EP1769246A1 - Analytisches system und verfahren zur analyse nichtlinearer optischer signale - Google Patents

Analytisches system und verfahren zur analyse nichtlinearer optischer signale

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EP1769246A1
EP1769246A1 EP04740541A EP04740541A EP1769246A1 EP 1769246 A1 EP1769246 A1 EP 1769246A1 EP 04740541 A EP04740541 A EP 04740541A EP 04740541 A EP04740541 A EP 04740541A EP 1769246 A1 EP1769246 A1 EP 1769246A1
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EP
European Patent Office
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excitation light
interaction
correlated
analytical system
modulation
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04740541A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Markus Haiml
Laurent P. Balet
Gert L. Duveneck
Gerd Marowsky
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Laser-Laboratorium Gottingen
Bayer AG
Original Assignee
Laser-Laboratorium Gottingen
Bayer Technology Services GmbH
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Filing date
Publication date
Application filed by Laser-Laboratorium Gottingen, Bayer Technology Services GmbH filed Critical Laser-Laboratorium Gottingen
Publication of EP1769246A1 publication Critical patent/EP1769246A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging

Definitions

  • the present invention describes a method for the detection of optical signals which are, for example, overlaid by scatter, noise and background signals.
  • this method is suitable for the detection of weak nonlinear optical signals, such as luminescence after two-photon excitation, i.e. after simultaneous absorption of two photons of relatively low energy (relatively long wavelength) by a luminescent chromophore, which leads to the emission of a photon of higher energy (shorter wavelength) than that of the excitation light in the form of luminescence.
  • weak nonlinear optical signals such as luminescence after two-photon excitation, i.e. after simultaneous absorption of two photons of relatively low energy (relatively long wavelength) by a luminescent chromophore, which leads to the emission of a photon of higher energy (shorter wavelength) than that of the excitation light in the form of luminescence.
  • Nonlinear optical signals are characterized in that their signal levels depend in a nonlinear manner on the exciting light intensity.
  • the intensity of the resulting luminescence is proportional to the square of the excitation intensity, in contrast, for example, to conventional single-photon luminescence excitation, in which the intensity after absorption of a single one Excitation photons of higher energy (shorter wavelength) emission of low-energy luminescence (longer wavelength) induced by luminescent molecules generally linearly depends on the excitation intensity.
  • Deviations from this linear relationship for the luminescence generated by absorption of a single photon by a luminescence-sensitive chromophore occur, for example, in the event of an inversion of the occupancy numbers of higher and lower-energy excited states (as are typical for the functional principle of a laser) or in the approximation the saturation of an excited state and the corresponding emptying of the ground state.
  • Another example of a linear dependence on the intensity of the incident excitation light is Stray light intensity from rough surfaces. In contrast, the intensity of background light and noise of the measured light signals are uncorrelated with the excitation light in many measuring arrangements.
  • the detection limit for weak light signals is often determined by scattered light from the excitation light (e.g. a laser). Since the luminescent light and the excitation light have different wavelengths, they can be spectrally separated to a certain degree, for example with transmission filters (bandpass filters such as interference filters or high-pass filters). Particularly in the case of luminescence excited by single-photon absorption, however, a non-negligible proportion of stray light often reaches the detector. The cause is the mostly small spectral separation of excitation and luminescence (Stokes shift) and the typically large difference in intensity between extremely weak (luminescence) signals and relatively strong scattered light from the excitation light.
  • the primary object of the present invention is to remove parts which are linearly correlated and uncorrelated with the intensity of the excitation light from one, two or more dimensional images.
  • a “one-, two- or multi-dimensional image” should be understood to mean the recording of the measured light intensities as a function of one, two or more (then typically three) location coordinates. This recording can be in the form of an image (eg a photograph whose intensity values are digitized in the course of the further steps of the method according to the invention) or a numerical file, for example in the form of a computer file.
  • An essential aspect of the present invention is that the separation of different light components is not wavelength-specific, but according to their non-linear character.
  • linear and nonlinear light components ie light components correlated linearly and nonlinearly with the excitation light
  • the present invention is explained below primarily against the background of luminescence excitation and detection as an example of a widely used detection method in (bio) chemical analysis and as an important field of application of the invention.
  • the invention is directly applicable to further optical techniques, such as, for example, "second harmony generation” (in which the irradiation of an excitation light of a specific wavelength results in the emission of a response light of half the wavelength, with respect to the wavelength of the irradiated excitation light) and their fields of application as well further techniques, in whole or in part, of non-optical character, which have as their object the detection of signals which follow the intensity of a power-modulated stimulating excitation signal in a non-linear manner.
  • second harmony generation in which the irradiation of an excitation light of a specific wavelength results in the emission of a response light of half the wavelength, with respect to the wavelength of the irradiated excitation light
  • non-optical character which have as their object the detection of signals which follow the intensity of a power-modulated stimulating
  • luminescence refers to the spontaneous emission of photons in the ultraviolet to infrared range after optical or non-optical, such as, for example, electrical or chemical or biochemical or thermal excitation.
  • chemiluminescence, bioluminescence, electroluminescence and in particular fluorescence and phosphorescence are included under the term "luminescence”.
  • optical transparency of a material is used in the following in the sense that the transparency of this material at least an excitation wavelength is required. With a longer or shorter wavelength, this material can also be absorbent.
  • the sensitivity for analyte detection has been significantly increased in recent years.
  • WO 95/33197 describes a method in which the excitation light is coupled into the waveguiding film of a sensor platform as a diffractive optical element via a relief grating.
  • the surface of the sensor platform is brought into contact with a sample containing the analyte, and the isotropically emitted luminescence in the penetration depth of the evanescent field of luminescent substances is measured by means of suitable measuring devices such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras.
  • suitable measuring devices such as photodiodes, photomultipliers or CCD cameras.
  • devices for the simultaneous or sequential implementation of luminescence-based multiple measurements with essentially monomodal, planar inorganic waveguides, e.g. B. WO 96/35940, devices (arrays) are known in which at least two separate waveguiding areas are arranged on a sensor platform, which are irradiated separately with excitation light.
  • the division of the sensor platform into separate wave-guiding areas has the disadvantage that the space required for discrete measurement areas in discrete wave-guiding areas on the common sensor platform is relatively large and therefore only achieves a relatively low density of different measurement fields (or so-called "features”) can be.
  • arrays Based on simple glass or microscope platelets, without additional wave-guiding layers, arrays are known as so-called “microarrays” with a very high feature density.
  • US 5445934 (Affymax Technologies) describes arrays of oligonucleotides with a density of more than Described and claimed 1000 features per square centimeter for the detection of nucleic acids with complementary (partial) sequences. The excitation and reading out of such arrays is based on classic optical arrangements and methods.
  • the entire array can be illuminated simultaneously with an expanded excitation light bundle, but what leads to a relatively low sensitivity, since the excitation is not limited to the interacting surface and because the scattered light component is also relatively large and scattered light or background fluorescent light is also generated from the glass substrate in the areas in which there is no immobilization to bind the analyte ilized oligonucleotides.
  • confocal measuring arrangements are often used and the various features are read out sequentially by "scanning". However, this results in a greater expenditure of time for reading out a large array and a relatively complex optical structure.
  • the background signals and the associated background noise remain the limiting factors for the detection limits that can be achieved.
  • this is due, among other things, to the fact that with most of the luminescent dyes used, the spectral distance between the excitation and emission wavelengths (Stokes shift) is relatively small, typically between 20 ⁇ m and 50 nm.
  • Some luminescent dyes are known which have a large Stokes shift, up to approximately 300 nm, such as, for example, some lanthanide complexes. However, they generally have a relatively low quantum yield and / or low photostability.
  • planar thin-waveguides make it possible to carry out two-photon luminescence excitation not only in a microscopic excitation beam diameter but also macroscopically on areas of several square millimeters on the surface of a suitable thin-film waveguide [Duveneck, GL, et al., "Evanescent- field-induced two-photon fluorescence: excitation of macroscopic areas of planar waveguides ", Applied Physics B, 73 (2001) 869-871; WO 01/79821; WO 02/79765].
  • This new combination of waveguide technology with two-photon luminescence excitation makes it possible to clearly separate the long-wave excitation light from the shorter-wave emission light.
  • Spectral separation methods have the general disadvantage of never completely suppressing the excitation light to be discriminated (excitation signal) and also not completely transmitting the emission wavelength to be detected.
  • the effectiveness of interference filters is still significantly dependent on the angle of incidence of the light on the filter.
  • the excitation current can also be used
  • the resulting emission light in the periodically varying lighting conditions (in the absence and in the presence of excitation light) is directed to a detector whose response time corresponds at least to the modulation frequency
  • Lock-in amplifiers only amplify those signals that are correlated with the modulation frequency by forming the difference between the detector signals fed to it in the different phases. This eliminates the light components measured by the detector, which are not correlated with the modulated excitation intensity.
  • the lock-in technique also allows the decay time, ie the lifetime of this emission after pulsed excitation, to be determined by measuring the phase difference between the maximum excitation light intensity and the maximum emission light intensity.
  • the signal components proportional to the excitation light are typically selected for further processing with a single detector (“point detector”) and response signal components that are not correlated with the excitation signal are rejected.
  • WO 96/15625 describes a device and a method for detecting an intensity-modulated radiation field, the demodulation process being electronically integrated in a detector array.
  • This method is suitable, for example, for time-of-flight measurements (TOF) or heterodyne interference measurements of distant, moving objects.
  • TOF time-of-flight measurements
  • the method is based on the filtering of linear signal components from the background light.
  • the measured time or phase shift in an interferometric method becomes The description mentions that, in the case of a sinusoidally modulated radiation field, the amplitude, the phase and the background light of the radiation field can be determined with a number of four scans (signal measurements) per period, and that with one Increasing the sampling rate can be used to determine further parameters of the radiation field, such as Fourier coefficients, however, no information is given as to how such a further development could be implemented, but rather only the detection of linear signal components of the radiation gsfeldes described.
  • the present invention relates to the separation of the non-linear signal components from the other components, which are linearly correlated or uncorrelated to a modulated excitation field.
  • signal components whose detection is the task of the invention described in WO 96/15626 and the other publications mentioned above are to be rejected.
  • the arrangement according to the invention and the method according to the invention to be carried out with it have the advantage that they enable the use of any one- or two-dimensional detector array, provided that its electronic response time is short enough to match the frequency of the modulation of the excitation light power and thus the modulation of the intensity of the light to be detected coming from the measuring location.
  • detectors such as the "lock-in CCDs" described is possible for the arrangement according to the invention and the measurement method according to the invention, but is in no way necessary.
  • the camera images are transmitted as data to a computer, and the phase-sensitive demodulation of this data is carried out by numerical analysis performed using the computer.
  • the method described in the two publications mentioned is limited to the separation of constant background light and linear interference signals, which are generated by illumination with a light source. In the arrangements described, two light beams of constant intensity but modulated phase shift are brought to interference.
  • the application of this method describes the measurement of two-dimensional height profiles, for example of surfaces with a structure on the order of micrometers or nanometers.
  • the mathematical method of Fourier series development of a time signal is used; only the phase position of the first harmonic coefficient, which is a measure of the distance of the sample point (measurement location) from the detector, is explicitly used.
  • the present invention does not relate to the measurement of height profiles, distance measurements, or object detection with modulated lighting. Under the conditions of application of our invention, the position of the measuring location is known very precisely.
  • the present invention also does not require the generation of interference patterns, but is suitable for analyzing these too, provided that they have non-linear signal components.
  • the present invention is intended for the generation of images non-linearly correlated with an excitation light in one or more spatial coordinates. from a well-known location.
  • a possible embodiment of the invention is based on phase-sensitive detection at the second harmonic of the excitation modulation.
  • phase position of the nonlinear signal does not provide any information about the spatial position, but rather, for example, about the chemical character. It can be used to measure excitation lifetimes, for example, in contrast to the runtime differences in the publications cited above. Detailed description of the invention
  • a first object of the present invention is a method for the highly sensitive simultaneous measurement of nonlinear optical emission signals, spatially resolved in one or two spatial dimensions, comprising:
  • interaction spaces Irradiation of the excitation light from at least one light source in a power-modulated and / or pulse-duration-modulated form into an interaction volume or to an interaction surface or an interaction layer (summarized under the name "interaction spaces"), in which interaction spaces one or more emissions non-linearly correlated with the excitation light are excited
  • An “interaction volume” is to be understood as a three-dimensional volume on which the excitation light acts and in which under suitable conditions can be generated in a manner that is linear with the intensity of a modulated irradiated excitation light response signals.
  • said non-linearly correlated response signals can be a luminescence after multiphoton excitation or a "second harmonic" signal, ie a response signal at half the irradiated excitation wavelength (frequency-doubled signal).
  • Such signals can originate, for example, from suitable chromophores. Multiphoton-induced emissions can be generated with a large number of chromophores, provided that sufficiently high excitation intensities are provided.
  • Rhodamines are known to be particularly well suited for the excitation of luminescence (more precisely fluorescence) after two-photon absorption.
  • For "second harmony generation” molecules with an asymmetrical arrangement of their molecular groups are known to be particularly suitable.
  • an “interaction surface” is to be understood as the surface between a solid support and an adjacent medium or the interface between different physico-chemical phases (which, for example, can also be immiscible different liquids), on which or on which nonlinear with the excitation light correlated response signals can be generated.
  • the “interaction layer” is intended to be a layer above or below such an interaction surface in which the described nonlinear response signals can be generated.
  • such an “interaction layer” can be the volume of a medium over an optical waveguide, the layer thickness being determined by the depth of penetration of the evanescent field of the light guided in the waveguide or in the waveguiding layer or in the waveguiding film is defined in said medium.
  • reaction volume As “interaction volume”, “interaction area” and “interaction layer” thus defined are to be summarized under the term “interaction space”.
  • interaction space As “non-linear correlated with an excitation light or its intensity
  • the excitation light can be modulated in various ways. For example, this can be done using an acousto-optical modulator (AOM), a liquid crystal (LCD) attenuator, a rotating wave plate in combination with a polarizer or a variable neutral density filter.
  • AOM acousto-optical modulator
  • LCD liquid crystal
  • a rotating wave plate in combination with a polarizer or a variable neutral density filter.
  • the different signal components correlated with the excitation light intensity are separated from the processing of the response signals recorded with different excitation power and spatially resolved in one or two spatial dimensions.
  • This can be, for example, pictures taken with a CCD camera, which are transferred in digital form to a computer and correspondingly stored in a one- or multi-dimensional data matrix.
  • a preferred embodiment of the method according to the invention is characterized in that it does not include spectral filtering of the light to be detected, which emanates from the interaction spaces.
  • the method according to the invention can also be carried out in combination with such spectral filtering.
  • the use of such spectrally selective optical components is preferred, which receive an existing spatial resolution of the signals (such as two-dimensional measurements of light intensities).
  • Edge e.g. high-pass or low-pass filters
  • band-pass filters such as interference filters, nodge filters etc.
  • Said one- or two-dimensional detector array can be selected from the group comprising CCD cameras, CCD chips, CMOS cameras, CMOS chips, photodiode arrays, avalanche diode arrays, multichannel plates and multichannel photomultipliers , wherein a phase-sensitive demodulation can be integrated in said detector array.
  • the time resolution of the detection should be so high that it can follow at least twice the frequency of the modulation of the excitation light. It proves to be a further important advantage of the present invention that even detectors with a relatively strong noise, which are relatively inexpensive but could not previously be used for highly sensitive measurements due to the high noise, can be used, since those which are uncorrelated with the excitation light Noise components are eliminated according to the invention.
  • a large number of possible embodiments of the method according to the invention are characterized in that the excitation light radiated into an interaction space is modulated by means of opto-mechanical and / or acousto-optical and / or electro-optically active aids.
  • Said opto-mechanical and / or acousto-optical and / or electro-optically active aids can be selected from the group consisting of mechanical shutters (comparable to camera closures) and rotating choppers, each alternating the light path between the excitation light source and the interaction space block and release, polarization-selective components such as rotating half-wave plates in combination with polarizers, liquid crystal attenuators, electro-optically active crystals, in their transmission locally or temporally variable neutral density filters, acousto-optic modulators and modulators that are based on interference effects, such as Michelson hiterferometer or Mach-Zehnder interferometer.
  • the modulation of the excitation light radiated into an interaction space takes place by means of direct, active modulation of the light emitted by the excitation light source.
  • the modulation of the irradiated to an interaction space Excitation light takes place by modulating the excitation current for a semiconductor laser as an excitation light source.
  • Numerous possible embodiments of the method according to the invention are characterized in that the modulation of the excitation light radiated into an interaction space takes place periodically. However, it is also possible for the excitation light radiated into an interaction space to be modulated non-periodically.
  • a special variant consists in that the modulation of the excitation light radiated into an interaction space consists in the simultaneous modulation of the pulse duration and the peak power of the irradiated excitation light, the peak power preferably being varied inversely in proportion to the pulse duration, and particularly preferably the integral of the pulse power remains constant.
  • the detection of the light emanating from the interaction spaces typically takes place in a time-correlated manner with the modulation of the excitation light power. It is possible for the light emanating from the interaction spaces to be detected at a frequency which corresponds to an integer multiple of the modulation frequency of the excitation light power. In order to carry out the separation of the response signal components which are differently correlated with the excitation light intensity, different embodiments are possible according to the method according to the present invention.
  • Other preferred embodiments of the method according to the invention are characterized in that the separation of the response signal components from the interaction space that are non-linearly correlated with the excitation light power is carried out with the aid of a harmonic analysis.
  • the harmonic analysis is based on the fact that non-linear systems generate harmonics with harmonic excitation (modulation at constant frequency).
  • the parameters of these harmonics can be determined by Fourier analysis. Signals correlated linearly with the excitation light, for example from scattered light, do not contribute to higher harmonics. Further explanations are given in Example 3.2.
  • stray light-free images of luminescence signals induced by two-photon absorption can be produced, for example, when the second harmonic is detected.
  • response signal components from the interaction space that are non-linearly correlated with the excitation light power are separated from the other signal components by means of a step-like modulation of the excitation light power.
  • the separation of the non-linearly correlated response signal components from the excitation light power Interaction space from the remaining signal components is carried out using a 4-stage algorithm for modulating the excitation light power.
  • This variant is characterized by the fact that it is particularly easy to implement in practice.
  • the power of the excitation light is not continuously modulated at one frequency, but is periodically set to 4 discrete values in stages. This advantageously means that the effort required to carry out the necessary calculations can be significantly reduced in comparison to other variants. This embodiment is described in detail in Example 3.3.
  • the step heights are advantageously chosen so that the parts to be eliminated in the mathematical analysis step of the method according to the invention can be linearly correlated with the excitation light or uncorrelated with the excitation light in a computationally simple manner to zero.
  • the excitation light powers can often not be set exactly to the required values, for example because the measurement of the excitation light power arriving in the interaction space is difficult to carry out.
  • a further preferred embodiment is therefore distinguished in that experimentally induced deviations in the excitation light powers from the nominal values provided for the modulation are compensated for by means of numerical corrections. It is particularly advantageous, if necessary, if the response signals measured using a 4-stage modulation algorithm are multiplied by correction factors. The procedure for determining correction factors is described in Example 3.3.1.
  • the correction factors for the response signals are determined by numerical analysis of the response signal data generated, this being done, for example, by evaluating the signals designated areas of an interaction space or using separate measurements (for example using a calibration sample).
  • the method according to the invention is characterized in that the separation of the non-linear response signal components from the interaction space correlated with the excitation light power from the other signal components can be carried out in real time (within the recording time for signal recording) with the recording of the signals from the interaction space.
  • the interaction space is an interaction layer on a surface of a solid support
  • the areal extent of the interaction space (on said surface of this support) due to the interaction area with the incident power-modulated excitation light and its depth (extension perpendicular to said) Surface of the carrier) are defined by the range of the modulated excitation light intensity in this spatial dimension perpendicular to said surface of the carrier.
  • the conditions are selected so that the excitation light intensity on this surface has a maximum value of a certain size and decreases with distance from the solid support and this surface.
  • the range of the excitation light intensity can then be, for example, a distance from this surface at which the excitation light intensity has decreased to 1 / e multiplied by the intensity on this surface.
  • Preferred embodiments of the method according to the invention are therefore characterized in that one or more specific binding partners for the detection of one or more analytes in a binding assay (with binding of the binding partner from a supplied solution to the immobilized binding partner) are immobilized on the surface of said solid support, the Analyte detection takes place on the basis of an optical response signal of the immobilized binding partner itself or the binding partner supplied in solution or one or more further binding partners supplied in one or more additional method steps correlated with the excitation light power.
  • a possible variant is characterized in that the specific binding partners immobilized on the surface of said solid support are the one or more analytes themselves, which are embedded in a native sample matrix or in a form of the modified with one or more preparation steps Sample matrix are immobilized.
  • sample matrix can for example be selected from the group of extracts of healthy or pathological cells (e.g. from human, animal, bacterial or plant cell extracts), extracts from animal or human tissue such as organ -, skin, hair or bone tissue, or of plant tissue, as well as of body fluids or their components, such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
  • body fluids or their components such as blood, serum or plasma, joint fluids, tear fluid, urine, saliva, tissue fluid, lymph.
  • the sample can be taken, for example, from an organism or tissue or cell structure or cell by means of a method from the group of tissue sections, biopsy and "laser capture micro dissection".
  • Another variant of the method according to the invention using immobilized specific binding partners consists in the fact that the specific binding partners immobilized on the surface of said solid support are biological or biochemical or synthetic recognition elements for the specific recognition of one or more analytes in a sample supplied.
  • Said attachment partners i.e. the self-immobilized analytes to be detected or to be detected in a sample supplied and / or their immobilized or biological or biochemical or synthetic recognition elements or in a detection reagent supplied can for example be selected from the group consisting of proteins, for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, Enzymes, glycopeptides, oligosaccharides, lectins, antigens for antibodies, proteins functionalized with additional binding sites (“tag proteins”, such as “histidine tag proteins”) as well as nucleic acids (e.g. DNA, RNA, oligonucleotides) and nucleic acid analogs (e.g. . PNA), aptamers, membrane-bound and isolated receptors and their ligands, cavities generated by chemical synthesis for receiving molecular imprints, natural and artificial polymers, etc.
  • proteins for example mono- or polyclonal antibodies and antibody fragments, peptides, Enzymes, glycopeptides
  • compounds or substances or molecular subgroups applied to the surface of said solid support which are capable of emitting optical signals correlated therewith under the action of the excitation light, or with the aid thereof, after their interaction with other compounds present in the interaction space, nonlinear Optical signals correlated with the excitation light can be generated, or specific binding partners applied can be immobilized in discrete measuring areas (spots), which can have any geometry, for example circular, oval, triangular, rectangular, polygon-like shape, etc., with a single measuring area being of the same type or can contain different compounds or substances or molecular subgroups or specific binding partners.
