exemple en Figure 5, les éléments A, B et C). Ces cellules fœtales ont été testées de manière individuelle, et également en groupes. Dans les groupes 1 à 10 (cf. Tableau 4 ci-dessus, cf. Figure 5) où les deux parents sont porteurs de deltaF508, nous avons étudié l'ADN extrait de cellules fœtales avec des amorces couvrant le locus F508 (voir Figure 5). Cet essai a permis d'identifier la mutation deltaF508 qui est caractérisée par une délétion de trois paires de bases (CTT) qui donne un produit PCR de 117 pb au lieu de 120 pb (voir figures 5 A', B' et C). Nous avons ainsi identifié des fœtus hétérozygotes portant la mutation deltaF508 (couples 1 , 3, 5, 7, 9 et 10) (Voir Figure 5, élément A'), des fœtus homozygotes (couples 2, 4 et 6) (Figure 5, élément B'), et un fœtus mutant homozygote pour la mucoviscidose (couple 8) Figure 5 élément C). Dans six cellules fœtales individuelles, les résultats que nous avons obtenus en génotypant par génotypage ont été confirmés en séquençant le produit de PCR spécifique du locus F508 (cf. Figure 5, éléments A", B" et C"). L'analyse de séquences n'a pas été réalisée de manière systématique, étant donné que les données obtenues par génotypages étaient extrêmement claires. Nous avons obtenu les mêmes résultats en testant de manière individuelle chaque CFC (cf. Tableau 4 ci-dessus) et en mélangeant les trois CFCs identifiéss dans chaque échantillon maternel. La fréquence de perte allélique était donc plus faible dans les échantillons provenant de CFCs (0/33) que ce que nous avions observé sur les leucocytes (6/67). Nous n'avons pas observé de perte allélique dans les groupes de produits PEP à partir des groupes de produit PEP de trois cellules fœtales.
Nous avons aussi montré que nous pouvons réaliser le diagnostic prénatal non invasif de la mucoviscidose dans des couples présentant des mutations CFTR inconnues, dans la mesure où l'ADN d'une fratrie affectée par la mucoviscidose (cas d'index) est disponible pour identifier les allèles STR liés aux allèles CFTR mutés. Chez le couple 11 (cf. Tableau 4), le père était un porteur de la mutation deltaF508, et la mère était porteuse d'une mutation inconnue (cf. Figure 6 éléments A, B et C). Des analyses de CFCs individuelles avec des amorces STR informatives liées au locus CFTR sur le chromosome 7 (diagnostic indirect) (cf. Figure 6 A), et par des amorces spécifiques du locus F508 (voir Figure 6 B), montrent l'absence de la mutation deltaF508, et la présence sous forme hétérozygote de l'allèle maternel portant la mutation inconnue qui a été identifiée par sa présence dans le génome du cas d'index. Ainsi, le fœtus était un porteur de la mutation maternelle inconnue. Chez le couple 12, le père et la mère étaient porteurs de la mutation inconnue (cf. Figure 6 D et E). Les analyses de cellules fœtales avec des amorces STR informatiques sur le chromosome 7 (diagnostic indirect) ont montré l'absence homozygote des allèles mutées, précédemment identifiés dans le génome du cas d'index. Ainsi, le fœtus était complètement normal.
Ce travail a entièrement été réalisé selon un protocole en aveugle, et des résultats cohérents ont été obtenus par la méthode non invasive ISET-CF et par la méthode invasive réalisée sur des échantillons de villosités choriales (CVS) par une équipe indépendante (voir Tableau 4 ci-dessus). 3-3 Discussion
Notre étude montre qu'un diagnostic prénatal non invasif de la fibrose cystique est possible, et peut être appliqué en routine dans le cadre de dispositifs cliniques. En réalité, l'application clinique de notre méthode aux cellules fœtales isolées à partir du sang de 12 mères ayant un quart de risque de donner naissance à un enfant affecté par la fibrose cystique, s'est, dans un protocole en aveugle, avérée être une méthode de diagnostic fiable dans tous les cas, avec identification précise des mères dont les fœtus sont sains, ou porteurs, ou affectés. La méthode implique l'isolement de cellules fœtales circulantes (CFCs) par ISET et microdissection laser, le génotypage pour déterminer la présence de marqueurs paternels (c'est-à-dire pour confirmer l'origine fœtale de ces cellules), et l'analyse de la mutation d'un pool de trois cellules dont le caractère fœtal avait été prouvé génétiquement. Les cellules fœtales peuvent être isolées de toutes les mères sans risque supplémentaire de fausse couche, et l'analyse de la mutation peut être réalisée sur des pools de cellules dont on a prouvé le caractère fœtal, ramenant presque à zéro, et de façon significative, la probabilité d'une ADO (perte allélique). Ces caractéristiques rendent le test fiable, et potentiellement applicable en clinique comme une alternative sûre aux procédures de diagnostic prénatal invasives. Des approches antérieures en vue du développement de protocoles de routine pour le diagnostic prénatal non invasif avaient échoué du fait de la faible efficacité des méthodes utilisées pour enrichir et/ou identifier des cellules fœtales circulantes (CFCs) (Bianchi, 1999 ; Bianchi, et al., 2002). De plus, les tests reposant sur le foetus portant un chromosome Y pour identifier des cellules fœtales comme étant différentes du fonds cellulaire maternel ne sont pas applicables aux fœtus féminins.
