EP1689785A2 - Utilisation de cations metalliques pour cristalliser le fragment fc d'un anticorps anti rhésus d - Google Patents

Utilisation de cations metalliques pour cristalliser le fragment fc d'un anticorps anti rhésus d

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EP1689785A2
EP1689785A2 EP04805251A EP04805251A EP1689785A2 EP 1689785 A2 EP1689785 A2 EP 1689785A2 EP 04805251 A EP04805251 A EP 04805251A EP 04805251 A EP04805251 A EP 04805251A EP 1689785 A2 EP1689785 A2 EP 1689785A2
Authority
EP
European Patent Office
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anticoφs
zinc
residues
cation
divalent
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP04805251A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Dominique Bourel
Arnaud Glacet
Sylvie Jorieux
Enrico Stura
Frédéric Ducancel
Jean-Luc Teillaud
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB Biotechnologies SAS
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
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Publication of EP1689785A2 publication Critical patent/EP1689785A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
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    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
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    • C07K16/34—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against blood group antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Definitions

  • the present invention relates to the use of metal cations, in particular divalent or trivalent, and more particularly of Zinc, Copper, Cadmium or Iron, to improve the functional activity of antibodies. More particularly, the subject of the invention is pharmaceutical compositions of antibodies comprising divalent or trivalent metal cations.
  • Passive immunotherapy which is very widespread, is based on the administration of antibodies, for example monoclonal antibodies directed against a given cell or substance. Passive immunotherapy using monoclonal antibodies has given encouraging results. However, if the use of monoclonal antibodies has several advantages, such as an assurance of product safety as regards the absence of infectious contamination, it can however prove difficult to obtain an effective monoclonal antibodies.
  • one of the objects of the invention is to provide new products or methods making it possible to overcome the drawbacks encountered during the industrial development of antico ⁇ s, namely their low efficiency and their high cost.
  • the Fc region of IgG consists of 2 globular domains named CH2 and CH3.
  • the 2 heavy chains interact closely at the level of the CH3 domains while at the level of the CH2 domains, the presence, on each of the 2 chains, of an oligosaccharide linked to Asn 297 (Kabat numbering) contributes to the separation of the 2 CH2 domains.
  • the CH2 and CH3 domains of the same chain are separated by a flexible region defining an interface between the 2 domains.
  • the interface between the CH2-CH3 domains has been described as a common site for the attachment of numerous (glyco) proteins such as FcRn, rheumatoid factors (Co ⁇ er et al., 1997) and certain bacterial and viral proteins, for example the protein A of Staphylococcus aureus (Deisenhofer, 1981), protein G of Streptococcus group G (Sauer-Eriksson et al., 1995), the gE-gl complex of the He ⁇ es simplex 1 virus (Chapman et al., 1999)) and the “core” protein of the hepatitis C virus (Maillard and ⁇ /., 2004).
  • Glyco proteins such as FcRn, rheumatoid factors (Co ⁇ er et al., 1997) and certain bacterial and viral proteins, for example the protein A of Staphylococcus aureus (Deisenhofer, 1981), protein G of Streptococcus group G (S
  • this zinc atom plays an important role in the general conformation of Fc, and thereby allows the improvement of the binding of Fc to its Fc ⁇ Rs receptors.
  • the invention provides an economical and universal solution to solve the problems linked to the low efficiency of the monoclonal antico ⁇ s available or under development by the use of metal cations which improve the functional activity of antico ⁇ s.
  • the invention also provides antico ⁇ s of class IgGl having a reduced capacity for activating the receptor Fc ⁇ RI ⁇ , as well as antico ⁇ s of class IgG3 artificially having a binding site for a cation metallic.
  • a first object of the invention is the use of divalent or trivalent metal cations to improve the functional activity of antico ⁇ s.
  • the metal cation used is zinc.
  • this zinc atom plays an important role in the general conformation of the Fc region, and thereby allows the improvement of the binding of the Fc region to its receptors.
  • these cations are used to interact with the Fc region of the antico ⁇ s in order to participate in the stabilization of this region.
  • these metal cations are used in order to participate in controlling the opening of the Fc region of the antico ⁇ s and thus of promoting the maintenance of the so-called “open” conformation of the antico ⁇ s, that is to say the maintenance of a certain separation between the CH2 domains favoring the attachment of the Fc region to its receptors.
  • the presence of the metal cations makes it possible to induce an opening of the Fc region, even if the metal cation does not remain in its site.
  • these metal cations promote the attachment of the antico ⁇ s to the FcyR receptors, in particular to the FcvRIII receptor.
  • the metal cation can, in another aspect of the invention, promote the bringing together of several Fc regions of antico ⁇ s, via a second binding site involving the histidine residues 268 and 285 (Kabat numbering), facilitating the activation of Fc ⁇ Rs, more particularly Fc ⁇ RI ⁇ and the transduction of signaling via these receptors.
  • functional activity is meant, without limitation, the ADCC activity (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), CDC activity (Complement Dépendent Cytotoxicity), phagocytosis activity, endocytosis activity or further induction of cytokine secretion.
  • ADCC activity Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • CDC activity Complement Dépendent Cytotoxicity
  • phagocytosis activity endocytosis activity or further induction of cytokine secretion.
  • receptors is meant not only the molecules of FcyR., Such as FcyRIII, present on the cells of the immune system such as monocytes, macrophages, B and T lymphocytes, NK cells and dendritic cells but also FcRn, complement molecules such as Cl q and those of bacterial walls such as protein A.
  • antico ⁇ s any polyclonal or monoclonal antico ⁇ s. If the antico ⁇ s is a monoclonal antico ⁇ s, it can be chimerical, humanized or human.
  • this antico ⁇ s is an IgG, for example an IgGl or an IgG3, in particular human.
  • antico ⁇ s also includes any glycoprotein comprising an Fc region, for example human, and one or more fragments, domains or derivatives of antico ⁇ s.
  • antico ⁇ s domain is understood to mean any of the domains VL, CL, VH, CH1, CH2, CH3, CH4; by "fragment of antico ⁇ s” any fragment which contains a complete binding site for an antigen, chosen from the fragments Fv, scFv, Fab, Fab ', F (ab') 2, and by "derivative of antico ⁇ s" all antico ⁇ s may include one or more mutations, substitutions, deletions and / or additions of one or more amino acid residues, as well as multi-specific and polyfunctional antico ants.
  • divalent or trivalent metal cation or by “metal cation” is meant any metal cation having an oxidation state +2 or +3 and more particularly zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel , manganese, gallium, gadolinium, selenium, gold, platinum or palladium or the like.
  • these metal cations are zinc, iron, copper or cadmium, and in a particularly advantageous manner it is zinc.
  • a second object of the invention relates to a method for potentiating the functional activity of the antico ⁇ s via the Fc region, comprising a step consisting in adding an appropriate amount of at least one metal cation in the biological system producing the antico ⁇ s or in a solution comprising antico ⁇ s before and / or after purification or in the preservation solution or in the final formulation in the form of an injectable solution of the antico ⁇ s.
  • these metal cations are zinc, iron, copper or cadmium.
  • biological system is understood to mean cell lines, non-human transgenic plants or animals.
  • cells it is possible to choose cells originating from cell lines, transfected using a vector comprising the gene coding for said antico ⁇ s, for example eukaryotic or prokaryotic cells, in particular mammalian, insect, plants, bacteria or yeast. More specifically, rat myeloma cells such as YB2 / 0 can be used.
  • CHO cells can also be used, in particular CHO-K, CHO-LeclO, CHO-Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- or other cell lines among Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS- 7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2 / 0-Ag 14 and P3X63Ag8.653, PERC6 or BHK.
  • a molar concentration of zinc at least equal to the molar concentration of antico ⁇ s is added.
  • a molar zinc concentration at least equal to 2 times is added, and preferably 3 times or 4 times the molar concentration of antico ⁇ s.
  • a molar concentration of metal cations is added which makes it possible to improve the functional activity of the antico ⁇ s by at least 25%, preferably 50% or 60%, 70%, 80%, 100%, and preferably 200 or 300 %.
  • the metal cations exist in different forms.
  • the zinc ions can be in the form of zinc acetate, zinc bromide, zinc hydrochloride, zinc chloride, zinc citrate, zinc gluconate, hydroxycarbonate zinc, zinc iodide, zinc L-lactate, zinc nitrate, zinc stearate, or zinc sulfate.
  • Another subject of the invention relates to antico ⁇ s of class IgG3, and more particularly the allotypes G3m (b) and G3m (g), having a binding site for a metal cation comprising the residues His 310 and His 435 on its Fc region created by molecular engineering.
  • antico ⁇ s of class IgG3 having an improved fixation of metal cations compared to unmodified antico ⁇ s , by creating a binding site involving a His 435 residue in substitution for the Arg 435 residue.
  • these IgG3 antico ⁇ s have a binding site for a metal cation, in particular zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, gallium, selenium, gold, platinum or palladium, comprising the residues His 310 and His 435, and advantageously also comprising the residue Asn 434 and / or His 433.
  • a metal cation in particular zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, gallium, selenium, gold, platinum or palladium
  • the residues His 310 and His 435 and advantageously also comprising the residue Asn 434 and / or His 433.
  • at least one of these histidine residues is replaced by at least one of the residues chosen among cysteine, aspartic acid and glutamic acid.
  • these residues also have the capacity to fix such metal cations.
  • the metal cation is zinc, iron, copper or cadmium, and preferably zinc.
  • the antico ⁇ s has a metal cation, - and more particularly a zinc atom, linked to one or more residues of the Fc region.
  • this IgG3 antico ⁇ s has a capacity for fixing to Fc ⁇ RI ⁇ and an improved functional activity compared to the native antico ⁇ s.
  • An object of the invention is thus the use of the antico ⁇ s IgG3 having a binding site for a metal cation previously described for the preparation of a medicament intended for the treatment of a pathology such as hemolytic disease of the newborn, viral, bacterial or parasitic pathology, pathology linked to pathogenic agents or derived toxins, listed as being particularly dangerous in cases of bioterrorism (classification of the Centers for Disease Control, CDC), in particular anthrax (Bacillus anthracis), botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pestis), smallpox (Variola major), latularemia (Francisella tularensis), viral hemorrhagic fevers (linked to filoviruses -Ebola, Marburg and arenaviruses -Lassa, Machupo), epsilon toxin Clostridium perfringens, brucellosis (Brucella species), melioidosis (Burkholderia
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition of therapeutic antico ⁇ s comprising divalent or trivalent cations and at least one excipient.
  • these metal cations are zinc, iron, copper or cadmium, or a mixture of several of them.
  • zinc is chosen, which can be in the form of zinc acetate, zinc bromide, zinc hydrochloride, zinc chloride, zinc citrate, zinc gluconate, hydroxycarbonate zinc, zinc iodide, zinc L-lactate, zinc nitrate, zinc stearate, or zinc sulfate.
  • the antico ⁇ s contained in the composition have a metal cation according to the invention linked to the residues His 310 and His 435, the residues His 433 and Asn 434 can also participate in the fixation.
  • the antico ⁇ s of the pharmaceutical composition are the antico ⁇ s of class IgG3 created by molecular engineering described above. In another preferred aspect of the invention, these are human IgGs or having a human Fc region.
  • the presence of such metal cations in the composition improves the fixation of the therapeutic antico ⁇ s that it contains to its receptors, in particular the Fc RULs, the composition thus having better therapeutic activity.
  • Another subject of the invention is a pharmaceutical composition in which at least 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, or even 99% of the antico ⁇ s have a divalent or trivalent metal cation, in particular a zinc ion, bound to a site located in the Fc region. It may preferably be the binding site comprising the amino acids His 310 and His 435, the amino acid Asn 434 and / or His 433 being capable of participating in the binding. In another aspect of the invention, it can be the binding site comprising the amino acids His 268 and His 285. In another aspect of the invention, the 2 sites can be occupied by a metal cation as described in the invention.
  • the metal cation is preferably one of those already mentioned above, in particular zinc, iron, copper or cadmium, or a mixture of several of them, possibly in the forms already mentioned.
  • Another object of the invention is a solution comprising a monoclonal antico ⁇ s or monoclonal antico ⁇ s and an appropriate quantity of divalent or trivalent metal cations, in particular of zinc ions at least equal to the molar concentration in antico ⁇ s, this solution being suitable for injection by intravenous, subcutaneous or intramuscular route.
  • the metal cations can be any divalent or trivalent metal cation, in particular zinc, iron, copper, cadmium, cobalt, nickel, manganese, gallium, selenium, gold, platinum or palladium or a similar.
  • the cation is a zinc ion or zinc acetate, zinc bromide, zinc hydrochloride, zinc chloride, zinc citrate, zinc gluconate, zinc hydroxycarbonate, zinc iodide, zinc L-lactate, zinc nitrate, zinc stearate, or zinc sulfate.
  • Another object of the invention is the use of zinc ions to improve the crystallization of therapeutic antico ⁇ s, and more particularly of monoclonal IgG, the zinc ions stabilizing the Fc region of the antico ⁇ s.
  • the addition of divalent cations, and more particularly of zinc, significantly increases the solubility of Fc of IgGs, by promoting crystalline contacts which facilitates the obtaining of the crystals necessary for structural studies.
