EP1744828A1 - Procede sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide - Google Patents

Procede sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide

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EP1744828A1
EP1744828A1 EP05762681A EP05762681A EP1744828A1 EP 1744828 A1 EP1744828 A1 EP 1744828A1 EP 05762681 A EP05762681 A EP 05762681A EP 05762681 A EP05762681 A EP 05762681A EP 1744828 A1 EP1744828 A1 EP 1744828A1
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EP
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chemical
layer
solution
functions
substrate
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP05762681A
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German (de)
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Inventor
Guillaume Delapierre
Françoise Vinet
Philippe Pegon
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Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Thales Angenieux SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Thales Angenieux SA filed Critical Commissariat a lEnergie Atomique CEA
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C40B60/14—Apparatus specially adapted for use in combinatorial chemistry or with libraries for creating libraries

Definitions

  • the invention relates to a sol-gel process for functionalizing a surface of a solid substrate.
  • the technical field of the invention can be defined as that of the functionalization of a surface of a solid substrate with a view to providing this surface with chemical functions capable of reacting with chemical or biological molecules, in other words of functions chemicals capable of immobilizing, catching on, grafting biological or chemical molecules.
  • the invention finds its application for example in the context of the preparation of chemical and biological sensors, in particular the production of DNA chips, oligonucleotides, sugars, peptides, and small organic molecules.
  • the invention also finds its application in the preparation of fluidic microsystems requiring a functionalization of their walls.
  • a functional layer that is to say a layer carrying chemical functions capable of to graft biological or chemical molecules.
  • a functional layer that is to say a layer carrying chemical functions capable of to graft biological or chemical molecules.
  • layers functional there are currently two types of layers functional, namely on the one hand the monomolecular layers and on the other hand the thick layers.
  • Monomolecular layers are layers whose arrangement is controlled and which are also called self-assembled monolayers ("Self Assembled Monolayers" or "SAM" in English).
  • These layers are generally obtained by a process involving the grafting of a silane in a slightly hydrated organic medium in order to avoid a high rate of hydrolysis of the silane leading to the formation of aggregates in solution and to thick unorganized layers.
  • the process for preparing the monomolecular layers has the disadvantage of commonly using aggressive and / or toxic organic solvents such as aromatic solvents, alkanes, or chlorinated solvents.
  • the preparation of such layers is described in particular in document FR-A-2 818 662.
  • Thick layers are layers whose thickness is generally from a few nm to several microns, for example from 10 nm to 10 ⁇ m and their nature is more diverse.
  • the thick layers can be prepared from organic polymers as described in document OA-01/67129; from mixtures of organic and inorganic organosilylated precursors; or from silsesquioxanes ("SSQ") comprising functional groups of amino type.
  • SSQ silsesquioxanes
  • the thick layers described in the prior art have several drawbacks.
  • organic polymers such as nylon often present non-specific adsorption problems.
  • Silsesquioxanes comprising an amino function do not directly allow the covalent attachment of biological molecules such as commercial oligonucleotides.
  • the object of the invention is to provide a method for functionalizing a surface of a substrate which meets, among other things, the needs listed above.
  • the object of the present invention is also to provide a method for functionalizing a surface of a substrate which does not have the drawbacks, defects, limitations and disadvantages of the methods of the prior art, which allows the substrate to be provided with a thick, uniform layer of controlled thickness and which meets the criteria and requirements indicated above.
  • the support is a biochip and where the surface is used to graft biological molecules or probes, the support must guarantee that the signal obtained during fluorescence measurements for example after hybridization of the probes is of an order of magnitude sufficient .
  • a sol-gel process for functionalizing a surface of a solid substrate, optionally cleaned and / or activated, in which the following steps are carried out: a) depositing on said surface, at room temperature, a solution in a mixture of water and a volatile organic solvent, miscible with water, of an acidic or basic catalyst, and of a silane or siloxane carrier at least one chemical function A allowing the immobilization of biological or chemical molecules and / or capable of being transformed into a chemical function A 'allowing the immobilization of biological or chemical molecules and at least one chemical function B d 'attachment capable of clinging chemically, or mechanically, to the surface; b) simultaneously with step a), and / or immediately after this step, the volatile organic solvent is evaporated, whereby the solution is transforms into a wet gel forming a thick gelled layer; then c) the thick gelled layer is dried, whereby a thick layer is obtained which is attached chemically
  • the method according to the invention can be defined as a “sol-gel” type method which implements a specific solution of a specific silane or siloxane to functionalize a surface.
  • a process for functionalizing a surface using such a solution of such a precursor is neither described nor suggested in the prior art.
  • the method according to the invention meets the needs mentioned above, provides a solution to the problems of the methods of the prior art and remedies the drawbacks, defects, limitations and disadvantages of the methods of the prior art.
  • the method according to the invention makes it possible to functionalize a support, whatever it is, quickly and uniformly, with reduced energy expenditure and at low cost.
  • the method according to the invention uses a functional silane or siloxane solution in a mixture of water and a volatile organic solvent miscible with water, for example an alcohol such as ethanol or isopropanol, in presence of an acidic or basic catalyst.
  • a functional silane or siloxane solution in a mixture of water and a volatile organic solvent miscible with water, for example an alcohol such as ethanol or isopropanol, in presence of an acidic or basic catalyst.
  • organic solvents such as toluene, alkanes or chlorinated solvents, commonly used in the preparation of monomolecular layers. These solvents are generally more aggressive and / or toxic than the alcohols used in the sol-gel processes.
  • the method according to the invention is compatible with many materials whose use was prohibited in the methods of the prior art such as plastics (for example plates to wells whose English name is MTP or "MicroTitration Plate"), resins (photosensitive and masking resins), glues (for example acrylic, epoxy, PU, ...), etc.
  • the process according to invention is applicable to large areas of up to several m 2 and the thick layer deposited has a thickness generally in the range of a few tens (for example 2, 3, 4, 5, 10) from nanometers to a few tens (for example 2, 3, 4, 5, 10) of microns and this thickness is controlled very precisely, to within a few percent, in particular in order to be able to produce layers having optical properties.
  • the deposition, the contacting of step a) is generally carried out using a liquid phase deposition technique known to those skilled in the art which is a simple, proven, and reliable technique.
  • This liquid phase deposition technique can be chosen for example from centrifugation ("spin-coating” in English), dip-shrinkage (“dip- coating “in English), laminar flow coating", and its variants roller coating ("roller coating") and curtain coating ("curtain coating”), spraying ( “spray coating” in English), printing (“printing”) for example by implementing the technique of jet printing (“jet printing”), and pipetting ("spotting").
  • process of the invention in step (a), and also generally in step (b) is generally carried out at room temperature, namely generally from 15 to 35 ° C., which is significantly lower than the neighboring temperature of 80 ° C. implemented during the deposition step of the processes for preparing layers of the "SAM" type.
  • room temperature namely generally from 15 to 35 ° C., which is significantly lower than the neighboring temperature of 80 ° C. implemented during the deposition step of the processes for preparing layers of the "SAM" type.
  • the energy consumption caused by the process é according to the invention is therefore significantly lower than that of the methods of the prior art, therefore the cost is also lower.
  • the duration of the entire process of the invention is significantly shorter than that of the processes of the prior art.
  • the total duration of steps a), b), c) of the process of the invention is generally less than or equal to 1 hour, for example it is 15 to 30 minutes. This is one of the advantages of the process of the invention that it can be carried out in a very short time, at least ten times shorter than the time of the process making it possible to prepare "SAM" type layers which is generally close to 16 hours. Furthermore, the duration of the contacting of the substrate with the solution during step a) does not influence the quality of the functionalization, unlike the methods of the prior art.
  • this duration of deposition, of contacting is generally reduced to the minimum time necessary to spread the solution over the entire surface to be functionalized, this surface to be functionalized being able to correspond to the entire surface. of the substrate or only part of it. This duration depends mainly on the deposition technique chosen and the size and shape of the substrate.
  • This duration is generally one or a few seconds (for example 2.5 to 10 seconds) for processes such as centrifugation, printing and pipetting to a few minutes (for example 2.5 to 10 minutes) for processes such as dip-shrinkage, laminar coating, and spraying.
  • This duration is, in all cases, very shorter than the durations used in the prior art for comparable steps.
  • the duration of step b) is generally less than or equal to 10 minutes, for example it is 1 to 5 minutes.
  • This step b) is advantageously partially simultaneous with step a), that is to say that it begins while step a) is not yet completed, and that it still continues after the completion of step a), which saves additional time.
  • the drying of the gelled layer carried out in step c) is generally a rapid drying of a duration generally less than or equal to 15 minutes, preferably of a duration of 1 to 10 minutes, for example 5 minutes.
  • This drying is generally carried out at a moderate temperature, for example from 25 to 60 ° C.
  • a step d ) baking or annealing at a higher temperature than the drying temperature can generally be from 70 to 200 ° C. and the duration of this annealing can range from one to a few minutes (for example 1, 2 or 5 minutes), to one hour.
  • the annealing temperature can be easily chosen by a person skilled in the art depending on the substrate.
  • the chemical function A is a reactive function with respect to the nucleophilic groups, such as an epoxy function. This type of function has the advantage of allowing direct attachment of biological and chemical molecules.
  • said silane or siloxane corresponds to the following formula (I):
  • Ri, R 2 and R 3 which are identical or different, represent a linear or branched alkyl group of 1 to 6 carbon atoms such as for example methyl, ethyl, n-propyl, i-propyl, n-butyl, i-butyl, or t-butyl; and Y represents a hydrocarbon chain such as a linear or branched alkyl chain of 1 to 20 carbon atoms in which one or more carbon atoms can be optionally replaced by an oxygen, sulfur or nitrogen atom.
  • silane or siloxane of formula (I) is 5, 6-epoxyhexyltriethoxysilane (EHTEOS) available for example from ABCR under the reference SIE 4575.0.
  • Other silanes or siloxanes are for example 2- (3, 4 epoxycyclohexyl) ethyl-trimethoxysilane, 2- (3, 4 epoxycyclohexyl) ethyltriethoxysilane, (3-glycidyloxypropyl) methyl-diethoxysilane, (3-glycidyloxypropyl) trimethoxysilane (GLYMO), (3-glycidoxypropyl) bis (trimethylsiloxy) methylsilane, (3-glycidoxypropyl) dimethylethoxysilane, (3-glycidoxypropyl) methyldimethoxysilane, (3-glycidoxypropyl) pentamethyldisiloxane.
  • the catalyst can be an acid catalyst.
  • the catalyst can be a basic catalyst.
  • the basic catalyst is generally chosen from ammonia, and primary, secondary, tertiary and aromatic amines.
  • the catalyst is a basic catalyst is selected from tri (alkyl Ci-C ⁇ 0) amines such as triethylamine (TEA).
  • the organic solvent miscible in the solution of step a) is an alcohol such as an aliphatic alcohol comprising from 1 to 12 carbon atoms, for example ethanol or isopropanol.