L'ADN fœtal dépourvu de cellules dans le plasma maternel, correspond à 3-5 % de l'ADN plasmatique total (Lo, et al., 1998), et permet la détermination du sexe fœtal, du statut fœtal de rhésus D et des mutations ponctuelles fœtales héritées du père dès lors que cet ADN n'existe pas dans le patrimoine génétique maternel (Li, et al., 2005 ; Li, et al., 2004). Cette approche, cependant, ne peut pas s'appliquer en routine pour le diagnostic prénatal de désordres récessifs tels que la fibrose cystique qui, par définition, requiert l'étude des mutations héritées de la mère et du père. Notre nouvelle approche surmonte tous les obstacles du diagnostic prénatal non invasif de la fibrose cystique. Les rares trophoblastes circulants, qui sont considérés comme ne persistant pas après l'accouchement (Bianchi, et al., 1996) sont enrichis par ISET, parce qu'ils sont plus grands que les leucocytes du sang périphérique. Cet enrichissement est tellement efficace que les cellules fœtales, 3 ou plus, ont été trouvées dans un échantillon unique de seulement 2-4 mL de sang pris chez toutes les mères du groupe de 51 testées jusqu'à présent dans notre laboratoire. Le génotypage de cellule individuelle après microdissection au laser permet d'identifier des cellules fœtales de façon univoque au moyen de la contribution bi-parentale à leur génome. Au stade du génotypage de cellule individuelle, même si une ADO survient, la conséquence est que l'ADN de la cellule individuelle est incomplètement caractérisé, et en conséquence écarté. Il n'y a pas de risque de réaliser un diagnostic incorrect. Cependant, nous montrons ici que le génotypage de cellules individuelles en utilisant 3 marqueurs STR, réduit fortement le taux d'ADO, en accroissant l'efficacité du génotypage de cellule individuelle et en accélérant le procédé de diagnostic. Finalement, le fait de réunir (pooler) la moitié du produit de pré-amplification par élongation d'amorces (PEP) (30 μl_ de 60 μl_) de 3 cellules fœtales et le fait de prendre 12 μl_ pour l'amplification F508, permet de réaliser une analyse de mutation sur l'ADN de cellule fœtale « pure », minimisant le diagnostic faux positif dû à la perte d'un allèle normal par ADO. Il a été préalablement démontré que le mélange d'ADN de 2 ou plus cellules uniques prévient presque complètement le risque d'ADO (Piyamongkol, et al., 2003), mais ces études ont été réalisées sur l'ADN cellulaire total (de cellules fraîches) qui n'avait pas été amplifié par PEP. Dans notre protocole, nous utilisons des aliquotes de produits PEP, rendant possible la réalisation de plusieurs analyses de PCR sur un génome de cellule individuelles, et sur un pool de génomes de plusieurs cellules à partir d'un fœtus unique. Dans notre expérience, le protocole optimisé de PEP inclut le degré de conservation d'ADN (nous conservons les filtres ISET pour le diagnostic prénatal non invasif à -200C), le traitement avec la protéinase K pour lyser les protéines de cellules (plusieurs protocoles ont été testés de façon comparée), et la qualité des amorces dégénérées utilisées pour la PEP (tout les lots d'amorces sont vérifiés avant leur utilisation dans le protocole de diagnostic prénatal non invasif). Nous confirmons que la PEP n'empêche pas l'apparition d'ADO (Hahn, et al., 1998), mais nos résultats vont plus loin et montrent que l'ADO est empêchée par le mélange de produits de PEP mélangés sous forme de grande partie aliquote. En réalité, les résultats obtenus en analysant 75 cellules testées individuellement et en pools de 3 cellules ont montré que la probabilité qu'une ADO, qui se produit de façon aléatoire, fasse échec à l'amplification du même allèle dans toutes les trois cellules poolées est extrêmement faible (1/10000). Dans la mesure où dans des protocoles de routine, le diagnostic prénatal non invasif pourrait être répété dans 5 à 10 pools de 3 cellules fœtales à partir d'un échantillon de sang de 10 mL, et dans la mesure où le test pourrait être également répété dans 2 échantillons de sang supplémentaires pris chez la même mère, le risque de diagnostic erroné pourrait être proche de zéro.
Dans le test de cellule unique, nous avons observé une plus forte incidence d'ADO parmi les 67 lymphocytes (9 %) que parmi les 33 cellules fœtales (0 %) analysées par PCR spécifique pour F508. Nous pensons que la nature compacte de l'ADN des lymphocytes pourrait expliquer leur plus fort taux d'ADO, si l'ADN de ces cellules est moins accessibles aux amorces de PCR.
Nous démontrons ici que le diagnostic prénatal non invasif de la fibrose cystique est possible même lorsque les deux parents portent des mutations CFTR inconnues (diagnostic indirect), dès lors que l'ADN d'un cas index (un enfant affecté du même couple) est disponible et que des amorces informatives STR sur le chromosome 7, où le gène CFTR est localisé, sont identifiées. En pratique, l'ADN d'un cas index est en général disponible parce que l'enfant affecté est très souvent l'indication unique que les parents sont porteurs des mutations de CFTR. Dans ce diagnostic indirect, il n'y a pas de nécessité de pooler les cellules fœtales pour éviter les erreurs parce que les allèles STR à la fois maternels et paternels, requis pour le diagnosti.c doivent être visualisés. Ainsi, la présence des deux allèles assure l'absence d'ADO et le diagnostic fiable.