  • Said discrete measuring ranges can, for example, by spatially selective application of compounds or substances or molecular subgroups, which under the influence of the excitation light are capable of emitting optical signals correlated therewith in a nonlinear manner, or with the aid of which, after their interaction with other compounds present in the interaction space, optical signals correlated nonlinearly with the excitation light can be generated, or by applying specific binding partners on said solid support are generated, preferably using one or more methods from the group of methods which “inkjet spotting”, mechanical spotting, “micro contact printing”, fluidic contacting of the areas for the measurement areas to be created with the compounds to be immobilized by supplying them in parallel or crossed microchannels, under the influence of pressure differences or electrical or electromagnetic potentials, as well as photochemical and photolithographic immobilization processes.
  • the detection limit of an analytical method is limited by signals due to so-called non-specific binding, ie by signals which are generated by binding analytes or other compounds used for the detection of said analytes, which not only in the area of the immobilized specific binding partners, but also are bound to the surface of the solid support in uncovered areas thereof, for example by hydrophobic adsorption or by electrostatic interactions.
  • “chemically neutral” compounds are applied between the spatially separated measuring areas or in unoccupied partial areas within these measuring areas with respect to the analyte and / or its binding partners, preferably consisting, for example, of the groups which contain albumins, in particular bovine serum albumin or human serum albumin , Casein, unspecific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies for the analyte (s) to be detected and their binding partners (especially for immunoassays), detergents - such as Tween 20 -, fragmented natural or synthetic DNA that does not hybridize with polynucleotides to be analyzed, such as extracts of herring or salmon sperm (especially for polynucleotide hybridization assays), or also uncharged, but hydrophilic polymers, such as polyethylene glycols or dextrans.
  • albumins in particular bovine serum albumin or human serum albumin
  • Casein unspecific, polyclonal or monoclonal, foreign or empirically unspecific antibodies
  • a variety of methods are known for immobilizing molecules or groups or complexes of molecules on a solid support.
  • One possibility is that compounds or substances or molecular subgroups applied to the surface of said solid support, which are capable of emitting optical signals correlated linearly under the influence of the excitation light, or with their help, after their interaction with other compounds present in the interaction space, optical signals correlated nonlinearly with the excitation light, or specific binding partners applied directly or by means of a so-called spacer ("spacer", formed as an independent molecule or molecular group) are immobilized on the surface of said solid support using one or more types of interactions from the group of interactions, which comprises hydrophobic interactions, electrostatic interactions and covalent bonding.
  • optical signals correlated nonlinearly with the excitation light, or an adhesion-promoting layer is applied to the applied specific binding partners, which preferably has a thickness of less than 200 nm, particularly preferably less than 20 nm, and which preferably has a chemical one Compound from the groups includes which silanes, functionalized silanes, epoxides, functionalized, charged or polar polymers and "self-organized passive or functionalized mono- or multilayers", thiols, alkyl phosphates and phosphonates, multi functional block copolymers such as poly (L) lysine / polyethylene glycols.
  • a large number of discrete measurement areas with the same or different specific binding partners contained therein can be arranged on the surface of the solid support. It would come in a 2- dimensional arrangement more than 10, preferably more than 100, particularly preferably more than 1000 measuring areas can be arranged on a square centimeter.
  • said solid support is optically transparent at the wavelength of the excitation light acting on it. It is also advantageous if said solid support is essentially planar.
  • said solid support comprises an optical waveguide structure comprising one or more layers.
  • said solid support comprises a planar optical waveguide comprising one or more layers or divided into discrete waveguiding regions.
  • said solid support has a planar optical thin-film waveguide with an essentially optically transparent, waveguiding layer (a) on a second, also essentially optically transparent layer (b) with a lower refractive index than layer (a) and optionally also one essentially optically transparent intermediate layer (b ') between layer (a) and layer (b) with a lower refractive index than layer (a).
  • a wave-guiding layer of said solid support is in optical contact with one or more optical coupling elements which make it possible to couple excitation light into said wave-guiding layer, said optical coupling elements being selected from the group of prism couplers, evanescent couplers brought together optical waveguides with overlapping evanescent fields, end face couplers with focusing lenses, preferably cylindrical lenses, arranged in front of one end face of said waveguiding layer of the evanescent field sensor platform, and grating couplers. It is particularly preferred that one or more lattice structures (c) are formed in a waveguiding layer of the solid support, which enable the excitation light to be coupled in.
  • one or more lattice structures (c ') with the same or different lattice period and lattice depth as lattice structures (c) are formed in a waveguiding layer of the solid support, which enable the coupling out of light guided in said waveguiding layer.
  • the signals to be detected non-linearly correlated with the excitation light using the method according to the invention can be of different types.
  • said optical emission signals non-linearly correlated with the excitation light intensity comprise the signals of frequency doubling ("second harmonic generation"), sum or difference frequency generation.
  • non-linear optical emission signals correlated with the excitation light intensity are induced by multiphoton absorption.
  • optical emission signals correlated nonlinearly with the excitation light intensity are induced by a two-photon absorption.
  • Another object of the present invention is an analytical system for the highly sensitive simultaneous measurement of non-linear optical emission signals, spatially resolved in one or two spatial dimensions, comprising: - at least one light source for emitting excitation light - technical aids for power modulation and / or pulse duration modulation of the at least one light source an interaction volume or an interaction surface or an interaction layer, collectively referred to as “interaction space”, in which one or more emissions non-linearly correlated with the excitation light can be excited - at least one one one or two-dimensional detector array for measuring the light emanating from the interaction space - a computer to which the measurement data transfer said detector arrays and by means of which the measurement data is formatted and analyzed in a one- or multi-dimensional data matrix t are characterized in that the proportions of the light emanating from there that are linearly proportional to the intensity of the excitation light available in the interaction spaces are fractioned
  • Another object of the invention is the use of an analytical system according to the invention and / or a method according to the invention for quantitative and / or qualitative analyzes for the determination of chemical, biochemical or biological analytes in screening methods in pharmaceutical research, combinatorial chemistry, clinical and preclinical development Real-time education studies and for determining kinetic parameters in affinity screening and in research, for qualitative and quantitative analyte determinations, in particular for DNA and RNA analysis and the determination of genomic or proteomic differences in the genome, such as For example, single nucleotide polymorphisms, for measuring protein-DNA interactions, for determining control mechanisms for m-RNA expression and for protein (bio) synthesis, for preparing toxicity studies and for determining expression profiles, in particular for determining biological and chemical marker substances, such as mRNA, proteins, peptides or low-molecular organic (messenger) substances, as well as for the detection of antibodies, antigens, pathogens or bacteria in pharmaceutical product research and development, human and veterinary diagnostics, agrochemical product research and
  • the invention also includes the use of an analytical system and / or a method according to the invention in nonlinear optics, materials research, the investigation of processes at phase boundaries and surfaces of solid bodies, the quality control of optical components, in particular for laser technology, for example of frequency doubling components.
  • An analytical system comprises an interaction space according to the aforementioned definition, in which nonlinearly correlated response signals can be generated with variations of an irradiated excitation light, an optical system for excitation and detection (by means of a one- or two-dimensional detector array) of said response signals, a computer onto which transmit the detector signals, store them in a data matrix and then use them to split the measurement data into their parts, which correlate differently with the excitation light, according to an inventive specification.
  • a method according to the invention comprises the use of an analytical system according to the invention for the generation and detection of non-linearly correlated response signals with an excitation light in an interaction volume as defined above and the splitting of the recorded measurement data according to their proportions differently correlated with the excitation light.
  • FIG. 1 shows, as an example of an interaction space for the generation of non-linearly correlated optical signals with an excitation light, the diagram of a thin-film waveguide in supervision, with gratings for coupling and decoupling light into and out of the waveguide, between which gratings the light is guided in the waveguide , and with measuring areas generated on the surface in the form of circular areas of material (referred to as a whole as “sensor platform”), in which the generation of non-linear response signals correlated with the excitation light is to be detected.
  • FIG. 2 shows a suitable optical system for generating signals correlated nonlinearly with the excitation light, as a component of an analytical system according to the invention.
  • Figure 3 shows in a false color representation (scale on the right edge) the response signals recorded by a sensor platform according to the diagram of Figure 1 as a superimposition of 150 images with modulated intensity of the excitation light, above without separation of the parts differently correlated with the excitation light, below after selection of the non-linearly correlated response signal component according to the inventive method.
  • FIG. 5 shows the dependence of the spatial noise, without and after selection of the non-linearly correlated response signal component by the method according to the invention, on the number of recordings taken into account for the analysis.
  • FIG. 6 illustrates an embodiment of the method according to the invention using a step-like (4-step) modulation of the excitation light and a harmonic analysis.
  • the interaction space in the sense of the preceding definition, in which nonlinear optical signals are to be generated, is the layer adjacent to the surface of a planar thin-film waveguide, the lateral extent of which is due to the length and width of a layer guided in the waveguide Excitation light and its height above the waveguide is defined by the depth of penetration of the evanescent field above the waveguide.
  • the coupling angle from the glass substrate to the waveguiding layer (a), based on the normal to the plane of the surface of the waveguide structure, is -20.4 ° for excitation light of 800 nm wavelength; the outer angle of incidence on the layer (b) to meet the coupling condition is -31.4 °.
  • first coupling grating (c) to the right in FIG. 1 for coupling the excitation light
  • second coupling grating (c ') to the left in FIG. 1 for coupling out the light guided in the waveguiding film in different concentrations in discrete measurement areas ("spots", spot diameter 120 ⁇ m, (center-to-center) spot distance 350 ⁇ m).
  • (d) denotes measurement areas generated on the waveguide structure by applying dyes to be examined, with filled circles under The experimental conditions indicate luminescent measuring ranges and non-filled circles indicate non-luminescent measuring ranges. These luminescent dyes are to be examined for their possibilities for emitting non-linearly correlated signals with a modulated excitation light intensity ts indicated. 2.
  • FIG. 1 A suitable optical system for generating signals non-linearly correlated with the excitation light, as part of an analytical system according to the invention, is shown in FIG.
  • a pulsed titanium sapphire laser with emission at approx. 800 nm (pulse length: 100 fsec, repetition rate: 80 MHz, medium power used: up to 1.5 W, spectral pulse width: 8 nm, tsunami model 3960, Spectra) serves as the excitation light source (f) Physics, Mt. View, CA, USA).
  • the intensity of the excitation light emitted by the laser can be continuously varied using an acousto-optical modulator (h) (fused silica crystal, 60 MHz carrier frequency, ASM-601-23, IntraAction, Bellwood, IL, USA) 0% and 80% of the output power can be regulated.
  • An aperture (i) serves to block out the zero order of the transmitted light after the acousto-optical modulator.
  • the hitensity of the excitation light can be regulated between 0% and 100% of the output power using a rotating half-wave plate (j) for 800 nm and a polarizer (k). Both intensity controls can be controlled with a computer.
  • lenses (1) for example in the excitation beam path (in the direction of the waveguide structure).
  • B. cylindrical lenses are used to generate parallel incident light beams of the desired geometry on the coupling grating (c) of the waveguide structure (W).
  • the incident excitation light is deflected via a mirror onto the coupling grating (c) of the waveguide structure, which is mounted on an adjusting element which translates in the x, y and z directions (parallel and in the axes perpendicular to the grating lines) and rotation ( with axis of rotation corresponding to the grid lines of the coupling grid).
  • the full width at half maximum in the Under these conditions, the wave-guiding layer of coupled excitation light is typically 1 mm to 2 mm.
  • the intensity of the excitation light of the pulsed laser impinging on the coupling grating of the waveguide structure is determined by rotating a half-wave plate (j) located in the excitation beam path (j) with constant adjustment of a polarizer also mounted in the excitation beam path ( k) Periodically sinusoidally modulated A complete rotation of the half-wave plate is connected with 4 complete, sinusoidal modulation periods of the excitation light intensity arriving at the coupling-in grating.
  • the light emanating from the waveguide structure is collected by means of collecting optics and, without further spectrally selective components in the emission beam path, on a CCD camera (m) (AstroCam, TE3 / A, Cambridge, GB) is guided as a detector, about 100 camera images are recorded during one revolution of the half-wave plate and their digital, pixel-resolved data are sent to a computer for further processing.
  • m CCD camera
  • optical power measuring device with which, for example, the intensity of the transmitted light component behind the waveguide structure can be measured
  • p optical spectrometer
  • s (P) is measured for three different powers P, the values for a 0 , ⁇ l5 and a 2 can be calculated. An image of a 2 for each pixel results in a background and stray light-free image of the non-linearly correlated signal component (in the special case of the luminescence signal induced by two-photon absorption).
  • s (P) is measured for more than three powers
  • the values for a 0 , a v and a 2 can be determined using a Gaussian method of least square deviation.
  • this calculation yields a polynomial algorithm that can be easily vectorized. This allows the coefficients a 0 , a ⁇ , and a 2 to be calculated for an entire image within a very short time (in real time).
  • the matrix ⁇ c ⁇ the calculation of which is relatively time-consuming, and the factor ⁇ remain constant and do not have to be recalculated, even if the measurement object is changed or if several identical cycles P (n) are measured on one measurement object, by averaging of the resulting solution vectors L to improve the signal-to-noise ratio.
  • FIG. 3 shows the mean of a series of 150 camera images taken during 1.5 rotations of the half-wave plate.
  • FIG. 3 shows the same averaged image series after the linear and the signal components not correlated with the modulated excitation light have been removed using the method of parallel Taylor development described above. At least 9 spots with immobilized dye molecules can clearly be seen, from which a non-linear emission, in this case a luminescence stimulated by two-photon absorption, originates. This spatially resolved emission comes from the portion of luminescence excited in the evanescent field of the waveguide, which is largely isotropically emitted into the surrounding space.
  • the upper line profile there is no specific signal, only strong scattered light with a high spatial statistical variation.
  • FIG. 5 illustrates the performance of the analytical method according to the invention on the basis of the reduction in "spatial signal noise” achieved.
  • the "spatial signal noise” is understood to mean the local variation of the signals without the influence of a specific emission signal, ie the noise of the scattered and background light.
  • an increasing number of images, up to a maximum of 150 images, were taken into account for the analysis (ie averaged).
  • harmonic analysis Another approach is chosen for harmonic analysis. It is based on the fact that non-linear systems generate harmonics with harmonic excitation (modulation at constant frequency).
  • the parameters of these harmonics can be determined by Fourier analysis. Such a Fourier analysis can also be vectorized for image series and carried out as simple matrix multiplication, as described in the case of the analysis based on parallel Taylor development. Signals correlated linearly with the excitation light, for example from scattered light, do not contribute to higher harmonics.
  • stray light-free images of luminescence signals induced by two-photon absorption can be produced, for example, when the second harmonic is detected.
  • a particularly simple variant of the embodiment using the harmonic analysis is based on the application of a 4-step algorithm.
  • the power of the excitation light is not continuously modulated at one frequency, but is periodically set to 4 discrete values in stages.
  • the time course of the signal modulation (here measured in the number of sequentially recorded camera images of the response signal) is shown in FIG. 6.
  • the intensity of the excitation light acting on the interaction space is set sequentially to the values 0, 1, 2 and 1.
  • This excitation light profile is followed by the linearly correlated response signal components (eg of scattered light), expressed in relative units, in the same way (0, 1, 2, 1 corresponding to non-scaled values a, b, c, d), as shown in FIG.
  • the response signal detected at the fundamental frequency ( ⁇ ) of this step-shaped modulation of the excitation light contains both linear and non-linear (in this case quadratic) components correlated with the excitation light.
  • the signal detected in the second harmonic (2oS) no longer contains any linearly correlated components (e.g. of scattered light), as can be seen from a detailed examination of the functioning of this embodiment of the method according to the invention:
  • the response signal values (0, 1, 2, 1) or (0, 1, 4, 1) measured at the various times, correlated with the fundamental frequency or the second harmonic, are corresponding to the Fourier analysis with cos ( ⁇ ) t ) or cos (2 ⁇ t) multiplied and the products then summed up ..
  • the zero point in time is chosen when recording the signal components c or c '. These cos values then give the values (-1, 0, 1, 0) for the fundamental wave and the values (1, -1, 1, -1) for the second harmonic, by which the signal values are to be multiplied.
  • the execution of this multiplication of the measured values with the cos values, together with the formation of the sums, for determining the Fourier coefficients, for the linearly correlated signal components (referred to as “linear signals” in the table) and the nonlinear (here quadratic) correlated Signal components (referred to as “non-linear signals” in the table) are shown in table form in FIG. 6. From this it can be seen how, following this embodiment of the method according to the invention, the parts linearly correlated with the excitation light are eliminated upon detection in accordance with the second harmonic.
  • the signal values of the individual pixels must then be scaled accordingly.
  • the scaling factor is ⁇ ⁇ :
  • the multiplication factors for the 4 levels (+ 1, -1, + 1, -1) are replaced by the correction factors ⁇ c a , c b , c c , ⁇ .
  • the background light is not correlated with the excitation light.
  • the analysis can be carried out using the condition (11.iv.b) in a corresponding image area in which no signals which are not linearly correlated with the excitation light should be recorded. It is advantageous if the signals of a scatter body are recorded in this image area.
  • the coefficients are adjusted by iterative variation in such a way that the signal values a 2 of the 4-stage algorithm converge to 0 in the calibration range, the linear components aj on the scattering body converge to finite values, in the rest of the calibration range to 0, and the background values ao to a constant value , or converge to the smoothest possible course, or to the dark field values of the detector system.
  • the convergence criteria can be defined differently. The procedure mentioned here is therefore not to be understood as general, but only as a possible example.
  • pulsed light sources mode-locked lasers
  • very high excitation powers are available for a short period of time, which are sufficient to excite non-linearly correlated response signals.
  • the pulse duration is very short compared to the period between two successive pulses, a high load on the sample (the interaction space) by excitation light can still be avoided, since the average temporal intensity of the excitation light can be set relatively low.
  • Another possible embodiment of an analytical system according to the invention and the method according to the invention to be carried out thereby is based not on varying the intensity of the excitation light irradiated on the interaction space, but rather on the pulse duration, for example via an element with adjustable dispersion of the group delay time (GDD, group delay dispersion).
  • GDD group delay time
  • the variation of the group delay and thus the variation of the pulse duration while the pulse energy remains the same can be done, for example, using a Gires Tournois Interferometer (GTI) mirror with an electrically controllable optical thickness.
  • GTI Gires Tournois Interferometer
  • the separation of linear and non-linear signals correlated with the excitation light and uncorrelated signals is based on the fact that, under the test conditions, the scattered light is proportional to the excitation light power and luminescence after their excitation by two-photon absorption is proportional to the square of the excitation light power.
  • the modulation of the pulse duration is advantageously carried out in such a way that the integral of the pulse power remains constant during the pulses, ie the peak power is correspondingly increased, for example, in the case of shorter pulses. Under these conditions the scattered light is independent of the peak power, and a luminescence induced by two-photon excitation is then linearly proportional to the pulse peak power.
  • the signal sought is then by the coefficient; given instead of a 2 .
  • the signal sought is modulated with the fundamental frequency under these conditions.
  • An advantage of this variant of the method according to the invention is, for example, that possible thermal effects due to the constant mean intensity, due to possible absorption of the excitation light irradiated with high intensity, are also constant and thus do not influence the results in a more complex manner.
  • Another advantage is that in the case of two-photon absorption, using a step-like modulation of the excitation light, it is even possible to work with only 2 steps (pulse durations) instead of 4 steps.
  • the signal values corresponding to the individual images are also added and subtracted alternately, in an analogous manner to that described above for the 4-stage algorithm. In this way, the signals triggered by two-photon absorption can also be selected and the stray light and background signal components can be suppressed.
  • a double-beam excitation is characterized in that (in the case of two-photon excitation) the two photons to be absorbed at the same time do not necessarily come from the same light source (laser) and not necessarily have the same wavelength.
  • laser laser
  • the cross sections (the sizes) of the three contributions can be different. For example, it is possible that only one of the three contributions is of significant size.
  • the excitation energy of the corresponding two-photon absorption process results from the sum of the individual photon energies.
  • ⁇ a (Y ⁇ + y ⁇ .. It is advantageous if one of the two
  • Laser is tunable in wavelength (i.e. has a variable emission wavelength). Then different analytes can be detected specifically on the basis of their two-photon absorption wavelength, by varying the wavelength of one of the two light beams acting on the interaction space.
  • both pulses must be present in the interaction space in terms of time and space.
  • one of the two lasers for example a tunable laser
  • the necessary time overlap is automatically guaranteed.
  • the excitation light intensities used can, for example, be selected so that the necessary peak power for efficient two-photon absorption is provided with the aid of the one pulsed laser, while the continuous wave laser is used for the energy selection of the absorption transition (corresponding to the previous summation for the resulting excitation wavelength).
  • P ⁇ and 2 are advantageously modulated with different frequencies ⁇ and ⁇ a ⁇ .
  • the signal sought can then be detected both at the sum frequency ( ⁇ + coi) and at the difference frequency ( ⁇ ⁇ - ⁇ i).
  • the intensity of the two beams P ⁇ and P 2 is advantageously modulated in accordance with the values (0,0,1,1) and (0,1,0,1).
  • rotating “choppers” By using these mechanical “choppers” only the light path is alternately blocked and released , as a further advantage over the aforementioned types of modulators, the problem of changes in the steel position and the focus, which can result when using these modulators, can be completely avoided.
  • the theoretically optimal performance "0%” and "100%" transmission can be achieved very well with a chopper.
  • the modulation of the intensity of one or both beams can be replaced by the modulation of another beam parameter, for example the pulse duration or the spatial position.
  • the parallel Talyor development is implemented analogously to Section 3.1 or 3.4.1.
  • the proportions of luminescence according to one, two, three, m photon absorption can be separated accordingly.
  • the proportion of single-photon absorption cannot be separated from excitation scattered light linearly correlated with the excitation light intensity. All other higher-order components (corresponding to multi-photon processes) can, however, be separated from the scattered light and from one another.
  • the modulation and signal recording method using a 4-step algorithm can be transferred to multi-photon processes without changing two-photon processes. Only the scaling factors for the signals need to be adjusted. It is also part of the present invention that when detecting m-photon absorption up to m laser beams are used in order to implement a selective analysis analogous to the arrangement of the double-beam excitation described above.
