EP1779092A1 - Composant optique pour l'observation d'un echantillon nanometrique, systeme comprenant un tel composant, procede d'analyse mettant en oeuvre ce composant, et leurs applications - Google Patents

Composant optique pour l'observation d'un echantillon nanometrique, systeme comprenant un tel composant, procede d'analyse mettant en oeuvre ce composant, et leurs applications

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Publication number
EP1779092A1
EP1779092A1 EP05788741A EP05788741A EP1779092A1 EP 1779092 A1 EP1779092 A1 EP 1779092A1 EP 05788741 A EP05788741 A EP 05788741A EP 05788741 A EP05788741 A EP 05788741A EP 1779092 A1 EP1779092 A1 EP 1779092A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
sample
sample analysis
optical component
optical
analysis method
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05788741A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Dominique Ausserre
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Electronique De Combree - Selco Ste
Original Assignee
Electronique De Combree - Selco Ste
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Filing date
Publication date
Application filed by Electronique De Combree - Selco Ste filed Critical Electronique De Combree - Selco Ste
Publication of EP1779092A1 publication Critical patent/EP1779092A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/17—Systems in which incident light is modified in accordance with the properties of the material investigated
    • G01N21/21—Polarisation-affecting properties

Definitions

  • the present invention relates to the field of observation and analysis of nanometric characteristics using an optical component and a polarized light observation system. It is known in the state of the art technology to prepare a sample support blade having index layers meeting specific criteria, as proposed in FR2818376 and FR2841339 patents. Also known in the state of the art US5631171 patent describes a device for the observation of nanometer thickness differences, by the analysis of the refraction of thin layers.
  • the present invention aims to remedy these drawbacks by proposing a solution for developing a broad spectrum of applications for the study of samples of which certain characteristics are not known, by an observation of their optical and physical characteristics.
  • the invention relates, in its most general sense, to an optical component for the observation of a sample, comprising a substrate and at least one layer of complex index and of predetermined thickness, intended to show a high contrast of intensity. or color for optical path variations, reliefs, nanometric thicknesses and diameters when observed by reflection in incoherent light converging around the normal incidence under polarization quenching conditions characterized in that the upper index layer has specific surface properties giving it a selective affinity with respect to at least one characteristic of the sample.
  • Said optical properties are the natural properties of the upper index layer or are obtained by physical, chemical, physicochemical, biochemical, biological modifications of the index layer.
  • sample means an object whose characteristics are not known and are revealed by the direct observation of very small (nanometric) optical path variations whose lateral extension may also be very small (nanometric ), the nano adjective meaning that these lengths are measured reasonably in nanometers.
  • optical component means an association of the substrate and at least one layer of complex index and of predetermined thickness having affinity variations.
  • affinity means a capacity of the surface of the component to combine with an external agent having determined and known physical, chemical or biological characteristics.
  • affinity variation means that the surface has affine zones corresponding to non-constant physical, chemical or biological characteristics.
  • affinity zone means a surface element having a particular affinity, different from the affinity of the neighboring zones.
  • the component according to the invention makes it possible to deduce from the optical observation characteristics corresponding to the affinity with a part or the whole of the surface of the optical component receiving the sample.
  • said sample is observed in differential interference contrast
  • said surface properties have affinity characteristics varying as a function of the coordinates on the surface of the component
  • the optical characteristics of the component vary as a function of the coordinates of the zone considered on the surface of the component, the variations in the optical characteristics of the component and the variations in the surface properties are correlated, the said variations form a gradient in a direction at least optical component,
  • said variations constitute a regular tiling of the surface
  • said variations constitute a matrix network, -
  • the component carries visible marks to identify and find a particular area.
  • the surface of the optical component has affinity properties corresponding to non-constant physical, chemical or biological characteristics.
  • affinity properties may consist of surface energy, surface charge, surface polarizability, selective porosity, physical affinities, physico-chemical affinities, capture and / or recognition sites, liquid film, presence of a solute, magnetic agents, surfactants, textures, chemical reactive groups, selective molecular traps, hydrophilic / hydrophobic patterns, millimetric, micrometric, nanometric patterns.
  • the surface properties may consist of surface energy, surface charge, surface polarizability, selective porosity, physical affinities, physico-chemical affinities, capture and / or recognition sites, liquid film, presence of a solute, magnetic agents, surfactants, textures, chemical reactive groups, selective molecular traps, hydrophilic / hydrophobic patterns, millimetric, micrometric, nanometric patterns.
  • - are the natural properties of the upper index layer, are obtained in one or more steps by chemical reaction of compounds with the surface of the index layer by a covalent chemical grafting or by electrostatic grafting of all molecular or macromolecular objects such as, polyelectrolytes, electrolytes, proteins, dendrimers, - are obtained by a physical modification of the index layer such as the application of a particle beam or an electromagnetic beam, a mechanical, acoustic, thermal action. , electric or magnetic, erosion, selective deposition, plasma treatment, metallization, pressure variation, application of a liquid jet, deposition of ink, fumes, powders, layers in liquid form , a solid contact,
  • - are obtained by a physico-chemical modification in gaseous, liquid or solid phase of the index layer such as swelling, deflation, dissolution, polymerization, adsorption, wetting, capillarity, condensation, electrostatic effect, evaporation, crystallization, deposition, electroplating, electrochemistry, electropolymerization, demixing, self-assembly, dip-coating, spin-coating, micro-contact printing, transfer of Langmuir-Blodgett, in one or more stages by a combination of these modifications,
  • - consist of a variation of the chemical nature of the surface, the composition of the surface, the roughness of the surface, the surface altitude, the reflection coefficient, a potential on the surface such that electrical, magnetic, electrostatic, zeta potential, electric charge density, variable electrostatic charge valence, hydrostatic pressure, osmotic pressure, linear or non-linear susceptibility (polarizability, light absorption coefficient, susceptibility magnetic, permeability, dielectric coefficient, Raman susceptibility, rotatory power, thermal conduction, electrical conduction, optical index, etc.), current density (electrical, thermal, ionic, hydrodynamic, etc.) or consist of anisotropy of any of these properties,
  • - are obtained by application to the sample of an external field during all or part of the observation such as the thermal, light, electrical, magnetic field, electromagnetic, hydrodynamic, aerodynamic, exposure to a particular beam or environment, are obtained by the addition of a biologically active layer or by a biological or biochemical modification of the index layer or on the index layer by a fixation by adsorption, grafting or deposition of membrane structures in the form of monolayers of bilayers or multilayers, pure or charged with membrane objects, by bursting of vesicles or liposomes or extracts of cell membranes, by fixation of biological macromolecules, by direct protein binding (for example Bovine Serum Albumin) or by grafting amphipol-membrane protein complexes, by binding of ligands (for example by avidin-biotin combinations), by binding of antibodies or by antigens, by cell attachment, by lysis or by cell adhesion, by attachment of cellular components resulting from a cells by chromatin binding, chromosome fixation in all
  • biologically active polymers such as polysaccharides, polylysine, polypyrole, polydimethylsiloxane, polyethylene glycol, - are obtained by any combination of different physical, chemical, physicochemical, biochemical, biological,
  • micellar structures micellar structures, micromanipulation components, microfluidic components, organic complexes, inorganic complexes, organic-inorganic complexes, amoebae, fluorescent markers, steric markers, aggregates, clusters and clusters, condensates, condensation drops, colloids, colloidal particles, complexes etallics, pollutants, powders, fumes, gases, asbestos fibers, nanotubes, nanowires
  • the association of said component with an observed sample constitutes an alternative or a coupling element to the tracing of the samples using radia-labeling, spectroscopy, Raman spectroscopy, infra-red, ultra-violet or visible spectroscopy, fluorescence, enzymatic labeling, mass spectrometry, piezoelectric detector, amperometric detector , surface acoustic wave detector, surface plasmon resonance, profilometry, near field microscopy, atomic force microscopy, ellipsometry.
  • radia-labeling spectroscopy, Raman spectroscopy, infra-red, ultra-violet or visible spectroscopy, fluorescence, enzymatic labeling, mass spectrometry, piezoelectric detector, amperometric detector , surface acoustic wave detector, surface plasmon resonance, profilometry, near field microscopy, atomic force microscopy, ellipsometry.
  • the optical component is fixed on the bottom of a Petri dish
  • the invention also relates to a sample analysis method implementing an optical component according to at least one of the preceding claims, characterized in that it comprises at least one step of bringing the sample into contact with each other. studying with the selective affinity surface of said component, and at least one step of direct and real-time observation of the component thus prepared with equipment comprising an incoherent light source converging around the normal incidence, and an assembly allowing the observation of the sample in polarized light under extinction conditions, and possibly a step of recording the image thus observed.
  • the method comprises an assembly formed by a crossed polarizer and analyzer located on either side of the optical component along the useful path of the light,
  • the equipment comprises a polarization separator device such as a Wollaston biprism or a Nomarski device and in that the sample is observed in differential interference contrast, the device comprises a polychromatic light source, monochromatic, visible, partially visible or not visible,
  • the method comprises: a step of identifying a particular zone of the image by virtue of the marks visible on the component, a step of analyzing the color and / or the intensity of the image as a function of time and / or positions along the surface and a comparison of these values with predetermined values,
  • the equipment used must then include a spectrometer
  • the method comprises a comparison step under the same conditions of observation of the color and / or intensity of the image as a function of time and / or positions along the surface and those of a sample reference whose characteristics are known,
  • all or part of the bringing into contact is carried out by evaporation of the sample, all or part of the bringing into contact is carried out by immersion in liquid phase by washing,
  • the bringing into contact comprises at least one rinsing, incubation or drying step
  • the method also comprises one or more steps for preparing the sample and / or an incubation step and / or an immersion step and / or a rinsing step and / or a drying step and then a step of dry observation,
  • the observations are made in immersion and the analysis consists in extracting the variations of intensity or signal at each point over time; the contacting and the observation are simultaneous,
  • the contacting is a hybridization or adsorption or chemical reaction of a solute with the component, the mechanism being able to be governed by a Brownian diffusion or by a convection, that is to say a determined movement of the solute towards or along the surface caused by a hydrodynamic flow or an external electric, magnetic, thermal, luminous, etc.
  • the method comprises a step of detection and / or recognition and / or analysis by using steric markers instead of fluorescent markers, said markers being themselves attached to an object capable of providing a recognition function.
  • steric markers instead of fluorescent markers, said markers being themselves attached to an object capable of providing a recognition function.
  • the diameter of these steric markers is less than 100 nanometers and preferably less than 50 nanometers, preferably less than 10 nanometers and preferably less than 5 nanometers.
  • the method according to the invention makes it possible to work with steric markers smaller than in the other techniques.
  • the nature of these steric markers is arbitrary. These steric markers may themselves have a recognition site and may be used to analyze an unknown sample on the surface directly or indirectly.
  • the combination of the component with an observed sample constitutes an alternative or a coupling element to the tracing of the samples by means of radiolabelling techniques, spectroscopy, Raman spectroscopy, infra-red spectroscopy, ultraviolet or visible, fluorescence, enzymatic labeling, mass spectrometry, piezoelectric detector, amperometric detector, surface acoustic wave detector, surface plasmon resonance, profilometry, near-field microscopy, atomic force microscopy, ellipsometry,
  • the combination of the component with an observed sample constitutes an alternative to the tracing of the samples using steric markers of larger dimensions or of imposed nature.
  • the interaction of a target bearing a steric marker and the sample observed is an alternative to tracing the samples using steric markers of larger dimensions.
  • the method comprises: a step of recognition and / or the selective and / or preferential attachment of objects of interest or predefined objects such as proteins, peptides, acids amino, antibodies, antigens, drugs, polysaccharides, lipids, liposomes, vesicles, toxins, metabolic products, synthetic molecules, aromatic molecules, fibers, filaments, DNA molecules, RNA, chromosomes, cells, cell extracts, bacteria, viruses, plots of a biochip, true and false hybrids of these plots, environment of these plots, true and false hybrids of this environment, micellar structures, micromanipulation components, microfluidic components, organic complexes, inorganic complexes, organic-inorganic complexes, amoebae, fluorescent markers, steric markers, aggregates, clusters and clusters, conden
  • salt clusters whose formation depends on the incubation, washing, rinsing and / or drying or clusters of impurities or biological agents such as proteins or other macromolecules, or physical agents such as aggregates, or chemical agents such as reagents or reaction products or impurities or physico-chemical agents such as precipitates or components of a mixture preferably absorbed, or targets consisting of complementary steric objects such as metals or plastic, latex beads, gold or silica attached to a ligand such as a single or double-stranded DNA molecule or an antibody or antigen or protein or copolymer
  • the step of forming physicochemical clusters may be a step of forming liquid drops spontaneously in contact with their vapor.
  • the step of forming physicochemical clusters is for example a step of forming drops of water on the hydrophilic sites of a sample or a part of a sample such as a carbon nanotube, a DNA molecule , a biological organism, a chromosome or a protein.
  • the optical component carrying the sample is placed along the optical path between a first optical system comprising a polarizer and a second optical system comprising an analyzer oriented in a position of extinction of the beam reflected by the component,
  • the optical component carrying the sample is placed along the optical path between a first optical system comprising a polarizer and a quarter-wave plate and a second optical system comprising the same quarter-wave plate and an analyzer,
  • the optical component carrying the sample is placed along the optical path between a first optical system comprising a polarizer and a separator element; polarizations such as a Wollaston biprism and a second optical system comprising the same polarization separator element and an analyzer,
  • the optical component carrying the sample is placed between a first optical system comprising a polarizer, a biprism and a compensator, and a second optical system comprising a compensator, a biprism and an analyzer,
  • At least one of the optical systems further comprises a quarter-wave plate, the analyzer of the second optical system and the polarizer of the first constitute only one and the same component,
  • the separation between the two optical systems along the optical path, obtained by a semi-reflective device is located after the polarizer of the first system along the optical path or before the polarizer of the first system along the optical path, analyzer and the polarizer then forming only one element
  • the sample observation equipment includes a lens, the optical component carrying the sample is observed by reflection on the upper surface (right microscope), the optical component carrying the sample is observed by reflection on the underside (inverted microscope).
  • the invention finally relates to a sample analysis system comprising an observation device and an optical component carrying a sample to be analyzed, characterized in that said optical component consists of a substrate and at least one complex index layer and of predetermined thickness, intended to exhibit a high contrast of intensity or color for nanometric thicknesses when observed by reflection in incoherent light converging around the incidence normal under polarization quenching conditions, the upper index layer having specific surface properties conferring selective affinity on at least one characteristic of the sample.
  • this analysis system comprises a differential interference contrast device.
  • the observation device comprises: a polychromatic or monochromatic light source, a means for analyzing the color and / or the intensity of the image as a function of time and / or positions along the surface and a comparison of these values with predetermined values,
  • a means of analyzing the curve of the intensity as a function of the wavelength of each point or part of the image for all the wavelengths present in the spectrum of the illumination means of intensity analysis of a monochromatic image or of a monochromatic filtering or projection of a colored image
  • a first optical system comprising said polarizer and a second optical system comprising said analyzer, at least one of said optical systems further comprising a compensator, a first optical system comprising said polarizer and a second optical system comprising said analyzer, one at least one of said optical systems further comprising a lambda / 4 blade.
  • the invention also relates to the following applications of the abovementioned process:
  • microelectronic components masks, microelectromechanical systems (MEMS), microelectronic and MEMS construction media, recording media (CD and DVD), flat screens,
  • RNA DNA microarray
  • chromosomes proteins, antigens, antibodies, cells, bacteria, viruses, etc.
  • Example 1 General scheme of the reflection analysis system.
  • the analysis system shown in FIG. 1 mainly comprises: a first optical system (10) comprising a polarizer (1) - a second optical system (20) comprising an analyzer (2)
  • a partially reflective component (80) preferentially a lens (60) for imaging
  • an output optic (50) for the observation preferentially an output optic (50) for the observation.
  • the two optical systems (10, 20) are arranged on either side of the optical component (30) in the path of the light. They may have a common part (15).
  • the light source is in the example described a polychromatic source. This characteristic is not, however, limiting.
  • the lighting source may be for example a halogen lamp, a xenon lamp, a mercury lamp, a sodium vapor lamp, a diode block, an incandescent lamp, a source of natural light, a discharge lamp, or any other source that is totally or partially incoherent.
  • the system (40) may include condensation and / or focusing optics, an optical fiber, a diaphragm, or a plurality of elements as in Kohler illumination.