En conclusion, nous avons développé un protocole basé sur l'ISET offrant un diagnostic prénatal fiable et sûr du statut de patients sains, porteurs ou affectés par la fibrose cystique.
Cette stratégie optimisée qui peut être accélérée par une microdissection laser automatisée et le développement de kits pour l'analyse PCR spécifique, devrait permettre l'accès du diagnostic prénatal non invasif de la fibrose cystique en application clinique.
3-4 Références bibliographiques de l'exemple 4
Balinsky W, Zhu CW. 2004. Pédiatrie cystic fibrosis: evaluating costs and genetic testing. J Pediatr Health Care 18(1 ):30-4.
Beroud C, Karliova M, Bonnefont JP, Benachi A, Munnich A, Dumez Y, Lacour B, Paterlini-Brechot P. 2003. Prénatal diagnosis of spinal muscular atrophy by genetic analysis of circulating fetal cells. Lancet 361 (9362): 1013-4. Bianchi DW. 1999. Fetal cells in the maternai circulation: feasibility for prénatal diagnosis. Br J Haematol 105(3):574-83.
Bianchi DW, Simpson JL, Jackson LG, Elias S, Holzgreve W, Evans Ml, Dukes KA, Sullivan LM, Klinger KW, Bischoff FZ and others. 2002. Fetal gender and aneuploidy détection using fetal cells in maternai blood: analysis of NIFTY I data. National Institute of Child Health and Development Fetal CeII Isolation Study. Prenat Diagn 22(7):609-15. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. 1996. MaIe fetal progenitor cells persist in maternai blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci U S A 93(2):705-8.
Ciarleglio LJ, Bennett RL1 Williamson J, Mandell JB, Marks JH. 2003. Genetic counseling throughout the life cycle. J Clin Invest 112(9): 1280-6.
Fink L, Collins FS. 1997. The Human Génome Project: view from the National
Institutes of Health. J Am Med Womens Assoc 52(1 ):4-7, 15. Garvin AM, Holzgreve W, Hahn S. 1998. Highly accurate analysis of heterozygous loci bysingle cell PCR. Nucleic Acids Res 26(15):3468-72. Hahn S, Garvin AM, Di Naro E, Holzgreve W. 1998. AIIeIe drop-out can occur in alleles differing by a single nucleotide and is not alleviated by preamplification or minor template incréments. Genêt Test 2(4):351-5. Hahn S, Zhong XY, Holzgreve W. 2002. Single cell PCR in laser capture microscopy. Methods Enzymol 356:295-301. Hahn S, Zhong XY, Troeger C, Burgemeister R, Gloning K, Holzgreve W. 2000.
Current applications of single-cell PCR. Cell Mol Life Sci 57(1):96-105. Kerem B, Rommens JM, Buchanan JA, Markiewicz D, Cox TK, Chakravarti A, Buchwald M, Tsui LC. 1989. Identification of the cystic fibrosis gène: genetic analysis. Science 245(4922): 1073-80. Li Y, Di Naro E, Vitucci A, Zimmermann B, Holzgreve W, Hahn S. 2005. Détection of paternally inherited fetal point mutations for beta-thalassemia using size- fractionated cell-free DNA in maternai plasma. Jama 293(7):843-9. Li Y, Holzgreve W, Page-Christiaens GC, GiIIe JJ, Hahn S. 2004. Improved prénatal détection of a fetal point mutation for achondroplasia by the use of size-fractionated circulatory DNA in maternai plasma-case report. Prenat
Diagn 24(11):896-8. Lo YM, Tein MS, Lau TK1 Haines CJ1 Leung TN, Poon PM1 Wainscoat JS1
Johnson PJ, Chang AM1 Hjelm NM. 1998. Quantitative analysis of fetal DNA in maternai plasma and sérum: implications for noninvasive prénatal diagnosis. Am J Hum Genêt 62(4):768-75.
Nasis O, Thompson S1 Hong T1 Sherwood M, Radcliffe S, Jackson L1 Otevrel T. 2004. Improvement in sensitivity of allele-specific PCR facilitâtes reliable noninvasive prénatal détection of cystic fibrosis. Clin Chem 50(4):694-701. Piyamongkol W, Bermudez MG, Harper JC, Wells D. 2003. Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop-out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis. Mol Hum Reprod 9(7):411-20. Schmidtke J. 1998. A Commentary on the NIH Consensus Development
Statement 'Genetic Testing for Cystic Fibrosis1. Community Genêt 1(1):53- 6. Vona G, Beroud C, Benachi A, Quenette A, Bonnefont JP, Romana S, Dumez Y,
Lacour B, Paterlini-Brechot P. 2002. Enrichment, immunomorphological, and genetic characterization of fetal cells circulating in maternai blood. Am
J PathoM60(1):51-8.
Vona G, Sabile A, Louha M, Sitruk V, Romana S, Schutze K, Capron F, Franco D, Pazzagli M, Vekemans M and others. 2000. Isolation by size of epithelial tumor cells : a new method for the immunomorphological and molecular characterization of circulatingtumor cells. Am J Pathol 156(1 ):57-63.
Watson MS, Cutting GR, Desnick RJ, Driscoll DA, Klinger K, Mennuti M, Palomaki GE, Popovich BW, Pratt VM, Rohlfs EM and others. 2004. Cystic fibrosis population carrier screening: 2004 revision of American Collège of Médical Genetics mutation panel. Genêt Med 6(5):387-91. Zhang L, Cui X, Schmitt K, Hubert R, Navidi W, Arnheim N. 1992. Whole génome amplification from a single cell: implications for genetic analysis. Proc Natl Acad Sci U S A 89(13):5847-51.

