EP1781804A1 - Procede et dispositif de mesure d'une activite enzymatique dans un fluide biologique - Google Patents

Procede et dispositif de mesure d'une activite enzymatique dans un fluide biologique

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EP1781804A1
EP1781804A1 EP05796245A EP05796245A EP1781804A1 EP 1781804 A1 EP1781804 A1 EP 1781804A1 EP 05796245 A EP05796245 A EP 05796245A EP 05796245 A EP05796245 A EP 05796245A EP 1781804 A1 EP1781804 A1 EP 1781804A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
denotes
substrate
enzymatic activity
electroactive
electrode
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP05796245A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Maxime Nigreto
Guillaume Lamblin
Marielle Paris
Norbert Benattar
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biopep SA
Universite de Cergy-Pontoise
Original Assignee
Biopep SA
Universite de Cergy-Pontoise
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biopep SA, Universite de Cergy-Pontoise filed Critical Biopep SA
Publication of EP1781804A1 publication Critical patent/EP1781804A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/46—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of cellular or enzymatic activity or functionality, e.g. cell viability
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/86—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood coagulating time or factors, or their receptors

Definitions

  • the invention relates to the field of biological analyzes and more particularly relates to a method and a device for measuring an enzymatic activity in a biological fluid, especially in whole blood.
  • plasma preparation requires a number of pre-analytical steps and is also a source of potential errors.
  • This patent describes more particularly a method for assaying proteases and anti-proteases, and in particular proteases and anti-proteases of the coagulation and complement systems.
  • This process consists in reacting the enzyme to be assayed on an electrochemically neutral substrate but which, after hydrolysis by the enzyme, produces a hydrolysis product capable of being either oxidized or electrochemically reduced in the electro-electrochemical field. - Activity of the system, this product is then determined by amperometry at a pH between 6 and 10.
  • the dosage of the enzyme is carried out here by a particular electrical measurement, defined in the patent.
  • a particular example of the substrate used is benzoyl-D, L-arginyl-p-aminodiphenylamide chloride.
  • the enzymatic reaction then makes it possible to release the corresponding amine, namely lap-aminodiphenylamine, also called pAD ⁇ , by abbreviation.
  • this known method of assaying and measuring coagulation proteases and protease proteases is carried out only in a homogeneous medium, ie in solution.
  • Patent EP 1 031 830 in the name of ASULAB, is largely based on the electrochemical sensor principle of US Pat. No. 4,304,853 mentioned previously.
  • ASULAB proposes to measure the prothrombin time by measuring the electrical activity generated by an enzymatic reaction with a charged generator-generated electrolytic substrate that can be cut from its chain by thrombin.
  • the surface on which the substrate is fixed is a platinum or silver layer.
  • reaction is carried out in a homogeneous medium, that is to say in solution.
  • the publication WO 01/36666 of the company I-STAT relates to an apparatus for the measurement of coagulation using an electrochemical sensor.
  • the equipment uses a reagent to trigger a coagulation reaction. Sensors then directly measure the enzymatic activity responsible for coagulation.
  • reaction described in the patent is a reaction in a homogeneous medium, that is to say in solution.
  • the invention aims in particular to improve the situation by proposing a new method and a new device for measuring an enzymatic activity in a biological fluid, which avoids the disadvantages of the prior art. It is in particular an object of the invention to provide such a method and such a device which are suitable for the measurement of different enzymatic activities in biological fluids of various natures, and in particular in turbid and / or colored biological fluids, as is the case with whole blood.
  • the invention more particularly relates to a method for measuring an enzymatic activity in a biological fluid, which comprises the following operations:
  • the invention thus makes it possible to reveal an electroactive product serving as a marker and which can be released from the support or remain attached to the support, the quantity of which provides a direct measurement of the enzymatic activity by amperometry.
  • - substrate molecule recognized and transformed by the enzyme
  • marker the product of an enzymatic reaction which is an electroactive group detectable by an electrode
  • micro or submicrovolumetric typically less than 100 microliters
  • the substrate is deposited in the form of at least one monomolecular layer of molecules corresponding to one of the following general formulas I and II:
  • S denotes a chemical group capable of forming a bond with the conductive surface
  • C n denotes a methylenic aliphatic chain consisting of n carbon atoms
  • E denotes a non-electroactive hydrophilic spacer of the polyethylene glycol type, optionally present to complete the C n chain,
  • P denotes a polypeptide sequence specific for the enzymatic activity to be measured
  • X denotes an electroactive residue capable of being oxidized or reduced in a range of potential accessible in the medium.
  • n is an integer from 9 to 18.
  • the conductive surface of the support is modified by deposition of a monomolecular layer or monomolecular strata of molecules corresponding to one or other of the general formulas I and II mentioned above.
  • These molecules have the property of self-assembling spontaneously on the conductive surface. They are also called SAM, abbreviation of the English expression “SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS” which means “self-assembled monolayers”.
  • the hydrophilic spacer E is optional. Its insertion in the sequence of formula I or of formula II is useful for increasing the surface hydrophilicity of the substrate, on the solution side, thus reducing possible phenomena of short-range repulsion, irreversible adsorption or denaturation of the substrate. the enzyme as it approaches the surface.
  • S denotes a thiol group
  • C n denotes a hydrophobic carbon chain comprising n hydrocarbon chains, in particular methylene, and supporting a hydrophilic spacer
  • E denotes a peptide sequence, at least two amino acids of a substrate specific for the enzymatic activity to be measured
  • X is an aromatic amine, in particular para-aminodiphenylamide.
  • S thus denotes a thiol group, also called sulfhydryl, connected to a carbon chain comprising n methylene chains (n is typically of the order of ten) and supporting a hydrophilic spacer E.
  • n is typically of the order of ten
  • E hydrophilic spacer
  • P denotes a peptide sequence having at least two amino acids, typically between two and five amino acids. This peptide is chosen for its character of specificity with respect to the enzyme to be measured, for example thrombin, in the case of the measurement of an activity related to the coagulation of blood.
  • X is advantageously an aromatic amine, in particular para-aminodiphenylamide.
