EP1697747A2 - Verfahren und vorrichtung zur markierung von biomolek len - Google Patents

Verfahren und vorrichtung zur markierung von biomolek len

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EP1697747A2
EP1697747A2 EP04790945A EP04790945A EP1697747A2 EP 1697747 A2 EP1697747 A2 EP 1697747A2 EP 04790945 A EP04790945 A EP 04790945A EP 04790945 A EP04790945 A EP 04790945A EP 1697747 A2 EP1697747 A2 EP 1697747A2
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EP
European Patent Office
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micromixer
reaction
volume
biomolecules
labeling
Prior art date
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EP04790945A
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Alexander Azzawi
Stefan Derschum
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Ehrfeld Mikrotechnik BTS GmbH
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Ehrfeld Mikrotechnik BTS GmbH
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Publication date
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    • B01J19/0093—Microreactors, e.g. miniaturised or microfabricated reactors
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    • B01J2219/0095—Control aspects
    • B01J2219/00984—Residence time

Definitions

  • the invention relates to a method for the efficient labeling of biomolecules, preferably proteins, nucleic acids and saccharides, with the aid of a micro-mixer and a device with which the method according to the invention can be carried out with little additional auxiliary means.
  • the labeling reaction in the micromixer is superior to conventional methods for labeling biomolecules.
  • marker molecules can be dyes, electrochemically active compounds or even proteins, such as peroxidase or green fluorescent protein (GFP).
  • GFP green fluorescent protein
  • marking is the conversion of a biomolecule, which can also be in a modified form for the purpose of specific marking, with an activated form of the marker molecule.
  • an activated form of the marker molecule typically, amino or sulfhydi groups present on the biomolecule are marked.
  • a marker molecule For the labeling of amino groups, for example the ⁇ -amino groups of the amino acid lysine present in a protein, a marker molecule is provided with a corresponding activated functionality.
  • This functionality can be, for example, an isothiocyanate (ITC) or a carboxylic acid function on the marker molecule activated by an N-hydroxysuccinimide group (NHS) or a tetrafluorophenyl group (TFP).
  • An NHS ester then reacts, for example, with a primary amino group to the corresponding amide according to the following reaction:
  • Corresponding maleimides are used for the activation of sulfhydryl groups.
  • suitable activated derivatives of fluorescent markers from various manufacturers are offered in large numbers. If one compares the instructions given for the labeling of proteins, there is broad agreement between the various instructions:
  • the protein is dissolved in an amine-free buffer (pH 7 to 9) in a concentration of about 10 mg / ml. 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) can be added to improve the solubility.
  • DMSO dimethyl sulfoxide
  • 2 and 10 molar equivalents of dyes, dissolved in DMSO are added and the reaction is stirred at room temperature for 5 minutes to 2 hours. The reaction is then stopped by adding a hydroxylamine solution or by removing the free dye, for example by gel permeation chromatography.
  • each biomolecule reacts with exactly the desired number of marker molecules and to provide a device which is suitable for this method.
  • the protein or the biomolecule and the marker molecule must therefore be mixed quickly with one another in predetermined proportions in the smallest possible volume compartments. It must then be ensured that the molecules have been in contact for a sufficiently long time to react with one another. After this time, the reaction is stopped in order to avoid side reactions.
  • biomolecules preferably proteins, nucleic acids or saccharides, which carry free reactive groups, such as free amino, thiol, alcohol, aldehyde / ketone and / or carboxylic acid groups, by means of a so forming a covalent bond reacting marker compound found, in which solutions of both compounds, ie biomolecule solution and solution of the marker compound, are supplied in defined flow rates to a micromixer, preferably a static micromixer, and mixed there intensively.
  • the reaction mixture is then preferably fed into a residence structure, where it is determined by the volume of the residence structure and the Flow rate of the reaction mixture predetermined time remains. After a time determined by the reaction conditions, the reaction is stopped.
  • All common compounds can be used as proteins, nucleic acids and / or saccharides, e.g. Enzymes, membrane proteins, antibodies, deoxyribonucleic acid (DNA), RNA, polysaccharides.
  • Enzymes e.g. Enzymes, membrane proteins, antibodies, deoxyribonucleic acid (DNA), RNA, polysaccharides.
  • micromixers and residence structures significantly increases the efficiency of the labeling reaction owing to the better mixing and metering of the reactants and the very precisely adjustable and narrow residence spectrum compared to all previously known methods.
  • static mixers are preferably used, which are continuously flowed through, e.g. Multilamination.
  • These include, for example, stack mixers, slotted plate mixers, i.e. Mixers in which streams of two different liquids are fanned out and the partial streams are alternately combined by an interdigital configuration, or comb mixers in which the two fluid streams to be mixed are fanned out into a large number of thin lamellae or films and these lamellae are then alternately combed into one another , so that diffusion and secondary flows result in rapid mixing.
  • EMB Ehrfeld Mikrotechnik BTS GmbH
  • V-type mixers from the Düsseldorf Research Center (FZK), split and recombiner mixers, such as Cascade mixer or diamond mixer (EMB), in which the solution streams are divided into smaller streams and these small streams are repeatedly merged and divided, Caterpillar mixers from the Institute for Microtechnology Mainz (IMM), or mixers with a cross-sectional constriction, such as focus mixers or cyclone mixers (IMM), or also jet mixers from Synthesechemie and impact jet mixers (IMM) or valve mixers (EMB).
  • FZK split and recombiner mixers
  • EMB diamond mixer
  • Caterpillar mixers from the Institute for Microtechnology Mainz (IMM)
  • mixers with a cross-sectional constriction such as focus mixers or cyclone mixers (IMM), or also jet mixers from Synthesechemie and impact jet mixers (IMM) or valve mixers (EMB).