  • the image of the source is preferably focused on the rear focal plane of the lens (60). Lighting is preferentially powerful.
  • the light beam (4) is polarized in a first direction by the polarizer (1). In the example of the chosen assembly, the direction of this polarization is preferably perpendicular to the plane of the figure.
  • the semitransparent mirror (80) sends the polarized light to the sample.
  • Each point of the source illuminates the sample of a parallel light beam with a different direction.
  • the source is wide so that the beam of light is convergent. After reflection on the sample, the beam of light goes back on itself and goes back through the lens.
  • Part of this beam then passes through the semi-transparent mirror (80) to pass through the optical system (20), reduced in this example to an analyzer (2) oriented parallel to the plane of the figure.
  • a real image of the sample is finally obtained either directly if the objective works at a finite distance or thanks to a focus optics if the objective works infinitely.
  • This image is finally taken up by an eyepiece (not shown) for direct observation or captured by a camera or a camera (not shown) to be recorded.
  • Figure 2A describes an optical component implemented by the invention.
  • the optical component (30) has a substrate (31) and has three main layers:
  • a second index layer (33) having index and thickness characteristics which are adapted according to the application and the associated affinity characteristics
  • one or more selective affinity layers (34).
  • the two layers (33, 34) have features that for most applications are not constant over the entire surface of the optical component.
  • Variations in the index characteristics of the layer (33) and the affinity characteristics of the layer (34) are correlated to form on the component a plurality of partial areas having a pair of determined index and affinity characteristics.
  • These partial areas form, for example, a matrix composed of elements having a circular shape, each element corresponding to a characteristic of index and a characteristic of associated specific affinity and different from those of the adjacent elements.
  • Figure 2B shows the different prototypes of optical components according to the invention.
  • Example 3 Images of a strand of DNA obtained with the optical component according to the invention.
  • Part c shows the image of the same molecule reconstructing from a scan by an atomic force microscope (AFM) used as a reference technique.
  • the thickness of the molecule given by the apparatus is 1.7 nm, which is in good correspondence with the theoretical diameter of the molecule which is 2 nm.
  • Part b shows a new image of the same molecule obtained using the same microscope after the AFM study.
  • the nanometric defects induced by the AFM scan draw a clearly visible square. Without prior optical identification, it is impossible to locate a specific object of a size as small as that of this molecule on a sample of a reasonable size (larger than a square millimeter).
  • Example 4 Schematic of a membrane protein sensor for producing a protein membrane biochip.
  • FIG. 4 represents an exemplary application for the production of a membrane protein biochip intended for observations in the air for the purpose of analysis of a mixture.
  • the component (30) has a silicon substrate (31) and a layer of index 1.34 as well as selective affinity layers (34) consisting of 5 nm thick pads with irregular contours.
  • the index layer is in silica airgel and has a thickness of 102.5 nm and a real index of 1.34.
  • the observation is performed with an average numerical aperture goal of 30 degrees.
  • the affinity layer (34) covering the surface is placed on an index layer (33) which can be formed of a strongly hydrophobic self-assembly monolayer (FIG. 4B), a hydrophilic film (FIG. a polymer cushion (FIG. 4D) or hybrid molecules grafted onto the surface (FIG. 4E).
  • the pads are several tens of microns in diameter. These are disks formed of a bilayer membrane 5 nm thick which carries different receptors (35) for each pad, then capable of selectively trapping a ligand (36) present in a medium to be analyzed.
  • the biological material consists of a lipid bilayer having membrane receptors (35) for capturing a ligand (36).
  • the pads In contact with the middle, the pads each capture the complementary species of the receiver they carry. Each pad captures a small or very small number of objects, which may be protein or peptide partners such as antibodies or hormones. The reading is carried out after rinsing with interference contrast. Each object captured (nanometric) is reflected by the presence of a bright spot on a low light background. Objects can be counted easily.
  • the analysis method according to the invention is particularly advantageous with respect to fluorescence or ellipsometry techniques practiced because the signal that it exploits at a point in the image is generated by a very small surface around the captured object, typically the square of the lateral resolution of the observation system that corresponds to the smallest observable surface, is significantly less than one square micron, unlike fluorescence or ellipsometry techniques that exploit a signal generated by a much larger light spot, greater than 100 square microns. Since the useful signal comes from the object in all cases and the noise or parasitic signal is best obtained in all cases from the smallest observable region, the signal-to-noise ratio is clearly improved during the implementation of the method of analysis according to the invention.
  • the present invention thus makes it possible to recognize individual captured objects while the other mentioned techniques require the presence of a large number of identical objects in order to be able to detect them. This is a huge advantage because the objects sought in certain environments are very rare. Our technique is therefore preferable in all situations where captured objects are of nanometric dimensions or are attached to objects of nanometric dimensions.
  • Figure 4F shows a supported bilayer observed in the air.
  • Example 5 Image of a supported bilayer observed in immersion.
  • Image 5 which represents a supported bilayer observed in water, was obtained in immersion and in interference contrast with support No. 15 (FIG. 2B).
  • the component (30) has a silicon substrate (31) and an index layer 1.74 as well as selective affinity layers (34) consisting of 5 nm thick pads with irregular contours.
  • FIG. 6 represents images obtained with the analysis system according to the invention for DNA microarrays.
  • the surface of the component has a matrix of affinity zones of different natures. Each zone corresponds to a different affinity layer, comprising a specific biological material. Such a component is brought into contact with a biological sample to be analyzed.
  • FIG. 6A summarizes the experiments carried out on the optical components according to the invention.
  • the deposited DNAs are PCR products of 1000 base pairs in length.
  • the preparation and the revelation of the biochips was carried out following a confidential procedure developed by the Inserm unit U533 directed by Jean Léger.
  • the fluorescence signals after scanning are quantified.
  • the signals for Cy3 and Cy5 are summed.
  • Sarfus allows to visualize hybridizations with probes higher than 600pb but not hybridizations with smaller probes.
  • the image 61 shows that the differentiation between the pad and its environment is very large, that the defects of the pad and the environment appear clearly visible.
  • the image 6J shows that the appearance of the hybrid pad differs clearly from that of the non-hybrid pad, the trapped DNA resulting in an extra thickness and introducing an additional roughness .
  • This technique of reading chips without marking has the big advantage over the fluorescence techniques that the signal exploited is of refractive origin and therefore stable in time under lighting, unlike the fluorescence signal that changes with the illumination time.
  • the technique also has the advantage of being compatible with very high density chips, the minimum area of a pad being of the order or less than one square micron.
  • Example 7 Use of the Optical Component According to the Invention for the Detection and Screening of Two-Dimensional and Three-Dimensional Crystals
  • Figure 7A shows the two-dimensional crystals of proteins.
  • the size of the observed area is 100 microns in length.
  • This figure illustrates the possibilities of using the optical component according to the invention to detect protein crystals in a very early (two-dimensional) state, which makes it possible to accelerate their detection, an important advantage for the screening, and to extend research to proteins that form two-dimensional crystals but not three-dimensional crystals.
  • protein screening consists in identifying among many candidates those which crystallize, which makes it possible to study the structure by X-ray diffraction, and emphasize that X-ray scattering techniques apply to two-dimensional objects ( GISAX technique for example).
  • Figure 7B shows the thin three-dimensional crystals of identical proteins obtained later.
  • the size of the image is 200 microns in length.
  • the surface of the component has been modified to be hydrophilic which allows the bovine serum albumin (BSA) present in the solution to settle and crystallize upon evaporation of the solvent.
  • BSA bovine serum albumin
  • Figure IC shows the 2D crystals of polymers
  • Polyethylene Glycol 4000 Polyethylene Glycol 4000.
  • the respective sizes of the observed areas are 100 microns and 200 microns in length.
  • the dendrites are about 4 nanometers thick.
  • FIG. 7D represents the three-dimensional visualization of the crystallization at room temperature of this same polymer.
  • the size of the images is 100 microns in length.
  • the formation of these dendrites on the surface is fast (of the order of one micron per minute).
  • This sequence of images illustrates the possibility of observing crystallization kinetics at room temperature inaccessible by other techniques.
  • Example 8 Control, control and crystallization monitoring of a protein gel.
  • the large size of the six images in Figure 8 is 200 microns. The first five are obtained dry between polarizer and analyzer crossed with component No. 7 (according to FIG. 2B).
  • the component used for the sixth (bottom right) is a single silicon carrier coated with a film of a solution in water of approximately 100 nm thick, which can be controlled with a control device the disjunction pressure such as that proposed by Moldover and Cahn (Physical Review Letters, 1986).
  • the observation is performed in differential interference contrast.
  • the samples are obtained from a solution of Beta-lactoglobulin (a milk protein) in water, used as such (sixth image) or deposited on a the
  • This solution forms a gel whose growth is governed by the pH of the solution, controlled during the experiment.
  • This example illustrates the possibility of monitoring, controlling and controlling the processes of gelation and more generally of aggregation and crystallization of proteins or other products, which is particularly advantageous in the agro-food field, particularly for the development of processes and manufacturing control (texture of ice cream, cheese, creams, yoghurt, etc.).
  • the same interest exists in the field of cosmetics where the control of textures is also important.
  • the observation method is here an alternative to confocal microscopy.
  • the images show the structures formed at different instants by beta-lactoglobulin in a solution (FIG. 6 of FIG. 8) or after evaporation of a solution (other images of FIG. 8).
  • Example 9 Application of the optical component according to the invention for the study and control of nanotubes.
  • FIG. 9A represents an image obtained with an example of an analysis system for the study and control of nanotubes. This image was obtained after CVD synthesis and shows an isolated multiwall nanotube with at its end the catalytic nanoparticle.
  • Nanotubes can be synthesized in different ways. Depending on the method chosen and the conditions different results are obtained ranging from well-aligned multiwall nanotubes or linking to each other to single or interlocked single-walled nanotubes. Catalysis residues are added to these mixtures.
  • the analysis method according to the invention makes it possible to discriminate all these different types of nanotubes. Among these processes is CVD (chemical vapor deposition) which allows growth synthesis on a surface from a nanoparticle catalyst or a nanometric defect.
  • CVD chemical vapor deposition
  • Another manufacturing process is the electric arc. This process is characterized by a great dispersity of the fabrigated nanotubes. Our technique makes it possible to watch and at the same time to sort with a AFM determined nanotubes.
  • the upper surface must be free for micromanipulation.
  • This component has the following characteristics: it consists of a 1 milimeter thick float glass substrate covered on one side with a chromium layer 5.3 nanometers thick and an oxide layer Chromium (CrO 2 ) 6 nanometers thick.
  • the substrate is used in reflection on the covered side and attacks with the light by the other face. The useful surface is thus observed through the glass. It is advantageous to carry out this observation by immersion in the oil in order to eliminate the stray light coming from the reflections on the glass face.
  • the surface can be used with its natural properties (high energy for a direct deposit with a strong anchoring of the tubes on the surface, for control, counting or tracking purposes for spectroscopic studies for example) or coated with a thin film of an amorphous polymer such as polydimethylsiloxane or else covered with a grafted layer by a surface-chemical vapor phase operation (for combed deposition from a solution for micromanipulation operations).
  • FIG. 9B shows the detection of carbon nanotubes of rare form in the middle of interesting objects.
  • This image whose large size is 200 microns, was obtained in immersion and in interference contrast with the support No. 16 (of FIG. 2B). It was then modified by silanization using octadecyl trichlorosilane in toluene after UV + 02 activation of the surface.
  • the nanotubes visualized in FIG. 9B were previously stabilized in an aqueous solution with surfactants of SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • the interaction between the surfactants and the silane layer is favorable to the dispersed deposition of well separated nanotubes.
  • Example 10 Monitoring the growth of a bacterial population.
  • FIG. 10 represents an image, the large size of which is 159 microns and which was obtained in immersion and in interference contrast with support No. 16 (of FIG. 2B), used with its natural surface properties. It has indeed an important affinity for bacteria. This component, associated with an observation in interferential contrast, makes it possible to follow the evolution of a bacterial population which develops on the surface.
  • the bacteria are Escherichia coli.
  • the method allows the detection of bacterial growth.
  • Components having a specific affinity for a bacterium allow a fine environmental control, especially in the food field.
  • FIG. HA shows a differential contrast device according to the invention.
  • An imaging device of a reflection interferential contrast sample (E) comprises a light source (S); a goal (O); an imaging device of the light source in the vicinity of the pupil of the lens (L); at least one polarizing element (P, A); a polarization separator element (W); a semi-transparent mirror (M). You can also add color filters (FC) anywhere between (S) and (OC) or (C).
  • the mirror (M) can itself be dichroic.
  • the element W introduces a lateral shift between two linear polarizations in a direction located at 45 ° from the X and Y axes. This is for example a Wollaston biprism.
  • the camera or ocular device is placed after (M).
  • the possible tube lens is between (M) and (C) or (OE).
  • Fig. 11B shows different differential contrast device configurations.
  • Example 12 Observation and measurement system between crossed polarizers.
  • a system for observing a sample (E) between crossed polarizers without interference contrast is less restrictive than the system described in the preceding example.
  • the L system is no longer essential.
  • the W system is absent.
  • Figure 12 shows a measurement system without imaging between crossed polarizers.
  • This system is a single-sensor (functional surface is homogeneous, there is no imaging). It comprises: a weakly convergent source (S + L); a sensor (CAP).
  • Figure 13A shows a rectangular area of the surface of the component of a length of 200 microns.
  • the component is obtained by modifying the surface of component No. 7 (of FIG. 2B) with a cesium hydroxide.
  • a drop of distilled water spattered for several weeks is deposited on the surface thus modified. Cells (unidentified) are visualized and the
  • the sample thus formed is subjected to a succession of alternating thermal shocks at -15 ° C. and + 30 ° C. The cell bursts and the chromatin is extracted therefrom.
  • the image 13A shows in its left part the cellular residue.
  • the sample is kept in a humid atmosphere. Part of the chromatin progressively progresses on the surface (towards the right) while another part remains compact and seems to form condensed chromosomes (to the left of the residue).
  • the stretched portion corresponds to an unfolded chromosome whose thickness is of the order of 30 nanometers.
  • the two strands of the chromosome are clearly visible and are linked by a bridge (white spot common to the strands to the right of the image) which clearly evokes a centromere.
  • FIG. 13C represents the two images which are 100 microns long and are obtained under the same conditions as above. They illustrate the possibility of probing interactions between partially decompacted DNA molecules (diameters 10 and 30 nm depending on brightness) with various biological objects (here not identified).
  • the two images of Figure 13D represent two decompacted DNA molecules obtained by proceeding in the same manner with a highly diluted human salivary solution.
  • the interactions between this DNA from a single cell and various biological objects are clearly visible.
  • the method makes it possible to perform genetic diagnostics for diagnostic or analytical purposes, for example sequencing. It has the enormous advantage of saving PCR amplification, and of allowing the saving of fluorescent markers, of being able to be implemented very easily and of providing much better information: not only can we know which association is occurring but also where it occurs along the strand. For these reasons, the technique is an advantageous alternative to FISH techniques (developed for example at the Institut Pasteur by Aaron Bensimon).
  • Example 14 A diagnostic method on a cell for identifying the receptors and membrane proteins present in its membrane. This example is illustrated by FIGS. 14A, 14B and 14C.
  • the long length of the 14A image is 200 microns. The observation is made in interferential contrast.
  • the component is component # 7 (of Figure 2B). Its surface has been made hyper-hydrophilic by exposure to UV illumination from a discharge lamp with a strong component at the wavelength of 240 nanometers.
  • a very dilute solution of human saliva was diluted in a glass of water (at 1 volume per 10,000 or so) and a drop of this solution was deposited on the surface of the component.
  • the eukaryotic cells contained in the solution strongly adhered to this surface and the cell membrane, a bilayer whose external parts are hydrophilic, crushed on the surface (clear disk) around the nucleus (dark cluster).
  • the method described in this example therefore allows all operations involving ligands of these accessible objects. These ligands can directly detect or themselves be provided with steric or fluorescent markers. The method allows identification and location of the addressed receptors.
  • FIG. 14B show analogous cells obtained under the same conditions at a later stage. early (left image) and at a later stage (right image) of the process.
  • the sample corresponding to the image on the right was subject to successive thermal shocks at -20 ° C. and + 20 ° C. in a humid atmosphere, leading to unfolding of the chromatin on the surface.
  • the image 14C obtained with the same settings, the same procedure and the same components as the previous illustrates the interest of these observations for the study of cellular mechanisms: here a cell at the anaphase stage of a mitosis.
