JP2018183095A - 胎児由来造血前駆細胞の単離方法、および胎児の染色体異常の可能性を試験する方法 - Google Patents

胎児由来造血前駆細胞の単離方法、および胎児の染色体異常の可能性を試験する方法 Download PDF

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Abstract

【課題】 胎児の出生前診断において、生検を用いた確定診断を必須とせず、リキッドバイオプシーの試料として使用可能な新たな試料の調製方法を提供する。
【解決手段】 本発明は、胎児由来造血前駆細胞の単離方法であり、エマルション形成工程と、培養工程と、検出工程と、選択工程とを含み、前記エマルション形成工程は、妊婦の血液試料と、培地と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記血液試料に含まれる妊婦由来造血前駆細胞または胎児由来造血前駆細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、前記培養工程は、造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記複数の液滴を、それぞれ培養する工程であり、前記検出工程は、前記培養後の液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する工程であり、前記選択工程は、前記培養後の液滴のうち、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択する工程であることを特徴とする。
【選択図】 なし

Description

本発明は、胎児由来造血前駆細胞の単離方法、および胎児の染色体異常の可能性を試験する方法に関する。
医療の現場において、患者から採取した生検を用いる生検診断が一般的である。しかしながら、生検の採取は、患者への負担が大きいことから、近年、血液等の体液試料を用いて診断を行うリキッドバイオプシーが注目されている。ダウン症等の胎児の出生前診断においても、絨毛、羊水等の生検が使用されていたが、リキッドバイオプシーとして、妊婦の血液に含まれるセルフリーＤＮＡや胎児由来の有核赤血球を用いる診断方法が提案されている（非特許文献１〜４）。
しかしながら、セルフリーＤＮＡも有核赤血球由来のＤＮＡも、染色体構造が完全に保持されてはいない。このため、染色体構造が保持されていないこれらの試料を、ダウン症のような染色体異常による疾患の診断において使用した場合、信頼性の点から、その診断結果で確定することが困難である。このため、結果的には、生検を用いた確定診断が必要とされているのが実情である。
Ron M. McCullough、「Non-Invasive Prenatal Chromosomal Aneuploidy Testing - Clinical Experience: 100,000 Clinical Samples」、PLOS ONE、Public Library of Science、October 2014、Volume 9、Issue 10、e109173 Taylor J. Jensen、「High-Throughput Massively Parallel Sequencing for Fetal Aneuploidy Detection from Maternal Plasma」、PLOS ONE、Public Library of Science、March 2013 | Volume 8 | Issue 3 | e57381 Amin R. Mazloom、「Noninvasive prenatal detection of sex chromosomal aneuploidies by sequencing circulating cell-free DNA from maternal plasma」、Prenatal Diagnosis、John Wiley & Sons, Ltd、2013、33、p.591-597 Glenn E. Palomaki、「DN A sequencing of maternal plasma reliably identifies trisomy 18 and trisomy 13 as well as Down syndrome:an international collaborative study」、 Genetics in medicine、American College of Medical Genetics and Genomics、March 2012、Volume 14、Number 3、p.296-305
そこで、本発明は、胎児の出生前診断において、生検を用いた確定診断を必須とせず、リキッドバイオプシーの試料として使用可能な新たな試料の調製方法を提供することを目的とする。
