EP1537194A1 - Procede de preparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante - Google Patents

Procede de preparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante

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EP1537194A1
EP1537194A1 EP03769562A EP03769562A EP1537194A1 EP 1537194 A1 EP1537194 A1 EP 1537194A1 EP 03769562 A EP03769562 A EP 03769562A EP 03769562 A EP03769562 A EP 03769562A EP 1537194 A1 EP1537194 A1 EP 1537194A1
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EP
European Patent Office
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hydrolysis
seeds
fatty acids
lipase
homogenization
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EP03769562A
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German (de)
English (en)
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EP1537194B1 (fr
Inventor
Zéphirin Mouloungui
Eric Mechling
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Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
Original Assignee
Institut National de la Recherche Agronomique INRA
Institut National Polytechnique de Toulouse INPT
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11C—FATTY ACIDS FROM FATS, OILS OR WAXES; CANDLES; FATS, OILS OR FATTY ACIDS BY CHEMICAL MODIFICATION OF FATS, OILS, OR FATTY ACIDS OBTAINED THEREFROM
    • C11C1/00—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids
    • C11C1/02—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils
    • C11C1/04—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis
    • C11C1/045—Preparation of fatty acids from fats, fatty oils, or waxes; Refining the fatty acids from fats or fatty oils by hydrolysis using enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/02—Pretreatment
    • C11B1/025—Pretreatment by enzymes or microorganisms, living or dead
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C11B—PRODUCING, e.g. BY PRESSING RAW MATERIALS OR BY EXTRACTION FROM WASTE MATERIALS, REFINING OR PRESERVING FATS, FATTY SUBSTANCES, e.g. LANOLIN, FATTY OILS OR WAXES; ESSENTIAL OILS; PERFUMES
    • C11B1/00—Production of fats or fatty oils from raw materials
    • C11B1/02—Pretreatment
    • C11B1/04—Pretreatment of vegetable raw material

Definitions

  • the present invention relates to the field of the preparation of fatty acids from the lipids contained in the seeds of certain plants.
  • Fatty acids are carboxylic acids with varying degrees of unsaturation and a wide variety of molecular weights. Fatty acids are used in the manufacture of a wide variety of products, such as soaps and surfactants, lubricants, paints and coatings, and candles, as well as in a wide variety of other products. agriculture and industry, especially in the food industry.
  • fatty acids are produced by chemical hydrolysis of an oil, for example by the action of heat and pressure in the presence of water, in order to break the bonds between the acid and the alcohol constituting the lipids. contained in oils.
  • fatty acids have been produced by chemical synthesis, a significant part of these is prepared from natural oils. Also known are processes for the preparation of fatty acids by hydrolysis of a medium containing lipids under the action of a lipase capable of hydrolyzing the lipids respectively into fatty acids and alcohols, mainly glycerol.
  • a lipase capable of hydrolyzing the lipids respectively into fatty acids and alcohols, mainly glycerol.
  • the hydrolysis of olive oil using Candida rugosa lipase has been described by LINFIELD et al. (LINFIELD W M et al., 1984, J. AM. Oil Chem. Soc. Vol. 61: 1067-1071).
  • the hydrolysis required a preliminary treatment of the starting substrate oil with a bleaching earth.
  • RAO et al. (RAO KSVA et al., 1992, Res. Ind., Vol. 37:36) describe a method of hydrolysis using a castor bean ground, in which the endogenous lipase of the seed, which is released from intracellular spherosomes by the grinding of the seeds is used to hydrolyze the endogenous lipids of these crushed seeds.
  • JACHMANIAN et al. (JACHMANIAN I et al., 1995, J Agric. Food Chem. Vol. 43 (11): 2992-2996) studied the lipid hydrolysis of a comminuted ground seed rapeseed, under the action of lipase endogenous.
  • the applicant has endeavored to develop an improved process for the preparation of fatty acids, by hydrolysis of the lipids contained in the seeds of a plant, which is simple, rapid, and which makes it possible to obtain a high yield. hydrolysis.
  • the applicant has endeavored to develop an improved process which does not require an oil extraction step prior to bringing the lipase into contact with the lipids, the hydrolysis of which, respectively in fatty acids and liquor, is sought after.
  • an exogenous lipase placed in a heterogeneous solid / liquid substrate reaction medium which reaction medium is subjected to a drastic homogenization treatment at high pressure or by ultrasound, retains its catalytic activity. hydrolysis of the lipids contained in the substrate solution thus treated.
  • an exogenous lipase is capable of carrying out a complete or almost complete hydrolysis of the lipids present, in this heterogeneous solid / liquid reaction medium, in the form of an emulsion consisting of droplets of oil dispersed in an aqueous medium, and that the fatty acids resulting from the hydrolysis of the lipids contained in said emulsion could be easily recovered, for example by simple extraction.
  • the subject of the present invention is a process for preparing fatty acids by in situ hydrolysis of the lipids contained in the seeds of a plant, characterized in that it comprises the following stages: a) grinding of the seeds in an aqueous medium up to obtaining a suspension of solid particles with a diameter of less than 500 ⁇ m; b) adding an exogenous lipase to the suspension obtained in step a); c) homogenization of the suspension containing the lipase until a homogenate consisting of an emulsion of the lipids initially contained in the seeds is obtained, mixed with the solid particles of the seeds; d) hydrolysis of the lipids contained in the homogenate obtained in step c) at a temperature between 15 ° C and 55 ° C, for a time between 15 minutes and 5 hours; e) recovery of the fatty acids resulting from the hydrolysis of the lipids carried out in step d).
  • step a) of grinding is carried out using a knife mill of the "Waring Blendor" type in an aqueous medium.
  • obtaining solid particles with an average diameter of less than 500 ⁇ m can be obtained by a grinding time of the seeds in the aqueous medium of a few minutes, preferably between 1 and 10 minutes and very preferably between 2 and 7 minutes, for example for a period of 5 minutes.
  • the aqueous grinding medium is preferably water but can also be any buffer solution, such as for example the two buffer solutions below:
  • 0.1 M phosphate buffer obtained from sodium dihydrogen phosphate dihydrate NaH 2 PO 4 , 2H 2 0 and balanced at pH 7.0 with sodium hydroxide Na OH. • Tris (hydroxymethyl) aminomethane buffer adjusted to pH 7 with hydrochloric acid. Other hydrolysis media: reactivity in 0.1 M NaCl medium.
  • a buffer solution is not preferred since a buffer solution is capable of introducing undesirable contaminating compounds which it is difficult or long to remove, in the rest of the process.
  • the seeds are added to the aqueous medium in a proportion of less than 20%, preferably less than 15%, by total weight of the aqueous medium containing the seeds.
  • step a) of grinding is difficult, if not impossible, to be carried out, because of a too high viscosity of the aqueous medium.
  • step e) of recovery of the fatty acids is difficult to achieve optimally, due to a proportion of solid phase too high.
  • the proportion by weight of the seeds, relative to the total weight of the aqueous medium containing the seeds is less than 15%.
  • an optimal kinetics of the hydrolysis reaction and a degree of hydrolysis of at least 95% of the lipids are obtained whatever the proportion by weight of seeds used, for a weight ratio of lipase / weight of seeds given.
  • the hydrolysis kinetics and the degree of hydrolysis of the lipids contained in the seeds were identical with an aqueous grinding medium containing respectively 10% and 13.5% by weight of seeds, relative to the total weight aqueous medium containing the seeds, for an identical lipase weight / seed weight ratio.
  • the exogenous lipase added to step b) in the heterogeneous liquid / solid suspension obtained at the end of step a) can be of any kind. It can be a lipase obtained from microorganisms of the genera Rhizopus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Pseudomonas, Humicola, Thermomyces or Penicillium or from the lipases of plants.
  • the exogenous lipase is added in an amount of 100 to 500 units, preferably from 150 to 400 units of lipase, per gram of the weight of the seeds treated in step a).
  • One unit of lipase corresponds to the quantity of lipase required to release 1 ⁇ mol of fatty acid from glyceride, per minute, under optimal conditions of catalytic activity of the enzyme.
  • step c) the homogenization of the liquid / solid suspension initially containing coarse seed particles of less than 500 ⁇ m is carried out until a homogenate consists of an emulsion of the lipids initially contained in the seeds, mixed with the solid particles of the seeds.
  • Step c) of homogenization of the heterogeneous liquid / solid suspension and containing the exogenous lipase can be carried out by any means known per se.
  • step c) of homogenization is carried out by homogenization under pressure or even by homogenization by sonication.
  • a high pressure homogenizer can be used such as the Lab 1000 type homogenizer sold by the company APV (Evreux, France), according to the manufacturer's recommendations.
  • the homogenization under pressure is carried out at a pressure of between 25 and 1000 bars, preferably between 100 and 500 bars, for example at 150 bars.
  • the pressure jump caused in the middle produces a shock wave contributing to the disintegration of the seed cells and disperses the lipids contained in the seed.
  • step c) of homogenization will be carried out by two successive cycles of homogenization under pressure.
  • step c) of homogenization can be carried out by 1 to 4 cycles of passages in a high pressure homogenizer, optimal results are obtained with two cycles of homogenization at high pressure.
  • the fatty acid extraction yield at the end of the process is increased without drastically affecting the activity of the exogenous lipase.
  • step c) of homogenization of the suspension containing the exogenous lipase can be carried out by sonication of said suspension until a homogenate consisting of an emulsion of the lipids initially contained in the seeds is obtained. , mixed with the solid particles of the seeds.
  • step c) of homogenization by sonication the solid particle suspension to which the exogenous lipase has been added is treated by ultrasound at a power greater than 20 Watts.