  • the two nuclei large objects to the left and right of the disc
  • the chromosome clusters spread at the ends of the equatorial plane
  • the method allows the study of cellular mechanisms and the detection of functional or structural abnormalities.
  • Example 15 Observation of a solution of DNA in immersion.
  • This example is dedicated to the observation of an immersion DNA solution for analysis and diagnostic purposes.
  • the image 15A corresponding to an observed window of total length 159 microns, is obtained in interference contrast and in immersion.
  • the solution is a rat brain DNA solution and the component is # 15 ( Figure 2B).
  • association in solution and the revelation by an adsorbent surface is an example of a diagnostic method that the component makes it possible to implement.
  • Image 15B of the same system is obtained after several hours of incubation shows associations of surfactants contained in the initial solution with certain regions of the adsorbed molecules.
  • the Brownian diffusion mechanisms govern the kinetics of these associations, which can be accelerated by mechanical agitation or a hydrodynamic flow.
  • This example illustrates the possibility of performing tests based on physico-chemical associations at the interface between the component and a solution (s).
  • Example 16 Examination and recognition of chromosomes, direct diagnosis on chromosomes.
  • the present example demonstrates the application of the method according to the invention to chromosome analysis.
  • the images in Figure 16 are 100 microns long.
  • the image on the left is obtained by observing the sample between polarizer and crossed analyzer and the image on the left is obtained in Nomarski differential interference contrast.
  • the two main objects visualized in Figure 16 are stretched chromosomes probably from a cell at the pre-metaphase stage in mitosis.
  • An advantage of the alalyzing method according to the invention is that it does not require blocking of a particular mitotic phase since the objects extracted from the different cells are immediately recognized.
  • Direct analysis for example for diagnostic purposes, is made possible by the observation of the bands colored that appear without marking and thus without destruction of objects. Another advantage is that a small number of cells is sufficient to implement the observation.
  • the chromosome is a human chromosome.
  • the lighting lamp is a xenon lamp.
  • the image on the left ( Figure 16) clearly shows the colored bands and the image on the right shows the two strands of the chromosome and the centromere at the break in the shape of the object.
  • Example 17 Visualization of steric markers.
  • the image of FIG. 17, obtained in differential interference contrast, has a large dimension of 15 microns and shows a population of colloidal gold beads with a majority diameter of 20 nanometers deposited on component No. 7 (FIG. 2B). from a solution.
  • the component was made hydrophobic by a vapor phase HDMS deposit, which allows a good dispersion of the suspension deposited by moving a drop on the surface using a pasteur pipette, a technique close to combing that we practice. In this method, the speed of the drop parallel to the support is of the order of 1 millimeter per second.
  • This experiment illustrates the ability of the analysis method to visualize steric markers of very small size. Markers 10 times smaller can still be viewed in the same way and using the same component.
  • Example 18 Importance of the affinity properties of the surface.
  • Figure 18A The two images of Figure 18A, whose large size is 200 (left) and 100 (right) microns respectively, show on a No. 7 component (according to Figure 2B) (left), and No. 7 modified by silanization (right) the impact of surface affinity on the structure of cationic surfactant monolayers (0.1% SDS).
  • the surfactants were deposited by evaporation from a very dilute solution in distilled water. When the surface is hydrophobic (on the left), the layers are regular although perforated (monolayer in the upper left part) or not (tricouche in the lower right part), suggesting a positional disorder of the molecules as in a liquid state.
  • the image 18B on the left shows the crystalline structures obtained on the hydrophilic component.
  • Image 19 the large size of which is 153 microns, shows a bilayer of phospholipids on a component No. 16 (FIG. 2B) after UV irradiation with oxygen.
  • the bilayer was obtained by depositing a very small amount of liposome solution of DPPC, a reference phospholipid.
  • the deposit is made by direct contact (both solid and liquid) between a manual spinner 100 microns in diameter soaked in the solution and the component.
  • the observation is then carried out in water in interferential contrast.
  • the observation shows the presence of a very regular bilayer (except top left) and very stable in water.
  • Such a bilayer may constitute a spot of a protein biochip.
  • the deposition technique is moreover compatible with the use of automated spotters, and the bilayer can accommodate any kind of receptors introduced beforehand by mixing in the DPPC solution, the receptors then integrating into liposome bilayers.
  • Each spot may correspond to a different solution containing receptors determined after the use of the biochip.
  • Liposomes are vesicles (sacs) whose membrane is a bilayer of phospholipids. They are used for the vectorization of active products in the cosmetic and pharmaceutical fields, the bags being used in contact with the target.
  • the present invention allows this study and this control.
  • the surface properties of the component must then reproduce those of the target. It is also important to characterize the size distribution of liposomes as it may change with time or storage conditions.
  • the interaction between the liposomes and the surface of the component can be adjusted by adjusting its surface properties.
  • each liposome becoming a puddle which may be a bilayer or a monolayer.
  • d the diameter of the liposome is slightly lower than the resolution r of the observation system, because the diameter of the puddle (disk) is 2 times that of the liposome (sphere). For d> r / 2, the puddle is resolved;
  • Each liposome appears in interferential contrast as a point whose light intensity and / or color are functions of its diameter.
  • the same proposal applies to puddles with a diameter of less than r / 2.
  • Liposomes of unknown nature are objects from the cosmetology industry.
  • the liposomes spontaneously adsorb on the component whose surface is very homogeneous in the form of hemi-liposomes, that is to say hemispheres placed on the surface.
  • the contact angle of objects on the surface is constant and very close to 90 °.
  • the bright dots are objects with a diameter of 50 nanometers.
  • the component makes it possible to establish an exploitable link between the size of the objects and their appearance (calibration), then to follow the evolution of the distribution of objects in the solution, with the conditions and the duration of storage, for example.
  • This application is very advantageous because it allows a direct and simple characterization to implement objects observed individually, whereas the available techniques, based on light scatterometry, only allow access to averaged quantities. on the whole population.
  • Example 21 Method of analyzing an object located on the surface or near the surface of a liquid, or at the interface between two liquids, where one or more layer (s) of index is (are ) constituted by the said liquid (s). Observation of layers or objects located on or near the surface of a liquid (Langmuir layers, compounds adsorbed at the liquid / air interface), and monitoring the interactions of these layers or objects with external agents by means of an optical component according to the invention used in the assembly illustrated in FIG. 21
  • the thickness e can be adjusted by the following device.
  • a mechanical or piezoelectric device or the variation of the level of the Langmuir layer makes it possible to bring the optical component to a position h with a precision of the order of one nanometer.
  • the thickness e of the film results from a balance between disjunction pressure and gravity.
  • An adjustment of h makes it possible to adjust e with a precision of the order of a few nanometers, so as to obtain maximum contrast.

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Abstract

La présente invention concerne un composant optique pour l'observation d'un échantillon, comportant un substrat et au moins une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées, destinée à faire apparaître un contraste élevé d'intensité ou de couleur pour des variations de chemin optique, des reliefs, des épaisseurs et des diamètres nanométriques lorsqu'il est observé par réflexion en lumière incohérente convergente autour de l'incidence normale dans des conditions d'extinction de polarisation caractérisé en ce que la couche d'indice supérieure présente des propriétés de surface spécifiques lui conférant une affinité sélective par rapport à au moins une caractéristique de l'échantillon. L'invention concerne aussi un système d'analyse comprenant un tel composant, un procédé d'analyse mettant en oeuvre ce composant et des applications de ce procédé.

Description

COMPOSANT OPTIQUE POUR L'OBSERVATION D'UN ECHANTILLON
NANOMETRIQUE, SYSTEME COMPRENANT UN TEL COMPOSANT, PROCEDE D'ANALYSE METTANT EN ŒUVRE CE COMPOSANT, ET LEURS
APPLICATIONS
La présente invention concerne le domaine de l'observation et de l'analyse de caractéristiques nanométriques à l'aide d'un composant optique et un système d'observation en lumière polarisée. On connaît dans l'état de la technique la technologie consistant à préparer une lame support d'échantillon présentant des couches d'indice répondant à des critères spécifiques, tel que proposé dans les brevets FR2818376 et FR2841339. On connaît également dans l'état de la technique le brevet US5631171 décrivant un équipement pour l'observation de différences d'épaisseur d'ordre nanométrique, par l'analyse de la réfraction de couches minces.
Ces différentes solutions nécessitent la conception et la production d'une lame particulière pour chaque type d'échantillon à observer, et ne permet pas de procéder à des études d'échantillons indéterminés ou de caractéristiques variables.
La présente invention vise à remédier à ces inconvénients en proposant une solution permettant de développer un large spectre d'applications pour l'étude d'échantillons dont certaines caractéristiques ne sont pas connues, par une observation de leurs caractéristiques optiques et physiques. L'invention concerne selon son acception la plus générale un composant optique pour l'observation d'un échantillon, comportant un substrat et au moins une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées, destinée à faire apparaître un contraste élevé d'intensité ou de couleur pour des variations de chemin optique, des reliefs, des épaisseurs et des diamètres nanométriques lorsqu'il est observé par réflexion en lumière incohérente convergente autour de l'incidence normale dans des conditions d'extinction de polarisation caractérisé en ce que la couche d'indice supérieure présente des propriétés de surface spécifiques lui conférant une affinité sélective par rapport à au moins une caractéristique de l'échantillon.
Lesdites propriétés optiques sont les propriétés naturelles de la couche d'indice supérieure ou sont obtenues par des modifications physiques, chimiques, physico¬ chimiques, biochimiques, biologiques de la couche d'indice.
On considère donc une couche d'indice supérieure pré¬ existante et une modification fonctionnelle ultérieure qui constitue le plus souvent une couche supplémentaire. L'empilement initial est prévu pour devenir optiquement efficace après modification fonctionnelle de la surface et/ou pour que la situation optique recherchée puisse résulter de l'association d'un pré-empilement et de la couche fonctionnelle. On entend au sens du présent brevet par « échantillon » un objet dont certaines caractéristiques ne sont pas connues et sont révélées par l'observation directe de variations de chemin optique très faibles (nanométriques) dont l'extension latérale peut être également très faible (nanométrique) , l'adjectif nanométrique signifiant que ces longueurs se mesurent raisonnablement en nanomètres. On entend au sens du présent brevet par « composant optique » une association du substrat et au moins d'une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées présentant des variations d'affinité.
On entend par « affinité » une capacité de la surface du composant à se combiner avec un agent extérieur présentant des caractéristiques physiques, chimiques ou biologiques déterminées et connues. On entend au sens du présent brevet par « variation d'affinité » le fait que la surface présente des zones affines correspondant à des caractéristiques physiques, chimiques ou biologiques non constantes. On entend au sens du présent brevet par « zone affine » un élément de surface présentant une affinité particulière, différente de l'affinité des zones avoisinantes.
Le composant selon l'invention permet de déduire de l'observation optique des caractéristiques correspondant à l'affinité avec une partie ou la totalité de la surface du composant optique recevant l'échantillon. Avantageusement : ledit échantillon est observé en contraste interférentiel différentiel, lesdites propriétés de surface présentent des caractéristiques d'affinité variant en fonction des coordonnées sur la surface du composant,
- les caractéristiques optiques du composant varient en fonction des coordonnées de la zone considérée sur la surface du composant, les variations des caractéristiques optiques du composant et les variations des propriétés de surface sont corrélées, - lesdites variations forment un gradient selon une direction au moins du composant optique,
- lesdites variations sont brutales, délimitant ainsi des domaines nettement séparés sur la surface comme par exemple dans le cas de biopuces, de nez artificiels, de frontière hydrophile/hydrophobe ou d'une manière générale de surface patterns,
- lesdites variations constituent un pavage régulier de la surface,
- lesdites variations constituent un réseau matriciel, - le composant porte des repères visibles permettant d'identifier et de retrouver une zone particulière.
Selon l'invention, la surface du composant optique présente des propriétés d'affinité correspondant à des caractéristiques physiques, chimiques ou biologiques non constantes. Ces propriétés d'affinité peuvent consister en énergie de surface, charge électrique de surface, polarisabilité de surface, porosité sélective, affinités physiques, affinités physico-chimiques, sites de capture et/ou de reconnaissance, film liquide, présence d'un soluté, agents magnétiques, surfactants, textures, groupes réactifs chimiques, pièges moléculaires sélectifs, patterns hydrophiles/hydrophobes, patterns millimétriques, micrométriques, nanométriques. Selon des modes de réalisation particuliers les propriétés de surface :
- sont les propriétés naturelles de la couche d'indice supérieure, sont obtenues en une ou plusieurs étapes par réaction chimique de composés avec la surface de la couche d'indice par un greffage chimique covalent ou par un greffage électrostatique de touts objets moléculaires ou macromoléculaires chargés tels que, polyélectrolytes, électrolytes, protéines, dendrimères, - sont obtenues par une modification physique de la couche d'indice telle que l'application d'un faisceau de particules ou d'un faisceau électromagnétique, une action mécanique, acoustique, thermique, électrique ou magnétique, une érosion, un dépôt sélectif, un traitement plasma, une métallisation, une variation de pression, l'application d'un jet liquide, un dépôt d'encre, de fumées, de poudres, de couches sous forme liquide, un contact solide,
- sont obtenues par une modification physico-chimique en phase gazeuse, liquide ou solide de la couche d'indice telle que gonflement, dégonflement, dissolution, polymérisation, adsorption, mouillage, capillarité, condensation, effet électrostatique, évaporation, cristallisation, dépôt, électrodéposition, électrochimie, électropolymérisation, démixtion , auto-assemblage, dip- coating, spin-coating, micro-contact printing, transfert de Langmuir-Blodgett, en une ou plusieurs étapes par une combinaison de ces modifications,
- consistent en une variation de la température ou résultent d'une variation de la température imposée à l'échantillon,
- consistent en ou résultent d'un éclairage par un faisceau de lumière annexe,
- consistent en une variation de la pression ou résultent d'une variation de la pression,
- consistent en une variation de la nature chimique de la surface, de la composition de la surface, de la rugosité de la surface, d'altitude de la surface, de coefficient de réflexion, d'un potentiel sur la surface tel qu'un potentiel électrique, magnétique, électrostatique, zêta, une densité de charges électriques, une valence de charges électrostatiques variable, d'une pression hydrostatique, d'une pression osmotique, de susceptibilité linéaire ou non linéaire (polarisabilité, coefficient d'absorption lumineuse, susceptibilité magnétique, perméabilité, coefficient diélectrique, susceptibilité Raman, pouvoir rotatoire, conduction thermique, conduction électrique, indice optique, etc.), d'une densité de courant (électrique, thermique, ionique, hydrodynamique, etc..) ou consistent en une anisotropie de l'une quelconque de ces propriétés,
- sont obtenues par application à l'échantillon d'un champ extérieur pendant tout ou partie de l'observation tel que le champ thermique, lumineux, électrique, magnétique, électromagnétique, hydrodynamique, aérodynamique, exposition à un faisceau ou à un environnement particulier, sont obtenues par l'apport d'une couche biologiquement active ou par une modification biologique ou biochimique de la couche d'indice ou sur la couche d'indice par une fixation par une adsorption, un greffage ou un dépôt de structures membranaires sous forme de monocouches de bicouches ou de multicouches, pures ou chargées d'objets membranaires, par éclatement de vésicules ou de liposomes ou d'extraits de membranes cellulaires, par une fixation de macromolécules biologiques, par une fixation de protéines directe (par exemple de Bovine Sérum Albumine) ou par greffage de complexes amphipols-protéines membranaires, par une fixation de ligands (par exemple par des associations avidine-biotine) , par une fixation d'anticorps ou d'antigènes, par une fixation de cellules, par lyse ou par adhésion cellulaire, par une fixation de composants cellulaires résultant d'une destruction de cellules, par une fixation de chromatine et de chromosomes dans tous leurs états de compaction, par une fixation directe de chromosomes, par une fixation d'ADN ou d'ARN, par peignage moléculaire ou par greffage ou par incubation, par fixation de virus ou de bactéries, par fixation d'agents anti-viraux ou anti-bactériens, par fixation de récepteurs membranaires sur une bicouche déjà fixée, par fixation de polysaccharides, par fixation de cytosquelettes ou d'éléments du cytosquelette, par fixation de microtubules, de tubuline ou de myosine, par fixation de fibres de cellule végétal, de fibres de chitine, de fibres de chitosane, de fibres de cellulose et par toute combinaison de ces différentes fixations,
- sont obtenues par le dépôt d'une couche de polymères biologiquement actifs, tels que polyosides, polylysine, polypyrole, polydiméthylsiloxane, polyéthylène glycol, - sont obtenues par une combinaison quelconque de différentes opérations physiques, chimiques, physico¬ chimiques, biochimiques, biologiques,
- confèrent des propriétés sélectives d'interactions intermoléculaires qui permettent la reconnaissance et/ou la fixation sélective et/ou préférentielle d'objets d'intérêt ou d'objets prédéfinis tels que les protéines, peptides, acides aminés, anticorps, antigènes, médicaments, polysaccharides, lipides, liposomes, vésicules, toxines, produits métaboliques, molécules de synthèse, molécules aromatiques, fibres, filaments, molécules d'ADN, d'ARN, chromosomes, cellules, extraits cellulaires, bactéries, virus, plots d'une biopuce, vrais et faux hybrides de ces plots, environnement de ces plots, vrais et faux hybrides de cet environnement, structures micellaires, composants de micromanipulation, composants microfluidiques, complexes organiques, complexes inorganiques, complexes organiques- inorganiques, amibes, marqueurs fluorescents, marqueurs stériques, agrégats, amas et clusters, condensats, gouttes de condensation, colloïdes, particules colloïdales, complexes métalliques, agents de pollution, poudres, fumées, gaz, fibres d'amiantes, nanotubes, nanofils, nanoparticules, dendrimères, boîtes quantiques, argiles, feuillets, vapeurs organiques, zéolithes, sels, particules chargées, contre- ions, solutés, tensioactifs, surfactants, catalyseurs, résidus de réactions chimiques, précipités, cristaux, notamment cristaux bidimensionnels, cristaux de protéines et cristaux bidimensionnels de protéines, cristaux de lipides, cristaux minéraux, cristaux de graisses, cristaux de sucres, cristaux de polymères, cristaux de sels ou toutes combinaisons de ces différents objets.