  • the mass proportions of alcohol, such as ethanol, and of water in the mixture of water and alcohol are from 0.05% to 10% of water relative to the alcohol.
  • the relative amounts of water, of silane or siloxane, such as EHTEOS, and of catalyst such as TEA defined by the parameters: ⁇ [ 2 0], perennial[catalyst] s
  • the epoxy function allows direct attachment of chemical or biological molecules.
  • said function A ′ is an aldehyde function.
  • the solution can optionally be subjected to maturation.
  • the invention further relates to a process for preparing a solid substrate comprising a surface on which are immobilized, grafted, chemical or biological molecules (generally called probes) in which a surface of a solid substrate is functionalized by the functionalization process as described above, then chemical or biological molecules are reacted, without washing the functionalized surface, with said chemical functions A or A ′ carried by the thick layer.
  • said chemical or biological molecules are molecules comprising nucleophilic groups such as, for example, amine, hydroxyl, phenol, oxyamine, thiol functions, or their anionic derivatives.
  • the probes can be immobilized on the functionalized surface: - by soaking the substrate in a solution containing the chemical or biological molecules to be immobilized; - By depositing a drop of this same solution on the substrate, this deposition can be done manually or by means of a deposition robot.
  • the irreversible immobilization of biological or chemical molecules is carried out by the creation of a covalent bond during the nucleophilic attack reaction between the chemical function A or A 'and the nucleophilic group carried by the biological or chemical molecules to be immobilized.
  • a second characteristic of the surfaces obtained, on which the chemical or biological molecules deposited by the process of the invention are immobilized is to give, surprisingly, very homogeneous "spots" and of smaller size than art. prior. This constitutes an advantage, because in fact, obtaining spots of smaller diameter makes it possible to increase the density of probes on the surface and therefore, makes it possible either to reduce the size of the device (with identical complexity), or to increase the number of probes deposited (on an equal surface).
  • the invention further relates to the use of the thick layer obtained by the process described above, at the end of step c) (dried thick layer) or d) (cooked thick layer) as an optical layer.
  • optical layer or layer with optical properties is generally meant a layer generally thick from a few tens to a few hundred nm, which has the main property of creating interference.
  • This layer can be used alone or it can be used in a stack of several optical layers (for example from 2 to 30 layers), the layers of the stack can all be layers deposited by the method according to the invention (at the end of step c) or d)) or only certain of these layers can be layers deposited by the method of the invention.
  • FIG. 1 is a graph which gives the fluorescence signal expressed in gray levels (NG) on 16 bits (65536 levels) for different functionalized surfaces on which were immobilized oligonucleotides which were then hybridized by a target marked by a fluorophore CY3.
  • Bars B and D give the fluorescence signals of the pads for the epoxy and aldehyde surfaces respectively prepared with functionalization by the sol-gel process of the invention (examples 3 and 4) and bars A and C give the fluorescence signals for the epoxy and aldehyde surfaces respectively prepared with a functionalization by the process using a layer of the "SAM" type (comparative examples 1 and 2).
  • - Figure 2 is a graph which gives the background noise of fluorescence expressed in gray levels (NG) on 16 bits (65536 levels) for various functionalized surfaces on which were immobilized oligonucleotides and which were then hybridized by a target marked with a CY3 fluorophore.
  • Bars B and D give the background noise for the epoxy and aldehyde surfaces respectively prepared with functionalization by the sol-gel process of the invention (Examples 3 and 4) and bars A and C give the background noise for the surfaces respectively epoxide and aldehyde prepared with a functionalization by the process using a layer of the "SAM" type (comparative examples 1 and 2).
  • FIG. 3 is a graph which gives the diameter D in micrometers (on the ordinate) of studs, spots, for a drop volume of 650 pL (picoliters), as well as the contact angle ( ⁇ in degrees) of the surface (on the abscissa) for various layers; * corresponds to a "SAM” type layer with epoxy functions, corresponds to a "sol-gel” type layer with epoxy functions, • corresponds to a "SAM” type layer with aldehyde functions, ⁇ corresponds to a type layer "sol-gel” with aldehyde functions.
  • the following diagram 1 describes the functionalization method by the sol-gel route according to the invention as well as a conventional method ("Reference method") of the prior art in which the functionalization is carried out via the preparation of a self-assembled monomolecular layer (“SAM” layer).
  • Reference method a method of the prior art in which the functionalization is carried out via the preparation of a self-assembled monomolecular layer (“SAM” layer).
  • the solid substrate can be made of a material chosen from semiconductors such as silicon; organic polymers such as poly (methyl methacrylate) (PMMA), polycarbonate (PC), polystyrene (PS), polypropylene (PP) and poly (vinyl chloride) (PVC); metals such as gold, aluminum and silver; the glasses ; mineral oxides generally in layers such as Si0 2 , AI2O3, Zr0 2 , Ti0 2 , a 2 ⁇ 5 ; and composite materials comprising several of these materials.
  • the surface of the solid substrate which it is desired to functionalize will optionally be cleaned and / or activated to allow the covalent or mechanical attachment of the layer to the substrate. This cleaning and / or activation can be done according to the protocols described below.
  • the purpose of cleaning is to remove organic and / or inorganic contaminants that could prevent the effectiveness of the functionalization.
  • the cleaning process used depends on the nature of the substrate and is chosen from the physical, chemical or mechanical processes known to those skilled in the art.
  • the cleaning method can be chosen from immersion in an organic solvent and / or detergent cleaning and / or acid pickling assisted by ultrasound; these cleanings being optionally followed by rinsing with tap water, then rinsing with deionized water; these rinses being optionally followed by drying by "lift-out", by an alcohol spray, by a jet of compressed air, with hot air, or by infrared rays.
  • Cleaning can also be cleaning with ultraviolet rays.
  • the purpose of activation is to activate the surface in order to make it more reactive during the functionalization step.
  • the activation method used depends on the nature of the substrate and can easily be chosen by a person skilled in the art from known activation methods. For example, for glass or oxide surfaces, in particular in the case of silicon substrates covered with an oxide layer, chemical activation of the surface makes it possible to confer hydroxyl groups on it.
  • the purpose of activation is to create the maximum number of OH sites, the surface oxide molecules, for example of surface SiO 2, thus give, for example, SiOH.
  • This activation can be carried out under basic conditions, for example using sodium hydroxide or of potassium hydroxide, for example in the case of the Brown process where an extended stay of the surface is carried out in the soda, or by a detergent cycle followed by an abundant rinsing with EDI then by drying.
  • the activation of the glass or oxide surface can also be carried out by controlled attack with an inorganic acid such as HF or by the Piranha process (mixture H2O2 / H2SO4), or by means of hydrochloric acid, sulfochromic acid or d 'sulfo-oxygenated acid, buffered or not, this attack being followed by abundant rinsing with deionized water and drying.
  • Activation of any surface can also be achieved by an oxygen plasma which creates free radicals.
  • the surface can be activated by controlled cleaning with an inorganic acid such as HF or by the Piranha process (mixture H2O2 / H2SO4), this attack being followed by abundant rinsing with water and drying.
  • Activation can also be achieved by an oxygen plasma.
  • silicon no chemical activation is necessary, because the grip is mainly mechanical.
  • the diversity of the compositions makes prefer a mode of activation of the plasma type, for example by an oxygen plasma or a low pressure plasma or an air plasma, although the chemical processes of detergents type work if they are optimized for each material.
  • the substrate can have any shape but it is generally a flat substrate and the functionalized surface is then generally the upper free surface of said substrate. However, the two faces of the same substrate can be functionalized simultaneously or separately by the same function or by different functions.
  • the substrate can be structured or unstructured. According to the invention, a solution of a suitable siloxane or silane is first prepared.
  • This silane or siloxane can for example correspond to the formula (I) given above.
  • This silane or siloxane can more generally be chosen from the epoxy-functional silanes or siloxanes of the following table:
  • the silane or siloxane solution is a solution in a mixture of alcohol and water, preferably ethanol and water and it generally contains a catalyst such as triethylamine
  • T (where r xl represents the molar concentration of the species x) which are such that O ⁇ ⁇ 100 and O ⁇ T ⁇ 100, the preferred values have already been mentioned above.
  • This solution is deposited on the substrate, possibly after maturation.
  • the term “maturation” or maturation is a term commonly used in the field of deposition by the sol-gel route and is clear to those skilled in the art in this field of technology.
  • “maturation” is generally meant that the solution is stored under special conditions for a period allowing the hydrolysis and condensation reactions to proceed until an ideal advancement for, on the one hand, the cohesion of the deposited layer then on the surface, and on the other hand, for grafting said layer to the substrate.
  • the ripening generally comprises, a storage of the solution in a closed container, protected from air and possibly from humidity, for example generally under an inert atmosphere, static (that is to say without agitation) or with gentle stirring, at a temperature generally between 15 ° and 60 °, for a period generally from one to a few hour (s) (for example 2, 5 or 10 hours) to one or a few weeks (for example 2, 5 or 10 weeks).
  • the maturing time depends mainly on the storage temperature and the parameters H and T defined above and can be easily determined by a person skilled in the art.
  • a ripening is preferably carried out, for example at least 3 days at 22 ° C. with stirring.
  • the solution obtained can be defined as a liquid hydrolyzed silane solution, it is this solution which is used. contact with the surface of the substrate, deposited thereon.
  • the deposition can be carried out by any suitable liquid phase deposition process known to a person skilled in the art such as, and in a non-exhaustive manner: centrifugal coating ("spin coating”), dip-coating (“dip coating”), laminar coating (“laminar flow coating” or “meniscus coating”), and its variants roller coating (“roller coating”) and curtain coating (“curtain coating”), printing (“printing” for example “ink jet printing “), pipetting (“ spotting "), or spray coating.
  • Some of these deposition methods make it possible to coat large areas, for example from a few hundred cm 2 to a few m 2 , which constitutes one of the advantages of the method of the invention. Certain others of these methods make it possible to produce localized deposits, for example of a few nm 2 to a few mm 2 , which constitutes another advantage of the method according to the invention. Other techniques can be highly automated and reach high rates (centrifugation, printing, spotting) which constitutes another advantage of the process of the invention.
  • the deposition is generally carried out at room temperature: that is to say at a temperature generally of 15 to 35 ° C, preferably of 20 to 25 ° C, for example 23 ° C.
  • the deposit is generally made in a few seconds to a few minutes, and the solution deposited on the surface in contact with it for a sufficient time, for example less than 10 minutes, to form a thick gelled layer covalently attached to the surface (step b)).
  • the formation of the thick layer (step b) takes place simultaneously (for example in part) in step a) or immediately after step a).
  • a final drying is carried out between 25 and 60 ° C for a few minutes for example for a period of less than 15 minutes, then the layer is optionally annealed at a temperature generally between 70 ° C and 200 ° C.
  • the thick layer is bonded to the surface via -Si-O- bonds.