  • Enzymatic hydrolysis reveals the corresponding amine, p-amino diphenylamine.
  • This amine was chosen for its appreciable hydrophobicity. This property favors the sensitivity of the detection insofar as it increases the partition coefficient: concentration of the free amine in the substrate / concentration of the free amine in solution.
  • the amine is oxidized at low potentials, which makes it readily detectable in the presence of also oxidizable interferers, such as ascorbic acid.
  • the invention is of particular interest in the case where the biological fluid is a cloudy fluid and / or colored, as is the case of whole blood.
  • the enzymatic activity to be measured may be that of a coagulation factor or the complement of whole blood, in particular of a coagulation factor such as thrombin.
  • enzymatic activity can be used to assay an endogenous or exogenous blood coagulation inhibitor or co-factor, knowing that the factors and inhibitors may be physiological or exogenous.
  • Exogenous inhibitors include, in particular, heparin, a substance administered to patients to inhibit blood clotting.
  • a drop of the sample in particular whole blood
  • the substrate in particular an active sensor, the place of measurement, allows a rapid and direct detection of enzymatic activities sought.
  • the invention makes it possible to avoid all the conventional pre-analytical steps necessary for the preparation of the plasma, which saves time and eliminates sources of errors. potential.
  • the invention makes it possible to measure an enzymatic activity from a sample of small volume of the biological fluid.
  • the enzyme that is to be quantified reacts with the immobilized substrate.
  • This enzymatic reaction generates an electro-active product detected by the measuring electrode integrated in the sensor.
  • the amplitude of the measured signal is proportional to the amount of product formed during the reaction, which makes it possible to know the activity of the coagulation factor.
  • This measurement system can be used directly by the patient or through a hospital staff.
  • One of the advantages of the invention is to allow a very rapid measurement of enzymatic activities, for example coagulation factors or coagulation inhibitors.
  • the invention is therefore particularly applicable in emergency rooms as a rapid diagnostic tool, or in the patient, to measure the evolution of a specific enzymatic activity.
  • the conductive surface is advantageously a layer of a metal capable of immobilizing the covalent molecules (I) or (II), in particular gold.
  • a metal capable of immobilizing the covalent molecules (I) or (II), in particular gold.
  • it is a layer of gold deposited on a support based on silicon.
  • the detection operation is performed with electrodes which typically include a working electrode, a counter electrode and optionally a reference electrode.
  • the working electrode is advantageously constituted by the support itself.
  • the counter electrode and the reference electrode may be distinct; however, it is advantageous that the counter-electrode and the reference electrode are combined, the counter electrode then serving as a potential reference.
  • the detection operation advantageously comprises the measurement of the amplitude of a signal proportional to the quantity of electro-active product revealed during the enzymatic reaction.
  • the invention relates to a device for measuring an enzymatic activity in a biological fluid, which can be used for carrying out the method defined above.
  • This device essentially comprises:
  • the substrate is advantageously deposited in the form of at least one monomolecular layer of molecules corresponding to one or other of the general formulas I and II as mentioned above. Therefore, the characteristics defined previously for the method also apply to the device.
  • the amperometric detection means comprise a specific potentiostat to deliver between the working electrodes and the reference electrode a periodic and adjustable potential difference to the detection domain of the marker.
  • FIG. 1 is the structural formula of an example of a substrate according to the invention.
  • FIG. 2 represents the structural formula of the peptide sequence of the substrate of FIG. 1;
  • FIG. 3 is a perspective view of an electrode according to the invention.
  • FIG. 4 is a perspective view of a measuring cell used in the invention.
  • FIG. 5 represents the amperometric detection of p-aminodiphenylamine (pADA) in solution by a surface of gold modified by a monolayer of the substrate whose formula is represented in FIG. 1;
  • pADA p-aminodiphenylamine
  • FIG. 6 represents the gradual variation of a voltammetric current recorded during a kinetics of hydrolysis in the presence of 80 mU / ml of trypsin; and
  • FIG. 7 is a graph showing the evolution of the currents of FIG. 6 as a function of time.
  • Trypsin is a protease in the same way as the enzymes of hemostasis. Trypsin is a protease in the same way as the enzymes of hemostasis.
  • the system used comprises a conductive surface, preferably a noble metal such as gold, modified by deposition of a monomolecular layer or monomolecular strata of molecules corresponding to one or other of the general formulas I and II such than previously mentioned.
  • S is a thiol group (also called sulfhydryl)
  • C n is a carbon chain comprising eleven methylene linkages
  • E is a hydrophilic spacer of the hexa-ethylene glycol type
  • P is a tripeptide sequence of a substrate hydrolyzed by the trypsin (the formula is shown in Figure 2)
  • X is para-aminodiphenylamide.
  • the amine which will be released by erizymatic hydrolysis namely p-aminodiphenylamine, was chosen because of its appreciable hydrophobicity, as mentioned above.
  • This amine is oxidized at low potentials, which makes it readily detectable in the presence of interfering also oxidizable, such as ascorbic acid.
  • This surface is a rectangular bar 1 (see Figure 3) having a surface layer of gold 2 deposited on a titanium layer 3, itself deposited on a strip 4 based on silicon.
  • the gold layer has a thickness of 3000 Angstroms, the titanium layer 300 Angstrom and the silicon bar 500 microns.
  • the whole is annealed for twenty minutes at 250 ° C. under vacuum.
  • the process is carried out according to the usual techniques of elaboration of information media in microcomputer or microelectronics.
  • SAM self-assembled monolayer
  • the surface handled with non-paraffinized protective gloves, is carefully degreased with acetone, then with ethanol, then rinsed with ultra pure water, again with ethanol and finally dried under a stream of nitrogen. It is then used as a working electrode in a conventional three-electrode electrochemical assembly (working electrode, counter-electrode and reference electrode) and immersed in a solution of pure water containing 0.5% by volume of sulfuric acid.