Claims

REVENDICATIONS
1 -Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose, à partir d'un échantillon de cellule(s) fœtale(s) isolée(s) d'un échantillon maternel prélevé comprenant l'ADN à tester d'un individu, ladite méthode comprenant les étapes suivantes : a. l'enrichissement en cellules foetales d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale ; b. l'analyse des cellules retenues pendant l'étape a) et la sélection des cellules présumées d'origine fœtale ; c. la démonstration par analyse génétique, de l'origine fœtale d'une ou plusieurs cellules sélectionnées à l'étape b et, d. sur l'ADN fœtal de cellule(s) sélectionnée(s) à l'étape c, la recherche d'allèles du gène CFTR porteurs de la mutation ΔF508 ou d'autres mutations connues ou, la recherche d'allèles d'un locus portant un polymorphisme génotypique génétiquement lié à une mutation morbide non identifiée du gène CFTR, au moyen des étapes suivantes: • l'amplification de l'ADN fœtal au moyen de couples d'amorces choisis pour leur capacité à amplifier le locus susceptible de porter la mutation connue recherchée sur le gène CFTR ou un locus comprenant un polymorphisme génotypique génétiquement lié (linkage) à la mutation du gène CFTR lors de la ségrégation, • l'identification sur les allèles correspondant aux fragments d'ADN amplifiés, de la présence ou de l'absence de la mutation connue recherchée du gène CFTR ou du locus polymorphique génétiquement lié au gène CFTR et
• la comparaison des allèles fœtaux avec les allèles correspondant d'échantillons contrôle et la détermination à partir de l'observation des allèles amplifiés, de la détection de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose chez l'individu testé. 2-Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 1 , dans laquelle la démonstration à l'étape c, de l'origine fœtale de cellules sélectionnées est réalisée par le génotypage desdites cellules au moyen des étapes suivantes : i) - l'amplification de l'ADN pris individuellement, d'une ou plusieurs cellules sélectionnées, à l'aide d'amorces dites informatives, capables d'amplifier des polymorphismes génétiques préalablement déterminés pour distinguer les allèles maternels des allèles paternels de façon à reconnaître le génome fœtal par la présence d'un allèle paternel et d'un allèle maternel dans chaque cellule sélectionnée ; ii) - la comparaison des allèles de l'ADN desdites cellules avec les allèles parentaux correspondants; iii) - la sélection de l'ADN de cellule(s) comportant un allèle maternel et un allèle paternel pour le ou les polymorphismes génétiques identifiés, démontrant l'origine fœtale de l'ADN de la(les) cellule(s).
3-Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle les amorces utilisées aux étapes c et d sont capables d'amplifier une petite quantité d'ADN.
4- Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle les amorces utilisées aux étapes c et d sont capables d'amplifier l'ADN d'une cellule unique.
5-Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 3 ou 4, dans laquelle les amorces utilisées sont capables d'amplifier une quantité d'ADN inférieure à 5 pg, notamment de l'ordre de 2 pg.
6- Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, dans laquelle l'étape d'amplification de l'étape c. et/ou l'étape d'amplification de l'étape d. comprend une première phase d'amplification réalisée avec des amorces externes et une deuxième phase d'amplification réalisée avec des amorces internes.
7- Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, dans laquelle les amorces informatives utilisées à l'étape c. sont dérivées de la séquence d'un chromosome choisi parmi le chromosome 16, le chromosome 21 ou le chromosome 7.
8-Méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 7, dans laquelle les amorces utilisées sont dérivées de la séquence du chromosome 7 et sont proches de l'allèle morbide de la mucoviscidose.
9-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle, à l'étape d., on recherche au moins un allèle porteur de la mutation du locus ΔF508 du gène CFTR, et on effectue l'amplification de l'ADN foetal testé avec des amorces capables d'amplifier le locus deltaF508 du gène CFTR.
10-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, dans laquelle on utilise des couples d'amorces capables d'amplifier le locus deltaF508 choisis parmi les couples (F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO : 25 ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO : 26) ; et (F : 5'- TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' SEQ ID NO : 27 ; R : 5'-
TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO : 28). 11 -Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 7 dans laquelle, l'anomalie du gène CFTR recherchée n'est pas connue et les étapes c et d sont réalisées dans les conditions suivantes :
• l'amplification selon les étapes c. et d. est confondue et réalisée au moyen d'amorces informatives d'amplification capables d'amplifier un locus comprenant un polymorphisme génotypique génétiquement lié (linkage) au gène CFTR lors de la ségrégation, et • la comparaison avec les échantillons contrôles à l'étape d. comporte la comparaison des allèles identifiés de l'ADN fœtal avec les allèles correspondants paternels, les allèles correspondants maternels et les allèles correspondants d'un enfant de la fratrie affecté par la mucoviscidose.
12-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 1 ou la revendication 11 dans laquelle, pour identifier la présence ou l'absence, d'au moins un allèle portant un polymorphisme génétique, formant un linkage avec l'allèle morbide de la mucoviscidose, l'au moins une phase d'amplification de l'ADN fœtal, de l'ADN maternel, de l'ADN paternel et de l'ADN de l'enfant de la fratrie est réalisée avec un ou plusieurs couples d'amorces choisis parmi :
(F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO : 1 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2),
(F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO : 5 ; R : 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-S1 SEQ ID NO : 6),
(F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30)) ; (F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-S' (SEQ ID NO: 34)) ;
(F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ ID NO : 3 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 4), (F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ ID NO : 7 ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO : 8),
(F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32)) ; (F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36)).