  • This layer carries the free chemical functions which are the epoxide functions (EP) shown in diagram 1 and which allow the attachment, immobilization, grafting, of chemical or biological molecules.
  • thick layer within the meaning of the invention generally means a layer of a few nanometers to several microns, for example from 10 nm to 10 ⁇ m, for example from 50 nm to 1 ⁇ m, for example 100 nm, as opposed to self-assembled monomolecular layers which generally have a thickness of a few Angstroms to a few nm.
  • the layer obtained is a uniform layer (without irregularities) even over a large area.
  • the thickness homogeneity is typically ⁇ 3%.
  • the layer also has very low absorption and diffusion losses (k ⁇ 2.10 "3 ) and its refractive index is close to 1.47 in the visible. This layer can therefore be used for its optical properties, alone or as a layer part of a stack of optical layers.
  • the process according to the invention which could be defined for example as a process of silanization by sol-gel route in hydroalcoholic medium, is compared to a process according to l prior art in which the silanization is carried out by preparing a layer of the "SAM" type.
  • a solution of the same siloxane namely EHTEOS
  • EHTEOS is applied to the surface, but in an organic solvent such than toluene and in the presence of a catalyst chosen from organic bases such as for example triethylamine (TEA) or diisopropylethylamine (DIEA).
  • TAA triethylamine
  • DIEA diisopropylethylamine
  • SAM self-assembled monomolecular layer
  • the functionalized surface namely the surface provided with the "SAM” layer or the thick layer, both carrying functions allowing the immobilization of chemical or biological molecules, one then proceeds to the immobilization, to the attachment, to the grafting of chemical or biological molecules.
  • the function carried by the layer being generally a function such as the epoxide function which is reactive with respect to nucleophilic groups
  • the chemical or biological molecule to be immobilized therefore generally comprises a nucleophilic group such as an amino group, thiol, oxyamine , hydroxyl or phenol or the conjugate base of these groups.
  • the chemical molecule is generally chosen according to the envisaged application, for example it may be a chiral, achiral, linear, cyclic or heterocyclic molecule.
  • the biological molecule is generally chosen from proteins, DNA, oligonucleotides, peptides, and oligosaccharides. If the chemical or biological molecule does not carry a nucleophilic group, it can be modified to give it one. In scheme 1, the immobilized molecule is thus an oligonucleotide modified with an NH 2 group.
  • the grafting, the immobilization of the biological or chemical molecules is done very simply, for example by putting the molecule in solution in an adequate medium, such as an aqueous buffer, and by depositing it on the functionalized surface, for example manually or by l using a "spotting" robot provided with piezoelectric type heads (without contact with the surface) or with "pin” or “pin and ring” type (contact with the surface).
  • a surface is finally obtained on which are grafted, attached, immobilized chemical or biological molecules: in diagram 1 of the oligonucleotides are thus immobilized via an amino-type bond (CN).
  • the functions carried by the thick layer or the "SAM" layer into other functions allowing the immobilization of chemical or biological molecules.
  • These functions are preferably also reactive functions with respect to the nucleophilic groups.
  • the epoxide functions can be transformed into aldehyde functions by first opening the epoxide cycle in aqueous HC1 medium to give a diol, and then carrying out an oxidative cleavage, for example with NaI0 4 .
  • the immobilization of chemical or biological molecules on the layer provided with aldehyde groups is done for example by bringing the chemical or biological molecule comprising a nucleophilic group into contact with the functionalized surface by aldehydes.
  • nucleophilic group is an NH2 group as in scheme 1 with oligo-NH2
  • a reduction is then carried out for example by NaBH.
  • EXAMPLE 1 in this example, by the “sol-gel” method according to the invention, a thick layer with a thickness close to 100 nm is prepared comprising epoxy functions on a cleaned glass substrate (commercial float glass slide) and primed by pickling in soda (Brown process).
  • a solution of 5,6-epoxyhexyltriethoxysilane (EHTEOS) in ethanol is deposited on said substrate in the presence of triethylamine (TEA) and water.
  • TAA triethylamine
  • EHTEOS is 2.5%.
  • the ratio of the mass concentrations of H 2 0 and EtOH is 0.18% (H 2 0 / EtOH).
  • the solution was matured for at least 3 days at 22 ° C with gentle stirring.
  • the deposit is made at room temperature by centrifugation at a speed of 200 to 3000 rpm, for example 700 rpm to give a wet layer.
  • the contact time between the substrate and the liquid solution is from 1 to a few seconds (for example 1 to 10 seconds).
  • the contact time between the substrate and the wet layer is 5 minutes ( drying of the layer with the substrate still in rotation). This gives a thick gelled layer on the substrate with a thickness of about 140 nm carrying epoxy functions.
  • the densified layer grafted to the substrate After drying for 5 minutes under an IR lamp and cooking for 1 to a few minutes (for example 5 or 10 minutes) up to 30 minutes at a temperature between 80 ° C and 150 ° C, the densified layer grafted to the substrate has a thickness close to 100 nm + 5 nm and a refractive index close to 1.47 (it is quarter wave around 595 nm).
  • EXAMPLE 2 a thick layer with a thickness of approximately 100 nm comprising aldehyde functions is prepared on a glass substrate (commercial float glass slide) by the "sol-gel" method according to the invention.
  • the substrate provided with a thick layer carrying epoxy functions, prepared as in Example 1 is treated with an aqueous solution of HCl (stay at room temperature for 3 hours in an aqueous solution at 0.2 N and then three successive rinses in 1 deionized water, then drying (by air jet or centrifugation) in order to open the epoxide cycles and form diols, then an oxidative cleavage of said diol is carried out with NaI0 (stirring for 1 hour at room temperature, rinsing for 5 minutes in deionized water then drying by centrifugation) to obtain the aldehyde type functions.
  • EXAMPLE 3 An NH 2 modified oligonucleotide (20 mothers) is deposited and immobilized on the supports prepared in Example 1. The deposition is carried out in an aqueous solution (Na 2 HP0 0.3 M) by a robot of the Piezo type. The oligonucleotide probes obtained were hybridized by a complementary target marked with a fluorophore CY3. The fluorescence measurements are carried out with an Axon Genepix scanner.
  • EXAMPLE 4 The same procedure is repeated as in Example 3 but with the supports prepared in Example 2 and a support is obtained on which modified oligonucleotides are immobilized.
  • COMPARATIVE EXAMPLE 1 a monomolecular layer is prepared, the arrangement of which is controlled ("SAM" layer) and which comprises epoxy functions, on a substrate by the following process:
  • the support glass slide or silica
  • the support is cleaned and activated in basic medium (NaOH / EtOH / deionized water in the proportions 1 g / 4 mL / 3 mL) then rinsed with deionized water (5 min) then dried at 80 ° C.
  • the support thus cleaned and activated (hydroxyl functions on the surface) is then functionalized at 80 ° C.
  • FIGS. 1 and 2 The results of the fluorescence measurements are given in FIGS. 1 and 2.
  • FIG. 1 gives the fluorescence signal expressed in gray levels (NG) on 16 bits (65536 levels) for the various hybridized probes obtained in Examples 3, 4 according to the invention (B and D) and Comparative Examples 1 and 2 (A and C).
  • FIG. 2 gives the background noise of the substrate for the samples of Examples 3, 4 (B and D) and Comparative Examples 1 and 2 (A and C).
  • Epoxy and aldehyde type surfaces provide a signal of the same order of magnitude. This signal is slightly weaker on the surfaces obtained by the sol-gel route according to the method according to the invention (B and D in FIG. 1): the signal of the sol-gel layers is less than 30% for the epoxy and 20% for aldehyde surfaces.
  • the background noise is improved on the surfaces obtained by the sol-gel route according to the method according to the invention (B and D in FIG. 2), which in particular makes it possible to increase the signal / noise ratio (sensitivity).
  • the diameter of this spot depends mainly on the contact angle of the surface: the higher this angle, the more hydrophobic the surface and the greater the diameter of a spot of an aqueous solution is weak.
  • the diameter of the spots obtained by the "sol-gel" route according to FIG. 3 is less than that obtained by the "SAM" route (FIG. 3).
  • spots is 650 pL (picoliters).
  • SAM semometric Adenosine A
  • the spots obtained have a diameter of 170 and 200 microns respectively.
  • the values of the contact angles for the epoxy and aldehyde type layers are close (respectively 65 and 66 °). We therefore expect to obtain a spot diameter between 180-190 microns.
  • the spots obtained on the "sol-gel” layers have a diameter of 90 and 110 microns respectively for the epoxy and aldehyde layers.
  • This thick layer of perfectly controlled thickness can, among other things, be used as an optical layer alone or as part of a stack, for example a Bragg mirror.
  • This mirror is characterized by optical layers whose thickness is equal to the emission wavelength divided by 4 times the refractive index of the layer at this wavelength.
  • a description of the preparation of this type of mirror by sol-gel route is given in document FR-A-2 818 378 (OA-02/48691).

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Abstract

Procédé sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide en vue de pourvoir cette surface de fonctions chimiques susceptibles de réagir avec des molécules chimiques ou biologiques, en d'autres termes de fonctions chimiques susceptibles d'immobiliser, d'accrocher, de greffer des molécules biologiques ou chimiques. L'invention trouve son application par exemple dans le cadre de la préparation de capteurs chimiques et biologiques, notamment de la réalisation de puces à ADN, à oligonucléotides, à sucres, à peptides, et à petites molécules organiques.