  • a micromixer is preferably used, in which the connections and feed lines are designed in such a way that only a small volume has to be flowed through until the actual microstructure enters or exits (low-volume micromixer).
  • This volume is preferably less than 10% of the volume of the solutions to be mixed, particularly preferably less than 1%, that is to say, for example, with a solution amount of 500 ⁇ l less than 5 ⁇ l.
  • a multilamination micromixer made of PEEK (polyether ether ketone) is particularly suitable.
  • the capillary inputs of the supply lines would be immediate attached to the openings of the micro structure so that the dead volume could be further minimized.
  • micromixers with channel widths of less than 100 ⁇ m are used.
  • the biomolecule and marker molecule solutions are pumped using precise and low-pulsation pumps, e.g. Syringe pumps, too dosed.
  • the reaction solution mixed in this way is then preferably fed into a residence structure having a predetermined residence time.
  • the solutions can also be metered into the micromixer via two syringes coupled to one another.
  • the mixing device preferably contains two openings for attaching metering syringes, the actual microstructured mixing structure, a short capillary-like structure with which a certain dwell time and a pressure drop for easier metering is achieved, an outlet for the mixed reaction solution and cutouts so that the mixing device is securely open the common reaction vessels, such as, for example the reaction vessels (e.g. 0.5-2 ml) from Eppendorf or the screw cap tubes (e.g. 2-50 ml) from Greiner-Bio One can be attached.
  • the reaction vessels e.g. 0.5-2 ml
  • the screw cap tubes e.g. 2-50 ml
  • Two commercially available syringes can be used to dose the solutions into the mixing device, see e.g. Fig. 2 or 3.
  • the syringes are filled with the solutions.
  • the volume of the syringes is preferably based on the desired dosage ratio of the two solutions.
  • the syringes are placed on the corresponding openings in the mixing device.
  • the two pistons and plunger of the syringe are connected to one another with small auxiliary devices, so that when the connected plunger is pressed down, both plungers move downwards at the same speed. This ensures that a volume ratio of the two reaction solutions corresponding to the ratio of the diameter of the syringe cylinders is metered into the mixing device, see FIG. 4.
  • the mixing device can be a device for multiple use. However, it is also possible to produce a large number of inexpensive mixing devices which are intended for single use by means of an inexpensive production process, such as, for example, by injection molding. As an alternative to the methods already described, metering into the micromixer is also possible via centrifugal force, as illustrated by way of example in FIG. 5.
  • the mixing device preferably contains two reservoirs on the top (10/11), the actual microstructured mixing structure (3), a short capillary-like structure, with which a certain dwell time and a pressure drop for easier metering is achieved, an outlet for the mixed reaction solution and Recesses so that the mixing device can be placed securely on the common reaction vessels.
  • the two solutions are filled into the reservoirs (10/11).
  • the size ratio of the reservoirs corresponds to the volume ratio of the solutions usually used in the reaction.
  • the reservoirs are connected to the mixed structure (3) via small, precisely defined openings.
  • the dimension of the opening and the feed lines is preferably chosen such that the two solutions are only metered into the mixed structure in the desired ratio when a force acts on the solutions in the reservoir.
  • the force can be generated in a laboratory centrifuge by centrifuging the filled mixing device placed on a collecting vessel, for example a 2 ml reaction vessel.
  • a collecting vessel for example a 2 ml reaction vessel.
  • the embodiment is preferred in which the two openings of the reservoirs are oriented towards the mixing structure at exactly right angles to the axis of rotation of the centrifuge, so that the same force acts on both solutions.
  • the mixing device is provided with appropriate markings to make alignment easier.
  • the force can also be generated by applying a pressure to the top of the reservoirs or by applying a negative pressure to the outlet of the mixing device.
  • the mixing device can also be a device for multiple use. However, it is also possible to produce a large number of inexpensive mixing devices which are intended for single use by means of an inexpensive production process, such as, for example, by injection molding.
  • the device according to the invention for carrying out a method for marking biomolecules carrying reactive groups, preferably proteins, therefore preferably contains 2 reservoirs for liquids, which may have a metering unit, preferably 2 syringes, a micromixer, possibly a residence structure and optionally any one Fall arrester for the product.
  • Dwell time structures in the sense of the invention are delimited volumes that can be flowed through in a predetermined time due to their internal volume, such as, for example, capillaries or micromixers.
  • Different residence structures can be used, each of which is characterized by the narrowest possible residence time distribution and has low dead volumes.
  • the indwelling structure consists of a capillary of a predetermined length, but other volumes or arrangements with uniform flow can also be used. Dwelling structures can also be used in which the mixture is pumped around in the circuit, a micro-mixer possibly being inserted into the circuit. The latter especially when there are two phases and phase separation.
  • reaction solution After passing through the residence structure, the reaction solution is collected.
  • the reaction can be stopped by metering in a further reagent using a further micromixer, by thermal treatment with a micro-heat exchanger or by dropping the reaction mixture into a collecting vessel with a corresponding termination reagent.
  • a dye molecule which carries a reactive group, i.e. free amino, thiol, alcohol, aldehyde / ketone and / or carboxylic acid groups.
  • reactive group-bearing marker compounds react to form covalent bonds, e.g. in M. Brinkley in Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 2-13 and by R.P. Haugland in Methods in Molecular Biology 1995, 45, 205-221.
  • the labeling of alcohols in biomolecules are preferably carried out via sulfonic acid chlorides, e.g. dansyl chloride (5-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl chloride) or the oxidation with sodium periodate to the aldehyde and the subsequent labeling with hydrazine derivatives of the dyes, such as, for example. Hydrazides, semicarbazides, carbohydrazides, e.g. Fluorescein-5-thiosemicarbazide.