  • the invention also aims to provide a test for evaluating the efficacy of an antico l'mentss comprising the study of the 3D conformation, in particular of the field involving the residues His 310, His 435, His 433 and / or Asn 434 of the Fc region as shown in FIG. 1 or 2 or also a determination of the zinc content of said antico ⁇ s, the presence of zinc being an indication of the effectiveness of the antico ⁇ s.
  • Another subject of the invention relates to an antico ⁇ s having at least one of its residues His 310 and His 435 modified.
  • the modification of the antico ⁇ s is a mutation, in particular a substitution by an amino acid having a low affinity for divalent or trivalent metal cations.
  • the His 310 residue and / or the His 435 residue can be substituted with a residue of lysine, alanine, glycine, valine, leucine, isoleucine, proline, methionine, tryptophan, phenylalanine, serine or threonine.
  • the His 310 and His 435 residues are both substituted by lysine residues.
  • mutants can be produced from any antico ⁇ s possessing in the “natural” state, that is to say non-mutated, a binding site for metal cations comprising the residues His 310 and His 435. It can be act in particular of IgGl, of IgG3 allotypes G3m (s) or G3m (st), IgG2 or IgG4.
  • the modification can be carried out with DEPC (diethyl pyrocarbonate), a histidine modifying agent.
  • DEPC diethyl pyrocarbonate
  • these antico ⁇ s are IgGl, or in any case antico ⁇ s having in the “natural” state, that is to say not mutated, a binding site for metal cations comprising the residues His 310 and His 435.
  • antico ⁇ s have a reduced functional activity compared to the same unmodified antico ⁇ s. However, they retain their ability to fix the antigen and the
  • the invention provides antico ⁇ s having a low ADCC activity, which is of particular interest in therapy to replace IgG4, or to prevent transplant rejection.
  • the double mutant antico ⁇ s according to the invention can also be used as anti-tetanus, anti-diphtheria or directed against pathogens or toxins derived therefrom, listed as being particularly dangerous in cases of bioterrorism (classification of the Centers for Disease Control, CDC) , including anthrax (Bacillus anthracis), botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pestis), smallpox (Variola major), tularemia (Francisella tularensis), viral haemorrhagic fevers (linked to filoviruses -Ebola, Marburg and arenaviruses -Lassa, Machupo), epsilon toxin from Clostridium perfringens, brucellosis (Brucella species ), melioidosis (Burk
  • Another object of the invention therefore relates to the use of modified antico ⁇ s as described above, and therefore having a weak functional activity, for the preparation of a medicament intended for the prevention of transplant rejection or for the treatment of 'a pathology chosen from tetanus, diphtheria, or caused by a pathogen or derived toxin, listed as being particularly dangerous in cases of bioterrorism " (classification by the Centers for Disease Control, CDC), in particular anthrax (Bacillus anthracis ), botulism (Clostridium botulium), plague (Yersinia pestis), smallpox (Variola major), tularemia (Francisella tularensis), viral haemorrhagic fevers (linked to filoviruses -Ebola, Marburg and arenaviruses -Lassa, Machupo) , epsilon toxin from Clostridium perfringens, brucellosis (Brucella species), melioidosis
  • antico ⁇ s having an impaired functional activity as previously described are also used for the preparation of a medicament to replace IgG4.
  • the antico ⁇ s described in the invention in particular the antico ⁇ s having an improved functional activity due to metal cations, or the modified antico donts whose functional activity is impaired, or the compositions or solutions of the invention, can be chosen from anti Ep-CAM, anti-KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25 , anti-CD30, anti-CD33, anti-CD38, anti-CD44, anti CD52, anti CA125 and anti ProteinC, anti-HLA-DR, anti-virals: HBV, HCV, HIV and RS V, and more particularly among the antico ⁇ s of Table I below: Table I: Name and brand Target company commercial indication of the antibody Edrecolomab Centocor anti Ep-CAM colorectal cancer PANOREX Rituximab Idea anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN Licensed to thrombocytopenia pu
  • IDEC-114 IDEC inhibition of non-Hodgkin's lymphoma ProteinC For example, the invention relates to a solution in the form of a concentrate at a concentration of antico ⁇ s ranging from 0.1 to 50 mg / ml, or 1 to 25 mg / ml which can be formulated for administration IV.
  • the solute may contain as an example: 9.0 mg / mL sodium chloride, 7.35 mg / mL sodium citrate dihydrate, and 0.7 mg / mL polysorbate-80 in sterile water.
  • 0.1 to 50 mg / ml, or 1 to 20 mg / ml of a cation are added to this solute or concentrate, the concentration of said cation being 1, 2, 3, 4 or 5 times the antico ants concentration either from 0.1 to 250 mg / mL or from 1100 mg / mL.
  • This concentrate can be injected into a pocket of serum or infusion liquid so as to obtain the dose which it is desired to administer, while maintaining the same cation content relative to the antico ⁇ s content.
  • the invention also relates to a lyophilized powder, sterile in a container and which can be reconstituted with sterile water just before injection comprising the appropriate amount of antico ⁇ s and the amount of said cation according to the invention 1 ", 2, 3 , 4 or 5 times higher than that of the antico ⁇ s.
  • This powder can be reconstituted for IV or subcutaneous injection.
  • the powder can comprise from 10 to 500 mg of antico ⁇ s and a quantity of said cation according to the invention 1, 2, 3, 4 or 5 times greater than that of antico ⁇ s, ie for example from 10 to 500 mg.
  • excipients such as sucrose, an amino acid, polysorbate:
  • the invention preferably relates to the compositions described above in which the cation content is at least equal to the content of antico ⁇ s, but also relates to any composition in which an amount of cation is added (zinc, iron, copper , cadmium, or the like, or a mixture thereof) less than said equimolar amount, for example 0.1 to 0.99 molar (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0 , 6, 0.7, 0.8 or 0.9 molar), but still sufficient to improve by at least 10% or 25%, or 50% or even 100% the effectiveness and / or the functional properties of the antico ⁇ s.
  • an amount of cation is added (zinc, iron, copper , cadmium, or the like, or a mixture thereof) less than said equimolar amount, for example 0.1 to 0.99 molar (0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0 , 6, 0.7, 0.8 or 0.9 molar), but still sufficient to improve by at least 10% or
  • Figure 1 Diagram showing the position of Zn2 + ions in the vicinity of the Fc fragment of the monoclonal antico ⁇ s EMAB5 (2 ⁇ ).
  • Figure 2 Detail of the electronic density map in the vicinity of histidine residues 310 and 435.
  • Figure 3 Supe ⁇ osition of the structures of the Fc fragment of the antico ⁇ s EMAB5 obtained in the absence (gray) and in the presence (white) of Zn2 + ion.
  • Figure 4 Attachment of the antico ⁇ s EMAB5 modified by DEPC to the Fc ⁇ RIH receptor. This figure shows, on the abscissa, the fixation of the antico ⁇ s on the red cells and on the ordinate the fixation of the CD 16 (Fc ⁇ RJH) present on the surface of the Jurkat CD 16 cells.
  • f antico ⁇ s witness AD1;
  • M EMAB5 control;
  • A EMAB5 FNR;
  • Figure 5 Activation by antico ⁇ s EMAB5 modified by DEPC of the Fc ⁇ PJII receptor present on Jurkat CD 16 cells.
  • This figure represents the quantity, expressed in pg / ml, of IL-2 secreted by Jurkat CD16 cells whose CD16 receptor was activated by the antico EMs EMAB5 control () and the fractions separated on protein A after modification of the antico ⁇ s EMAB5 by DEPC: FNR (•), FR (M).
  • Figure 6 Effect of the DEPC modification on the ADCC activity of the EMAB5 monoclonal antibody.
  • This figure represents the percentage of lysis of Rh red blood cells (D +) induced by the control monoclonal antico ⁇ s EMAB5 and by the 2 fractions FR and FNR, separated on Sepharose-protein A gel, of the antico ⁇ s modified by DEPC.
  • Figure 7 Measurement of the Fc binding of the doubly mutated His310-435Lys antico ⁇ s to the Fc ⁇ R ⁇ I receptor.
  • Anticoips 1C7, 2H11, 4G5 and 4H10 are the mutated antico ⁇ s.
  • Antico ⁇ s 16D11, 11G5 and 6H11 are not mutated.
  • This figure shows on the abscissa, the fixation of the antico ⁇ s on the red cells and on the ordinate the fixation of the CD 16 (Fc ⁇ RIII) present on the surface of the Jurkat CD 16 cells.
  • the figure groups together the results obtained with the supernatants containing the doubly mutated antico ⁇ s (curves in solid lines) and those containing non-mutated antico ⁇ s (dotted curves).
  • Figure 10 Study by flow cytometry of the binding of antico ⁇ s carrying the double mutation His310-435Lys to the CD 16 receptor
  • EMAB5 It is a human IgGl ( ⁇ ), directed against the Rh (D) antigen, produced in the cell line YB2 / 0 (rat myeloma, line ATCC No. CRL 1662) suitable for culture in medium without serum.
  • EMAB5 was purified by affinity chromatography on Sepharose- protein A.
  • ADCC activity of EMAB5 is at least equal to that of the reference anti-Rh (D) polyclonal antibody, WinRho (Cangene).
  • the purified antico ⁇ s EMAB5 is dialyzed overnight against 50 mM Tris buffer, pH 8.0.
  • the antico d'ants solution adjusted to 50 mM CaCl 2 and 10 mM cysteine, is incubated for 30 min. at 37 ° C before adding the trypsin solution (1 mg / ml) in an enzyme / substrate ratio of 1/25. After 5 a.m. incubation at 37 ° C, the reaction is stopped by the addition of diisopropyl fluorophosphate (1 mM final).
  • the hydrolyzate is dialyzed overnight against 50 mM Imidazole buffer, pH 7.8.
  • the dialysis hydrolyzate is brought into contact with Affarose-protein L at the rate of 1 ml of gel for 3.6 mg of antico ⁇ s. After 4 h. incubation at room temperature with shaking, the gel is mounted in a column and washed with 50 mM Imidazole buffer, pH 7.8. The effluent and the washing buffer which contain the Fc fragments are combined, concentrated by centrifugation on Vivaspin 20 using the conditions described by the manufacturer.
  • Crystallogenesis After development, the crystallization conditions adopted are as follows: the solution of Fc fragments, at 2 mg / ml in 50 mM imidazole buffer, pH 7.8, is brought to 10% of 5,000, 100 mM monomethyl polyethylene glycol sodium cacodylate, 0.1 mM zinc chloride, pH 5.1 by vapor diffusion in seated drops at 17 ° C. Collection of diffraction data and determination of the structure: The crystal obtained is subjected to X-rays at the ESRF in Grenoble and the information collected is processed by the DENZO and SCALEPACK programs (Otwinowski and Minor, 1997). The structure is solved and refined to 2.3 ⁇ (Fig.l) using the rest of the CCP4 programs.
  • the three-dimensional structure (shown diagrammatically in FIG. 1) makes it possible to highlight the presence of zinc ions (in white) near the CH2 and CH3 domains (in gray).
  • the electronic density map presented in FIG. 2 shows the zinc ion linked to the histidine residues 310 (CH2) and 435 (CH3). Another zinc ion is linked to histidine 268 from an Fc and to histidine 285 from a symmetrical Fc. The third is near histidine 433.
  • the crystals obtained all belong to the space group
  • P2 (l) 2 (l) 2 (l) with two chains per asymmetric unit and the opening of the Fc is characterized by the distances between the proline residues 329 of chains A and B and between the mannose residues 4 of chains A and B.
  • the Fc fragments of Pantico ⁇ s EMAB5 are characterized by a distance between pralines 329 of 32.53 ⁇ and a distance between mannoses 4 of 17.61 ⁇ . When a metal ion is added to the crystallization solution (see Table II), these characteristic distances increase.
  • Table II Main characteristics of the crystals of the Fc fragment of the monoclonal antico ⁇ s EMAB5 in the space group P2 (l) 2 (l) 2 (l).
  • FIG. 3 shows the supe ⁇ osition of the main chains of the structures obtained in the absence (in gray) and in the presence of zinc (white) in the crystallization solution.
  • the addition of a metal salt to the Fc solution therefore promotes a so-called open conformation, a conformation close to that of Fc linked to the Fc ⁇ RHI receptor.
  • Diethylpyrocarbonate is a reagent that has been widely used to modify and study the role of histidine residues in proteins (Miles, 1977). Firan et al. (2001) showed that human IgGl treated with DEPC lost their ability to bind the FcRn receptor which is involved in the transfer of maternal IgG to the fetus. DEPC acts by substitution of a nitrogen group present on the imidazole cycle of histidine, thus transforming the histidine residue into 3-carboethoxy histidine.
  • the monoclonal antico ⁇ s EMAB5 dialysis against 0.1 M sodium acetate buffer, pH 6.0, is brought into contact with DEPC at a rate of 70 ⁇ g of DEPC / mg of IgG. After 30 minutes of incubation at room temperature, the reaction is stopped by the addition of imidazole (0.2 mg / ml final).
  • the modified monoclonal antibody is fractionated by affinity chromatography on Sepharose-protein A.
  • a fraction of the modified monoclonal antibody is not retained on the affinity gel and constitutes the non-retained fraction or FNR.