  • the i / E curve (current / potential) then reveals a series of peaks attributed to the formation of gold oxides in the region 1.2-1.5 V followed, after inversion of the potential, of a peak
  • the integration of the reduction peak makes it possible to evaluate the effective surface of the electrode and therefore, in comparison with the geometrical surface, the roughness.
  • the electrode is removed from the solution to a final potential of 0.0 V leaving the gold free of oxides detrimental to SAM formation, as described in the literature.
  • the deposition of the assembled monolayer will now be described.
  • the strip After vigorous rinsing with ultra pure water, the strip is left stirring and at room temperature for at least twelve hours in 10 ml of ethanol containing a homogeneous mixture of electrogenic substrate and mercapto-hexanol coupled to a polyethylene chain.
  • C 3 glycol in a proportion of between 0.1 and 10% respectively calculated to obtain a total concentration of 0.1 mM.
  • the mercapto-hexanol acts as a diluent of the substrate of FIG. 1 on the surface.
  • electrochemical desorption this method consists of subjecting the modified surface to a reduction potential sweep from 0 to -1.4 V in 0.5 M KOH medium at 0.05 V / s. Under these conditions, each set of bonds (Au-S) present on the surface undergoes an electrochemical reduction which results in the desorption of the organic molecule. This reaction consumes electrons. There is therefore a peak of desorption whose potential is characteristic of each thiol. Integration of the peak gives the surface density of the thiol.
  • the immobilized electrogenic substrate has an oxidation signal located above 0.4 V corresponding to the oxidation of X coupled to the substrate. Integration of the response gives the surface density of the thiol.
  • a SAM deposited on gold supported by a quartz crystal is suitable for weighing by the QCM technique.
  • reversible redox markers permeation using reversible redox markers.
  • the kinetics of the gradual modification of gold by the SAM is followed by the evolution of the cyclo-voltametric signal of simple redox couples known to give a reversible or quasi-reversible signal, such as the Fe (CN) 6 3 ' ' pair. 4 - (hexacyanoferrate ffl / II) or Ru (CN) 6 3 + / 2 + (hexacyanoruthenate IMI).
  • the reversibility of the signals is characterized by a separation of the anodic and cathodic oxidation-reduction peaks of the order of 65-80 mV in Tris medium 0.15 M / KC10.5 M pH 7.4.
  • the residual current obtained in the presence of a SAM lowers the residual current of the bare surface due to the capacity of the self-assembled molecular layer.
  • the typical capacity of the bare double layer, of the order of 20 ⁇ F / cm 2 on bare gold drops to 2 to 6 ⁇ F / cm 2 after modification.
  • the capacity of the SAM of the support having the formula of Figure 1 is insensitive to the potential.
  • the electrochemical analysis is carried out by means of a device as shown in FIG. 4.
  • the electrochemical analysis of the trypsin activity is carried out in a cylindrical polytetrafluoroethylene tank containing 5 ml of 0.15 M Tris buffer. 0.5M KC1 at pH 7.4 using strip 1 as the working electrode, a platinum wire 11 as a counter electrode and an Ag / AgCl 12 electrode as a reference electrode inserted laterally into the vessel, leaving no contact the solution as the tip to minimize protein adsorptions on the glass. It is also possible to put at stake only two electrodes: the working electrode and a silver wire which then acts as a pseudo ⁇ reference, provided that the two electrodes are sufficiently separated so that the phenomena which take place on the counter electrode do not interfere with each other. not with those taking place on the working electrode.
  • the surface of the bar, placed horizontally under the tank, is accessible to the solution by a circular view 13 made through the bottom of the tank. Sealing is provided by mechanical pressure exerted by a mechanical clamping system 14 and by interposition of a solvent-resistant polymer O-ring 15 between the tank and the bar.
  • the response of the modified surface in the presence of trypsin is obtained by applying a triangular voltammetric signal train between 0.0 and 0.35 V at a rate of 0.1 V / s and periodically at a frequency which depends on the enzyme concentration (between 10 and 300s).
  • the maximum potential must not exceed 0.35 V in order to avoid the risk of oxidizing the unhydrolyzed substrate. This limit also aims to not affect the integrity of the SAM.
  • the above method and device can be applied to measure other enzymatic activities in a biological fluid, including enzymatic activities related to coagulation of whole blood.

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Abstract

L'invention concerne un procédé et un dispositif pour mesurer une activité enzymatique dans un fluide biologique. Le procédé comprend les opérations suivantes : a) fournir un support présentant une surface conductrice sur laquelle est immobilisé un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, le substrat comportant un résidu électroactif ; b) faire réagir un échantillon du fluide biologique avec le substrat de manière à provoquer une réaction enzymatique engendrant un produit électroactif ; c) détecter la quantité du produit électroactif par une mesure ampérométrique au moyen du support en contact avec le milieu contenant l'enzyme. Application notamment à la mesure d'activités enzymatiques liées à la coagulation du sang.

Description

Procédé et dispositif de mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique
L'invention se rapporte au domaine des analyses biologiques et elle concerne plus particulièrement un procédé et un dispositif pour la mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, notamment dans du sang total.
La détermination d'activités enzymatiques données, dans certains fluides biologiques, revêt une importance particulière pour le diagnostic et le traitement de certaines maladies.
C'est le cas en particulier de la détermination de différentes activités enzymatiques liées à la coagulation du sang total. En effet, la détermination de ces activités enzymatiques pose des problèmes particuliers lorsque le fluide biologique considéré est trouble et/ou coloré et peut donc donner lieu à des difficultés lors d'analyses par voie optique.
Dans le cas du sang total, qui est un fluide trouble et coloré, il est certes possible d'en extraire le plasma à des fins d'analyse ultérieure. Toutefois, la préparation du plasma nécessite un certain nombre d'étapes pré-analytiques et est en outre une source d'erreurs potentielles.
On connaît déjà d'après le brevet US 4 304 853 aux noms de Nigretto et Jozefowicz, un procédé de dosage des protéases et anti-protéases des systèmes de la coagulation.