  • sulfonic acid chlorides e.g. Dansyl chloride (5-dimethylamino-naphthalene-1-sulfonyl chloride) or the oxidation with sodium periodate to the aldehyde and the subsequent labeling with hydrazine derivatives of the dyes, such as, for example.
  • Hydrazides, semicarbazides, carbohydrazides e.g. Fluorescein-5-thi
  • Aldehydes / ketones are preferably labeled with amines (Schiff bases) or with hydrazine derivatives to form the hydrazide, while carboxylic acids are preferably labeled with hydrazine derivatives to form the hydrazide.
  • the marker molecule carries a reactive group which reacts with the free amino, thiol, alcohol and / or aldehyde / ketone-bearing biomolecules to form covalent bonds and the marker molecule also catalyzes a chemical reaction which leads to a easily detectable color change or change in the redox potential of its substrate, such as peroxidases and alkaline phosphatases.
  • Bersonders preferred as reactive groups are amino and / or thiol groups.
  • the labeling reaction can be terminated after leaving the residence structure by adding a compound which reacts quickly with the unreacted marker molecules.
  • a compound which reacts quickly with the unreacted marker molecules are commercially available compounds containing amino and / or thiol groups, such as e.g. Hydroxylamine, glutathione or mercaptoethanol.
  • the reaction can also be terminated after leaving the residence structure by chromatographic separation of the unreacted marker molecules.
  • All commercially available chromatography processes are suitable for this, e.g. gel permeation chromatography with, for example, Sephadex® G or Biogel® P or ion exchange chromatography, affinity chromatography, reversed phase chromatography (HPLC) and solid phase extraction.
  • the reaction can be terminated after leaving the residence structure by thermal treatment of the reaction solution. This is preferably done by cooling the reaction solution, preferably using a microstructured heat exchanger, or by heating the reaction solution, preferably using a microstructured heat exchanger.
  • the method according to the invention leads to higher yields and to an improved sample quality, since the two reactants are mixed quickly and thoroughly in the micromixer and the residence time in the residence structure can be set very precisely.
  • Fig. 4 shows the schematic experimental setup with a micromixer, which enables simultaneous dosing via 2 syringes and
  • Fig. 5 shows the schematic experimental setup with an addition from 2 reservoirs via centrifugal force or pressure.
  • Anti-human IgG antibodies should be labeled with fluorescein isothiocyanate (FITC).
  • the antibodies supplier: Sigma, Saint Louis
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • the antibodies were dissolved in 0.1 M sodium hydrogen carbonate buffer (pH 8.5) (10 mg / ml).
  • 10 mg of FITC supplier: Molecular Probes, Eugene
  • a 1.5 M hydroxylamine solution was also prepared to stop the reaction.
  • the antibody solutions purified in this way were examined by UV / Vis spectroscopy.
  • the two syringes (1, 2) shown in Fig. 2 were connected to a micromixer (3) via capillaries.
  • a flushing line shown in Fig. 3 was attached to the capillary of one of the syringes, which was initially closed with a clamp. This flushing line was connected to an HPLC pump, which was supplied with water (double distilled).
  • the micromixer (3) was in turn connected to a capillary (4) with a length of 28 cm.
  • a collecting vessel (5) was provided, in which the reaction solution was collected.
  • the antibody solutions purified in this way were examined by UV / Vis spectroscopy.
  • the labeled antibodies were tested for their suitability for staining granulocytes.
  • a protein is provided with a fluorescent label.
  • the NHS ester of the fluorescent marker was used to react unspecifically with the ⁇ -amino groups of the amino acid lysine present in the protein.
  • 0.27 ⁇ M protein was dissolved in 1,800 ⁇ l NaHC0 3 buffer (0.1 M, pH 8). 100 ⁇ l DMSO were added to improve the solution.
  • 1.08 ⁇ M dye-NHS ester was dissolved in 140 ⁇ l DMSO.
  • the protein and dye solutions were metered into the micromixer via 1/16 "capillaries using syringe pumps. The total flow was 400 ⁇ l / min.
  • the mixture was applied with a pipette to PD-10 columns (supplier: Amersham).
  • the eluate was collected in freeze-drying glasses, frozen and then lyophilized.

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Description

Verfahren und Vorrichtung zur Markierung von Biomolekülen
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur effizienten Markierung von Biomolekülen, vorzugsweise Proteinen, Nukleinsäuren und Sacchariden, mit Hilfe eines Mikroinischers sowie eine Vorrichtung mit dem das erfindungsgemäße Verfahren mit einem geringen Aufwand an weiteren Hilfsmitteln durchgeführt werden kann. Die Markierungsreaktion im Mikromischer ist herkömmlichen Methoden zur Markierung von Biomolekülen überlegen.
Es ist bekannt, dass Biomoleküle, insbesondere Proteine, für eine empfindliche und spezifische Detektion häufig mit Markermolekülen versehen werden müssen. Die9e Markermoleküle können Farbstoffe, elektrochemisch aktive Verbindungen oder auch selbst Proteine sein, wie die Peroxidase oder das Green Fluorescent Protein (GFP). Derartige Markierungen werden z.B. beschrieben von M. Brinkley in Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 2-13 und von R.P. Haugland in Methods in Molecular Biology 1995, 45, 205-221.
Eine Möglichkeit für die Markierung ist die Umsetzung eines Biomoleküls, das zum Zwecke einer spezifischen Markierung auch in einer abgewandelten Form vorliegen kann, mit einer aktivierten Form des Markermoleküls. Typischerweise werden am Biomolekül vorhandene Amino- oder Sulfhydi lgruppen markiert.