  • resonant processes in the context of the present invention were presented above. These are understood to mean processes by which a real existing state, for example an excited state of a molecule or chromophores, is reached (excited). (eg by multiphoton absorption), which state then disintegrates after a finite, if mostly short, time period, for example by emission of light.
  • non-resonant processes are to be understood as those processes in which an excited state does not really exist, but is of a purely virtual nature. This means that the virtual, excited state has to decay again almost instantaneously, whereby additional boundary conditions for the direction and momentum of the light beams involved must be taken into account.
  • An example application for a two-dimensional non-linear optical signal detection is the measurement of the homogeneity of frequency doubling crystals.
  • the angle between the light beam of the excitation laser and the generated, frequency-doubled light beam is zero or very small, so that a spatial separation of the two light beams is hardly possible.
  • highly effective spectral filters must be used, or the use of spectrally dispersive elements (grids, prisms) is required, whereby only one spatial dimension can then be spatially resolved, while generating two-dimensional images no longer is possible.
  • Another disadvantage of the conventional arrangements and methods is that the excitation light usually has to be focused into the crystal in order to achieve the required intensity for efficient frequency doubling.
  • the frequency-doubled signals for such an arrangement are generally very small and provided with large portions of the excitation light.
  • the detection methods described here have been developed precisely for this problem. All of the aforementioned embodiments of the invention are suitable for separating the signal components that are differently correlated with the excitation light.
  • an embodiment of the invention in combination with such spectral filtering, eg. B. using a bandpass filter, in which the spatially resolved hiformation is preserved via the signal distribution.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur hochempfindlichen gleichzeitigen Messung nichtlinearer optischer Emissionssignale in einer oder zwei Ortsdimensionen, umfassend: Einstrahlung des Anregungslichts von mindestens einer Lichtquelle in einer leistungsmodulierten oder pulsmodulierten Form in ein Wechselwirkungsvolumen oder zu einer Wechselwirkungsfläche oder einer Wechselwirkungsschicht (zusammengefasst unter der Bezeichnung 'Wechselwirkungsräume'), in welchen Wechselwirkungsräumen jeweils eine oder mehrere mit dem Anregungslicht nichtlinear korrelierte Emissionen angeregt werden können; Messung des von besagten Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einem ein- oder zweidimensionalen Detektor-Array; Übertragung der Messdaten von besagtem Detektor-Array auf einen Computer und Formatierung der Daten in einer ein- oder zweidimensionalen Datenmatrix, dadurch gekennzeichnet, dass unkorrelierte oder die zur Intensität des in den Wechselwirkungsräumen verfügbaren Anregungslichts linear proportionalen Anteile des von dort ausgehenden Lichts von zur verfügbaren Anregungslichtintensität nicht linear proportionalen Anteilen des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts getrennt werden. Die Erfindung betrifft auch ein für die Ausführung des erfindungsgemässen Verfahrens geeignetes analytisches System.

Description

Analytisches System und Verfahren zur Analyse nichtlinearer optischer Signale
Die vorliegende Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Detektion optischer Signale welche beispielsweise von Streu-, Rausch- und Hintergrundsignalen überlagert sind. Im Speziellen eignet sich dieses Verfahren zum Nachweis schwacher nichtlinearer optischer Signale, wie beispielsweise von Lumineszenz nach Zweiphotonen- Anregung, d.h. nach gleichzeitiger Absorption von zwei Photonen relativ niedriger Energie (relativ langer Wellenlänge) durch einen lumineszenzfähigen Chromophor, was zur Emission eines Photons höherer Energie (kürzer Wellenlänge) als derjenigen des Anregunsglichts in Form von Lumineszenz führt. [W. Denk, J.H. Strickler und W.W. Webb, "Two-photon laser scanning fluorescence microscopy", Science 248 (1990) 73-76; Duveneck, G.L., et al, "Evanescent-field-induced two-photon fluorescence: excitation ofmacroscopic areas ofplanar waveguides", Applied Physics B, 73 (2001) 869-871.].
Nichtlineare optische Signale sind dadurch gekennzeichnet, dass ihre Signalhöhen in nichtlinearer Weise von der anregenden Lichtintensität abhängen. Im Fall der Zweiphotonen-Lumineszenzanregung, welche die gleichzeitige Absorption von zwei Photonen des eingestrahlten Anregungslichts voraussetzt, ist die Intensität der resultierenden Lumineszenz proportional zum Quadrat der Anregungsintensität, im Gegensatz beispielsweise zur konventionellen Einphotonen-Lumineszenzanregung, bei der die Intensität der nach Absorption jeweils eines einzelnen Anregungsphotons höherer Energie (kürzerer Wellenlänge) durch lumineszenzfähige Moleküle induzierte Emission niederenergetischer Lumineszenz (längerer Wellenlänge) im allgemeinen linear von der Anregungsintensität abhängt. Abweichungen von diesem linearen Zusammenhang für die durch Absorption jeweils eines einzelnen Photons durch einen lumineszenzfälligen Chromophor erzeugte Lumineszenz treten beispielsweise im Falle einer Inversion der Besetzungszahlen von höher- und niederenergetischen angeregten Zuständen (wie sie für das Funktionsprinzip eines Lasers typisch sind) oder bei der Annäherung an die Sättigung eines angeregten Zustands und an die entsprechende Entleerung des Grundzustands auf. Ein weiteres Beispiel für eine lineare Abhängigkeit von der Intensität des eingestrahlten Anregungslichts ist die Intensität des Streulichts von rauhen Oberflächen. Demgegenüber sind die Intensität von Hmtergrundlicht und von Rauschen der gemessenen Lichtsignale bei vielen Messanordnungen unkorreliert zum Anregungslicht.
In der Praxis zeigt sich, dass die Nachweisgrenze für schwache Lichtsignale, beispielsweise von Emissionen eingesetzter Lumineszlabel zum analytischen Nachweis in einer Probe befindlicher Stoffe geringer Konzentration, oft bestimmt wird durch Streulicht des Anregungslichts (z. B. eines Lasers). Da das Lumineszenzlicht und das Anregungslicht unterschiedliche Wellenlängen haben, kann man diese bis zu einem gewissen Grad spektral trennen, beispielsweise mit Transmissionsfiltern (Bandpass-Filtern wie z. B. Interferenzfiltern oder Hochpass- Filtern). Insbesondere im Fall von durch Einphotonen-Absorption angeregter Lumineszenz erreicht jedoch oft ein nicht vernachlässigbarer Anteil von Streulicht den Detektor. Ursache ist u.a. die meist kleine spektrale Trennung von Anregung und Lumineszenz (Stokes-Shift) und der typischerweise große Intensitätsunterschied zwischen extrem schwachen (Lumineszenz-) Signalen und relativ starkem Streulicht des Anregungslichts.
Primäre Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, aus ein-, zwei- oder mehrdimensionalen Bildern mit der Intensität des Anregungslichts linear korrelierte und unkorrelierte Anteile zu entfernen. Dabei soll unter einem „ein-, zwei- oder mehrdimensionalen Bild" die Aufzeichnung der gemessenen Lichtintensitäten als Funktion von ein, zwei oder mehr (dann typischerweise drei) Ortskoordinaten verstanden werden. Diese Aufzeichnung kann in Form einer Abbildung (z. B. einer Photographie, deren Intensitätswerte im Laufe der weiteren Schritte des erfindungsgemässen Verfahrens digitalisiert werden) oder einer numerischen Datei, beispielsweise in Form eines Computer-Files, vorliegen.
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung ist, dass die Trennung von unterschiedlichen Lichtanteilen nicht wellenlängenspezifisch erfolgt, sondern entsprechend deren nichtlinearem Charakter. Somit können auch lineare und nichtlineare Lichtanteile (d.h. linear und nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Lichtanteile) bei gleicher Wellenlänge getrennt werden. Mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren lässt sich diese Trennung auch in Echtzeit für ein-, zwei- oder mehrdimensionale Bilder durchführen.
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend vor allem vor dem Hintergrund von Lumineszenzanregung und -detektion als Beispiel für ein weit verbreitetes Nachweisverfahren in der (bio-)chemischen Analytik und als ein wichtiges Anwendungsgebiet der Erfindung erläutert. Die Erfindung ist jedoch direkt anwendbar auf weitere optische Techniken, wie beispielsweise „Second Harmonie Generation" (wobei die Einstrahlung eines Anregungslichts einer bestimmten Wellenlänge in der Ausstrahlung eines Antwortlichts der halben Wellenlänge, bezüglich der Wellenlänge des eingestrahlten Anregungslichts, führt) und deren Anwendungsgebiete sowie auf weitere Techniken ganz oder teilweise nicht-optischen Charakters, welche die Detektion von Signalen zum Gegenstand haben, welche der hitensität eines leistungsmodulierten stimulierenden Anregungssignal in nicht-linearer Weise folgen.
Technischer Hintergrund der Erfindung
Beispielsweise in der biochemischen Analytik besteht ein hoher Bedarf nach Anordnungen und Methoden, mit denen, unter Verwendung von auf einer Oberfläche immobilisierten biochemischen oder biologischen oder synthetischen Erkennungselementen, ein oder mehrere in einer zugeführten Probe befindliche Analyten mit hoher Selektivität und Empfindlichkeit nachgewiesen werden sollen. Viele bekannte Nachweismethoden stützen sich dabei auf die Bestimmung einer oder mehrerer Lumineszenzen in Anwesenheit des einen oder der mehreren Analyten.
Mit dem Begriff "Lumineszenz" wird dabei in dieser Anmeldung die spontane Emission von Photonen im ultravioletten bis infraroten Bereich nach optischer oder nichtoptischer, wie beispielsweise elektrischer oder chemischer oder biochemischer oder thermischer Anregung, bezeichnet. Beispielsweise sind Chemilumineszenz, Biolumineszenz, Elektrolumineszenz und insbesondere Fluoreszenz und Phosphoreszenz unter dem Begriff "Lumineszenz" mit eingeschlossen.
Der Begriff "optische Transparenz eines Materials" wird im folgenden in dem Sinne verwendet, dass die Transparenz dieses Materials bei mindestens einer Anregungswellenlänge gefordert wird. Bei einer längeren oder kürzeren Wellenlänge kann dieses Material auch absorbierend sein.
Mittels hochbrechender Dünnschichtwellenleiter, basierend auf einem nur einige hundert Nanometer dünnen wellenleitenden Film auf einem transparenten Trägermaterial, konnte in den letzten Jahren die Empfindlichkeit für einen Analytnachweis deutlich gesteigert werden. Dabei macht man sich zunutze, dass die Lichtleitung in dem hochbrechenden Material eines Wellenleiters mit der Ausbildung eines sogenannten evaneszenten Feldes verbunden ist, welches eine Eindringtiefe von molekularer Grössenordnung, d.h. von einigen hundert Nanometern, in die benachbarten Medien mit niedrigerem Brechungsindex hat. Damit ist ein strikt oberflächengebundenes Anregungsfeld verfügbar, welches erlaubt, Vorgänge selektiv innerhalb einer durch die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes in die niederbrechenden Medien definierten Schichtdicke zu studieren. Beispielsweise wird in der WO 95/33197 eine Methode beschrieben, in der das Anregungslicht über ein Reliefgitter als diffraktives optisches Element in den wellenleitenden Film einer Sensorplattform eingekoppelt wird. Die Oberfläche der Sensorplattform wird mit einer den Analyten enthaltenden Probe in Kontakt gebracht, und die isotrop abgestrahlte Lumineszenz in der Eindringtiefe des evaneszenten Feldes befindlicher lumineszenzfähiger Substanzen wird mittels geeigneter Messvorrichtungen wie zum Beispiel Photodioden, Photomultiplier oder CCD-Kameras gemessen. Es ist auch möglich, den in den Wellenleiter rückgekoppelten Anteil der evaneszent angeregten Strahlung über ein diffraktives optisches Element, zum Beispiel ein Gitter, auszukoppeln und zu messen. Diese Methode ist zum Beispiel in der WO 95/33198 beschrieben.
Die Begriffe "evaneszentes Feld" und "Nahfeld" werden nachfolgend synonym verwendet.
Ein Nachteil der vorangehend im Stand der Technik, insbesondere in der WO 95/33197 und WO 95/33198, beschriebenen Verfahren zur Detektion evaneszent angeregter Lumineszenz liegt darin, dass mit den darin beschriebenen Ausführungsformen von Senso lattformen jeweils nur eine Probe analysiert wird. Um weitere Messungen auf derselben Sensorplattform durchführen zu können, sind fortlaufend aufwendige Wasch- bzw. Reinigungsschritte notwendig. Dieses gilt insbesonders, wenn ein von der ersten Messung verschiedener Analyt detektiert werden soll. Im Falle eines Immunoassays bedeutet dieses im allgemeinen, dass die gesamte immobilisierte Schicht auf der Sensorplattform ausgetauscht oder gleich eine neue Sensorplattform als Ganzes verwendet werden muss.
Zur gleichzeitigen oder aufeinanderfolgenden Durchführung von lumineszenzbasierenden Mehrfachmessungen mit im wesentlichen monomodalen, planaren anorganischen Wellenleitern sind, z. B. in der WO 96/35940, Vorrichtungen (Arrays) bekannt geworden, in denen auf einer Sensorplattform wenigstens zwei getrennte wellenleitende Bereiche angeordnet sind, die getrennt mit Anregungslicht bestrahlt werden. Die Aufteilung der Sensorplattform in getrennte wellenleitende Bereiche hat allerdings nachteilig zur Folge, dass der Platzbedarf für diskrete Messbereiche, in diskreten wellenleitenden Bereichen auf der gemeinsamen Sensorplattform relativ gross ist und daher wieder nur eine verhältnismässig geringe Dichte unterschiedlicher Messfelder (oder sogenannter "features") erreicht werden kann.
Es bestand daher der Bedarf nach einer Vergrösserung der Feature-Dichte bzw. nach einer Verkleinerung der erforderlichen Fläche pro Messbereich.
Basierend auf einfachen Glas- oder Mikroskop-Plättchen, ohne zusätzliche wellenleitende Schichten, sind Arrays als sogenannte „Mikroarrays" mit einer sehr hohen Feature-Dichte bekannt. Beispielsweise werden in der US 5445934 (Affymax Technologies) Arrays von Oligonukleotiden mit einer Dichte von mehr als 1000 Features pro Quadratzentimeter für den Nachweis von Nukleinsäuren mit komplementären (Teil-)Sequenzen beschrieben und beansprucht. Die Anregung und das Auslesen solcher Arrays beruht auf klassischen optischen Anordnungen und Methoden. Es kann das ganze Array gleichzeitig mit einem aufgeweiteten Anregungslichtbündel beleuchtet werden, was jedoch zu einer relativ geringen Empfindlichkeit führt, da die Anregung nicht auf die wechselwirkende Oberfläche beschränkt ist und da ausserdem der Streulichtanteil relativ gross ist und Streulicht oder Untergrundfluoreszenzlicht aus dem Glassubstrat auch in den Bereichen erzeugt wird, in denen sich keine zur Bindung des Analyten immobilisierten Oligonukleotide befinden. Um die Anregungsintensität zu erhöhen und die Empfindlichkeit bei der Detektion zu verbessern, werden vielfach konfokale Messanordnungen eingesetzt und die verschiedenen Features sequentiell mittels "Scannen" ausgelesen. Dieses hat jedoch einen grösseren Zeitaufwand zum Auslesen eines grossen Arrays und einen relativ komplexen optischen Aufbau zur Folge.
Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass das Format derartiger „Mikroarrays" auf planare Düimschichtwellenleiter als Träger (Sensorplattform) übertragen werden kann, ohne dass der Anteil der in den Wellenleiter zurückgekoppelten, im evaneszenten Feld angeregten Lumineszenz zu einem signifikanten Übersprechen von Signalen aus verschiedenen Messbereichen führt. Mit dieser Anordnung konnte eine deutliche Steigerung der Empfindlichkeit, um einen Faktor 50 bis 100, im Vergleich zu den herkömmlichen Messanordnungen erreicht werden [G.L. Duveneck et al., Analytica Chimica Acta 469 (2002) 49 -61].
Für alle genannten Konfigurationen bleiben jedoch schliesslich vor allem die Untergrundsignale und das damit verbundene Rauschen des Untergrunds limitierend für die jeweils erreichbaren Nachweisgrenzen. Dieses ist für diese, ebenso wie für alle vorgenannten Anregungs- und Detektionskonfigurationen, unter anderem dadurch bedingt, dass bei den meisten verwendeten Lumineszenzfarbstoffen der spektrale Abstand zwischen Anregungs- und Emissionswellenlänge (Stokes-Shift) relativ gering ist, typischerweise zwischen 20 um und 50 nm. Zwar sind einige Lumineszenzfarbstoffe bekannt, welche einen grossen Stokes-Shift, bis etwa 300 nm, aufweisen, wie beispielsweise einige Lanthanid-Komplexe. Diese besitzen nachteilig jedoch im allgemeinen eine relativ niedrige Quantenausbeute und / oder geringe Photostabilität.
Ausserdem ist bei den bekannten Anordnungen basierend auf hochbrechenden Dünnschichtwellenleitern, beispielsweise basierend auf wellenleitenden Schichten aus Ta O5 oder TiO2, mit herkömmlicher Anregung nachteilig, dass die Ausbreitungsverluste dieser Wellenleiter, wie auch die Eigenfluoreszenz dieser Dünnschichtwellenleiter (beispielsweise durch Spuren von fluoreszenten Verunreinigungen in der Trägerschicht (b)), bei kurzen Anregungswellenlängen drastisch ansteigen. So ist hier kurzwellige Anregung bei etwa 450 nm bis 500 nm limitiert. Es wäre jedoch eine Anordnung wünschenswert, mit der Fluorophore auch bei kürzeren Wellenlängen angeregt werden und ihre Lumineszenzen mit einem möglichst niedrigen oder bestenfalls sogar ohne Untergrund detektiert werden können.
Seit einigen Jahren sind Methoden bekannt geworden, welche auf Multiphotonen- Anregung, insbesondere Zweiphotonen- Anregung beruhen. Eine Zweiphotonen- Anregung erfordert jedoch extrem hohe Feldstärken bzw. Intensitäten des Anregungslichts. Diese erreicht man in den beschriebenen Anordnungen mit leistungsstarken Pulslasern extrem kurzer Pulslängen (typischerweise von Femtosekunden). Bisherige Systeme benutzen optische Anordnungen, welche mit sehr hohen Systemkosten verbunden sind und hohe Anforderungen an die fachliche Qualifikation des Benutzers stellen. Sie sind daher für routinemässigere Anwendungen, ausserhalb des Forschungsbereichs, nicht geeignet. Die erforderlichen Intensitätsdichten werden bisher beispielsweise mit gepulsten Hochleistungslasern in konfokalen mikroskopischen Anordnungen erreicht, wie es zum Beispiel in dem US- Patent Nr. 5034613 beschrieben ist, mit einem Laserfokusdurchmesser von weniger als einem Mikrometer in der Fokusebene des Mikroskops. Die Ausmessung einer ausgedehnten Fläche mittels Scannens erfordert jedoch wiederum neben dem grossen instrumentellen Aufwand nachteilig auch einen hohen Zeitaufwand.
Vor kurzem wurde gezeigt, dass es mithilfe planarer Dünnscl ichtwellenleiter möglich ist, Zweiphotonen-Lumineszenzanregung nicht nur in einem mikroskopischen Anregungsstrahldurchmesser, sondern makroskopisch auf Flächen von etlichen Quadratmillimetern an der Oberfläche eines geeigneten Dünnschichtwellenleiters durchzuführen [Duveneck, G.L., et al., "Evanescent-field-induced two-photon fluorescence: excitation ofmacroscopic areas ofplanar waveguides", Applied Physics B, 73 (2001) 869-871; WO 01/79821; WO 02/79765]. Durch diese neuartige Kombination von Wellenleitertechnologie mit Zweiphotonen-Lumineszenzanregung wird es möglich, das langwellige Anregungslicht spektral deutlich vom kürzerwelligen Emissionslicht zu trennen. Allerdings wird dieser Vorteil der grösseren spektralen Trennung teilweise wieder dadurch aufgehoben, dass aufgrund der wesentlich kleineren Quantenausbeuten der Zweiphotonen-induzierten Lumineszenz, im Vergleich zur herkömmlichen Einphotonen-induzierten Lumineszenz, das Verhältnis zwischen nur sehr schwacher Emissionsintensität und sehr starker Intensität des Anregungsstreulichts wesentlich ungünstiger als im Falle der Einphotonen-induzierten Lumineszenz ist.
Es besteht daher das Bedürfnis nach einem Verfahren und einer analytischen Messanordnung, womit auch für die Zweiphotonen-induzierte Lumineszenz, als Beispiel für optische Signale, welche der Intensität eines Anregungssignal in nichtlinearer Weise folgen, eine wirksame Trennung vom Anregungslicht (Anregungssignal) durchgeführt werden kann. Zugleich ist es wünschenswert, für ein solches Verfahren und eine solche Messanordnung die spezifische Eigenschaft der nichtlinearen Korrelation mit dem Anregungslicht vorteilhaft auszunutzen.
Spektrale Trennmethoden haben den generellen Nachteil einer niemals vollständigen Unterdrückung des zu diskriminierenden Anregungslichts (Anregungssignals) und einer ebenfalls nicht vollständigen Transmission für die zu detektierende Emissionswellenlänge. Zusätzlich ist beispielsweise die Wirksamkeit von Interferenzfiltern nachteilig noch deutlich abhängig vom Auftreffwinkel des Lichts auf dem Filter.
Eine elegante Alternative zur spektralen Trennung von Anregungs- und Emissionssignal besteht in der sogenannten „Lock-in"-Technik, welche schon seit langem bekannt ist zur punktförmigen Signaldetektion (d.h. in Kombination mit null-dimen- sionalen Detektoren) [Meade, M. L., „Lock-in amplifiers: principles and applications", London (1983), Peregrinus 232]. Das Grundprinzip dieser Technik beruht auf der Modulation des Anregungssignals mit einer wählbaren Modulationsfrequenz und der mit dieser Modulationsfrequenz korrelierten Detektion des Emissionssignals. Beispielsweise kann die Modulation der auf ein Wechselwirkungsvolumen oder auf eine Wechselwirkungsschicht auftreffenden Anregungslichtintensitat mithilfe einer rotierenden Scheibe mit einer Anordnung von Schlitzen und geschlossenen Bereichen (einem sogenannten „Chopper") erfolgen, womit der Anregungslichtweg alternierend blockiert und freigegeben wird. Alternativ kann beispielsweise auch der Anregungsstrom einer Laserdiode moduliert werden. Das resultierende Emissionslicht bei den periodisch variierenden Beleuchtungsbedingungen (in Abwesenheit und in Anwesenheit von Anregungslicht) wird auf einen Detektor geleitet, dessen Ansprechzeit mindestens der Modulationsfrequenz entspricht. Ein zugehöriger sogenannter Lock-in Verstärker verstärkt nur jene Signale, die mit der Modulationsfrequenz korreliert sind, indem die Differenz der ihm zugeleiteten Detektorsignale bei den verschiedenen Phasen gebildet wird. Damit werden die vom Detektor gemessenen Lichtanteile, welche nicht mit der modulierten Anregungsintensität korreliert sind, eliminiert. Die Lock-in-Technik erlaubt es unter geeigneten Bedingungen auch, durch Messung der Phasendifferenz zwischen maximaler Anregungslichtintensitat und maximaler Emissionslichtintensität die Abklingzeit, d.h. die Lebensdauer dieser Emission nach pulsförmiger Anregung, zu bestimmen.