前記目的を達成するために、本発明は、胎児由来造血前駆細胞の単離方法であり、
エマルション形成工程と、培養工程と、検出工程と、選択工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、妊婦の血液試料と、培地と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記血液試料に含まれる妊婦由来造血前駆細胞または胎児由来造血前駆細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記培養工程は、造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記複数の液滴を、それぞれ培養する工程であり、
前記検出工程は、前記培養後の液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する工程であり、
前記選択工程は、前記培養後の液滴のうち、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択する工程であることを特徴とする。
本発明は、胎児の染色体異常の可能性を試験する方法であり、
胎児由来造血前駆細胞の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、妊婦の血液試料から、前記本発明の単離方法により、胎児由来造血前駆細胞を単離する工程であり、
前記解析工程は、前記単離された胎児由来造血前駆細胞について、染色体解析を行う工程であることを特徴とする。
本発明によれば、胎児由来造血前駆細胞を効率よく単離することができる。前記胎児由来造血前駆細胞に含まれる染色体は、染色体構造が保持されていることから、胎児の染色体異常の可能性の試験において、有用な試料として使用できる。
本発明者は、胎児の染色異常の診断において、生検を必要としない、リキッドバイオプシーでの診断の確定を行うため、鋭意研究を行った。妊婦の血液（末梢血）には、造血前駆細胞がわずかに含まれており、妊婦と胎児との間における相互輸血により、妊婦の血液には、胎児由来の造血前駆細胞もごくわずかに含まれている。このため、妊婦の血液から、胎児由来造血前駆細胞を単離できれば、前記胎児由来造血前駆細胞中の完全な染色体を用いて、胎児の染色体異常を診断することが可能になるとの知見を得た。そこで、妊婦の血液試料を用いて非水溶性溶媒中での液滴を形成し、造血前駆細胞の増殖因子を用いて前記液滴の培養を行うことで、液滴中の細胞のうち造血前駆細胞を特異的に増殖した上で、前記胎児由来造血前駆細胞を検出することにより、前記胎児由来造血前駆細胞を、効果的に単離できるとして、本発明を確立するに至った。このように、本発明によれば、染色体が保持された胎児由来造血前駆細胞を単離できるため、リキッドバイオプシーによる胎児の出生前診断を、従来のセルフリーＤＮＡ等を用いる診断よりも、高い信頼性で行うことができ、生検での確定診断も割愛することが可能になる。
本発明の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記造血前駆細胞の増殖因子の存在下、液滴を形成する。
本発明の単離方法は、例えば、前記検出工程において、前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する。
本発明の単離方法は、例えば、前記エマルション形成工程において、前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、前記検出工程において、前記液滴に含まれる前記増幅試薬を用いて、前記遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する。
本発明の単離方法は、例えば、前記検出工程において、前記液滴に前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅用試薬を添加し、前記遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する。
本発明の単離方法は、例えば、前記検出工程において、前記培養後の液滴について、細胞の増殖の有無を検出し、増殖が検出された液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞の検出を行う。
本発明の単離方法は、例えば、さらに、解析工程を含み、前記解析工程は、前記選択工程で前記選択した液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞中の染色体の異常を解析する工程である。
本発明の単離方法は、例えば、さらに、液滴分離工程を含み、
前記液滴分離工程は、前記培養後の液滴を、２つ以上に分離する工程であり、