Ce brevet décrit plus particulièrement un procédé de dosage des protéases et des anti- protéases, et notamment des protéases et anti-protéases des systèmes de la coagulation et du complément. Ce procédé consiste à faire réagir l'enzyme à doser sur un substrat électro- chimiquement neutre mais qui fournit après hydrolyse par l'enzyme un produit d'hydrolyse susceptible d'être soit oxydé, soit réduit électro-chimiquement dans le domaine d'électro- activité du système, ce produit étant ensuite déterminé par ampérométrie à un pH compris entre 6 et 10.
Le dosage de l'enzyme s'effectue ici par une mesure électrique particulière, définie dans le brevet.
Un exemple particulier du substrat utilisé est le chlorure de benzoyl-D,L-arginyl-p- aminodiphénylamide. La réaction enzymatique permet alors de libérer l'aminé correspondante, à savoir lap-aminodiphénylamine, encore appelée pADÀ, par abréviation. Toutefois, ce procédé connu de dosage et mesure des protéases et anti-protéases de la coagulation s'effectue seulement en milieu homogène, c'est-à-dire en solution.
Le brevet EP 1 031 830, au nom de la société ASULAB, reprend en grande partie le principe de capteur électrochimique du brevet US 4 304 853 mentionné précédemment.
ASULAB propose de mesurer le temps de prothrombine en mesurant l'activité électrique générée par une réaction enzymatique avec un substrat électrogène formé par un groupe chargé qui peut être coupé de sa chaîne par la thrombine. La surface sur laquelle le substrat se fixe est une couche de platine ou d'argent.
Comme dans le cas du brevet US 4304853, la réaction s'effectue en milieu homogène, c'est- à-dire en solution.
La publication WO 01/63271, au nom de ROCHE DIAGNOSTICS, reprend l'idée d'utiliser une mesure électrochimique pour la mesure de la coagulation. Ce brevet fait état d'une réaction en milieu homogène et utilise un réactif pour la mise en évidence de la thrombine, qui n'est pas fixé sur un support solide. Le dispositif décrit comprend des électrodes de mesure en palladium. Toutefois, cette publication ne mentionne pas explicitement la mesure de facteurs de coagulation.
Le brevet US 6 495 336 de la société PENTAPHARM décrit des produits permettant une mesure électrochimique de l'activité des protéines de la coagulation, et plus précisément l'activité de la thrombine. Le brevet revendique une réaction dans un milieu homogène en présence d'électrodes d'or ou de platine, le principe de mesure s'apparentant à la technologie décrite dans le brevet US 4 304 853 mentionné plus haut.
Le publication WO 01/36666 de la société I-STAT concerne un appareillage pour la mesure de coagulation en utilisant un capteur électrochimique. L'appareillage utilise un réactif pour déclencher une réaction de coagulation. Des capteurs mesurent alors directement l'activité enzymatique responsable de la coagulation.
Là aussi, la réaction décrite dans le brevet est une réaction en milieu homogène, c'est-à-dire en solution.
L'invention a notamment pour but d'améliorer la situation en proposant un nouveau procédé et un nouveau dispositif pour la mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, qui permet d'éviter les inconvénients de la technique antérieure. C'est en particulier un but de l'invention de procurer un tel procédé et un tel dispositif qui conviennent à la mesure de différentes activités enzymatiques dans des fluides biologiques de natures diverses, et en particulier dans des fluides biologiques troubles et/ou colorés, comme c'est le cas du sang total.
C'est aussi un but de l'invention de procurer un tel procédé et un tel dispositif qui conviennent à la mesure d'activités enzymatiques présentes dans le sang, et notamment d'activités enzymatiques liées à la coagulation du sang.
C'est encore un but de l'invention de procurer un tel procédé et un tel dispositif qui permettent de conduire une réaction dans différents types de milieux, non seulement en milieux homogènes, mais aussi en milieux hétérogènes.
L'invention concerne plus particulièrement un procédé de mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, qui comprend les opérations suivantes :
a) fournir un support présentant une surface conductrice sur laquelle est immobilisé un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, le substrat comportant un résidu électroactif ;
b) faire réagir un échantillon du fluide biologique avec le substrat de manière à provoquer une réaction enzymatique engendrant un produit électroactif révélé par hydrolyse enzymatique ;
c) détecter la quantité du produit électroactif par une mesure ampérométrique au moyen du support en contact avec le milieu contenant l'enzyme.
L'invention permet ainsi de révéler un produit électroactif servant de marqueur et qui peut être libéré du support ou rester attaché au support, dont la quantité fournit une mesure directe de l'activité enzymatique par ampérométrie.
Dans la présente demande, les termes mentionnés ci-dessous ont les significations indiquées :
- ampérométrique : mesure d'un courant généré par une excitation de potentiel, soit instantanée, soit dépendant du temps ;
- substrat : molécule reconnue et transformée par l'enzyme ; - marqueur : le produit d'une réaction enzymatique qui est un groupe électro-actif détectable par une électrode ;
- électro-actif : susceptible d'être oxydé ou réduit ;
- diffusant : se déplaçant sous l'influence d'un gradient de concentration ;
- volume réduit : micro ou submicrovolurnétrique (typiquement inférieur à 100 microlitres) ;
- électrode de travail : conducteur, siège de la réaction électrochimique ou capacitive donnant lieu à la mesure.
Dans une forme de réalisation préférée de l'invention, le substrat est déposé sous la forme d'au moins une couche monomoléculaire de molécules répondant à l'une des formules générales I et II suivantes :
S-Cn-(E)-P-X (I)
S-Cn-(E)-X-P (H) dans lesquelles :
S désigne un groupement chimique propre à former une liaison avec la surface conductrice, Cn désigne une chaîne aliphatique méthylénique constituée de n atomes de carbone,
E désigne un espaceur hydrophile non électroactif du type polyéthylène glycol, présent facultativement pour compléter la chaîne Cn,
P désigne une séquence polypeptidique spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, et
X désigne un résidu électroactif propre à être oxydé ou réduit dans un domaine de potentiel accessible dans le milieu.
Dans les formules I et II, n est nombre entier compris entre 9 et 18.