Selon un autre mode de réalisation, l'association dudit composant avec un échantillon observé constitue une alternative ou un élément de couplage aux traçages des échantillons à l'aide des techniques de radie-marquage, de spectroscopie, de spectroscopie Raman, de spectroscopie infra-rouge, ultra-violet ou visible, de fluorescence, de marquage enzymatique, de spectrométrie de masse, de détecteur piézoélectrique, de détecteur ampérométrique, de détecteur à ondes acoustiques de surface, de résonance des plasmons de surface, de profilométrie, de microscopies à champ proche, de microscopie à force atomique, d'ellipsométrie. Selon d'autres modes de réalisation :
- le composant optique est fixé sur le fond d'une boîte de Pétri,
- le substrat constitue le fond d'une boîte de Pétri. L'invention concerne également un procédé d'analyse d'échantillon mettant en œuvre un composant optique conforme à l'une au moins des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de mise en contact de l'échantillon à étudier avec la surface d'affinité sélective dudit composant, et au moins une étape d'observation directe et en temps réel du composant ainsi préparé avec un équipement comportant une source lumineuse incohérente convergente autour de l'incidence normale, et un ensemble permettant l'observation de l'échantillon en lumière polarisée dans des conditions d'extinction, et éventuellement une étape d'enregistrement de l'image ainsi observée.
Selon un mode de réalisation préféré :
- le procédé comporte un ensemble formé par un polariseur et un analyseur croisés situés de part et d'autre du composant optique le long du trajet utile de la lumière,
- l'équipement comporte un dispositif séparateur de polarisations tel qu'un biprisme de Wollaston ou un dispositif de Nomarski et en ce que l'échantillon est observé en contraste interférentiel différentiel, le dispositif comporte une source lumineuse polychromatique, monochromatique, visible, partiellement visible ou non visible,
Selon des modes de mise en œuvre particuliers le procédé comporte: une étape de l'identification d'une zone particulière de l'image grâce aux repères visibles sur le composant, une étape d'analyse de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et une comparaison de ces valeurs avec des valeurs prédéterminées,
- une étape d'analyse des caractéristiques de l'image réalisant un filtrage de l'image en fonction de seuil de luminosité et/ou une mesure de la position et de l'intensité des éléments dépassant ledit seuil de luminosité en fonction des positions le long de la surface. Selon d'autres variantes :
- il s'agit d'une analyse de la courbe de l'intensité en fonction de la longueur d'onde de chaque point ou partie de l'image pour l'ensemble des longueurs d'onde présentes dans le spectre de l'éclairage, l'équipement utilisé doit alors comporter un spectromètre,
- il s'agit d'intensité d'une image monochromatique ou d'un filtrage ou d'une projection monochromatique d'une image colorée,
- le procédé comporte une étape de comparaison dans les mêmes conditions d'observation de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et de celles d'un échantillon de référence dont les caractéristiques sont connues,
- tout ou partie de la mise en contact est réalisée par évaporation de l'échantillon, - tout ou partie de la mise en contact est réalisée par immersion en phase liquide par lavage,
- la mise en contact comporte au moins une étape de rinçage, d'incubation ou de séchage,
- tout ou partie de la mise en contact est réalisée par contact solide, par exemple par contact printing,
- le procédé comporte en outre une ou plusieurs étapes de préparation de l'échantillon et/ou une étape d'incubation et/ou une étape d'immersion et/ou une étape de rinçage et/ou une étape de séchage puis une étape d'observation à sec,
- les observations se font en immersion et l'analyse consiste à extraire les variations d'intensité ou de signal en chaque point au cours du temps, - la mise en contact et l'observation sont simultanées,
- la mise en contact est une hybridation ou adsorption ou réaction chimique d'un soluté avec le composant, le mécanisme pouvant être gouverné par une diffusion brownienne ou par une convection, c'est-à-dire un mouvement déterminé du soluté vers ou le long de la surface provoqué par un écoulement hydrodynamique ou un champ extérieur électrique, magnétique, thermique, lumineux, etc..
Avantageusement, le procédé comporte une étape de détection et/ou de reconnaissance et/ou d'analyse grâce à l'utilisation de marqueurs stériques à la place de marqueurs fluorescents, lesdits marqueurs étant eux-mêmes attachés à un objet capable d'assurer une fonction de reconnaissance. On a donc deux éléments sélectifs : la surface du composant qui permet de capturer quelque chose et l'élément attaché au marqueur qui permet de révéler ou de reconnaître ce qu'on a capturé. Le diamètre de ces marqueurs stériques est inférieur à 100 nanomètres et de préférence inférieur à 50 nanomètres, de préférence inférieure à 10 nanomètres et de préférence inférieure à 5 nanomètres. Le procédé selon l'invention permet de travailler avec des marqueurs stériques plus petits que dans les autres techniques. La nature de ces marqueurs stériques est arbitraire. Ces marqueurs stériques peuvent être eux-mêmes nantis d'un site de reconnaissance et peuvent être utilisés pour analyser un échantillon inconnu sur la surface de façon directe ou indirecte.
Selon un autre mode de réalisation, l'association du composant avec un échantillon observé constitue une alternative ou un élément de couplage aux traçages des échantillons à l'aide des techniques de radiomarquage, de spectroscopie, de spectroscopie Raman, de spectroscopie infra-rouge, ultra-violet ou visible, de fluorescence, de marquage enzymatique, de spectrométrie de masse, de détecteur piézoélectrique, de détecteur ampérométrique, de détecteur à ondes acoustiques de surface, de résonance des plasmons de surface, de profilométrie, de microscopies à champ proche, de microscopie à force atomique, d'ellipsométrie,
Selon une deuxième variante, l'association du composant avec un échantillon observé constitue une alternative aux traçages des échantillons à l'aide de marqueurs stériques de dimensions supérieures ou de nature imposée.
Selon une autre variante, l'interaction d'une cible portant un marqueur stérique et de l'échantillon observé constitue une alternative aux traçages des échantillons à l'aide de marqueurs stériques de dimensions supérieures. Selon des modes de réalisation particuliers, le procédé comporte: une étape de reconnaissance et/ou la fixation sélective et/ou préférentielle d'objets d'intérêt ou d'objets prédéfinis tels que les protéines, peptides, acides aminés, anticorps, antigènes, médicaments, polysaccharides, lipides, liposomes, vésicules, toxines, produits métaboliques, molécules de synthèse, molécules aromatiques, fibres, filaments, molécules d'ADN, d'ARN, chromosomes, cellules, extraits cellulaires, bactéries, virus, plots d'une biopuce, vrais et faux hybrides de ces plots, environnement de ces plots, vrais et faux hybrides de cet environnement, structures micellaires, composants de micromanipulation, composants microfluidiques, complexes organiques, complexes inorganiques, complexes organiques- inorganiques, amibes, marqueurs fluorescents, marqueurs stériques, agrégats, amas et clusters, condensats, gouttes de condensation, colloïdes, particules colloïdales, complexes métalliques, agents de pollution, poudres, fumées, gaz, fibres d'amiantes, nanotubes, nanofils, nanoparticules, dendrimères, boîtes quantiques, argiles, feuillets, vapeurs organiques, zéolithes, sels, particules chargées, contre- ions, solutés, tensioactifs, surfactants, catalyseurs, résidus de réactions chimiques, précipités, cristaux, notamment cristaux bidimensionnels, cristaux de protéines et cristaux bidimensionnels de protéines, cristaux de lipides, cristaux minéraux, cristaux de graisses, cristaux de sucres, cristaux de polymères, cristaux de sels ou toutes combinaisons de ces différents objets, - une étape de détection d'objets de toutes natures associés à une molécule d'ADN simple ou double brin posé sur ou à proximité d'une surface,
- une étape de formation de clusters nanométriques ou micrométriques sur des sites appartenant à des objets physiques, chimiques, physico-chimiques ou biologiques suivie d'une étape de détection et/ou d'observation de ces structures.
Il s'agit ici de clusters de sels dont la formation dépend du procédé d'incubation, de lavage, de rinçage et/ou de séchage ou de clusters d'impuretés ou d'agents biologiques tels que des protéines ou d'autres macromolécules, ou d'agents physiques tels que des agrégats, ou d'agents chimiques tels que des réactifs ou des produits de réactions ou d'impuretés ou d'agents physico-chimiques tels que des précipités ou des composants d'un mélange préférentiellement absorbés, ou de cibles constituées d'objets stériques complémentaires comme de métaux ou en plastique, billes de latex, d'or ou de silice attachés à un ligand tel qu'une molécule d'ADN simple ou double brin ou un anticorps ou un antigène ou une protéine ou un copolymère•
L'étape de formation de clusters physico-chimiques peut est une étape de formation de gouttes liquides spontanément au contact de leur vapeur. L'étape de formation de clusters physico-chimiques est par exemple une étape de formation de gouttes d'eau sur les sites hydrophiles d'un échantillon ou d'une partie d'un échantillon comme un nanotube de carbone, une molécule d'ADN, un organisme biologique, un chromosome ou une protéine. II existe plusieurs configurations optiques pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention :
- le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et un second système optique comprenant un analyseur orienté dans une position d'extinction du faisceau réfléchi par le composant,
- le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et une lame quart d'onde et un second système optique comprenant la même lame quart d'onde et un analyseur,
- le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et un élément séparateur de polarisations tel qu'un biprisme de Wollaston et un second système optique comprenant le même élément séparateur de polarisations et un analyseur,
- le composant optique portant l'échantillon est placé entre un premier système optique comprenant un polariseur, un biprisme et un compensateur, et un second système optique comprenant un compensateur, un biprisme et un analyseur,
- l'un au moins des systèmes optiques comprend en outre une lame quart d'onde, - l'analyseur du second système optique et le polariseur du premier ne constituent qu'un seul et même composant,
- la séparation entre les deux systèmes optiques le long du trajet optique, obtenue par un dispositif semi- réfléchissant, est localisée après le polariseur du premier système le long du trajet optique ou avant le polariseur du premier système le long du trajet optique, l'analyseur et le polariseur ne formant alors qu'un seul élément, le l'équipement d'observation de l'échantillon comporte un objectif, le composant optique portant l'échantillon est observé par réflexion sur face supérieure(microscope droit), le composant optique portant l'échantillon est observé par réflexion sur face inférieure (microscope inversé) .
L'invention concerne enfin un système d'analyse d'échantillon comportant un dispositif d'observation et un composant optique portant un échantillon à analyser caractérisé en ce que ledit composant optique est constitué par un substrat et au moins une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées, destinée à faire apparaître un contraste élevé d'intensité ou de couleur pour des épaisseurs nanométriques lorsqu'il est observé par réflexion en lumière incohérente convergente autour de l'incidence normale dans des conditions d'extinction de polarisation, la couche d'indice supérieure présentant des propriétés de surface spécifique lui conférant une affinité sélective par rapport à au moins une caractéristique de l'échantillon. Selon un mode de réalisation préféré, ce système d'analyse comprend un dispositif de contraste interférentiel différentiel.
Avantageusement, le dispositif d'observation comprend : - une source lumineuse polychromatique ou monochromatique, un moyen d'analyse de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et une comparaison de ces valeurs avec des valeurs prédéterminées,
- un moyen d'analyse des caractéristiques de l'image réalisant un filtrage de l'image en fonction de seuil de luminosité et/ou une mesure de la position et de l'intensité des éléments dépassant ledit seuil de luminosité en fonction des positions le long de la surface,
- un moyen d'analyse de la courbe de l'intensité en fonction de la longueur d'onde de chaque point ou partie de l'image pour l'ensemble des longueurs d'onde présentes dans le spectre de l'éclairage, - un moyen d'analyse d'intensité d'une image monochromatique ou d'un filtrage ou d'une projection monochromatique d'une image colorée,
- un moyen de comparaison dans les mêmes conditions d'observation de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et de celles d'un échantillon de référence dont les caractéristiques sont connues, - un réactif destiné à la préparation de l'échantillon en vue de la mise en contact avec la surface d'affinité sélective, un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, chacun desdits systèmes optiques comprenant en outre un biprisme,
- un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, l'un au moins desdits systèmes optiques comprenant en outre un compensateur, un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, l'un au moins desdits systèmes optiques comprenant en outre une lame lambda/4.
L'invention concerne encore des applications suivantes du procédé susvisé:
- criblage de cristaux de protéines, de peptides, de lipides et de toutes autres autres molécules suceptibles de former des cristaux,
- criblage des cristaux bidimensionnels au lieu de cristaux seulement tridimensionnels habituellement,
- étude des interactions intermoléculaires,
- techniques de micromanipulation d'objets visualisés,
- lecture et l'analyse de biopuces à ADN, à ARN, a chromosomes, à protéines, à antigènes, à anticorps, à cellules, à bactéries, à virus ou de puces de toutes natures,
- analyse peptidique, étude de la multimérisation des récepteurs membranaires, - étude du transport axonal et de la libération de neurotransmetteurs,
- détection et l'analyse de chromosomes à des fins d'étude ou de diagnostic médical par l'exploitation des bandes de couleur ou d'intensité directement visibles sur les chromosomes,
- analyse d'une seule molécule d'ADN,
- contrôle non destructif de liposomes, contrôle non destructif d'émulsions et/ou de suspensions,
- contrôle non destructif de nanotubes,
- contrôle de fumées,
- contrôle de fibres d'amiantes,
- détection de traces, - contrôle de corrosion,
- contrôle de pollution terrestre, atmosphérique et des eaux,
- contrôle de qualité de l'eau,
- fabrication de capteurs de gaz, de liquides, de particules, de « nez artificiels », contrôle de qualité de greffages chimiques sur solide, de couches, de différents stades de dépôt d'épaisseurs nanométriques, de couches de Langmuir-Blodgett,
- contrôle de qualité et la fabrication de composants microélectroniques, de masques, de systèmes micro-électro¬ mécaniques (MEMS), de supports pour construction microélectronique et MEMS, de supports d'enregistrement (CD et DVD), d'écrans plats,
- suivi de croissances de couches et de nano-objets, de nanotubes par CVD à partir d'un catalyseur, contrôle et mise au point des surfaces biocompatibles, diagnostic sur extraits membranaires, tissus, cellules, - étude et reconnaissance d'interactions polymères- membranes,
- la détection de biréfringence, de séparation de phases, d'adsorptions préférentielles, - construction de composants moléculaires,
- détection et suivi de croissances bactériennes, de croissances cellulaires, contrôle de différentes étapes des procédés enzymatiques, - contrôle de croissance nanométrique de structures cristallines,
- contrôle de qualité de couches sensibles pour des capteurs pendant la phase de fabrication de la couche sensible et/ou pendant la phase de mise au point des procédés de mise en œuvre du capteur, ledit capteur étant par exemple une biopuce à ADN, à ARN, à chromosomes, à protéines, à antigènes, à anticorps, à cellules, à bactéries, à virus etc..