  • the frequency of ultrasound does not seem to be an essential parameter of treatment.
  • an ultrasonic power of between 20 and 200 Watts is used, and very preferably between 20 and 100 Watts.
  • the duration of the homogenization step by sonication is advantageously between 10 seconds and 10 minutes, preferably between 30 seconds and 5 minutes.
  • a sonication time of 30 seconds at the power of 64 Watts an average kinetics of lipid hydrolysis was observed, leading to a degree of hydrolysis after 120 minutes of reaction greater than 85%.
  • a sonication time of 1 minute considerably improves the reaction kinetics and a degree of hydrolysis greater than 90% is reached after 120 minutes of reaction. Longer sonication times further increase the reaction kinetics without significantly increasing the final degree of hydrolysis.
  • stage c) of homogenization by high pressure homogenization or by homogenization by sonication, the degrees of hydrolysis of the lipids obtained at the end of the process are comparable. They are generally greater than 95%, under the optimal conditions indicated above.
  • the results obtained in the examples show that the final yield of extraction of fatty acids resulting from the hydrolysis of lipids is substantially the same, whether step c) of homogenization has been carried out by homogenization under pressure or else by homogenization by sonication.
  • step c) shows that this homogenate is formed of lipid droplets which aggregate into small clumps forming an emulsion, the homogenate also containing many solid debris from the seeds, in particular seed shell debris as well as cellular debris.
  • the size of the fatty drops is on average between 5 and 15 ⁇ m and their surface appears fine and smooth, which suggests that the stabilization of the oil / water interface of the droplets does not involve solid particles.
  • the homogenate contains the lipids initially contained in the seeds in the form of a liquid / liquid emulsion with the water present in the aqueous medium that constitutes said homogenate.
  • Step d) of hydrolysis of the lipids contained in the homogenate obtained in step c) is carried out by incubating the homogenate at a temperature between 15 ° C and 55 ° C, for a period between 15 minutes and 5 hours.
  • the exogenous lipase catalyzes the hydrolysis reaction of the lipids, in particular the triglycerides, contained in the form of a liquid / liquid emulsion in the homogenate, respectively in the different fatty acids constituting said lipids, on the one hand , and various alcohols, in particular glycerol, with which said fatty acids were esterified in the spherosomes of the seeds.
  • the process for preparing fatty acids by in situ hydrolysis of the invention can therefore be carried out at room temperature without requiring heating of the reaction medium consisting of the homogenate obtained in step c), which makes this process simple to implementation and also inexpensive.
  • step d) of hydrolysis at low temperature, for example between 20 ° C. and 30 ° C. makes it possible to avoid, or at the very least to reduce, the simultaneous hydrolysis of other compounds. side effects such as glucosinolates, the sulfur hydrolysis products of which cause thyroid problems in humans and animals.
  • myrosinase which is the enzyme responsible for the hydrolysis of glucosinolates, is not very active, the optimal catalytic activity of this enzyme being between
  • step d) of lipid hydrolysis can be adapted as a function of the reaction temperature chosen.
  • Step c) homogenization in fact allows a physical rupture of the macroscopic structure of the seeds and a release in the aqueous medium of the lipids initially contained in the spherosomes, which are intracellular vesicles surrounded by a membrane.
  • stage c) of homogenization the lipase is localized over the entire surface of the oil / water interface of the lipid droplets generated, which allows rapid and as complete hydrolysis of said lipid substrates. which are readily available to the enzyme.
  • Stage e) of recovery of the fatty acids resulting from the hydrolysis of the lipids produced in stage d) can be carried out by any method of extraction of the lipids known to those skilled in the art.
  • step e) of recovery of fatty acids comprises the following steps: e1) separation of the fatty acids from the other constituents of the homogenate obtained in step d), in the form of an emulsion; e2) extraction of fatty acids from the emulsion, with a solvent.
  • the fatty acids are separated from the other constituents of the homogenate obtained in step d) by obtaining a liquid medium with three phases, respectively a solid phase, a phase aqueous and a lipid emulsion phase, by centrifugation of the homogenate, then recovery of the lipid emulsion phase.
  • Obtaining the three-phase liquid medium is preferably carried out by centrifugation of the heterogeneous liquid / solid reaction medium at the end of step d) of hydrolysis. If necessary, several successive centrifugations can be carried out in order to improve the yield of the process.
  • a three-phase medium comprising respectively (i) a solid pellet comprising essentially the solid debris from the seeds, shells or cellular debris, (ii) an aqueous phase and (iii) an oily phase under the shape of an emulsion.
  • the oily phase in the form of an emulsion constitutes the phase enriched in fatty acids resulting from the hydrolysis of the lipids initially contained in the seeds. This oily phase represents approximately 7 to 10% by weight of the total weight of the reaction medium obtained at the end of step d) of hydrolysis.
  • the extraction of fatty acids is carried out with a solvent chosen from water, an alcohol, an ester, an organic carbonate or a ketone.
  • a solvent chosen from water, an alcohol, an ester, an organic carbonate or a ketone.
  • Water is preferably used for the extraction of fatty acids in the form of an emulsion.
  • Ethanol is preferably used for the extraction of fatty acids and the obtaining of concentrates, as well as for the subsequent transformation of fatty acids into ethylenic esters, for various applications, in particular in solvents, lubricants, cosmetics. , preservatives, etc.
  • an organic ester or carbonate is used for the subsequent transformation of the fatty acids, in situ or ex situ.
  • the solvent precipitates the proteins and phospholipids contained in the emulsion and solubilizes the fatty acids.
  • the fraction of precipitated compounds and the fraction of solubilized fatty acids can be easily separated, for example by centrifugation.
  • the solvent used is ethanol, which can for example be added to the emulsion containing fatty acids in an amount of 1.5 to 2 volumes of ethanol per volume of emulsion.
  • Step e2) of extracting the fatty acids from the emulsion using a solvent is advantageously followed by a step e3) of drying the extraction solution containing the fatty acids.
  • the drying step can be carried out by simple evaporation, at atmospheric pressure or even under vacuum until a complete drying of the fatty acids is achieved.
  • Figure 1 illustrates the kinetics of in situ enzymatic hydrolysis of endogenous lipids of rapeseed by lipase from Candida rugosa with a homogenization step carried out by sonication.
  • Figure 2 illustrates the kinetics of enzymatic hydrolysis in situ of endogenous lipids of rapeseed by lipase from Candida rugosa: comparison of cell breaking tools, sonication or high pressure homogenization.
  • Figure 3 illustrates the cumulative percentage of total lipids extracted by centrifugation of media from in situ enzymatic hydrolysis of rapeseed oil, after sonication or homogenization
  • Figure 4 illustrates the comparative kinetics of enzymatic hydrolysis in situ of endogenous lipids of rapeseed by lipase from Candida rugosa (1): effect of the dry matter content in the medium
  • Figure 5 illustrates the comparative kinetics of in situ enzymatic hydrolysis of endogenous lipids from rapeseed by lipase from Candida rugosa (2): effect of the ultrasonic power dissipated in the medium.
  • Figure 6 illustrates the comparative kinetics of in situ enzymatic hydrolysis of endogenous lipids from rapeseed by lipase from Candida rugosa (3): effect of the duration of the ultrasonic treatment.
  • Figure 7 illustrates the comparative kinetics of in situ enzymatic hydrolysis of endogenous lipids from rapeseed by lipase from Candida rugosa (4): effect of temperature on the reaction rate.
  • Figure 8 illustrates the comparative kinetics of in situ enzymatic hydrolysis of the endogenous lipids of rapeseed by the lipase from Candida rugosa (5): effect of the amount of lipase introduced into the medium.
  • Figure 9 illustrates the in situ enzymatic hydrolysis of endogenous lipids from rapeseed by lipase from Candida rugosa: effect of the amount of lipase introduced into the medium on its specific activity and initial speed.
  • Figure 10 is a light micrograph of the homogenate at the end of the lipid hydrolysis step.
  • Figure 11 is a photo micrograph of light microscopy (magnification x1000) of the homogenate at the end of the lipid hydrolysis step
  • Figure 12 is a light micrograph of the homogenate at the end of the lipid hydrolysis step
  • Colza seeds are added with water so as to obtain the proportions 1: 8 by mass, respectively.
  • This mixture is then poured into a household mixer of the “Warring blendor” type. The grinding is then carried out for 5 minutes, taking care to bring back to the bottom of the bowl the particles which adhere to the walls.
  • the lipase from Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) is dissolved in water so as to obtain a concentration of 10 mg / ml.
  • Ninety grams of the ground seed previously obtained are added with 10 grams of enzyme solution in a 150 ml double-coated beaker. At this point, the medium contains
  • the mixture obtained after dry grinding or in the presence of water is then treated by ultrasound (Vibracell, Bioblock Scientific, Illkirch, France) 5 minutes at 59 W (70% of active period).
  • the medium is cooled during the sonication by circulation of cold water in the wall of the beaker. After this step, the stream of cold water is immediately replaced by that from a bath thermostatically controlled at 37 ° C.
  • the medium is then allowed to evolve with magnetic stirring (250 rpm) for 120 minutes.
  • the reaction is monitored by a series of samples performed at predetermined times. During these, 1.5 ml of medium are transferred to a tube containing 1 ml of hydrochloric acid and 5 ml of chloroform.
  • This tool was chosen for its compatibility with work on an industrial scale in addition to its robustness. Its principle of operation consists in forcing the liquid to emulsify by means of a constant flow pump, through the space of a few ⁇ m left free by a back pressure valve. The pressure upstream of the latter then becomes very high, and the sudden decompression downstream of this valve leads to the rupture of macrostructures such as the cells.