前記検出工程は、前記同じの液滴から分離した２つ以上の分離液滴のうち少なくとも１つについて、前記胎児由来造血前駆細胞を検出し、
前記選択工程は、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された分離液滴と同じ液体から分離した他の分離液滴を、選択する。
本発明の単離方法は、例えば、前記増殖因子が、ｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ−３からなる群から選択された少なくとも一つの因子を含む。
本発明の単離方法は、例えば、前記エマルション工程において、前記エマルション形成溶媒が、非水溶性溶媒を含み、前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、前記複数の液滴は、前記血液試料と前記培地とを含む水溶性の液滴である。
本発明の単離方法は、例えば、流路を有するデバイスを使用し、前記流路内で、前記エマルション形成工程、および前記培養工程を行う。
本発明の単離方法は、例えば、前記流路内で、さらに、前記検出工程を行う。
本発明の単離方法および試験方法は、妊婦の血液試料を用いて液滴を形成し、造血前駆細胞の増殖因子の存在下で培養を行い、前記液滴における前記胎児由来造血前駆細胞を検出することで、前記胎児由来造血前駆細胞を単離することがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。
以下、本発明の単離方法および試験方法の実施形態について、例をあげて説明する。本発明の単離方法および試験方法は、下記の実施形態によって何ら限定および制限されない。また、各実施形態の記載は、それぞれ互いに援用できる。
（本発明の胎児由来造血前駆細胞の単離方法）
本発明の単離方法は、前述のように、エマルション形成工程と、培養工程と、検出工程と、選択工程とを含み、
前記エマルション形成工程は、妊婦の血液試料と、培地と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記血液試料に含まれる妊婦由来造血前駆細胞または胎児由来造血前駆細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
前記培養工程は、造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記複数の液滴を、それぞれ培養する工程であり、
前記検出工程は、前記培養後の液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する工程であり、
前記選択工程は、前記培養後の液滴のうち、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択する工程であることを特徴とする。
本発明の単離方法は、妊婦の血液試料を用いて液滴を形成し、造血前駆細胞の増殖因子の存在下で培養を行い、前記液滴における前記胎児由来造血前駆細胞を検出することで、前記胎児由来造血前駆細胞を単離することがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。
本発明における前記エマルション形成工程は、前述のように、妊婦の血液試料と、培地と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記血液試料に含まれる妊婦由来造血前駆細胞または胎児由来造血前駆細胞を含む複数の液滴を形成する工程である。前記エマルション形成溶媒中における前記液滴の形成によって、前記血液試料を、複数の液滴に分割して区画することができる。そして、前記液滴のそれぞれに、前記血液試料に由来する様々な細胞（例えば、妊婦由来造血前駆細胞、胎児由来造血前駆細胞、その他の各種細胞等）が、分配されることになる。
前記妊婦の血液試料は、前記妊婦から採取した試料であり、血液の種類は、例えば、末梢血である。前記血液試料は、例えば、未希釈の血液でもよいし、希釈した血液でもよいし、濃縮した血液でもよい。前記妊婦の種は、例えば、ヒト、非ヒト動物等があげられる。
前記エマルション形成溶媒は、特に制限されず、その中に、前記血液試料と前記培地とを含む液滴を形成できるものであればよい。前記エマルション形成溶媒は、例えば、非水溶性溶媒であり、前記非水溶性溶媒中に、前記血液試料と前記培地とを含む水溶性の液滴が形成できる。