L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description des exemples non limitatifs de réalisation qui suivent, se référant aux figures annexées.
Exemple 1 : Schéma général du système d'analyse par réflexion.
Le système d'analyse représenté en figure 1 comprend principalement : un premier système optique (10) comprenant un polariseur (1) - un deuxième système optique (20) comprenant un analyseur (2)
- un composant optique (30)
- une source d'éclairage (40)
- un composant partiellement réfléchissant (80) - préférentiellement un objectif (60) pour l'imagerie
- préférentiellement une optique de sortie (50) pour 1'observation.
- préférentiellement un dispositif d'enregistrement de l'image (70)
II correspond à un premier exemple de réalisation destiné à une observation par réflexion.
Les deux systèmes optiques (10, 20) sont disposés de part et d'autre du composant optique (30) sur le trajet de la lumière. Ils peuvent avoir une partie commune (15).
La source lumineuse est dans l'exemple décrit une source polychromatique. Cette caractéristique n'est toutefois pas limitative. La source d'éclairage peut être par exemple une lampe halogène, une lampe xénon, une lampe à mercure, une lampe à vapeur de sodium,un pavé de diodes,une lampe à incandescence, une source de lumière naturelle, une lampe à décharge, ou tout autre source totalement ou partiellement incohérente.
Le système (40) peut comprendre une optique de condensation et/ou de focalisation, une fibre optique, un diaphragme, ou plusieurs éléments comme dans un éclairage de Kôhler. L'image de la source est préférentiellement focalisée sur le plan focal arrière de l'objectif (60). L'éclairage est préférentiellement puissant. Le faisceau lumineux (4) est polarisé selon une première direction par le polariseur (1). Dans l'exemple du montage choisi, la direction de cette polarisation est préférentiellement perpendiculaire au plan de la figure. Le miroir semi-transparent (80) envoie la lumière polarisée vers l'échantillon.
Chaque point de la source éclaire l'échantillon d'un faisceau de lumière parallèle avec une direction différente. La source est large si bien que le faisceau de lumière est convergent. Après réflexion sur l'échantillon, le faisceau de lumière retourne sur lui-même et repasse à travers l'objectif.
Une partie de ce faisceau traverse ensuite le miroir semi-transparent (80) pour passer à travers le système optiuqe (20) , réduit dans cet exemple à un analyseur (2) orienté parallèlement au plan de la figure.
Une image réelle de l'échantillon est finalement obtenue soit directement si l'objectif travaille à distance finie soit grâce à une optique de focalisation si l'objectif travaille à l'infini. Cette image est finalement reprise par un oculaire (non représenté) pour une observation directe ou saisie par un appareil photo ou une caméra (non représentés) pour être enregistrée.
Exemple 2 : Schéma d'un composant optique selon 1'invention
La figure 2A décrit un composant optique mis en œuvre par l'invention.
Le composant optique (30) comporte un substrat (31) et présente principalement trois couches :
- une première couche d'indice (32) présentant des caractéristiques d'indice et d'épaisseur constantes sur toute la surface
- une deuxième couche d'indice (33) présentant des caractéristiques d'indice et d'épaisseur qui sont adaptées en fonction de l'application et des caractéristiques d'affinité associées
- une ou plusieurs couches d'affinité sélective (34). Les deux couches (33, 34) présentent des caractéristiques qui, pour la plupart des applications, ne sont pas constantes sur toute la surface du composant optique.
Les variations des caractéristiques d'indice de la couche (33) et des caractéristiques d'affinité de la couche (34) sont corrélées de façon à former sur le composant une pluralité de zones partielles présentant un couple de caractéristiques d'indice et d'affinité déterminés.
Ces zones partielles forment par exemple une matrice composée d'éléments présentant une forme circulaire, chaque élément correspond à une caractéristique d'indice et une caractéristique d'affinité associée spécifiques et différentes de celles des éléments adjacents.
L'observation optique du comportement optique de l'échantillon sur ce composant et en particulier des variations d'une zone à l'autre permet d'en déduire des informations physico-chimiques ou biologiques de l'échantillon observé.
La figure 2B représente les différents prototypes de composants optiques selon l'invention.
Exemple 3 : Les images d'un brin d'ADN obtenues avec le composant optique selon l'invention.
Ces images représentent une molécule d'ADN de phage Lambda double brin obtenue par peignage (tirage très lent de la surface du composant à partir d'une solution de pH réglé) sur un composant constitué d'un support de silicium recouvert d'une couche de silice de 104 nm d'épaisseur (couche d'indice) modifiée par un traitement chimique par un HexaDiMethylSilazane (HDMS) en phase vapeur. La partie a présente une image obtenue et enregistrée avec un microscope optique (DMRHC de Leica)équipé d'un éclairage épiscopique, d'un polariseur et d'un analyseur, d'un objectif Apoplan X 100, et travaillant en contraste interférentiel. Cette image est la première image sans marquage d'une molécule d'ADN obtenue par une technique optique en champ lointain jamais publiée. La partie c montre l'image de la même molécule reconstruire à partir d'un balayage par un microscope à force atomique (AFM) utilisé comme technique de référence. L'épaisseur de la molécule donnée par l'appareil est de 1,7 nm, ce qui est en bonne correspondance avec le diamètre théorique de la molécule qui est de 2 nm. La partie b montre une nouvelle image de la même molécule obtenue au moyen du même microscope après l'étude par AFM. Les défauts nanométriques induits par le balayage AFM dessinent un carré nettement visible. Sans repérage optique préalable, il est impossible de localiser un objet déterminé d'une taille aussi petite que celle de cette molécule sur un échantillon d'une taille raisonnable (plus grand qu'un millimètre carré) .
Exemple 4 : Schéma d'un capteur à protéines membranaires pour la réalisation d'une biopuce à protéines membranaires.
La figure 4 représente un exemple d'application pour la réalisation d'une biopuce à protéines membranaires destinée à des observations dans l'air à des fins d'analyse d'un mélange. Le composant (30) présente un substrat de silicium (31) et une couche d'indice 1.34 ainsi que des couches d'affinité sélective (34) constituées de plots de 5 nm d'épaisseur aux contours irréguliers.
La couche d'indice est en aérogel de silice et possède une épaisseur de 102,5 nm et un indice réel de 1,34.
L'observation est effectuée avec un objectif d'ouverture numérique moyenne de 30 degrés.
La couche d'affinité (34) couvrant la surface est posée sur une couche d'indice (33) pouvant être formée d'une monocouche auto-assemblée fortement hydrophobe (figure 4B), d'un film hydrophile (figure 4C), d'un coussin de polymère (figure 4D)ou de molécules hybrides greffées sur la surface (figure 4E). Les plots ont plusieurs dizaines de microns de diamètre. Ce sont des disques formés d'une bicouche membranaire d'épaisseur 5 nm qui porte des récepteurs (35) différents pour chaque plot, alors capable de piéger sélectivement un ligand (36) présent dans un milieu à analyser. Dans l'exemple décrit, le matériel biologique est constitué par une bicouche lipidique présentant des récepteurs membranaires (35) destinés à capter un ligand (36). Au contact du milieu, les plots capturent chacun l'espèce complémentaire du récepteur qu'ils portent. Chaque plot capture un nombre faible ou très faible d'objets, qui peuvent être des partenaires protéiques ou peptidiques tels que des anti-corps ou des hormones. La lecture s'effectue après rinçage par contraste interférentiel. Chaque objet capturé (nanométrique) se traduit par la présence d'un point brillant sur un fond faiblement lumineux. Les objets peuvent être comptés facilement.
Dans cet exemple, le procédé d'analyse selon l'invention est particulièrement avantageux par rapport aux techniques de fluorescence ou d'ellipsométrie pratiquées car le signal qu'il exploite en un point de l'image est généré par une surface très réduite autour de l'objet capturé, typiquement le carré de la résolution latérale du système d'observation qui correspond à la plus petite surface observable, soit nettement moins qu'un micron carré, contrairement aux techniques de fluorescence ou d'ellipsométrie qui exploitent un signal généré par un spot de lumière beaucoup plus grand, supérieur à 100 microns carrés. Le signal utile provenant dans tous les cas de l'objet et le bruit ou signal parasite provenant au mieux dans tous les cas de la plus petite région observable, le rapport signal sur bruit est nettement amélioré lors de la mise en œuvre du procédé d'analyse selon l'invention. La présente invention permet donc de reconnaître des objets capturés individuels alors que les autres techniques mentionnées nécessitent la présence d'un grand nombre d'objets identiques pour pouvoir les détecter. Cela constitue un énorme avantage car les objets recherchés dans certains milieux sont très rares. Notre technique est donc préférable dans toutes les situations ou les objets capturés sont de dimensions nanométriques ou sont attachés à des objets de dimensions nanométriques. La figure 4F représente une bicouche supportée observée dans l'air.
Exemple 5 : Image d'une bicouche supportée observée en immersion. L'image 5, qui représente une bicouche supportée observée dans l'eau, a été obtenue en immersion et en contraste interférentiel avec le support N°15 (figure 2B).
Le composant (30) présente un substrat de silicium (31) et une couche d'indice 1.74 ainsi que des couches d'affinité sélective (34) constituées de plots de 5 nm d'épaisseur aux contours irréguliers.
Exemple 6 : Biopuces à ADN : contrôle et lecture.
La figure 6 représente des images obtenues avec le système d'analyse selon l'invention pour les biopuces à ADN.
La surface du composant présente une matrice de zones d'affinité de natures différentes. Chaque zone correspond à une couche d'affinité différente, comprenant un matériel biologique spécifique. Un tel composant est mis en contact avec un échantillon biologique à analyser.
Les réactions biochimiques s'effectueront entre cet échantillon et le matériel biologique fixé sur les différentes zones d'affinité du composant. Les zones ayant donné lieu à une interaction biomoléculaire présenteront des surépaisseurs d'ordre nanométrique et des caractéristiques optiques particulières, dont l'observation avec le système selon l'invention conduira à une visualisation directe permettant de déduire la nature biologique de l'échantillon. Le schéma 6A résume les expérimentations effectuées sur les composants optiques selon l'invention. Les ADN déposés sont des produits de PCR de 1000 paires de bases de longueur. La préparation et la révélation des biopuces a été réalisée suivant une procédure confidentielle mise au point par l'unité Inserm U533 dirigée par Jean Léger.
A l'issue du spotting, l'observation des supports (SP) permet de voir que les spots sont bien présents. Cette première observation vérifie que le travail du spotteur s'est bien déroulé. L'image 6B montre que le spotteur a manqué un dépôt (2e ligne, 4e colonne).
Les observations avant hybridation nous permettent d'apprécier la qualité des dépôts de produit de PCR. L'image 6C montre qu'à cette étape, il est possible de distinguer les dépôts de solutions de produits de PCR des dépôts de tampon. Un contrôle rapide des spots permet de s'assurer qu'ils ont tous la même allure, la même taille et qu'ils sont homogènes. Les insuffisances du procédé de rinçage laissent des résidus que notre technique peut détecter et qualifier (contrôle de procédés de fabrication) . Ces observations permettent d'apprécier aussi l'impact des différents traitements de préparation à l'hybridation. L'utilité de la saturation par la sérum albumine bovine (BSA) a ainsi été mise en cause dans l'observation des dépôts d'oligonucléotides sondes par notre technique En se déposant sur la surface, la BSA forme une couche de 2-3nm d'épaisseur qui diminue le différentiel de hauteur entre le dépôt et le fond.
A la suite de l'hybridation, ce sont toujours les mêmes dépôts qui sont observés à l'intérieur d'un même groupe sur les différents supports. Les signaux observés proviennent donc de l'étape d'hybridation. Les intensités et couleurs (le contraste) sont seuillées de telle manière que les plots qui ont capturé des brins d'ADN, ou plots positifs, apparaissent couverts de points brillants alors que les plots qui n'ont rien capturé, ou négatifs, n'apparaissent plus (Figure 6D).
D'après l'organisation des dépôts, aucun des dépôts de tampon ne donne lieu à un signal. Les signaux observés sont donc spécifiques de la présence d'ADN.
Les dépôts observés par notre technique (Figure 6E) correspondent à des dépôts fluorescents en microscopie (Image 6F) et au scanner. Or, cette fluorescence est la conséquence de l'hybridation. Ce qui est observé par notre technique est donc aussi le résultat de l'hybridation.
Pour connaître la quantité de matériel hybride, les signaux de fluorescence après lecture au scanner sont quantifiés. Les signaux pour Cy3 et Cy5 sont additionnés.
Les résultats pour un groupe de dépôt sont reportés dans le tableau 6G. Une représentation sous forme d'histogramme est réalisée (Graphique 6H), la position de chacun des bâtons correspond à celle des dépôts, la hauteur des bâtons est fonction du niveau de signal de fluorescence, la couleur est fonction de la détection par notre technique. Dans ce groupe de dépôts, il y a 72 dépôts au total dont 45 contiennent de l'ADN et 27 uniquement du tampon. Les 27 dépôts de tampon ne sont pas visualisés par notre technique avec ce réglage du contraste effectué par le choix du composant, ici le N°7 (figure 2B). C'est ce qui était attendu. Un contraste plus élevé serait obtenu avec le composant N°4 (figure 2B).
Parmi les 36 spots de solution d'ADN restant, notre technique permet dans sa configuration d'en visualiser 27. Les 9 qui ne sont pas visualisés correspondent à 3 réplicats de 3 solutions d'ADN différentes : R056X01A01, R056X01E05 et R056X01M05.
La taille standard des fragments déposés est de lOOOpb mais ces 3 solutions contiennent des fragments plus petits : R056X01A01 => 500pb, R056X01E05 => 300pb, R056X01M05 => 500pb.
En résumé, avec ce composant et avec ce réglage du contraste, Sarfus permet de bien visualiser les hybridations avec des sondes supérieures à 600pb mais pas les hybridations avec des sondes plus petites.
La comparaison d'image de plots avant et après hybridation (images 61 et 6J) permet de voir les changements d'aspect dus à la capture d'ADN.
L'image 61 montre que la différenciation entre le plot et son environnement est très grande, que les défauts du plot et de l'environnement apparaissent nettement visibles.
La technique est donc très performante pour le contrôle de procédés de fabrication et d'incubation
L'image 6J, avec contraste atténué pour assurer une dynamique suffisante à l'image, montre que l'aspect du plot hybride se différencie nettement de celui du plot non hybride, l'ADN piégé se traduisant par une surépaisseur et introduisant une rugosité supplémentaire.
Ceci illustre à la fois les possibilités d'optimiser les procédés d'hybridation, de lavage, de rinçage, de séchage, de minimisation des adsorptions parasites et les possibilités de lecture par distinction des plots négatifs et positifs. De plus, associée à des techniques de seuillage ou d'analyse d'intensité et/ou de couleur, la technique est quantitative et permet d'évaluer quelle quantité d'ADN a été capturée sur chaque plot.
Cette technique de lecture de puces sans marquage présente le gros avantage sur les techniques de fluorescence que le signal exploité est d'origine réfractive et donc stable dans le temps sous l'éclairage, contrairement au signal de fluorescence qui évolue avec le temps d'éclairement.
La technique présente aussi l'avantage d'être compatible avec des puces de très haute densité, la surface minimale d'un plot étant de l'ordre ou inférieur au micron carré.
Exemple 7 : Utilisation du composant optique selon l'invention pour la détection et le criblage des cristaux bidimensionnels et tridimensionnels.
La figure 7A représente les cristaux bidimensionnels de protéines. La taille de la zone observée est de 100 microns dans sa longueur. Cette figure illustre les possibilités d'utiliser le composant optique selon l'invention pour détecter des cristaux de protéines dans un état très précoce (bidimensionnel) , ce qui permet d'accélérer leur détection, un avantage important pour le screening, et d'étendre la recherche aux protéines qui forment des cristaux bidimensionnels mais pas des cristaux tridimensionnels. Rappelons que le screening des protéines consiste à identifier parmi de nombreux candidats ceux qui cristallisent, ce qui permet d'en étudier la structure par diffraction de rayons X, et soulignons que les techniques de diffusion de rayons X s'appliquent à des objets bidimensionnels (technique GISAX par exemple).