Für die Markierung von Aminogruppen, zum Beispiel die in einem Protein vorhandenen ε- Aminogruppen der Aminosäure Lysin, wird ein Markermolekül mit einer entsprechenden aktivierten Funktionalität versehen. Diese Funktionalität kann beispielsweise ein Isothiocyanat (ITC) oder eine durch eine N-Hydroxysuccinimidgruppe (NHS) oder eine Tetrafluorphenylgruppe (TFP) aktivierte Carbonsäurefunktion am Markermolekül sein. Ein NHS-Ester reagiert dann beispielsweise mit einer primären Aminogruppe zum entsprechenden Amid gemäß folgender Reaktion:
Protein
Für die Aktivierung von Sulfhydrylgruppen werden entsprechende Maleimide eingesetzt. Für die Markierung von Biomolekülen, wie Proteine, werden geeignete aktivierte Derivate von Fluoreszenzmarkern von verschiedenen Herstellern in einer großen Zahl angeboten. Vergleicht man die für die Markierung von Proteinen angegebenen Vorschriften, so ist eine weitgehende Übereinstimmung zwischen den verschiedenen Vorschriften festzustellen: Das Protein wird in einem aminfreien Puffer (pH 7 bis 9) in einer Konzentration von etwa 10 mg/ml gelöst. Zur Verbesserung der Löslichkeit können noch 5% Dimethylsulfoxyd (DMSO) zugegeben werden. Dann werden zwischen 2 und 10 molare Äquivalente Farbstoffe, gelöst in DMSO, zugesetzt und die Reaktion bei Raumtemperatur 5 Minuten bis 2 Stunden gerührt. Anschließend wird die Reaktion durch Zugabe einer Hydroxylaminlösung oder durch das Abtrennen des freien Farbstoffes, zum Beispiel durch Gelpermeationschromatographie, gestoppt.
Bei der bisher üblichen Markierung von Biomolekülen, insbesondere Proteinen z.B. mit Farbstoffen oder Fluoreszenziriarkern kann es jedoch zu Problemen kommen, weil sich nach der Reaktion mit dem Biomolekül gelegentlich ein unlöslicher Niederschlag bildet. Dieser Niederschlag ist auf ein Übermarkieren mit dem Marker zurückzuführen. Die übermarkierten Moleküle können nicht für die weitere Anwendung eingesetzt werden und gehen somit verloren.
Ebenso kann es bei einer unregelmäßigen Markierung von Biomolekülen zu einer sehr starken Markierung einzelner Moleküle kommen. Dies führt zu einem Selbstquenching der Fluoreszenz in diesen Molekülen und somit zu einer geringeren Fluoreszenzintensität der gesamten Probe.
Es stellte sich deshalb die Aufgabe, ein Verfahren zu finden, bei dem nach Möglichkeit jedes Biomolekül mit genau der gewünschten Anzahl von Markermolekülen reagiert und eine für dieses Verfahren geeignete Vorrichtung zur Verfügung zu stellen. Das Protein bzw. das Biomolekül und das Markermolekül müssen also in vorher festgelegen Mengenverhältnissen in möglichst kleinen Volumenkompartimenten schnell miteinander vermischt werden. Anschließend muss gewährleistet sein, dass die Moleküle ausreichend lange Zeit in Kontakt sind, um miteinander zu reagieren. Nach dieser Zeit wird die Reaktion abgebrochen, um Nebenreaktionen zu vermeiden.
Es wurde nun ein Verfahren zur Markierung von Biomolekülen, vorzugsweise von Proteinen, von Nukleinsäuren oder Sacchariden, die freie Reaktivgruppen tragen, wie freie Amino-, Thiol-, Alkohol-, Aldehyd/Keton- und/oder Carbonsäuregruppen, durch eine damit unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagierende Markerverbindung gefunden, bei dem Lösungen beider Verbindungen, d.h. Biomolekülösung und Lösung der Markerverbindung, in definierten Mengenströmen, einem Mikromischer, vorzugsweise einem statischen Mikromischer, zugeführt und dort intensiv vermischt werden. Anschließend wird die Reaktionsmischung vorzugsweise in eine Verweilstruktur eingespeist, wo sie eine durch das Volumen der Verweilstruktur und die Fließgeschwindigkeit der Reaktionsmischung vorbestimmte Zeit verbleibt. Nach einer durch die Reaktionsbedingungen vorgegeben Zeit wird die Reaktion abgebrochen.
Als Proteine, Nukleinsäuren und/oder Saccharide können alle gängigen Verbindungen eingesetzt werden, wie z.B. Enzyme, Membranproteine, Antikörper, Desoxyribonukleinsäure (DNA), RNA, Polysaccharide.
Erfindungsgemäß wird durch den Einsatz von Mikromischern und Verweilstrukturen die Effizienz der Markierungsreaktion aufgrund der besseren Durchmischung und Dosierung der Reaktanden und dem sehr genau einstellbaren und engen Verweilspektrum gegenüber allen bisher bekannten Methoden erheblich gesteigert.
Für das erfindungsgemäße Verfahren können alle bekannten statischen Mikromischer eingesetzt werden. Hierbei werden vorzugsweise statische Mischer eingesetzt, die kontinuierlich durchströmt werden, wie z.B. Multilaminationsmischer. Darunter fallen beispielsweise Stapelmischer, Schlitzplattenmischer, d.h. Mischer, bei denen Ströme von zwei unterschiedlichen Flüssigkeiten aufgefächert und die Teilströme durch eine interdigitale Konfiguration alternierend kombiniert werden, oder auch Kammmischer, bei denen die beiden zu vermischenden Fluidströme in eine Vielzahl von dünnen Lamellen oder Filmen aufgefächert werden und diese Lamellen anschließend abwechselnd ineinander gekämmt werden, so dass es durch Diffusion und Sekundärströmungen zu einer schnellen Vermischung kommt. Diese sind z.B. aus dem Produktprogramm der Ehrfeld Mikrotechnik BTS GmbH (EMB) erhältlich.