Description

PROCEDE SOL-GEL DE FONCTIONNALISATION D'UNE SURFACE D'UN SUBSTRAT SOLIDE
DESCRIPTION
L'invention concerne un procédé sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide. Le domaine technique de 1 ' invention peut être défini comme celui de la fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide en vue de pourvoir cette surface de fonctions chimiques susceptibles de réagir avec des molécules chimiques ou biologiques, en d'autres termes de fonctions chimiques susceptibles d'immobiliser, d'accrocher, de greffer des molécules biologiques ou chimiques . L'invention trouve son application par exemple dans le cadre de la préparation de capteurs chimiques et biologiques, notamment de la réalisation de puces à ADN, à oligonucléotides, à sucres, à peptides, et à petites molécules organiques. L'invention trouve aussi son application dans la préparation de microsystèmes fluidiques nécessitant une fonctionnalisation de leurs parois. Afin de greffer, d'immobiliser et d'accrocher des molécules biologiques ou chimiques sur un substrat, il est généralement nécessaire de munir ce substrat d'une couche fonctionnelle, c'est-à-dire d'une couche porteuse de fonctions chimiques susceptible de greffer les molécules biologiques ou chimiques . Pour greffer des molécules biologiques, il existe ainsi actuellement deux types de couches fonctionnelles, à savoir d'une part les couches monomoléculaires et d'autre part les couches épaisses. Les couches monomoléculaires sont des couches dont l'arrangement est contrôlé et qui sont aussi dénommées couches monomoléculaires autoassemblées ("Self Assembled Monolayers" ou "SAM" en anglais) . Ces couches sont généralement obtenues par un procédé impliquant le greffage d'un silane en milieu organique légèrement hydraté afin d'éviter un fort taux d'hydrolyse du silane conduisant à la formation d'agrégats en solution et à des couches épaisses non organisées . Le procédé de préparation des couches monomoléculaires présente l'inconvénient de mettre en œuvre couramment des solvants organiques agressifs et/ou toxiques tels que les solvants aromatiques, les alcanes, ou les solvants chlorés. La préparation de telles couches est décrite notamment dans le document FR-A-2 818 662. Les couches épaisses sont des couches dont l'épaisseur est généralement de quelques nm à plusieurs microns, par exemple de 10 nm à 10 μm et leur nature est plus diverse. Les couches épaisses peuvent être préparées à partir de polymères organiques comme cela est décrit dans le document O-A-01/67129 ; à partir de mélanges de précurseurs organosilylés organiques et inorganiques ; ou à partir de silsesquioxanes ("SSQ") comportant des groupements fonctionnels de type amino . Les couches épaisses décrites dans l'art antérieur présentent plusieurs inconvénients. Ainsi, les polymères organiques comme le nylon présentent souvent des problèmes d'adsorption non spécifiques . Les silsesquioxanes comportant une fonction amino ne permettent pas directement l'accroche covalente de molécules biologiques tels que les oligonucléotides commerciaux. De plus, ces deux types de couches sont obtenus par des procédés : - lents : la fonctionnalisation nécessite la mise en contact de la surface avec les molécules pendant un temps long, de quelques heures à 24 heures ; - coûteux en énergie : le greffage nécessite le maintien à une haute température (typiquement 80°) pendant des durées de quelques heures à 24 heures , - multi-étapes, donc compliqués : après fonctionnalisation, un lavage des surfaces à l'aide de solvants organiques avec assistance ultrasonore est nécessaire ; - incompatibles avec de nombreux substrats, notamment les plastiques car ils utilisent des solvants agressifs tels que le toluène et les solvants chlorés ; - peu respectueux de l'homme et de l'environnement car ils utilisent des solvants toxiques tels que le toluène et les solvants chlorés. Les mélanges de précurseurs organosilylés organiques et inorganiques sont composés d'un grand nombre de constituants : la mise au point de leur formulation pour obtenir des couches d'épaisseur contrôlée et reproductible est très complexe. Il existe donc un besoin pour un procédé permettant de fonctionnaliser une surface d'un substrat au moyen d'une couche épaisse fonctionnelle, c'est-à- dire un procédé permettant de pourvoir une surface d'un substrat de fonctions chimiques permettant l'accrochage, le greffage, l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques, qui soit rapide, simple, faible consommateur d'énergie et d'un faible coût . II existe encore un besoin pour un procédé qui permette de fonctionnaliser, au moyen d'une couche épaisse, toutes sortes de surfaces, quelle que soit leur forme, et quel que soit le matériau qui les constitue, par exemple des surfaces de substrats minéraux tels que le silicium, les verres et les oxydes massifs ou en films ; des surfaces de substrats organiques ou métalliques . Il existe en particulier un besoin pour un procédé permettant de fonctionnaliser des substrats de grande taille avec les mêmes performances que pour les substrats usuels de quelques cm2. La couche épaisse préparée doit être par ailleurs uniforme, et d'une épaisseur parfaitement contrôlée . Le but de l'invention est de fournir un procédé de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat qui réponde, entre autres, aux besoins énumérés ci-dessus. Le but de la présente invention est encore de fournir un procédé de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat qui ne présente pas les inconvénients, défauts, limitations et désavantages des procédés de l'art antérieur, qui permette de pourvoir le substrat d'une couche épaisse, uniforme et d'épaisseur contrôlée et qui réponde aux critères et exigences indiquées plus haut. Dans le cas où le support est une biopuce et où la surface est utilisée pour greffer des molécules biologiques ou sondes, le support doit garantir que le signal obtenu lors de mesures de fluorescence par exemple après hybridation des sondes soit d'un ordre de grandeur suffisant. Ce but, et d'autres encore, sont atteints, conformément à l'invention par un procédé sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide, éventuellement nettoyée et/ou activée, dans lequel on réalise les étapes suivantes : a) on dépose sur ladite surface, à température ambiante, une solution dans un mélange d'eau et d'un solvant organique volatil, miscible avec l'eau, d'un catalyseur acide ou basique, et d'un silane ou siloxane porteur d'au moins une fonction chimique A permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques et/ou susceptible d'être transformée en une fonction chimique A' permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques et d'au moins une fonction chimique B d'accrochage susceptible de s'accrocher chimiquement par covalence, ou mécaniquement, à la surface ; b) simultanément à l'étape a), et/ou immédiatement après cette étape, on évapore le solvant organique volatil, moyennant quoi la solution se transforme en un gel humide formant une couche épaisse gélifiée ; puis c) on sèche la couche épaisse gélifiée, moyennant quoi on obtient une couche épaisse accrochée chimiquement par covalence, ou mécaniquement à la surface et portant lesdites fonctions chimiques A permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques . Le procédé selon l'invention peut être défini comme un procédé de type "sol-gel" qui met en œuvre une solution spécifique d'un silane ou siloxane spécifique pour fonctionnaliser une surface. Un tel procédé de fonctionnalisation d'une surface utilisant une telle solution d'un tel précurseur n'est ni décrite ni suggérée dans l'art antérieur. Le procédé selon l'invention répond aux besoins cités plus haut, apporte une solution aux problèmes des procédés de l'art antérieur et remédie aux inconvénients, défauts, limitations et désavantages des procédés de l'art antérieur. Le procédé selon l'invention permet de fonctionnaliser un support, quel qu'il soit, rapidement et de manière uniforme, avec une dépense d'énergie réduite et à un faible coût. Le procédé selon l'invention met en œuvre une solution de silane ou siloxane fonctionnel dans un mélange d'eau et d'un solvant organique volatil miscible avec l'eau, par exemple un alcool tel que l'éthanol ou 1 ' isopropanol, en présence d'un catalyseur acide ou basique. On évite de ce fait l'utilisation de solvants organiques tels que le toluène, les alcanes ou les solvants chlorés, couramment utilisés dans la préparation des couches monomoléculaires . Ces solvants sont généralement plus agressifs et/ou toxiques que les alcools utilisés dans les procédés sol-gels. De ce fait, le procédé selon l'invention, au contraire des procédés de l'art antérieur, est compatible avec de nombreux matériaux dont l'utilisation était proscrite dans les procédés de l'art antérieur comme les plastiques (par exemple des plaques à puits dont la dénomination anglaise est MTP ou "MicroTitration Plate"), les résines (résines photosensibles et de masquage) , les colles (par exemple acryliques, époxy, PU, ...) , etc.... Le procédé selon l'invention est applicable à de grandes surfaces pouvant atteindre plusieurs m2 et la couche épaisse déposée a une épaisseur généralement dans la gamme de quelques dizaines (par exemple 2, 3, 4, 5, 10) de nanomètres à quelques dizaines (par exemple 2, 3, 4, 5, 10) de microns et cette épaisseur est contrôlée très précisément, à quelques pourcents près, afin notamment de pouvoir réaliser des couches ayant des propriétés optiques . Le dépôt, la mise en contact de l'étape a) est généralement réalisé en utilisant une technique de dépôt en phase liquide connue de l'homme du métier qui est une technique simple, éprouvée, et fiable. Cette technique de dépôt en phase liquide peut être choisie par exemple parmi la centrifugation ("spin-coating" en anglais) , le trempage-retrait ("dip- coating" en anglais), l'enduction laminaire ("laminar flow coating" en anglais), et ses variantes l'enduction au rouleau (« roller coating ») et l'enduction au rideau (« curtain coating ») , le pistolage ("spray coating" en anglais), l'impression ("printing") par exemple en mettant en œuvre la technique de l'impression par jet ("jet printing"), et le dépôt à la pipette ("spotting") . Le procédé de l'invention dans l'étape (a), et aussi généralement dans l'étape (b) est généralement réalisé à température ambiante, à savoir généralement de 15 à 35°C, ce qui est nettement plus faible que la température voisine de 80 °C mise en œuvre lors de l'étape de dépôt des procédés de préparation des couches de type "SAM". Contrairement aux procédés de l'art antérieur, il n'est donc nullement besoin de chauffer la solution et/ou le substrat, d'où une simplicité de mise en œuvre et une réduction des coûts. La consommation d'énergie occasionnée par le procédé selon l'invention est donc nettement plus faible que celle des procédés de l'art antérieur, de ce fait le coût est également moindre. La durée de l'ensemble du procédé de l'invention est nettement plus courte que celle des procédés de l'art antérieur. La durée totale des étapes a) , b) , c) du procédé de l'invention est généralement inférieure ou égale à 1 heure par exemple elle est de 15 à 30 minutes. C'est là un des avantages du procédé de l'invention que de pouvoir être réalisé en une durée très courte, au moins dix fois plus courte que la durée du procédé permettant de préparer des couches de type "SAM" qui est généralement voisine de 16 heures. Par ailleurs, la durée de la mise en contact du substrat avec la solution lors de l'étape a) n'influe pas sur la qualité de la fonctionnalisation contrairement aux procédés de l'art antérieur. L'influence de la durée de la mise en contact de la solution avec le substrat sur la qualité de