13-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 10, dans laquelle l'étape c. comprend ou consiste en l'identification, sur une préparation d'ADN dérivée du génome d'une cellule fœtale unique collectée, d'un ou plusieurs marqueurs de polymorphisme génétique ou d'une combinaison de ces marqueurs, démontrant la contribution bi- parentale à l'ADN de ladite cellule et en conséquence, l'origine fœtale de ladite au moins une cellule.
14-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 13, dans laquelle les couples d'amorces dites informatives utilisées à l'étape c) sont choisis parmi :
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO : 1 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2,
- F : S'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO : 5 ; R : 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO : 6, - F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' SEQ ID NO : 9 ; R : 5'-
ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' SEQ ID NO : 10,
- F : δ'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-S' SEQ ID NO : 13, R : 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' SEQ ID NO : 14 ;
- F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' SEQ ID NO : 17 ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-S' SEQ ID NO : 18,
- F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' SEQ ID NO : 21 ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' SEQ ID NO : 22,
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ; - F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-S1 (SEQ ID NO: 34) ;
- F: 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ IDNO: 3 ; R: 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 4, - F: 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ IDNO: 7; R: 5'-
GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO : 8,
- F: 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' SEQ IDNO: 11 ; R: 5'- ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-S1 SEQ ID NO : 12,
- F: 5'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-3' SEQ IDNO: 15; R: 5'- AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' SEQ ID NO : 16,
- F: 5'-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' SEQ IDNO: 19; R: 5'- GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' SEQ ID NO : 20,
F : 5'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-3! SEQ ID NO : 23 ; R : 5'- TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' SEQ ID NO :24, - F: 5!- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31) ; R: 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ;
- F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36).
15-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 11, dans laquelle, les amorces suivantes sont utilisées à l'étape c: F: 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ IDNO: 1, R: 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ IDNO: 2; ou F: 5'- GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-3' SEQ IDNO: 5, R: 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ IDNO: 6; ou F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29), R: 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ; ou F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33), R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34), pour la réalisation d'une première phase d'amplification ;
- F: 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ IDNO: 3, R: 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ IDNO: 4; ou F: 5'- AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ ID NO : 7, R : 5'-
GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO : 8 ; ou F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31), R : 5'-
AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ; ou F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35), R:5'-
AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36), pour la réalisation d'une deuxième phase d'amplification.
16- Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon la revendication 10, dans laquelle les amorces utilisées capables d'amplifier le locus deltaF508 sont : F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO : 25 ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO : 26 pour la première phase d'amplification et ; F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' SEQ ID NO : 27 ; R : 5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO : 28 pour la deuxième phase d'amplification.
17-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle des cellules retenues pendant l'étape a) sont collectées individuellement notamment par microdissection.
18-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose, selon l'une quelconque des revendications 1 à 16, dans laquelle des cellules retenues pendant l'étape a) sont collectés, puis analysées in situ au cours de l'étape b), sans collecte individuelle des cellules.
19-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 1 à 18, dans laquelle l'étape a) consiste en la filtration d'un échantillon maternel prélevé, pur ou dilué, susceptible de comprendre des cellules d'origine fœtale, de façon à concentrer sur un filtre, selon leur taille, certaines cellules y compris des cellules d'origine fœtale et, l'étape b) consiste en l'analyse des cellules retenues sur le filtre et la sélection des cellules présumées d'origine foetale.
20-Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications 10, 12, 14, 15 ou 16 dans laquelle au moins une amorce utilisable pour réaliser l'étape c. et/ou l'étape d. est remplacée par un oligonucléotide variant dont la séquence est dérivée de celle d'une desdites amorces, ledit oligonucléotide variant présentant au moins 60 % d'identité, de préférence 80 %, de manière préférée 95 % d'identité ou plus, avec l'amorce dont sa séquence dérive.
21 -Méthode de détection, non invasive prénatale, de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que ladite étape d. est réalisée sur le pool de l'ADN de plusieurs cellules sélectionnées individuellement à ladite étape c.
22-Polynucléotide utilisable comme amorce pour amplifier une quantité d'ADN d'un échantillon biologique caractérisé en ce qu'il est choisi parmi des polynucléotides dont la séquence comprend ou consiste en l'une des séquences suivantes :
F : δ'-AAAAACCCTGGCTTATGC-S' SEQ ID NO : 1 ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2 ; - F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO : 5 ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO : 6 ;
- F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-31 SEQ ID NO : 9 ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' SEQ ID NO : 10;
- F : δ'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-S' SEQ ID NO : 13 ; R : 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' SEQ ID NO : 14;
- F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' SEQ ID NO : 17 ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' SEQ ID NO : 18 ;
- F : 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3' SEQ ID NO : 21 ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' SEQ ID NO : 22 ; - F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'~ AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ; - F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO : 25 ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO : 26 ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' SEQ ID NO : 27 ; R : 5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO : 28.