Ebenfalls möglich sind V-Typ Mischer des Forschungszentrums Karlsruhe (FZK), Split und Recombinemischer, wie z.B. Kaskadenmischer oder Rautenmischer (EMB), in dem die Lösungsströme in kleinere Ströme aufgeteilt und diese kleinen Ströme wiederholt zusammengeführt und aufgeteilt werden, Caterpillarmischer der Instituts für Mikrotechnik Mainz (IMM), oder auch Mischer mit einer Querschnittsverengung, wie Fokusmischer oder Zyklonmischer (IMM), oder auch Jetmischer der Firma Synthesechemie und Prallstrahlmischer (IMM) oder Ventilmischer (EMB).
Für das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise ein Mikromischer eingesetzt, bei dem die Anschlüsse und Zuleitungen so gestaltet sind, das nur ein geringes Volumen bis zum Ein- bzw. Austritt der eigentlichen Mikrostruktur durchströmt werden muss (totvolumenarmer Mikro- mischer). Dieses Volumen liegt vorzugsweise unter 10 % des Volumens der zu mischenden Lösungen, besonders bevorzugt unter 1%, also z.B. bei einer Lösungsmenge von 500 μl unter 5 μl. Besonders geeignet ist ein aus PEEK (Polyetheretherketon) hergestellter Multilaminations- mikromischer. In den Beispielen würden die Kapülareingänge der Zuleitungen unmittelbar gegenüber den Öffnungen der MikroStruktur angebracht, so dass dadurch das Totvolumen weiter minimiert werden konnte.
In einer bevorzugten Ausführungsfόrm der Erfindung werden Mikromischer mit Kanalweiten von kleiner als 100 μm eingesetzt.
In einen derartigen Mikromischer werden die Biomolekül- und die Markermoleküllösungen mittels präzisen und pulsationsarmen Pumpen, wie z.B. Spritzenpumpen, zu dosiert. Vorzugsweise wird anschließend die so vermischte Reaktionslösung in eine Verweilstruktur mit vorgegebener Verweilzeit eingespeist.
Alternativ dazu können die Lösungen aber auch über zwei miteinander gekoppelte Spritzen in den Mikromischer dosiert werden.
Die Mischvorrichtung enthält dabei vorzugsweise zwei Öffnungen zum Aufsetzen von Dosierspritzen, die eigentliche mikrostrukturierte Mischstruktur, eine kurze kapillarartige Struktur, mit der eine gewisse Verweilzeit und ein Druckabfall zur leichteren Dosierung realisiert wird, einen Auslass für die gemischte Reaktionslösung und Aussparungen, damit die Mischvorrichtung sicher auf die gängigen Reaktionsgefäße, wie etwa z.B. die Reaktionsgefäße (z.B. 0,5-2 ml) der Firma Eppendorf oder die Schraubdeckelröhrchen (z.B. 2-50 ml) der Firma Greiner-Bio One aufgesetzt werden kann.
Zum Dosieren der Lösungen in die Mischvorrichtung können zwei handelsübliche Spritzen eingesetzt werden, siehe z.B. Fig. 2 oder 3. Die Spritzen werden mit den Lösungen befüllt. Das Volumen der Spritzen orientiert sich vorzugsweise am gewünschten Dosierverhältnis der beiden Lösungen. Nach dem Befüllen werden die Spritzen auf die entsprechenden Öffnungen der Mischvorrichtung aufgesetzt. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die beiden Kolben und Stempel der Spritze mit kleinen Hilfsvorrichtungen miteinander verbunden, so dass sich beim Herunterdrücken der verbundenen Stempel beide Stempel mit der gleichen Geschwindigkeit nach unten bewegen. Dadurch wird sichergestellt, dass ein dem Verhältnis der Durchmesser der Spritzenzylinder entsprechendes Volumenverhältnis der beiden Reaktionslösungen in die Mischvorrichtung dosiert wird, siehe Fig. 4.
Bei der Mischvorrichtung kann es sich um eine Vorrichtung zum mehrfachen Gebrauch handeln. Es ist aber auch möglich mittels eines kostengünstigen Herstellungsverfahrens, wie zum Beispiel durch Spritzguss, eine große Zahl kostengünstiger Mischvorrichtungen herzustellen, die zum einmaligen Gebrauch gedacht sind. Alternativ zu den bereits beschriebenen Verfahren ist eine Zudosierung in den Mikromischer auch über Zentrifugalkraft möglich, wie beispielhaft in Fig. 5 verdeutlicht.
Hierfür enthält die Mischvorrichtung vorzugsweise zwei Reservoirs an der Oberseite (10/11), die eigentliche mikrostrukturierte Mischstruktur (3), eine kurze kapillarartige Struktur, mit der eine gewisse Verweilzeit und ein Druckabfall zur leichteren Dosierung realisiert wird, einen Auslass für die gemischte Reaktionslösung und Aussparungen, damit die Mischvorrichtung sicher auf die gängigen Reaktionsgefäße aufgesetzt werden kann.
Zum Dosieren der Lösungen in die Mischvorrichtung werden die beiden Lösungen in die Reservoirs (10/11) eingefüllt. Dabei entspricht das Größenverhältnis der Reservoirs dem üblicherweise in die Reaktion eingesetzten Volumenverhältnis der Lösungen. Über kleine, genau definierte Öffnungen sind die Reservoirs mit der Mischstruktur (3) verbunden. Die Dimension der Öffnung und der Zuleitungen ist vorzugsweise so gewählt, dass erst bei der Einwirkung einer Kraft auf die Lösungen im Reservoir die beiden Lösungen im gewünschten Verhältnis in die Mischstruktur dosiert werden.