la fonctionnalisation est d'autant plus réduite que la surface du substrat a été de préférence préalablement nettoyée et/ou activée et/ou que la solution a subi une étape préalable de mûrissement. Dans le procédé selon l'invention, cette durée de dépôt, de mise en contact, est généralement réduite au temps minimal nécessaire pour répandre la solution sur la totalité de la surface à fonctionnaliser, cette surface à fonctionnaliser pouvant correspondre à la totalité de la surface du substrat ou à une partie seulement de celle-ci. Cette durée dépend principalement de la technique de dépôt choisie et des taille et forme du substrat. Cette durée est généralement de une ou quelques secondes (par exemple 2, 5 à 10 secondes) pour des procédés comme la centrifugation, l'impression et le dépôt à la pipette à quelques minutes (par exemple 2, 5 à 10 minutes) pour des procédés tels que le trempage-retrait, l'enduction laminaire, et le pistolage. Cette durée est, dans tous les cas, très inférieure aux durées mises en œuvre dans l'art antérieur pour des étapes comparables . La durée de l'étape b) est généralement inférieure ou égale à 10 minutes, par exemple elle est de 1 à 5 minutes. Cette étape b) est avantageusement partiellement simultanée à l'étape a), c'est-à-dire qu'elle débute alors que l'étape a) n'est pas encore achevée, et qu'elle se poursuit encore après l'achèvement de l'étape a), ce qui entraine un gain de temps supplémentaire. Le séchage de la couche gélifiée réalisé dans l'étape c) est généralement un séchage rapide d'une durée généralement inférieure ou égale à 15 minutes, de préférence d'une durée de 1 à 10 minutes, par exemple de 5 minutes. Ce séchage est généralement réalisé à une température modérée, par exemple de 25 à 60 °C. Avantageusement, bien que cela ne soit pas obligatoire, il est possible pour garantir selon besoin une meilleure résistance de la couche aux protocoles ultérieurs d'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques, de réaliser après le séchage de l'étape c) , une étape d) de cuisson ou recuit à une température plus élevée que la température du séchage. La température de recuit peut être généralement de 70 à 200 °C et la durée de ce recuit peut aller de une à quelques minutes (par exemple 1, 2 ou 5 minutes), à une heure. La température du recuit peut être facilement choisie par l'homme du métier en fonction du substrat . Cette étape d) , avantageuse, conseillée, mais néanmoins facultative, du procédé selon l'invention, qui est une étape de cuisson à haute température de la couche de silane ou siloxane a donc une durée extrêmement limitée par rapport à celle des étapes comparables des procédés de l'art antérieur. Avantageusement, la fonction chimique A est une fonction réactive vis-à-vis des groupements nucléophiles, telle qu'une fonction époxyde . Ce type de fonction présente l'avantage de permettre l'accrochage direct de molécules biologiques et chimiques . Avantageusement, ledit silane ou siloxane répond à la formule suivante (I) :
dans laquelle Ri, R2 et R3 identiques ou différents représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone tel que par exemple méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, i- butyle, ou t-butyle ; et Y représente une chaîne hydrocarbonée telle qu'une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de 1 à 20 atomes de carbone dans laquelle un ou plusieurs atomes de carbone peuvent être éventuellement remplacés par un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote. Un exemple de silane ou siloxane de formule (I) est le 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane (EHTEOS) disponible par exemple chez ABCR sous la référence SIE 4575.0. D'autres silanes ou siloxanes sont par exemple le 2- (3, 4 époxycyclohexyl) éthyl- triméthoxysilane, le 2- (3, 4 époxycyclohexyl) éthyltriéthoxysilane, le (3- glycidyloxypropyl) méthyl-diéthoxysilane, le (3- glycidyloxypropyl) triméthoxysilane (GLYMO) , le (3- glycidoxypropyl) bis (triméthylsiloxy) méthylsilane, le (3-glycidoxypropyl) diméthyléthoxysilane, le (3- glycidoxypropyl) méthyldiméthoxysilane, le (3- glycidoxypropyl) pentaméthyldisiloxane . Le silane ou siloxane par exemple de formule (I) est généralement présent dans la solution à une concentration massique de 0,1% à 10%. Le catalyseur est généralement présent dans la solution à une concentration massique de 0,005% à
Le catalyseur peut être un catalyseur acide. Le catalyseur acide est choisi généralement parmi les acides inorganiques tels que HC1, HN03, H2SO4, et leurs mélanges par exemple ; ou les acides organiques tels que HCOOH, CH3COOH, CH2=CH (CH3) COOH, et leurs mélanges par exemple. Le catalyseur peut être un catalyseur basique . Le catalyseur basique est choisi généralement parmi l'ammoniaque, et les aminés primaires, secondaires, tertiaires et aromatiques. De préférence, le catalyseur lorsqu'il s'agit d'un catalyseur basique est choisi parmi les tri (alkyl en Ci à Cι0) aminés telle que la triéthylamine (TEA) . Avantageusement le solvant organique miscible dans la solution de l'étape a) est un alcool tel qu'un alcool aliphatique comprenant de 1 à 12 atomes de carbone, par exemple l'éthanol ou 1 ' isopropanol . Avantageusement, les proportions massiques d'alcool, tel que l'éthanol, et d'eau dans le mélange d'eau et d'alcool sont de 0,05% à 10% d'eau par rapport à l'alcool. Généralement, les quantités relatives d'eau, de silane ou siloxane, tel que EHTEOS, et de catalyseur tel que TEA, définies par les paramètres : ττ [ 20] , „ [catalyseur] s
H = τ -_-_-! et = — - — Ï (ou [x] représente [silane ou siloxane] [silane ou siloxane] la concentration molaire de l'espèce x) sont telles que O<H<100 et O<T<100, de préférence 0,1<H<20 et 0,01<T<10, de préférence encore 0,8<H<2 et 0,1<T<2. On a vu que la fonction époxyde permettait l'accroche directe de molécules chimiques ou biologiques. Il est toutefois possible de transformer, par des réactions chimiques connues de l'homme du métier, après l'étape c) ou d) , ou ultérieurement les fonctions A, par exemple les fonctions époxyde portées par la couche épaisse en d'autres fonctions A', différentes des fonctions A par exemple de la fonction époxyde, et permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques. Lesdites fonctions A' différentes des fonctions A, par exemple différentes des fonctions époxyde, sont choisies de préférence parmi les fonctions réactives vis-à-vis des groupements nucléophiles telles que, par exemple, les fonctions diol, aldéhyde, acide carboxylique, ester activé, halogénure d'acide, anhydride, amide, halogénure de sulfonyle et halogénure d' alkyle ou d'aryle. De préférence, ladite fonction A' est une fonction aldéhyde. Avant le dépôt de la solution sur la surface (étape a) ) , on peut éventuellement faire subir à la solution une maturation. L'invention a trait en outre à un procédé de préparation d'un substrat solide comprenant une surface sur laquelle sont immobilisées, greffées, des molécules chimiques ou biologiques (appelées généralement sondes) dans lequel on fonctionnalise une surface d'un substrat solide par le procédé de fonctionnalisation tel qu'il est décrit ci-dessus puis on fait réagir, sans procéder à un lavage de la surface fonctionnalisée, des molécules chimiques ou biologiques avec lesdites fonctions chimiques A ou A' portées par la couche épaisse. De préférence, lesdites molécules chimiques ou biologiques sont des molécules comportant des groupements nucléophiles tels que, par exemple, des fonctions aminé, hydroxyle, phénol, oxyamine, thiol, ou leurs dérivés anioniques . L'immobilisation des sondes sur la surface fonctionnalisée peut s'effectuer : - par trempage du substrat dans une solution contenant les molécules chimiques ou biologiques à immobiliser ; - par dépôt d'une goutte de cette même solution sur le substrat, ce dépôt pouvant être fait manuellement ou par l'intermédiaire d'un robot de dépôt . L'immobilisation irréversible des molécules biologiques ou chimiques s'effectue par la création d'une liaison covalente lors de la réaction d'attaque nucléophile entre la fonction chimique A ou A' et le groupement nucléophile porté par les molécules biologiques ou chimiques à immobiliser. Il est à noter qu'à l'issue de l'étape de fonctionnalisation, et préalablement aux étapes suivantes, il n'est pas nécessaire selon une caractéristique fondamentale du procédé selon l'invention, de réaliser un lavage de la surface alors que dans le procédé utilisé pour la fabrication de couches dites "SAM", il est obligatoire de laver les surfaces à l'aide de solvants organiques et éventuellement d'ultrasons. Le procédé selon l'invention est donc plus court, plus simple et de ce fait moins coûteux. Il est ainsi compatible avec une plus grande variété de substrats, tels que notamment les matières plastiques. Les surfaces obtenues sur lesquelles sont immobilisées les molécules chimiques ou biologiques, déposées par le procédé de l'invention faisant appel à une couche fonctionnalisée préparée par voie sol-gel, donnent de manière surprenante lors des analyses en fluorescence un bruit de fond nettement réduit par rapport aux surfaces analogues mais dans lesquelles la couche fonctionnalisée ou couche "SAM" est préparée par une technique de silanisation classique. Les intensités des signaux de fluorescence étant voisins, il en résulte notamment une augmentation du rapport signal/bruit . De plus, une deuxième caractéristiques des surfaces obtenues, sur lesquelles sont immobilisées les molécules chimiques ou biologiques déposées par le procédé de l'invention, est de donner, de manière surprenante, des "spots" très homogènes et de dimension inférieure à l'art antérieur. Ceci constitue un avantage, car en effet, l'obtention de spots de plus petit diamètre permet d'augmenter la densité de sondes sur la surface et donc, permet soit de réduire la taille du dispositif (à complexité identique) , soit d'augmenter le nombre de sondes déposées (à surface égale) . L'invention concerne en outre l'utilisation de la couche épaisse obtenue par le procédé décrit ci- dessus, à l'issue de l'étape c) (couche épaisse séchée) ou d) (couche épaisse cuite) en tant que couche optique . Par couche optique ou couche à propriétés optiques, on entend généralement une couche généralement épaisse de quelques dizaines à quelques centaines de nm, qui a la principale propriété de créer des interférences . Cette couche peut être utilisée seule ou bien elle peut être utilisée dans un empilement de plusieurs couches optiques (par exemple de 2 à 30 couches), les couches de l'empilement peuvent être toutes des couches déposées par le procédé selon l'invention (à l'issue de l'étape c) ou d) ) ou seulement certaines de ces couches peuvent être des couches déposées par le procédé de l'invention. L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre, donnée à titre illustratif et non limitatif en liaison avec les dessins joints dans lesquels : - la figure 1 est un graphique qui donne le signal de fluorescence exprimé en niveaux de gris (NG) sur 16 bits (65536 niveaux) pour différentes surfaces fonctionnalisées sur lesquelles ont été immobilisés des oligonucleotides qui ont ensuite été hybrides par une cible marquée par un fluorophore CY3. Les barres B et D donnent les signaux de fluorescence des plots pour les surfaces respectivement époxyde et aldéhyde préparées avec une fonctionnalisation par le procédé sol-gel de l'invention (exemples 3 et 4) et les barres A et C donnent les signaux de fluorescence pour les surfaces respectivement époxyde et aldéhyde préparées avec une fonctionnalisation par le procédé faisant appel à une couche de type "SAM" (exemples comparatifs 1 et 2) . - la figure 2 est un graphique qui donne le bruit de fond de fluorescence exprimé en niveaux de gris (NG) sur 16 bits (65536 niveaux) pour diverses surfaces fonctionnalisées sur lesquelles ont été immobilisés des oligonucleotides et qui ont ensuite été hybrides par une cible marquée d'un fluorophore CY3. Les barres B et D donnent les bruits de fond pour les surfaces respectivement époxyde et aldéhyde préparées avec une fonctionnalisation par le procédé sol-gel de l'invention (exemples 3 et 4) et les barres A et C donnent les bruits de fond pour les surfaces respectivement époxyde et aldéhyde préparées avec une fonctionnalisation par le procédé faisant appel à une couche de type "SAM" (exemples comparatifs 1 et 2) . - la figure 3 est un graphique qui donne le diamètre D en micromètres (en ordonnée) de plots, spots, pour un volume de goutte de 650 pL (picolitres) , ainsi que l'angle de contact (α en degrés) de la surface (en abscisse) pour diverses couches ; * correspond à une couche de type "SAM" à fonctions epoxydes, correspond à une couche de type "sol-gel" à fonctions epoxydes, • correspond à une couche de type "SAM" à fonctions aldéhydes, ^ correspond à une couche de type "sol-gel" à fonctions aldéhydes. On a décrit sur le schéma 1 suivant, le procédé de fonctionnalisation par voie sol-gel selon l'invention ainsi qu'un procédé classique ("Procédé de référence") de l'art antérieur dans lequel la fonctionnalisation est réalisée par l'intermédiaire de la préparation d'une couche monomoléculaire autoassemblée (couche "SAM") . SCHEMA 1