Ainsi, la surface conductrice du support est modifiée par dépôt d'une couche monomoléculaire ou de strates monomoléculaires de molécules répondant à l'une ou l'autre des formules générales I et II mentionnées précédemment. Ces molécules ont pour propriété de s'auto-assembler spontanément sur la surface conductrice. Elles sont aussi appelées SAM, abréviation de l'expression anglo-saxonne "SELF-ASSEMBLED MONOLAYERS" qui signifie "monocouches auto-assemblées".
L'espaceur hydrophile E est facultatif. Son insertion dans la séquence de la formule I ou de la formule II est utile pour augmenter l'hydrophilie superficielle du substrat, côté de la solution, diminuant ainsi d'éventuels phénomènes de répulsion à courte distance, d'adsorption irréversible ou de dénaturation de l'enzyme lors de son approche vers la surface. Dans une forme de réalisation préférentielle, dans les formules I et II, S désigne un groupement thiol, Cn désigne une chaîne carbonée hydrophobe comprenant n enchaînements hydrocarbonés, en particulier méthylène, et supportant un espaceur hydrophile E, P désigne une séquence peptidique, à au moins deux acides aminés d'un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer et X est une aminé aromatique, en particulier le para- aminodiphénylamide.
S désigne ainsi un groupement thiol, encore appelé sulfhydryle, relié à une chaîne carbonée comprenant n enchaînements méthylène (n est typiquement de l'ordre de dix) et supportant un espaceur hydrophile E. Celui-ci est de préférence du type éthylène glycol.
P désigne une séquence peptidique ayant au moins deux acides aminés, typiquement entre deux et cinq acides aminés. Ce peptide est choisi pour son caractère de spécificité vis-à-vis de l'enzyme à mesurer, par exemple de la thrombine, dans le cas de la mesure d'une activité liée à la coagulation du sang.
X est avantageusement une aminé aromatique, en particulier le para-aminodiphénylamide. L'hydrolyse enzymatique permet de révéler l'aminé correspondante, à savoir la p-amino diphénylamine. Cette aminé a été choisie pour son hydrophobie appréciable. Cette propriété favorise la sensibilité de la détection dans la mesure où elle augmente le coefficient de partage : concentration de l'aminé libre dans le substrat/concentration de l'aminé libre en solution. En outre, l'aminé est oxydée aux faibles potentiels, ce qui la rend aisément détectable en présence d'interférants également oxydables, tels que l'acide ascorbique.
Comme déjà indiqué, l'invention trouve un intérêt tout particulier dans Ie cas où le fluide biologique est un fluide trouble et/ou coloré, comme c'est le cas du sang total.
A ce titre, l'activité enzymatique à mesurer peut être celle d'un facteur de coagulation ou du complément du sang total, en particulier d'un facteur de coagulation tel que la thrombine. En liaison avec la coagulation, l'activité enzymatique peut servir à doser un inhibiteur ou un cofacteur de la coagulation du sang, endogène ou exogène, sachant que les facteurs et les inhibiteurs peuvent être physiologiques ou exogènes. Comme inhibiteur exogène, on peut citer en particulier l'héparine, substance administrée aux patients pour inhiber la coagulation du sang.
Pour la réaction de l'opération b), on peut déposer directement une goutte de l'échantillon, en particulier de sang total, sur le support sur lequel est immobilisé le substrat. Dans ces conditions, le dépôt d'une faible quantité du fluide, par exemple d'une simple goutte de sang, sur le support et le substrat, constituant un capteur actif, lieu de la mesure, permet une détection rapide et directe des activités enzymatiques recherchées.
S'agissant de mesures liées à la coagulation du sang total, l'invention permet d'éviter toutes les étapes pré-analytiques conventionnelles nécessaires à la préparation du plasma, ce qui permet de gagner du temps et d'éliminer des sources d'erreurs potentielles.
Ainsi, dans cette application particulière, l'invention permet de mesurer une activité enzymatique à partir d'un échantillon de faible volume du fluide biologique.
Lorsque l'échantillon de fluide, par exemple la goutte de sang, entre en contact avec le substrat, l'enzyme que l'on veut quantifier vient réagir avec le substrat immobilisé. Cette réaction enzymatique engendre un produit électro-actif détecté par l'électrode de mesure intégrée dans le capteur. L'amplitude du signal mesure est proportionnelle à la quantité de produit formée lors de la réaction, ce qui permet de connaître l'activité du facteur de coagulation.
Ce système de mesure peut être utilisé directement par le patient ou par l'intermédiaire d'un personnel hospitalier.
L'un des avantages de l'invention est de permettre une mesure très rapide d'activités enzymatiques, par exemple de facteurs de la coagulation ou d'inhibiteurs de la coagulation. L'invention trouve donc une application particulière dans les salles d'urgence comme outil de diagnostic rapide, ou chez le patient, afin de mesure l'évolution d'une activité enzymatique déterminée.
La surface conductrice est avantageusement une couche d'un métal susceptible d'immobiliser les molécules covalentes (I) ou (II), en particulier l'or. De préférence, il s'agit d'une couche d'or déposée sur un support à base de silicium.
L'opération de détection s'effectue avec des électrodes qui comprennent typiquement une électrode de travail, une contre-électrode et éventuellement une électrode de référence. L'électrode de travail est avantageusement constituée par le support lui-même. La contre- électrode et l'électrode de référence peuvent être distinctes ; toutefois, il est avantageux que la contre-électrode et l'électrode de référence soient confondues, la contre-électrode servant alors de référence de potentiel.
L'opération de détection comprend avantageusement la mesure de l'amplitude d'un signal proportionnel à la quantité de produit électro-actif révélé lors de la réaction enzymatique. Sous un autre aspect, l'invention concerne un dispositif de mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, pouvant être utilisé pour la mise en oeuvre du procédé défini précédemment.
Ce dispositif comprend essentiellement :
- un support présentant une surface conductrice ;
- un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer et comportant un résidu électroactif, le substrat étant immobilisé sur la surface conductrice ; - des moyens de détection par mesure électrochimique, en particulier ampérométrique.