  • the fraction retained on the gel and called FR is eluted with 0.1 M Glycine-HCl buffer, pH 2.8.
  • the two fractions thus obtained are dialyzed against 20 mM sodium phosphate buffer, 50 mM NaCl, pH 7.2, concentrated on Vivaspin according to the manufacturer's recommendations and stored at 4 ° C for 15 days maximum.
  • the control antico ⁇ s which serves as a reference, underwent the same treatment except for DEPC which was replaced by an identical volume of ethanol.
  • the antico ⁇ s are subjected to a test, called CFC, which estimates the capacity of the antico ⁇ s to fix, firstly, the antigen against which they are directed then, in a second, the Fc ⁇ RlJJ (CD 16) receptor expressed on the surface of the Jurkat CD 16 cell line.
  • CFC a test
  • the wells of a microtiter plate are covered with papain Rb (D +) red cells.
  • Anti-Rit (D) antico ⁇ s, diluted to concentrations varying from 7.8 to 500 ng / ml in UVIDM + 2.5% fetal calf serum (SVF) are deposited in parallel on two microtiter plates previously "coated” with red cells. After 90 min. incubation at 37 ° C, the wells are washed.
  • One of the plates, used to detect IgG fixed on red cells, is incubated in the presence of an anti-human mouse Fc ⁇ antibody labeled with alkaline phosphatase (Jackson ImmunoResearch Laboratories).
  • the Jurkat CD16 cells In the other plate, the Jurkat CD16 cells, diluted to the concentration of 2 ⁇ 10 6 cells / ml in DVLDM + 1% FCS, are added. After 15 min. of contact at 37 ° C., the plate is centrifuged by gradually increasing the speed and the duration of centrifugation until the negative controls are negativized.
  • the expression “negative control” means antico ⁇ s which bind to the red cells immobilized in the wells of the microtitration plate but which do not fix the Fc ⁇ RIII receptor present on the surface of the Jurkat CD 16 cells. In the wells containing the negative control, the Jurkat cells CD 16, after centrifugation, form a cluster in the center of the well whereas in wells containing a positive control, Jurkat CD 16 cells line the well.
  • the activation test of the Jurkat CD16 cells measures the secretion of interleukin-2 (IL-2) induced by the binding of the Fc of the antico ⁇ s to the Fc ⁇ RIJI receptor (CD 16) after binding of Fab to its antigen, present on the target cell.
  • IL-2 interleukin-2
  • the level of IL-2 secreted by Jurkat CD 16 cells is proportional to the activation of the CD 16 receptor.
  • a 96-well microtiter plate 50 ⁇ l of dilutions of antico ⁇ s, 50 ⁇ l of a red cell suspension at 6.10 5 / ml, 50 ⁇ l of a suspension of Jurkat CD 16 cells at 1.10 6 / ml and 50 ⁇ l of a PMA solution at 40 ng / ml. All dilutions were carried out in EVIDM culture medium containing 5% FCS. After 16 hours of incubation at 37 ° C and 7% CO 2, the microtiter plate is centrifuged and the amount of IL-2 contained in the supernatant is assayed by a commercial kit (Duoset, R&D). The levels of secreted IL-2 are expressed in pg / ml. The results are expressed in% of CD16 activation, the level of dTL-2 secreted in the presence of the control monoclonal antibody being considered equal to 100%.
  • ADCC Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity
  • the red cells of a globular concentrate RbD (+) are treated with papain (1 mg / ml, 10 min at 37 ° C.) then washed in 0.9% NaCl.
  • the effector cells are isolated from a pool of at least 3 buffy coats, by centrifugation on Ficoll (Amersham Biosciences), followed by an adhesion step in the presence of 25% of FCS, so as to obtain a lymphocyte / monocyte ratio of the order of 9.
  • each well is deposited: 100 ⁇ l of a dilution of purified anti-Rh (D) antico ⁇ s (from 9.3 to 150 ng / ml), 25 ⁇ l of Rh (Dr-) papain red cells at 4 x 10 7 , 25 ⁇ l of effector cells at 8 x .10 7 and 50 ⁇ l of polyvalent IgG (Tegeline, LFB) at the usual concentrations of 2 and 10 mg / ml.
  • the dilutions are made in EVIDM containing 0.25% of SVF.
  • the plates are centrifuged, then the hemoglobin released in the supernatant is measured via its peroxidase activity in the presence of a chromogenic substrate, 2,7-diaminofluorene (DAF).
  • DAF 2,7-diaminofluorene
  • the results are expressed as a percentage of lysis, 100% corresponding to the total lysis of the red cells in NH 4 C1 (control 100%) and 0% to the reaction mixture without antico ⁇ s (control 0%).
  • the specific lysis is calculated as a percentage according to the following formula:
  • the F ⁇ R fraction After treatment with DEPC according to the conditions described above, approximately 20% of the molecules of the monoclonal antico ⁇ s EMAB5, constituting the FNR fraction, lose their capacity to bind to the gel of Sepharose-protein A. Knowing that histidine 435 is an essential amino acid for the attachment of IgG to protein A, it seems likely that the IgG of the FNR fraction differs from the FR fraction, retained on the Sepharose-protein A gel, by the modification of the residue His435. In the test for measuring the binding to the CD 16 receptor in the presence of antigen, the F ⁇ R fraction has the same capacities as the FR fraction, capacities which are identical to those of the control antico ⁇ s (Fig. 4).
  • the binding of the different fractions of the monoclonal antico ⁇ s EMAB5, modified or not by DEPC, is much higher than that of the monoclonal antico ⁇ s AD1, used in this test as a negative control.
  • the modification of histidine residues by DEPC does not induce a change in the ability of the monoclonal antibody EMAB5 to bind to Rh (D +) red blood cells or to the CD 16 receptor present on the surface of the Jurkat cell line. CD 16.
  • the functional activity of the monoclonal antico ⁇ s EMAB5 modified by DEPC is very slight.
  • the secretion of IL-2 of the Jurkat CD16 line induced by the FR and FNR fractions of the monoclonal antibody EMAB5 modified by DEPC represents, respectively, 42.8% and 19.5% of the secretion induced by the antibody witness (Fig. 5).
  • the results of the ADCC activity, expressed as% of actual lysis, show that the activity of the FNR fraction is lower than that of the FR fraction (FIG. 6).
  • the FR fraction shows a decrease in ADCC activity compared to the control antico ⁇ s, when the amount of antico ⁇ s added to the well is lower ( ⁇ 20 ng / ml) and that the amount of Multipurpose IgG is 2.5 mg / ml.
  • ADCC induction of cytokine secretion
  • histidine residues by a chemical agent (DEPC or other) does not make it possible to control either the degree or the location of the modifications.
  • a chemical agent DEPC or other
  • His310 and His435 which play an essential role in the binding of the zinc cation at the CH2-CH3 interface of IgGl, are replaced by lysine residues, by site-directed mutagenesis.
  • the YB2 / 0 cells co-transfected by electroporation with the mutated vector EMAB5- H-K338-K463-1 and the vector EMAB5- dhfr-K- Spel encoding the light chain of the antico EMs EMAB5, are cultured in RPMI medium supplemented with 5% of SVF dialysis, 0.5% of G418 and 25 nM of Methotrexate (MTX).
  • the clones secreting the highest levels of human IgG are cultured in 24-well plates in medium without MTX. The supernatants, harvested after 7 days of culture, are used to carry out the tests described below. 2.
  • CFC Fc ⁇ RIII receptor
  • This test is carried out on culture supernatants, the level of human IgG contained in the supernatants being determined by ELISA assay.
  • the wells of a microtiter plate are covered by papainized Rh (D +) red cells.
  • Culture supernatants containing native or mutated anti-Rh (D) antico dils and diluted to concentrations varying from 7.8 to 500 ng / ml in IMDM + 2.5% FCS are deposited in parallel on two microtiter plates previously “coated” by the red cells. After 90 min. incubation at 37 ° C, the wells are washed.
  • One of the plates, used to detect the IgGs fixed on the red cells is incubated in the presence of an anti-human mouse anti-Fc ⁇ labeled with alkaline phosphatase (Jackson LnmunoReaserch Laboratories).
  • Jurkat CD 16 cells are added after 15 min. contact at 37 ° C., the plate is centrifuged by gradually increasing the speed and the duration of centrifugation until the negative controls are negativized. After centrifugation, the wells are read and a score is given as a function of the spreading of Jurkat CD 16 cells in the well.
  • the microtiter plate After 16 hours of incubation at 37 ° C and 7% CO 2, the microtiter plate is centrifuged and the amount of IL-2 contained in the supernatant is assayed by a commercial kit (Duoset, R&D). The levels of secreted IL-2 are expressed in pg / ml.
  • the various tests were carried out on the culture supernatants containing the anti-Rh (D) monoclonal antibodies that were mutated or not.
  • the results of the CFC test show that the double mutation His310-435Lys does not induce any modification in the binding of the antico ⁇ s to the Fc ⁇ RIII receptor, carried by the Jurkat CD16 cell line (Fig. 7). While the non mutated clone 6H11 (negative control) exhibits binding to the receptor Fc ⁇ RUI decreased, the mutated clones 1C7, 2H11, 4G5 and 4H10 bind the Fc ⁇ RJJJ receptor similarly to the non-mutated clones 16D11 and 11G5 (positive controls).
  • CD 16 activation was carried out on the culture supernatants of 4 mutated clones mentioned above and of 3 non-mutated clones (16D11, 11G5 and 24G9).
  • the results represent the mean (+/- standard deviation) of the levels of IL-2 secreted by the Jurkat CD 16 cells in the presence of the non-mutated clones (Native) and of the mutated clones (His310-435Lys).
  • the mutated antico ⁇ s induce a secretion of_L-2 very reduced compared to that induced by the native antico ⁇ s (Fig. 8).
  • the mutated antico ⁇ s have a decrease in capacity to activate the Fc ⁇ RI ⁇ receptor by 50%.
  • the addition of 50 mM of imidazole in the Pantico ⁇ s incubation buffer with the cells causes a decrease in fixation of the antico ⁇ s which results in a significant decrease in the percentage of labeled cells; at the antico ants concentration of 1.5 ⁇ g / ml, the presence of imidazole induces a 40% decrease in the number of labeled cells.
  • Imidazole is a reagent that has the property of fixing cations.
  • the fixation of the antico ⁇ s on the CD 16 receptor is reduced.
  • the results expressed as a percentage of cells labeled as a function of the amount of antico ⁇ s added show that the antico ⁇ s 4G5 and 4H10, which have the double mutation His310-435Lys, bind significantly less well to Jurkat CD 16 cells than the clone 24G9, which is the non-mutated control antico ⁇ s.

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Abstract

La présente invention concerne l'utilisation de cations métalliques, notamment du Zinc, pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques d'anticorps comprenant des cations métalliques.

Description

UTILISATION DE CATIONS METALLIQUES POUR L'AMELIORATION DE L'ACTIVITE FONCTIONNELLE DES ANTICORPS
La présente invention concerne l'utilisation de cations métalliques, notamment divalents ou trivalents, et plus particulièrement de Zinc, de Cuivre, de Cadmium ou de Fer, pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticorps. Plus particulièrement, l'invention a pour objet des compositions pharmaceutiques d'anticorps comprenant des cations métalliques divalents ou trivalents.
Introduction et art antérieur
L'immunothérapie passive, très répandue, est fondée sur l'administration d'anticorps, par exemple des anticorps monoclonaux dirigés contre une cellule ou une substance donnée. L'immunothérapie passive au moyen d'anticoφs monoclonaux a donné des résultats encourageants. Toutefois, si l'utilisation d'anticoφs monoclonaux possède plusieurs avantages, comme par exemple une assurance de sécurité du produit quant à l'absence de contamination infectieuse, il peut en revanche s'avérer difficile d'obtenir un anticoφs monoclonal efficace.
En effet, le risque est de développer un anticoφs monoclonal qui s'avère peu efficace et pour lequel on observe des effets secondaires incompatibles avec une utilisation en thérapie clinique. Ces deux aspects sont étroitement liés sachant que des anticoφs peu actifs sont administrés à fortes doses pour compenser leur faible activité et obtenir une réponse thérapeutique. L'administration de fortes doses non seulement induit des effets secondaires mais est économiquement peu rentable.
Ces problèmes sont majeurs dans le développement industriel des anticoφs monoclonaux, chimériques, humanisés ou humains. A titre d'exemple, la société Protein Design Labs a suspendu les essais cliniques en phase VE du Remitogen®, qui est un anticoφs anti-HLA-DR pouvant être utilisé pour traiter les cancers de cellules MHC de classe π positives, notamment les leucémies des lymphocytes B et T.
Ainsi, un des objets de l'invention est de fournir de nouveaux produits ou procédés permettant de pallier les inconvénients rencontrés lors du développement industriel d'anticoφs, à savoir leur faible efficacité et leur coût élevé.