Le substrat solide peut être en un matériau choisi parmi les semiconducteurs tels que le silicium ; les polymères organiques tels que le poly (methacrylate de méthyle) (PMMA) , le polycarbonate (PC) , le polystyrène (PS) , le polypropylène (PP) et le poly (chlorure de vinyle) (PVC) ; les métaux tels que l'or, l'aluminium et l'argent ; les verres ; les oxydes minéraux généralement en couche tels que Si02, AI2O3, Zr02, Ti02, a2θ5 ; et les matériaux composites comprenant plusieurs de ces matériaux. La surface du substrat solide que l'on souhaite fonctionnaliser sera éventuellement nettoyée et/ou activée pour permettre l'accroche covalente ou mécanique de la couche sur le substrat. Ce nettoyage et/ou cette activation pourra se faire selon les protocoles décrits ci-dessous. Le nettoyage a pour but d'éliminer les contaminants organiques et/ou inorganiques qui pourraient empêcher l'efficacité de la fonctionnalisation. Le procédé de nettoyage utilisé dépend de la nature du substrat et est choisi parmi les procédés physiques, chimiques ou mécaniques connus de l'homme du métier. Par exemple, et de manière non limitative, le procédé de nettoyage peut être choisi parmi l'immersion dans un solvant organique et/ou le nettoyage lessiviel et/ou le décapage acide assistés par les ultrasons ; ces nettoyages étant suivis éventuellement d'un rinçage à l'eau de ville, puis d'un rinçage à l'eau désionisée ; ces rinçages étant suivis éventuellement d'un séchage par "lift-out", par une pulvérisation d'alcool, par un jet d'air comprimé, à l'air chaud, ou par les rayons infrarouges. Le nettoyage peut être aussi un nettoyage par les rayons ultraviolets. L'activation a pour but d'activer la surface afin de la rendre plus réactive lors de l'étape de fonctionnalisation. Le procédé d'activation utilisé dépend de la nature du substrat et pourra être choisi facilement par l'homme du métier parmi les procédés d'activation connus. Par exemple, pour des surfaces en verre ou en oxydes, en particulier dans le cas de substrats en silicium recouverts d'une couche d'oxyde, une activation chimique de la surface permet de lui conférer des groupements hydroxyles . Le but de l'activation est de créer le maximum de sites OH, les molécules d'oxyde de surface, par exemple de SiÛ2 de surface, donnent ainsi par exemple du SiOH. Cette activation peut être réalisée dans des conditions basiques, par exemple au moyen de soude ou de potasse, par exemple dans le cas du procédé Brown où l'on réalise un séjour prolongé de la surface dans la soude, ou par un cycle lessiviel suivi d'un rinçage abondant par l'EDI puis d'un séchage. L'activation de la surface en verre ou en oxyde peut aussi être réalisée par attaque contrôlée avec un acide inorganique tel que HF ou par procédé Piranha (mélange H2O2/H2SO4) , ou au moyen d'acide chlorhydrique, d'acide sulfochromique ou d'acide sulfo- oxygéné tamponnés ou pas, cette attaque étant suivie d'un rinçage abondant à l'eau désionisée et d'un séchage. L'activation de toute surface peut aussi être réalisée par un plasma d'oxygène qui crée des radicaux libres . Autrement dit, on peut activer la surface par nettoyage contrôlé avec un acide inorganique tel que HF ou par le procédé Piranha (mélange H2O2/H2SO4) , cette attaque étant suivie d'un rinçage abondant par l'eau et d'un séchage. L'activation peut aussi être réalisée par un plasma d'oxygène. Pour le silicium, aucune activation chimique n'est nécessaire, car l'accroche est principalement mécanique. Pour les substrats en plastique, la diversité des compositions fait préférer un mode d'activation de type plasma, par exemple par un plasma à l'oxygène ou un plasma à faible pression ou un plasma à l'air, bien que les procédés chimiques de type lessiviels fonctionnent s'ils sont optimisés pour chaque matériau. Des mesures faites par la méthode d'angle de goutte ou par infra-rouge permettent de caractériser l'efficacité de la transformation de l'état de surface du substrat. Le substrat peut présenter une forme quelconque mais il s'agit généralement d'un substrat plan et la surface fonctionnalisée est alors généralement la surface libre supérieure dudit substrat . Cependant, les deux faces d'un même substrat peuvent être fonctionnalisées simultanément ou séparément par une même fonction ou par des fonctions différentes . Le substrat peut être structuré ou non structuré. Selon l'invention, on prépare tout d'abord une solution d'un siloxane ou silane adéquate. Ce silane ou siloxane peut par exemple répondre à la formule (I) donnée plus haut. Ce silane ou siloxane peut plus généralement être choisi parmi les silanes ou siloxanes à fonction époxy du tableau suivant :
Sur le schéma 1, le procédé est illustré à titre d'exemple avec le 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane
(EHTEOS) . La solution du silane ou siloxane est une solution dans un mélange d'alcool et d'eau, de préférence d'éthanol et d'eau et elle contient généralement un catalyseur tel que de la triéthylamine
TEA. Les quantités relatives des constituants
sont définies par les deux paramètres H et
T = (ou rx.l représente la concentration molaire de l'espèce x) qui sont tels que O<Η<100 et O<T<100, les valeurs préférées ont déjà été mentionnées plus haut. Une solution typique est une solution de 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane (EHTEOS) dans un mélange d'eau et d'éthanol contenant de la triéthylamine (TEA), la concentration massique de la solution en EHTEOS est de 2,5%, le rapport des concentrations massiques d'eau et d'éthanol est de 0,18%, les quantités relatives des constituants sont définies par les paramètres [H=H20]/[EHTEOS]=l et T=[TEA]/[EHTEOS]=l . Cette solution est déposée sur le substrat, éventuellement après maturation. Le terme "maturation" ou mûrissement est un terme couramment employé dans le domaine du dépôt par voie sol-gel et est clair pour l'homme du métier dans ce domaine de la technique. Par "maturation" on entend généralement que la solution est stockée dans des conditions particulières pendant une durée permettant aux réactions d'hydrolyse et de condensation de se dérouler jusqu'à un avancement idéal pour, d'une part, la cohésion de la couche déposée ensuite sur la surface, et d'autre part, pour le greffage de ladite couche au substrat . Le mûrissement comprend généralement, un stockage de la solution dans un récipient clos, à l'abri de l'air et éventuellement de l'humidité, par exemple généralement sous atmosphère inerte, en statique (c'est-à-dire sans agitation) ou sous faible agitation, à une température généralement comprise entre 15° et 60°, pendant une durée généralement de une à quelques heure (s) (par exemple 2, 5 ou 10 heures) à une ou quelques semaines (par exemple 2, 5 ou 10 semaines) . Pour une solution d'un silane donné, la durée de mûrissement dépend principalement de la température de stockage et des paramètres H et T définis ci-dessus et peut être facilement déterminée par l'homme du métier. Par exemple pour la solution typique décrite plus haut, on procède de préférence à un mûrissement, par exemple au moins 3 jours à 22 °C sous agitation. A l'issue du mûrissement, la solution obtenue peut être définie comme une solution liquide de silane hydrolyse, c'est cette solution qui est mise en contact avec la surface du substrat, déposée sur celle- ci . Le dépôt peut être effectué par tout procédé de dépôt en phase liquide adéquate connu de l'homme du métier tel que, et de manière non exhaustive : enduction centrifuge ("spin coating"), trempage retrait ("dip coating"), enduction laminaire ("laminar flow coating" ou "meniscus coating"), et ses variantes l'enduction au rouleau (« roller coating ») et l'enduction au rideau (« curtain coating ») , impression ("printing" par exemple "ink jet printing"), dépôt à la pipette ("spotting") , ou pistolage ("spray coating") . Certains de ces procédés de dépôt permettent de revêtir de grandes surfaces par exemple de quelques centaines de cm2 à quelques m2, ce qui constitue un des avantages du procédé de l'invention. Certains autres de ces procédés permettent de réaliser des dépôts localisés par exemple de quelques nm2 à quelques mm2, ce qui constitue un autre avantage du procédé selon l'invention. D'autres techniques peuvent être fortement automatisées et atteindre de hautes cadences (centrifugation, impression, spotting) ce qui constitue un autre avantage du procédé de l'invention. Le dépôt est généralement réalisé à température ambiante : à savoir à une température généralement de 15 à 35°C, de préférence de 20 à 25°C, par exemple de 23 °C. Le dépôt est effectué généralement en quelques secondes à quelques minutes, et on laisse la solution déposée sur la surface en contact avec celle- ci pendant une durée suffisante, par exemple inférieure à 10 minutes, pour former une couche épaisse gélifiée accrochée par covalence à la surface (étape b) ) . La formation de la couche épaisse (étape b) se fait simultanément (par exemple en partie) à l'étape a) ou immédiatement après l'étape a) . Un dernier séchage est effectué entre 25 et 60 °C pendant quelques minutes par exemple pendant une durée inférieure à 15 minutes, puis la couche est éventuellement recuite à une température généralement compris entre 70°C et 200°C. Dans le cas d'une surface munie de groupes hydroxyles, et d'une solution contenant un siloxane tel que EHTEOS, la couche épaisse est liée à la surface par l'intermédiaire de liaisons -Si-O-. Cette couche porte les fonctions chimiques libres qui sont les fonctions epoxydes (EP) représentées sur le schéma 1 et qui permettent l'accrochage, l'immobilisation, le greffage, de molécules chimiques ou biologiques . Par couche épaisse au sens de l'invention, on entend généralement une couche de quelques nanometres à plusieurs microns par exemple de 10 nm à 10 μm, par exemple de 50 nm à 1 μm, par exemple 100 nm, par opposition aux couches monomoléculaires autoassemblées qui ont généralement une épaisseur de quelques Angstrôms à quelques nm. La couche obtenue est une couche uniforme (sans irrégularités) même sur une grande surface. L'homogénéité d'épaisseur est typiquement de ± 3%. La couche présente également de très faibles pertes par absorption et diffusion (k < 2.10"3) et son indice de réfraction est voisin de 1,47 dans le visible. Cette couche peut donc