Dans ce dispositif, le substrat est avantageusement déposé sous la forme d'au moins une couche monomoléculaire de molécules répondant à l'une ou l'autre des formules générales I et II telles que mentionnées plus haut. Par conséquent, les caractéristiques définies précédemment pour le procédé s'appliquent aussi au dispositif.
Dans une forme de réalisation de l'invention, les moyens de détection ampérométrique comprennent un potentiostat propre à délivrer entre les électrodes de travail et l'électrode de référence une différence de potentiel périodique et ajustable au domaine de détection du marqueur.
Dans la description qui suit, faite à titre d'exemple, on se réfère aux dessins annexés, sur lesquels :
- la figure 1 est la formule développée d'un exemple d'un substrat selon l'invention ;
- la figure 2 représente la formule développée de la séquence peptidique du substrat de la figure 1 ;
- la figure 3 est une vue en perspective d'une électrode selon l'invention ;
- la figure 4 est une vue en perspective d'une cellule de mesure utilisée dans l'invention ;
- la figure 5 représente la détection ampérométrique de la p-aminodiphénylamine (pADA) en solution par une surface d'or modifiée par une monocouche du substrat dont la formule est représentée à la figure 1 ;
- la figure 6 représente la variation progressive d'un courant voltamétrique enregistré pendant une cinétique d'hydrolyse en présence de 80 mU/ml de trypsine ; et - la figure 7 est un graphique montrant l'évolution des courants de la figure 6 en fonction du temps.
L'invention sera décrite à l'aide de l'exemple suivant.
Exemple
L'exemple décrit se réfère au dosage de la trypsine, à des fins de validation du procédé et du dispositif de l'invention. La trypsine est une protéase au même titre que les enzymes de l'hémostase. La trypsine est une protéase au même titre que les en2ymes de l'hémostase.
Le système utilisé comprend une surface conductrice, de préférence en un métal noble tel que l'or, modifiée par dépôt d'une couche monomoléculaire ou de strates monomoléculaires de molécules répondant à l'une ou l'autre des formules générales I et II telles que mentionnées précédemment.
Dans ces formules, S est un groupement thiol (encore appelé sulfhydryle), Cn est une chaîne carbonée comprenant onze enchaînements méthylène, E est un espaceur hydrophile du type hexa-éthylène glycol, P est une séquence tripeptidique d'un substrat hydrolyse par la trypsine (dont la formule est représentée sur la figure 2) et X est le para aminodiphénylamide.
L'aminé qui sera libérée par hydrolyse erizymatique, à savoir la p-aminodiphénylamine, a été choisie en raison de son hydrophobie appréciable, comme mentionné plus haut. Cette aminé est oxydée à de faibles potentiels, ce qui la rend aisément détectable en présence d'interférent également oxydables, comme l'acide ascorbique.
On décrira maintenant la préparation de la surface. Cette surface est une barrette rectangulaire 1 (voir la figure 3) présentant en surface une couche d'or 2 déposée sur une couche de titane 3, elle-même déposée sur une barrette 4 à base de silicium.
Typiquement, la couche d'or a une épaisseur de 3000 Angstrôm, la couche de titane de 300 Angstrôm et la barrette de silicium de 500 micromètres. L'ensemble est recuit vingt minutes à 250° C sous vide. Le processus est réalisé selon les techniques habituelles d'élaboration des supports d'information en micro-informatique ou en micro-électronique. Il est cependant nécessaire de prétraiter l'or pour optimiser la formation d'une monocouche auto-assemblée (SAM) présentant les propriétés requises. La surface, manipulée avec des gants protecteurs non paraffinés, est soigneusement dégraissée à l'acétone, puis à l'éthanol, puis rincée à l'eau ultra pure, à nouveau à l'éthanol et enfin séchée sous courant d'azote. Elle est ensuite utilisée comme électrode de travail dans un montage électrochimique classique à trois électrodes (électrode de travail , contre-électrode et électrode de référence) et immergée dans une solution d'eau pure contenant 0,5 % en volume d'acide sulfurique.
On décrira maintenant les opérations de prétraitement. Les méthodes antérieures de préparation des surfaces destinées à la formation de monocouche auto-assemblées (SAM) font appel soit à l'électrochimie, soit à des méthodes physiques sous vide. Un état de surface reproductible et contrôlé a pu être obtenu selon la procédure électrochimique. Elle consiste à imposer à la barrette un nombre de cyclo-voltamogrammes entre 0,0 et 1,5 V/référence Ag/AgCl à la vitesse de balayage de 0,1 V/s suffisante pour obtenir une stabilisation de la réponse. Ceci nécessite environ trente cycles. La courbe i/E (courant/potentiel) met alors en évidence une série de pics attribuée à la formation d'oxydes d'or dans la zone 1,2-1,5 V suivie, après inversion du potentiel, d'un pic étroit de la réduction de ces oxydes vers 0,8 V. L'intégration du pic de réduction permet d'évaluer la surface effective de l'électrode et donc, par comparaison avec la surface géométrique, la rugosité. L'électrode est retirée de la solution à un potentiel final de 0,0 V laissant l'or exempt d'oxydes préjudiciables à la formation de SAM, comme décrit dans la littérature.
Les expériences sont conduites avec un potentiostat EG & G Princeton Applied Research modèle 273 A, équipé d'un logiciel ECHEM ou Power Suit EG & G.
On décrira maintenant le dépôt de la monocouche assemblée (SAM). Après rinçage vigoureux avec de l'eau ultra pure, la barrette est abandonnée sous agitation et à température ambiante pendant au moins douze heures dans 10 ml d'éthanol contenant un mélange homogène de substrat électrogène et de mercapto-hexanol couplé à une chaîne de polyéthylène glycol en C3 dans une proportion comprise entre 0,1 et 10 % respectivement calculée pour obtenir une concentration totale de 0, 1 mM. Le mercapto-hexanol joue le rôle de diluant du substrat de la figure 1 sur la surface. Des résultats préliminaires négatifs conduits avec une SAM exempte de thiol de dilution laissent à penser que la dilution superficielle du substrat électrogène dégage une meilleure accessibilité de l'enzyme au substrat et rendent les conditions physico-chimiques locales plus favorables à l'accomplissement de l'hydrolyse enzymatique. D'autres études conduites au laboratoire et les indications recueillies dans la littérature pour des molécules de structure comparable indiquent qu'une durée de modification de douze heures est suffisante pour obtenir une saturation de la surface par la SAM. La densité de la SAM immobilisée a été évaluée par la technique de la micro-balance à quartz (QCM). Elle atteint environ 4 H 1010 mol/cm2, en accord avec les données publiées sur des analogues.