  • the detailed description of the mode of operation of this type of apparatus has also been described in detail by Lecluse WJ (1979, High pressure homogenizations, preparation of emulsions and dispersions. Chemistry Information 191, 1-8). This process has the advantage of being continuous and of requiring homogeneous treatment of the entire medium, unlike sonication for which the particles only pass into the active zone periodically.
  • A. MATERIALS AND METHODS Lipase is added to the medium after grinding the seeds for 5 minutes in the presence of water.
  • the sonication stage is replaced by two homogenization cycles with a Lab 1000 homogenizer (APV, Evreux, France) equipped with two homogenization stages.
  • the pressure of the first homogenization stage is adjusted to 150 bars, that of the second stage being fixed at 20 bars, in agreement with the results published by Wâsche et al. (1993) and with the supplier's recommendations.
  • the seed content of the medium is 13.5% by mass and the lipase / seeds ratio is fixed at 333 UL / g of seeds, in order to be able to compare the kinetics measured with those already obtained before with the use of ultrasound.
  • the stopwatch is started with the addition of lipase, ie just before the start of the passage of the medium in the homogenizer.
  • MG monoglycerides
  • DG diglycerides
  • TG triglycerides
  • UL Lipase unit, corresponding to the quantity of lipase necessary to release 1 ⁇ mol. fatty acid per minute, from glycerides under optimal operating conditions.
  • Inhibition reversible or irreversible loss of part of the activity of an enzyme following a physical phenomenon or due to an interaction with one or more molecules
  • DH degree of hydrolysis, defined as the percentage of ester bonds broken during the hydrolysis of the oil into fatty acids.
  • AS Specific activity, defined as the rate of formation of fatty acids in relation to the quantity of enzyme preparation introduced.
  • a liter of medium at 15% by mass is prepared by passing for 5 minutes in the mixer 150g of rapeseed seeds in 850mL of H 2 0. After passing through the mixer, the quantity of medium recovered is weighed in order to estimate the quantity seeds (15% of the mass recovered).
  • the hydrolysis is carried out with the enzyme “LIPOLYVE CC”, the concentration of which is 30 units / mg.
  • the enzyme solution is prepared in water so as to obtain, after mixing with the medium, an enzyme concentration of the order of 300 units per gram of seeds and a concentration of seeds in the medium of the order of 13.5% by mass.
  • the enzyme solution is added to the medium and the whole is passed to the 2-cycle homogenizer at 350 bars.
  • the homogenate (medium passed to the homogenizer) thus recovered is placed in a reactor at 37 ° C with stirring at 250 rpm for two hours.
  • the hydrolyzate (homogenate after 2 hours of hydrolysis at 37 ° C) is finally stored at 4 ° C.
  • Emulsion recovery protocol :
  • the emulsion is prepared from the hydrolyzate by centrifugation. After stirring, the hydrolyzate is centrifuged for 5 minutes at maximum speed. During the last emulsion preparation, the hydrolyzate was centrifuged for 5 minutes at 7600 G. During centrifugation, the different phases are separated and it is possible to recover the emulsion by filtration on a fine mesh. The pellet is then resuspended in the aqueous phase before being centrifuged a second time under the same conditions. The emulsion formed is thus recovered two other times.
  • the determination of the dry matter makes it possible to calculate the amount of water contained in the emulsion.
  • the amount of dry matter is calculated by weighing a certain volume of emulsion (about 4 ml) before and after passing 6 hours in an oven at 103 ° C. To avoid loss of emulsion by spraying, the weighed emulsion volume is mixed with sand before being placed in the oven. Always to avoid losses, the weighings are carried out with the aluminum dish containing the emulsion, with the sand and with the spatula used to mix the sand and the emulsion.
  • the amount remaining after 6 hours at 103 ° C represents the dry matter.
  • the difference in weight tells us about the amount of water in the emulsion.
  • the oil is expected to contain the quantity of fatty acids resulting from the hydrolysis of the triglycerides of the lipids of the crushed seeds.
  • the oil content of our emulsion is determined according to a "simplified method by extraction with Phexane" (Standard V 03-908). For safety reasons, cyclohexane was used and not Phexane.
  • This content is determined on the dry matter allowing us to calculate the amount of water contained in the emulsion.
  • the aluminum dish containing the dry matter and the spatula. were placed in the cartridge of the soxhlet.
  • Oil content ((mi - mo) / m eSs ai) x 100 mo: balloon tare in grams mi: balloon mass after evaporation of the cyclohexane in grams rriessai: emulsion mass, in grams, used to obtain the dry matter
  • Oil content of the emulsion 58.3 + /. 1.3%
  • the determination of the proteins contained in the emulsion is done indirectly by determination of nitrogen according to the Kjeldahl method: mineralization and steam distillation.
  • test portion of approximately 300 mg (weighed to the nearest mg) placed in a mineralization tube
  • indicator solution (boric acid 4%, bromocresol green 1x10 "3 %, methyl red 7x10 " %)
  • V HCI volume used for titration in mL.
  • m mass of emulsion sample in milligrams
  • test sample of approximately 1.2g of emulsion placed in a crucible • addition of 0.1g of previously calcined magnesium oxide • passage of 2 hours in the oven at 900 ° C to obtain white ashes
  • the phosphorus assay was carried out on three independent emulsions.
  • Phospholipid content of the emulsion 3.8 + /. 0.1%
  • the emulsion is composed of: ... 32.5% H 2 O "7.0.6%
  • the emulsion has a density of 0.943 +/- . 0.004%
  • the media used to carry out these tests are obtained by homogenization under pressure or by homogenization by sonication, as indicated in Examples 1 and 2
  • the homogenization by sonication was carried out by continuous sonication at the power of 82 W.
  • the pellet is weighed before being supplemented with distilled water until the initial mass of treated medium is obtained. The whole is then homogenized by vigorous stirring for 30 seconds. This new suspension is then treated as the initial medium by centrifugation and then extraction of the fat from the phases higher than the solvent. In total, 4 cycles are carried out in this way, the last pellet obtained being also extracted with chloroform and methanol after being resuspended in 15 ml of distilled water. A balance on lipids can thus be carried out.
  • the cumulative percentage of total lipids extracted after each washing cycle is presented in FIG. 3.
  • the comparison of the results obtained for a hydrolysis involving sonication or homogenization shows us an identical extractability of lipids during the first cycle.
  • the total percentage of lipids extracted during the following cycles is significantly higher if the medium has undergone a pressure homogenization treatment. Indeed, a difference of 6.5% is observed on the total yield.
  • This difference shows that the homogenization of the medium at high pressure releases a greater quantity of fatty acids in the form of an emulsion. This suggests that cell wall disruption is more extensive than in experiments involving sonication.
  • the similarity between the extraction yields during the first centrifugation cycle would seem to indicate that the interactions between the particles of the emulsion and the cellular debris are roughly equivalent in the two cases.
  • the preparation of the hydrolysis media by grinding followed by homogenization makes it possible to clearly improve the total yield of extraction of the fatty acids produced during the reaction.
  • the difference measured after 4 washing / centrifugation cycles is 6.5%.
  • the extractability observed after the first aqueous extraction cycle suggests that the interactions between the emulsion droplets and the cell debris from the pellet are of the same order in the case of the use of ultrasound or homogenization. under pressure.
  • the proportion of seeds introduced into the medium directly conditions the rate of filling of the reactor with glyceride substrate. Indeed, during the increase in the seed content of the medium, it is logically enriched in glycerides and proteins, which represent respectively 46.5 and 18% of the fresh mass of the rapeseeds used. the quantity of seeds in the medium was varied within the limits of the possibilities of the material. The response measured during this study is the change in the degree of hydrolysis (DH) over time.
  • DH degree of hydrolysis
  • the reaction kinetics measurement protocol is carried out using wet grinding as a pretreatment step before sonication. So that this last step of the process is not limiting, the ultrasonic probe was adjusted to its maximum power, ie 82 W with an active period of 100%. Two seed contents were tested: 10 and 13.5%. Beyond this, the ultrasonic probe heats up, which presents a risk of damage to the equipment. As before, each test was carried out three times to ensure reproducibility.
  • the kinetics obtained, presented on figure 4, are superimposable, except for experimental errors.
  • the hydrolysis rate is rapid during the first 30 minutes, then gradually slows down until reaching a level after 60 minutes of reaction, for an optimal DH value of 95%.
  • a mixture containing 15% of rapeseed in distilled water is ground for 5 minutes in a household blender of the "Warring blendor" type.
  • the lipase from Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) is dissolved in water so as to obtain a concentration of 10 mg / ml.
  • Ninety grams of the ground seed previously obtained are added with 10 grams of enzyme solution in a 150 ml double-coated beaker.
  • the medium contains 13.5% by mass of rapeseed seeds and an amount of lipase corresponding to 333 UL / g of seeds.
  • the mixture is then treated by ultrasound (Vibracell, Bioblock Scientific, Illkirch, France) 5 minutes at 12, 28, 47, 64 or 82 W (100% active period) according to the tests.
  • the medium is cooled during the sonication by circulation of cold water in the wall of the beaker. After this step, the stream of cold water is immediately replaced by that from a bath thermostatically controlled at 37 ° C.
  • the medium is then allowed to evolve with magnetic stirring (250 rpm) for 120 minutes.
  • the Monitoring of the reaction is ensured by a series of samples taken at predetermined times. During these, 1.5 ml of medium are transferred to a tube containing 1 ml of hydrochloric acid and 5 ml of chloroform. After vigorous stirring, the organic phase is removed, dried with anhydrous Na 2 S0 4 , then diluted 10 times before being injected with GPC for analysis. Each test was carried out three times to determine the error on the experimental value
  • EXAMPLE 7 Optimal conditions for homogenization by sonication - Duration of sonication.