Aujourd'hui, la recherche est orientée sur la région Fc de l'immunoglobuline (Ig) afin d'améliorer les propriétés fonctionnelles des anticoφs. A terme, cela devrait permettre l'obtention d'anticoφs qui se lient et activent les récepteurs des cellules effectrices (monocytes /macrophages, lymphocytes B, cellules NK et dendritiques) de manière plus efficace. La région Fc des IgG est constituée de 2 domaines globulaires nommés CH2 et CH3. Les 2 chaînes lourdes interagissent étroitement au niveau des domaines CH3 tandis qu'au niveau des domaines CH2, la présence, sur chacune des 2 chaînes, d'un oligosaccharide lié à l'Asn 297 (numérotation de Kabat) contribue à l'écartement des 2 domaines CH2. Par ailleurs, les domaines CH2 et CH3 d'une même chaîne sont séparés par une région flexible définissant une interface entre les 2 domaines.
L'interface entre les domaines CH2-CH3 a été décrite comme étant un site commun de fixation de nombreuses (glyco)protéines comme le FcRn, les facteurs rhumatoïdes (Coφer et al., 1997) et certaines protéines bactériennes et virales, par exemple la protéine A de Staphylococcus aureus (Deisenhofer, 1981), la protéine G de Streptococcus de groupe G (Sauer-Eriksson et al., 1995), le complexe gE-gl du virus Heφes simplex 1 (Chapman et al., 1999) ) et la protéine « core » du virus de l'hépatite C (Maillard et α/., 2004).
Par ailleurs, il a été démontré que certains résidus d'acides aminés, localisés au niveau de cette interface dans le domaine CH2 ou le domaine CH3, étaient impliqués dans la fixation au FcRn, à la protéine A, etc. Ainsi, les IgGl humaines mutées au niveau du résidu d'histidine 435 (His 435, numérotation de Kabat) perdent leur capacité à fixer le FcRn et la protéine A mais conservent leur capacité à fixer le FcγRUI (Firan et al^ 2001 ; Shields et al-, 2001).
Par contre, aucune des études notifiant des modifications de l'interface CH2-CH3 d'IgG humaines ou murines, ne montre une relation quelconque entre la structure de cette partie de la molécule d'IgG et les capacités effectrices de ces IgG via les récepteurs FcγR (FcγRI, FcγRII, FcγRIÏÏ).
Dans le cadre de l'invention, nous avons déteπαiné la structure tridimensionnelle des régions Fc de différents anticoφs monoclonaux présentant des activités fonctionnelles différentes, notamment l'activité ADCC et l'induction de la production de cytokines. Nous avons découvert la présence d'un ion zinc situé entre les domaines CH2 et CH3, plus précisément, lié à des résidus localisés à l'interface des domaines CH2-CH3 impliquée dans la reconnaissance de la région Fc de Panticoφs par le récepteur FcRn ainsi que dans la fixation de la protéine A, issue de la paroi bactérienne de Staphylococcus aureus.
De part sa localisation à l'interface des domaines CH2 et CH3, cet atome de zinc joue un rôle important dans la conformation générale du Fc, et par là même permet l'amélioration de la liaison du Fc à ses récepteurs FcγRs.
Nos études de la structure tridimensionnelle de la région Fc de ces anticoφs ont révélé que la présence de cations métalliques tels que le Zinc, le Cuivre, le Cadmium ou le Fer, dans la solution de cristallisation était toujours associée à la conformation dite ouverte de la région Fc des IgG (Radaev et al., 2001). Cette conformation ouverte favorise la fixation aux récepteurs FcγR, notamment au FcγRIIL Ainsi, il est désormais possible de potentialiser l'activité fonctionnelle des anticoφs monoclonaux ou polyclonaux au moyen de cations métalliques. A l'opposé, l'abolition de la fixation de cations métalliques tels que le zinc, le cuivre, le cadmium ou le fer aux anticoφs, plus particulièrement à l'interface CH2-CH3, par utilisation de mutants de la séquence peptidique ou de substances chimiques appropriées, conduit à l'obtention d'anticoφs aux propriétés fonctionnelles abrogées ou fortement diminuées.
Ainsi, l'invention apporte une solution économique et universelle pour résoudre les problèmes liés à la faible efficacité des anticoφs monoclonaux disponibles ou en cours de développement par l'utilisation de cations métalliques qui améliorent l'activité fonctionnelle d'anticoφs. A cet effet, nous proposons une méthode pour potentialiser l'activité fonctionnelle des anticoφs au moyen de cations métalliques. Enfin, par la modification du site de liaison aux cations métalliques, l'invention fournit également des anticoφs de classe IgGl possédant une capacité d'activation du récepteur FcγRIÏÏ diminuée, ainsi que des anticoφs de classe IgG3 possédant artificiellement un site de fixation pour un cation métallique.
Description
Ainsi, un premier objet de l'invention est l'utilisation de cations métalliques divalents ou trivalents pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticoφs.
Nos études tridimensionnelles de la région Fc des anticoφs ont révélé que la présence de cations métalliques tels que le Zinc, le Fer, le Cuivre ou le Cadmium, était toujours associée à la conformation dite ouverte de la région Fc des IgG. Cette conformation ouverte favorise la fixation des anticoφs aux récepteurs FcγR, notamment au FcγRHI. Ainsi, il est désormais possible de potentialiser l'activité fonctionnelle des anticoφs monoclonaux ou polyclonaux au moyen de tels cations métalliques. De manière préférentielle, le cation métallique utilisé est le zinc. En effet, nos analyses ont permis de mettre en évidence la présence d'un ion zinc lié aux résidus d'histidine 310 et d'histidine 435 (dans la présente demande, la numérotation est celle de Kabat, Kabat database, http://immuno.bme.nwu.edu).
De part sa localisation sur la région Fc, cet atome de zinc joue un rôle important dans la conformation générale de la région Fc, et par là même permet l'amélioration de la liaison de la région Fc à ses récepteurs.
Ainsi, de manière avantageuse, on utilise ces cations pour interragir avec la région Fc des anticoφs afin de participer à la stabilisation de cette région.
Plus particulièrement, on les utilise afin de participer au contrôle de l'ouverture de la région Fc des anticoφs et ainsi de favoriser le maintien de la conformation dite « ouverte » des anticoφs, c'est-à-dire le maintien d'un certain écartement entre les domaines CH2 favorisant la fixation de la région Fc sur ses récepteurs. La présence des cations métalliques permet d'induire une ouverture de la région Fc, même si le cation métallique ne se maintient pas dans son site. Ainsi, de manière avantageuse, ces cations métalliques favorisent la fixation des anticoφs aux récepteurs FcyR, notamment au récepteur FcvRIII.
De plus, le cation métallique peut, dans un autre aspect de l'invention, favoriser le rapprochement de plusieurs régions Fc d'anticoφs, via un deuxième site de fixation impliquant les résidus d'histidine 268 et 285 (numérotation de Kabat), facilitant l'activation des FcγRs, plus particulièrement des FcγRIÏÏ et la transduction des la signalisation par l'intermédiaire de ces récepteurs.
Par « activité fonctionnelle » on entend, de manière non limitative, l'activité ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity), l'activité CDC (Complément Dépendent Cytotoxicity), l'activité de phagocytose, l'activité d'endocytose ou encore l'induction de la sécrétion de cytokines. Ainsi, l'utilisation de cations métalliques tels que décrit dans l'invention permet d'améliorer l'activité fonctionnelle d'au moins 50%, préférentiellement 60%, ou 70%, 80%, 100%, et préférentiellement 200% ou 300%. De plus, on entend par «récepteurs » non seulement les molécules de FcyR., telles que FcyRIII, présentes sur les cellules du système immunitaire telles les monocytes, les macrophages, les lymphocytes B et T, les cellules NK et les cellules dendritiques mais également le FcRn, les molécules du complément comme le Cl q et celles des parois bactériennes comme la protéine A.
Par « anticoφs », on entend tout anticoφs polyclonal ou monoclonal. Si l'anticoφs est un anticoφs monoclonal, il peut être chimérique, humanisé ou humain. Avantageusement, cet anticoφs est une IgG, par exemple une IgGl ou une IgG3, notamment humaine. De plus, le terme anticoφs inclut également toute glycoprotéine comportant une région Fc, par exemple humaine, et un ou plusieurs fragments, domaines ou dérivés d'anticoφs. On entend par « domaine d'anticoφs » l'un quelconque des domaines VL, CL, VH , CH1, CH2, CH3, CH4 ; par « fragment d'anticoφs » tout fragment qui contient un site de fixation complet pour un antigène, choisi parmi les fragments Fv, scFv, Fab, Fab', F(ab')2, et par « dérivé d'anticoφs » tout anticoφs pouvant comprendre une ou plusieurs mutations, substitutions, délétions et/ou additions d'un ou plusieurs résidus d'acides aminés, ainsi que les anticoφs multi- spécifiques et polyfonctionnels.
Par « cation métallique divalent ou trivalent» ou par « cation métallique » on entend tout cation métallique ayant un degré d'oxydation +2 ou +3 et plus particulièrement le zinc, le fer, le cuivre, le cadmium, le cobalt, le nickel, le manganèse, le gallium, le gadolinium, le sélénium, l'or, le platine ou le palladium ou un analogue. Préférentiellement, ces cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, et de manière particulièrement avantageuse il s'agit du zinc. Par « analogue » on entend tout ion libre ou lié susceptible de se lier au niveau de la région Fc des anticoφs, et plus particulièrement aux résidus His 310, His 435, les résidus Asn 434 et His 433 (numérotation de Kabat) pouvant également participer à la fixation. Un deuxième objet de l'invention concerne une méthode pour potentialiser l'activité fonctionnelle des anticoφs via la région Fc, comprenant une étape consistant à ajouter une quantité appropriée d'au moins un cation métallique dans le système biologique produisant les anticoφs ou dans une solution comprenant des anticoφs avant et/ou après purification ou encore dans la solution de conservation ou dans la formulation finale sous la forme d'une solution injectable des anticoφs.
De manière avantageuse, ces cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium.
On entend par « système biologique » des lignées cellulaires, des plantes ou animaux transgéniques non humains. Parmi les cellules, on peut choisir des cellules provenant de lignées cellulaires, transfectées à l'aide d'un vecteur comportant le gène codant pour ledit anticoφs, par exemple des cellules eucaryotes ou procaryotes, notamment des cellules de mammifères, d'insectes, de plantes, de bactéries ou de levures. Plus spécifiquement, on peut utiliser des cellules de myélome de rat telle que YB2/0.
On peut également utiliser des cellules CHO, notamment CHO-K, CHO-LeclO, CHO- Lecl, CHO Pro-5, CHO dhfr- ou d'autres lignées cellulaires parmi Wil-2, Jurkat, Vero, Molt-4, COS-7, 293-HEK, K6H6, NSO, SP2/0-Ag 14 et P3X63Ag8.653, PERC6 ou BHK.
De manière préférentielle, on ajoute une concentration molaire en zinc au moins égale à la concentration molaire en anticoφs.
Eventuellement, on ajoute une concentration molaire en zinc au moins égale à 2 fois, et préférentiellement à 3 fois ou à 4 fois la concentration molaire en anticoφs. Alternativement, on ajoute une concentration molaire en cations métalliques permettant d'améliorer l'activité fonctionnelle de l'anticoφs d'au moins 25%, préférentiellement 50% ou 60%, 70%, 80%, 100%, et préférentiellement 200 ou 300%. Avantageusement, les cations métalliques existent sous différentes formes. Dans un aspect particulier de l'invention, les ions zinc peuvent être sous forme d'acétate de zinc, de bromure de zinc, de chlorhydrate de zinc, de chlorure de zinc, de citrate de zinc, de gluconate de zinc, d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc, de nitrate de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc.
Un autre objet de l'invention se rapporte à des anticoφs de classe IgG3, et plus particulièrement les allotypes G3m(b)et G3m(g), possédant un site de fixation pour un cation métallique comprenant les résidus His 310 et His 435 sur sa région Fc créé par ingénierie moléculaire.
Dans le cadre de l'invention, nous avons mis en évidence que des cations métalliques se fixent sur les anticoφs de classe IgGl sur un site comprenant les résidus His 310 et His 435, les résidus His 433 et Asn 434 pouvant eux aussi être impliqués dans cette fixation. Or, les anticoφs de classe IgG3 d'allotype G3m(b) ou G3m(g) ne comportent pas un tel site de fixation à l'état naturel. En effet, ils possèdent un résidus arginine (Arg) en position 435. Ainsi, dans le cadre de l'invention, nous créons, par mutagenèse dirigée, des anticoφs de classe IgG3 présentant une fixation de cations métalliques améliorée par rapport aux anticoφs non modifiés, de par la création d'un site de fixation impliquant un résidu His 435 en substitution du résidu Arg 435.
Ainsi, ces anticoφs IgG3 comportent un site de fixation pour un cation métallique, notamment le zinc, le fer, le cuivre, le cadmium, le cobalt, le nickel, le manganèse, le gallium, le sélénium, l'or, le platine ou le palladium, comprenant les résidus His 310 et His 435, et de manière avantageuse comprenant aussi le résidus Asn 434 et/ou His 433. De manière avantageuse, l'un au moins de ces résidus histidine est remplacé par un au moins des résidus choisis parmi la cystéine, l'acide aspartique et l'acide glutamique. En effet, ces résidus possèdent aussi la capacité de fixer de tels cations métalliques. Préférentiellement, le cation métallique est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, et de manière préférée le zinc. Dans un aspect particulier de l'invention, l'anticoφs possède un cation métallique,- et plus particulièrement un atome de zinc, lié à un ou plusieurs résidus de la région Fc. De manière particulièrement avantageuse, cet anticoφs IgG3 possède une capacité de fixation au FcγRIÏÏ et une activité fonctionnelle améliorées par rapport à l'anticoφs natif.