23-Couple de polynucléotides, utilisable comme couple d'amorces pour amplifier une quantité d'ADN d'un échantillon biologique, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les couples de polynucléotides dont les séquences comprennent ou consistent en :
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO :1 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO :2 ;
- F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO :5 ; R : 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO :6 ;
- F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' SEQ ID NO :9 ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' SEQ ID NO :10; - F : 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' SEQ ID NO :13, R : 5'-
GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' SEQ ID NO :14 ;
- F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' SEQ ID NO :17 ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' SEQ ID NO :18 ;
- F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' SEQ ID NO :21 ; R : 5'- ATGTACACTGACTTGTTTGAG-S' SEQ ID NO :22 ;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3" (SEQ ID NO: 34) ; F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO :25 ; R : 5'-
TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO :26 ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' SEQ ID NO :27 ; R : 5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO :28. 24- Polynucléotide présentant au moins 60 % d'identité, de préférence 80 %, de manière préférée 95 % d'identité ou plus, avec une séquence selon la revendication22.
25- Association d'un couple d'amorces dites externes par rapport à la séquence cible, utilisé dans une première phase d'amplification d'une préparation d'ADN et d'un autre couple d'amorces dites internes ou emboîtées par rapport aux dites amorces externes, utilisé dans une deuxième phase d'amplification sur le produit d'amplification obtenu par ladite première phase d'amplification, lesdits couples étant choisis parmi :
-F: 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-31 SEQ IDNO: 1 ; R: 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2) en tant qu'amorces externes et -F: 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ IDNO: 3; R: 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 4 en tant qu'amorces internes ; ou
-F: δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ IDNO: 5; R: 5'- TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO : 6 en tant qu'amorces externes et -F: 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ IDNO: 7; R: 5'-
GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO : 8 en tant qu'amorces internes ; ou
-F: 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3' SEQ IDNO: 9 ; R: 5'-
ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' SEQ ID NO : 10 en tant qu'amorces externes et -F: 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' SEQ IDNO: 11.; R: 5'- ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' SEQ ID NO : 12 en tant qu'amorces internes ; ou
- F: 5'-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' SEQ IDNO: 13, R: 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' SEQ IDNO: 14; en tant qu'amorces externes et -F : δ'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' SEQ ID NO : 15 ; R : 5'- AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' SEQ ID NO : 16 en tant qu'amorces internes ; ou
-F : δ'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-S' SEQ ID NO : 17 ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' SEQ ID NO : 18 en tant qu'amorces externes et -F : 5'-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' SEQ ID NO : 19 ; R : 5'-
GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' SEQ ID NO : 20 en tant qu'amorces internes ; ou
- F : 5'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-3' SEQ ID NO : 21 ; R : 5'-
ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' SEQ ID NO : 22 en tant qu'amorces externes et F : δ'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-S' SEQ ID NO : 23; R : 5'- TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' SEQ ID NO : 24 en tant qu'amorces internes, ou
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO : 25 ; R : 5'- TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO : 26 en tant qu'amorces externes et F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTG G-3' SEQ ID NO : 27 ; R : 5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO : 28 en tant qu'amorce internes, ou
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) en tant qu'amorces externes et F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31 ) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) en tant qu'amorces internes, ou
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO:. 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) en tant qu'amorces externes et F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36) en tant qu'amorces internes.
26-Utilisation d'amorces dans le cadre d'une méthode de détection, non invasive prénatale, in vitro de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose à partir de l'ADN génomique de cellules fœtales isolées de l'échantillon maternel prélevé, caractérisée en ce que les amorces sont choisies parmi :
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO : 1 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO : 2 ; - F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO : 5 ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO : 6;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ;