être utilisée pour ses propriétés optiques, seule ou comme couche faisant partie d'un empilement de couches optiques. Sur le schéma 1, le procédé selon l'invention, que l'on pourrait définir par exemple comme un procédé de silanisation par voie sol-gel en milieu hydroalcoolique, est comparé à un procédé selon l'art antérieur dans lequel la silanisation est réalisée en préparant une couche de type "SAM". Dans ce procédé de l'art antérieur, on applique sur la surface une solution du même siloxane, à savoir le EHTEOS, mais dans un solvant organique tel que le toluène et en présence d'un catalyseur choisi parmi les bases organiques telles que par exemple la triéthylamine (TEA) ou la diisopropyléthylamine (DIEA) . Du fait de la présence d'un solvant agressif tel que le toluène, ce procédé ne peut être mis en œuvre sur de nombreux substrats sensibles, notamment les plastiques (PMMA, PC, PP, PS, PVC) ou comportant des parties résinées ou collées. Le dépôt est réalisé à une température élevée par exemple à 80 °C et pendant une longue durée par exemple voisine de 16 heures. On obtient ainsi une couche monomoléculaire auto-assemblée ("SAM") d'une épaisseur de quelques Angstrôms à quelques nm, liée au substrat, par exemple par des liaisons -Si-O-, et qui porte les fonctions permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques telles que des fonctions époxyde (EP) . Sur la surface fonctionnalisée, à savoir la surface pourvue de la couche "SAM" ou de la couche épaisse, toutes deux porteuses de fonctions permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques, on procède ensuite à l'immobilisation, à l'accrochage, au greffage des molécules chimiques ou biologiques . La fonction portée par la couche étant généralement une fonction telle que la fonction époxyde qui est réactive vis-à-vis des groupements nucléophiles, la molécule chimique ou biologique à immobiliser comporte donc généralement un groupement nucléophile tel qu'un groupement aminé, thiol, oxyamine, hydroxyle ou phénol ou la base conjuguée de ces groupements . La molécule chimique est choisie généralement en fonction de l'application envisagée, par exemple il pourra s'agir d'une molécule chirale, achirale, linéaire, cyclique ou hétérocyclique . La molécule biologique est choisie généralement parmi les protéines, l'ADN, les oligonucleotides, les peptides, et les oligosaccharides . Si la molécule chimique ou biologique n'est pas porteuse d'un groupement nucléophile, on peut la modifier pour lui en conférer un. Sur le schéma 1, la molécule immobilisée est ainsi un oligonucléotide modifié avec un groupe NH2. Le greffage, l'immobilisation des molécules biologiques ou chimiques se fait très simplement, par exemple en mettant la molécule en solution dans un milieu adéquate, tel qu'un tampon aqueux, et en le déposant sur la surface fonctionnalisée par exemple manuellement ou à l'aide d'un robot de "spotting" muni de têtes de type piézoélectriques (sans contact avec la surface) ou de type "pin" ou "pin and ring" (contact avec la surface) . On obtient finalement une surface sur laquelle sont greffées, accrochés, immobilisées les molécules chimiques ou biologiques : sur le schéma 1 des oligonucleotides sont ainsi immobilisés par l'intermédiaire d'une liaison de type aminé (C-N) . On peut aussi à l'issue de l'étape de fonctionnalisation transformer les fonctions portées par la couche épaisse ou la couche "SAM", en d'autres fonctions permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques . Ces fonctions sont de préférence également des fonctions réactives vis-à-vis des groupements nucléophiles . Ainsi, les fonctions epoxydes peuvent être transformées en fonctions aldéhyde en ouvrant tout d'abord le cycle époxyde en milieu HC1 aqueux pour donner un diol, et en réalisant ensuite une coupure oxydante par exemple par NaI04. L'immobilisation des molécules chimiques ou biologiques sur la couche munie de groupements aldéhydes se fait par exemple en mettant en contact la molécule chimique ou biologique comportant un groupement nucléophile avec la surface fonctionnalisée par les aldéhydes . Si le groupement nucléophile est un groupement NH2 comme sur le schéma 1 avec oligo-NH2, on effectue ensuite une réduction par exemple par NaBH . EXEMPLE 1 Dans cet exemple, on prépare par le procédé "sol-gel" selon l'invention, une couche épaisse d'une épaisseur voisine de 100 nm comportant des fonctions époxyde sur un substrat en verre (lame en verre flotté commerciale) nettoyé et apprêté par décapage dans la soude (procédé Brown) . On dépose sur ledit substrat une solution de 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane (EHTEOS) dans l'éthanol en présence de triéthylamine (TEA) et d'eau. La concentration massique de la solution en
EHTEOS est de 2,5%. Le rapport des concentrations massiques de H20 et d'EtOH est de 0,18% (H20/EtOH) . Les quantités relatives des constituants sont définies par les deux paramètres H=[H2θ]/[EHTEOS]=l et T=[TEA]/[EHTEOS]=l, où [x] représente la concentration molaire de l'espèce x. La solution a été mûrie au moins 3 jours à 22 °C sous faible agitation. Le dépôt est fait à température ambiante par centrifugation à une vitesse de 200 à 3000 tr/min, par exemple de 700 tr/min pour donner une couche humide. La durée de contact entre le substrat et la solution liquide est de 1 à quelques secondes (par exemple 1 à 10 secondes) . La durée de contact entre le substrat et la couche humide est de 5 minutes (temps de séchage de la couche avec le substrat toujours en rotation) . On obtient ainsi sur le substrat une couche épaisse gélifiée d'une épaisseur de 140 nm environ porteuse de fonctions epoxydes . Après séchage 5 minutes sous lampe IR et cuisson de 1 à quelques minutes (par exemple 5 ou 10 minutes) jusqu'à 30 minutes à une température comprise entre 80°C et 150°C, la couche densifiee et greffée au substrat a une épaisseur voisine de 100 nm + 5 nm et un indice de réfraction voisin de 1,47 (elle est quart d'onde vers 595 nm) .
EXEMPLE 2 Dans cet exemple, on prépare une couche épaisse d'une épaisseur de 100 nm environ comportant des fonctions aldéhyde sur un substrat en verre (lame en verre flotté commerciale) par le procédé "sol-gel" selon l'invention. On traite le substrat muni d'une couche épaisse porteuse de fonctions époxyde préparée comme dans l'exemple 1 avec une solution aqueuse de HC1 (séjour à température ambiante pendant 3 heures dans une solution aqueuse à 0,2 N puis trois rinçages successifs dans l'eau désionisée, puis séchage (par jet d'air ou centrifugation) afin d'ouvrir les cycles epoxydes et former des diols, puis on réalise une coupure oxydante dudit diol par NaI0 (agitation pendant 1 heure à température ambiante, rinçage pendant 5 minutes dans l'eau désionisée puis séchage par centrifugation) pour obtenir les fonctions de type aldéhyde .
EXEMPLE 3 On dépose et on immobilise sur les supports préparés dans l'exemple 1 un oligonucléotide modifié NH2 (20 mères) . Le dépôt est effectué dans une solution aqueuse (Na2HP0 0,3 M) par un robot de type Piezo. Les sondes oligonucléotidiques obtenues ont été hybridées par une cible complémentaire marquée d'un fluorophore CY3. Les mesures de fluorescence sont effectuées au scanner Axon Genepix.
EXEMPLE 4 On répète le même mode opératoire que dans l'exemple 3 mais avec les supports préparés dans l'exemple 2 et l'on obtient un support sur lequel sont immobilisés des oligonucleotides modifiés. EXEMPLE COMPARATIF 1 Dans cet exemple, on prépare une couche monomoléculaire dont l'agencement est contrôlé (couche "SAM") et qui comporte des fonctions epoxydes, sur un substrat par le procédé suivant : Le support (lame de verre ou silice) est nettoyé et activé en milieu basique (NaOH/EtOH/eau désionisée dans les proportions 1 g/4 mL/3 mL) puis rincé à l'eau désionisée (5 min) puis séché à 80°C. Le support ainsi nettoyé et activé (fonctions hydroxyles en surface) est ensuite fonctionnalisé à 80 °C pendant 16 heures par une solution d' EHTEOS (5 mM) et de triéthylamine (TEA, 0,2 M) dans le toluène. Les substrats sont ensuite rincés à l'acétone, à l'éthanol et à l'eau, séchés par centrifugation, puis la couche organique est réticulée à haute température (3 h à 110 °C) . La fonction époxyde est transformée en diol par trempage des substrats pendant 3 heures à température ambiante dans une solution aqueuse d'CHl à
0,2 M. Les substrats sont ensuite rincés puis séchés par centrifugation. On prépare ensuite une sonde oligonucléotidique hybridée par le mode opératoire de l'exemple 3 et on effectue les mesures de fluorescence. EXEMPLE COMPARATIF 2 Dans cet exemple, on prépare une couche monomoléculaire dont l'agencement est contrôlé (couche "SAM") et comportant des fonctions aldéhyde par le même procédé que dans l'exemple comparatif 1 puis on transforme les fonctions époxyde en fonctions aldéhyde par le mode opératoire de l'exemple 2. On prépare ensuite une sonde oligonucléotidique hybridée par le mode opératoire de l'exemple 3 et on effectue les mesures de fluorescence.
Les résultats des mesures de fluorescence sont donnés sur les figures 1 et 2. La figure 1 donne le signal de fluorescence exprimé en niveaux de gris (NG) sur 16 bits (65536 niveaux) pour les diverses sondes hybridées obtenues dans les exemples 3, 4 selon l'invention (B et D) et les exemples comparatifs 1 et 2 (A et C) . La figure 2 donne le bruit de fond du substrat pour les échantillons des exemples 3, 4 (B et D) et les exemples comparatifs 1 et 2 (A et C) . Les surfaces de type époxyde et aldéhydique permettent d'obtenir un signal du même ordre de grandeur. Ce signal est légèrement plus faible sur les surfaces obtenues par voie sol-gel selon le procédé selon l'invention (B et D sur la figure 1) : le signal des couches sol-gel est inférieur à 30% pour les surfaces epoxydes et de 20% pour les surfaces aldéhydes . Le bruit de fond est amélioré sur les surfaces obtenues par voie sol-gel selon le procédé selon l'invention (B et D sur la figure 2) ce qui permet notamment d'augmenter le rapport signal/bruit (sensibilité) . Pour un robot de dépôt, un tampon de dépôt et un volume spotté donnés, le diamètre de ce spot dépend principalement de l'angle de contact de la surface : plus cet angle est élevé, plus la surface est hydrophobe et plus le diamètre d'un spot d'une solution aqueuse est faible. De manière surprenante, compte tenu des valeurs mesurées des angles de contact, le diamètre des spots obtenus par la voie "sol-gel" selon la figure 3 est inférieur à celui obtenu par la voie "SAM" (fig. 3) . Dans cet exemple, le volume de la goutte
"spottée" est de 650 pL (picolitres) . Sur les couches obtenues par voie "SAM", une grande différence d'angle de contact existe entre les couches de type époxyde et aldéhyde (respectivement 70 et 61°) . Les spots obtenus ont respectivement un diamètre de 170 et 200 microns. Sur les couches obtenues par voie "sol-gel" selon l'invention, les valeurs des angles de contact pour les couches de type époxyde et aldéhyde sont proches (respectivement 65 et 66°) . On s'attend donc à obtenir un diamètre de spot compris entre 180-190 microns. De manière surprenante, les spots obtenus sur les couches "sol-gel" ont respectivement un diamètre de 90 et 110 microns pour les couches époxyde et aldéhyde. Cette couche épaisse, d'épaisseur parfaitement contrôlée peut entre autre être utilisée comme couche optique seule ou comme faisant partie d'un empilement, par exemple un miroir de Bragg. Ce miroir est caractérisé par des couches optiques dont l'épaisseur est égale à la longueur d'onde d'émission divisé par 4 fois l'indice de réfraction de la couche à cette longueur d'onde. Une description de la préparation de ce type de miroir par voie sol-gel est donnée dans le document FR-A-2 818 378 ( O-A-02/48691) .