Bei der vorangehend beschriebenen traditionellen Lock-in Technik werden typischerweise die zum Anregungslicht proportionalen Signalanteile mit einem einzelnen Detektor („Punktdetektor") für die Weiterverarbeitung selektiert und nicht mit dem Anregungssignal korrelierte Antwortsignalanteile verworfen.
Es sind verschiedene Arbeiten zur Übertragung der beschriebenen Lock-in Technik oder damit verwandter Methoden auf ein oder zweidimensionale Detektor- Arrays bekannt. In der WO 96/15625 werden eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion eines intensitätsmodulierten Strahlungsfeldes beschrieben, wobei der Demodulationsprozess elektronisch in einem Detektor- Array integriert ist. Diese Methode ist beispielsweise für Laufzeitmessungen („time of flight", TOF) oder heterodyne Interferenzmessungen von entfernten, bewegten Objekten geeignet. Die Methode beruht auf der Filterung von linearen Signalanteilen vom Hintergrundlicht. Aus der gemessenen Laufzeit oder Phasenverschiebung in einem interferometrischen Verfahren wird beispielsweise die Entfernung zu einem Objekt bestimmt. In der Beschreibung wird erwähnt, dass, im Falle eines sinusförmig modulierten Strahlungsfeldes, bei einer Anzahl von vier Abtastungen (Signalmessungen) je Periode die Amplitude, die Phase und das Hintergrundlicht des Strahlungsfeldes bestimmt werden können, und dass bei einer Erhöhung der Abtastrate weitere Parameter des Strahlungsfeldes, wie beispielsweise Fourierkoeffizienten, bestimmt werden können. Es werden jedoch keinerlei Angaben gemacht, wie eine solche Weiterentwicklung realisiert werden könnte, sondern es wird ausschliesslich die Detektion linearer Signalanteile des Strahlungsfeldes beschrieben. In einer Publikation [T. Spirig, P. Seitz, O. Vietze und F. Heitger, „The Lock-hi CCD - Two- Dimensional Synchronous Detection of Light", IEEE Journal of Quantum Electronics 31 (1995) 1705 - 1708] der zugrundeliegenden Arbeiten wird die technische Umsetzung des Detektors, dort bezeichnet als „Lock-in CCD" (CCD: „charge- coupled device") näher beschrieben. Weiterentwicklungen dieser Anordnung werden beschrieben in T. Spierig, M. Marley und P. Seitz, „The Multitap Lock-In CCD with Offset Subtraction", IEEE Transactions on Electronic Devices 44 (1997) 1643 - 1647 und in der internationalen Patentanmeldung WO 01/84182. Jedoch enthalten beide Arbeiten keinerlei Hinweise auf Möglichkeiten zur Detektion nichtlinear mit der Intensität eines am Messort verfügbaren Anregungsfeldes korrelierter Signalanteile.
Demgegenüber hat die vorliegende Erfindung die Trennung der nichtlinearen Signalanteile von den übrigen Anteilen, welche linear korreliert oder unkorreliert zu einem modulierten Anregungsfeld sind, zum Gegenstand. Der vorliegenden Erfindung folgend, sollen also gerade solche Signalanteile verworfen werden, deren Detektion die Aufgabe der in der WO 96/15626 und den weiteren vorgenannten Publikationen beschriebenen Erfindung ist. Ausserdem haben die erfmdungsgemässe Anordnung und das damit auszuführende erfmdungsgemässe Verfahren den Vorteil, dass sie die Verwendung jedes beliebigen ein- oder zweidimensionalen Detektor- Arrays ermöglichen, sofern dessen elektronische Ansprechzeit kurz genug ist, um der Frequenz der Modulation der Anregungslichtleistung und damit der Modulation der Intensität des vom Messort ausgehenden, nachzuweisenden Lichts zu folgen. Die Verwendung von Detektoren wie den beschriebenen „Lock-in CCDs" ist für die erfmdungsgemässe Anordnung und das erfindungsgemässe Messverfahren möglich, aber keineswegs notwendig.
Vor kurzem wurden Anwendung von zweidimensional ortsaufgelöster phasensensitiver Detektion in der Interferenz-Mikroskopie bekannt [A. Dubois, "Phase-map measurements by interferometry with sinusoidal phase modulation and four integrating buckets", J. Opt Soc. Am. A 18 (2001) 1972 - 1979; A. Dubois, L. Vabre, A.C. Boccara und E. Beaurepaire, "High-resolution full-field optical coherence tomography with a Linnik microscope", Applied Optics 41 (2002) 805 - 812]. In den beschriebenen Anordnungen wird jeweils eine kommerzielle CCD- Kamera als Detektor verwendet. Die Kamerabilder werden, wie imn einem Ausfuhrungsbeispiel unserer Erfindung, als Daten auf einen Computer übertragen, und die phasensensitive Demodulation dieser Daten wird durch numerische Analyse mithilfe des Computers durchgeführt. Das in den beiden genannten Publikationen beschriebene Verfahren ist beschränkt auf die Trennung von konstantem Hintergrundlicht und linearen Interferenzsignalen, welche durch Beleuchtung mit einer Lichtquelle erzeugt werden. In den beschriebenen Anordnungen werden zwei Lichtstrahlen konstanter Intensität, aber modulierter Phasenverschiebung zur Interferenz gebracht. Als Anwendung dieses Verfahrens wird die Messung von zweidimensionalen Höhenprofilen, z.B. von Oberflächen mit einer Strukturierung in der Grössenordnung von Mikrometern oder Nanometern, beschrieben. In den beiden Publikationen wird die mathematische Methode der Fourierreihen-Entwicklung eines Zeitsignales verwendet; es wird explizit nur die Phasenlage des ersten, harmonischen Koeffizienten, der ein Mass für den Abstand des Probenpunktes (Messortes) vom Detektor ist, benutzt.
Die vorliegende Erfindung betrifft demgegenüber nicht die Messung von Höhenprofilen, Abstandsmessungen, oder Objekterkennung bei modulierter Beleuchtung. Unter den Bedingungen der Anwendung unserer Erfindung ist die Position des Messortes sehr genau bekannt. Auch erfordert die vorliegende Erfindung keine Erzeugung von Interferenzmustem, ist aber geeignet, auch diese zu analysieren, sofern sie nichtlineare Signalanteile haben. Im Gegensatz zu der in den beiden Publikationen beschriebenen Bestimmung linear mit einem Anregungslicht korrelierter Signalanteile von einem durch diese Analyse zu ermittelnden, vorher unbekannten Messort ist die vorliegende Erfindung vorgesehen für die in ein oder mehr Ortskoordinaten ortsaufgelöste Erzeugung von Abbildungen nichtlinear mit einem Anregungslicht korrelierter Signale, die von einem wohlbekannten Messort ausgehen. Eine mögliche Ausführungsform der Erfindung basiert auf phasensensitiver Detektion bei der zweiten Harmonischen der Anregungsmodulation. Die Phasenlage des nichtlinearen Signals liefert in diesen Fall keine Information über die räumliche Position, sondern beispielsweise über den chemischen Charakter. Man kann damit z.B. Anregungslebensdauern messen, im Gegensatz zu Laufzeitunterschieden bei den oben zitierten Publikationen. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Es wurde nun überraschend gefunden, dass es mit einem erfindungsgemässen analytischen System und einem damit ausgeführten Analyseverfahren möglich ist, nichtlinear mit einem modulierten Anregungssignal korrelierte optische Signale ohne zusätzliche Filterung, wie beispielsweise spektrale Filterung, zweifelsfrei zu detektieren, obwohl sie in dem ursprünglich aufgenommenen Signal vor dem damit verbundenen Signalrauschen in keiner Weise erkennbar sind. Dieses wird erfmdungsgemäss dadurch ermöglicht, dass nicht nur ausschliesslich die nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierten Signalanteile selektiert und übrige Signalanteile verworfen werden, sondern zugleich das Rauschen des selektierten nichtlinearen Signals im Vergleich zum Rauschen des ursprünglichen Signals signifikant vermindert wird.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur hochempfindlichen gleichzeitigen Messung nichtlinearer optischer Emissionssignale, ortsaufgelöst in einer oder zwei Ortsdimensionen, umfassend:
- Einstrahlung des Anregungslichts von mindestens einer Lichtquelle in einer leistungsmodulierten und / oder pulsdauermodulierten Form in ein Wechselwirkungsvolumen oder zu einer Wechselwirkungsfläche oder einer Wechselwirkungsschicht (zusammengefasst unter der Bezeichnung "Wechselwirkungsräume"), in welchen Wechselwirkungsräumen jeweils eine oder mehrere nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Emissionen angeregt werden können,
- Messung des von besagten Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einem ein- oder zweidimensionalen Detektor- Array,
- Übertragung der Messdaten von besagtem Detektor- Array auf einen Computer und Formatierung der Daten in einer ein- oder mehrdimensionalen Datenmatrix, dadurch gekennzeichnet, dass die zur Intensität des in den Wechselwirkungsräumen verfügbaren Anregungslichts linear proportionalen Anteile des von dort ausgehenden Lichts von zur verfügbaren Anregungslichtintensitat nichtlinear proportionalen Anteilen des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts getrennt werden.
Dabei soll unter einem „Wechselwirkungsvolumen" ein dreidimensionales Volumen verstanden werden, auf welches das Anregungslicht einwirkt und in welchem unter geeigneten Bedingungen mchtlinear mit der Intensität eines moduliert eingestrahlten Anregungslicht korrelierte Antwortsignale erzeugt werden können. Beispielsweise kann es sich bei besagten nichtlinear korrelierten Antwortsignalen um eine Lumineszenz nach Multiphotonen- Anregung oder um "Second Harmonic"-Signal, d.h. um ein Antwortsignal bei der Hälfte der eingestrahlten Anregungswellenlänge (frequenzverdoppeltes Signal) handeln. Derartige Signale können beispielsweise von geeigneten Chromophoren ausgehen. Multiphotonen-induzierte Emissionen können bei einer Vielzahl von Chromophoren erzeugt werden, sofern ausreichend hohe Anregungsintensitäten bereitgestellt werden. Zur Anregung von Lumineszenz (genauer Fluoreszenz) nach Zweiphotonen- Absorption sind Rhodamine als besonders gut geeignet bekannt. Für „Second Harmonie Generation" sind Moleküle mit einer asymmetrischen Anordnung ihrer molekularen Gruppen als besonders geeignet bekannt.
Entsprechend soll unter einer „Wechselwirkungsfläche" die Oberfläche zwischen einem festen Träger und einem benachbarten Medium oder die Grenzfläche zwischen unterschiedlichen physikalisch-chemischen Phasen (was z.B. auch nicht mischbare unterschiedliche Flüssigkeiten sein können) verstanden werden, an denen bzw. auf denen nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Antwortsignale erzeugt werden können.
Als „Wechselwirkungsschicht" soll eine Schicht oberhalb oder unterhalb einer derartigen Wechselwirkungsfläche handeln, in der die beschriebenen nichtlinearen Antwortsignale erzeugt werden können. Beispielsweise kann es sich bei einer solchen „Wechselwirkungsschicht" um das Volumen eines Mediums über einem optischen Wellenleiter handeln, wobei die Schichtdicke durch die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes des im Wellenleiter bzw. in der wellenleitenden Schicht oder dem wellenleitenden Film geführten Lichts in besagtes Medium definiert wird.
Die so definierten Begriffe „Wechselwirkungsvolumen", „Wechselwirkungsfläche" und „Wechselwirkungsschicht" sollen unter der Bezeichnung „Wechselwirkungsraum" zusammengefasst werden. Als „nichtlinear mit einem Anregungslicht bzw. dessen Intensität korrelierte
Antwortsignale" sollen solche Signale bezeichnet werden, die eine streng monotone
Änderung mit der Grosse (Intensität) des Anregungssignals zeigen, welche aber nicht von linear proportionaler Natur ist. Signale, die sich bei einer Änderung des
Anregungslichts bzw. von dessen Intensität in einer nicht systematischen Weise oder in rein statistischer Art ändern, sollen als mit dem Anregungslicht bzw. mit dessen
Intensität „unkorreliert" bezeichnet werden.
„Leistungsmodulierte Form" und „pulsdauermodulierte Form" sollen zusammenfassend bezeichnet werden als „modulierte Form" des Anregungslichts.
Die Modulation des Anregungslichts kann auf verschiedene Weise erfolgen. Beispielsweise kann dieses mithilfe eines akusto-optischen Modulators (AOM), eines Flüssigkristall- (LCD) Abschwächers, einer rotierenden Wellenplatte in Kombination mit einem Polarisator oder eines variablen Neutraldichtefilters erfolgen.
Die Trennung der unterschiedlichen mit der Anregungslichtintensitat korrelierten Signalanteile erfolgt aus der Verarbeitung der bei unterschiedlicher Anregungsleistung aufgenommenen, in ein oder zwei Ortsdimensionen ortsaufgelösten Antwortsignale. Dabei kann es sich beispielsweise um mit einer CCD- Kamera aufgenommene Bilder handeln, welche in digitaler Form auf einen Computer übertragen und entsprechend in einer ein- oder mehrdimensionalen Datenmatrix abgespeichert werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass sie keine spektrale Filterung des zu detektierenden, von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts umfasst. Das erfmdungsgemässe Verfahren kann jedoch auch in Kombination mit einer solchen spektralen Filterung durchgeführt werden. In diesem Falle wird der Einsatz solcher spektral selektiver optischer Komponenten bevorzugt, welche eine vorhandene Ortsauflösung der Signale (wie beispielsweise zweidimensionale Messungen von Lichtintensitäten) erhalten. Geeignet sind beispielsweise Kanten- (z. B. Hochpass- oder Tiefpass-Filter) und Bandpass-Filter (wie z. B. Interferenzfilter, Nodge-Filter etc.). Besagtes ein- oder zweidimensionales Detektor- Array kann ausgewählt sein aus der Gruppe, welche CCD-Kameras, CCD-Chips, CMOS-Kameras, CMOS-Chips, Photodioden- Arrays, Avalanche-Dioden- Arrays, Multichannel-Plates und Vielkanal- Photomultiplier umfasst, wobei eine phasensensitive Demodulation in besagtes Detektor- Array integriert sein kann. Die Zeitauflösung der Detektion sollte so hoch sein, dass sie mindestens der doppelten Frequenz der Modulation des Anregungslichts folgen kann. Dabei erweist es sich als ein weiterer wichtiger Vorteil der vorliegenden Erfindung, dass auch Detektoren mit einem relativ starken Rauschen, welche relativ preiswert sind, aber bisher für hochempfindliche Messungen aufgrund des hohen Rauschens nicht einsetzbar wären, verwendet werden können, da die mit dem Anregungslicht unkorrelierten Rauschkomponenten erfindungsgemäss eliminiert werden.
Eine Vielzahl möglicher Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zeichnet sich dadurch aus, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels opto-mechanischer und / oder akusto-optischer und / oder elektro-optisch aktiver Hilfsmittel erfolgt.
Besagte opto-mechanische und / oder akusto-optische und / oder elektro-optisch aktiven Hilfsmittel können ausgewählt sein aus der Gruppe, welche mechanische Shutter (vergleichbar mit Kamera- Verschlüssen) und rotierende Chopper, welche jeweils alternierend den Lichtweg zwischen der Anregungslichtquelle und dem Wechselwirkungsraum blockieren und freigeben, polarisationsselektive Komponenten wie beispielsweise rotierende Halbwellen-Platten in Kombination mit Polarisatoren, Flüssigkristall-Abschwächer, elektro-optisch aktive Kristalle, in ihrer Transmission örtlich oder zeitlich variable Neutraldichte-Filter, akusto-optische Modulatoren sowie Modulatoren, die auf Interferenzeffekten beruhen, wie beispielsweise Michelson- hiterferometer oder Mach-Zehnder-Interferometer, umfasst.
Charakteristisch für andere Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens ist, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels direkter, aktiver Modulation des von der Anregungslichtquelle ausgestrahlten Lichts erfolgt. Beispielsweise ist es möglich, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels Modulation des Anregungsstromes für einen Halbleiterlaser als Anregungslichtquelle erfolgt.
Zahlreiche mögliche Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zeichnen sich dadurch aus, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts periodisch erfolgt. Es ist aber auch möglich, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts nicht-periodisch erfolgt.
Die möglichen Ausführungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zeichnen sich mehrheitlich dadurch aus, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts in der Modulation der eingestrahlten hitensität besteht.
Eine spezielle Variante besteht darin, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts in der gleichzeitigen Modulation der Pulsdauer und der Spitzenleistung des eingestrahlten Anregungslichts besteht, wobei vorzugsweise die Spitzenleistung invers proportional zur Pulsdauer variiert wird und besonders bevorzugt das Integral der Pulsleistung konstant bleibt.
Es ist möglich, das erfmdungsgemässe Verfahren ohne Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse durchzuführen. Bevorzugt werden jedoch solche Ausfuhrungsformen des Verfahrens, welche neben der Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts die Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse umfassen.
Im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens erfolgt typischerweise die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts zeitlich korreliert mit der Modulation der Anregungslichtleistung. Dabei ist es möglich, dass die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einer Frequenz erfolgt, die einem ganzzahligen Vielfachen der Modulationsfrequenz der Anregungslichtleistung entspricht. Zur Durchführung der Trennung der unterschiedlich mit der Anregungslichtintensitat korrelierten Antwortsignalanteile sind gemäss des vorliegenden erfindungsgemässen Verfahrens verschiedene Ausfuhrungsformen möglich.
Mehrere mögliche Ausfuhrungsformen zeichnen sich dadurch aus, dass die Trennung der mchtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer parallelen Reihenentwicklung erfolgt. Es wird bevorzugt, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer parallelen Taylor-Entwicklung erfolgt. Die Vorgehensweise ist im Detail in Beispiel 3.1, im Abschnitt zu den Ausfuhrungsbeispielen der Erfindung, beschrieben.
Andere bevorzugte Ausfuhrungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens zeichnen sich dadurch aus, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer harmonischen Analyse erfolgt. Die harmonische Analyse beruht darauf, dass nichtlineare Systeme bei harmonischer Anregung (Modulation bei konstanter Frequenz) Oberwellen erzeugen. Die Parameter dieser Oberwellen können durch Fourier- Analyse bestimmt werden. Linear mit dem Anregungslicht korrelierte Signale, beispielsweise von Streulicht, tragen nicht zu höheren Harmonischen bei. Weitere Erläuterungen hierzu werden in Beispiel 3.2 gegeben. Mithilfe dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens lassen sich beispielsweise bei Detektion der zweiten Harmonischen streulichtfreie Bilder von durch Zweiphotonen- Absorption induzierten Lumineszenzsignalen anfertigen.
Charakteristisch für eine weitere bevorzugte Gruppe von Ausfuhrungsformen ist, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mittels einer stufenförmigen Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
Besonders bevorzugt wird, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen unter Verwendung eines 4- Stufen- Algorithmus zur Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt. Diese Variante zeichnet sich dadurch aus, dass sie besonders einfach in die Praxis umsetzbar ist. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Leistung des Anregungslichts nicht kontinuierlich bei einer Frequenz moduliert, sondern periodisch in Stufen auf 4 diskrete Werte gesetzt. Dieses führt vorteilhaft dazu, dass der Aufwand zur Durchführung der notwendigen Berechnungen im Vergleich zu anderen Varianten deutlich reduziert werden kann. Diese Ausführungsform ist detailliert in Beispiel 3.3 beschrieben.
Für die vorgenannten Ausfuhrungsformen mit einer stufenförmigen Modulation der Anregungslichtleistung werden die Stufenhöhen vorteilhaft so gewählt, dass die im mathematischen Analyseschritt des erfindungsgemässen Verfahrens zu eliminierenden linear mit dem Anregungslicht korrelierten Anteile oder mit dem Anregungslicht unkorrelierten Anteile in rechnerisch einfacher Weise zu jeweils Null summiert werden können. In der experimentellen Praxis können die Anregungslichtleistungen jedoch oft nicht exakt auf die dafür erforderlichen Sollwerte eingestellt werden, beispielsweise weil die Messung der im Wechselwirkungsraum eintreffenden Anregungslichtleistung schwer durchführbar ist.
Eine weitere bevorzugte Ausführungsform zeichnet sich daher dadurch aus, dass experimentell bedingte Abweichungen der Anregungslichtleistungen von den für die Modulation vorgesehenen Sollwerten mittels numerischer Korrekturen kompensiert werden. Insbesondere ist es vorteilhaft, falls erforderlich, wenn die unter Anwendung eines 4-Stufen Algorithmus zur Modulation gemessenen Antwortsignale mit Korrekturfaktoren multipliziert werden. Die Vorgehensweise zur Bestimmung von Korrekturfaktoren ist in Beispiel 3.3.1 beschrieben.
Vorteilhaft ist, wenn es möglich ist, die Korrekturfaktoren für die Antwortsignale aus gemessenen Anregungslichtleistungen für die Erzeugung besagter Antwortsignale zu bestimmen. Oft ist eine solche Messung jedoch zumindest mit der erforderlichen Genauigkeit nicht durchfühbar. Dann wird bevorzugt, dass die Korrekturfaktoren für die Antwortsignale durch eine numerische Analyse der erzeugten Antwortsignaldaten bestimmt werden, wobei dieses beispielsweise durch Auswertung der Signale aus hierfür ausgewiesenen Teilbereichen eines Wechselwirkungsraumes oder mithilfe separater Messungen (beispielsweise unter Verwendung einer Kalibrationsprobe) erfolgen kann.
Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren verbundenen Berechnungen können mit handelsüblichen Computern in sehr kurzer Zeit durchgeführt werden. Daher zeichnet sich das erfmdungsgemässe Verfahren dadurch aus, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen in Echtzeit zeitgleich (innerhalb der Aufzeichnungszeit für die Signalaufhahme) mit der Aufnahme der Signale aus dem Wechselwirkungsraum erfolgen kann.