前記非水溶性溶媒は、例えば、油、ミネラルオイル、クロロホルム、芳香族化合物等があげられる。前記非水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記培地の組成は、特に制限されず、後の培養工程において、造血前駆細胞を培養できる培地であればよい。前記培地は、例えば、アミノ酸、塩、グルコース、ビタミン等の成分を含み、いわゆるダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムＦ１２培地、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地、マッコイ５Ａ培地、イーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）、αＭＥＭ培地、ＭＥＭ培地、ＲＰＭＩ１６４０培地、イスコフ改変ダルベッコ培地等が使用できる。
前記培地は、例えば、さらに、前記造血前駆細胞の増殖因子を含んでもよい。前記培地に予め前記増殖因子を含有させ、前記液滴を形成することによって、後の培養工程において、前記増殖因子の存在下で培養を行うことができる。なお、前記増殖因子は、培養時に存在すればよく、添加のタイミングは、特に制限されず、前記培養時に添加されてもよい。前記増殖因子の種類は、特に制限されず、例えば、ｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ−３等があげられ、いずれか一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよく、好ましくは三種類の併用である。
前記液滴の形成においては、例えば、さらに、水溶性溶媒を共存させてもよい。前記水溶性溶媒は、例えば、水、緩衝液、水溶性高分子溶液等があげられる。前記水溶性溶媒は、例えば、一種類を単独で使用してもよいし、二種類以上を併用してもよい。
前記液滴の形成においては、例えば、後述する検出工程において使用する試薬を共存させてもよい。これにより、前記試薬を含有する液滴が形成されるため、例えば、後述する検出工程において、新たに試薬を添加することなく、検出工程における試薬反応を行うことができる。前記試薬に関しては、後述する。
前記形成する液滴の大きさは、特に制限されず、その平均体積は、下限が、例えば、４ｐＬ以上であり、上限が、例えば、１０ｎＬ以下である。
前記液滴に含まれる細胞の個数は、特に制限されない。前記液滴１個に含まれる細胞数は、例えば、５個以下、２個以下、好ましくは１個である。
前記エマルション形成溶媒中における液滴の形成方法は、特に制限されず、前記エマルション形成溶媒と、前記血液試料と、前記培地とを接触させることで、前記エマルション形成溶媒中に、複数の液滴を形成できる。前記接触は、例えば、前記エマルション形成溶媒に、前記血液試料と前記培地との混合液を接触させてもよいし、前記血液試料と前記培地との混合液に、前記エマルション形成溶媒を接触させてもよい。前記液滴の形成方法は、例えば、公知のドロップレット作製方法が適用できる。
前記液滴の形成には、例えば、マイクロ流路を有するエマルション化デバイスを使用できる。前記デバイスは、前記マイクロ流路として、例えば、サンプル用流路と、エマルション形成溶媒用流路と、これらの連結部と、前記連結部から導出される導出流路とを含む。このデバイスを用いた場合、例えば、以下のように液滴が形成される。まず、前記連結部には、前記エマルション形成溶媒用流路から、前記エマルション形成溶媒が導入され、つぎに、前記エマルション形成溶媒が導入された前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から、前記血液試料と前記培地との混合液（例えば、任意で前記試薬を含む）が導入される。そして、前記連結部において、前記エマルション形成溶媒と前記混合液とが接触し、エマルション化され、前記連結部から前記導出流路に、エマルション（前記エマルション形成溶媒中に液滴が分散された状態）として導出される。なお、前記血液試料と前記培地とは、例えば、前述のように、予め混合した混合液として、前記デバイスの流路に導入してもよいし、別々に流路に導入してもよい。後者の場合、前記連結部の上流において、前記サンプル用流路と試薬用流路とを有し、前記連結部に向かって、前記サンプル用流路から前記血液試料が導入され、前記試薬用流路から前記培地や任意で前記試薬等が導入されてもよい。
本発明における前記培養工程は、造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記複数の液滴を、それぞれ培養する工程である。前記造血前駆細胞の増殖因子の存在下で前記液滴を培養することによって、例えば、前記胎児由来造血前駆細胞または前記妊婦由来造血前駆細胞を特異的に増殖することができる。
前記培養工程において、前記増殖因子は、前述のように、予め前記液滴に含有させてもよいし、培養工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。
前記培養工程における培養条件は、特に制限されず、前記造血前駆細胞の培養に適した条件が好ましい。具体例として、培養温度は、例えば、３７℃であり、培養時間は、例えば、５〜１４日である。