La figure 7B représente les cristaux tridimensionnels minces de protéines identiques obtenus plus tard. La taille de l'image est de 200 microns dans sa longueur. La surface du composant a été modifiée pour être hydrophile ce qui permet à la sérum albumine bovine (BSA) présent dans la solution de se déposer et de cristalliser lors de l'évaporation du solvant. La figure IC représente les cristaux 2D de polymères
(Polyéthylène Glycol 4000). Les tailles respectives des zones observées sont de 100 microns et 200 microns dans la longueur. Les dendrites mesurent environ 4 nanomètres d'épaisseur.
La figure 7D représente la visualisation tridimensionnelle de la cristallisation à température ambiante de ce même polymère. La taille des images est de 100 microns dans la longueur. La formation de ces dendrites en surface est rapide (de l'ordre du micron par minute). Cette séquence d'images illustre la possibilité d'observer des cinétiques de cristallisation à température ambiante inaccessibles par d'autres techniques.
On peut y voir la façon dont le polymère cristallise à partir du film de polymère amorphe. Aucune autre technique ne permet d'obtenir ces informations.
Exemple 8 : Contrôle, maîtrise et suivi de cristallisation d'un gel de protéines. La grande dimension des six images de la figure 8 est de 200 microns. Les cinq premières sont obtenues à sec entre polariseur et analyseur croisés avec le composant N°7 (selon figure 2B) .
Le composant utilisé pour la sixième (en bas à droite) est un simple support de silicium recouvert d'un film d'une solution dans l'eau d'approximativement 100 nm d'épaisseur, ce qui peut se contrôler avec un dispositif de contrôle de la pression de disjonction tel celui proposé par Moldover et Cahn (Physical Review Letters, 1986). Pour la sixième image, l'observation est effectuée en contraste interférentiel différentiel.
Les échantillons sont obtenus à partir d'une solution de Beta-lactoglobuline (une protéine du lait) dans l'eau, utilisée telle quelle (sixième image) ou déposée sur une l'
surface activée par une irradiation UV sous oxygène (les cinq autres images). Cette solution forme un gel dont la croissance est gouvernée par le pH de la solution, contrôlé pendant l'expérience. Cet exemple illustre la possibilité de suivre, contrôler et maîtriser les processus de gélification et plus généralement d'agrégation et de cristallisation de protéines ou autres produits, ce qui est particulièrement avantageux dans le domaine de agro-alimentaire, notamment pour la mise au point de procédés et le contrôle de fabrication (texture des glaces, des fromages, des crèmes, des yoghourts, etc.). Le même intérêt existe dans le domaine des cosmétiques où la maîtrise des textures est également importante. Le procédé d'observation est ici une alternative à la microscopie confocale. Les images montrent les structures formées à différents instants par la Beta-lactoglobuline dans une solution (image 6 de la figure 8) ou après évaporation d'une solution (autres images de la figure 8).
Exemple 9 : Application du composant optique selon l'invention pour l'étude et le contrôle de nanotubes.
La figure 9A représente une image obtenue avec un exemple de système d'analyse pour l'étude et le contrôle de nanotubes. Cette image a été obtenue après synthèse CVD et montre un nanotube multiparois isolé avec à son extrémité la nanoparticule catalytique.
Les nanotubes peuvent être synthétisés de différentes façons. En fonction de la méthode choisie et des conditions différents résultats sont obtenus allant de nanotubes multiparois bien alignés ou s'enchaînant les uns aux autres à des nanotubes monoparoi individuels ou enchevêtrés. Des résidus de catalyse s'ajoutent à ces mélanges. Le procédé d'analyse selon l'invention permet de discriminer tous ces différents types de nanotubes. Parmi ces procédés figure la CVD (chemical vapor déposition) gui permet une synthèse par croissance sur une surface à partir d'une nanoparticule de catalyseur ou d'un défaut nanométrigue.
Il est important pour optimiser et contrôler cette fabrication de suivre en direct la croissance du nanotube et le positionnement relatif du nanotube et du catalyseur à chague étape de ce processus. La technigue le permet. Il faut alors travailler dans l'enceinte à vide de l'appareil CVD, ce gui est possible compte tenu de la simplicité de notre technigue. Un petit microscope interférentiel peut être implanté sur l'enceinte. Un autre procédé de fabrication de nanotubes est l'ablation laser. Notre technigue permet de visualiser in situ le résultat de cette ablation.
Un autre procédé de fabrication est l'arc électrigue. Ce procédé se caractérise par une grande dispersité des nanotubes fabrigués. Notre technigue permet de regarder et en même temps de trier avec un AFM des nanotubes déterminés.
Pour cela, la surface supérieure doit être libre pour la micromanipulation. On choisit donc de travailler avec un composant « face arrière » sur un microscope inversé. Ce composant a les caractéristigues suivantes : il est composé d'un substrat en verre floatté de 1 milimètre d'épaisseur recouvert sur une seule face d'une couche de chrome de 5,3 nanomètres d'épaisseur et d'une couche d'oxyde de chrome (CrO2) de 6 nanomètres d'épaisseur. Le substrat s'utilise en réflexion sur la face recouverte et s'attague avec la lumière par l'autre face. La surface utile s'observe donc a travers le verre. II est avantageux d'effectuer cette observation en immersion dans l'huile afin de supprimer la lumière parasite provenant des réflexions sur la face de verre.
Selon la finalité de l'observation, La surface peut s'utiliser avec ses propriétés naturelles (de haute énergie pour un dépôt direct avec un ancrage fort des tubes sur la surface, à des fins contrôle, de comptage ou de repérage pour des études spectroscopiques par exemple) ou recouverte d'une fine pellicule d'un polymère amorphe tel que le polydimethylsiloxane ou encore recouverte d'une couche greffée par une opération de chimie de surface en phase vapeur (pour un dépôt par peignage à partir d'une solution pour des opérations de micromanipulation) .
La figure 9B représente la détection de nanotubes de carbone de forme rare au milieu d'objets intéressants. Cette image, dont la grande dimension est de 200 microns, a été obtenue en immersion et en contraste interférentiel avec le support N°16 (de la figure 2B) . Elle a été ensuite modifiée par une silanisation à l'aide d'un octadecyl-trichlorosilane dans le toluène après activation UV+02 de la surface.
Les nanotubes visualisés sur la figure 9B ont été préalablement stabilisés dans une solution aqueuse avec des surfactants de SDS (sodium dodecyl sulfate). L'interaction entre les surfactants et la couche de silane est favorable au dépôt dispersé de nanotubes bien séparés.
Exemple 10 : Suivi de la croissance d'une population bactérienne.
La figure 10 représente une image, dont la grande dimension est 159 microns et qui a été obtenue en immersion et en contraste interférentiel avec le support N°16 (de la figure 2B), utilisé avec ses propriétés naturelles de surface. Il présente en effet une affinité importante pour les bactéries. Ce composant, associé à une observation en contraste interférentiel, permet de suivre l'évolution d'une population bactérienne qui se développe sur la surface.
Les réseaux polymérisés tissés par les bactéries sur la surface ne sont pas visibles sur cette image à cause du réglage du contraste, effectué par le choix du composant, mais sont visualisables avec le composant N°13 (de la figure
2B) .
Les bactéries sont des Eschérischia coli. Le procédé permet la détection d'une croissance bactérienne.
Des composants possédant une affinité spécifique pour une bactérie permettent un contrôle environnemental fin, en particulier dans le domaine alimentaire.
Exemple 11 : Dispositif de contraste différentiel.
La figure HA représente un dispositif de contraste différentiel selon l'invention. Un dispositif d'imagerie d'un échantillon (E) en contraste interférentiel par réflexion comporte une source lumineuse (S) ; un objectif (O) ; un dispositif d'imagerie de la source lumineuse au voisinage de la pupille de l'objectif (L) ; au moins un élément polarisant (P,A) ; un élément séparateur de polarisations (W) ; un miroir semi-transparent (M) . On peut aussi ajouter des filtres de couleur (FC) à tout endroit entre (S) et (OC) ou (C). Le miroir (M) peut être lui-même dichroïque.
Il peut comporter de plus : un élément compensateur (C) ; une lentille de tube (LT) ; un/des oculaire(s) (OC) ; une caméra (CAM) ; une lame retard à lambda/4 (L/4) ; une autre lame retard (LR) ; un compensateur (COMP). L'élément W introduit un décalage latéral entre 2 polarisations linéaires dans une direction située à 45° des axes X et Y. C'est par exemple un biprisme de Wollaston. La caméra ou le dispositif oculaire se placent après (M) . La lentille de tube éventuelle se place entre (M) et (C) ou (OE) .
La figure 11B représente des différentes configurations de dispositif de contraste différentiel.
Exemple 12 : Système d'observation et de mesure entre polariseurs croisés.
Un système d'observation d'un échantillon (E) entre polariseurs croisés sans contraste interférentiel est moins contraignant que le système décrit dans l'exemple précédent. Le système L n'est plus indispensable. Le système W est absent.
Tout le reste de la description précédente reste valable.
La figure 12 représente un système de mesure sans imagerie entre polariseurs croisés.
Ce système est un monocapteur (la surface fonctionnelle est homogène ; il n'y a plus d'imagerie). II comporte : une source faiblement convergente (S+L) ; un capteur (CAP).
Il présente l'avantage d'être miniaturisable (exemple : source = diode lumineuse ; capteur = diode photovoltaïque) .
Exemple 13 : Interaction d'un brin d'ADN avec des objets biologiques ou physico-chimiques.
La figure 13A représente une zone rectangulaire de la surface du composant d'une longueur de 200 microns. Le composant est obtenu par modification de la surface du composant N°7 (de la figure 2B) par un hydroxyde de césium.
Une goutte d'une eau distillée croupie pendant plusieurs semaines est déposée sur la surface ainsi modifiée. Des cellules (non identifiées) sont visualisées et l'
déposées sur le bord de la goutte pendant évaporation de l'eau, qui laisse par ailleurs une couronne périphérique sur la surface qui sont attribués à des ions positifs et préférentiellement divalents tels que du calcium. L'échantillon ainsi formé est soumis à une succession de chocs thermiques alternatifs à -15°C et + 300C. La cellule éclate et la chromatine s'en extrait.
L'image 13A montre dans sa partie gauche le résidu cellulaire. L'échantillon est maintenu dans une atmosphère humide. Une partie de la chromatine se déroule progressivement sur la surface (vers la droite) tandis qu'une autre partie reste compacte et semble former des chromosomes condensés (à gauche du résidu).
La partie étirée correspond à un chromosome déplié dont l'épaisseur est de l'ordre de 30 nanomètres. Les deux brins du chromosome sont nettement visibles et sont liés par un pont (tache blanche commune aux brins vers la droite de l'image) qui évoque clairement un centromère.
L'association des brins avec des objets biologiques, peut-être des histones ou autres grosses protéines, est nettement visible, ainsi que leur affinité pour un film très mince, peut-être d'eau salée ou de protéines autour de leur point de séparation.
Dans la région où les brins sont séparés, la symétrie des motifs le long des deux brins est frappante. Ces motifs révélant des associations avec d'autres objets de très petite dimension, cette symétrie illustre la spécificité des sites concernés par ces associations et illustre la possibilité d'utiliser le procédé à des fins de diagnostic. La symétrie de leur association avec le film mince qui recouvre aussi l'espace inter-brin (adsorption) illustre les possibilités de test ou diagnostic sur une molécule d'ADN au moyen d'agents physico-chimiques. La figure 13B représente la grande dimension de 100 microns de l'image précédente, prise sur le même système avec un plus fort grossissement. On y reconnaît plus nettement les chromosomes encore compactés. L'objet brillant situé le plus haut présente des bandes colorées peu contrastées qui permettent en principe de l'identifier.
La figure 13C représente les deux images qui ont une longueur de 100 microns et sont obtenues dans les mêmes conditions que précédemment. Elles illustrent la possibilité de sonder des interactions entre molécules d'ADN partiellement décompactées (diamètres 10 et 30 nm selon brillance) avec des objets biologiques variés (ici non identifiés) .
Les deux images de la figure 13D représentent deux molécules d'ADN décompactés obtenues en procédant de la même manière avec une solution salivaire humaine très diluée.
Les interactions entre cet ADN issu d'une seule cellule et des objets biologiques variés sont nettement visibles. Le procédé permet d'effectuer des diagnostics génétiques à des fins de diagnostic ou d'analyse, par exemple de séquençage. Il présente l'énorme avantage d'économiser l'amplification PCR, et ceux d'autoriser l'économie de marqueurs fluorescents, de pouvoir être mis en œuvre très facilement et de renseigner beaucoup mieux : non seulement on peut savoir quelle association se produit mais aussi où elle se produit le long du brin. Pour ces raisons, la technique est une alternative avantageuse aux techniques FISH (développées par exemple à l'Institut Pasteur par Aaron Bensimon).
Exemple 14 : Procédé de diagnostic sur une cellule permettant d'identifier les récepteurs et protéines membranaires présents dans sa membrane. Cet exemple est illustré par les figures 14A, 14B et 14C. La grande longueur de l'image 14A est de 200 microns. L'observation est faite en contraste interférentiel. Le composant est le composant N°7 (de la figure 2B). Sa surface a été rendue hyper-hydrophile par une exposition à un éclairage UV issu d'une lampe à décharge avec une forte composante à la longueur d'onde de 240 nanomètres.
Une solution très diluée d'une salive humaine a été diluée dans un verre d'eau (à 1 volume pour 10 000 environ) et une goutte de cette solution a été déposée sur la surface du composant. Les cellules eucaryotes contenues dans la solution ont fortement adhéré à cette surface et la membrane cellulaire, une bicouche dont les parties externes sont hydrophiles, s'est écrasée sur la surface (disque clair) autour du noyau (amas sombre).
L'évaporation de l'eau a ensuite augmenté la force ionique du liquide intracellulaire et ouvert les parois de la membrane nucléaire. La chromatine (amas coloré) s'extrait alors du noyau pour occuper l'espace entre les deux bicouches, encore gonflé de liquide comme le montre l'éclaircissement du disque dans sa partie inférieure droite.
De nombreux objets intracellulaires ou membranaires sont visibles sur le reste du disque, et tous les récepteurs membranaires et transmembranaires sont accessibles pour des diagnostics.
Le procédé décrit dans cet exemple permet donc toutes les opérations impliquant des ligands de ces objets accessibles. Ces ligands peuvent directement détecter ou eux-mêmes être nantis de marqueurs stériques ou fluorescents. Le procédé permet l'identification et la localisation des récepteurs adressés.
Les deux images de la figure 14B montrent des cellules analogues obtenues dans les mêmes conditions à un stade plus précoce (image de gauche) et à un stade plus tardif (image de droite) du processus.
L'échantillon correspondant à l'image de droite a fait l'objet de chocs thermiques successifs à — 200C et + 2O0C en atmosphère humide, conduisant au dépliement de la chromatine sur la surface.
L'image 14C, obtenue avec les mêmes réglages, la même procédure et les mêmes composants que la précédente illustre l'intérêt de ces observations pour l'étude des mécanismes cellulaires : ici une cellule au stade anaphase d'une mitose.
On voit clairement les deux noyaux (gros objets à gauche et à droite du disque) et les amas de chromosomes (étalés aux extrémités du plan équatorial) . Au centre, des traces des manchons. Le procédé permet l'étude de mécanismes cellulaires et la détection d'anomalies fonctionnelles ou structurelles.
Exemple 15 : Observation d'une solution d'ADN en immersion.
Le présent exemple est dédié à l'observation d'une solution d'ADN en immersion à des fins d'analyse et de diagnostic. L'image 15A, correspondant à une fenêtre observée de longueur totale 159 microns, est obtenue en contraste interférentiel et en immersion. La solution est une solution d'ADN de cerveau de rat et le composant est le N°15 (figure 2B) .
L'Adsorption de l'ADN sur l'oxyde d'Ytrium résultant d'un dépôt par CVD (chemical vapor déposition) est spontanée. Cet ADN est associé en solution a de nombreux objets biologiques dont la dimension varie de quelques nanomètres à quelques microns. Ces associations sont révélées par l'adsorption des molécules d'ADN sur la surface, qui apparaissent comme des fils associés à des objets dont les plus petits qui ont un diamètre de quelques nanomètres apparaissent sphériques.
L'association en solution et la révélation par une surface adsorbante est un exemple de procédé de diagnostic que le composant permet de mettre en œuvre.
L'image 15B du même système est obtenue après plusieurs heures d'incubation montre des associations de surfactants contenus dans la solution initiale avec certaines régions des molécules adsorbées. Les mécanismes de diffusion brownienne gouvernent la cinétique de ces associations, qui peuvent être accélérées par une agitation mécanique ou un flux hydrodynamique.