Es wird bevorzugt, dass es sich bei dem Wechselwirkungsraum um eine Wechselwirkungsschicht an einer Oberfläche eines festen Trägers handelt, wobei die flächige Ausdehnung des Wechselwirkungsraumes (auf besagter Oberfläche dieses Trägers) durch die Wechselwirkungsfläche mit dem auftreffenden leistungsmodulierten Anregungslicht und seine Tiefe (Ausdehnung senkrecht zu besagter Oberfläche des Trägers) durch die Reichweite der modulierten Anregungslichtintensitat in dieser Raumdimension senkrecht zu besagter Oberfläche des Trägers definiert sind. Typischerweise sind die Bedingungen so gewählt, dass die Anregungslichtintensitat an dieser Oberfläche einen Maximalwert bestimmter Grosse hat und mit Abstand von dem festen Träger und dieser Oberfläche abnimmt. Als Reichweite der Anregungslichtintensitat kann dann beispielsweise ein Abstand von dieser Oberfläche bezeichnet werden, bei dem die Anregungslichtintensitat auf 1/e multipliziert mit der Intensität an dieser Oberfläche abgenommen hat.
Es wird ausserdem bevorzugt, dass sich innerhalb des Wechselwirkungsraumes Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen befinden, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können. Das erfindungsgemässe Verfahren kann vorteilhaft in der biochemischen Analytik eingesetzt werden. Eine Vielzahl biochemischer analytischer Methoden beruht darauf, dass der Nachweis eines oder mehrerer Analyten auf deren spezifischen Bindung mit immobilisierten spezifischen Bindungspartnern beruht.
Bevorzugte Ausfuhrungsformen des erfindungsgemässen Verfahrens sind daher dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers einer oder mehrere spezifische Bindungspartner zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einem Bindungsassay (unter Bindung des Bindungspartners aus einer zugeführten Lösung an den immobilisierten Bindungspartner) immobilisiert sind, wobei der Analytnachweis anhand eines nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten optischen Antwortsignals des immobilisierten Bindungspartners selbst oder des in Lösung zugeführten Bindungspartners oder eines oder mehrerer weiterer, in einem oder mehreren zusätzlichen Verfahrensschritten zugeführter Bindungspartner, erfolgt.
Eine mögliche Variante ist dabei dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um den einen oder die mehreren Analyten selbst handelt, welche eingebettet in eine native Probenmatrix oder in einer mit einem oder mehreren Aufbereitungsschritten modifizierten Form der Probenmatrix immobilisiert sind.
Die native oder in einem oder mehreren Aufbereitungsschritten modifizierte Probenmatrix kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe von Extrakten gesunder oder krankhafter Zellen, (z. B. von menschlichen, tierischen, bakteriellen oder pflanzlichen Zellextrakten), Extrakten von tierischem oder menschlichem Gewebe, wie beispielsweise Organ-, Haut-, Haar- oder Knochengewebe, oder von Pflanzengewebe, sowie von Körperflüssigkeiten oder deren Bestandteilen, wie beispielsweise Blut, Serum oder Plasma, Gelenkflüssigkeiten, Tränenflüssigkeit, Urin, Speichel, Gewebeflüssigkeit, Lymphe. Insbesondere kann es sich auch um Extrakte stimulierter oder unbehandelter Zellen und Extrakte gesunden oder krankhaften Gewebes handeln. Die Probe kann beispielsweise einem Organismus oder Gewebeoder Zellverband oder Zelle mittels einer Methode aus der Gruppe von Gewebeschnitten, Biopsie und „Laser Capture Micro Dissection" entnommen sein. Eine andere Variante des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung immobilisierter spezifischer Bindungspartner besteht darin, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente zur spezifischen Erkennung eines oder mehreren in einer zugeführten Probe befindlicher Analyten handelt.
Besagte Bindungspartner, d.h. die selbst immobilisierten nachzuweisenden oder in einer zugeführten Probe nachzuweisenden Analyten und / oder deren immobilisierte oder in einem zugeführten Nachweisreagens zugeführte biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe, welche Proteine, beispielsweise mono- oder polyklonale Antikörper und Antikörperfragmente, Peptide, Enzyme, Glycopeptide, Oligosaccharide, Lektine, Antigene für Antikörper, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierte Proteine („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag- Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotide) und Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Aptamere, membrangebundene und isolierte Rezeptoren und deren Liganden, durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, natürliche und künstliche Polymere, etc. umfasst.
Es wird bevorzugt, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers aufgebrachte Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder aufgebrachte spezifische Bindungspartner in diskreten Messbereichen (Spots) immobilisiert sind, welche eine beliebige Geometrie, beispielsweise kreisförmige, ovale, dreieckige, rechteckige, polygonartige Form etc. haben können, wobei ein einzelner Messbereich gleichartige oder unterschiedliche Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen oder spezifische Bindungspartner enthalten kann.
Besagte diskrete Messbereiche können beispielsweise durch räumlich selektive Aufbringung von Verbindungen oder Stoffen oder molekularen Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder durch Aufbringung von spezifischen Bindungspartnern auf besagtem festen Träger erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Gruppe von Verfahren, welche "InkJet spotting", mechanisches Spotting, „micro contact printing", fluidische Kontaktierung der Bereiche für die zu erschaffenden Messbereiche mit den zu immobilisierenden Verbindungen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen, sowie photochemische und photolithographische hnmobilisierungsverfahren umfasst.
In vielen Fällen wird die Nachweisgrenze eines analytischen Verfahrens begrenzt durch Signale aufgrund sogenannter unspezifischer Bindung, d.h. durch Signale, welche durch Bindung von Analyten oder anderen, zum Nachweis besagter Analyten eingesetzten Verbindungen erzeugt werden, welche nicht nur im Bereich der immobilisierten spezifischen Bindungspartner, sondern auch in davon unbedeckten Bereichen an der Oberfläche des festen Trägers gebunden werden, beispielsweise durch hydrophobe Adsorption oder durch elektrostatische Wechselwirkungen. Daher ist es von Vorteil, wenn zwischen den räumlich getrennten Messbereichen oder in unbesetzten Teilbereichen innerhalb dieser Messbereiche gegenüber den Analyten und / oder gegenüber seinen Bindungspartnern "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, welche Albumine, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifische, polyklonale oder monoklonale, artfremde oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten und deren Bindungspartner unspezifische Antikörper (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierende, fragmentierte natürliche oder synthetische DNA, wie beispielsweise Extrakte von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladene, aber hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, umfassen. Es sind eine Vielzahl von Methoden für die Immobilisierung von Molekülen oder Molekülgruppen oder -komplexen auf einem festen Träger bekannt. Eine Möglichkeit besteht darin, dass an der Oberfläche besagten festen Trägers aufgebrachte Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit mchtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder aufgebrachte spezifische Bindungspartner direkt oder mittels eines sogenannten Spacers ("Abstandshalters", ausgebildet als eigenständiges Molekül oder molekulare Gruppe) an der Oberfläche besagten festen Trägers immobilisiert sind unter Ausnutzung einer oder mehrerer Arten von Wechselwirkungen aus der Gruppe von Wechselwirkungen, welche hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen und kovalente Bindung umfasst.
Im allgemeinen ist es jedoch von Vorteil, wenn zwischen der Oberfläche besagten festen Trägers und den immobilisierten Verbindungen oder Stoffen oder molekularen Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder den aufgebrachten spezifischen Bindungspartnern eine Haftvermittlungsschicht aufgebracht ist, welche vorzugsweise eine Dicke von weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm hat, und welche vorzugsweise eine chemische Verbindung aus den Gruppen umfasst, welche Silane, funktionalisierte Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte passive oder funktionalisierte Mono- oder Mehrfachschichten", Thiole, Alkylphosphate und -phosphonate, multifunktionelle Block-Copolymere, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycole, umfassen.
Auf der Oberfläche des festen Trägers können eine Vielzahl von diskreten Messbereichen mit darin enthaltenen gleichartigen oder unterschiedlichen spezifischen Bindungspartnern angeordnet sein. Dabei kömien in einer 2- dimensionalen Anordnung mehr als 10, bevorzugt mehr als 100, besonders bevorzugt mehr als 1000 Messbereiche auf einem Quadratzentimeter angeordnet sein.
Es wird bevorzugt, dass besagter fester Träger bei der Wellenlänge des einwirkenden Anregungslichts optisch transparent ist. Ausserdem ist es von Vorteil, wenn besagter fester Träger im wesentlichen planar ist.
Des weiteren wird bevorzugt, dass besagter fester Träger eine optische Wellenleiterstruktur, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
Besonders bevorzugt wird daher, wenn besagter fester Träger einen durchgehenden oder in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilten planaren optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
Ganz besonders bevorzugt wird, dass besagter fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
Für die Einkopplung von Anregungslicht in einen optischen Wellenleiter gibt es eine Reihe unterschiedlicher technischer Lösungen. Es wird bevorzugt, dass eine wellenleitende Schicht besagten festen Trägers mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Gruppe von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensorplattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern. Besonders bevorzugt wird, dass in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht ermöglichen.
Ausserdem ist es vorteilhaft, wenn in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitterperiode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.
Verschiedene Ausfuhrungsformen von optischen Wellenleiterstrukturen, insbesondere basierend auf Dünnschichtwellenleitern, sowie von optischen Systemen, welche für das erfmdungsgemässe Verfahren ebenso wie als Bestandteil eines nachfolgend beschriebenen erfindungsgemässen analytischen Systems geeignet sind, sind beispielsweise in den internationalen Patentanmeldungen WO 95/33197, WO 95/33198, WO 96/35940, WO 98/22799, WO 99/58963, WO 01/13096, WO 01/43875, WO 01/55691, WO 01/79821, WO 01/92870, WO 02/20873, WO 02/21110, WO 02/40998, WO 02/46756, WO 02/46766 und WO 02/79765 beschrieben worden. Der Inhalt dieser Anmeldungen wird hiermit vollumfänglich als Bestandteil der vorliegenden Erfindung eingeführt.
Die mit dem erfindungsgemässen Verfahren nachzuweisenden nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierten Signale können unterschiedlicher Natur sein. Beispielsweise besteht eine Möglichkeit darin, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale die Signale einer Frequenzverdopplung („second harmonic generation"), Summen- oder Differenzfrequenzerzeugung umfassen.
Bevorzugt wird, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale durch eine Multiphotonen- Absorption induziert werden.
Besonders bevorzugt wird, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale durch eine Zweiphotonen-Absorption induziert werden. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein analytisches System zur hochempfindlichen gleichzeitigen Messung nichtlinearer optischer Emissionssignale, ortsaufgelöst in einer oder zwei Ortsdimensionen, umfassend: - mindestens eine Lichtquelle zur Aussendung von Anregungslicht - technische Hilfsmittel zur Leistungsmodulation und / oder Pulsdauermodulation des von der mindestens einen Lichtquelle ausgehenden Anregungslichts ein Wechselwirkungsvolumen oder eine Wechselwirkungsfläche oder eine Wechselwirkungsschicht, gemeinsam bezeichnet als „Wechselwirkungsraum", worin eine oder mehrere nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Emissionen angeregt werden können - mindestens ein ein- oder zweidimensionales Detektor- Array zur Messung des von dem Wechselwirkungsraum ausgehenden Lichts - einen Computer, auf den die Messdaten besagten Detektor- Arrays übertragen und mithilfe dessen die Messdaten in einer ein- oder mehrdimensionalen Datenmatrix formatiert und analysiert werden dadurch gekennzeichnet, dass die zur Intensität des in den Wechselwirkungsräumen verfügbaren Anregungslichts linear proportionalen Anteile des von dort ausgehenden Lichts von zur verfügbaren Anregungslichtintensitat nichtlinear proportionalen Anteilen des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts getremit werden.
Für das erfmdungsgemässe analytische System bestehen gleichartige mögliche Ausfuhrungsformen und Bevorzugungen wie für das vorangehend beschriebene erfindungsgemässe Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung eines erfindungsgemässen analytischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen Verfahrens zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbmdungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid-Polymorphismen, zur Messung von Protein-DNA- wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA- Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antikörpern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und -entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Bestandteil der Erfindung ist ausserdem die Verwendung eines erfindungsgemässen analytischen Systems und / oder eines erfindungsgemässen Verfahrens in der nichtlinearen Optik, der Materialforschung, der Untersuchung von Vorgängen an Phasengrenzen und Oberflächen fester Körper, der Qualitätskontrolle optischer Komponenten, insbesondere für die Laser-Technologie, beispielsweise von frequenzverdoppelnden Komponenten.
Die Erfindung wird nachfolgend beispielhaft, d.h. ohne Einschränkung der Allgemeinheit, weiter erläutert.
Beispiele:
Ein erfmdungsgemässes analytisches System umfasst einen Wechselwirkungsraum gemäss der vorgenannten Definition, in dem mit Variationen eines eingestrahlten Anregungslichts nichtlinear korrelierte Antwortsignale erzeugt werden können, ein optisches System zur Anregung und Detektion (mittels eines ein- oder zweidimensionalen Detektorarrays) besagter Antwortsignale, einen Computer, auf den die Detektorsignale übertragen, in einer Datenmatrix abgespeichert und mithilfe dessen dann die Messdaten nach einer erfindungsgemässen Vorschrift in ihre unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Anteile aufgespalten werden.
Ein erfmdungsgemässes Verfahren umfasst die Verwendung eines erfindungsgemässen analytischen Systems zur Erzeugung und Detektion von nichtlinear mit einem Anregungslicht korrelierten Antwortsignalen in einem wie oben definierten Wechselwirkungsvolumen und die Aufspaltung der aufgenommenen Messdaten nach ihren unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Anteilen.
Das erfmdungsgemässe analytische System und Verfahren werden nachfolgend beispielhaft anhand ihrer genannten Bestandteile, vorwiegend für den speziellen Fall des Nachweises von Lumineszenz induziert durch Zweiphotonen- Anregung erläutert, sind jedoch in allgemeiner Weise auf die Detektion und Quantifizierung nichtlinear mit einem Anregungslicht korrelierter Prozesse anwendbar.
Kurzbeschreibung der Abbildungen:
Figur 1 zeigt als Beispiel eines Wechselwirkungsraumes für die Erzeugung nichtlinear mit einem Anregungslicht korrelierte optische Signale das Schema eines Dünnschichtwellenleiters in Aufsicht, mit Gittern zur Ein- und Auskopplung von Licht in den bzw. aus dem Wellenleiter, zwischen welchen Gittern das Licht im Wellenleiter geleitet wird, und mit auf der Oberfläche erzeugten Messbereichen in Form kreisförmiger Bereiche aufgebrachten Materials (als ganzes bezeichnet als „Sensoφlattform"), in denen die Erzeugung nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierter Antwortsignale nachgewiesen werden soll. Figur 2 zeigt ein geeignetes optisches System zur Erzeugung nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierter Signale, als Bestandteil eines erfindungsgemässen analytischen Systems.
Figur 3 zeigt in einer Fehlfarbendarstellung (Skala am rechten Rand) die von einer Sensorplattform gemäss dem Schema von Figur 1 aufgenommenen Antwortsignale als Überlagerung von 150 Aufnahmen bei modulierter Intensität des Anregungslichts, oben ohne Separation der unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Anteile, unten nach Selektion des nichtlinear korrelierten Antwortsignalanteils nach dem erfingungsgemässen Verfahren.
Figur 4 zeigt Linienprofile der als Bilder in Figur 3 gezeigten Daten längs der Linie y = 0, oben vor, unten nach Selektion des nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierten Antwortsignalanteils nach dem erfingungsgemässen Verfahren.
Figur 5 zeigt die Abhängigkeit des räumlichen Rauschens ,ohne und nach Selektion des nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierten Antwortsignalanteils nach dem erfingungsgemässen Verfahren, von der Anzahl für die Analyse berücksichtigter Aufnahmen.
Figur 6 illustriert eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens unter Verwendung einer stufenförmigen (4-Schritt-) Modulation des Anregungslichts und einer harmonischen Analyse.
1. Wechselwirkungsraum zur Erzeugung nichtlinear korrelierter optischer Signale
Als Wechselwirkungsraum im Sinne der vorangehenden Definition, in dem nichtlineare optische Signale erzeugt werden sollen, dient die an die Oberfläche eines planaren Dünnschichtwellenleiters angrenzende Schicht, deren laterale Ausdehnung durch die Ausbreitungslänge und -breite eines im Wellenleiters geführten Anregungslichts und deren Höhe über dem Wellenleiter durch die Eindringtiefe des evaneszenten Feldes oberhalb des Wellenleiters definiert ist.
Die Wellenleiterstruktur (W) (Figurl) wird gebildet von einem 150 nm dünnen wellenleitenden Film aus Tantalpentoxid (wellenleitende, optisch transparente Schicht (a), n = 2.092 bei 800 nm), der auf einem Glassubstrat (AF45-Glas als optisch transparente Schicht (b), n = 1.496 bei 800 nm) aufgebracht ist (Schichtenstruktur in Figur 1 nicht gezeigt). Zur Ein- und Auskopplung von Licht in bzw. aus der wellenleitenden Schicht (a) dienen im Abstand von 9 mm in der Schicht (a) erzeugte Koppelgitter (c, c') in der Form von Reliefgittern (Gitterperiode 360 nm, Gittertiefe 12 nm). Unter diesen Bedingungen beträgt für Anregungslicht von 800 nm Wellenlänge der Einkoppelwinkel vom Glassubstrat zur wellenleitenden Schicht (a), bezogen auf die Normale zur Ebene der Oberfläche der Wellenleiterstruktur, -20.4°; der äussere Einstrahlwinkel auf die Schicht (b), zur Erfüllung der Einkopplungsbedingung, beträgt -31.4°.
Auf der Wellenleiterstruktur sind zwischen einem ersten, der Einkopplung des Anregungslichts dienenden Koppelgitter (c) (rechts in Figur 1) und einem zweiten, der Auskopplung des im wellenleitenden Film geführten Lichts dienenden Koppelgitter (c') (links in Figur 1) unterschiedliche lumineszenzfähige Farbstoffe in unterschiedlicher Konzentration in diskreten Messbereichen („Spots", Spotdurchmesser 120 μm, (Zentrum-zu-Zentrum) Spotabstand 350 μm) aufgebracht. Mit (d) sind auf der Wellenleiterstruktur durch Aufbringung von zu untersuchenden Farbstoffen erzeugte Messbereiche bezeichnet, wobei ausgefüllte Kreise unter den Versuchsbedingungen lumineszente Messbereiche und nicht ausgefüllte Kreise nicht lumineszente Messbereiche andeuten. Diese lumineszenzfähigen Farbstoffe sollen auf ihre Möglichkeiten zur Aussendung nichtlinear mit einer modulierten Aregungslichtintensität korrelierter Signale untersucht werden. Mit (e) ist die Spindes in der Schicht (a) geleiteten Anregungslichts angedeutet. 2. Optisches System zur Erzeugung nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierter Signale
Ein geeignetes optisches System zur Erzeugung nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierter Signale, als Bestandteil eines erfindungsgemässen analytischen Systems, ist in Figur 2 dargestellt. Als Anregungslichtquelle (f) dient ein gepulster Titan- Sapphir-Laser mit Emission bei ca. 800 nm (Pulslänge: 100 fsec, Repetitionsrate: 80 MHz, eingesetzte mittlere Leistung: bis 1.5 W, spektrale Pulsbreite: 8 nm, Tsunami Modell 3960, Spectra Physics, Mt. View, CA, USA). Nach Durchgang des Lichts durch eine Strahlformungsoptik (g) kann die Intensität des vom Laser ausgestrahlten Anregungslichts mit einem akustooptischen Modulator (h) (Fused Silica Kristall, 60 MHz Trägerfrequenz, ASM-601-23, IntraAction, Bellwood, IL, USA) kontinuierlich zwischen 0 % und 80 % der Ausgangsleistung reguliert werden. Dabei dient eine Apertur (i) dazu, die nullte Ordnung des transmittierten Lichts nach dem akustooptischen Modulator auszublenden. Alternativ kann mithilfe einer rotierenden Halbwellen-Platte (j) für 800 nm und eines Polarisators (k) die hitensität des Anregungslichts zwischen 0 % und 100 % der Ausgangsleistung reguliert werden. Beide Intensitätsregulierungen können mit einem Computer gesteuert werden.
Nach den alternativ zu verwendenden Komponenten zur Intensitätsregulierung können im Anregungsstrahlengang (in Richtung der Wellenleiterstruktur) Linsen (1), z. B. Zylinderlinsen, eingesetzt werden, um auf dem Einkoppelgitter (c) der Wellenleiterstruktur (W) parallel eingestrahlte Anregungslichtbündel gewünschter Geometrie zu erzeugen. Das eingestrahlte Anregungslicht wird über einen Spiegel umgelenkt auf das Einkoppelgitter (c) der Wellenleiterstruktur, welche auf einem Justierelement montiert ist, welches Translation in x-, y- und z-Richtung (parallel und in den Achsen senkrecht zu den Gitterlinien) und Rotation (mit Drehachse übereinstimmend mit den Gitterlinien des Einkoppelgitters) erlaubt.
Für die nachfolgend berichteten Schritte des Experiments wird der Laserstrahl der Amegungslichtquelle in den meisten Fällen mit einer Zylinderlinse (f = 40 mm) senkrecht zu den Gitterlinien kollimiert, so dass auf dem Gitter typischerweise ein elliptischer ausgeleuchteter Bereich von ca. 0.1 mm x 1 mm bis 2 mm (mit langer Achse parallel zu den Gitterlinien) erzeugt wird. Die Halbwertsbreite des in die wellenleitende Schicht eingekoppelten Anregungslichts beträgt unter diesen Bedingungen typischerweise entsprechend 1 mm bis 2 mm. In einer früheren Arbeit (WO 02/79765) wurde gezeigt, dass unter diesen Bedingungen längs der gesamten Spur des im Wellenleiter geführten Lichts an der Wellenleiteroberflächen Lumineszenzanregung durch Zweiphotonen- Absorption, als ein Spezialfall von nichtlinear mit einem Anregungslicht korrelierten Antwortsignalen, erzeugt werden kann.