前述のように、前記エマルション形成工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記培養工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記導出流路の下流に連結された培養流路を有し、前記培養流路内で前記液滴を培養することができる。
本発明における前記検出工程は、前記培養後の液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する工程である。検出方法は、特に制限されず、前記胎児由来造血前駆細胞か否かを判断できる方法であればよい。
先の前記培養工程では、前記造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記液滴を培養しているため、前記液滴には、増殖した胎児由来造血前駆細胞が含まれる場合もあれば、増殖した妊婦由来造血前駆細胞が含まれる場合もある。このため、前記検出工程では、前記妊婦由来造血前駆細胞が含まれる液滴と、前記胎児由来造血前駆細胞が含まれる液滴とを区別するために、前記検出方法は、前記妊婦由来造血前駆細胞に対して、有意に前記胎児由来造血前駆細胞を検出できる方法が好ましい。
前記検出方法としては、例えば、遺伝子検出があげられ、検出するターゲットとしては、例えば、前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子、短鎖縦列型反復配列（short tandem repeat；ＳＴＲ)、一塩基多型（Single Nucleotide Polymorphism；ＳＮＰ）等があげられる。前記検出ターゲットの具体例としては、例えば、Ｙ染色体上の遺伝子（胎児が男性の場合）、血液型に関わる遺伝子、性染色体および常染色体上のＳＴＲ（例えば、Ｄ１Ｓ１６５６、 ＴＰＯＸ、Ｄ２Ｓ４４１、Ｄ２Ｓ１３３８、Ｄ３Ｓ１３５８等）、ＳＮＰ（例えば、ｒｓ１０４９５４０７、ｒｓ１２９４３３１、ｒｓ１４１３２１２、ｒｓ１４９０４１３、ｒｓ５６０６８１、ｒｓ８９１７００等）、Amelogenin等があげられる。前記検出ターゲットは、この他にも、例えば、ForenSeq（TM） DNA Signature Prep キット（illumina社）のForenSeq（TM） DNA Signature Prep Refereece Guideに例示されているもの等があげられる。
前記遺伝子検出においては、例えば、ターゲットの有無を確認する手法があげられる。具体例としては、核酸増幅により前記ターゲットの増幅の有無を確認する方法、核酸増幅により得られた増幅産物とプローブとのハイブリダイズの有無を確認する方法等があげられる。前記核酸増幅の方法は、特に制限されず、ＰＣＲ法等の公知の手法が採用できる。前記核酸増幅の試薬は、特に制限されず、例えば、ポリメラーゼ、プライマー、ｄＮＴＰ、プローブ等があげられる。
前記検出工程で使用する試薬は、例えば、予め前記液滴に含有させてもよいし、前記検出工程時に前記液滴に添加してもよく、操作が容易であることから、前者が好ましい。
前述のように、前記エマルション形成工程および前記培養工程は、マイクロ流路を有するデバイスを用いて行えることから、前記検出工程も、同様に、前記デバイスのマイクロ流路内で行うことが好ましい。この場合、前記デバイスは、例えば、前記培養流路の下流に連結された検出流路を有し、前記検出流路内で前記検出を行うことができる。
前記検出工程において、前記培養後の液滴は、例えば、全てについて前記胎児由来造血前駆細胞の検出を行ってもよいし、前記培養後の液滴について、細胞の増殖の有無を検出した上で、増殖が検出された液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞の検出を行ってもよい。前記細胞の増殖について、検出方法は、特に制限されず、例えば、ドロップレット内の画像解析、電気抵抗測定等で行うことができる。
本発明における前記選択工程は、前記培養後の液滴のうち、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択する工程である。前記培養後の液滴から、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択して単離することにより、例えば、後述するように、前記液滴に含まれる前記胎児由来造血前駆細胞を用いて、染色体異常の解析を行うことができる。
前述のように、前記デバイスを用いて前記検出工程までを行った場合には、例えば、前記デバイスから、前記液滴を導出させ、別の容器（マイクロチューブ等）に回収することで単離できる。