Cet exemple illustre la possibilité d'effectuer des tests basés sur des associations physico-chimiques à l'interface entre le composant et une (des) solution(s).
Exemple 16 : Examen et reconnaissance de chromosomes, diagnostic direct sur chromosomes.
Le présent exemple démontre l'application du procédé selon l'invention à l'analyse de chromosomes. Les images de la figure 16 ont une longueur de 100 microns. L'image de gauche est obtenue par observation de l'échantillon entre polariseur et analyseur croisés et l'image de gauche est obtenue en contraste interférentiel différentiel de Nomarski.
Les deux principaux objets visualisés sur la figure 16 sont des chromosomes étirés provenant probablement d'une cellule au stade d'une pré-métaphase dans la mitose.
Un avantage du procédé d'alalyse selon l'invention est qu'il ne nécessite pas de blocage d'une phase mitotique particulière puisque les objets extraits des différentes cellules sont immédiatement reconnus.
Une analyse directe, par exemple à des fins de diagnostic, est rendu possible par l'observation des bandes colorées qui apparaissent sans marquage et donc sans destruction des objets. Un autre avantage est qu'un petit nombre de cellule suffit à mettre en œuvre l'observation.
Un autre avantage est qu'aucun procédé de filtrage, de blocage ou de réplication n'est nécessaire. La bonne correspondance entre les bandes colorées et les bandes obtenues par des procédés de marquage classiques a été vérifiée. Le chromosome est un chromosome humain. La lampe d'éclairage est une lampe xénon. L'image de gauche (figure 16) montre nettement les bandes colorées et l'image de droite fait apparaître les deux brins du chromosome et le centromère au niveau de la cassure dans la forme de l'objet.
Exemple 17 : Visualisation de marqueurs stériques. L'image de la figure 17, obtenue en contraste interférentiel différentiel, a une grande dimension de 15 microns et montre une population de billes d'or colloidal d'un diamètre majoritaire de 20 nanomètres déposées sur le composant N°7 (figure 2B) à partir d'une solution. Le composant a été rendu hydrophobe par un dépôt d'HDMS en phase vapeur, ce qui permet une bonne dispersion de la suspension déposée par déplacement d'une goutte sur la surface à l'aide d'une pipette pasteur, une technique proche du peignage que nous pratiquons. Dans ce procédé, la vitesse de la goutte parallèlement au support est de l'ordre de 1 millimètre par seconde. Cette expérience illustre la capacité du procédé d'analyse à visualiser des marqueurs stériques d dimension très petite. Des marqueurs 10 fois plus petits peuvent encore être visualisés de la même façon et en utilisant le même composant. Exemple 18 : Importance des propriétés d'affinité de la surface.
Les deux images de la figure 18A, dont la grande dimension est de 200 (gauche) et 100 (droite) microns respectivement, montrent sur un composant N°7 (selon la figure 2B) (à gauche), et N°7 modifié par une silanisation (à droite) l'impact de l'affinité de la surface sur la structure de monocouches de surfactants cationiques (SDS à 0,1 %) . Les surfactants ont été déposés par évaporation à partir d'une solution très diluée dans l'eau distillée. Lorsque la surface est hydrophobe (à gauche), les couches sont régulières bien que trouées (monocouche dans la partie en haut à gauche) ou non (tricouche dans la partie en bas à droite), suggérant un désordre de position des molécules comme dans un état liquide.
Lorsque la surface est hydrophile (à droite), les couches forment des domaines facettés qui révèlent un ordre cristallin. Un comportement analogue est observé avec des surfactants anioniques comme HAC (hexodecyltrimethylammonium chloride à 5%) .
A titre d'exemple, l'image 18B à gauche, prise dans les même conditions, montre les structures cristallines obtenues sur le composant hydrophile. Nous sommes cependant dans un cas intermédiaire ou l'ordre moléculaire à l'intérieur des couches est compatible avec une structure pleine et régulière de bicouches sur plusieurs étages, comme le montre la figure 18B de droite , prise dans les mêmes conditions.
Exemple 19 : Bicouches phospholipidiques.
L'image 19 dont la grande dimension est de 153 microns, montre une bicouche de phospholipides sur un composant N°16 (figure 2B) après irradiation UV sous oxygène.
La bicouche a été obtenue par dépôt d'une très faible quantité solution de liposomes de DPPC, un phospholipide de référence. Le dépôt est réalisé par contact direct (à la fois solide et liquide) entre un spotteur manuel de 100 microns de diamètre trempé dans la solution et le composant.
L'observation est ensuite effectuée dans l'eau en contraste interférentiel. L'observation montre la présence d'une bicouche très régulière (sauf en haut à gauche) et très stable dans l'eau. Une telle bicouche peut constituer un spot d'une biopuce à protéines.
La technique de dépôt est de plus compatible avec l'utilisation de spotteurs automatisés, et la bicouche peut accueillir toute sorte de récepteurs introduits préalablement par mélange dans la solution de DPPC, les récepteurs s'intégrant alors aux bicouches des liposomes. A chaque spot peut correspondre une solution différente contenant des récepteurs déterminés après l'usage de la biopuce.
Exemple 20 : Caractérisation et contrôle d'une suspension de liposomes.
Les liposomes sont des vésicules (des sacs) dont la membrane est une bicouche de phospholipides. Ils sont employés pour la vectorisation de produits actifs dans les domaines cosmétiques et pharmaceutiques, les sacs sOuvrant au contact de la cible.
Il est important d'étudier et de contrôler leur comportement au contact de la cible, qui est caractérisée par ses propriétés de surface, le contact du liposome et de la cible se faisant par leur surface.
La présente invention permet cette étude et ce contrôle. Les propriétés de surface du composant doivent alors reproduire celles de la cible. II est également important de caractériser la distribution de tailles des liposomes, car elle peut évoluer avec le temps ou les conditions de stockage.
A cette fin, on peut ajuster l'interaction entre les liposomes et la surface du composant en réglant ses propriétés de surface.
Une interaction favorable conduit :
- soit à l'éclatement des liposomes sur la surface, chaque liposome devenant une flaque qui peut être une bicouche ou une monocouche. C'est particulièrement intéressant lorsque le diamètre d du liposome est légèrement inférieur à la résolution r du système d'observation, car le diamètre de la flaque (disque) est 2 fois celui du liposome (sphère) . Pour d > r/2, la flaque est résolue ;
- soit à la formation d'hémi-liposomes sur la surface. Chaque liposome apparaît en contraste interférentiel comme un point dont l'intensité lumineuse et/ou la couleur sont fonctions de son diamètre. La même proposition s'applique aux « flaques » de diamètre inférieur à r/2.
La comparaison avec des systèmes calibrés permet alors facilement de caractériser la distribution. Dans cette application, les propriétés de la surface doivent être très homogènes pour que l'interaction des liposomes avec la surface soit partout identique.
La grande dimension de l'image 2OA est de 159 microns. L'observation est faite en contraste interférentiel en immersion. Les liposomes de nature inconnue sont des objets provenant de l'industrie cosmétologique. Les liposomes s'adsorbent spontanément sur le composant dont la surface est très homogène sous forme d'hémi-liposomes, c'est-à-dire de d'hémisphères posées sur la surface. L'angle de contact des objets sur la surface est constant et très proche de 90°. Les points brillants correspondent à des objets d'un diamètre de 50 nanomètres.
Un agrandissement d'un facteur de l'ordre de 10 de l'image 2OB montre comment la taille des liposomes affecte leur aspect. Les billes d'un diamètre à peine inférieur à 100 nanomètres apparaissent comme des taches très lumineuses d'un diamètre apparent comparable à la résolution du microscope utilisé, soit environ 300 nanomètres. Une autre population d'objets beaucoup plus petits, d'un diamètre de l'ordre de 10 nanomètres, prend l'apparence de taches d'un diamètres comparable à celui des précédentes, mais d'une luminosité très inférieure. La suspension est donc essentiellement bidisperse.
Le composant permet d'établir un lien exploitable entre les taille des objets et leur aspect (calibration) , puis de suivre l'évolution de la distribution d'objets dans la solution, avec les conditions et la durée de stockage, par exemple. Cette application et très avantageuse car elle permet une caractérisation directe et simple à mettre en œuvre d'objets observés individuellement, alors que les techniques disponibles, basées sur la diffusion de lumière (scatterométrie) , ne permettent d'accéder qu'à des quantités moyennées sur toute la population.
Ce procédé d'étude, de caractérisation et de contrôle s'applique également à des mousses. Le même procédé s'applique aux émulsions, microémulsions, micelles, tubules, microtubules et toutes structures auto-assemblées de surfactants, citons par exemple les copolymères diblocs.
Exemple 21 : Procédé d'analyse d'un objet situé à la surface où à la proximité de la surface d'un liquide, ou à l'interface entre deux liquides, où une ou plusieurs couche(s) d'indice est (sont) constituée(s) par le(s)dit liquide(s) . Observation de couches ou d'objets situés à la surface ou au voisinage de la surface d'un liquide (couches de Langmuir, composés adsorbés à l'interface liquide/air), et suivi des interactions de ces couches ou de ces objets avec des agents extérieurs grâce à un composant optique selon l'invention utilisé dans le montage illustré par la figure 21
L'épaisseur e peut être ajustée grâce au dispositif suivant. Un dispositif mécanique ou piézoélectrique ou la variation du niveau de la couche de Langmuir permettent d'amener le composant optique à une position h avec une précision de l'ordre du nanomètre.
L'épaisseur e du film résulte d'un équilibre entre pression de disjonction et gravité. Un ajustement de h permet d'ajuster e avec une précision de l'ordre de quelques nanomètres, de manière à obtenir un contraste maximal.
Selon un principe similaire, il est possible d'utiliser un film d'huile à la surface de l'eau, et d'ajuster l'épaisseur dudit film de manière à obtenir un contraste maximal. Tout autre couple de liquides non miscibles est également utilisable.

Claims

REVENDICATIONS
1 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon, comportant un substrat et au moins une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées, destinée à faire apparaître un contraste élevé d'intensité ou de couleur pour des variations de chemin optique, des reliefs, des épaisseurs et des diamètres nanométriques lorsqu'il est observé par réflexion en lumière incohérente convergente autour de l'incidence normale dans des conditions d'extinction de polarisation caractérisé en ce que la couche d'indice supérieure présente des propriétés de surface spécifiques lui conférant une affinité sélective par rapport à au moins une caractéristique de l'échantillon.
2 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon est observé entre un polariseur et un analyseur croisés situés de part et d'autre du composant optique le long du trajet utile de la lumière.
3 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon la revendication 1 caractérisé en ce que l'échantillon est observé en contraste interférentiel différentiel.
4 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon la revendication 1 caractérisé en ce que lesdites propriétés de surface présentent des caractéristiques d'affinité variant en fonction des coordonnées sur la surface du composant.
5 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les caractéristiques optiques du composant varient en fonction des coordonnées de la zone considérée sur la surface du composant.
6 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon la revendication 4 et 5 caractérisé en ce que les variations des caractéristiques optiques du composant et les variations des propriétés de surface sont corrélées.
7 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une au moins des revendication 4 à 6 caractérisé en ce que lesdites variations forment un gradient selon une direction au moins du composant optique.
8 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une au moins des revendication 4 à 6 caractérisé en ce que lesdites variations sont brutales, délimitant ainsi des domaines nettement séparés sur la surface.
9 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une au moins des revendication 4 à 8 caractérisé en ce que lesdites variations constituent un pavage régulier de la surface.
10 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une au moins des revendication 4 à 9 caractérisé en ce que lesdites variations constituent un réseau matriciel.
11 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le composant porte aussi des repères visibles permettant d'identifier et de retrouver une zone particulière.
12 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont les propriétés naturelles de la couche d'indice supérieure.
13 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues en une ou plusieurs étapes par réaction chimique de composés avec la surface de la couche d'indice par un greffage chimique covalent ou par un greffage électrostatique de touts objets moléculaires ou macromoléculaires chargés tels que, polyélectrolytes, électrolytes, protéines, dendrimères.
14 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par une modification physique de la couche d'indice telle que l'application d'un faisceau de particules ou d'un faisceau électromagnétique, une action mécanique, acoustique, thermique, électrique ou magnétique, une érosion, un dépôt sélectif, un traitement plasma, une métallisation, une variation de pression, l'application d'un jet liquide, un dépôt d'encre, de fumées, de poudres, de couches sous forme liquide, un contact solide.
15 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par une modification physico-chimique en phase gazeuse, liquide ou solide de la couche d'indice telle que gonflement, dégonflement, dissolution, polymérisation, adsorption, mouillage, capillarité, condensation, effet électrostatique, évaporation, cristallisation, dépôt, électrodéposition, électrochimie, électropolymérisation, démixtion, auto-assemblage, dip-coating, spin-coating, micro-contact printing, transfert de Langmuir-Blodgett, en une ou plusieurs étapes par une combinaison de ces modifications.
16 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface consistent en une variation de la température ou résultent d'une variation de la température imposée à l'échantillon.
17 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface consistent en ou résultent d'un éclairage par un faisceau de lumière annexe.
18 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface consistent en une variation de la pression ou résultent d'une variation de la pression.
19 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface consistent en une variation de la nature chimique de la surface, de la composition de la surface, de la rugosité de la surface, d'altitude de la surface, de coefficient de réflexion, d'un potentiel sur la surface, d'une pression hydrostatique, d'une pression osmotique, de susceptibilité linéaire ou non linéaire de polarisabilité, coefficient d'absorption lumineuse, susceptibilité magnétique, perméabilité, coefficient diélectrique, susceptibilité Raman, pouvoir rotatoire, conduction thermique, conduction électrique, indice optique, d'une densité de courant électrique, thermique, ionique, hydrodynamique ou consistent en une anisotropie de l'une quelconque de ces propriétés.
20 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par application à l'échantillon d'un champ extérieur pendant tout ou partie de l'observation tel que le champ thermique, lumineux, électrique, magnétique, électromagnétique, hydrodynamique, aérodynamique, exposition à un faisceau ou à un environnement particulier.
21 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par l'apport d'une couche biologiquement active ou par une modification biologique ou biochimique de la couche d'indice ou sur la couche d'indice par une fixation par une adsorption, un greffage ou un dépôt de structures membranaires sous forme de monocouches de bicouches ou de multicouches, pures ou chargées d'objets membranaires, par éclatement de vésicules ou de liposomes ou d'extraits de membranes cellulaires, par une fixation de macromolécules biologiques, par une fixation de protéines directe ou par greffage de complexes amphipoIs-protéines membranaires, par une fixation de ligands, par une fixation d'anticorps ou d'antigènes, par une fixation de cellules, par lyse ou par adhésion cellulaire, par une fixation de composants cellulaires résultant d'une destruction de cellules, par une fixation de chromatine et de chromosomes dans tous leurs états de compaction, par une fixation directe de chromosomes, par une fixation d'ADN ou d'ARN, par peignage moléculaire ou par greffage ou par incubation, par fixation de virus ou de bactéries, par fixation d'agents anti-viraux ou anti-bactériens, par fixation de récepteurs membranaires sur une bicouche déjà fixée, par fixation de polysaccharides, par fixation de cytosquelettes ou d'éléments du cytosguelette, par fixation de microtubules, de tubuline ou de myosine, par fixation de fibres de cellule végétal, de fibres de chitine, de fibres de chitosane, de fibres de cellulose et par toute combinaison de ces différentes fixations.
22 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par le dépôt d'une couche de polymères biologiquement actifs, tels que polyosides, polylysine, polypyrole, polyéthylène glycol, polydiméthylsiloxane.
23 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface sont obtenues par une combinaison quelconque de différentes opérations physiques, chimiques, physico-chimiques, biochimiques, biologiques.
24 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que les propriétés de surface confèrent des propriétés sélectives d'interactions intermoléculaires.