Die Intensität des auf das Einkoppelgitter der Wellenleiterstruktur auftreffenden Anregungslichts des gepulsten Lasers (Pulsfrequenz: 80 MHz) wird durch Rotation einer im Anregungsstrahlengang befindlichen Halbwellen-Platte („half-wave plate") (j) bei konstanter Einstellung eines ebenfalls im Anregungsstrahlengang montierten Polarisators (k) periodisch sinusförmig moduliert. Eine vollständige Drehung der Halbwellen-Platte ist verbunden mit 4 vollständigen, sinusförmigen Modulationsperioden der auf das Einkoppelgitter eintreffenden Anregungslichtintensitat. Das von der Wellenleiterstruktur ausgehende Licht wird mit einer Sammeloptik gesammelt und, ohne weitere spektral selektive Komponenten im Emissionsstrahlengang, auf eine CCD-Kamera (m) (AstroCam, TE3/A, Cambridge, GB) als Detektor geleitet. Während einer Umdrehung der Halbwellen-Platte werden etwa 100 Kamerabilder aufgenommen und deren digitale, pixelaufgelöste Daten zur Weiterverarbeitung zu einem Computer geleitet.
Als weitere optionale optische Komponenten sind in Figur 2 ein hiterferenzfilter (n) angedeutet, der vor der CCD-Kamera positioniert werden kann, ein optisches Leistungsmessgerät (o), mit dem beispielsweise die Intensität des transmittierten Lichtanteils hinter der Wellenleiterstruktur gemessen werden kann, und ein optisches Spektrometer (p), mit dem beispielsweise das Spektrum des am zweiten Gitter (c') ausgekoppelten Lichts analysiert werden kann. Diese letztgenannten Komponenten sind keine notwendigen Bestandteile eines erfindungsgemässen analytischen Systems. 3. Trennung der unterschiedlich mit der Anregungslichtintensitat korrelierten Signalanteile
Zur Umsetzung der Trennung der unterschiedlich mit der Anregungslichtintensitat korrelierten Antwortsignalanteile sind gemäss des vorliegenden erfindungsgemässen analytischen Systems und des damit auszuführenden erfindungsgemässen Verfahrens verschiedene Ausfuhrungsformen möglich.
3.1. Parallele Taylor-Entwicklung
Gegeben sei ein Antwortsignal s in Abhängigkeit von der Leistung P eines Anregungslichts in Form einer Taylor-Reihe. s = a0 + a P + a2 - P2 (1) ao ... Hintergrund , aι ... lineares Streulicht , a2 ... nichtlineares Signal
Wenn s(P) für drei verschiedene Leistungen P gemessen wird, lassen sich die Werte für a0, αl5 and a2 berechnen. Ein Bild von a2 für jeden Bildpunkt ergibt ein hintergrund- und streulichtfreies Bild des nichtlinear korrelierten Signalanteils (im Spezialfall des durch Zweiphotonen- Ansorption induzierten Lumineszenzsignals).
Wird s(P) für mehr als drei Leistungen gemessen, so lassen sich die Werte für a0, av and a2 nach einer Ausgleichsrechnung nach dem Gauß 'sehen Verfahren der kleinsten Quadratabweichung bestimmen. Für den Fall von Gl. (1) ergibt diese Rechnung einen polynomialen Algorithmus, der sich leicht vektorisieren lässt. Damit lassen sich die Koeffizienten a0, a}, und a2 für ein ganzes Bild innerhalb kürzester Zeit (in Echtzeit) berechnen.
Wir wählen folgende Bezeichnungen: P "\ .. einfallende Leistung, Bild n. s^y) ... Signal des Bildpunktes (x,y), Bild n. ak ... a0, ÖJ, a2 Koeffizient des Bildpunktes (x,y). Die Anwendung des Gauß'schen Prinzips auf Gl. (1) ergibt: d L") -an (»)_( c^) xt*j>) Hw *> 0 für k = 0, 1, 2 (2) da H,. u *,y) daraus folgt:
(3)
und unter Verwendung der folgenden Abkürzung SPo=∑l = N, Sp1=∑PM,..., Sp4=∑Pi" (4) cy -V ) „ -V ) p(") c,„ _V ) p(")2 (5) n n n ergibt sich als Lösung
mit 3 2 ^ ^4 = jSp2 — 2-Sp1- Sp2 • Sp3 + Sp3 + Sp • Sp4 - Sp2 • Sp4 (7) und (Sp3 ■ Sp3 - SpA ■ Sp2) (Sp, ■ Sp4 - Sp2 ■ Sp3) (Sp2 ■ Sp2 - Sp, • SpJ c= (Spλ-Sp4-Sp3-Sp2) (Sp2-Sp2-Sp0-Sp4) (Sp0 ■ Sp - Sp1 • Sp2) (8) (Sp2 ■ Sp2 - Sp3 • Spt) (Sp0 ■ Sp3 - Sp2 ■ Spλ) (Spλ ■ Sp, - Sp0 ■ Sp2)_
Im vorliegenden Beispiel wird mithilfe der parallelen Taylor-Entwicklung eine Serie von 150 CCD-Kamerabildern, jeweils mit einem (geometrisch identischen) Bildausschnitt von 100 x 400 Bildpunkten, analysiert. Dieses bedeutet die Erstellung von 40000 quadratischen Fits für 6000000 Datenwerte. Die Auswertung erfolgt durch einfache Matrizenmultiplikation innerhalb eines Bruchteils einer Sekunde mit heute handelsüblichen Computern. Die Ergebnisse der Analyse sind in den Figuren 3 bis 5 dargestellt. Von Vorteil ist, dass bei Verwendung derselben Leistungsvariation P(n) nur der Vektor {ιSz(X,y) , &P(x,y) , Szp2(x,y)} neu berechnet werden muss. Die Matrix {c^}, deren Berechnung relativ zeitaufwendig ist, und der Faktor^ bleiben konstant und müssen nicht neu berechnet werden, selbst wenn das Messobjekt gewechselt wird oder wenn an einem Messobjekt mehrere gleiche Zyklen P(n) gemessen werden, um durch Mittelung der resultierenden Lösungsvektoren L das Signal-zu-Rausch- Verhältnis zu verbessern.
Der obere Teil von Figur 3 zeigt den Mittelwert einer Serie von 150 Kamerabildern, die während 1.5 Drehungen der Halbwellen-Platte aufgenommen wurden. Ein gleichartiges Bild ergibt sich in etwa bei Aufnahme eines einzigen Bildes mit entsprechend langer Belichtungszeit, bei der, ohne Modulation der Anregungslichtintensitat, die gleiche Gesamtleistung des Anregungslichts eingestrahlt wird. Zu erkemien sind ausschliesslich Streulichtanteile des Anregungslichts, auf der rechten Seite (x = 0 mm) am Einkoppelgitter, auf der linken Seite (x = -9 mm) am Auskoppelgitter, dazwischen längs der Spur des im wellenleitenden Film geführten Lichts. Der eingestrahlte Laserstrahl war in diesem Fall auf etwa 1 mm parallel zu den Gitterlinien aufgeweitet.
Der untere Teil von Figur 3 zeigt die gleiche gemittelte Bildserie, nachdem mithilfe der vorangehend beschriebenen Methode der parallelen Taylor-Entwicklung die linear und die nicht mit dem modulierten Anregungslicht korrelierten Signalanteile entfernt wurden. Zu erkennen sind deutlich mindestens 9 Spots mit immobilisierten Farbstoffmolekülen, von denen eine nichtlineare Emission, in diesem Falle eine durch Zweiphotonen- Absorption angeregte Lumineszenz, ausgeht. Diese ortsaufgelöst detektierte Emission stammt aus dem Anteil von im evaneszenten Feld des Wellenleiters angeregter Lumineszenz, welcher weitgehend isotrop in den umgebenden Raum abgestrahlt wird.
Ein erheblicher Anteil von im evaneszenten Feld angeregter Lumineszenz koppelt in den Wellenleiter zurück und wird dort geleitet, wobei es für die Ausbreitung im Wellenleiter keine Vorzugsrichtung gibt. Die in diesem Teil von Figur 3 im Bereich der Koppelgitter erkennbaren Signale entsprechen wahrscheinlich dem Anteil in den Wellenleiter rückgekoppelter Lumineszenz nach Zweiphotonen- Anregung, der an besagten Koppelgittern wieder ausgekoppelt wird.
Figur 4 zeigt Linienprofile der digitalisierten Messwerte von Figur 3 parallel zur x- Achse von Figur 3 für y = 0 mm. Im oberen Linienprofil ist keinerlei spezifisches Signal, sondern nur starkes Streulicht mit einer hohen räumlich statistischen Variation erkennbar. Im unteren Linienprofil sind, neben den Signalen von den Koppelgittern (bei x = -9 mm und x = 0 mm) deutlich die nichtlinearen Signale aus 3 Messbereichen (Spots) erkemibar (bei x = -7.3 mm, x = -3 mm und x = -1.8 mm). Ausserdem ist noch eine schwächere Emission (bei x = -7 mm) desselben Farbstoffs wie bei x = -7.3 mm erkennbar, der hier in niedrigerer Konzentration immobilisiert wurde (schwach auch im unteren Teil von Figur 3 erkennbar).
Figur 5 verdeutlicht die Leistungsfähigkeit des erfindungsgemässen analytischen Verfahrens anhand der erreichten Verminderung des „räumlichen Signalrauschens". Dabei wird unter dem „räumlichen Signalrauschen" die lokale Variation der Signale, ohne Einfluss eines spezifischen Emissionssignals verstanden, d.h. das Rauschen des Streu- und Hintergrundlichts. Zur Erstellung dieser Graphik wurde eine zunehmende Anzahl von Bildern, bis zu einem Maximum von 150 Bildern, für die Analyse berücksichtigt (d.h. gemittelt). Analysiert wurde der Bereich zwischen x = -6 mm und x = - 4 mm (entlang y = 0 mm) aus Figur 3, in dem keine nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierten spezifischen Emissionen festgestellt worden waren. Die Anzahl berücksichtigter Bilder führt bei der Mittelung der Daten ohne Separation in die unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Anteile zu keinerlei Verminderung des Rauschens (σavg = const). Es ist lediglich möglich, durch längere Belichtungszeiten und höhere Integrationszeiten das zeitliche Signalrauschen zu vermindern (hier nicht analysiert). Demgegenüber führt die Separation der unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Signalanteile mithilfe der parallelen Taylor-Entwicklung, gemäss dem erfindungsgemässen Verfahren, zu einer immer stärkeren Verminderung des Rauschens der nichtlinear korrelierten Signalanteile bei Berücksichtigung einer grösseren Anzahl von Bildern. Bei Berücksichtigung von 150 Bildern wurde bereits eine Verminderung des Rauschens um einen Faktor 25 erreicht. Dieser Verbesserungsfaktor kann bei Berücksichtigung einer grösseren Anzahl von Bildern noch weiter erhöht werden.
3.2. Harmonische Analyse
Ein anderer Ansatz wird bei der harmonischen Analyse gewählt. Sie beruht darauf, dass nichtlineare Systeme bei harmonischer Anregung (Modulation bei konstanter Frequenz) Oberwellen erzeugen. Die Parameter dieser Oberwellen können durch Fourier- Analyse bestimmt werden. So eine Fourier- Analyse lässt sich ebenfalls für Bilderserien vektorisieren und als einfache Matrizenmultiplikation durchführen, wie im Fall der Analyse beruhend auf paralleler Taylor-Entwicklung beschrieben. Linear mit dem Anregungslicht korrelierte Signale, beispielsweise von Streulicht, tragen nicht zu höheren Harmonischen bei. Mithilfe dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens lassen sich beispielsweise bei Detektion der zweiten Harmonischen streulichtfreie Bilder von durch Zweiphotonen- Absorption induzierten Lumineszenzsignalen anfertigen.
3.3. -Schritt Algorithmus
Eine besonders einfach in die Praxis umsetzbare Variante der Ausfuhrungsform unter Verwendung der harmonischen Analyse beruht auf der Anwendung eines 4-Schritt Algorithmus. In dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die Leistung des Anregungslichts nicht kontinuierlich bei einer Frequenz moduliert, sondern periodisch in Stufen auf 4 diskrete Werte gesetzt. Der zeitliche Verlauf der Signalmodulation (hier gemessen in der Anzahl sequentiell aufgenommener Kamerabilder des Antwortsignals) ist in Figur 6 dargestellt. Ausgedrückt in relativen Einheiten, wird die auf den Wechselwirkungsraum einwirkende Intensität des Anregungslichts sequentiell auf die Werte 0, 1, 2 und 1 eingestellt. Diesem Anregungslichtprofil folgen die linear korrelierten Antwortsignalanteile (z.B. von Streulicht), ausgedrückt in relativen Einheiten, in gleicher Weise (0, 1, 2, 1 entsprechend nicht skalierten Werten a, b, c, d), wie in Figur 6 durch die eng schraffierten Flächen dargestellt. Beispielsweise die Anteile von quadratisch mit dem Anregungslicht korrelierten Emissionen (wie z. B. Lumineszenz nach Zweiphotonen- Absorption), folgen der Anregungslichtintensitat, wiederum ausgedrückt in relativen Einheiten, mit den Werten (0, 1, 4, 1 entsprechend nicht skalierten Werten a', b', c', d'; weit schraffierte Flächen in Figur 6).
Aus Figur 6 wird deutlich ersichtlich, dass das bei der Grundfrequenz (ώ) dieser stufenförmigen Modulation des Anregungslichts detektierte Antwortsignal sowohl linear als auch nichtlinear (in diesem Fall quadratisch) mit dem Anregungslicht korrelierte Anteile enthält. Demgegenüber enthält das bei der zweiten Harmonischen (2oS) detektierte Signal keine linear korrelierten Anteile (z. B. von Streulicht) mehr, wie aus der Detailbetrachtung der Funktionsweise dieser Ausfuhrungsform des erfindungsgemässen Verfahrens ersichtlich wird:
Die zu den verschiedenen Zeitpunkten, korreliert mit der Grundfrequenz bzw. der zweiten Harmonischen gemessenen Antwortsignalwerte, (0, 1, 2, 1) bzw. (0, 1, 4, 1) werden entsprechend der Fourier- Analyse mit cos(ß) t) bzw cos(2ω t) multipliziert und die Produkte anschliessend summiert..
Der Zeitnullpunkt sei dabei bei Aufnahme der Signalanteile c bzw. c' gewählt. Diese cos-Werte ergeben dann für die Grundwelle die Werte (-1, 0, 1, 0) und für die zweite Harmonische die Werte (1, -1, 1, -1), mit denen die Signalwerte zu multiplizieren sind. Die Ausführung dieser Multiplikation der Messwerte mit den cos-Werten, zusammen mit der Bildung der Summen, zur Bestimmung der Fourier-Koeffizienten, für die linear korrelierten Signalanteile (bezeichnet als „lineare Signale" in der Tabelle) und die nichtlinear (hier quadratisch) korrelierten Signalanteile (bezeichnet als „nichtlineare Signale" in der Tabelle) ist in Tabellenform in Figur 6 widergegeben. Hieraus wird ersichtlich, wie, dieser Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens folgend, die linear mit dem Anregungslicht korrelierten Anteile bei Detektion entsprechend der zweiten Harmonischen eliminiert werden.
Für die Anwendung in der Praxis ist es von wesentlichem Vorteil, dass die cos-Werte bei 2 ω abwechselnd -1 und +1 sind, d.h., dass sich die Fourier- Analyse auf einfaches, abwechselndes Addieren und Subtrahieren der Signalwerte reduziert, was den Aufwand der numerischen Analyse wesentlich vermindert. Auch wenn diese Variante hier nur am Beispiel der numerischen Behandlung für einen einzelnen Messort demonstriert ist, lässt sich selbstverständlich diese Variante des erfindungsgemässen Verfahrens auf ein- oder zweidimensionale Bilder anwenden, welche bei einer entsprechenden stufenförmigen Modulation des Anregungslichts aufgenommen und deren Daten bei der zweiten Harmonischen der Modulationsfrequenz analysiert werden. Insbesondere bei einer grossen Anzahl von Bildpunkten erweist sich der äuserst einfache Algorithmus als besonders vorteilhaft.
Für eine quantitative Analyse müssen die Signalwerte der einzelnen Bildpunkte anschliessend noch entsprechend skaliert werden. Soll beispielsweise der skalierte Signalwert dem mittleren Signal eines 4-Stufen Zyklus (0, 1, 2, 1) entsprechen, welches bei der ersten Stufe gemessen wird, so beträgt der Skalierungfaktor ~, wobei N die Anzahl der Messzyklen ist: 02 + l2 + 22 + l2 _ 3 s ** - <h ~ 4 --• «, (9) Stfen = a2(02 -l2 + 22 -l2)N = 2N- a2
Soll der skalierte Signalwert dem Signal entsprechen, welches man für eine konstante Leistung messen würde, die der mittleren Leistung eines ganzen 4-Schritt Zyklus entspricht, so beträgt der Skalierungfaktor ~^:
'4-Stufen = a2(0 -V + 2 -V)N = 2N-
3.3.1. Korrekturfaktoren für den 4-Schritt Algorithmus
Für den Fall, dass die eingestellte Anregungsleistung, welche zu den linear korrelierten Sigalanteilen b und d führt, nicht exakt dem Mittelwert der Amegungsleistungen mit den resultierenden Signalanteilen a und c entspricht, können linear korrelierte Signalanteile (z.B. Streulicht) nicht vollständig mit der Methode des 4-Schritt Algorithmus unterdrückt werden. Eine einfache Weiterentwicklung der speziellen Variante des erfindungsgemässen Verfahrens besteht dann darin, die den Bildern entsprechenden Daten vor Durchführung der Addition/Subtraktion mit einem Korrekturfaktor zu multiplizieren. Die entsprechenden Korrekturfaktoren für die Aufnahme der Messdaten a, b, c, d müssen für eine Messanordnung nur einmal bestimmt werden.
Im folgenden werden die Multiplikationsfaktoren für die 4 Stufen (+1,-1 ,+1,-1) durch die Korekturfaktoren { ca, cb, cc, } ersetzt.
Für den Fall, dass es möglich ist, die effektive Anregungsleistung bei den 4 Stufen, Pa, Pb, Pc, d zu messen, lassen sich die Korrekturfaktoren folgendermassen bestimmen:
Das Hintergrundlicht ist nicht korreliert mit dem Anregungslicht. Damit lautet die Bedingung zur Elimination des Hintergrundslichts, d.h. die zugehörige Filterbedingung: (ll.i) ca + cb + cc + cd = 0
Demgegenüber ist das Streulicht linear mit dem Anregungslicht korreliert, so dass die entsprechende Filterbedingung lautet: (ll.ii) ca Pa + cb Pb + cc Pc + cdPd = 0
Die Gleichung für die Signalskalierung (im Falle der Lumineszenz nach Zweiphotonen- Absorption, welche quadratisch mit dem Anregungslicht korreliert ist) lautet: (11 ii) ca Pa 2 + cb Pb 2 + cc Pc 2 + cd Pd 2 = (Pa 2 + Pb 2 + P 2 + Pf) 13
Auf der rechten Seite von Gleichung (11. iii) wird anstelle des arithmetischen Mittelwerts (Division durch 4) ein um 4/3 höherer Wert verwendet. Die Ursache ist die hier gewählte Signalnormierung (siehe Gleichung (9)); die Normierung kann jedoch auch anders gewählt werden.
Damit sind drei Bedingungen zur Bestimmung von 4 Unbekannten gegeben. Das System ist so also noch unterbestimmt. Diesen noch bestehenden Freiheitsgrad kann man beispielsweise benutzen, um das zeitliche Rauschen zu minimieren. Dieses ist gleichbedeutend mit der Minimierung der Summe der Quadrate der Beiträge, so dass alternativ die Bedingungen (1 l.iv.a) für die Rauschunterdrückung des Hintergrundlichts oder (1 l.iv.b) für die Rauschunterdrückung des Streulichts als vierte Bedingungen zur Bestimmung der vier Korrekturfaktoren verwendet werden können: (1 l.iv.a) cf + cf + cf + cf - min (11.iv.b) ca Pf + cb Pf + cc Pf + cd Pf → min
Für den Fall, dass die Korrekturfaktoren aus gemessenen Bilddaten bestimmt werden sollen, kann in einem entsprechenden Bildbereich, in dem keine nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Signale erfasst sein sollten, die Analyse unter Benutzung der Bedingung (11.iv.b) durchgeführt werden. Vorteilhaft ist, wenn in diesem Bildbereich die Signale eines Streukörpers erfasst sind. Durch iterative Variation werden die Koeffizienten derart angepasst, dass die Signalwerte a2 des 4-Stufen Algorithmus im Kahbrationsbereich gegen 0 konvergieren, die linearen Anteile aj am Streukörper gegen endliche Werte, im übrigen Kalibrationsbreich gegen 0 konvergieren, und die Hintergrundwerte ao gegen einen konstanen Wert, oder gegen einen möglichst glatten Verlauf, oder gegen die Dunkelfeldwerte des Detektorsystems konvergieren. Je nach Anwendungsfall lassen sich die Konvergenzkriterien unterschiedlich definieren. Die hier genamite Vorgehensweise ist daher nicht als von allgemeiner Natur, sondern nur als ein mögliches Beispiel zu verstehen.
3.4. Alternative Techniken
Nachfolgend werden alternative Techniken beschrieben, welche ebenfalls den nichtlinearen Charakter der Zweiphotonen- Absorption und ausgewählte Modulationsverfahren benutzen, um Hintergrundlicht und Streulicht effizient zu unterdrücken. 3.4.1. Pulsdauermodulation
Für die meisten Anwendungen ist die Verwendung von gepulsten Lichtquellen (modengekoppelten Lasern) wegen deren hoher Spitzenleistungen von Vorteil: Zum Zeitpunkt des Lichtpulses stehen für einen kurzen Zeitraum sehr hohe Anregungsleistungen zur Verfügung, welche ausreichend sind zur Anregung nichtlinear korrelierter Antwortsignale. Insbesondere wenn die Pulsdauer sehr kurz im Vergleich zum Zeitraum zwischen zwei aufeinanderfolgenden Pulsen ist, kann aber trotzdem eine hohe Belastung der Probe (des Wechselwirkungsraumes) durch Anregungslicht vermieden werden, da die einwirkende zeitliche Durchschnittsintensität des Anregungslichts relativ niedrig eingestellt werden kann.
Eine andere mögliche Ausführungsform eines erfindungsgemässen analytischen Systems und damit auszuführenden erfindungsgemässen Verfahrens beruht darauf, nicht die Intensität des auf den Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts zu variieren, sondern die Pulsdauer, beispielsweise über ein Element mit einstellbarer Dispersion der Gruppenlaufzeit (GDD, group delay dispersion). Die Variation der Gruppenlaufzeit und damit die Variation der Pulsdauer bei gleichbleibender Pulsenergie kann beispielsweise mittels eines Gires-Tournois-Interferometer- (GTI) Spiegels mit elektrisch steuerbarer optischer Dicke erfolgen.