Un objet de l'invention est ainsi l'utilisation de l'anticoφs IgG3 possédant un site de fixation pour un cation métallique précédemment décrit pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une pathologie comme la maladie hémolytique du nouveau-né, une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire, une pathologie liée aux agents pathogènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), latularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique d'anticoφs thérapeutiques comprenant des cations divalents ou trivalents et au moins un excipient. De manière préférée, ces cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux. De manière particulièrement avantageuse, on choisit le zinc, qui peut être sous forme d'acétate de zinc, de bromure de zinc, de chlorhydrate de zinc, de chlorure de zinc, de citrate de zinc, de gluconate de zinc, d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc,de nitrate de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc. Dans un aspect particulier, les anticoφs contenus dans la composition possèdent un cation métallique selon l'invention lié aux résidus His 310 et His 435, les résidus His 433 et Asn 434 pouvant également participer à la fixation.
Dans un autre aspect particulier de l'invention, les anticoφs de la composition pharmaceutique sont les anticoφs de classe IgG3 créés par ingénierie moléculaire décrits précédemment. Dans un autre aspect préféré de l'invention, ce sont des IgG humaines ou ayant une région Fc humaine.
Ainsi, la présence de tels cations métalliques dans la composition améliore la fixation des anticoφs thérapeutiques qu'elle contient à ses récepteurs, notamment les Fc RUL la composition possédant ainsi une meilleure activité thérapeutique.
Un autre objet de l'invention est une composition pharmaceutique dans laquelle au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou encore 99% des anticoφs possèdent un cation métallique divalent ou trivalent, notamment un ion zinc, lié à un site se trouvant dans la région Fc. Il peut s'agir de manière préférentielle du site de fixation comprenant les acides aminés His 310 et His 435, l'acide aminé Asn 434 et/ou His 433 étant susceptible(s) de participer à la fixation. Dans un autre aspect de l'invention, il peut s'agir du site de fixation comprenant les acides aminés His 268 et His 285. Dans un autre aspect de l'invention, les 2 sites peuvent être occupés par un cation métalliquetel que décrit dans l'invention.
Le cation métallique est de manière préférentielle un de ceux déjà cités précédemment, notamment le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux, éventuellement sous les formes déjà évoquées.
Un autre objet de l'invention est une solution comprenant un anticoφs monoclonal ou des anticoφs monoclonaux et une quantité appropriée de cations métalliques divalents ou trivalents, en particulier d'ions zinc au moins égale à la concentration molaire en anticoφs, cette solution étant adaptée pour une injection par voie intraveineuse, sous- cutanée ou intramusculaire.
Les cations métalliques peuvent être tout cation métallique divalent ou trivalent, notamment du zinc, du fer, du cuivre, du cadmium, du cobalt, du nickel, du manganèse, du gallium, du sélénium, du or, du platine ou du palladium ou un analogue. De manière préférée, le cation est un ion zinc ou d'acétate de zinc, de bromure de zinc, de chlorhydrate de zinc, de chlorure de zinc, de citrate de zinc, de gluconate de zinc, d'hydroxycarbonate de zinc, d'iodure de zinc, de L-lactate de zinc,de nitrate de zinc, de stéarate de zinc, ou de sulfate de zinc.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation d'ions zinc pour améliorer la cristallisation d'anticoφs thérapeutiques, et plus particulièrement d'IgG monoclonaux, les ions zinc stabilisant la région Fc des anticoφs. L'ajout de cations divalents et plus particulièrement de zinc, augmente significativement la solubilité des Fc des IgGs, en favorisant les contacts cristallins ce qui facilite l'obtention des cristaux nécessaires aux études structurales.
L'invention a également pour objet de fournir un test permettant d'évaluer l'efficacité d'un anticoφs comprenant l'étude de la conformation 3D, notamment du domaine impliquant les résidus His 310, His 435, His 433 et/ou Asn 434 de la région Fc telle que montrée à la figure 1 ou 2 ou encore un dosage de la teneur en zinc desdits anticoφs, la présence de zinc étant une indication de l'efficacité de l'anticoφs.
Un autre objet de l'invention se rapporte à un anticoφs possédant l'un au moins de ses résidus His 310 et His 435 modifié.
Dans un aspect particulier de l'invention, la modification de l'anticoφs est une mutation, notamment une substitution par un acide aminé possédant une faible affinité pour les cations métalliques divalents ou trivalents. Par exemple, le résidu His 310 et/ou le résidu His 435 peu(ven)t être substitué(s) par un résidu de lysine, d'alanine, de glycine, de valine, de leucine, d'isoleucine, de proline, de méthionine, de tryptophane, de phénylalanine, de serine ou de thréonine. De manière particulièrement avantageuse, les résidus His 310 et His 435 sont substitués tous les deux par des résidus de lysine.
Ces mutants peuvent être réalisés à partir de tout anticoφs possédant à l'état « naturel », c'est-à-dire non muté, un site de fixation pour les cations métalliques comprenant les résidus His 310 et His 435. Il peut s'agir notamment d'IgGl, d'IgG3 allotypes G3m(s) ou G3m(st), IgG2 ou IgG4.
Ces mutants possèdent une capacité d'activation du FcγRIII diminuée de façon significative.
Dans un deuxième mode de réalisation, la modification peut être réalisée par le DEPC (diéthyl pyrocarbonate), un agent modifiant les histidines.
Avantageusement, ces anticoφs sont des IgGl, ou en tout état de cause des anticoφs possédant à l'état « naturel », c'est-à-dire non muté, un site de fixation pour les cations métalliques comprenant les résidus His 310 et His 435.
Ces anticoφs possèdent une activité fonctionnelle diminuée par rapport au même anticoφs non modifié. Toutefois, ils conservent leur capacité à fixer l'antigène et le
Fc RIÏÏ.
Ainsi, l'invention fournit des anticoφs possédant une faible activité ADCC, présentant un intérêt particulier en thérapie en remplacement des IgG4, ou pour prévenir les rejets de greffe. On peut encore utiliser les anticoφs double mutants selon l'invention comme anti-tétaniques, anti-diphtériques ou dirigés contre des agents pathogènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
Ainsi, un autre objet de l'invention concerne l'utilisation d'anticoφs modifiés comme décrit ci-dessus, et possédant donc une activité fonctionnelle faible, pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention du rejet de greffe ou au traitement d'une pathologie choisie parmi le tétanos, la diphtérie, ou provoquée par un agent pathogène ou toxine dérivée, listé comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme "(classification des Centers for Disease Control, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus —Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
Enfin, des anticoφs possédant une activité fonctionnelle altérée comme précédemment décrits sont aussi utilisés pour la préparation d'un médicament en remplacement des IgG4.
A titre d'exemple, les anticoφs décrits dans l'invention, notamment les anticoφs possédant une activité fonctionnelle améliorée due aux cations métalliques, ou les anticoφs modifiés dont l'activité fonctionnelle est altérée, ou encore les compositions ou solutions de l'invention, peuvent être choisis parmi les anti Ep-CAM, anti- KIR3DL2, anti-EGFR, anti-VEGFR, anti HER1, anti HER2, anti GD, anti GD2, anti GD3, anti-CD20, anti CD-23, anti CD-25, anti-CD30, anti-CD33, anti-CD38, anti- CD44, anti CD52, anti CA125 et anti ProteinC, anti-HLA-DR, les anti-viraux: HBV, HCV, HIV et RS V, et plus particulièrement parmi les anticoφs du Tableau I ci-après : Tableau I : Nom et marque Société cible indication commerciale de l'anticorps Edrecolomab Centocor anti Ep-CAM cancer colorectal PANOREX Rituximab Idée anti CD20 B cell lymphoma RITUXAN Licensié à thrombocytopenia puφura Genentech/ Hofïman la roche Trastuzumab Genentech anti HER2 cancer ovarien HERCEPTIN Licensié à Hofïman la roche/Immunogen Palivizumab Medimmune RSV SYNAGIS Licensié à Abott Alemtuzumab BTG anti CD52 leukemia CAMPATH Licensié à Schering ibritumomab IDEC anti CD20 NHL tiuxetan Licensié à Schering ZEVALIN Cetuximab Merck /BMS / anti EGFR cancers C-C225 Imclone
Bevacizumab Genentech/ anti VEGFR cancers AVASTIN Hoffinan la roche Epratuzumab hnmumedics/ anti CD22 cancers: Amgen lymphome non hogkinien
Hu M195Mab Protein Design Anti CD33 cancers Labs MDX-210 Lnmuno-Designed ND cancers Molécules BEC2 hnclone anti GD3 cancers Mitumomab Oregovomab Altarex anti CA125 cancer ovarien OVAREX
Ecromeximab Kyowa-Hakko anti GD3 melanome malin KW-2971 ABX-EGF Abgenix EGF cancers
MDX010 Medarex Anti CD4R Cancers
XTL 002 XTL ND anti- viral : HCV biopharmaceuticals Hll SCFV viventia biotech ND cancers
4B5 viventia biotech anti GD2 Cancers XTL 001 XTL ND anti-viral : HBV biopharmaceuticals MDX-070 MEDAREX Anti-PSMA cancer de la Prostate
TΝX-901 TANOX anti IgE Allergies
IDEC-114 IDEC inhibition lymphome non-Hodgkinien ProteinC Par exemple, l'invention porte sur une solution se trouvant sous la forme d'un concentré à une concentration d'anticoφs allant de 0,1 à 50 mg/mL, ou 1 à 25 mg/mL qui peut être formulé pour une administration IV. Le soluté peut contenir à titré d'exemple : 9,0 mg/mL chlorure de sodium, 7,35 mg/mL citrate de sodium dihydraté, et 0,7 mg/mL polysorbate-80 dans de l'eau stérile. Dans ce soluté ou concentré, on rajoute en outre de 0,1 à 50 mg/mL, ou 1 à 20 mg/mL d'un cation, la concentration dudit cation étant égale à 1, 2, 3, 4 ou 5 fois la concentration en anticoφs soit de 0,1 à 250 mg/mL ou de 1 100 mg/mL. Ce concentré peut être injecté dans une poche de sérum ou de liquide de perfusion de sorte à obtenir la dose que l'on souhaite administrer, tout en maintenant la même teneur en cation par rapport à la teneur en anticoφs.
L'invention porte également sur une poudre lyophilisée, stérile dans un containeur et qui peut être reconstituée avec de l'eau stérile juste avant injection comprenant la quantité appropriée d'anticoφs et la quantité dudit cation selon l'invention 1", 2, 3, 4 ou 5 fois supérieure à celle de l'anticoφs.
On peut reconstituer cette poudre pour une injection IV ou sous-cutanée. Dans ce dernier cas, la poudre peut comprendre de 10 à 500 mg d'anticoφs et une quantité dudit cation selon l'invention 1, 2, 3, 4 ou 5 fois supérieure à celle de l'anticoφs, soit par exemple de 10 à 500 mg. On peut rajouter les excipients tels que le sucrose, un acide aminé, du polysorbate:
Il faut comprendre que l'invention concerne préférentiellement les compositions décrites ci-dessus dans lesquelles la teneur en cation est au moins égale à la teneur en anticoφs, mais vise également toute composition dans laquelle on rajoute une quantité de cation (zinc, fer, cuivre, cadmium, ou un analogue, ou leur mélange) inférieure à ladite quantité équimolaire, par exemple de 0,1 à 0,99 molaire (0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8 ou 0,9 molaire), mais toujours suffisante pour améliorer d'au moins 10% ou 25%, ou 50% ou encore 100% l'efficacité et/ou les propriétés fonctionnelles de l'anticoφs.
D'autres aspects et avantages de l'invention seront décrits dans les exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et ne limitent pas l'étendue de l'invention.
Afin d'acquérir des données nouvelles sur les relations structure-fonction de la région Fc des anticoφs. le demandeur a cristallisé les fragments Fc de l'anticoφs monoclonal EMAB5, exprimé dans la lignée cellulaire YB2/0, en présence ou en absence de zinc. Une étude par diffraction des rayons X (RX) des fragments Fc cristallisés a été entreprise ; une partie de cette étude est présentée dans les exemples 1 et 2 qui suivent. L'exemple 3 montre l'effet d'une modification chimique des histidines sur l'activité Fc et l'exemple 4 l'effet d'une double mutation des résidus histidine 310 et 435 en lysines.
Description des figures
Figure 1 : Schéma montrant la position des ions Zn2+ au voisinage du fragment Fc de l'anticoφs monoclonal EMAB5 (2Â).
Figure 2 : Détail de la carte de densité électronique au voisinage des résidus d'histidine 310 et 435.
Figure 3 : Supeφosition des structures du fragment Fc de l'anticoφs EMAB5 obtenues en absence (gris) et en présence (blanc) d'ion Zn2+.
Figure 4 : Fixation de l'anticoφs EMAB5 modifié par le DEPC au récepteur FcγRIH. Cette figure présente en abscisse ,1a fixation des anticoφs sur les hématies et en ordonnée la fixation du CD 16 (FcγRJH) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16. f (*) anticoφs témoin AD1 ; (M) EMAB5 témoin ; (A) EMAB5 FNR ; (•) EMAB5 FR.