- F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ ID NO :3 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO :4 ;
- F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ ID NO :7 ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO :8 ; - F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31 ) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ; - F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36) ;
F : δ'-TGGAGCCTTCAGAGGGTAAA-S' SEQ ID NO :25 ; R : 5'- TGCATAATCAAAAAGTTTTCACA-3' SEQ ID NO :26 ;
F : 5'-TCTGTTCTCAGTTTTCCTGG-3' SEQ ID NO :27 ; R : (5'- TCTTACCTCTTCTAGTTGGC-3' SEQ ID NO :28.
27-Utilisation d'amorces dans le cadre d'une méthode in vitro pour l'identification du caractère fœtal d'une cellule unique collectée à partir de l'échantillon maternel prélevé, sur une préparation d'ADN dérivée du génome de la cellule unique collectée, caractérisée en ce que les amorces sont choisies parmi :
F : 5'-AAAAACCCTGGCTTATGC-3' SEQ ID NO :1 ; R : 5'-
AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO :2 ; - F : δ'-GGAATCTGTTCTGGCAATGGAT-S' SEQ ID NO :5 ; R : 5'-
TTGCAATGAGCCGAGATCCTG-3' SEQ ID NO :6 ;
- F : 5'-CAGATGCTCGTTGTGCACAA-3I SEQ ID NO :9 ; R : 5'- ATACCATTTACGTTTGTGTGTG-3' SEQ ID NO :10 ; - F : 5!-TGACAGTGCAGCTCATGGTC-3' SEQ ID NO .13, R : 5'- GGTCATTGGTCAAGGGCTGCT-3' SEQ ID NO :14 ;
- F : 5'-TTGACATTCTTCTGTAAGGAAGA-31 SEQ ID NO :17 ; R : 5'- AGGCTTGCCAAAGATATTAAAAG-3' SEQ ID NO :18 ; - F : δ'-TTGTGAATAGTGCTGCAATG-S' SEQ ID NO :21 ; R : 5'-
ATGTACACTGACTTGTTTGAG-3' SEQ ID NO :22 ;
- F: 5'- AAGTAATTCTCCTGCCTCAG-3' (SEQ ID NO: 29) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT -3' (SEQ ID NO: 30) ;
- F: 5'- GAATTATAACCGTAACTGATTC-3' (SEQ ID NO: 33) ; R:5'- GAGATAATGCTTGTCTGACTTC-3' (SEQ ID NO: 34) ;
- F : 5'-CTTGGGGACTGAACCATCTT-3' SEQ ID NO :3 ; R : 5'- AGCTACCATAGGGCTGGAGG-3' SEQ ID NO :4 ;
- F : 5'-AAAGGCCAATGGTATATCCC-3' SEQ ID NO :7 ; R : 5'- GCCCAGGTGATTGATAGTGC-3' SEQ ID NO :8 ; - F : 5'-GATCCCAAGCTCTTCCTCTT-3' SEQ ID NO :11 ; R : 5'-
ACGTTTGTGTGTGCATCTGT-3' SEQ ID NO :12 ;
- F : 5'-GGATAAACATAGAGCGACAGTTC-S' SEQ ID N0 :15 ; R : 5'- AGACAGAGTCCCAGGCATT-3' SEQ ID NO :16 ;
- F : 5'-CCCTCTCAATTGTTTGTCTACC-3' SEQ ID N0 :19 ; R : 5'- GCAAGAGATTTCAGTGCCAT-3' SEQ ID NO :20 ;
- F : δ'-ATGTACATGTGTCTGGGAAGG-S' SEQ ID NO :23 ; R : 5'- TTCTCTACATATTTACTGCCAACA-3' SEQ ID NO :24 ;
- F: 5'- CCTTGGGCCAATAAGGTAAG-3' (SEQ ID NO: 31 ) ; R : 5'- AGCTACTTGCAGTGTAACAGCATTT-3' (SEQ ID NO: 32) ; - F: 5'- CTGATTCATAGCAGCACTTG -3' (SEQ ID NO: 35) ; R:5'- AAAACATTTCCATTACCACTG-3' (SEQ ID NO: 36).
28-Kit pour la détection, non invasive prénatale de l'état sain normal, de l'état de porteur sain ou de l'état de porteur malade de la mucoviscidose comprenant une ou plusieurs amorces selon la revendication 27, et le cas échéant des réactifs pour effectuer l'amplification de l'ADN et/ou des instructions pour effectuer la détection de l'état de porteur sain ou de porteur malade de la mucoviscidose.
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX340916B (es) 2008-01-18 2016-07-29 President And Fellows Of Harvard College * Metodos para detectar señales de identificacion de enfermedad o condiciones en fluidos corporales.
CA2793877A1 (fr) 2010-03-22 2011-09-29 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Mutations associees a la mucoviscidose
TW201209171A (en) 2010-07-23 2012-03-01 Harvard College Methods of detecting diseases or conditions using phagocytic cells
US20130203624A1 (en) 2010-07-23 2013-08-08 President And Fellows Of Harvard College Methods of Detecting Prenatal or Pregnancy-Related Diseases or Conditions
EP2596132A4 (fr) 2010-07-23 2013-12-18 Harvard College Procédés de détection de signatures de maladies ou pathologies dans des liquides biologiques
AU2011280997A1 (en) 2010-07-23 2013-02-28 President And Fellows Of Harvard College Methods of detecting autoimmune or immune-related diseases or conditions
US20130316347A1 (en) * 2012-05-24 2013-11-28 Rarecells Sas Process for multi-analyses of rare cells extracted or isolated from biological samples through filtration
CN104619856A (zh) * 2012-05-29 2015-05-13 加利福尼亚大学董事会 用于从流体样品中分离细胞的系统、方法及部件
MX2014015434A (es) * 2012-06-15 2015-07-14 Harry Stylli Metodos para detectar enfermedades o condiciones utilizando celulas enfermas en circulacion.
NZ771629A (en) 2013-03-09 2022-12-23 Harry Stylli Methods of detecting cancer
WO2014164362A1 (fr) 2013-03-09 2014-10-09 Harry Stylli Procédés de détection du cancer de la prostate
US10947587B2 (en) * 2013-11-05 2021-03-16 The Regents Of The University Of California Single-cell forensic short tandem repeat typing within microfluidic droplets
JP2016042836A (ja) * 2014-08-25 2016-04-04 富士フイルム株式会社 検査通知出力装置、検査通知出力方法、検査通知出力プログラム、及び遺伝子染色体検査システム
US10626464B2 (en) 2014-09-11 2020-04-21 Cell Mdx, Llc Methods of detecting prostate cancer
JP2018183095A (ja) * 2017-04-26 2018-11-22 株式会社エンプラス 胎児由来造血前駆細胞の単離方法、および胎児の染色体異常の可能性を試験する方法

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5721098A (en) * 1986-01-16 1998-02-24 The Regents Of The University Of California Comparative genomic hybridization
ES2112833T3 (es) 1988-12-06 1998-04-16 Flinders Technologies Pty Ltd Aislamiento de celulas fetales a partir de sangre materna para permitir el diagnostico prenatal.
US6309822B1 (en) * 1989-06-07 2001-10-30 Affymetrix, Inc. Method for comparing copy number of nucleic acid sequences
US5641628A (en) * 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
FR2657543B1 (fr) * 1990-01-26 1992-12-18 Biocom Sa Dispositif modulaire pour le recueil, l'incubation, la filtration d'echantillons multiples.