Die Kraft kann durch das Zentrifugieren der gefüllten, auf ein Auffanggefäß, beispielsweise ein 2 ml Reaktionsgefäß, aufgesetzten Mischvorrichtung in einer Laborzentrifuge erzeugt werden. Dabei ist die Ausführungsform bevorzugt, in der die beiden Öffnungen der Reservoirs zu der Mischstruktur hin genau rechtwinklig zur Rotationsachse der Zentrifuge ausgerichtet sind, damit auf beide Lösungen die gleiche Kraft wirkt. Um eine leichtere Ausrichtung zu ermöglichen ist die Mischvorrichtung mit entsprechenden Markierungen versehen.
Ebenso kann die Kraft durch Anlegen eines Druckes an der Oberseite der Reservoirs oder durch Anlegen eines Unterdruckes am Auslass der Mischvorrichtung erzeugt werden.
Bei der Mischvorrichtung kann es sich ebenfalls um eine Vorrichtung zum mehrfachen Gebrauch handeln. Es ist aber auch möglich mittels eines kostengünstigen Herstellungsverfahrens, wie zum Beispiel durch Spritzguss, eine große Zahl kostengünstiger Mischvorrichtungen herzustellen, die zum einmaligen Gebrauch gedacht sind.
Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens zur Markierung von Reaktivgruppen tragenden Biomolekülen, vorzugsweise Proteinen, enthält daher vorzugsweise 2 Reservoirs für Flüssigkeiten, die ggf. über eine Zudosiereinheit, vorzugsweise 2 Spritzen, verfügen, einen Mikromischer, ggf. eine Verweilstruktur und ggf. ein beliebiges Auffanggerät für das Produkt. Bei Verweilzeitstrukturen im Sinne der Erfindung handelt es sich um abgegrenzte Volumina, die aufgrund ihres inneren Volumens in einer vorgegebenen Zeit durchströmt werden können, wie z.B. Kapillaren oder auch Mikromischer. Es können unterschiedliche Verweilstrukturen eingesetzt werden, die sich jeweils durch eine möglichst enge Verweilzeitverteilung auszeichnen und geringe Totvolumina aufweisen. Im einfachsten Fall besteht die Verweilstruktur aus einer Kapillare vorgegebener Länge, aber auch andere gleichmäßig durchströmte Volumina oder Anordnungen können eingesetzt werden. Ebenfalls können Verweilstrukturen eingesetzt werden, bei denen das Gemisch im Kreislauf umgepumpt wird, wobei ggf. ein Mikromischer in den Kreislauf eingefügt ist. Letzteres vor allem wenn zwei Phasen und Phasentrennung vorliegen.
Nach dem Durchlaufen der Verweilstruktur wird die Reaktionslösung aufgefangen. Dabei kann die Reaktion durch Zudosieren eines weiteren Reagenzes mittels eines weiteren Mikromischers, durch thermische Behandlung mit einem Mikrowärmetauscher oder durch Eintropfen der Reaktionsmischung in ein Auffanggefäß mit einem entsprechenden Abbruchreagenz gestoppt werden.
Als Markerverbindung wird vorzugsweise ein Farbstoffmolekül eingesetzt, das eine reaktive Gruppe trägt, d.h. freien Amino-, Thiol-, Alkohol-, Aldehyd/Keton- und/oder Carbonsäuregruppen. Diese Reaktivgruppen-tragenden Markerverbindungen reagieren unter Bildung kovalenter Bindungen, wie sie z.B. in M. Brinkley in Bioconjugate Chemistry 1992, 3, 2-13 und von R.P. Haugland in Methods in Molecular Biology 1995, 45, 205-221 beschrieben sind.
Die Markierung von Alkoholen in Biomolekülen, wie z.B. Proteinen, wie Serin, Threonin und Tyrosin) geschieht vorzugsweise über Sulfonsäurechloride, wie z.B. Dansyl-chlorid (5-Dimethyl- amino-naphthalin-1-sulfonylchlorid) oder der Oxidation mit Natriumperiodat zum Aldehyd und der anschließenden Markierung mit Hydrazinderivaten der Farbstoffe, wie zJB. Hydrazide, Semicarbazide, Carbohydrazide, wie z.B. Fluorescein-5-thiosemicarbazid.
Die Markierung von Aldehyden/Ketonen erfolgt vorzugsweise mit Aminen (Schiff-Basen) oder mit Hydrazindervidaten zum Hydrazid, während die Markierung von Carbonsäuren vorzugsweise mit Hydrazindervidaten zum Hydrazid erfolgt.
Besonders bevorzugt dabei ist, dass das Markermolekül eine reaktive Gruppe trägt, die mit den freien Amino-, Thiol,- Alkohol und/oder Aldehyd/Keton-tragenden Biomolekülen unter Bildung kovalenter Bindungen reagiert und das Markermolekül zudem eine chemische Reaktion katalysiert, die zu einer leicht detektierbaren Farbänderung oder Änderung des Redoxpotentials seines Substrates führt, wie z.B. Peroxidasen und alkalische Phosphatasen. Bersonders bevorzugt als Reaktivgruppen sind Amino- und/oder Thiolgruppen.
Die Markierungsreaktion kann nach Verlassen der Verweilstruktur dabei durch Zugabe einer Verbindung abgebrochen werden, die mit den noch nicht umgesetzten Markermolekülen schnell reagiert., Dies sind handelsübliche Amino- und/oder Thiolgruppen-haltige Verbindungen, wie z.B. Hydroxylamin, Glutathion oder Mercaptoethanol.