25 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon la revendication 23 caractérisé en ce que les propriétés sélectives permettent la reconnaissance et/ou la fixation sélective et/ou préférentielle d'objets d'intérêt ou d'objets prédéfinis tels que les protéines, peptides, acides aminés, anticorps, antigènes, médicaments, polysaccharides, lipides, liposomes, vésicules, toxines, produits métaboliques, molécules de synthèse, molécules aromatiques, fibres, filaments, molécules d'ADN, d'ARN, chromosomes, cellules, extraits cellulaires, bactéries, virus, plots d'une biopuce, vrais et faux hybrides de ces plots, environnement de ces plots, vrais et faux hybrides de cet environnement, structures micellaires, composants de micromanipulation, composants microfluidiques, complexes organiques, complexes inorganiques, complexes organiques- inorganiques, amibes, marqueurs fluorescents, marqueurs stériques, agrégats, amas et clusters, condensats, gouttes de condensation, colloïdes, particules colloïdales, complexes métalliques, agents de pollution, poudres, fumées, gaz, fibres d'amiantes, nanotubes, nanofils, nanoparticules, dendrimères, boîtes quantiques, argiles, feuillets, vapeurs organiques, zéolithes, sels, particules chargées, contre- ions, solutés, tensioactifs, surfactants, catalyseurs, résidus de réactions chimiques, précipités, cristaux, notamment cristaux bidimensionnels, cristaux de protéines et cristaux bidimensionnels de protéines, cristaux de lipides, cristaux minéraux, cristaux de graisses, cristaux de sucres, cristaux de polymères, cristaux de sels ou toutes combinaisons de ces différents objets. 26 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que l'association dudit composant avec un échantillon observé constitue une alternative ou un élément de couplage aux traçages des échantillons à l'aide des techniques de radiomarquage, de spectroscopie, de spectroscopie Raman, de spectroscopie infra-rouge, ultra-violet ou visible, de fluorescence, de marquage enzymatique, de spectrométrie de masse, de détecteur piézoélectrique, de détecteur ampérométrique, de détecteur à ondes acoustiques de surface, de résonance des plasmons de surface, de profilométrie, de microscopies à champ proche, de microscopie à force atomique, d'ellipsométrie.
27 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce qu'il est fixé sur le fond d'une boîte de Pétri.
28 - Composant optique pour l'observation d'un échantillon selon l'une quelconque des revendications précédentes caractérisé en ce que le substrat constitue le fond d'une boîte de Pétri.
29 - Procédé d'analyse d'échantillon mettant en œuvre un composant optique conforme à l'une au moins des revendications précédentes, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une étape de mise en contact de l'échantillon à étudier avec la surface d'affinité sélective dudit composant, et au moins une étape d'observation directe et en temps réel du composant ainsi préparé avec un équipement comportant une source lumineuse incohérente convergente autour de l'incidence normale, et un ensemble permettant l'observation de l'échantillon en lumière polarisée dans des conditions d'extinction, et éventuellement une étape d'enregistrement de l'image ainsi observée.
30 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comporte un ensemble formé par un polariseur et un analyseur croisés situés de part et d'autre du composant optique le long du trajet utile de la lumière.
31 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte un dispositif séparateur de polarisations tel qu'un biprisme de Wollaston ou un dispositif de Nomarski et en ce que l'échantillon est observé en contraste interférentiel différentiel.
32 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte une source lumineuse polychromatique.
33 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte une source lumineuse monochromatique.
34 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte une source lumineuse visible.
35 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte une source lumineuse partiellement visible. 36 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que l'équipement comporte une source lumineuse non visible.
37 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de l'identification d'une zone particulière de l'image grâce aux repères visibles sur le composant.
38 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et une comparaison de ces valeurs avec des valeurs prédéterminées.
39 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce qu'il comporte une étape d'analyse des caractéristiques de l'image réalisant un filtrage de l'image en fonction de seuil de luminosité et/ou une mesure de la position et de l'intensité des éléments dépassant ledit seuil de luminosité en fonction des positions le long de la surface.
40 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 39 caractérisé en ce qu'il s'agit d'une analyse de la courbe de l'intensité en fonction de la longueur d'onde de chaque point ou partie de l'image pour l'ensemble des longueurs d'onde présentes dans le spectre de l'éclairage.
41 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 39 caractérisé en ce qu'il s'agit d'intensité d'une image monochromatique ou d'un filtrage ou d'une projection monochromatique d'une image colorée.
42 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 39 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de comparaison dans les mêmes conditions d'observation de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et de celles d'un échantillon de référence dont les caractéristiques sont connues.
43 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que tout ou partie de la mise en contact est réalisée par évaporation de l'échantillon.
44 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que tout ou partie de la mise en contact est réalisée par immersion en phase liquide.
45 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 44 caractérisé en ce que tout ou partie de la mise en contact est réalisée par lavage.
46 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 44 caractérisé en ce que la mise en contact comporte au moins une étape de rinçage.
47 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 44 caractérisé en ce que la mise en contact comporte au moins une étape d'incubation. 48 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que la mise en contact comporte en plus une étape de séchage.
49 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que tout ou partie de la mise en contact est réalisée par contact solide.
50 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 49 caractérisé en ce que tout ou partie de la mise en contact est réalisée par contact printing.
51 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce qu'il comporte en outre une ou plusieurs étapes de préparation de l'échantillon et/ou une étape d'incubation et/ou une étape d'immersion et/ou une étape de rinçage et/ou une étape de séchage puis une étape d'observation à sec.
52 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de détection et/ou de reconnaissance et/ou d'analyse grâce à l'utilisation de marqueurs stériques à la place de marqueurs fluorescents, lesdits marqueurs étant eux-mêmes attachés à un objet capable d'assurer une fonction de reconnaissance.
53 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 52 caractérisé en ce que le diamètre de ces marqueurs stériques est inférieur à 100 nanomètres et de préférence inférieur à 50 nanomètres. 54 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que l'association du composant avec un échantillon observé constitue une alternative ou un élément de couplage aux traçages des échantillons à l'aide des techniques de radiomarquage, de spectroscopie, de spectroscopie Raman, de spectroscopie infra-rouge, ultra-violet ou visible, de fluorescence, de marquage enzymatique, de spectrométrie de masse, de détecteur piézoélectrique, de détecteur ampérométrique, de détecteur à ondes acoustiques de surface, de résonance des plasmons de surface, de profilométrie, de microscopies à champ proche, de microscopie à force atomique, d'ellipsométrie.
55 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que l'association du composant avec un échantillon observé constitue une alternative aux traçages des échantillons à l'aide de marqueurs stériques de dimensions supérieures ou de nature imposée.
56 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 42 caractérisé en ce que l'interaction d'une cible portant un marqueur stérique et de l'échantillon observé constitue une alternative aux traçages des échantillons à l'aide de marqueurs stériques de dimensions supérieures.
57 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une au moins des revendications 29 à 42 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de reconnaissance et/ou la fixation sélective et/ou préférentielle d'objets d'intérêt ou d'objets prédéfinis tels que les protéines, peptides, acides aminés, anticorps, antigènes, médicaments, polysaccharides, lipides, liposomes, vésicules, toxines, produits métaboliques, molécules de synthèse, molécules aromatiques, fibres, filaments, molécules d'ADN, d'ARN, chromosomes, cellules, extraits cellulaires, bactéries, virus, plots d'une biopuce, vrais et faux hybrides de ces plots, environnement de ces plots, vrais et faux hybrides de cet environnement, structures micellaires, composants de micromanipulation, composants microfluidiques, complexes organiques, complexes inorganiques, complexes organiques- inorganiques, amibes, marqueurs fluorescents, marqueurs stériques, agrégats, amas et clusters, condensats, gouttes de condensation, colloïdes, particules colloïdales, complexes métalliques, agents de pollution, poudres, fumées, gaz, fibres d'amiantes, nanotubes, nanofils, nanoparticules, dendrimères, boîtes quantiques, argiles, feuillets, vapeurs organiques, zéolithes, sels, particules chargées, contre- ions, solutés, tensioactifs, surfactants, catalyseurs, résidus de réactions chimiques, précipités, cristaux, notamment cristaux bidimensionnels, cristaux de protéines et cristaux bidimensionnels de protéines, cristaux de lipides, cristaux minéraux, cristaux de graisses, cristaux de sucres, cristaux de polymères, cristaux de sels ou toutes combinaisons de ces différents objets.
58 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une au moins des revendications 29 à 42 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de détection d'objets de toutes natures associés à une molécule d'ADN simple ou double brin posé sur ou à proximité d'une surface.
59 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une au moins des revendications 29 à 42 caractérisé en ce qu'il comporte une étape de formation de clusters nanométriques ou micrométriques sur des sites appartenant à des objets physiques, chimiques, physico-chimiques ou biologiques suivie d'une étape de détection et/ou d'observation de ces structures.
60 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 59 caractérisé en ce qu'il s'agit de clusters de sels dont la formation dépend du procédé d'incubation, de lavage, de rinçage et/ou de séchage.
61 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 59 caractérisé en ce qu'il s'agit de clusters d'impuretés ou d'agents biologiques tels que des protéines, d'impuretés ou d'agents physiques tels que des agrégats, d'impuretés ou d'agents chimiques tels que des réactifs ou des produits de réactions ou d'impuretés ou d'agents physico-chimiques tels que des précipités ou des composants d'un mélange préférentiellement absorbés, ou de cibles constituées d'objets stériques complémentaires comme de métaux ou en plastique, billes de latex, d'or ou de silice attachés à un ligand tel qu'une molécule d'ADN simple ou double brin ou un anticorps ou un antigène ou une protéine ou un copolymère.
62 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 59 caractérisé en ce que l'étape de formation de clusters physico-chimiques est une étape de formation de gouttes liquides spontanément au contact de leur vapeur.
63 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 59 caractérisé en ce que l'étape de formation de clusters physico-chimiques est une étape de formation de gouttes d'eau sur les sites hydrophiles d'un échantillon ou d'une partie d'un échantillon comme un nanotube de carbone, une molécule d'ADN, un organisme biologique, un chromosome ou une protéine.
64 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 63 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et un second système optique comprenant un analyseur orienté dans une position d'extinction du faisceau réfléchi par le composant.
65 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 63 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et une lame quart d'onde et un second système optique comprenant la même lame quart d'onde et un analyseur.
66 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 63 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est placé le long du trajet optique entre un premier système optique comprenant un polariseur et un élément séparateur de polarisations tel qu'un biprisme de Wollaston et un second système optique comprenant le même élément séparateur de polarisations et un analyseur.
67 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 63 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est placé entre un premier système optique comprenant un polariseur, un biprisme et un compensateur, et un second système optique comprenant un compensateur, un biprisme et un analyseur. 68 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 66 à 67 caractérisé en ce que l'un au moins des systèmes optiques comprend en outre une lame quart d'onde.
69 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 68 caractérisé en ce que l'analyseur du second système optique et le polariseur du premier ne constituent qu'un seul et même composant.
70 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 68 caractérisé en ce que la séparation entre les deux systèmes optiques le long du trajet optique est obtenue par un dispositif semi- réfléchissant.
71 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 70 caractérisé en ce que cette séparation est localisée après le polariseur du premier système le long du trajet optique.
72 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 70 caractérisé en ce que cette séparation est localisée avant le polariseur du premier système le long du trajet optique, l'analyseur et le polariseur ne formant alors qu'un seul élément.
73 - Procédé d'analyse d'échantillon selon la revendication 29 caractérisé en ce que le l'équipement d'observation de l'échantillon comporte un objectif.
74 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 68 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est observé par réflexion sur face supérieure(microscope droit).
75 - Procédé d'analyse d'échantillon selon l'une quelconque des revendications 29 à 68 caractérisé en ce que le composant optique portant l'échantillon est observé par réflexion sur face inférieure (microscope inversé).
76 - Système d'analyse d'échantillon comportant un dispositif d'observation et un composant optique portant un échantillon à analyser caractérisé en ce que ledit composant optique est constitué par un substrat et au moins une couche d'indice complexe et d'épaisseur prédéterminées, destinée à faire apparaître un contraste élevé d'intensité ou de couleur pour des épaisseurs nanométriques lorsqu'il est observé par réflexion en lumière incohérente convergente autour de l'incidence normale dans des conditions d'extinction de polarisation, la couche d'indice supérieure présentant des propriétés de surface spécifique lui conférant une affinité sélective par rapport à au moins une caractéristique de l'échantillon.
77 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend un dispositif de contraste interférentiel différentiel.
78 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend une source lumineuse polychromatique ou monochromatique.
79 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend en outre un moyen d'analyse de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et une comparaison de ces valeurs avec des valeurs prédéterminées.
80 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend en outre un moyen d'analyse des caractéristiques de l'image réalisant un filtrage de l'image en fonction de seuil de luminosité et/ou une mesure de la position et de l'intensité des éléments dépassant ledit seuil de luminosité en fonction des positions le long de la surface.
81 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend en outre un moyen d'analyse de la courbe de l'intensité en fonction de la longueur d'onde de chaque point ou partie de l'image pour l'ensemble des longueurs d'onde présentes dans le spectre de l'éclairage.
82 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend en outre un moyen d'analyse d'intensité d'une image monochromatique ou d'un filtrage ou d'une projection monochromatique d'une image colorée.
83 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce que le dispositif d'observation comprend en outre un moyen de comparaison dans les mêmes conditions d'observation de la couleur et/ou de l'intensité de l'image en fonction du temps et/ou des positions le long de la surface et de celles d'un échantillon de référence dont les caractéristiques sont connues. 84 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend en outre au moins un réactif destiné à la préparation de l'échantillon en vue de la mise en contact avec la surface d'affinité sélective.
85 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur.
86 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, chacun desdits systèmes optiques comprenant en outre un biprisme.
87 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, l'un au moins desdits systèmes optiques comprenant en outre un compensateur.
88 - Système d'analyse d'échantillon selon la revendication 76 caractérisé en ce qu'il comprend un premier système optique comprenant ledit polariseur et un deuxième système optique comprenant ledit analyseur, l'un au moins desdits systèmes optiques comprenant en outre une lame lambda/4.
89 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection et au criblage de cristaux de protéines, de peptides, de lipides et de toutes autres autres molécules suceptibles de former des cristaux.
90 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection et au criblage des cristaux bidimensionnels au lieu de cristaux seulement tridimensionnels habituellement.
91 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'étude des interactions intermoléculaires.
92 - Application du procédé selon la revendication 29 aux techniques de micromanipulation d'objets visualisés.
93 - Application du procédé selon la revendication 29 à la lecture et l'analyse de biopuces à ADN, à ARN, à chromosomes, à protéines, à antigènes, à anticorps, à cellules, à bactéries, à virus.
94 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'analyse peptidique.
95 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'étude de la multimérisation des récepteurs membranaires.
96 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'étude du transport axonal et de la libération de neurotransmetteurs.
97 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection et l'analyse de chromosomes à des fins d'étude ou de diagnostic médical par l'exploitation des bandes de couleur ou d'intensité directement visibles sur les chromosomes.
98 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'analyse d'une seule molécule d'ADN.
99 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle non destructif de liposomes.
100 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle non destructif d'émulsions et/ou de suspensions.
101 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle non destructif de nanotubes.
102 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de fumées.
103 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de fibres d'amiantes.
104 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection de traces.
105 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de corrosion.
106 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de pollution terrestre, atmosphérique et des eaux.
107 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de qualité de l'eau. 108 - Application du procédé selon la revendication 29 à la fabrication de capteurs de gaz, de liquides, de particules.
109 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de qualité de greffages chimiques sur solide, de couches, de différents stades de dépôt d'épaisseurs nanométriques, de couches de Langmuir- Blodgett.
110 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de qualité et la fabrication de composants microélectroniques, de masques, de systèmes micro-électro-mécaniques (MEMS), de supports pour construction microélectronique et MEMS, de supports d'enregistrement (CD et DVD), d'écrans plats.
111 - Application du procédé selon la revendication 29 au suivi de croissances de couches et de nano-objets, de nanotubes par CVD à partir d'un catalyseur.
112 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle et mise au point des surfaces biocompatibles.
113 - Application du procédé selon la revendication 29 au diagnostic sur extraits membranaires, tissus, cellules.
114 - Application du procédé selon la revendication 29 à l'étude et reconnaissance d'interactions polymères-membranes. 115 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection de biréfringence, de séparation de phases, d'adsorptions préférentielles.
116 - Application du procédé selon la revendication 29 à la construction de composants moléculaires.
117 - Application du procédé selon la revendication 29 à la détection et suivi de croissances bactériennes, de croissances cellulaires.
118 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de différentes étapes des procédés enzymatiques.
119 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de croissance nanométrique de structures cristallines.
120 - Application du procédé selon la revendication 29 au contrôle de qualité de couches sensibles pour des capteurs pendant la phase de fabrication de la couche sensible et/ou pendant la phase de mise au point des procédés de mise en œuvre du capteur.
121 - Application du procédé selon la revendication 120 caractérisé en ce que le capteur est une biopuce à ADN, à ARN, à chromosomes, à protéines, à antigènes, a anticorps, à cellules, à bactéries, à virus.
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