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé Sol-gel de fonctionnalisation d'une surface d'un substrat solide, éventuellement nettoyée et/ou activée, dans lequel on réalise les étapes suivantes : a) on dépose sur ladite surface, à température ambiante, une solution dans un mélange d'eau et d'un solvant organique volatil, miscible avec l'eau, d'un catalyseur acide ou basique, et d'un silane ou siloxane porteur d'au moins une fonction chimique A permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques et/ou susceptible d'être transformée en une fonction chimique A' permettant l'immobilisation de molécules biologiques ou chimiques et d'au moins une fonction chimique B d'accrochage susceptible de s'accrocher chimiquement par covalence, ou mécaniquement, à la surface ; b) simultanément à l'étape a), et/ou immédiatement après cette étape, on évapore le solvant organique volatil, moyennant quoi la solution se transforme en un gel humide formant une couche épaisse gélifiée ; puis c) on sèche la couche épaisse gélifiée, moyennant quoi on obtient une couche épaisse accrochée chimiquement par covalence, ou mécaniquement à la surface et portant lesdites fonctions chimiques A permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques .
2. Procédé selon la revendication 1, dans lequel le dépôt de la solution dans l'étape a) est réalisé par une technique de dépôt en phase liquide choisie parmi la centrifugation ("spin-coating" en anglais) , le trempage-retrait ("dip-coating" en anglais), l'enduction laminaire ("laminar flow coating" en anglais) et ses variantes l'enduction au rouleau
(« roller coating ») et l'enduction au rideau
(« curtain coating ») , le pistolage ("spray coating" en anglais), l'impression ("printing") par exemple en mettant en œuvre la technique de l'impression par jet
("jet printing"), et le dépôt à la pipette
("spotting") .
3. Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'étape b) est réalisée à température ambiante.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la durée de l'étape a) est de 1 seconde à 10 minutes.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la durée de l'étape b) est inférieure ou égale à 10 minutes, par exemple de 1 à 5 minutes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel l'étape b) est partiellement simultanée à l'étape a) .
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le séchage réalisé dans l'étape c) a une durée inférieure ou égale à 15 minutes.
8. Procédé selon la revendication 7, dans lequel le séchage de l'étape c) est réalisé à une température de 25 à 60 °C.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel après le séchage de l'étape c) , on réalise une étape d) de cuisson ou de recuit à une température plus élevée que la température de séchage.
10. Procédé selon la revendication 9, dans lequel l'étape d) est réalisée à une température de 70 à 200°C.
11. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite fonction chimique A est une fonction réactive vis-à-vis des groupements nucléophiles, telle qu'une fonction époxyde.
12. Procédé selon la revendication 1, dans lequel ledit silane ou siloxane répond à la formule suivante (I) :
dans laquelle Ri, R2 et R3 identiques ou différents représentent un groupe alkyle linéaire ou ramifié de 1 à 6 atomes de carbone tel que méthyle, éthyle, n-propyle, i-propyle, n-butyle, i-butyle, ou t- butyle ; et Y représente une chaîne hydrocarbonée telle qu'une chaîne alkyle linéaire ou ramifiée de 1 à 20 atomes de carbone dans laquelle un ou plusieurs atomes de carbone peuvent être éventuellement remplacés par un atome d'oxygène, de soufre ou d'azote.
13. Procédé selon l'une des revendications précédentes, dans lequel ledit silane ou siloxane est choisi parmi le 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane (EHTEOS), le 2- (3, 4 époxycyclohexyl) éthyl-triméthoxysilane, le 2- (3,4 époxycyclohexyl) éthyltriéthoxysilane, le (3- glycidyloxypropyl) méthyl-diéthoxysilane, et le (3- glycidyloxypropyl) triméthoxysilane (GLYMO) , le (3- glycidoxypropyl) bis (triméthylsiloxy) méthylsilane, le
(3-glycidoxypropyl) diméthyléthoxysilane, le (3- glycidoxypropyl) méthyldiméthoxysilane, et le (3- glycidoxypropyl) pentaméthyldisiloxane .
14. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le silane ou siloxane est présent dans la solution à une concentration massique de 0,1 à 10%.
15. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel le catalyseur est un catalyseur acide.
16. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 14, dans lequel le catalyseur est un catalyseur basique.
17. Procédé selon la revendication 15, dans lequel le catalyseur acide est choisi parmi les acides inorganiques tels que HC1, HNO3, H2S0 , et leurs mélanges ; ou les acides organiques tels que HCOOH, CH3COOH, CH2=CH(CH3)COOH, et leurs mélanges.
18. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le catalyseur basique est choisi parmi l'ammoniaque et les aminés primaires, secondaires, tertiaires et aromatiques .
19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le catalyseur est choisi parmi les tri (alkyl en Ci à C10) aminés telle que la triéthylamine (TEA) .
20. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le catalyseur est présent dans la solution à une concentration massique de 0,005 à 5%.
21. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le solvant organique miscible dans la solution de l'étape a) est un alcool tel qu'un alcool aliphatique de 1 à 12 atomes de carbone, comme l'éthanol ou 1 ' isopropanol .
22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel les proportions d'alcool et d'eau dans le mélange d'eau et d'alcool sont de 0,05% à 10% d'eau par rapport à l'alcool.
23. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes dans lequel les quantités relatives d'eau, de siloxane tel que EHTEOS, et de catalyseur tel que TEA définies par les paramètres [H?θl „, [catalyseur] „ r . H = τ -^-* et T = — != i — , où [x] représente [silane ou siloxane] [silane ou siloxane] la concentration molaire de l'espèce x, sont telles que O<Η<100 et O<T<100 ; de préférence 0,1<H<20 et 0,01<T<10, de préférence encore 0,8<H<2 et 0,1<T<2.
24. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 23, dans lequel on transforme les fonctions A, par exemple les fonctions epoxydes portées par la couche épaisse, en d'autres fonctions A' différentes des fonctions A, et permettant l'immobilisation de molécules chimiques ou biologiques.
25. Procédé selon la revendication 24 dans lequel les fonctions A' sont choisies parmi les fonctions réactives vis-à-vis des groupements nucléophiles telles que les fonctions diol, aldéhyde, acide carboxylique, ester activé, halogénure d'acide, anhydride, amide, halogénure de sulfonyle et halogénure d' alkyle ou d'aryle.
26. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel avant l'étape a), on fait subir à la solution une maturation.
27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la maturation comprend le stockage de la solution dans un récipient clos sans agitation ou sous faible agitation à une température de 15 à 60 °C pendant 1 heure à 10 semaines.
28. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le substrat solide est en un matériau choisi parmi les semiconducteurs tels que le silicium ; les polymères organiques tels que le poly (methacrylate de méthyle)
(PMMA) , le polycarbonate (PC) , le polystyrène (PS) , le polypropylène (PP) et le poly (chlorure de vinyle)
(PVC) ; les métaux tels que l'or, l'aluminium et l'argent ; les verres ; les oxydes minéraux généralement en couche tels que SiÛ2, AI2O3, ZrÛ2, iÛ2, Ta2Û5 ; et les matériaux composites comprenant plusieurs de ces matériaux.
29. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel le substrat est structuré ou non structuré.
30. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel la couche épaisse a une épaisseur de 10 nm à 10 μm, par exemple de 50 nm à 1 μm.
31. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel : - la solution de l'étape a) est une solution de 5, 6-époxyhexyltriéthoxysilane (EHTEOS) dans un mélange d'eau et d'éthanol contenant de la triéthylamine (TEA) ; - la concentration massique de la solution en EHTEOS est de 2,5%, le rapport des concentrations massiques d'eau et d'éthanol est de 0,18%, et les quantités relatives des constituants sont définies par les paramètres H=[H20]/[EHTEOS]=l et T=[TEA]/[EHTEOS]=l ; - le substrat est un substrat en verre nettoyé et apprêté par décapage dans la soude ; - la solution est une solution qui a été mûrie au moins 3 jours à 22 °C sous faible agitation ; - le dépôt est fait à température ambiante par centrifugation à une vitesse comprise entre 200 tr/min et 3000 tr/min par exemple de 700 tr/min pour donner une couche humide et la durée de contact entre le substrat et la solution liquide est de 1 à 10 secondes ; - la durée de contact entre la couche humide et le substrat est de 5 minutes, avec le substrat toujours en rotation, et l'on obtient ainsi sur le substrat une couche épaisse gélifiée d'une épaisseur de 140 nm environ porteuse de fonctions epoxydes ; - on sèche ladite couche épaisse gélifiée 5 minutes sous une lampe à infrarouges et l'on effectue une cuisson de 1 à 30 minutes à une température comprise entre 80 °C et 150 °C moyennant quoi on obtient une couche densifiee et greffée au substrat d'une épaisseur voisine de 100 nm + 5 nm et d'indice de réfraction voisin de 1,47.
32. Procédé de préparation d'un substrat solide comprenant une surface sur laquelle sont immobilisées des molécules chimiques ou biologiques dans lequel on fonctionnalise une surface d'un substrat solide par le procédé de fonctionnalisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 31, puis on fait réagir, sans procéder à un lavage de la surface fonctionnalisée, des molécules chimiques ou biologiques avec lesdites fonctions chimiques A ou A' portées par la couche épaisse.
33. Procédé selon la revendication 32, dans lequel lesdites molécules chimiques ou biologiques sont des molécules comportant des groupements nucléophiles tels que les fonctions aminé, hydroxyle, oxyamine, thiol, ou leurs dérivés anioniques .
34. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 et 33, dans lequel lesdites molécules chimiques sont choisies parmi les molécules chirales, achirales, linéaires, cycliques, hétérocycliques .
35. Procédé selon l'une quelconque des revendications 32 et 33, dans lequel lesdites molécules biologiques sont choisies parmi les protéines, l'ADN, les oligonucleotides, les peptides, et les oligosaccharides .
36. Utilisation de la couche épaisse obtenue à l'issue de l'étape c) ou d) du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes en tant que couche optique.
37. Utilisation selon la revendication 36, dans laquelle ladite couche est utilisée seule.
38. Utilisation selon la revendication 36, dans laquelle ladite couche est utilisée dans un empilement de plusieurs couches optiques.
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