Figure 5 : Activation par l'anticoφs EMAB5 modifié par le DEPC du récepteur FcγPJII présent sur les cellules Jurkat CD 16.
Cette figure représente la quantité, exprimée en pg/ml, d'IL-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD16 dont le récepteur CD16 a été activé par l'anticoφs EMAB5 témoin ( ) et les fractions séparées sur protéine A après modification de l'anticoφs EMAB5 par le DEPC : FNR (•), FR (M).
Figure 6 : Effet de la modification par le DEPC sur l'activité ADCC de l'anticoφs monoclonal EMAB5.
Cette figure représente le pourcentage de lyse des hématies Rh(D+) induite par l'anticoφs monoclonal EMAB5 témoin et par les 2 fractions FR et FNR, séparées sur gel de Sépharose-protéine A, de l'anticoφs modifié par le DEPC.
Figure 7 : Mesure de la fixation du Fc des anticoφs doublement mutés His310-435Lys au récepteur FcγRÏÏI. Les anticoips 1C7, 2H11, 4G5 et 4H10 sont les anticoφs mutés. Les anticoφs 16D11, 11G5 et 6H11 ne sont pas mutés. Cette figure présente en abscisse, la fixation des anticoφs sur les hématies et en ordonnée la fixation du CD 16 (FcγRIII) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16. La figure regroupe les résultats obtenus avec les surnageants contenant les anticoφs doublement mutés (courbes en trait plein) et ceux contenant des anticoφs non mutés (courbes en pointillés).
Figure 8 : Etude de la sécrétion d'IL-2 induite par des anticoφs monoclonaux anti- Rh(D) mutés ou non. Cette figure représente le pourcentage d'IL-2 sécrété par des anticoφs monoclonaux anti-Rh(D) natifs (n = 3 clones) et portant la double mutation His310-435Lys (n = 4 clones). Les résultats sont exprimés en pourcentage par rapport à un anticoφs témoin purifié, EMAB5.
Figure 9 : Influence de l'imidazole sur la fixation de l'anticoφs monoclonal EMAB5 au récepteur CD16 (Fc-)R1II).
Figure 10 : Etude par cytométrie en flux de la fixation des anticoφs portant la double mutation His310-435Lys au récepteur CD 16
EXEMPLES
Afin d'acquérir des données nouvelles sur les relations structure-fonction de la région Fc des anticoφs, le demandeur a cristallisé les fragments Fc de l'anticoφs monoclonal EMAB5, exprimé dans la lignée cellulaire YB2/0, en présence ou en absence de zinc. Une étude par diffraction des rayons X des fragments Fc cristallisés a été entreprise ; une partie de cette étude est présentée dans les exemples 1 et 2 qui suivent. L'exemple 3 montre l'effet d'une modification chimique des histidines sur l'activité Fc et l'exemple 4 l'effet d'une double mutation des résidus histidine 310 et 435 en lysines. Anticorps monoclonal :
EMAB5. Il s'agit d'une IgGl(κ) humaine, dirigée contre l'antigène Rh(D), produite dans la lignée cellulaire YB2/0 (myélome de rat, lignée ATCC n° CRL 1662) adaptée à la culture en milieu sans sérum.
- Purification : EMAB5 a été purifié par chromatographie d'affinité sur Sépharose- protéine A.
- Analyse glycannique : par HPCE-LIF, il a été montré que la structure majoritaire est un oligosaccharide de type biantenné, contenant environ 25 % de fucose.
- Activité biologique : l'activité ADCC de EMAB5 est au moins égale à celle de l'anticoφs polyclonal anti-Rh(D) de référence, WinRho (Cangène). Préparation du fragment Fc :
- Conditions d'hydrolyse : L'anticoφs purifié EMAB5 est dialyse une nuit contre du tampon Tris 50 mM, pH 8,0. La solution d'anticoφs, ajustée à 50 mM CaC12 et 10 mM cystéine, est incubée 30 min. à 37°C avant d'ajouter la solution de trypsine (1 mg/ml) dans un rapport enzyme/substrat de 1/25. Après 5 h. d'incubation à 37°C, la réaction est arrêtée par l'addition de diisopropyl fluorophosphate (1 mM final). L'hydrolysat est dialyse une nuit contre du tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8.
- Purification du fragment Fc : L'hydrolysat dialyse est mis en contact avec de l'Affarose-protéine L à raison de 1 ml de gel pour 3,6 mg d'anticoφs. Après 4 h. d'incubation à température ambiante sous agitation, le gel est monté en colonne et lavé par le tampon Imidazole 50 mM, pH 7,8. L'effluent et le tampon de lavage qui contiennent les fragments Fc sont réunis, concentrés par centrifugation sur Vivaspin 20 en utilisant les conditions décrites par le fabricant.
EXEMPLE 1. Présence d'ions zinc liés aux fragments Fc.
Cristallogénèse : Après mise au point, les conditions de cristallisation retenues sont les suivantes : la solution de fragments Fc, à 2 mg/ml en tampon imidazole 50 mM, pH 7.8, est amenée à 10% de monométhyl polyéthylène glycol 5 000, 100 mM cacodylate de sodium, 0.1 mM chlorure de zinc, pH 5,1 par diffusion de vapeur en gouttes assies à 17°C. Collection des données de diffraction et détermination de la structure : Le cristal obtenu est soumis aux RX à l'ESRF de Grenoble et les informations collectées sont traitées par les programmes DENZO et SCALEPACK (Otwinowski and Minor, 1997). La structure est résolue et affinée à 2.3 Â (Fig.l) en utilisant la suite des programmes CCP4.
Résultats : Ce cristal du fragment Fc de EMAB5 appartient au groupe spatial C222ι avec un fragment par unité asymétrique Les paramètres de maille sont les suivants : a = 50.2 À; b = 147.7 Â; c = 75.6Â ; α = β = γ = 90°.
La structure tridimensionnelle (schématisée à la figure 1) permet de mettre en évidence la présence d'ions zinc (en blanc) près des domaines CH2 et CH3 (en gris). La carte de densité électronique présentée figure 2 montre l'ion zinc lié aux résidus d'histidine 310 (CH2) et 435 (CH3). Un autre ion zinc est lié à l'histidine 268 d'un Fc et à l'histidine 285 d'un Fc symétrique. Le troisième se trouve près de l'histidine 433.
EXEMPLE 2. Effet des cations métalliques sur la conformation des fragments Fc.
Dans cet exemple, les cristaux obtenus appartiennent tous au groupe d'espace
P2(l)2(l)2(l) avec deux chaînes par unité asymétrique et on caractérise l'ouverture des Fc par les distances entre les résidus de proline 329 des chaînes A et B et entre les résidus de mannose 4 des chaînes A et B. Cristallisés en absence d'ion métallique, les fragments Fc de Panticoφs EMAB5 sont caractérisés par une distance entre pralines 329 de 32,53 Â et une distance entre mannoses 4 de 17,61 Â. Lorsque l'on ajoute un ion métallique à la solution de cristallisation (voir Tableau II), ces distances caractéristiques augmentent.
Tableau II : Principales caractéristiques des cristaux du fragment Fc de l'anticoφs monoclonal EMAB5 dans le groupe d'espace P2(l)2(l)2(l).
La figure 3 montre la supeφosition des chaînes principales des structures obtenues en absence (en gris) et en présence de zinc (blanc) dans la solution de cristallisation. L'addition d'un sel métallique à la solution de Fc favorise donc une conformation dite ouverte, conformation proche de celle du Fc lié au récepteur FcγRHI.
EXEMPLE 3 : Modification des résidus histidine par le DEPC
Le diéthylpyrocarbonate (DEPC) est un réactif qui a été très utilisé pour modifier et étudier le rôle des résidus d'histidine présents dans les protéines (Miles, 1977). Firan et al.(2001) ont montré que des IgGl humaines traitées par le DEPC perdaient leur capacité à fixer le récepteur FcRn qui est impliqué dans le transfert des IgG maternelles vers le foetus. Le DEPC agit par substitution d'un groupement nitrogène présent sur le cycle imidazole de l'histidine, transformant ainsi le résidu d'histidine en 3-carboéthoxy histidine.
1. Modification par le DEPC
L'anticoφs monoclonal EMAB5, dialyse contre du tampon acétate de sodium 0,1 M, pH 6,0, est mis en contact avec du DEPC à raison de 70 μg de DEPC/mg d'IgG. Après 30 minutes d'incubation à température ambiante, la réaction est arrêtée par l'addition d'imidazole (0,2 mg/ml final).
Après dessalage en tampon phosphate de sodium 20 mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, l'anticoφs monoclonal modifié est fractionné par chromatographie d'affinité sur Sépharose-protéine A. Une fraction de l'anticoφs monoclonal modifié n'est pas retenue sur le gel d'affinité et constitue la fraction non retenue ou FNR. La fraction retenue sur le gel et appelée FR est éluée par du tampon Glycine-HCl 0,1 M, pH 2,8. Les deux fractions ainsi obtenues sont dialysées contre du tampon Phosphate de sodium 20mM, NaCl 50 mM, pH 7,2, concentrées sur Vivaspin selon les recommandations du fabricant et conservées à 4°C pendant 15 jours maximum. L'anticoφs témoin, qui nous sert de référence, a subi le même traitement hormis le DEPC qui a été remplacé par un volume identique d' éthanol.
2. Mesure de la fixation du Fc des anticoφs au récepteur FcγRffl par test CFC.
Afin de vérifier l'intégrité des anticoφs traités par le DEPC, les anticoφs sont soumis à un test, appelé CFC, qui estime la capacité des anticoφs à fixer, dans un premier temps, l'antigène contre lequel ils sont dirigés puis, dans un second temps, le récepteur FcγRlJJ (CD 16) exprimé à la surface de la lignée cellulaire Jurkat CD 16. Les puits d'une plaque de microtitration sont recouverts par des hématies Rb(D+) papaïnées. Les anticoφs anti-Rit(D), dilués à des concentrations variant de 7,8 à 500 ng/ml en UVIDM + 2,5% sérum de veau foetal (SVF) sont déposés en parallèle sur deux plaques de microtitration préalablement « coatées » par les hématies. Après 90 min. d'incubation à 37°C, les puits sont lavés.
L'une des plaques, utilisée pour détecter les IgG fixées sur les hématies, est incubée en présence d'un anticoφs de souris anti-Fcγ humain marqué à la phosphatase alkaline (Jackson ImmunoResearch Laboratories).
Dans l'autre plaque, les cellules Jurkat CD16, diluées à la concentration de 2 x 106 cellules/ml en DVLDM + 1% SVF, sont ajoutées. Après 15 min. de contact à 37°C, la plaque est centrifugée en augmentant progressivement la vitesse et la durée de centrifugation jusqu' à negativer les témoins négatifs. On entend par témoin négatif des anticoφs qui se fixent aux hématies immobilisées dans les puits de la plaque de microtitration mais qui ne fixent pas le récepteur FcγRIII présent à la surface des cellules Jurkat CD 16. Dans les puits contenant le témoin négatif, les cellules Jurkat CD 16, après centrifugation, forment un amas au centre du puits alors que dans les puits contenant un témoin positif, les cellules Jurkat CD 16 tapissent le puits.
Après centrifugation, la lecture des puits est effectuée et un score est donné en fonction de l'étalement de cellules Jurkat CD 16 dans le puits.
3. Mesure de l'activation du récepteur FcγRIÏÏ Le test d'activation des cellules Jurkat CD16 mesure la sécrétion de l'interleukine-2 (IL-2) induite par la fixation du Fc des anticoφs sur le récepteur FcγRIJI (CD 16) après liaison du Fab à son antigène, présent sur la cellule cible. Le taux d'IL-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD 16 est proportionnel à l'activation du récepteur CD 16. Dans une plaque de microtitration de 96 puits, on dépose successivement 50 μl de dilutions d'anticoφs, 50 μl d'une suspension d'hématies à 6.105/ml, 50 μl d'une suspension de cellules Jurkat CD 16 à 1.106/ml et 50 μl d'une solution de PMA à 40 ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture EVIDM contenant 5% de SVF. Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de CO2, la plaque de microtitration est centrifugée et la quantité d'IL-2 contenue dans le surnageant est dosée par un kit commercial (Duoset, R&D). Les taux d'IL-2 sécrétée sont exprimés en pg/ml. Les résultats sont exprimés en % d'activation CD16, le taux dTL-2 sécrétée en présence de l'anticoφs monoclonal témoin étant considéré égal à 100%.
4. Mesure de l'activité ADCC La technique ADCC (Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity) permet d'évaluer la capacité des anticoφs à induire la lyse des hématies Rh(D+), en présence de cellules effectrices (cellules mononucléées ou lymphocytes).