  • the sonication period was alternately fixed at 30 sec, 1 min., 2 min., 3 min. and 5 min for an ultrasonic power set at 64 W.
  • the evolution of the DH as a function of time is used as a response, each test being repeated three times to ensure its reproducibility.
  • the duration of sonication of the medium is an important parameter, which plays a positive role in reactivity.
  • the explanation of these observations is close to that advanced to justify the influence of the ultrasonic power applied to the medium.
  • a maximum is observed for a treatment duration greater than or equal to 3 minutes, beyond which there is no longer any improvement in the interactions between the lipase and its substrate.
  • the ultrasonic power dissipated in the medium is 82 W and the temperature is set at 22, 27, 32, 37 or 42 ° C.
  • the different kinetics of DH obtained are compared with each other. Each test is repeated 3 times and a standard deviation is calculated.
  • the amount of lipase is a second determining factor for reactivity.
  • the determination of this parameter thus makes it possible to determine the influence of the enzyme / seed ratio on the reactivity and on the efficiency of the lipase, in particular with regard to inhibitions of the enzyme by compounds of the seed.
  • DH as a function of time is all the faster the higher the quantity of enzyme introduced. On the other hand, no optimum reactivity as a function of the amount of lipase added seems to be achieved.
  • [AG] is the molar concentration of AG
  • [MG] is the molar concentration of MG
  • [DG] is the molar concentration of DG
  • [TG] is the molar concentration of TG.
  • the denominator represents total concentration of fatty acid radicals, whether in free form or linked to glycerol. This sum therefore remains constant, whatever the DH. The difference in DH between 0 and 15 minutes is therefore equal to the quantity of fatty acids produced during this period, normalized by the quantity of total fatty acid radicals.
  • the media observed are prepared according to the same protocol as during the study of the reactivity presented in the previous example.
  • the lipase / seed ratio is fixed at 333 UL / g of seeds.
  • Cellular breaking is for its part ensured by wet grinding for 5 minutes followed by a period of 5 min. sonication at 82 W.
  • the proportion of seed introduced is 13.5% by mass.
  • the media thus obtained are left to react until complete hydrolysis.
  • Figure 10 illustrates the various constituents of the medium as well as its organization after grinding and hydrolysis. It is within this that the lipase evolves and reacts with the lipids of the seed.
  • the fatty acids appear in the form of a granulation present over the entire surface observed. It is noted that the lipid droplets do not seem to disperse but rather aggregate in small clusters. This phenomenon is important for the efficiency of the extraction step because it indicates that surfactants of all kinds which garnish fatty globules do not create repulsion between them. In the event of difficulties in breaking the emulsion, only the rigidity of the interface can be called into question.
  • FIG. 11 This photographer was taken from the fatty layer separated by centrifugation, at a total magnification of 1 OOOx.
  • This illustration allows to observe more precisely the lipid droplets.
  • a scale bar provides a reference for the size of these fatty drops. Their dimensions are between 5 and 15 ⁇ m. Their surface appears fine and smooth, which suggests that the stabilization of the interface is molecular, and does not involve any solid particle.
  • this microscopic observation shows that the hydrolysis in situ takes place at the level of a liquid / liquid emulsified system.
  • the photo in Figure 11 shows that the centrifugation of the medium allows good separation of lipids and cellular debris from the breaking of the seed. Furthermore, the trend already observed at lower magnification that the droplets have to associate to form aggregates is confirmed by this finer shot. Finally, given the size of the fatty globules observed, which is generally between 5 and 15 ⁇ m, it is likely that a beginning of coalescence has already taken place. Indeed, according to Wâsche et al. (1993), (Wâsche A., Luck T., Holley W., 1993.
  • Figure 12 is a photographic photograph taken at an intermediate magnification of 400 ⁇ , shows the detail of a group of cells having undergone the hydrolysis process. In this photograph, it is possible to clearly distinguish cells completely emptied of their content, but also cells still containing part of their constituents.
  • FIG. 12 it can be seen that a homogenization by sonication results in the perforation of the cell walls, without completely breaking the cell since a large number of cells are emptied without their walls appear damaged at this magnification.

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Abstract

L'invention concerne un procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :a) broyage des graines en milieu aqueux jusqu'à l'obtention d'une suspension de particules solides d'un diamètre inférieur à 500 µm ;b) ajout d'une lipase exogène dans la suspension obtenue à l'étape a) ;c) homogénéisation de la suspension contenant la lipase jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une émulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines ;d) hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) à une température comprise entre 15°C et 55°C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures ;e) récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisée à l'étape d).

Description

Procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante
DOMAINE DE L'INVENTION
La présente invention se rapporte au domaine de la préparation d'acides gras à partir des lipides contenus dans les graines de certains végétaux.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les acides gras sont des acides carboxyliques ayant divers degrés d'insaturation et une grande variété de poids moléculaires. Les acides gras sont utilisés dans la fabrication d'une grande variété de produits, tels que les savons et les tensioactifs, les lubrifiants, les peintures et les revêtements, ou encore les bougies, ainsi que dans une grande diversité d'autres produits de l'agriculture et de l'industrie, notamment dans le domaine agroalimentaire.
Classiquement, les acides gras sont produits par hydrolyse chimique d'une huile, par exemple par l'action de la chaleur et de la pression en présence d'eau, afin de rompre les liaisons entre l'acide et l'alcool constitutifs des lipides contenus dans les huiles.
Bien que les acides gras ont été produits par synthèse chimique, une partie importante de ces derniers est préparée à partir d'huiles naturelles. On connaît aussi des procédés de préparation d'acides gras par hydrolyse d'un milieu contenant des lipides sous l'action d'une lipase capable d'hydrolyser les lipides respectivement en acides gras et alcools, principalement le glycérol. L'hydrolyse de l'huile d'olive en utilisant la lipase de Candida rugosa a été décrite par LINFIELD et al. (LINFIELD W M et al., 1984, J. AM. Oil Chem. Soc. vol. 61 :1067-1071 ) . Cependant, l'hydrolyse nécessitait un traitement préalable de l'huile substrat de départ avec une terre de blanchiment.
L'hydrolyse de l'huile de soja par la lipase a été décrite par PARK et al. (PARK Y K et al. 1988, J. Am. Oil Chem. Soc, vol. 61 : 252-254). Cependant une Iipolyse presque complète nécessitait l'utilisation de deux lipases distinctes. Le brevet américain publié sous le n°US 5,932,458 décrit un procédé d'hydrolyse d'une huile à l'aide d'une lipase immobilisée. Notamment, la lipase peut être obtenue par broyage de graines d'avoine, puis élimination des lipides par extraction avec un solvant. Pour effectuer la réaction d'hydrolyse, la lipase immobilisée est ensuite mise en contact avec de l'huile de soja dans un solvant organique, le 2,2,4- triméthylpentane.
RAO et al. (RAO KSVA et al., 1992, Res. Ind., vol.37 :36) décrivent une méthode d'hydrolyse utilisant un broyât de graines de ricin, dans lequel la lipase endogène de la graine, qui est libérée des sphérosomes intracellulaires par le broyage des graines, est utilisée pour hydrolyser les lipides endogènes de ces graines broyées. De même, JACHMANIAN et al. (JACHMANIAN I et al., 1995, J Agric. Food Chem. vol. 43(11): 2992-2996) ont étudié l'hydrolyse des lipides d'un broyât de graines de colza germées, sous l'action de la lipase endogène.
Toutefois, ces études d'hydrolyse des lipides par les lipases endogènes impliquent de choisir précisément le stade de développement des graines utilisées, puisque les lipases ne sont produites qu'au moment de la germination. De plus, ces études visent exclusivement à montrer que les graines entières sont des sources de lipase. Aucun essai d'extraction des acides gras et des alcools n'est donc décrit.
DESCRIPTION DE l'INVENTION
Le demandeur s'est attaché à mettre au point un procédé amélioré de préparation d'acides gras, par hydrolyse des lipides contenus dans les graines d'une plante, qui soit simple, rapide, et qui permette l'obtention d'un haut rendement d'hydrolyse. En particulier, le demandeur s'est attaché à mettre au point un procédé amélioré ne nécessitant pas une étape d'extraction de l'huile préalable à la mise en contact de la lipase avec les lipides dont l'hydrolyse, respectivement en acides gras et alcools, est recherchée.
De manière surprenante, on a montré selon l'invention qu'une hydrolyse quasi-complète des lipides contenus dans des graines de plantes pouvait être obtenue en faisant agir une lipase exogène dans un milieu reactionnel hétérogène solide/liquide dans lequel le substrat lipidique est présent.
Plus précisément, on a montré selon l'invention, qu'une lipase exogène placée dans un milieu reactionnel substrat hétérogène solide/liquide, lequel milieu reactionnel est soumis à un traitement d'homogénéisation drastique à haute pression ou par ultrasons, conserve son activité catalytique d'hydrolyse des lipides contenus dans la solution substrat ainsi traitée. On a également montré selon l'invention qu'une lipase exogène était capable d'effectuer une hydrolyse complète ou quasi-complète des lipides présents, dans ce milieu reactionnel hétérogène solide/liquide, sous la forme d'une emulsion constituée de gouttelettes d'huile dispersées dans un milieu aqueux, et que les acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides contenus dans ladite emulsion pouvaient être facilement récupérés, par exemple par simple extraction.
Il a enfin été montré selon l'invention qu'un traitement de graines de plantes par broyage et homogénéisation permettait de rendre accessible la plus grande partie des lipides initialement contenus dans les graines à l'action d'une lipase exogène.