また、本発明は、例えば、さらに、前記培養工程の後、前記検出工程の前に、液滴分離工程を含んでもよい。前記液滴分離工程は、前記培養後の液滴を、２つ以上に分離する工程である。このように、各液滴から、同じ液滴由来の２つ以上の分離液滴に分離することで、前記検出工程において、前記同じの液滴から分離した２つ以上の分離液滴のうち少なくとも１つについて、前記胎児由来造血前駆細胞を検出することができる。このため、前記選択工程では、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された分離液滴と同じ液体から分離した他の分離液滴を、選択することができる。このような方法とすることによって、例えば、前記検出工程において、例えば、前記液滴内で核酸増幅等の処理を行った場合でも、同じ液滴由来であり且つ前記核酸増幅等の処理が行われていない分割液滴を、後の染色体異常の解析を行うための分離液滴として確保することができる。このため、前記染色体異常の解析において、前記液滴に増幅産物が含まれることによる、解析精度の低下等も抑制できる。
本発明は、例えば、前記培養工程の後、前記検出工程の前、または前記検出工程と同時に、前記エマルション内の前記液滴に含まれる細胞について、核酸等の細胞内成分を放出する処理を行う。前記細胞内成分の放出は、特に制限されず、例えば、一般的な細胞溶解試薬を用いることができる。前記細胞溶解試薬は、例えば、前記培養工程の後、前記エマルション内の前記液滴に添加する。前記試薬としては、例えば、界面活性剤と、塩と、溶媒とを含む溶液があげられる。前記界面活性剤としては、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム等の陰イオン界面活性剤等があげられ、前記塩としては、例えば、塩化ナトリウム等があげられ、前記溶媒としては、各種緩衝液があげられる。前記試薬の組成の具体例としては、例えば、５０ｍｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ、０．５ｗ／ｖ％デオキシコール酸ナトリウム、０．１ｗ／ｖ％ラウリル硫酸ナトリウム、および１．０ｗ／ｖ％ ＮＩＰ−４０が例示できる。前記細胞溶解試薬を前記液滴に含有させることによって、例えば、前記液滴中で、前記細胞から、核酸等の細胞内成分を放出させることができる。前記液滴中で前記細胞から前記細胞内成分を放出させる際、その処理条件は、特に制限されない。
本発明は、さらに、解析工程を含んでもよい。前記解析工程は、例えば、前記選択工程で前記選択した液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞中の染色体の異常を解析する工程である。染色体異常の解析については、後述する。
（本発明の胎児の染色体異常の試験方法）
本発明の試験方法は、前述のように、胎児の染色体異常の可能性を試験する方法であり、
胎児由来造血前駆細胞の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、妊婦の血液試料から、前記本発明の単離方法により、胎児由来造血前駆細胞を単離する工程であり、
前記解析工程は、前記単離された胎児由来造血前駆細胞について、染色体解析を行う工程であることを特徴とする。
本発明の試験方法は、妊婦の血液試料を用いて液滴を形成し、造血前駆細胞の増殖因子の存在下で培養を行い、前記液滴における前記胎児由来造血前駆細胞を検出することで、前記胎児由来造血前駆細胞を単離することがポイントであり、その他の工程や条件は、特に制限されない。本発明の試験方法において、前記胎児由来造血前駆細胞の単離方法は、前記本発明の単離方法の記載を援用できる。
本発明における前記解析工程は、前記単離された胎児由来造血前駆細胞について、染色体解析を行う工程である。前記染色体解析の方法は、特に制限されない。具体例としては、例えば、前記胎児由来造血前駆細胞から染色体を単離し、目的の染色体異常について、公知の方法により解析を行うことができる。前記解析方法としては、例えば、ＦＩＳＨ、Ｇ−Ｂａｎｄ、ＮＧＳ等があげられる。
前記胎児由来造血前駆細胞を用いて解析できる胎児の染色体異常としては、例えば、ダウン症、エドワーズ症候群、パトウ症候群、ターナー症候群、ＤｉＧｅｏｒｇｅ症候群、Ｃｒｉ−ｄｕ−ｃｈａｔ症候群、プラダー・ウィリー症候群、Ａｎｇｅｌｍａｎ症候群等があげられる。
（本発明の胎児の染色体異常の診断方法）
本発明の試験方法は、前述のように、胎児の染色体異常を診断する方法であり、
胎児由来造血前駆細胞の単離工程と、解析工程とを含み、
前記単離工程は、妊婦の血液試料から、前記本発明の単離方法により、胎児由来造血前駆細胞を単離する工程であり、
前記解析工程は、前記単離された胎児由来造血前駆細胞について、染色体解析を行う工程であることを特徴とする。
本発明の診断方法は、前記本発明の単離方法および前記本発明の試験方法の記載を援用できる。