Brièvement, les hématies d'un concentré globulaire RbD(+) sont traitées à la papaïne (lmg/ml, 10 min à 37°C) puis lavées en NaCl 0,9%. Les cellules effectrices sont isolées à partir d'un pool d'au moins 3 buffy-coat, par centrifugation sur Ficoll (Amersham Biosciences), suivi d'une étape d'adhérence en présence de 25% de SVF, de façon à obtenir un ratio lymphocytes/monocytes de l'ordre de 9. Dans une plaque de microtitration (96 puits) on dépose par puits : 100 μl d'une dilution d'anticoφs anti- Rh(D) purifié (de 9,3 à 150 ng/ml), 25 μl d'hématies papaïnées Rh(D-r-) à 4 x 107, 25 μl de cellules effectrices à 8 x .107 et 50 μl d'IgG polyvalentes (Tégéline, LFB) aux concentrations usuelles de 2 et 10 mg/ml. Les dilutions sont faites en EVIDM contenant 0,25% de SVF. Après incubation 1 nuit à 37°C, les plaques sont centrifugées, puis l'hémoglobine libérée dans le surnageant est mesurée par l'intermédiaire de son activité peroxydasique en présence d'un substrat chromogénique, le 2,7- diaminofluorène (DAF). Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse, 100% correspondant à la lyse totale des hématies en NH4C1 (témoin 100%) et 0% au mélange réactionnel sans anticoφs (témoin 0%). La lyse spécifique est calculée en pourcentage selon la formule suivante :
(DO échantillon -DO témoin 0%) XI 00 = 0/ DO témoin 100% - DO témoin 0% /o Résultats :
Après traitement par le DEPC suivant les conditions décrites ci-dessus, environ 20% des molécules de l'anticoφs monoclonal EMAB5, constituant la fraction FNR, perdent leur capacité à se fixer au gel de Sépharose-protéine A. Sachant que l'histidine 435 est un acide aminé essentiel de la fixation des IgG à la protéine A, il paraît vraisemblable que les IgG de la fraction FNR se différencient de la fraction FR, retenue sur le gel de Sépharose-protéine A, par la modification du résidu His435. Dans le test de mesure de la fixation au récepteur CD 16 en présence d'antigène, la fraction FΝR présente les mêmes capacités que la fraction FR, capacités qui sont identiques à celles de l'anticoφs témoin (Fig. 4). De plus, la fixation des différentes fractions de l'anticoφs monoclonal EMAB5, modifié ou non par le DEPC, est très supérieure à celle de l'anticoφs monoclonal AD1, utilisé dans ce test comme témoin négatif. Ainsi, la modification des résidus d'histidine par le DEPC n'induit pas de changement dans la capacité de l'anticoφs monoclonal EMAB5 à se fixer aux hématies Rh(D+) ni au récepteur CD 16 présent à la surface de la lignée cellulaire Jurkat CD 16.
Par contre, l'activité fonctionnelle de l'anticoφs monoclonal EMAB5 modifié par le DEPC est très diininuée. Ainsi, la sécrétion d'IL-2 de la lignée Jurkat CD16 induite par les fractions FR et FNR de l'anticoφs monoclonal EMAB5 modifié par le DEPC représente, respectivement, 42,8% et 19.5% de la sécrétion induite par l'anticoφs témoin (Fig. 5). Les résultats de l'activité ADCC, exprimés en % de lyse réelle, montrent que l'activité de la fraction FNR est inférieure à celle de la fraction FR (Fig.6). D'autre part, la fraction FR présente une diminution de l'activité ADCC par rapport à l'anticoφs témoin, lorsque la quantité d'anticoφs ajoutée dans le puits est plus faible (< 20 ng/ml) et que la quantité d'IgG polyvalentes est de 2,5 mg/ml. En conclusion, bien qu'ayant conservé leur capacité à fixer l' antigène et le récepteur FcγRUI (CD16), les fractions d'anticoφs monoclonal EMAB5 modifiées par le DEPC présentent une activité fonctionnelle (ADCC, induction de la sécrétion de cytokine) diminuée. Cette diminution d'activité est plus marquée pour la fraction FNR, fraction ! qui présente vraisemblablement une modification du résidu His435. Ces résultats montrent donc que la conservation du résidu His435 est importante pour la préservation de l'activité fonctionnelle des anticoφs de type IgGl.
EXEMPLE 4 : Activité fonctionnelle des anticorps portant la double mutation His310-435Lys
La modification des résidus d'histidine par un agent chimique (DEPC ou autre) ne permet de maîtriser ni le degré, ni la localisation des modifications. Ainsi, les deux résidus d'histidine, His310 et His435, qui jouent un rôle essentiel dans la liaison du cation zinc à l'interface CH2-CH3 des IgGl, sont substituées par des résidus de lysine, par mutagénèse dirigée.
1. Obtention d'un anticoφs anti-R_h(D) portant la double mutation His310-435Lys Le vecteur d'expression contenant le cDNA codant la séquence d'acides aminés de la chaîne lourde de l'anticoφs anti-Rh(D) EMAB5, a servi de matrice pour la réalisation d'une double mutagénèse dirigée réalisée par PCR (« PCR-based site-directed mutagenesis »). Les quatre substitutions nucléotidiques suivantes ont été introduites: - C1229A et C1301G pour le changement du résidu His338 en Lys (position 310 selon la numérotation de Kabat), soit CAC-> AAG ; - C1674A et C1676G pour la mutation du résidu His463 en Lys (position 435 selon la numérotation de Kabat), soit CAC -> AAG. La séquence mutée a été séquencée et les résultats du séquençage sont donnés à le Tableau ni.
Tableau III : Séquences oligonucléotidique et polypeptidique de la chaîne lourde doublement mutée de l'anticoφs monoclonal EMAB5
Les résidus His338 et His461 de la chaîne lourde de l'anticoφs monoclonal EMAB5, qui correspondent aux résidus His310 et His435 selon la numérotation de Kabat, ont été substitués par des résidus de lysine.
Séquence du cDNA du double mutant His310-435Lys (SEQ ID No 1) atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgtccagtgtcaggtgcagctggtggagtctgggggag gcgtggtccagcctgggaggtccctgagactctcctgtacagcctctggattcaccttcaaaaactatgctatgcattgggtcc gccaggctccagccaaggggctggagtgggtggcaactatatcatatgatggaaggaatatacaatatgcagactccgtgaa gggccgatgcaccttctccagagacaattctcaggacaccctgtatctgcaactgaacagcctcagaccggaggacacggct gtgtattactgtgcgagacccgtaagaagccgatggctgcaattaggtcttgaagatgcttttcatatctggggccaggggaca atggtcaccgtctcttcagcctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcac agcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgaccagcgg cgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgg gcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtg acaaaactcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaa ggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgt ggtcagcgtcctcaccgtcctgaagcaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctccc agcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccggg atgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggaga gcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagct caccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaacaagtacac gcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatag
Séquence peptidique du double mutant His310-H435Lys (SEQ ID No 2) :
1 MEFGLSWVFL VAL RGVQCQ VQLVESGGGV VQPGRSLRLS CTASGFTFKΝ 51 YAMHWVRQAP AKGLEWVATI SYDGRΝIQYA DSVKGRCTFS RDΝSQDTLYL 101 QLΝSLRPEDT AVYYCARPVR SRWLQLGLED AFHI GQGTM VTVSSASTKG 151 PSVFPLAPSS KSTSGGTAAL GCLVKDYFPE PVTVSWΝSGA LTSGVHTFPA 201 VLQSSGLYSL SSWTVPSSS LGTQTYICΝV ΝHKPSΝTKVD KKVEPKSCDK 251 THTCPPCPAP ELLGGPSVFL FPPKPKDTLM ISRTPEVTCV WDVSHEDPE 301 VKFΝWYVDGV EVHΝAKTKPR EEQYΝSTYRV VSVLTVLKQD WLΝG EYKCK 351 VSΝKALPAPI EKTISKAKGQ PREPQVYTLP PSRDELTKΝQ VSLTCLVKGF 401 YPSDIAVEWE SΝGQPEΝΝYK TTPPVLDSDG SFFLYSKLTV DKSRWQQGΝV 451 FSCSVMHEAL HΝKYTQKSLS LSPGK*
Les cellules YB2/0, co-transfectées par électroporation avec le vecteur muté EMAB5- H-K338-K463-1 et le vecteur EMAB5- dhfr-K- Spel codant pour la chaîne légère de l'anticoφs EMAB5, sont cultivées en milieu RPMI additionné de 5% de SVF dialyse, 0,5% de G418 et 25 nM de Méthotrexate (MTX). Les clones sécrétant les plus forts taux d'IgG humaines sont cultivés en plaques de 24 puits en milieu sans MTX. Les surnageants, récoltés après 7 jours de culture, sont utilisés pour faire les essais décrits ci-dessous. 2. Mesure de la fixation du Fc des anticoφs au récepteur FcγRIII (CFC)
Ce test est réalisé sur les surnageants de culture, le taux d'IgG humaines contenu dans les surnageants étant déterminé par dosage ELISA.
Les puits d'une plaque de microtitration sont recouverts par des hématies Rh(D+) papaïnées. Les surnageants de culture contenant les anticoφs anti-Rh(D) natifs ou mutés et dilués à des concentrations variant de 7,8 à 500 ng/ml en IMDM + 2,5% SVF sont déposés en parallèle sur deux plaques de microtitration préalablement « coatées » par les hématies. Après 90 min. d'incubation à 37°C, les puits sont lavés. L'une des plaques, utilisée pour détecter les IgG fixées sur les hématies, est incubée en présence d'un anticoφs de souris anti-Fcγ humain marqué à la phosphatase alkaline (Jackson LnmunoReaserch Laboratories).
Dans l'autre plaque, les cellules Jurkat CD 16 sont ajoutées après 15 min. de contact à 37°C, la plaque est centrifugée en augmentant progressivement la vitesse et la durée de centrifugation jusqu'à negativer les témoins négatifs. Après centrifugation, la lecture des puits est effectuée et un score est donné en fonction de l'étalement de cellules Jurkat CD 16 dans le puits .
3. Mesure de l'activation du récepteur CD16 Dans une plaque de microtitration de 96 puits, on dépose successivement 50 μl de dilutions de surnageants de culture contenant des anticoφs anti-Rb.(D) natifs ou mutés, 50 μl d'une suspension d'hématies à 6.10s/ml, 50 μl d'une suspension de cellules Jurkat CD 16 à 1.106/ml et 50 μl d'une solution de PMA à 40 ng/ml. Toutes les dilutions ont été réalisées en milieu de culture EVIDM contenant 5% de SVF. Après 16 heures d'incubation à 37°C et 7% de CO2, la plaque de microtitration est centrifugée et la quantité d'IL-2 contenue dans le surnageant est dosée par un kit commercial (Duoset, R&D). Les taux d'IL-2 sécrétés sont exprimés en pg/ml.
Les résultats sont exprimés en % d'activation CD16, le taux d'IL-2 sécrétée en présence de l'anticoφs monoclonal témoin étant considéré égal à 100%
Les différents tests ont été réalisés sur les surnageants de culture contenant les anticoφs monoclonaux anti-Rh(D) mutés ou non. Les résultats du test CFC montrent que la double mutation His310-435Lys n'induit pas de modification de la fixation de l'anticoφs au récepteur FcγRIII, porté par la lignée cellulaire Jurkat CD16 (Fig.7). Alors que le clone non muté 6H11 (témoin négatif) présente une fixation au récepteur FcγRUI diminuée, les clones mutés 1C7, 2H11, 4G5 et 4H10 fixent le récepteur FcγRJJJ de manière similaire aux clones non mutés 16D11 et 11G5 (témoins positifs).
L'activation CD 16 a été réalisée sur les surnageants de culture de 4 clones mutés cités ci-dessus et de 3 clones non mutés (16D11, 11G5 et 24G9). Les résultats représentent la moyenne (+/- écart-type) des taux d'IL-2 sécrétée par les cellules Jurkat CD 16 en présence des clones non mutés (Natif) et des clones mutés (His310-435Lys). Les anticoφs mutés induisent une sécrétion d'_L-2 très dminuée par rapport à celle induite par les anticoφs natifs (Fig.8). Ainsi, les anticoφs mutés présentent une baisse de capacité à activer le récepteur FcγRIÏÏ de 50%.
EXEMPLE 5 : Etude de la fixation des anticorps monoclonaux mutés ou non sur le récepteur FcγRIII par cytométrie en flux.
L'influence de l'imidazole ainsi que l'impact des mutations His310-435Lys sur la fixation des anticoφs au récepteur FcγRUI (CD 16) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16 ont été évalués par cytométrie en flux.
1. Effet de l'imidazole 5.105 cellules Jurkat CD 16 sont incubées pendant 30 minutes en présence de différentes concentrations de l'anticoφs monoclonal EMAB5 dilué en tampon PBS contenant 0,5% d'albumine bovine (SAB) ou en tampon PBS-SAB 0,5% supplémenté à 50 mM en imidazole. Puis les cellules sont lavées en tampon PBS-SAB 0,5% et incubées en présence de F(ab')2 de souris anti-IgG humaine (H+L) marquée au FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories). Après 30 minutes d'incubation, les cellules sont lavées comme précédemment et la fixation de l'anticoφs EMAB5 est analysée par cytométrie en flux en utilisant un FACScalibur 4CA et le programme Cell Quest Pro (Becton Dickinson). 2. Fixation de l'anticoφs doublement muté 5.105 cellules Jurkat CD16 sont incubées pendant 30 minutes dans du tampon PBS- SAB 0,5% en présence de différentes concentrations d'anticoφs monoclonaux contenus dans des surnageants de culture. Puis les cellules sont lavées en tampon PBS- SAB 0,5% et incubées en présence de F(ab')2 de souris anti-IgG humaine (H+L) marquée au FITC . Après 30 minutes d'incubation, les cellules sont lavées comme précédemment et la fixation des anticoφs est analysée par cytométrie en flux en utilisant un FACScalibur 4CA et le programme Cell Quest Pro (Becton Dickinson).