La présente invention a pour objet un procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) broyage des graines en milieu aqueux jusqu'à l'obtention d'une suspension de particules solides d'un diamètre inférieur à 500 μm ; b) ajout d'une lipase exogène dans la suspension obtenue à l'étape a) ; c) homogénéisation de la suspension contenant la lipase jusqu'à l'obtention d'un homogénat constitué d'une emulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines ; d) hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) à une température comprise entre 15°C et 55°C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures ; e) récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisée à l'étape d).
Etape de broyage des graines
Selon le procédé ci-dessus, l'étape a) de broyage est réalisée à l'aide d'un broyeur à couteauxde type « Waring Blendor » dans un milieu aqueux. En général, l'obtention de particules solides d'un diamètre moyen inférieur à 500 μm peut être obtenu par une durée de broyage des graines dans le milieu aqueux de quelques minutes, de préférence entre 1 et 10 minutes et de manière tout à fait préférée entre 2 et 7 minutes, par exemple pendant une durée de 5 minutes.
Le milieu aqueux de broyage est préférentiellement de l'eau mais peut être également toute solution tampon, telle que par exemple les deux solutions tampons ci-dessous :
• Tampon phosphate 0,1 M obtenu à partir du dihydrogénophosphate de sodium dihydrate NaH2 PO4, 2H20 et équilibré à pH 7,0 avec l'hydroxyde de sodium Na OH. • Tampon tris (hydroxyméthyl) aminométhane ajusté à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique. Autres milieux d'hydrolyse : réactivité en milieu NaCI 0,1 M.
Toutefois, le recours à une solution tampon n'est pas privilégiée car une solution tampon est susceptible d'introduire des composés contaminants indésirables qu'il est difficile ou long d'éliminer, dans la suite du procédé.
De préférence, lors de l'étape a) de broyage, les graines sont ajoutées au milieu aqueux à raison d'une proportion inférieure à 20%, de préférence inférieure à 15%, en poids total du milieu aqueux contenant les graines. Pour une proportion de graines supérieure à 20% en poids total du milieu aqueux, l'étape a) de broyage est difficile, voire impossible à réaliser, du fait d'une viscosité trop grande du milieu aqueux. De plus, pour une proportion des graines supérieure à 20% en poids total du milieu aqueux contenant les graines, l'étape e) de récupération des acides gras est difficile à réaliser de manière optimale, du fait d'une proportion de phase solide trop élevée.
De préférence, la proportion en poids des graines, par rapport au poids total du milieu aqueux contenant les graines, est inférieure à 15%. En revanche, si les limites supérieures en proportion de poids des graines indiquées ci-dessus sont respectées, une cinétique optimale de la réaction d'hydrolyse et un degré d'hydrolyse d'au moins 95% des lipides sont obtenus quelle que soit la proportion en poids de graines utilisées, pour un rapport poids de lipase/poids de graines donné. Ainsi, on a montré que la cinétique d'hydrolyse et le degré d'hydrolyse des lipides contenus dans les graines était identique avec un milieu aqueux de broyage contenant respectivement 10% et 13,5 % en poids de graines, par rapport au poids total du milieu aqueux contenant les graines, pour un rapport poids de lipase/poids de graines identique. La lipase exogène, ajoutée à l'étape b) dans la suspension hétérogène liquide/solide obtenue à la fin de l'étape a), peut être de toute nature. Elle peut être une lipase obtenue à partir de microorganismes des genres Rhizopus, Mucor, Alcaligenes, Candida, Aspergillus, Pseudomonas, Humicola, Thermomyces ou encore Pénicillium ou à partir des lipases des végétaux.
A titre illustratif, on peut utiliser la lipase obtenue à partir de Candida rugosa, comme décrit dans les exemples.
De préférence, la lipase exogène est ajoutée à raison de 100 à 500 unités, de préférence de 150 à 400 unités de lipase, par gramme du poids des graines traitées à l'étape a).
Une unité de lipase correspond à la quantité de lipase requise pour libérer 1 μmole d'acide gras à partir de glycéride, par minute, en conditions optimales d'activité catalytique de l'enzyme.
On a en effet montré selon l'invention qu'une bonne cinétique d'hydrolyse était obtenue avec une quantité de lipase d'environ 100 unités par gramme de graines de départ et que le degré d'hydrolyse obtenu avec ce rapport lipase/graines atteignait environ 75% d'hydrolyse des lipides contenus initialement dans les graines.
Pour des rapports lipase/graines supérieurs, la cinétique d'hydrolyse est encore améliorée et l'hydrolyse des lipides est presque complète. Ainsi, un degré d'hydrolyse des lipides supérieur à 90% est obtenu avec un rapport lipase/graines de 166 unités de lipase par gramme de poids de graines traitées à l'étape a).
Pour des rapports encore supérieurs lipase/graines, bien que la cinétique d'hydrolyse soit accrue, le degré d'hydrolyse n'est pas significativement amélioré. Ainsi, pour un rapport lipase/graines de 333 unités de lipase par gramme du poids de graines traitées à l'étape a), un degré d'hydrolyse des lipides d'environ 95% est obtenu.
Etape d'homogénéisation de la suspension de broyât de graines contenant la lipase exogène.
A l'étape c), l'homogénéisation de la suspension liquide/solide contenant initialement des particules grossières de graines inférieures à 500 μm est réalisée jusqu'à l'obtention d'un homogenat constitué d'une emulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines.
L'étape c) d'homogénéisation de la suspension hétérogène liquide/solide et contenant la lipase exogène peut être réalisée par tout moyen connu en soi.
De préférence, l'étape c) d'homogénéisation est réalisée par homogénéisation sous pression ou encore par homogénéisation par sonication.
Homogénéisation sous pression
Pour réaliser l'étape c) par homogénéisation sous pression, on peut utiliser un homogénéisateur à haute pression tel que l'homogénéisateur du type Lab 1000 commercialisé par la Société APV (Evreux, France), selon les recommandations du fabricant.
De préférence, l'homogénéisation sous pression est réalisée à une pression comprise entre 25 et 1000 bars, de préférence entre 100 et 500 bars, par exemple à 150 bars. Le saut de pression provoqué au milieu produit une onde de choc contribuant à la désintégration des cellules de la graine et disperse les lipides contenus dans la graine.
De manière tout à fait préférée, l'étape c) d'homogénéisation sera réalisée par deux cycles successifs d'homogénéisation sous pression.
De manière surprenante, l'homogénéisation sous pression n'affecte pas l'activité spécifique de la lipase exogène.
De plus, il a été observé que la réalisation de plusieurs cycles d'homogénéisation sous pression accroît le rendement final d'extraction des acides gras, même si un tel traitement inhibe faiblement l'activité de la lipase exogène.
Ainsi, bien que l'étape c) d'homogénéisation peut être effectuée par 1 à 4 cycles de passages dans un homogénéisateur à haute pression, des résultats optimaux sont obtenus avec deux cycles d'homogénéisation à haute pression. Dans ce cas, le rendement d'extraction des acides gras à la fin du procédé est accru sans affecter drastiquement l'activité de la lipase exogène.
Homogénéisation par sonication
Selon une alternative avantageuse, l'étape c) d'homogénéisation de la suspension contenant la lipase exogène peut être réalisée par sonication de ladite suspension jusqu'à l'obtention d'un homogenat constitué d'une emulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines.
Pour réaliser l'étape c) d'homogénéisation par sonication, la suspension particules solides à laquelle a été ajoutée la lipase exogène est traitée par des ultrasons à une puissance supérieure à 20 Watts.
La fréquence des ultrasons ne semble pas un paramètre essentiel du traitement.
Pour réaliser l'étape d'homogénéisation par sonication, on peut utiliser notamment le générateur d'ultrasons de type Vibracell commercialisé par la Société Bioblock Scientific (lllkrisch, France).
On a montré selon l'invention qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides ainsi qu'un haut degré d'hydrolyse étaient obtenus avec une puissance d'ultrasons supérieure à 20 Watts. Ainsi, pour une puissance d'ultrasons de 28 Watts, le degré d'hydrolyse après 120 minutes de réaction enzymatique atteint presque 90%. Pour des puissances d'ultrasons supérieures, la cinétique d'hydrolyse des lipides est encore accrue et le degré d'hydrolyse augmente encore. Par exemple, un degré d'hydrolyse des lipides d'environ 95% est obtenu avec une puissance d'ultrasons de 82 Watts.
De préférence, on utilise une puissance d'ultrasons comprise entre 20 et 200 Watts, et de manière tout à fait préférée entre 20 et 100 Watts.
La durée de l'étape d'homogénéisation par sonication est avantageusement comprise entre 10 secondes et 10 minutes, de préférence entre 30 secondes et 5 minutes. Pour une durée de sonication de 30 secondes à la puissance de 64 Watts, on a observé une cinétique moyenne d'hydrolyse des lipides conduisant à un degré d'hydrolyse après 120 minutes de réaction supérieur à 85%. Dans les mêmes conditions, une durée de sonication de 1 minute améliore considérablement la cinétique réactionnelle et un degré d'hydrolyse supérieur à 90% est atteint après 120 minutes de réaction. Des durées supérieures de sonication accroissent encore la cinétique réactionnelle sans augmenter significativement le degré d'hydrolyse final.
Quelle que soit la nature de l'étape c) d'homogénéisation, par homogénéisation à haute pression ou par homogénéisation par sonication, les degrés d'hydrolyse des lipides obtenus à la fin du procédé sont comparables. Ils sont en général supérieurs à 95%, dans les conditions optimales indiquées ci-dessus.