Ebenfalls kann die Reaktion nach Verlassen der Verweilstruktur durch chromatographisches Abtrennen der noch nicht umgesetzten Markermoleküle abgebrochen werden. Hierfür eignen sich alle handelsüblichen Chromatographieverfahren, wie z.B. die Gelpermeationschromatographie mit beispielsweise Sephadex® G oder Biogel® P oder die Ionentauscherchromatographie, Affinitäts- Chromatographie, Reversed Phase Chromatographie (HPLC) und die Festphasenextrakion.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann die Reaktion nach Verlassen der Verweilstruktur durch eine thermische Behandlung der Reaktionslösung abgebrochen werden. Dies geschieht vorzugsweise durch Kühlen der Reaktionslösung vorzugsweise mittels eines mikrostrukturierten Wärmetauschers oder durch das Erhitzen der Reaktionslösung vorzugsweise mittels eines mikrostrukturierten Wärmetauschers.
Das erfindungsgemäße Verfahren führt zu höheren Ausbeuten und zu einer verbesserten Probenqualität, da eine schnelle und gründliche Vermischung der beiden Reaktionspartner im Mikromischer stattfindet und die Verweilzeit in der Verweilstruktur sehr genau eingestellt werden kann.
Die Erfindung wird durch die beiliegenden Abbildungen und die . folgenden Beispiele näher erläutert, ohne dass diese darauf beschränkt ist.
Es zeigen:
Fig. 1 die Explosionszeichnung eines totvolumenarmen Mikromischers,
Fig. 2 den schematischen Versuchsaufbau mit dem Mikromischer,
Fig. 3 die vollständige Versuchsapparatur,
Fig. 4 den schematischen Versuchsaufbau mit einem Mikromischer, der das gleichzeitige Dosieren über 2 Spritzen ermöglicht und
Fig. 5 den schematischen Versuchsaufbau mit einer Zudosierung aus 2 Reservoirs über Zentrifugalkraft oder Druck. Beispiele
Beispiel 1
Es sollten Anti-human IgG Antikörper (aus der Ziege) mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markiert werden. Die Antikörper (Lieferant: Sigma, Saint Louis) wurden in 0,1 M Natriumhydrogencarbonatpuffer (pH 8,5) gelöst (10 mg/ml). 10 mg FITC (Lieferant: Molecular Probes, Eugene) wurden in 1 ml DMSO gelöst. Zudem wurde zum Abstoppen der Reaktion eine 1,5 m Hydroxylaminlösung (pH 8,4) hergestellt.
Es wurde die herkömmliche Markierungsmethode, wie sie in der mitgelieferten Beschreibung des Fluoreszenzmarkers angegeben ist, mit der erfindungsgemäßen Markierung im Mikromischer verglichen.
AI und A2 — Herkömmliches Markierungsverfahren
Es wurden 2 Ansätze von je 75 μl Antikörperlösung in zwei 1,5 ml Reaktionsgefäße gegeben. Zu einem Ansatz (AI) wurden 37,5 μl der Farbstofflösung, zum anderen (A2) 10 μl gegeben. Es wurde 1 h bei Raumtemperatur kräftig geschüttelt. Anschließend wurden jeweils 100 μl der Hydroxylaminlösung zugegeben und erneut bei Raumtemperatur 20 min geschüttelt. Danach wurde der freie Farbstoff mittels Gelpermeationschromatographie (PD-10 Säulen, Lieferant: Amersham, Laufmittel: Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS)) abgetrennt.
Die so gereinigten Antikörperlösungen wurden UV/Vis-spektroskopisch untersucht.
B - Erfindungsgemäßes Markierungsverfahren
Die beiden in Abb. 2 gezeigten Spritzen (1, 2) wurden über Kapillaren mit einem Mikromischer (3) verbunden. Zusätzlich wurde eine in Abb. 3 gezeigte Spülleitung an der Kapillare einer der Spritzen angebracht, die zunächst mit einer Klemme verschlossen wurde. Diese Spülleitung wurde an eine HPLC-Pumpe angeschlossen, die mit Wasser (bidestilliert) versorgt wurde. Der Mikromischer (3) war wiederum mit einer Kapillare (4) mit einer Länge von 28 cm verbunden. Am Ende der Kapillare wurde ein Auffanggefäß (5) bereitgestellt, in dem die Reaktionslösung gesammelt wurde.
Das erfindungsgemäße Markierungsverfahren wurde nun in folgender Weise durchgeführt:
Die Antikörperlösung und die Farbstofflösung wurden jeweils in einer 1 ml Spritze aufgezogen und in jeweils eine der Spritzepumpen (6) und (7) eingespannt. Ansatz Bl:
Es wurden 75 μl Proteinlösung (Flussrate: 150 μl/min) und 37,5 μl (Flussrate: 75 μl/min) Farbstofflösung innerhalb von 30 Sekunden in den Mischer dosiert. Anschließend wurde die Klammer der Spülleitung geöffnet und mittels einer HPLC-Pumpe mit einem Fluss von 0,2 μl/min die noch in der Kapillare befindliche Lösung herausgedrückt. Das Auffanggefäß (5) wurde verschlossen und eine Stunde lang bei Raumtemperatur geschüttelt.
Ansatz B2:
Es wurden 75 μl Proteinlösung (Flussrate: 150 μl/min) und 10 μl (Flussrate: 20 μl/min) Farbstofflösύng innerhalb von 30 Sekunden in den Mischer dosiert. Der Ansatz wurde wie in Bl beschrieben weiter behandelt.
Die beiden Ansätze der B-Reihe wurden nach einstündigem Schütteln mit jeweils 100 μl einer Hydroxylaminlösung versetzt und erneut bei Raumtemperatur 20 min geschüttelt. Anschließend wird der freie Farbstoff mittels Gelperm eationschromatographie (PD-10 Säulen, Lieferant:. Amersham, Laufmittel PBS) abgetrennt.
Die so gereinigten Antikörperlösungen wurden UV/Vis-spektroskopisch untersucht.