Les résultats de la fixation de l'anticoφs EMAB5 sur le récepteur CD16 (FcγRIÏÏ) présent à la surface des cellules Jurkat CD 16 en présence ou non d'imidazole sont présentés en Fig.9.
Ainsi, l'addition de 50 mM d'imidazole dans le tampon d'incubation de Panticoφs avec les cellules provoque une diminution de fixation de l'anticoφs qui se traduit par une baisse significative du pourcentage de cellules marquées ; à la concentration en anticoφs de 1,5 μg/ml, la présence d'imidazole induit une diminution de 40% du nombre de cellules marquées.
L'imidazole est un réactif qui a la propriété de fixer les cations. Ainsi, en déprivant le milieu d'incubation des cations s par addition d'imidazole, la fixation de l'anticoφs sur le récepteur CD 16 est diminué.
La fixation sur le récepteur FcγRiπ des cellules Jurkat CD 16 de 3 anticoφs monoclonaux contenus dans des surnageants de culture est présentée à la Fig.10.
Ainsi, les résultats exprimés en pourcentage de cellules marquées en fonction de la quantité d'anticoφs ajoutée, montrent que les anticoφs 4G5 et 4H10, qui ont la double mutation His310-435Lys, se fixent significativement moins bien aux cellules Jurkat CD 16 que le clone 24G9, qui est l'anticoφs témoin non muté. Ces expériences illustrent bien que la fixation des anticoφs au récepteur CD 16 est affectée par l'absence de cations. Inversement, la présence de cations devrait améliorer la fixation de l'anticoφs sur le récepteur et de ce faite améliorer l'activité cytotoxique de l'anticoφs.
REFERENCES
Chapman TL, You I, Joseph M, Bjorkman PJ, Morrison SL, Raghavan M. Characterization of the interaction between the heφes simplex virus type I Fc receptor and immunoglobulin G. (1999) J. Biol. Chem. ; 274 : 6911-9.
Coφer AL, Sohi MK, Bonagura VR, Steinitz M, Jefferis R, Feinstein A, Beale D, Taussig MJ, Sutton BJ. Structure of human IgM rheumatoid factor Fab bound to its autoantigen IgG Fc reveals a novel topology of antibody-antigen interaction. (1997) Nat Stract Biol.; 4 : 374-81.
Deisenhofer J. Crystallographic refinement and atomic models of a human Fc fragment and its complex with fragment B of protein A from Staphylococcus aureus at 2.9- and 2.8-A resolution.
(1981) Biochemistry. 20, 2361-70.
Firan M, Bawdon R, Radu C, Ober RJ, Eaken D, Antohe F, Ghetie V, Ward ES. The MHC class I-related receptor, FcRn, plays an essential rôle in the maternofetal transfer of gamma-globulin in humans. (2001) Int. I munol. 13, 993-1002.
Maillard P, Lavergne JP, Siberil S, Faure G, Roohvand F, Petres S, Teillaud JL, - Budkowska A. Fcgamma receptor-like activity of hepatitis C virus core protein. (2004) J. Biol. Chem. 279, 2430-7.
Miles EW. Modification of histidyl residues in proteins by diéthylpyrocarbonate. (1977) Methods Enzymol. 47, 431-42. Otwinowski Z, Minor W. Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode..(1997).Methods Enzymol. 276, 307-26.
Sauer-Eriksson AE, Kleywegt GJ, Uhlen M, Jones TA. Crystal structure of the C2 fragment of sfreptococcal protein G in complex with the Fc domain of human IgG. (1995) Structure. 3, 265-78.
Shields RL, Namenuk AK, Hong K, Meng YG, Rae J, Briggs J, Xie D, Lai J, Stadlen A, Li B, Fox JA, Presta LG. High resolution mapping of the binding site on human IgGl for Fc gamma RI, Fc gamma Ru, Fc gamma RIII, and FcRn and design of IgGl variants with improved binding to the Fc gamma R. (2001) J Biol Chem. 276, 6591- 604).

Claims

REVENDICATIONS
1. Utilisation de cations métalliques divalents ou trivalents pour améliorer l'activité fonctionnelle d'anticoφs. .
2. Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que lesdits anticoφs sont des IgG humaines ou ayant une région Fc humaine.
3. Utilisation selon l'une de revendications 1 ou 2, caractérisée en ce que lesdits cations interagissent avec la région Fc desdits anticoφs.
4. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que lesdits cations participent au contrôle de l'ouverture de la région Fc desdits anticoφs.
5. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que lesdits cations favorisent la fixation desdits anticoφs aux récepteurs FcγR, notamment au récepteur FcγRHL
6. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que ledit cation est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium.
7. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisée en ce que ledit cation est le zinc.
8. Méthode pour potentialiser l'activité fonctionnelle des anticoφs via la région Fc, comprenant une étape consistant à ajouter une quantité appropriée d'au moins un cation métallique divalent ou trivalent dans le système biologique produisant les anticoφs ou dans une solution comprenant des anticoφs avant et/ou après purification ou encore dans la solution de conservation ou dans la formulation finale sous la forme d'une solution injectable des anticoφs.
9. Méthode selon la revendication 8, caractérisée en ce que ledit cation est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium.
10. Méthode selon la revendication 9, caractérisée en ce qu'on ajoute une concentration molaire en zinc au moins égale à la concentration molaire en anticoφs.
11. Anticoφs de classe IgG3 possédant un site de fixation pour un cation métallique divalent ou trivalent comprenant les résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat) sur sa région Fc créé par ingénierie moléculaire.
12. Anticoφs selon la revendication 11, caractérisé en ce que ledit site de fixation comprend le résidu Asn 434 et/ou le résidu His 433 (numérotation de Kabat).
13. Anticoφs selon l'une quelconque des revendication 11 ou 12, caractérisé en ce que ledit site de fixation est créé par substitution de l'Arg 435 par l'His 435.
14. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 12, caractérisé en ce que l'un au moins desdits résidus histidine est remplacé par un au moins des résidus choisis parmi la cystéine, l'acide aspartique et l'acide glutamique.
15. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, caractérisé en ce qu'il possède un cation métallique divalent ou trivalent fixé sur ledit site de fixation.
16. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, caractérisé en ce que ledit cation est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium.
17. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, caractérisé en ce que l'allotype dudit anticoφs est G3m(b) ou G3m(g).
18. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, caractérisé en ce qu'il possède une fixation au FC R-ÏÏI améliorée et une activité fonctionnelle améliorée par rapport à l'anticoφs natif.
19. Utilisation de l'anticoφs selon l'une quelconque des revendications 11 à 18 pour la préparation d'un médicament pour le traitement des pathologies comme la maladie hémolytique du nouveau-né, une pathologie virale, bactérienne ou parasitaire, une pathologie liée aux agents pathogènes ou toxines dérivées, listés comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Contrai, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis).
20. Composition pharmaceutique d'anticoφs thérapeutiques comprenant des cations divalents ou trivalents et au moins un excipient.
21. Composition selon la revendication 20, caractérisée en ce que lesdits anticoφs possèdent un cation métallique divalent ou trivalent sur les résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat).
22. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 20 à 21, caractérisée en ce que lesdits anticoφs sont les anticoφs des revendications 11 à 18 ou des IgG humaines ou ayant une région Fc humaine.
23. Composition pharmaceutique selon l'une quelconque des revendications 20 à 22, caractérisée en ce que les cations métalliques sont le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux.
24. Composition pharmaceutique selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit cation est le zinc, notamment de l'acétate de zinc, du bromure de zinc, du citrate de zinc, de Phydroxycarbonate de zinc, de Piodure de zinc, du L-lactate de zinc, du nitrate de zinc, du stéarate de zinc, du gluconate de zinc, du sulphate de zinc, du chlorure de zinc ou du chlorhydrate de zinc.
25. Composition pharmaceutique dans laquelle au moins 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ou encore 99% des anticoφs possèdent un cation métallique divalent ou trivalent lié, notamment lié au site comprenant les résidus His 310 et His 435 (numérotation de Kabat).
26. Composition selon la revendication 25, caractérisée en ce que ledit site comprend les résidus His 433 et/ou Asn 434 (numérotation de Kabat).
27. Composition selon l'une quelconque des revendications 25 ou 26, caractérisée en ce que ledit cation métallique est le zinc, le fer, le cuivre ou le cadmium, ou un mélange de plusieurs d'entre eux.
28. Solution comprenant un anticoφs monoclonal ou des anticoφs polyclonaux et une quantité appropriée en cation métallique divalent ou trivalent, en particulier une concentration en ions zinc au moins égale à la concentration en anticoφs, ladite solution étant adaptée pour une injection par voie intraveineuse, intramusculaire, ou sous-cutanée.
29. Utilisation d'ions zinc pour améliorer la cristallisation d'anticoφs thérapeutiques.
30. Test permettant d'évaluer l'efficacité d'un anticoφs comprenant l'étude de la conformation 3D du domaine impliquant His 310, His 435, His 433 et/ou Asn 434 (numérotation de Kabat ) telle que montrée à la figure 1 ou 2 ou encore un dosage de la teneur en Zinc desdits anticoφs, la présence de zinc étant une indication de l'efficacité de l'anticoφs.
31. Anticoφs possédant l'un au moins de ses résidus His 310 et His 435 modifié (numérotation de Kabat).
32. Anticoφs selon la revendication 31, caractérisée en ce que ladite modification est une mutation.
33. Anticoφs selon la revendication 32, caractérisé en ce que ladite mutation est une substitution par un acide aminé possédant une faible affinité pour lesdits cations métalliques .
34. Anticoφs selon la revendication 33, caractérisé en ce que ledit acide aminé est la lysine, l'alanine, la glycine, la valine, la leucine, l'isoleucine, la praline, la méthionine, le tryptophane, la phénylalanine, la serine ou la thréonine.
35. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 32 à 34, caractérisé en ce que les résidus His 310 et His 435 sont substitués par des résidus lysine.
36. Anticoφs selon la revendication 31, caractérisé en ce que la modification est effectuée par le DEPC.
37. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 31 à 36, caractérisé en ce qu'ils appartiennent à la sous-classe des IgGl .
38. Anticoφs selon l'une quelconque des revendications 31 à 37, caractérisé en ce qu'ils possèdent une activité fonctionnelle diminuée par rapport au même anticoφs non modifié.
39. Utilisation des anticoφs 31 à 38 pour la préparation d'un médicament destiné à la prévention du rejet de greffe ou au traitement d'une pathologie choisie parmi le tétanos, la diphtérie, ou provoquée par un agent pathogène ou toxine dérivée, listé comme étant particulièrement dangereux dans les cas de bioterrorisme (classification des Centers for Disease Confrol, CDC), notamment l'anthrax (Bacillus anthracis), le botulisme (Clostridium botulium), la peste (Yersinia pestis), la variole (Variola major), la tularémie (Francisella tularensis), les fièvres hémorragiques virales (liées aux filovirus -Ebola, Marburg et aux arenavirus -Lassa, Machupo), la toxine epsilon de Clostridium perfringens, la brucellose (Brucella species), la melioidose (Burkholderia mallei), la toxine de ricin (Ricinus communis)..
40. Utilisation de l'anticoφs selon l'une quelconque des revendications 31 à 38 pour la préparation d'un médicament en remplacement des IgG4.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2894982A1 (fr) * 2005-12-16 2007-06-22 Lab Francais Du Fractionnement Procede de preparation d'anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs
FR2942799B1 (fr) * 2009-03-06 2011-02-25 Lfb Biotechnologies Anticorps monoclonal anti-rhesus d
EP2787006B1 (fr) * 2013-04-02 2018-02-28 Miltenyi Biotec GmbH Anticorps anti-CD8 dont la liaison dépend de Ca2+

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007080277A1 (fr) * 2005-12-16 2007-07-19 Lfb Biotechnologies Procede de preparation d' anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2081213A1 (fr) * 1990-05-08 1991-11-09 Richard A. Lerner Proteines capables de liaison avec les metaux
US5898067A (en) * 1997-02-07 1999-04-27 Novo Nordisk A/S Crystallization of proteins
FR2807767B1 (fr) * 2000-04-12 2005-01-14 Lab Francais Du Fractionnement Anticorps monoclonaux anti-d

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007080277A1 (fr) * 2005-12-16 2007-07-19 Lfb Biotechnologies Procede de preparation d' anticorps selectifs des recepteurs fc activateurs

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
KUMPEL B M: "Efficacy of RhD monoclonal antibodies in clinical trials as replacement therapy for prophylactic anti-D immunoglobulin: more questions than answers.", VOX SANGUINIS AUG 2007 LNKD- PUBMED:17683353, vol. 93, no. 2, August 2007 (2007-08-01), pages 99 - 111, XP055002584, ISSN: 0042-9007 *

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