De même, les résultats obtenus dans les exemples montrent que le rendement final d'extraction des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides est sensiblement le même, que l'étape c) d'homogénéisation ait été réalisée par homogénéisation sous pression ou encore par homogénéisation par sonication.
On remarque toutefois qu'une homogénéisation sous pression produit des résultats légèrement supérieurs à ceux obtenus avec une homogénéisation par sonication. Le rendement total de l'extraction des acides gras à la fin du procédé est, dans le cas d'une homogénéisation sous pression, supérieur de 6,5% au rendement observé lorsque l'étape c) d'homogénéisation a été réalisée par sonication.
L'observation au microscope de l'homogénat obtenu à l'étape c) montre que cet homogenat est formé de gouttelettes lipidiques qui s'agrègent en petits amas formant une emulsion, l'homogénat contenant en outre de nombreux débris solides des graines, notamment des débris de coque des graines ainsi que des débris cellulaires. La taille des gouttes grasses est en moyenne comprise entre 5 et 15 μm et leur surface apparaît fine et lisse, ce qui suggère que la stabilisation de l'interface huile/eau des gouttelettes ne fait pas intervenir de particules solides.
Ainsi, l'homogénat contient les lipides contenus initialement dans les graines sous la forme d'une emulsion liquide/liquide avec l'eau présente dans le milieu aqueux que constitue ledit homogenat.
Etape d'hydrolyse des lipides
L'étape d) d'hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) est réalisée par l'incubation de l'homogénat à une température comprise entre 15°C et 55°C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures.
Durant cette étape, la lipase exogène catalyse la réaction d'hydrolyse des lipides, notamment des triglycérides, contenus sous la forme d'une emulsion liquide/liquide dans l'homogénat, respectivement en les différents acides gras constitutifs desdits lipides, d'une part, et des divers alcools, notamment le glycérol, avec lesquels lesdits acides gras étaient estérifiés dans les sphérosomes des graines.
Pour une température de 22°C, on observe une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides associée à un degré d'hydrolyse supérieur à
85%. Lorsque l'on augmente la température de réaction, la cinétique d'hydrolyse des lipides s'accroît, ainsi que le degré d'hydrolyse final.
Toutefois, un degré d'hydrolyse d'environ 95% est déjà obtenu après 120 minutes de réaction à la température de 27°C. A des températures supérieures, la cinétique réactionnelle augmente, alors que le degré d'hydrolyse n'est pas significativement amélioré .
Le procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ de l'invention peut donc être réalisé à température ambiante sans nécessiter un chauffage du milieu reactionnel constitué de l'homogénat obtenu à l'étape c), ce qui rend ce procédé simple de mise en œuvre et en outre peu onéreux.
En outre, la possibilité de réaliser l'étape d) d'hydrolyse à basse température, par exemple entre 20°C et 30°C permet d'éviter, ou à tout le moins de réduire, l'hydrolyse simultanée d'autres composés indésirables tels que les glucosinolates, dont les produits d'hydrolyse soufrés engendrent des troubles thyroïdiens chez l'homme et l'animal .
En effet, à une température égale ou inférieure à 30°C, la myrosinase, qui est l'enzyme responsable de l'hydrolyse des glucosinolates , est peu active, l'activité catalytique optimale de cette enzyme se situant entre
40°C et 70°C.
De plus, le fait qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides associée à un haut degré d'hydrolyse final soient atteints pour de larges plages de températures de l'étape d) d'hydrolyse, rend le procédé de l'invention particulièrement simple à réaliser, puisqu'aucune régulation précise de la température de réaction n'est requise.
Avantageusement, la durée de l'étape d) d'hydrolyse des lipides peut être adaptée en fonction de la température de réaction choisie.
Toutefois, elle peut être réalisée de manière optimale pour une durée comprise entre 60 et 120 minutes à une température de réaction égale ou supérieure à 27°C.
Le procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante ci-dessus est très reproductible . On a montré que la différence de degré d'hydrolyse entre 0 et 15 minutes de réaction varie de manière linéaire avec le rapport pondéral lipase exogène/poids des graines.
Sans vouloir être lié par une quelconque théorie, le demandeur pense que le haut niveau d'hydrolyse des lipides obtenus grâce au procédé de l'invention est due notamment à la nature spécifique de l'homogénat obtenu à l'issue de l'étape c) dudit procédé. L'étape c) d'homogénéisation permet en effet une rupture physique de la structure macroscopique des graines et une libération dans le milieu aqueux des lipides contenus initialement dans les sphérosomes, qui sont des vésicules intracellulaires entourées d'une membrane. Le demandeur pense qu'au cours de l'étape c) d'homogénéisation, la lipase se localise sur toute la surface de l'interface huile/eau des gouttelettes lipidiques générées ce qui permet une hydrolyse rapide et aussi complète que possible desdits lipides substrats qui sont facilement accessibles à l'enzyme.
Etape de récupération des acides gras
L'étape e) de récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisés à l'étape d) peut être effectuée par toute méthode d'extraction des lipides connus de l'homme du métier. De préférence, l'étape e) de récupération des acides gras comprend les étapes suivantes : e1 ) séparation des acides gras des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d), sous la forme d'une emulsion ; e2) extraction des acides gras à partir de l'émulsion, avec un solvant.
Selon un mode de réalisation préféré de l'étape e1), les acides gras sont séparés des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d) par obtention d'un milieu liquide à trois phases, respectivement une phase solide, une phase aqueuse et une phase d'émulsion lipidique, par centrifugation de l'homogénat, puis récupération de la phase d'émulsion lipidique. L'obtention du milieu liquide triphasique est préférentiellement réalisée par centrifugation du milieu hétérogène liquide/solide reactionnel à la fin de l'étape d) d'hydrolyse. Le cas échéant, plusieurs centrifugations successives peuvent être réalisées afin d'améliorer le rendement du procédé.
A l'issue de la ou des centrifugations, on obtient un milieu triphasique comprenant respectivement (i) un culot solide comprenant essentiellement les débris solides des graines, coques ou débris cellulaires, (ii) une phase aqueuse et (iii) une phase huileuse sous la forme d'une emulsion. La phase huileuse sous la forme d'une emulsion constitue la phase enrichie en acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides initialement contenus dans les graines. Cette phase huileuse représente environ 7 à 10% en poids du poids total du milieu reactionnel obtenu à la fin de l'étape d) d'hydrolyse.
La phase d'émulsion huileuse est séparée des deux autres phases respectivement aqueuses et solides, par exemple par simple prélèvement à la surface du milieu triphasique obtenu après centrifugation. Lorsque plusieurs centrifugations successives sont réalisées, les fractions d'émulsions huileuses sont réunies en vue de procéder à l'étape e2) d'extraction des acides gras avec un solvant.
De préférence, l'extraction des acides gras est réalisée avec un solvant choisi parmi l'eau, un alcool, un ester, un carbonate organique ou une cétone. On a préférentiellement recours à l'eau pour l'extraction des acides gras sous forme d'une emulsion.
On a préférentiellement recours à l'éthanol pour l'extraction des acides gras et l'obtention de concentrats, ainsi que pour la transformation ultérieure des acides gras en esters éthyléniques, pour des applications diverses, notamment dans des solvants, des lubrifiants, des cosmétiques, des conservateurs, etc..
On a préférentiellement recours à un ester ou à un carbonate organique pour la transformation ultérieure des acides gras, in situ ou ex situ. Le solvant précipite les protéines et les phospholipides contenus dans l'émulsion et solubilise les acides gras. La fraction de composés précipités et la fraction d'acides gras solubilisés peuvent être aisément séparées, par exemple par centrifugation.
Afin d'améliorer encore le rendement final du procédé, on procédera avantageusement à plusieurs cycles d'extraction avec le solvant, les fractions d'intérêt contenant les acides gras obtenus à la fin de chaque cycle d'extraction étant ensuite réunies.
De préférence, le solvant utilisé est l'éthanol, qui peut être par exemple ajouté à l'émulsion contenant les acides gras à raison de 1 ,5 à 2 volumes d'éthanol par volume d'émulsion. L'étape e2) d'extraction des acides gras à partir de l'émulsion à l'aide d'un solvant est avantageusement suivie d'une étape e3) de séchage de la solution d'extraction contenant les acides gras.
Avantageusement, l'étape de séchage peut être réalisée par simple évaporation, à pression atmosphérique ou encore sous vide jusqu'à atteindre un séchage complet des acides gras.
Selon une autre alternative, l'étape e3) de séchage peut être une étape de séchage modéré dans lequel seul le solvant est éliminé, le milieu aqueux résiduel étant conservé. Le cas échéant, lorsque l'étape e3) de séchage des acides gras est réalisée de la manière modérée indiquée ci-dessus, le mélange acides gras/eau peut être séparé par centrifugation. Selon ce mode de mise en œuvre spécifique de l'étape e3) du procédé, la qualité des acides gras obtenus à la fin du procédé est la meilleure, car l'eau retient d'éventuelles impuretés tels que des peptides solubles dans l'alcool ou encore des traces de phospholipides.
La présente invention est en outre illustrée, sans pour autant être limitée, par les figures et les exemples suivants.
FIGURES
La Figure 1 illustre la cinétique d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa avec une étape d'homogéinisation réalisée par sonication.
La Figure 2 illustre les cinétiques d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa : comparaison des outils de cassage cellulaire, sonication ou homogénéisation haute pression.
La Figure 3 illustre le pourcentage cumulé des lipides totaux extraits par centrifugation des milieux issus de l'hydrolyse enzymatique in situ de l'huile de colza, après sonication ou homogénéisation La Figure 4 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (1 ) :effet de la teneur en matière sèche dans le milieu
La Figure 5 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (2) : effet de la puissance ultrasonore dissipée dans le milieu.