US5474796A (en) * 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
FR2782730B1 (fr) * 1998-08-25 2002-05-17 Biocom Sa Procede de separation cellulaire pour l'isolation de cellules pathogeniques, notamment cancereuses rares, equipement et reactif pour la mise en oeuvre du procede et application du procede
US6682887B1 (en) * 1999-04-30 2004-01-27 Aclara Biosciences, Inc. Detection using degradation of a tagged sequence
DE10002446A1 (de) * 2000-01-21 2001-08-16 Paul Cullen Genchip für ein Neugeborenen Screening
US20020182609A1 (en) * 2000-08-16 2002-12-05 Luminex Corporation Microsphere based oligonucleotide ligation assays, kits, and methods of use, including high-throughput genotyping
FR2824144B1 (fr) * 2001-04-30 2004-09-17 Metagenex S A R L Methode de diagnostic prenatal sur cellule foetale isolee du sang maternel
AUPR749901A0 (en) * 2001-09-06 2001-09-27 Monash University Method of identifying chromosomal abnormalities and prenatal diagnosis
WO2003031646A1 (fr) * 2001-10-12 2003-04-17 The University Of Queensland Selection et amplification de marqueurs genetiques multiples
US7399590B2 (en) * 2002-02-21 2008-07-15 Asm Scientific, Inc. Recombinase polymerase amplification
MXPA05005205A (es) * 2002-11-14 2006-03-08 Third Wave Tech Inc Pruebas para deteccion de alelo ctfr.
US20040157220A1 (en) * 2003-02-10 2004-08-12 Purnima Kurnool Methods and apparatus for sample tracking
ATE435301T1 (de) * 2003-10-16 2009-07-15 Sequenom Inc Nicht invasiver nachweis fötaler genetischer merkmale

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. H. HANDYSIDE: "Isothermal whole genome amplification from single and small numbers of cells: a new era for preimplantation genetic diagnosis of inherited disease", MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION, vol. 10, no. 10, 1 January 2004 (2004-01-01), pages 767 - 772, XP055057148, ISSN: 1360-9947, DOI: 10.1093/molehr/gah101 *
ADINOLFI M: "NON- OR MINIMALLY INVASIVE PRENATAL DIAGNOSTIC TESTS ON MATERNAL BLOOD SAMPLES OR TRANSCERVICAL CELLS", PRENATAL DIAGNOSIS, CHICHESTER, SUSSEX, GB, vol. 15, no. 10, 1 October 1951 (1951-10-01), pages 889 - 896, XP009051370, ISSN: 0197-3851 *
BAYRAK-TOYDEMIR PINAR ET AL: "Are fetal cells in maternal plasma really there? We think they are.", JOURNAL OF HUMAN GENETICS, vol. 48, no. 12, 2003, pages 665 - 667, ISSN: 1434-5161 *
BEROUD C ET AL: "Prenatal diagnosis of spinal muscular atrophy by genetic analysis of circulating fetal cells", THE LANCET, LANCET LIMITED. LONDON, GB, vol. 361, no. 9362, 22 March 2003 (2003-03-22), pages 1013 - 1014, XP004778156, ISSN: 0140-6736, DOI: 10.1016/S0140-6736(03)12798-5 *
BISCHOFF F Z ET AL: "Intact fetal cell isolation from maternal blood: Improved isolation using a simple whole blood progenitor cell enrichment approach (RosetteSepTM).", CLINICAL GENETICS, vol. 63, no. 6, June 2003 (2003-06-01), pages 483 - 489, ISSN: 0009-9163 *
CHEN HAN-PING ET AL: "Comparison of three methods for the gene analysis of fetal cells from maternal peripheral blood", CHINESE MEDICAL JOURNAL (ENGLISH EDITION), vol. 117, no. 4, April 2004 (2004-04-01), pages 507 - 510, ISSN: 0366-6999 *
CHOOLANI MAHESH ET AL: "Characterization of first trimester fetal erythroblasts for non-invasive prenatal diagnosis.", MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION, vol. 9, no. 4, April 2003 (2003-04-01), pages 227 - 235, ISSN: 1360-9947 *
COSTA J-M: "NOUVELLE APPROCHE NON INVASIVE DE DIAGNOSTIC PRENATAL: L'ANALYSE DU SANG MATERNEL//NEW NON-INVASIVE TECHNIQUE FOR PRENATAL DIAGNOSIS: ANALYSIS OF MATERNAL BLOOD", JOURNAL DE GYNECOLOGIE OBSTETRIQUE ET BIOLOGIE DE LAREPRODUCTION, MASSON, PARIS, FR, vol. 32, no. 1, SUPPL, 1 February 2003 (2003-02-01), pages 1S48/1S49, XP009024980, ISSN: 0368-2315 *
O'DONOGHUE K ET AL: "Identification of fetal mesenchymal stem cells in maternal blood: Implications for non-invasive prenatal diagnosis.", MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION, vol. 9, no. 7-8, July 2003 (2003-07-01), pages 497 - 502, ISSN: 1360-9947 *
See also references of WO2006077322A1 *
W. PIYAMONGKOL: "Detailed investigation of factors influencing amplification efficiency and allele drop-out in single cell PCR: implications for preimplantation genetic diagnosis", MOLECULAR HUMAN REPRODUCTION, vol. 9, no. 7, 1 July 2003 (2003-07-01), pages 411 - 420, XP055187262, DOI: 10.1093/molehr/gag051 *
WACHI TOSHIKI ET AL: "Studies on preliminary concentration methods for recovery of fetal nucleated red blood cells in maternal blood", CONGENITAL ANOMALIES, vol. 44, no. 4, December 2004 (2004-12-01), pages 196 - 203, ISSN: 0914-3505 *

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