Bei allen vier Ansätzen wurden aus den eingesetzten 0,75 mg Antikörpern nach der Aufreinigung der Reaktionen zwischen 0,6 und 0,7 mg markierte Antikörper erhalten. Die Markierungsgrade (Moleküle Farbstoff pro Molekülprotein) sind für AI: 8,62, für A2: 6,32, für Bl: 4,91 und für B2: 2,30.
Die markierten Antikörper wurden auf ihre Eignung zur Anfärbung von Granulozyten getestet.
Dabei zeigte sich, dass die Proben der A-Reihe einen sehr hohen Hintergrund aufwiesen. Die Proben der B-Reihe zeigten einen geringen Hintergrund. Der Zellkern und die Mitosespindeln waren, wie erwartet, sehr gut sichtbar.
Durch den Einsatz des Mikromischers konnte also eine deutlich verbesserte Probenqualität erhalten werden. Dies ist auf eine gleichmäßigere Markierung der Antikörper zurückzuführen.
Beispiel 2
In der in diesem Beispiel gezeigten Reaktion wird ein Protein mit einem Fluoreszenzmarker versehen. Dabei wurde der NHS-Ester des Fluoreszenzmarkers eingesetzt, um unspezifisch mit den ε-Aminogruppen der im Protein vorhandenen Aminosäure Lysin zu reagieren. 0,27 μM Protein wurden in 1.800 μl NaHC03-Puffer (0,1 M, pH 8) gelöst. Zur besseren Lösung wurden 100 μl DMSO zugegeben. 1,08 μM Farbstoff-NHS-Ester wurden in 140 μl DMSO gelöst. In den Mikromischer wurden über 1/16"-Kapillaren die Protein- und die Farbstofflösungen mittels Spritzenpumpen zudosiert. Der Gesamtfluss betrug 400 μl/min.
Am Ausgang des Mischers befand sich eine Kapillare, die so lang war, dass die Verweilzeit der Reaktionslösungen im System 5 Minuten betrug. Anschließend tropfte die Lösung in ein Auffanggefäß (5), das mit der Stopplösung (Hydroxylaminlösung) gefüllt war. Nachdem die entsprechenden Mengen Protein bzw. Farbstofflösung zudosiert waren, musste das zuletzt zudosierte Volumen noch 5 min durch die Verweilkapillare gedrückt werden. Dies geschah mit Hilfe einer HPLC-Pumpe, die mit einem Fluss von 400 μl/min Wasser durch die Kapillare pumpte.
Nach dem Reaktionsende wurde der in der Stopp-Lösung aufgefangene Markierungsansatz noch 15 Minuten gerührt und anschließend in einer Tischzentrifuge (Modell 5804 R von der Firma Eppendorf) bei Raumtemperatur und 13.200 rpm zentrifugiert, um unlösliche Bestandteile abzutrennen. Bei dieser Reaktion waren jedoch kaum unlösliche Bestandteile zu beobachten.
Der Ansatz wurde mit einer Pipette auf PD-10 Säulen (Lieferant: Amersham) aufgetragen. Das Eluat wurde in Gefriertrocknungsgläschen aufgefangen, eingefroren und anschließend lyophilisert.
In Bezug auf die eingesetzte Menge Protein wurde eine Ausbeute von 86,6% mit einem Markierungsgrad von 2,9 erzielt. Mit der von den Herstellern empfohlenen Standardmethode wurden lediglich 45 % Ausbeute mit einem Markierungsgrad von 2,7 erzielt.
Zudem zeigte die im Mikromischer hergestellte Probe gegenüber der herkömmlich hergestellten Probe eine leicht verbesserte Aktivität im anschließenden Aktivitätstest.
Bezugszeichenliste:
1 Spritze 1
2 Spritze 2
3 Mikromischer
4 Kapillarleitung
5 Auffanggefäß
6 Spritzenpumpe 1
7 Spritzenpumpe 2
8 Verbindungen beider Kolben
9 Verbindungen beider Stempel
10 Reservoir 1
11 Reservoir 2

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Markierung von freie Reaktivgruppen-tragenden Biomolekülen durch eine damit unter Ausbildung einer kovalenten Bindung reagierende Markerverbindung, dadurch gekennzeichnet, dass Lösungen beider Verbindungen in definierten Mengenströmen einem Mikromischer, vorzugsweise einem statischen Mikromischer, zugeführt und dort intensiv vermischt werden, anschließend gegebenenfalls die Reaktionsmischung in eine Verweilstruktur eingespeist wird, dort eine durch das Volumen der Verweilstruktur und die Fließgeschwindigkeit der Reaktionsmischung vorbestimmte Zeit verbleibt und die Reaktion nach einer durch die Reaktionsbedingungen vorgegeben Zeit abgebrochen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die freie Reaktivgruppen Amino-, Thiol,- Alkohol , Aldehyd/Keton- und/oder Carbonsäuregruppen sind.
3. Verfahren nach Ansprüche 1 und/oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Biomoleküle Proteine, Nukleinsäuren und/oder Saccharide sind.
4. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Mikromischer mit Kanalweiten von kleiner als 100 μm eingesetzt wird.
5. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüchen "1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem eingesetzten Mikromischer um einen Multilarninationsmischer oder um einen Split- und Recombinemischer handelt.
6. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5 > dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der eingesetzten Verweilstruktur um eine Kapillare vorgegeben Volumens oder ein anderes gleichmäßig durchströmtes Volumen oder eine gleichmäßig durchströmte Anordnungen handelt.
7. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass bei der eingesetzten Verweilstruktur die Reaktionsmischung im Kreislauf umgepumpt wird, wobei ggf. ein Mikromischer in den Kreislauf eingefügt ist.
8. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 7.
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