La Figure 6 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (3) : effet de la durée du traitement ultrasonore.
La Figure 7 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (4) : effet de la température sur la vitesse de réaction.
La Figure 8 illustre les cinétiques comparatives d'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa (5) : effet de la quantité de lipase introduite dans le milieu.
La Figure 9 illustre l'hydrolyse enzymatique in situ des lipides endogènes de la graine de colza par la lipase issue de Candida rugosa : effet de la quantité de lipase introduite dans le milieu sur son activité spécifique et la vitesse initiale.
La Figure 10 est un cliché photographique de microscopie photonique (grossissement x100) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides. La Figure 11 est un cliché photographique de microscopie photonique (grossissement x1000) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides
La Figure 12 est un cliché photographique de microscopie photonique (grossissement x400) de l'homogénat à la fin de l'étape d'hydrolyse des lipides
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Homogénéisation par sonication A. MATERIEL ET METHODES
1. Prétraitement par broyage humide
Les graines de colza sont additionnées d'eau de manière à obtenir les proportions 1 : 8 en masses, respectivement. Ce mélange est alors versé dans un mixeur ménager de type « Warring blendor ». Le broyage est alors effectué pendant 5 minutes en ayant soin de ramener dans le fond du bol les particules qui adhèrent aux parois. Parallèlement, la lipase issue de Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) est solubilisée dans l'eau de manière à obtenir une concentration de 10 mg / ml. Quatre-vingt-dix grammes du broyât de graine précédemment obtenu sont additionnées de 10 grammes de solution enzymatique dans un bêcher à double enveloppe de 150 ml. A ce stade, le milieu contient
10 % en masse de graines de colza et une quantité de lipase correspondant à 300 UL / g de graines.
2. Traitement par les ultrasons et mesure des cinétiques
Le mélange obtenu après broyage à sec ou en présence d'eau est ensuite traité par les ultrasons (Vibracell, Bioblock Scientific, lllkirch, France) 5 minutes à 59 W (70% de période active). Le milieu est refroidi pendant la sonication par circulation d'eau froide dans la paroi du bêcher. Après cette étape, le courant d'eau froide est immédiatement remplacé par celui provenant d'un bain thermostaté à 37°C. On laisse alors le milieu évoluer sous agitation magnétique (250 rpm) pendant 120 minutes. Le suivi de la réaction est assuré par une série de prélèvement réalisés à des temps prédéterminés. Lors de ceux-ci, 1 ,5 ml de milieu sont transférés dans un tube contenant 1 ml d'acide chlorhydrique et 5 ml de chloroforme. Après agitation vigoureuse, la phase organique est prélevée, séchée avec Na2S0 anhydre, puis diluée 10 fois avant d'être injectée en CPG pour analyse dans une colonne capillaire BPX5 (SGE) dimensions 12m x 0,32 mm ; épaisseur du film : 0,25 μm. Température du four : Gradiant de 80°C pendant 1 min (10°C/min) 16°C jusqu'à 140°C ; 7°C/min jusqu'à 300°C ; 15°C/min jusqu'à 360°C maintenu pendant 10 min. Température du détectant 365°C.
B. RESULTATS ET DISCUSSION
Les cinétiques d'hydrolyse obtenues sont présentées sur la figure 1. Les résultats montrent qu'une bonne cinétique d'hydrolyse des lipides est obtenue, puisque la réaction d'hydrolyse atteint un plateau après seulement 120 minutes de réaction. Le degré d'hydrolyse atteint 90%.
EXEMPLE 2 : Homogénéisation sous pression. Comparaison avec l'homogénéisation par sonication.
La présence d'amas cellulaires ne libérant pas la totalité des lipides inclus dans les cellules qu'ils contiennent nous a amené à chercher un autre outil de remplacement assurant une rupture plus complète des cellules de la graine. Déjà utilisé dans des domaines variés en agro-alimentaire, l'homogénéiseur haute pression nous est paru être une alternative envisageable. Wâsche et al. (1993, Wâsche A., Luck T. Holley W, 1993. « Influence of technological parameters and protein properties on the aqueous extraction and demulsification of oil from rapeseed » In Food proteins : Structure and functionality developed from the 4th Symposium on food, Schwenke K.D. (Ed.) Weinheim 198-200), ont par ailleurs décrit ce procédé comme efficace pour l'extraction aqueuse d'huile de colza. Cet outil a été choisi pour sa compatibilité avec le travail à l'échelle industrielle en plus de sa robustesse. Son principe de fonctionnement consiste à forcer le liquide à émulsionner au moyen d'une pompe à débit constant, au travers de l'espace de quelques μm laissé libre par une vanne de contre-pression. La pression en amont de cette dernière devient alors très forte, et la décompression brutale en aval de cette vanne entraîne la rupture des macrostructures telles que les cellules. La description détaillée du mode de fonctionnement de ce type d'appareil a été par ailleurs décrite en détail par Lecluse W.J. (1979, Homogénéisations à haute pression, préparation d'émulsions et de dispersions. Information Chimie 191 , 1-8). Ce procédé a pour avantage d'être continu et d'obliger le traitement homogène de tout le milieu, contrairement à la sonication pour laquelle les particules ne passent dans la zone active que périodiquement.
A. MATERIEL ET METHODES La lipase est ajoutée au milieu après broyage 5 minutes des graines en présence d'eau. L'étape de sonication est quant à elle remplacée par deux cycles d'homogénéisation par un homogénéisateur Lab 1000 (APV, Evreux, France) muni de deux étages d'homogénéisation. La pression du premier étage d'homogénéisation est réglée à 150 bars, celle du second étage étant fixée à 20 bars, en accord avec les résultats publiés par Wâsche et al. (1993) et avec les recommandations du fournisseur. La teneur en graine du milieu est de 13,5% en masses et le rapport lipase / graines est fixé à 333 UL /g de graines, afin de pouvoir comparer les cinétiques mesurées avec celles déjà obtenues auparavant avec l'utilisation des ultrasons. Comme lors des précédents essais, le chronomètre est déclenché à l'addition de la lipase, soit juste avant le début du passage du milieu dans l'homogénéisateur.
B. RESULTATS
La comparaison des cinétiques obtenues avec sonication ou homogénéisation, tous les autres paramètres restant par ailleurs identiques, peut être effectuée au moyen de leur représentation graphique présentée sur la figure 2. Les deux cinétiques obtenues ont un profil similaire, mais ne sont cependant pas superposables. En effet, la courbe obtenue suite aux essais faisant intervenir l'homogénéisation montre une hydrolyse moins rapide que lors de l'utilisation des ultrasons. Cependant, il est à noter que le maximum de degré d'hydrolyse (DH) obtenu après deux heures de réaction est similaire dans les deux cas.
L'obtention d'un DH de l'ordre de 95% en 2 heures montre clairement que l'homogénéisation est capable de générer des conditions adéquates pour l'hydrolyse enzymatique in situ des lipides du colza. Il aurait été possible que la violence du traitement subi par le milieu dégrade la lipase, la rendant inactive. Par ailleurs, les essais de ce nouveau matériel ont été réalisés sans aucune optimisation. La vitesse d'hydrolyse mesurée ne représente donc pas a priori un optimum de réactivité, et la gamme de pressions d'homogénéisation possibles pour l'appareil utilisé est assez étendue. Ainsi, il est possible de faire varier la pression d'homogénéisation, mais aussi sur le nombre de passages effectués ou la pression du second étage d'homogénéisation.
Conclusion Les premiers résultats cinétiques obtenus lors de l'hydrolyse enzymatique des lipides du colza assistée par l'homogénéisation montrent que celle-ci est possible dans ces conditions de procédé. Même si sa vitesse initiale est inférieure à celle obtenue lorsque la réaction est réalisée après sonication, le DH final reste identique.
EXEMPLE 3 : Analyse des caractéristigues physico-chimiques de l'homogénat obtenu à l'étape c) du procédé
1. Définitions et abréviations AG : acides gras
MG : monoglycérides DG : diglycérides TG : triglycérides UL : Unité Lipase, correspondant à la quantité de lipase nécessaire pour libérer 1 μmol. d'acide gras par minute, à partir de glycérides en conditions optimales de fonctionnement.
Inhibition : perte réversible ou irréversible d'une partie de l'activité d'une enzyme suite à un phénomène physique ou du fait d'une interaction avec une ou plusieurs molécules
US : ultrasons
CPG : chromatographie en phase gazeuse
DH : degré d'hydrolyse, défini comme étant le pourcentage de liaisons ester rompues lors de l'hydrolyse de l'huile en acides gras.
AS : Activité spécifique, définie comme la vitesse de formation des acides gras rapportée à la quantité de préparation enzymatique introduite.
2. Caractérisation de l'émulsion
2.1 Préparation d'hydrolysat et d'émulsion Protocole de préparation de l'hydrolysat :
Un litre de milieu à 15 % en masse est préparé par passage de 5 minutes au mixer de 150g de graines de colza dans 850mL d'H20. Après passage au mixer, la quantité de milieu récupérée est pesée afin d'estimer la quantité de graines (15 % de la masse récupérée). L'hydrolyse est réalisée avec l'enzyme « LIPOLYVE CC » dont la concentration est 30 unités/mg. La solution d'enzyme est préparée dans de l'eau afin d'obtenir après mélange avec le milieu une concentration d'enzyme de l'ordre de 300 unités par gramme de graines et une concentration de graines dans le milieu de l'ordre de 13.5 % en masse.