In den Fällen der vorangehend beschriebenen Beispiele beruht Trennung von linear und nichtlinear mit dem Anregunglicht korrelierten sowie unkorrelierten Signalen darauf, dass unter den Versuchsbedingungen das Streulicht proportional zur Anregungslichtleistung und Lumineszenz nach deren Anregung durch Zweiphotonen- Absorption proportional zum Quadrat der Anregungslichtleistung ist. Für gepulste Anregung ist dieses gültig, wenn die Leistungssmodulation durch variable Abschwächung oder Verstärkung des ganzen Pulszuges erfolgt, ohne die Pulsdauer oder die Wiederholrate der Pulse zu verändern.
Vorteilhaft wird die Modulation der Pulsdauer so durchgeführt, dass das Integral der Pulsleistung während der Pulse konstant bleibt, d.h. dass beispielsweise bei kürzeren Pulsen die Spitzenleistung entsprechend erhöht wird. Unter diesen Voraussetzungen ist das Streulicht unabhängig von der Spitzenleistung, und eine durch Zweiphotonenanregung induzierte Lumineszenz ist dann linear proportional zur Puls- Spitzenleistung. Folglich ist das gesuchte Signal im Fall der parallelen Taylor- Entwicklung dann durch den Koeffizienten ; statt a2 gegeben. Im Fall der harmonischen Analyse ist das gesuchte Signal unter diesen Bedingungen mit der Grundfrequenz moduliert. Ein Vorteil dieser Variante des erfindungsgemässen Verfahrens ist beispielsweise, dass aufgrund der konstanten mittleren Intensität mögliche thermische Effekte, aufgrund möglicher Absorption des mit hoher Intensität eingestrahlten Anregungslichts, ebenfalls konstant sind und damit zu keiner Beeinflussung der Resultate in komplexerer Weise führen.
Ein weiterer Vorteil ist, dass man im Fall der Zweiphotonen-Absorption, bei Verwendung einer stufenförmigen Modulation des Anregungslichts sogar mit nur 2 Stufen (Pulsdauern), anstelle von 4 Stufen, arbeiten kann. Bei Anwendung des 2- Stufen Algorithmus werden, in analoger Weise wie vorangehend für den 4-Stufen Agorithmus beschrieben, die den Einzelbildern entsprechenden Signalwerte ebenfalls abwechselnd addiert und subtrahiert. Auf diese Weise können ebenfalls die durch Zweiphotonen-Absorption ausgelösten Signale selektiert und die Streulicht- und Hintergrundsignalanteile unterdrückt werden.
3.4.2. Doppelstrahl-Anregung
Als eine weitere mögliche Variante eines erfindungsgemässen analytischen Systems und damit auszuführenden erfindungsgemässen Verfahrens zeichnet sich eine Doppelstrahl- Anregung dadurch aus, dass (im Falle der Zweiphotonen- Anregung) die beiden gleichzeitig zu absorbierenden Photonen nicht notwendigerweise von der gleichen Lichtquelle (Laser) stammen und nicht notwendigerweise dieselbe Wellenlänge haben müssen. Wirken zwei ausreichend starke Laserstrahlen gleichzeitig auf den Wechselwirkungsraum ein, so ergeben sich drei Beiträge zu einer Zweiphotonen-Absorption: ein Beitrag ist proportional zum Quadrat der Intensität des ersten Anregungsstrahls, ein zweiter Beitrag proportional zum Quadrat der Intensität des zweiten Anregungsstrahl, und ein dritter Beitrag is proportional zum Produkt der Intensitäten des ersten und des zweiten Anregungsstrahls. Dabei können die Wirkungsquerschnitte (die Grossen) der drei Beiträge unterschiedlich sein. Es ist beispielsweise möglich, dass nur einer der drei Beiträge von signifikanter Grosse ist.
Wenn die beiden Anregungslichtstrahlen die (unterschiedlichen) Wellenlängen λ\ und λi haben, so ergibt sich die Anregungsenergie des entsprechenden Zweiphotonen- Absorptionsprozesses aus der Summe der Einzelphotonenenergien. Somit erhält man für die Anregungswellenlänge λa = (Yλι + yΛ ..Vorteilhaft ist, wenn einer der beiden
Laser in der Wellenlänge abstimmbar ist (d.h. eine variable Emissionswellenlänge besitzt). Dann lassen sich verschiedene Analyten spezifisch anhand ihrer Zweiphotonen- Absorptionswellenlänge nachweisen, indem einer der beiden auf den Wechselwirkungsraum einwirkenden Lichtstrahlen in seiner Wellenlänge variiert wird.
Damit gleichzeitig je ein Photon aus den beiden Laserstrahlen absorbiert werden kann, müssen im Fall von zwei gepulsten Laserquellen beide Pulse zeitlich und räumlich im Wechselwirkungsraum vorhanden sein. Ist nun einer der beiden Laser, beispielsweise ein durchstimmbarer Laser, ein Dauerstrichlaser (d.h. kontinuierlich emittierend), so ist die notwendige zeitliche Überlappung automatisch gewährleistet. Dabei können die eingesetzten Anregungslichtintensitäten beispielsweise so ausgewählt sein, dass mithilfe des einen, gepulsten Lasers die notwendige Spitzenleistung für effiziente Zweiphotonenabsorption bereitgestellt wird, während der Dauerstrichlaser für die Energieselektion des Absorptionsüberganges (entsprechend der vorangehenden Summenbildung für die resultierende Anregungswellenlänge) eingesetzt wird.
Die in Abschnitt 3.1 bis 3.3 beschriebenen Verfahren lassen sich auch in Kombination mit einer Doppelstrahl-Anregung durchführen. Dabei soll nur Lumineszenz aus dem Beitrag der gemischten Zweiphotonen- Absorption sichtbar gemacht werden. Streulicht, sowie Lumineszenz aus den beiden Beiträgen der Einzelstahl Zweiphotonen-Absorption, sofern vorhanden, sollen unterdrückt werden. Einer speziellen Variante des erfindungsgemässen Verfahrens folgend, werden die Intensitäten 1 und 2 der beiden Strahlen unabhängig voneinander moduliert. Die Abhängigkeit des gemessenen Signals lautet dann: s = a0 + 1/, • P1 + vx ■ P2 + u2 ■ Pf + v2 • Pf + a PP2 (11)
Gesucht ist der Koeffizient α2 für jeden Bildpunkt (x,y).
Im Fall der parallelen Taylor-Entwicklung lautet das zu lösende Gleichungssystem:
Σ *—lfö) -«o - « l,lXιy i 1 ' -v l,^j P 22 W - u 22(I])1) P 1 nf -v22(w) Py 2 Ϋ -a22^ i 1 >/» a 2w1 =0 δK, \ (XJ» 0M (χ,y) n mit X... a0,ul,vl,u2,v2,a2 (12)
Im Fall der harmonischen Analyse werden P\ und 2 vorteilhaft mit unterschiedlichen Frequenzen ω und ^a≥ moduliert. Das gesuchte Signal kann dann sowohl bei der Summenfrequenz (ω +coi) als auch bei der Differenzfrequenz (ω\-ωi) detektiert werden.
Im Fall des 4-Stufen Algorithmus wird vorteilhaft die Intensität der beiden Strahlen P\ und P2 entsprechend den Werten (0,0,1,1) und (0,1,0,1) moduliert. Daraus ergibt sich als ein wesentlicher Vorteil, dass anstelle von akusto-optischen, elektro-optischen oder polarisationsbasierenden Modulatoren einfache, mechanische Verschlüsse, beispielsweise rotierende „Chopper" verwendet werden können. Indem mit diesen mechanischen „Choppern" lediglich der Lichtweg alternierend blockiert und freigegeben wird, kann, als ein weiterer Vorteil gegenüber den zuvor genannten Arten von Modulatoren das Problem von Veränderungen der Stahllage und der Fokussierung, welches sich bei Verwendung dieser Modulatoren ergeben kann, gänzlich vermieden werden. Ausserdem sind mit einem Chopper die theoretisch optimalen Leistungen „0%" und „100%" Transmission sehr gut realisierbar. Eine 50% Leistungsstufe entfällt hier. Die Auswertung der 4 Bilder erfolgt durch Summation mit den Koeffizienten {+1 - 1 -1,+1 } . Analog zu Abschnitt 3.3 und Figur 6 ergeben sich somit für die Beiträge eines 4-Stufen Zyklus von ao, ul9 vi, u , v2, a2: a0 : (+1) + (-1) + (-1) + (+1) = 0 «, : (0) + (0) + (-1) + (+1) = 0 v, : (0) + (-1) + (0) + (+1) = 0 u2 : (0) + (0) + (-1) + (+1) = 0 v2 : (0) + (-1) + (0) + (+1) = 0 a2 : (0) + (0) + (0) + (+1) = 1
Als weitere Variante von Ausfuhrungsformen der Erfindung basierend auf einer Doppelstrahl-Technik kann die Modulation der Intensität eines oder beider Strahlen durch die Modulation eines anderen Strahlparameters, beispielsweise der Pulsdauer oder der räumlichen Position, ersetzt werden.
4. Anwendung auf weitere nichtlineare optische Prozesse
Verschiedene Ausfuhrungsformen eines erfindungsgemässen analytischen Systems und damit auszuführender Verfahren wurden vorangehend vor allem an Beispielen zur Anwendung auf Lumineszenzanregung durch Zweiphotonen- Absoφtion erläutert. Die Erfindung ist jedoch auch auf andere nichtlineare optische Prozesse anwendbar, wie im folgenden demonstriert werden soll.
4.1. Mehrphotonenanregung
Bei Mehrphotonenanregung ist die Abhängigkeit des Lumineszenzsignals von der Anregungsleistung gegeben durch s = a0 + a1 - P + am - P'" (14) wemi m Photonen gleichzeitig absorbiert werden. Eine Anregung durch Mehrphotonen- Absorption der Ordnung m entspricht dann einer linearen Absoφtion (Einphotonen- Absoφtion) bei einer Wellenlänge ex =λι Im, wenn die Wellenlänge des Amegungslasers XL beträgt. Bei einer Anregungswellenlänge von 800 nm können Mehφhotonen-Absoφtionen durch entsprechend ausgewählte Farbstoffe oder Chromophoren also mit Übergangsenergien entsprechend Wellenlängen von 800 nm, 400 nm, 267 nm, 200 nm, usw. erfolgen.
Die Umsetzung der parallelen Talyor-Entwicklung erfolgt analog zu Abschnitt 3.1 oder 3.4.1. Dabei lassen sich entsprechend die Anteile von Lumineszenz nach Ein-, Zwei-, Drei-, m-Photonenabsoφtion trennen. Der Anteil von Einphotonen- Absoφtion lässt sich dabei nicht von linear mit der Anregungslichtintensitat korreliertem Anregungsstreulicht trennen. Alle übrigen Anteile höherer Ordnung (entsprechend Mehφhotonen-Prozessen) können jedoch vom Streulicht sowie untereinander separiert werden.
Bei Verwendung der harmonischen Analyse muss beachtet werden, dass Prozesse unterschiedlicher Ordnung, die gleichzeitig auftreten, meistens nicht in einfacher Form separierbar sind. Die durch Fünfbhotonen Absoφtion induzierte Lumineszenz beispielsweise enthält Fourier-Komponenten bei der Modulationsfrequenz des Anregungslichtes ω, sowie bei den Harmonischen 2ß), 3ß>, 4ß>und 5ω. Die Signalstärke nimmt ausserdem mit zunehmender Ordnung der Harmonischen ab. Daraus folgt, dass ein Detektionssystem für ra-Photonenabsoφtion am besten bei der zweiten Harmonischen betrieben werden soll. Ausserdem sollte möglichst kein Licht von anderen nichtlinearen Prozessen vom Detektionssystem registriert werden. Falls dennoch nichtlinear-optische Signale der Ordnung k vom Detektor gemessen werden, sollte die harmonische Analyse bei der Ä+l-ten Harmonischen erfolgen. Trivialerweise muss natürlich m ≥ k + 1 gelten.
Die Methode der Modulation und Signalaufhahme mittels eines 4-Stufen Algorithmus kann ohne Änderung von Zweiphotonen-Prozessen auf Mehφhotonenprozesse übertragen werden. Lediglich die Skalierungfaktoren für die Signale müssen angepasst werden. Bestandteil der vorliegenden Erfindung ist auch, dass bei Detektion von m- Photonenabsoφtion bis zu m Laserstrahlen verwendet werden, um eine selektive Analyse analog zur vorangehend beschriebenen Anordnung der Doppelstrahlanregung zu realisieren.
4.2. Frequenzverdopplung, Summen- und Differenzfrequenzerzeugung
Vorangehend wurden Anwendungen auf solche Prozesse vorgestellt, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung als „resonante Prozesse" bezeichnet werden sollen. Darunter sollen solche Prozesse verstanden werden, durch die ein real existierender Zustand, beispielsweise ein angeregter Zustand eines Moleküls oder Chromophoren, erreicht (angeregt) wird (z. B. durch Multiphotonen-Absoφtion), welcher Zustand dann nach einer endlichen, wenn meist auch kurzen Zeitdauer beispielsweise durch Emission von Licht wieder zerfällt. Im Gegensatz dazu sollen als „nicht-resonante Prozesse" solche Prozesse verstanden werden, bei denen ein angeregter Zustand nicht real existiert, sondern rein virtueller Natur ist. Dieses bedingt, dass der virtuelle, angeregte Zustand quasi instantan wieder zerfallen muss, wobei zusätzliche Randbedingungen für Richtung und Impuls der beteiligten Lichtstrahlen berücksichtigt werden müssen.
Für die Erzeugung und Analyse der Signale entsprechend der vorliegenden Erfindung spielt es dabei aber keine Rolle, ob beim Anregungsprozess virtuelle oder reale Prozesse beteiligt sind. Die erfindungsgemässen analytischen Systeme und damit auszuführenden Verfahren können, in analoger Weise auf die Signalerzeugung, - detektion und -analyse von nichtlinearen Prozessen, welche zu real existierenden oder zu virtuellen angeregten Zuständen führen, angewendet werden.
Dabei ist beispielsweise für die Analyse von Frequenzverdopplung („Second- Harmonic Generation") in gleicher Weise wie vorangehend für die Lumineszenzerzeugung durch Zweiphotonen-Absoφtion, bei Einstrahl- Anregung, vorzugehen. Die in den Abschnitten 3.1. bis 3.3. beschriebenen Varianten des erfindungsgemässen Verfahrens können hierauf direkt, ohne Änderung, übertragen werden.
Eine Anordnung und Analyse zur Summenfrequenzerzeugung können analog zu der in Abschnitt 3.4.2. beschriebenen Variante der Doppelstrahl- Anregung betrieben werden.
Eine beispielhafte Anwendung für eine zwei-dimensionale nicht-linear optische Signaldetektion ist die Messung der Homogenität von Frequenzverdopplungskristallen. Üblicherweise ist der Winkel zwischen dem Lichtstrahl des Anregungslasers und dem erzeugten, frequenzverdoppelten Lichtstrahl null oder sehr klein, so dass eine räumliche Trennung der beiden Lichtstrahlen kaum möglich ist. Zur selektiven Detektion der verdoppelten Signale mithilfe herkömmlicher Anordnungen und Verfahren müssen daher hochwirksame Spektralfilter eingesetzt werden, oder es wird die Verwendung spektral dispersiver Elemente (Gitter, Prisma) erforderlich, wobei dann nur noch eine Raumdimension ortsaufgelöst werden kann, während eine Erzeugung zweidimensionaler Bilder nicht mehr möglich ist. Ein weiterer Nachteil der herkömmlichen Anordnungen und Verfahren ist ausserdem, dass meistens das Anregungslicht in den Kristall fokussiert werden muss, um die erforderliche Intensität zur effizienten Frequenzerdopplung zu erreichen. Zur Erzeugung einer zweidimensionalen Darstellung der Erzeugung der frequenzverdoppelten Signale ist dann ein Scannen des fokussierten Anregungslichts über die Querschnittsfläche des Kristalls erforderlich. Dieses ist nicht nur mit einem höheren Zeitaufwand verbunden, sondern birgt in sich inherent auch noch die Unsicherheit, dass schwer zwischen Inhomogenitäten des frequenzverdoppelnden Kristalls und Änderungen des optischen Lichtweges für verschiedene Fokussierungspunkte in der Scan-Ebene als Ursache für mögliche Variationen des frequenzverdoppelten Signals unterschieden werden kann. Mit Hilfe des erfindungsgemässen analytischen Systems und Verfahrens wäre es möglich, einen Kristall mit einem aufgeweiteten Amegungslichtstrahl zu durchleuchten und ein zweidimensionales Bild der an unterschiedlichen Regionen des Kristalls erzeugten, frequenzverdoppelten Signale, zu detektieren. Infolge der Strahlaufweirung werden für eine solche Anordnung die frequenzverdoppelten Signale in der Regel sehr klein und mit starken Anteilen des Anregungslichtes versehen sein. Gerade für diese Problemstellung sind die hier beschriebenen Detektionsverfahren entwickelt worden. Für die Trennung der unterschiedlich mit dem Anregungslicht korrelierten Signalanteile eignen sich alle der vorgenannten Ausfuhrungsformen der Erfindung. Vorzugsweise wird man für diese spezielle Anwendung, in der das Verhältnis zu erwartender frequenzverdoppelter Signalanteile und von Signalanteilen der der eingestrahlten Grundfrequenz besonders ungünstig ist, eine Ausführungsfoπn der Erfindung in Kombination mit einer solchen spektralen Filterung, z. B. mithilfe eines Bandpass-Filters, bei der die ortsaufgelöste hiformation über die Signalverteilung erhalten bleibt, einsetzen.

Claims

Ansprüche:
1. Verfahren zur hochempfindlichen gleichzeitigen Messung nichtlinearer optischer Emissionssignale, ortsaufgelöst in einer oder zwei Ortsdimensionen, umfassend:
- Einstrahlung des Anregungslichts von mindestens einer Lichtquelle in einer leistungsmodulierten und / oder pulsdauermodulierten Form in ein Wechselwirkungsvolumen oder zu einer Wechselwirkungsfläche oder einer Wechselwirkungsschicht (zusammengefasst unter der Bezeichnung "Wechselwirkungsräume"), in welchen Wechselwirkungsräumen jeweils eine oder mehrere nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Emissionen angeregt werden können,
- Messung des von besagten Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einem ein- oder zweidimensionalen Detektor- Array,
- Übertragung der Messdaten von besagtem Detektor- Array auf einen Computer und Formatierung der Daten in einer ein- oder mehrdimensionalen Datenmatrix, dadurch gekemizeichnet, dass die zur Intensität des in den Wechselwirkungsräumen verfügbaren Anregungslichts linear proportionalen Anteile des von dort ausgehenden Lichts von zur verfügbaren Anregungslichtintensitat nichtlinear proportionalen Anteilen des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts getrennt werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es keine spektrale Filterung des zu detektierenden, von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts umfasst.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es in Kombination mit einer spektralen Filterung des zu detektierenden, von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts durchgeführt wird.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 3, dadurch gekennzeichnet, dass besagtes ein- oder zweidimensionale Detektor- Array ausgewählt ist aus der Gruppe, welche CCD-Kameras, CCD-Chips, CMOS-Kameras, CMOS-Chips, Photodioden- Arrays, Avalanche-Dioden- Arrays, Multichannel-Plates und Vielkanal-Photomultiplier umfasst, wobei eine phasensensitive Demodulation in besagtes Detektor- Array integriert sein kami.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels opto-mechanischer und / oder akusto-optischer und / oder elektro-optisch aktiver Hilfsmittel erfolgt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekemizeichnet, dass besagte opto- mechanische und / oder akusto-optische und / oder elektro-optisch aktiven Hilfsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe, welche mechanische Shutter und rotierende Chopper, welche jeweils alternierend den Lichtweg zwischen der Anregungslichtquelle und dem Wechselwirkungsraum blockieren und freigeben, polarisationsselektive Komponenten wie beispielsweise rotierende Halbwellen-Platten in Kombination mit Polarisatoren, Flüssigkristall- Abschwächer, elektro-optisch aktive Kristalle, in ihrer Transmission örtlich oder zeitlich variable Neutraldichte-Filter, akusto-optische Modulatoren sowie Modulatoren, die auf Interferenzeffekten beruhen, wie beispielsweise Michelson-Interferometer oder Mach-Zehnder-Interferometer, umfasst.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels direkter, aktiver Modulation des von der Anregungslichtquelle ausgestrahlten Lichts erfolgt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels Modulation des Anregungsstromes für einen Halbleiterlaser als Anregungslichtquelle erfolgt.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts periodisch erfolgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts nicht-periodisch erfolgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts in der Modulation der eingestrahlten Intensität besteht.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts in der gleichzeitigen Modulation der Pulsdauer und der Spitzenleistung des eingestrahlten Anregungslichts besteht, wobei vorzugsweise die Spitzenleistung invers proportional zur Pulsdauer variiert wird und besonders bevorzugt das Integral der Pulsleistung konstant bleibt.
13. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass es ohne Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse erfolgt.
14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 12, dadurch gekennzeichnet, dass es neben der Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts die Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse umfasst.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 14, dadurch gekennzeichent, dass die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts zeitlich korreliert mit der Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einer Frequenz erfolgt, die einem ganzzahligen Vielfachen der Modulationsfrequenz der Anregungslichtleistung entspricht.
17. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekemizeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer parallelen Reihenentwicklung erfolgt.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer parallelen Taylor-Entwicklung erfolgt.
19. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer harmonischen Analyse erfolgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mittels einer stufenförmigen Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
21. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 - 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen unter Verwendung eines 4-Stufen- Algorithmus zur Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
22. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 - 21, dadurch gekennzeichnet, dass experimentell bedingte Abweichungen der Anregungslichtleistungen von den für die Modulation vorgesehenen Sollwerten mittels numerischer Korrekturen kompensiert werden.
23. Verfahren nach einem der Ansprüche 21 - 22, dadurch gekennzeichnet, dass die unter Anwendung eines 4-Stufen Algorithmus zur Modulation gemessenen Antwortsignale mit Korrekturfaktoren multipliziert werden.
24. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturfaktoren für die Antwortsignale aus gemessenen Anregungslichtleistungen für die Erzeugung besagter Antwortsignale bestimmt werden.
25. Verfahren nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass die Korrekturfaktoren für die Antwortsignale durch eine numerische Analyse der erzeugten Antwortsignaldaten bestimmt werden, wobei dieses beispielsweise durch Auswertung der Signale aus hierfür ausgewiesenen Teilbereichen eines Wechselwirkungsraumes oder mithilfe separater Messungen (beispielsweise unter Verwendung einer Kalibrationsprobe) erfolgen kann.