Après dépôt, la caractérisation de la SAM peut être effectuée avec différentes techniques : - désorption électrochimique : cette méthode consiste à soumettre la surface modifiée à un balayage de potentiel réducteur de 0 à -1,4 V en milieu KOH 0,5 M à 0,05 V/s. Dans ces conditions, chaque ensemble de liaisons (Au-S) présent à la surface subit une réduction électrochimique qui aboutit à la désorption de la molécule organique. Cette réaction consomme des électrons. Il apparaît donc un pic de désorption dont le potentiel est caractéristique de chaque thiol. L'intégration du pic donne la densité superficielle du thiol.
- oxydation électrochimique : le substrat électrogène immobilisé présente un signal d'oxydation situé au-delà de 0,4 V correspondant à l'oxydation de X couplé au substrat. L'intégration de la réponse donne la densité superficielle du thiol.
- pondérale : une SAM déposée sur l'or supporté par un cristal de quartz se prête à une pesée par la technique de QCM.
- perméation au moyen de marqueurs redox réversibles. La cinétique de la modification progressive de l'or par la SAM est suivie par l'évolution du signal cyclo-voltamétrique de couples redox simples connus pour donner un signal réversible ou quasi-réversible, tels le couple Fe(CN)6 3''4- (hexacyanoferrate ffl/II) ou Ru(CN)6 3+/2+ (hexacyanoruthénate IMI). Sur or non modifié, la réversibilité des signaux est caractérisée par une séparation des pics anodique et cathodique d'oxydo-réduction de l'ordre de 65-80 mV en milieu Tris 0,15 M/KC10,5 M pH 7,4. Au fur et à mesure de la formation de la SAM, l'intensité des courants anodique et cathodique faiblit jusqu'à donner une variation exponentielle. Le recours à différentes théories (théories Amatore-Teyssier-Savéant ou de Finklea) permet d'évaluer la densité des défauts responsables de la persistance du signal voltamétrique d'oxydoréduction des marqueurs.
- capacitance : le courant résiduel obtenu en la présence d'une SAM abaisse le courant résiduel de la surface nue du fait de la capacité de la couche moléculaire auto-assemblée. La capacité typique de la double couche nue, de l'ordre de 20μF/cm2 sur un or nu descend à 2 à 6μF/cm2 après modification. Dans la zone 0,0-0,35 V, la capacité de la SAM du support ayant la formule de la figure 1 est peu sensible au potentiel.
L'analyse électrochimique est réalisée au moyen d'un dispositif tel que représenté à la figure 4. L'analyse électrochimique de l'activité de la trypsine est conduite dans une cuve cylindrique 10 en polytétrafluoréthylène contenant 5ml de tampon Tris 0,15 M/KC1 0,5 M à pH 7,4 en utilisant la barrette 1 comme électrode de travail, un fil de platine 11 comme contre-électrode et une électrode Ag/AgCl 12 comme électrode de référence insérée latéralement dans la cuve, en ne laissant au contact de la solution que l'embout pour minimiser les adsorptions de protéines sur le verre. Il est aussi possible de ne mettre enjeu que deux électrodes : l'électrode de travail et un fil d'argent qui joue alors le rôle de pseudo¬ référence, à condition de veiller à suffisamment séparer les deux électrodes pour que les phénomènes qui se déroulent sur la contre-électrode n'interfèrent pas avec ceux qui se déroulent sur l'électrode de travail.
La surface de la barrette, placée horizontalement sous la cuve, est accessible à la solution par un regard circulaire 13 pratiqué à travers le fond de la cuve. L'étanchéité est assurée par pression mécanique exercée par un système de serrage mécanique 14 et par interposition d'un joint torique 15 de polymère résistant aux solvants, entre la cuve et la barrette.
On décrira maintenant le signal électrochimique.
La réponse de la surface modifiée en présence de trypsine est obtenue par application d'un train de signaux voltamétriques triangulaires entre 0,0 et 0,35 V à la vitesse de 0,1 V/s et périodiquement à une fréquence qui dépend de la concentration d'enzyme (entre 10 et 300s) . Le potentiel maximum ne doit pas dépasser 0,35 V pour ne pas risquer d'oxyder le substrat non hydrolyse. Cette limite vise aussi à ne pas affecter l'intégrité de la SAM. Le bruit de fond du système est d'abord enregistré dans la solution exemple de trypsine. Ceci donne des voltamogrammes superposés dont les courants seront retranchés de ceux obtenus en présence d'enzyme. Puis, dès l'introduction de l'enzyme, on trace le premier voltamogramme de la cinétique, donnant le courant à t = 0.
L'enzyme nécessaire pour obtenir une concentration finale de 80 mU BAEE/ml (BAEË = basyl arigine ethyl ester) est introduite au temps t0 de la cinétique. Après une brève agitation de la solution pour homogénéiser la concentration de l'enzyme, on observe le développement progressif d'un signal voltamétrique qui se détache du courant résiduel en produisant une croissance du courant dans la zone du potentiel attendue pour l'oxydation de la pADA libre, vers 0,17 V comme le montre la figure 5. Cette figure montre les variations du courant I en fonction du potentiel E en mV pour différentes concentrations de la pADA libre.
Le courant produit résulte de l'oxydation de l'aminé accumulée à proximité de la surface (dans la solution et probablement, du fait de l'hydrophobie non négligeable de la pADA, dans la SAM), pendant le temps qui sépare deux balayages successifs de potentiels, comme montré à la figure 6.