以上、実施形態および実施例を参照して、本発明を説明したが、本発明は、上記発明のスコープ内で当業者が理解し得る様々な変更をすることができる。また、本明細書で引用する特許文献および学術文献等の文献に記載の内容は、全て引用により本明細書に取り込むものとする。
本発明によれば、胎児由来造血前駆細胞を効率よく単離することができる。前記胎児由来造血前駆細胞に含まれる染色体は、染色体構造が保持されていることから、胎児の染色体異常の可能性の試験において、有用な試料として使用できる。

Claims (13)

  1. エマルション形成工程と、培養工程と、検出工程と、選択工程とを含み、
    前記エマルション形成工程は、
    妊婦の血液試料と、培地と、エマルション形成溶媒とを接触させて、前記エマルション形成溶媒中に、前記血液試料に含まれる妊婦由来造血前駆細胞または胎児由来造血前駆細胞を含む複数の液滴を形成する工程であり、
    前記培養工程は、
    造血前駆細胞の増殖因子の存在下、前記複数の液滴を、それぞれ培養する工程であり、
    前記検出工程は、
    前記培養後の液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する工程であり、
    前記選択工程は、
    前記培養後の液滴のうち、前記胎児由来造血前駆細胞が検出された液滴を選択する工程であることを特徴とする胎児由来造血前駆細胞の単離方法。
  2. 前記エマルション形成工程において、前記造血前駆細胞の増殖因子の存在下、液滴を形成する、請求項１記載の単離方法。
  3. 前記検出工程において、前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する、請求項１または２記載の単離方法。
  4. 前記エマルション形成工程において、前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅用試薬の存在下、液滴を形成し、
    前記検出工程において、前記液滴に含まれる前記増幅試薬を用いて、前記遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離方法。
  5. 前記検出工程において、前記液滴に前記胎児由来造血前駆細胞に特異的な遺伝子の増幅用試薬を添加し、前記遺伝子の増幅を行い、前記遺伝子の増幅の有無によって、前記胎児由来造血前駆細胞を検出する、請求項１から３のいずれか一項に記載の単離方法。
  6. 前記検出工程において、前記培養後の液滴について、細胞の増殖の有無を検出し、増殖が検出された液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞の検出を行う、請求項１から５のいずれか一項に記載の単離方法。
  7. さらに、解析工程を含み、
    前記解析工程は、
    前記選択工程で前記選択した液滴について、前記胎児由来造血前駆細胞中の染色体の異常を解析する工程である、請求項１から６のいずれか一項に記載の単離方法。
  8. さらに、液滴分離工程を含み、
    前記液滴分離工程は、
    前記培養後の液滴を、２つ以上に分離する工程であり、
    前記検出工程は、
    前記同じの液滴から分離した２つ以上の分離液滴のうち少なくとも１つについて、前記胎児由来造血前駆細胞を検出し、
    前記選択工程は、
    前記胎児由来造血前駆細胞が検出された分離液滴と同じ液体から分離した他の分離液滴を、選択する、請求項１から７のいずれか一項に記載の単離方法。
  9. 前記増殖因子が、ｈＳＣＦ、ｈＦｌｔ３ＬおよびＩＬ−３からなる群から選択された少なくとも一つの因子を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の単離方法。
  10. 前記エマルション工程において、
    前記エマルション形成溶媒は、非水溶性溶媒を含み、
    前記非水溶性溶媒中に、前記複数の液滴が形成され、
    前記複数の液滴は、前記血液試料と前記培地とを含む水溶性の液滴である、請求項１から９のいずれか一項に記載の単離方法。
  11. 流路を有するデバイスを使用し、
    前記流路内で、前記エマルション形成工程、および前記培養工程を行う、請求項１から１０のいずれか一項に記載の単離方法。
  12. 前記流路内で、さらに、前記検出工程を行う、請求項１１記載の単離方法。
  13. 胎児由来造血前駆細胞の単離工程と、解析工程とを含み、
    前記単離工程は、
    妊婦の血液試料から、請求項１から１３のいずれか一項に記載の単離方法により、胎児由来造血前駆細胞を単離する工程であり、
    前記解析工程は、
    前記単離された胎児由来造血前駆細胞について、染色体解析を行う工程であることを特徴とする胎児の染色体異常の可能性を試験する方法。


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