26. Verfaliren nach einem der Ansprüche 1 - 25, dadurch gekemizeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen in Echtzeit zeitgleich (innerhalb der Aufzeichnungszeit für die Signalaufhahme) mit der Aufnahme der Signale aus dem Wechselwirkungsraum erfolgt.
27. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Wechselwirkungsraum um eine Wechselwirkungsschicht an einer Oberfläche eines festen Trägers handelt, wobei die flächige Ausdehnung des Wechselwirkungsraumes (auf besagter Oberfläche dieses Trägers) durch die Wechselwirkungsfläche mit dem auftreffenden leistungsmodulierten Anregungslicht und seine Tiefe (Ausdehnung senkrecht zu besagter Oberfläche des Trägers) durch die Reichweite der modulierten Anregungslichtintensitat in dieser Raumdimension senkrecht zu dieser Oberfläche des Trägers definiert sind.
28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass sich innerhalb des Wechselwirkungsraumes Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen befinden, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können.
29. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers einer oder mehrere spezifische Bindungspartner zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einem Bindungsassay (unter Bindung des Bindungspartners aus einer zugeführten Lösung an den immobilisierten Bindungspartner) immobilisiert sind, wobei der Analytnachweis anhand eines nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten optischen Antwortsignals des immobilisierten Bindungspartners selbst oder des in Lösung zugeführten Bindungspartners oder eines oder mehrerer weiterer, in einem oder mehreren zusätzlichen Verfahrensschritten zugeführter Bindungspartner, erfolgt.
30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um den einen oder die mehreren Analyten selbst handelt, welche eingebettet in eine native Probenmatrix oder in einer mit einem oder mehreren Aufbereitungsschritten modifizierten Form der Probenmatrix immobilisiert sind.
31. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente zur spezifischen Erkennung eines oder mehreren in einer zugeführten Probe befindlicher Analyten handelt.
32. Verfahren nach einem der Ansprüche 29 - 31, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Bindungspartner, d.h. die selbst immobilisierten nachzuweisenden oder in einer zugeführten Probe nachzuweisenden Analyten und / oder deren immobilisierte oder in einem zugeführten Nachweisreagens zugeführte biologische oder biochemische oder synthetische Erkenuungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, welche Proteine, beispielsweise mono- oder polyklonale Antiköφer und Antiköφerfragmente, Peptide, Enzyme, Glycopeptide, Oligosaccharide, Lektine, Antigene für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierte Proteine („Tag-Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotide) und Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Aptamere, membrangebundene und isolierte Rezeptoren und deren Liganden, durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, natürliche und künstliche Polymere, etc. umfasst.
33. Verfahren nach einem der Ansprüche 28 - 32, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers aufgebrachte Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder aufgebrachte spezifische Bindungspartner in diskreten Messbereichen (Spots) immobilisiert sind, welche eine beliebige Geometrie, beispielsweise kreisförmige, ovale, dreieckige, rechteckige, polygonartige Form etc. haben können, wobei ein einzelner Messbereich gleichartige oder unterschiedliche Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen oder spezifische Bindungspartner enthalten kann.
34. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch gekennzeichnet, dass diskrete Messbereiche durch räumlich selektive Aufbringung von Verbindungen oder Stoffen oder molekularen Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder von spezifischen Bindungspartnern auf besagtem festen Träger erzeugt werden, vorzugsweise unter Verwendung eines oder mehrerer Verfahren aus der Gruppe von Verfahren, welche "InkJet spotting", mechanisches Spotting, „micro contact printing", fluidische Kontaktierung der Bereiche für die zu erschaffenden Messbereiche mit den zu immobilisierenden Verbindungen durch deren Zufuhr in parallelen oder gekreuzten Mikrokanälen, unter Einwirkung von Druckunterschieden oder elektrischen oder elektromagnetischen Potentialen, sowie photochemische und photolithographische Immobilisierungsverfahren umfasst.
35. Verfahren nach einem der Ansprüche 33 - 34, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen den räumlich getrennten Messbereichen oder in unbesetzten Teilbereichen innerhalb dieser Messbereiche gegenüber den Analyten und / oder gegenüber seinen Bindungspartnern "chemisch neutrale" Verbindungen aufgebracht sind, vorzugsweise beispielsweise bestehend aus den Gruppen, welche Albumine, insbesondere Rinderserumalbumin oder Humanserumalbumin, Casein, unspezifische, polyklonale oder monoklonale, artfremde oder empirisch für den oder die nachzuweisenden Analyten und deren Bindungspartner unspezifische Antiköφer (insbesondere für Immunoassays), Detergentien - wie beispielsweise Tween 20 -, nicht mit zu analysierenden Polynukleotiden hybridisierende, fragmentierte natürliche oder synthetische DNA, wie beispielsweise Extrakte von Herings- oder Lachssperma (insbesondere für Polynukleotid-Hybridisierungsassays), oder auch ungeladene, aber hydrophile Polymere, wie beispielsweise Polyethylenglycole oder Dextrane, umfassen.
36. Verfaliren nach einem der Ansprüche 28 - 35, dadurch gekennzeichnet, dass an der Oberfläche besagten festen Trägers aufgebrachte Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder aufgebrachte spezifische Bindungspartner direkt oder mittels eines sogenannten Spacers ("Abstandshalters", ausgebildet als eigenständiges Molekül oder molekulare Gruppe) an der Oberfläche besagten festen Trägers immobilisiert sind unter Ausnutzung einer oder mehrerer Arten von Wechselwirkungen aus der Gruppe von Wechselwirkungen, welche hydrophobe Wechselwirkungen, elektrostatische Wechselwirkungen und kovalente Bindung umfasst.
37. Verfaliren nach einem der Ansprüche 28 - 36, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen der Oberfläche besagten festen Trägers und den immobilisierten Verbindungen oder Stoffen oder molekularen Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder den aufgebrachten spezifischen Bindungspartnern eine Haftvermittlungsschicht aufgebracht ist, welche vorzugsweise eine Dicke von weniger als 200 nm, besonders bevorzugt von weniger als 20 nm hat, und welche vorzugsweise eine chemische Verbindung aus den Gruppen umfasst, welche Silane, funktionalisierte Silane, Epoxide, funktionalisierte, geladene oder polare Polymere und "selbstorganisierte passive oder funktionalisierte Mono- oder Mehrfachschichten", Thiole, Alkylphosphate und -phosphonate, multifunktionelle Block-Copolymere, wie beispielsweise Poly(L)lysin/Polyethylenglycole, umfassen.
38. Verfaliren nach einem der Ansprüche 31 - 37, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 10 , bevorzugt mehr als 100, besonders bevorzugt mehr als 1000 Messbereiche auf einem Quadratzentimeter angeordnet sind.
39. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 - 38, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger bei der Wellenlänge des einwirkenden Anregungslichts optisch transparent ist.
40. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 - 39, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger im wesentlichen planar ist.
41. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 - 40, dadurch gekennzeiclmet, dass besagter fester Träger eine optische Wellenleiterstruktur, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
42. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 - 41, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger einen durchgehenden oder in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilten planaren optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
43. Verfahren nach einem der Ansprüche 27 - 42, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst.
44. Verfaliren nach einem der Ansprüche 41 - 43, dadurch gekemizeichnet, dass eine wellenleitende Schicht besagten festen Trägers mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Gruppe von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern.
45. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 44, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht ermöglichen.
46. Verfahren nach einem der Ansprüche 41 - 45, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitteφeriode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.
47. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 46, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale die Signale einer Frequenzverdopplung („second harmonic generation"), Summen- oder Differenzfrequenzerzeugung umfassen.
48. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 - 47, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale durch eine Multiphotonen- Absoφtion induziert werden.
49. Verfahren nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale durch eine Zweiphotonen- Absoφtion induziert werden.
50. Analytisches System zur hochempfindlichen gleichzeitigen Messung nichtlinearer optischer Emissionssignale, ortsaufgelöst in einer oder zwei Ortsdimensionen, umfassend:
- mindestens eine Lichtquelle zur Aussendung von Anregungslicht
- Technische Hilfsmittel zur Leistungsmodulation und / oder Pulsdauermodulation des von der mindestens einen Lichtquelle ausgehenden Anregungslichts
- ein Wechselwirkungsvolumen oder eine Wechselwirkungsfläche oder eine Wechselwirkungsschicht, gemeinsam bezeichnet als „Wechselwirkungsraum", worin eine oder mehrere nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte Emissionen angeregt werden können - mindestens ein ein- oder zweidimensionales Detektor- Array zur Messung des von dem Wechselwirkungsraum ausgehenden Lichts einen Computer, auf den die Messdaten besagten Detektor- Arrays übertragen und mithilfe dessen die Messdaten in einer ein- oder mehrdimensionalen Datenmatrix formatiert und analysiert werden dadurch gekennzeichnet, dass die zur Intensität des in den Wechselwirkungsräumen verfügbaren Anregungslichts linear proportionalen Anteile des von dort ausgehenden Lichts von zur verfügbaren Anregungslichtintensitat nichtlinear proportionalen Anteilen des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts getrennt werden.
51. Analytisches System nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, dass es keine Komponenten für eine spektrale Filterung des zu detektierenden, von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts umfasst.
52. Analytisches System nach Anspruch 50, dadurch gekennzeiclmet, dass es zusätzlich Komponenten für eine spektrale Filterung des zu detektierenden, von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts umfasst.
53. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 52, dadurch gekennzeichnet, dass das mindestens eine ein- oder zweidimensionale Detektor- Array ausgewählt ist aus der Gruppe, welche CCD-Kameras, CCD- Chips, CMOS-Kameras, CMOS-Chips, Photodioden-Arrays, Avalanche- Dioden- Arrays, Multichannel-Plates und Vielkanal-Photomultipliern umfasst, wobei eine phasensensitive Demodulation in besagtes Detektor- Array integriert sein kann.
54. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 — 53, dadurch gekennzeichnet, dass besagte technische Hilfsmittel zur Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts ausgewählt sind aus der Gruppe, welche opto-mechanische, akusto-optische und elektro- optisch aktive Hilfsmittel umfasst.
55. Analytisches System nach Anspruch 54, dadurch gekennzeichnet, dass besagte opto-mechanische und / oder akusto-optische und / oder elektro-optisch aktiven Hilfsmittel ausgewählt sind aus der Gruppe, welche mechanische Shutter und rotierende Chopper, welche jeweils alternierend den Lichtweg zwischen der Anregungslichtquelle und dem Wechselwirkungsraum blockieren und freigeben, polarisationsselektive Komponenten wie beispielsweise rotierende Halbwellen-Platten in Kombination mit Polarisatoren, Flüssigkristall-Abschwächer, elektro-optisch aktive Kristalle, in ihrer Transmission örtlich oder zeitlich variable Neutraldichte-Filter, akusto- optische Modulatoren sowie Modulatoren, die auf Interferenzeffekten beruhen, wie beispielsweise Michelson-Interferometer oder Mach-Zehnder- Interferometer, umfasst.
56. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 53, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels direkter, aktiver Modulation des von der Anregungslichtquelle ausgestrahlten Lichts erfolgt.
57. Analytisches System nach Anspruch 56, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts mittels Modulation des Amegungsstromes für einen Halbleiterlaser als Anregungslichtquelle erfolgt.
58. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 57, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts periodisch erfolgt.
59. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 57, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts nicht-periodisch erfolgt.
60. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 59, dadurch gekennzeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungshchts in der Modulation der eingestrahlten Intensität besteht.
61. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 59, dadurch gekemizeichnet, dass die Modulation des zu einem Wechselwirkungsraum eingestrahlten Anregungslichts in der gleichzeitigen Modulation der Pulsdauer und der Spitzenleistung des eingestrahlten Anregungslichts besteht, wobei vorzugsweise die Spitzenleistung invers proportional zur Pulsdauer variiert wird und besonders bevorzugt das Integral der Pulsleistung konstant bleibt.
62. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 61, dadurch gekennzeichnet, dass keine Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse erfolgt.
63. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 61, dadurch gekennzeichnet, dass neben der Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts eine Detektion des modulierten Anregungslichts oder einer dazu proportionalen Messgrösse erfolgt.
64. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 63, dadurch gekennzeichent, dass die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts zeitlich korreliert mit der Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
65. Analytisches System nach Anspruch 64, dadurch gekennzeichnet, dass die Detektion des von den Wechselwirkungsräumen ausgehenden Lichts mit einer Frequenz erfolgt, die einem ganzzahligen Vielfachen der Modulationsfrequenz der Anregungslichtleistung entspricht.
66. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer parallelen Reihenentwicklung, bevorzugt mithilfe einer parallelen Taylor- Entwicklung, erfolgt.
67. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mithilfe einer harmonischen Analyse erfolgt.
68. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen mittels einer stufenförmigen Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
69. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 65, dadurch gekennzeichnet, dass die Trennung der nichtlinear mit der Amegungslichtleistung korrelierten Antwortsignalanteile aus dem Wechselwirkungsraum von den übrigen Signalanteilen unter Verwendung eines 4-Stufen- Algorithmus zur Modulation der Anregungslichtleistung erfolgt.
70. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 69, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Wechselwirkungsraum um eine Wechselwirkungsschicht an einer Oberfläche eines festen Trägers handelt, wobei die flächige Ausdehnung des Wechselwirkungsraumes (auf besagter Oberfläche dieses Trägers) durch die Wechselwirkungsfläche mit dem auftreffenden leistungsmodulierten Anregungslicht und seine Tiefe (Ausdehnung senkrecht zu besagter Oberfläche des Trägers) durch die Reichweite der modulierten Anregungslichtintensitat in dieser Raumdimension senkrecht zu dieser Oberfläche des Trägers definiert sind.
71. Analytisches System nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass sich innerhalb des Wechselwirkungsraumes Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen befinden, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können.
72. Analytisches System nach Anspruch 70, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers einer oder mehrere spezifische Bindungspartner zum Nachweis eines oder mehrerer Analyten in einem Bindungsassay (unter Bindung des Bindungspartners aus einer zugeführten Lösung an den immobilisierten Bindungspartner) immobilisiert sind, wobei der Analytnachweis anhand eines nichtlinear mit der Anregungslichtleistung korrelierten optischen Antwortsignals des immobilisierten Bindungspartners selbst oder des in Lösung zugeführten Bindungspartners oder eines oder mehrerer weiterer, in einem oder mehreren zusätzlichen Verfahrensschritten zugeführter Bindungspartner, erfolgt.
73. Analytisches System nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um den einen oder die mehreren Analyten selbst handelt, welche eingebettet in eine native Probenmatrix oder in einer mit einem oder mehreren Aufbereitungsschritten modifizierten Form der Probenmatrix immobilisiert sind.
74. Analytisches System nach Anspruch 72, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den auf der Oberfläche des besagten festen Trägers immobilisierten spezifischen Bindungspartnern um biologische oder biochemische oder synthetische Erkennungselemente zur spezifischen Erkennung eines oder mehreren in einer zugeführten Probe befindlicher Analyten handelt.
75. Analytisches System nach einem der Ansprüche 72 - 74, dadurch gekennzeichnet, dass besagte Bindungspartner, d.h. die selbst immobilisierten nachzuweisenden oder in einer zugeführten Probe nachzuweisenden Analyten und / oder deren immobilisierte oder in einem zugeführten Nachweisreagens zugeführte biologische oder biochemische oder synthetische Erkenuungselemente ausgewählt sind aus der Gruppe, welche Proteine, beispielsweise mono- oder polyklonale Antiköφer und Antiköφerfragmente, Peptide, Enzyme, Glycopeptide, Oligosaccharide, Lektine, Antigene für Antiköφer, mit zusätzlichen Bindungsstellen funktionalisierte Proteine („Tag- Proteinen", wie beispielsweise „Histidin-Tag-Proteinen") sowie Nukleinsäuren (beispielsweise DNA, RNA, Oligonukleotide) und Nukleinsäureanaloge (z. B. PNA), Aptamere, membrangebundene und isolierte Rezeptoren und deren Liganden, durch chemische Synthese erzeugte Kavitäten zur Aufnahme molekularer Imprints, natürliche und künstliche Polymere, etc. umfasst.
76. Analytisches System nach einem der Ansprüche 71 - 75, dadurch gekennzeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers aufgebrachte Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen, welche unter Einwirkung des Anregungslichts zur Emission damit nichtlinear korrelierter optischer Signale fähig sind, oder mit deren Hilfe, nach deren Wechselwirkung mit weiteren im Wechselwirkungsraum anwesenden Verbindungen, nichtlinear mit dem Anregungslicht korrelierte optische Signale erzeugt werden können, oder aufgebrachte spezifische Bindungspartner in diskreten Messbereichen (Spots) immobilisiert sind, welche eine beliebige Geometrie, beispielsweise kreisförmige, ovale, dreieckige, rechteckige, polygonartige Form etc. haben können, wobei ein einzelner Messbereich gleichartige oder unterschiedliche Verbindungen oder Stoffe oder molekulare Teilgruppen oder spezifische Bindungspartner enthalten kann.
77. Analytisches System nach Anspruch 76, dadurch gekemizeichnet, dass auf der Oberfläche besagten festen Trägers in einer 2-dimensionalen Anordnung mehr als 10 , bevorzugt mehr als 100, besonders bevorzugt mehr als 1000 Messbereiche auf einem Quadratzentimeter angeordnet sind.
78. Analytisches System nach einem der Ansprüche 70 - 77, dadurch gekemizeichnet, dass besagter fester Träger bei der Wellenlänge des einwirkenden Anregungslichts optisch transparent ist.
79. Analytisches System nach einem der Ansprüche 70 - 78, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger im wesentlichen planar ist.
80. Analytisches System nach einem der Ansprüche 70 - 79, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger eine optische Wellenleiterstruktur, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
81. Analytisches System nach einem der Ansprüche 70 - 80, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger einen durchgehenden oder in diskrete wellenleitende Bereiche aufgeteilten planaren optischen Wellenleiter, umfassend eine oder mehrere Schichten, umfasst.
82. Analytisches System nach einem der Ansprüche 70 - 81, dadurch gekennzeichnet, dass besagter fester Träger einen planaren optischen Dünnschichtwellenleiter mit einer im wesentlichen optisch transparenten, wellenleitenden Schicht (a) auf einer zweiten, ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Schicht (b) mit niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) und gegebenenfalls einer ebenfalls im wesentlichen optisch transparenten Zwischenschicht (b') zwischen Schicht (a) und Schicht (b) mit ebenfalls niedrigerem Brechungsindex als Schicht (a) umfasst
83. Analytisches System nach einem der Ansprüche 80 - 82, dadurch gekennzeichnet, dass eine wellenleitende Schicht besagten festen Trägers mit einem oder mehreren optischen Koppelelementen in optischem Kontakt steht, welche die Einkopplung von Anregungslicht in die besagte wellenleitende Schicht ermöglichen, wobei besagte optische Koppelelemente ausgewählt sind aus der Gruppe von Prismenkopplern, evaneszenten Kopplern mit zusammengebrachten optischen Wellenleitern mit überlappenden evaneszenten Feldern, Stirnflächenkopplern mit vor einer Stirnseite der besagten wellenleitenden Schicht der Evaneszentfeld-Sensoφlattform angeordneten fokussierenden Linsen, vorzugsweise Zylinderlinsen, und Gitterkopplern.
84. Analytisches System nach einem der Ansprüche 80 - 83, dadurch gekennzeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Einkopplung von Anregungslicht ermöglichen.
85. Analytisches System nach einem der Ansprüche 80 - 84, dadurch gekemizeichnet, dass in einer wellenleitenden Schicht des festen Trägers eine oder mehrere Gitterstrukturen (c') mit gleicher oder unterschiedlicher Gitteφeriode und Gittertiefe wie Gitterstrukturen (c) ausgeprägt sind, welche die Auskopplung von in besagter wellenleitender Schicht geführtem Licht ermöglichen.
86. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 85, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale die Signale einer Frequenzverdopplung („second harmonic generation"), Summen- oder Differenzfrequenzerzeugung umfassen.
87. Analytisches System nach einem der Ansprüche 50 - 86, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Amegungslichtintensität korrelierte optische Emissionssignale durch eine Multiphotonen- Absoφtion induziert werden.
88. Analytisches System nach Anspruch 87, dadurch gekennzeichnet, dass besagte nichtlinear mit der Anregungslichtintensitat korrelierte optische Emissionssignale durch eine Zweiphotonen- Absoφtion induziert werden.
89. Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 49 und / oder eines analytischen Systems nach einem der Ansprüche 50 -88 zu quantitativen und / oder qualitativen Analysen zur Bestimmung chemischer, biochemischer oder biologischer Analyten in Screeningverfahren in der Pharmaforschung, der Kombinatorischen Chemie, der Klinischen und Präklinischen Entwicklung, zu Echtzeitbmdungsstudien und zur Bestimmung kinetischer Parameter im Affinitätsscreening und in der Forschung, zu qualitativen und quantitativen Analytbestimmungen, insbesondere für die DNA- und RNA- Analytik und die Bestimmung von genomischen oder proteomischen Unterschieden im Genom, wie beispielsweise Einzelnukleotid- Polymoφhismen, zur Messung von Protein-DNA-wechselwirkungen, zur Bestimmung von Steuerungsmechanismen für die m-RNA-Expression und für die Protein(bio)synthese, für die Erstellung von Toxizitätsstudien sowie für die Bestimmung von Expressionsprofilen, insbesondere zur Bestimmung von biologischen und chemischen Markerstoffen, wie mRNA, Proteinen, Peptiden oder niedermolekularen organischen (Boten-)Stoffen, sowie zum Nachweis von Antiköφern, Antigenen, Pathogenen oder Bakterien in der pharmazeutischen Produktforschung und -entwicklung, der Human- und Veterinärdiagnostik, der Agrochemischen Produktforschung und - entwicklung, der symptomatischen und präsymptomatischen Pflanzendiagnostik, zur Patientenstratifikation in der pharmazeutischen Produktentwicklung und für die therapeutische Medikamentenauswahl, zum Nachweis von Pathogenen, Schadstoffen und Erregern, insbesondere von Salmonellen, Prionen, Viren und Bakterien, insbesondere in der Lebensmittel- und Umweltanalytik.
Verwendung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 - 49 und / oder eines analytischen Systems nach einem der Ansprüche 50 -88 in der nichtlinearen Optik, der Materialforschung, der Untersuchung von Vorgängen an Phasengrenzen und Oberflächen fester Köφer, der Qualitätskontrolle optischer Komponenten, insbesondere für die Laser-Technologie, beispielsweise von frequenzverdoppelnden Komponenten.
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