Après quelques cycles de potentiels, le signal se stabilise, indiquant que la cinétique est arrivée à son terme. La pente de la courbe i = f(temps) est proportionnelle à l'activité de l'enzyme. L'intensité maximale obtenue est proportionnelle à la quantité de substrat accessible à l'enzyme sur la surface, comme le montre la figure 7. Le procédé et le dispositif ci-dessus peuvent être appliqués pour mesurer d'autres activités enzymatiques dans un fluide biologique, notamment des activités enzymatiques liées à la coagulation du sang total.

Claims

Revendications
1. Procédé de mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend les opérations suivantes :
a) fournir un support présentant une surface conductrice sur laquelle est immobilisé un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, le substrat comportant un résidu électroactif ;
b) faire réagir un échantillon du fluide biologique avec le substrat de manière à provoquer une réaction enzymatique engendrant un produit électroactif ;
c) détecter la quantité du produit électroactif par une mesure ampérométrique au moyen du support en contact avec le milieu contenant l'enzyme.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que le substrat est déposé sous la forme d'au moins une couche monomoléculaire de molécules répondant à l'une des formules générales I et II suivantes :
S-Cn-(E)-P-X (I) S-Cn-(E)-X-P (II) dans lesquelles :
S désigne un groupement chimique propre à réagir avec la surface conductrice, Cn désigne une chaîne aliphatique méthylénique constituée de n atomes de carbone, E désigne un espaceur hydrophile non électroactif du type polyéthylène glycol, présent facultativement pour compléter la chaîne Cn,
P désigne une séquence polypeptidique spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, et X désigne un résidu électroactif propre à être oxydé ou réduit dans un domaine de potentiel accessible dans le milieu, après l'hydrolyse enzymatique.
3. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que, dans les formules I et II, S désigne un groupement thiol, Cn désigne une chaîne carbonée hydrophobe comprenant n enchaînements hydrocarbonés, en particulier méthylène, et supportant un espaceur hydrophile E, P désigne une séquence peptidique, à au moins deux acides aminés d'un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer et X est un amide aromatique, en particulier le para-aminodiphénylamide.
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le fluide biologique est un fluide pouvant être trouble et/ou coloré.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le fluide biologique est du sang total.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'activité enzymatique est celle d'un facteur de coagulation ou du complément du sang total, en particulier d'un facteur de coagulation tel que la thrombine.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que l'activité enzymatique sert à doser un inhibiteur ou un cofacteur de la coagulation du sang, endogène ou exogène.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que, dans l'opération b), on dépose directement une goutte de l'échantillon, en particulier de sang total, sur le support sur lequel est immobilisé le substrat.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que la surface conductrice est une couche d'un métal susceptible d'immobiliser les couches covalentes (I) ou (II), en particulier l'or.
10. Procédé selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que l'opération de détection comprend l'utilisation d'électrodes de mesure ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre-électrode et éventuellement une électrode de référence.
11. Procédé selon la revendication 10, caractérisé en ce que l'électrode de travail est constituée du support.
12. Procédé selon l'une des revendications 10 et 11, caractérisé en ce que la contre-électrode et l'électrode de référence sont confondues.
13. Procédé selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce que l'opération de détection comprend la mesure de l'amplitude d'un signal proportionnel à la quantité de produit électroactif révélé lors de la réaction enzymatique.
14. Dispositif de mesure d'une activité enzymatique dans un fluide biologique, pour la mise en œuvre du procédé selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce qu'il comprend :
- un support présentant une surface conductrice ;
- un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer et comportant un résidu électroactif, le substrat étant immobilisé sur la surface conductrice ; - des moyens de détection par mesure électrochimique, en particulier ampérométrique.
15. Dispositif selon la revendication 14, caractérisé en ce que le substrat est déposé sous la forme d'au moins une couche monomoléculaire de molécules répondant à l'une des formules générales I et II suivantes :
S-Cn-(E)-P-X (I)
S-Cn-(E)-X-P (II) dans lesquelles :
S désigne un groupement chimique propre à réagir avec la surface conductrice, Cn désigne une chaîne aliphatique méthylénique constituée de n atomes de carbone,
E désigne un espaceur hydrophile non électroactif du type polyéthylène glycol, présent facultativement pour compléter la chaîne Cn,
P désigne une séquence polypeptidique spécifique de l'activité enzymatique à mesurer, et X désigne un résidu électroactif propre à être oxydé ou réduit dans un domaine de potentiel accessible dans le milieu, après l'hydrolyse enzymatique.
16. Dispositif selon la revendication 15, caractérisé en ce que, dans les formules I et II, S désigne un groupement thiol, Cn désigne une chaîne carbonée hydrophobe comprenant n enchaînements hydrocarbonés, en particulier méthylène, et supportant un espaceur hydrophile E, P désigne une séquence peptidique, à au moins deux acides aminés, d'un substrat spécifique de l'activité enzymatique à mesurer et X est un amide aromatique, en particulier le para-aminodiphénylamide.
17. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que la surface conductrice est une couche d'un métal noble, en particulier d'or, déposée sur le support.
18. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 17, caractérisé en ce que les moyens de détection comprennent des électrodes de mesure ampérométrique comprenant une électrode de travail, une contre-électrode et éventuellement une électrode de référence.
19. Dispositif selon la revendication 18, caractérisé en ce que l'électrode de travail est constituée par le support.
20. Dispositif selon l'une des revendications 18 et 19, caractérisé en ce que la contre- électrode et l'électrode de référence sont confondues.
21. Dispositif selon l'une des revendications 18 à 20, caractérisé en ce que les moyens de détection ampérométrique comprennent un potentiostat propre à délivrer entre les électrodes de travail et l'électrode de référence une différence de potentiel périodique et ajustable au domaine de détection du marqueur.
22. Dispositif selon l'une des revendications 14 à 21, caractérisé en ce qu'il comprend une série de substrats spécifiques respectivement d'enzymes différentes, permettant ainsi une analyse simultanée et l'établissement d'un profil diagnostique.
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