La solution d'enzyme est ajoutée au milieu et le tout est passé à l'homogeneisateur 2 cycles à 350 bars. L'homogénat (milieu passé à l'homogeneisateur) ainsi récupéré est placé dans un réacteur à 37°C avec agitation à 250 rpm durant deux heures. L'hydrolysat (homogenat après 2 heures d'hydrolyse à 37°C) est finalement conservé à 4°C. Protocole de récupération de l'émulsion :
L'émulsion est préparée à partir de l'hydrolysat par centrifugation. Après agitation, l'hydrolysat est centrifugé 5 minutes à vitesse maximale. Lors de la dernière préparation d'émulsion, l'hydrolysat a été centrifugé 5 minutes à 7600 G. Lors de la centrifugation, les différentes phases sont séparées et il est possible de récupérer l'émulsion par filtration sur une maille fine. Le culot est ensuite remis en suspension dans la phase aqueuse avant d'être centrifugé une deuxième fois dans les mêmes conditions. L'émulsion formée est ainsi récupérée deux autres fois.
Après trois centrifugations, seule l'émulsion est conservée et stockée à 4°C. De cette manière, il est possible de récupérer 75g d'émulsion à partir de 1000g d'hydrolysat.
2-2 Calcul de la densité de l'émulsion
Les calculs de densité ont été réalisés par pesée de volumes précis (pesée de 5mL dans une fiole jaugée). Le résultat obtenu est une moyenne de trois mesures réalisées sur des émulsions indépendantes. Densité de l'émulsion : 0,943 +/. 0,004 g/mL
2-3 Détermination de la matière sèche
La détermination de la matière sèche permet de calculer la quantité d'eau contenue dans l'émulsion. La quantité de matière sèche est calculée par pesée d'un certain volume d'émulsion (environ 4mL) avant et après passage de 6 heures dans une étuve à 103°C. Pour éviter des pertes d'émulsion par projections, le volume d'émulsion pesé est mélangé à du sable avant d'être placé à l'étuve. Toujours pour éviter les pertes, les pesées sont effectuées avec la coupelle en aluminium contenant l'émulsion, avec le sable et avec la spatule ayant servi à mélanger le sable et l'émulsion.
La quantité restante après 6 heures à 103°C représente la matière sèche. La différence de poids nous renseigne sur la quantité d'eau contenue dans l'émulsion.
Ce test à été effectué sur trois émulsions indépendantes. Quantité d'eau contenue dans l'émulsion : 32,5 +/. 0,6 % d'H2O 2-4 Détermination de la teneur en acide
On attend par l'huile la quantité d'acides gras issus de l'hydrolyse des triglycérides des lipides des graines broyées.
La teneur en huile de notre emulsion est déterminée selon une "méthode simplifiée par extraction à Phexane" (Norme V 03-908). Pour des raisons de sécurité, il a été utilisé du cyclohexane et non de Phexane.
Cette teneur est déterminée sur la matière sèche nous ayant permis de calculer la quantité d'eau contenue dans l'émulsion. Pour éviter de fausser les résultats, la coupelle en aluminium contenant la matière sèche ainsi que la spatule. ont été placées dans la cartouche du soxhlet.
Après 6 heures d'extraction à chaud, les soxhlets sont démontés et le cyclohexane évaporé sous vide. Teneur en huile = ((mi - mo) / meSsai ) x 100 mo : tare du ballon en grammes mi : masse ballon après évaporation du cyclohexane en grammes rriessai : masse d'émulsion, en grammes, utilisée pour obtenir la matière sèche Teneur en huile de l'émulsion : 58,3 +/. 1 ,3 %
2-5 Dosage des protéines selon la méthode Kjeldahl
Le dosage des protéines contenues dans l'émulsion se fait indirectement par dosage de l'azote selon la méthode Kjeldahl : minéralisation et distillation à la vapeur.
Le protocole suivi pour le dosage des protéines sur l'émulsion dérive de la note d'application fournie avec le système de minéralisation « TECATOR 2020 Digestor » :
• prise d'essai d'environ 300mg (pesée au mg près) placée dans tube de minéralisation
• ajout de deux « Kjeltabs CK » (Thompson & Capper LTD, Réf. AA17)
• ajout de 12mL d'H2S04 95% puis légère agitation
• fixation de la tête d'aspiration sur les tubes, aspiration maximum • tubes introduits dans bloc de minéralisation « TECATOR 2020 Digestor » à 420°C
• au bout de 5 minutes, réglage de l'aspiration pour conserver les vapeurs acides à l'intérieur de la tête d'aspiration en ayant une position correcte de l'anneau de condensation
• minéralisation poursuivie pendant une heure pour obtenir une solution limpide de couleur bleu/vert
• après 20 minutes de refroidissement, la distillation est réalisée avec l'appareil Kjeltec 1026 • introduction dans le distillateur d'une fiole conique contenant
25mL de solution d'indicateur (acide borique 4 %, vert de bromocrésol 1x10"3%, rouge de méthyle 7x10" %)
• distillation sur l'appareil Kjeltec 1026 avec les réglages suivants : Alkali 2 (3 volumes sont parfois nécessaires), Delay 2 et Steam 36
• titration du distillât avec une solution d'acide chlorhydrique 0.0136 N
Deux dosages de l'azote ont été réalisés sur chacune des trois émulsions indépendantes.
% Azote = ((VHClessai - VHClblanc) x NHcι x 14.007 x 100) / m
V : volume HCI utilisé pour la titration en mL . m : masse d'échantillon d'émulsion en milligrammes
% Protéines = % Azote x F
F : facteur de conversion de l'azote en protéines, dans notre cas 6.25
Teneur en protéines de l'émulsion : 7,24 +/.0,47 %
2-6 Dosage du phosphore contenu dans l'émulsion
Dosage colorimétrique du phosphore contenu dans l'émulsion selon la Norme NF-T 60-227 « Méthode Vanadomolybdique » :
• prise d'essai d'environ 1.2g d'émulsion placée dans un creuset • ajout de 0.1g d'oxyde de magnésium préalablement calciné • passage de 2 heures au four à 900°C pour obtenir des cendres blanches
• les cendres sont ensuite dissoutes dans 5mL d'HN03 6N
• préparation des échantillons de la courbe étalon : Préparation d'une solution de phosphore à 1 mg/mL dans de PHN0 6N (463mg Na2HP04 dans 100mL d'HN03 6N). Les différentes concentrations de la gamme sont préparées directement dans les cuves du spectrophotomètre.
Tableau 1 :
Préparation de la gamme étalon pour le dosage du phosphore
• de la même manière les échantillons sont préparés directement dans les cuves avec 400μL de cendres dissoutes dans l'acide, 800μL de Vanadate 0.25% et 800μL de Molybdate 5%
• après 20 minutes (formation du complexe vanadomolybdique), l'absorbance de la gamme étalon et des échantillons est mesurée à 460nm
• avec la courbe étalon, on obtient pour chaque échantillon une concentration en phosphore dans les cendres dissoutes
• la teneur en phosphore de l'émulsion est finalement calculée avec la masse d'émulsion connue
Le dosage du phosphore a été réalisé sur trois émulsions indépendantes.
Teneur en phosphore ≈ ([PO4 21 x 0.05) x (100 / m)
[P04 2"] : concentration en phosphore des cendres dissoutes en mg/mL m : masse de la prise d'essai en grammes
Teneur en phosphore de l'émulsion : 0,148 +/. 0,004 %
II est aussi possible avec ce dosage d'estimer le pourcentage en masse des phospholipides en multipliant la teneur en phosphore par un facteur 26. Nous obtenons donc ainsi :
Teneur en phospholipides de l'émulsion : 3,8 +/. 0,1 %
2-7 Caractéristiques de l'émulsion
Nous pouvons maintenant faire une synthèse des composants de l'émulsion avec leurs proportions respectives.
L'émulsion est composée de : ... 32,5 % d'H2O "7.0,6%
58,3 % d'huile +/. 1,3% 7,24 % de protéines +/.0,47% 3,8 % de phospholipides +/. 0,1%
L'émulsion a une densité de 0,943 +/. 0,004%
EXEMPLE 4 : Extraction des acides gras après hydrolyse des lipides. A. MATERIEL ET METHODES
Les milieux utilisés pour réaliser ces essais sont obtenus par homogénéisation sous pression ou par homogénéisation par sonication, comme indiqué dans les Exemples 1 et 2 L'homogénéisation par sonication a été réalisée par sonication continue à la puissance de 82 W.
Quarante grammes de milieu hydrolyse sont centrifugés 5 min à 2500 g. La phase aqueuse et l'émulsion sont transférés dans une ampoule à décanter où elles sont mélangées avec 30 ml de méthanol puis 30 ml de chloroforme.
Cette mixture est centrifugée 5 minutes, puis la phase chloroformique est prélevée, tandis que le reste est extrait une seconde fois par 30 ml de chloroforme. La masse de matière grasse ainsi extraite est pesée après évaporation sous vide du chloroforme.
Pour sa part, le culot est pesé avant d'être complété avec de eau distillée jusqu'à obtention de la masse initiale de milieu traité. L'ensemble est ensuite homogénéisé par agitation vigoureuse 30 secondes. Cette nouvelle suspension est alors traitée comme le milieu initial par centrifugation puis extraction de la matière grasse des phases supérieures au solvant. Au total, 4 cycles sont effectués de cette manière, le dernier culot obtenu étant lui aussi extrait par le chloroforme et le méthanol après avoir été remis en suspension dans 15 ml d'eau distillée. Un bilan sur les lipides pourra ainsi être réalisé.
Chaque essai a été réalisé à trois reprises pour déterminer l'erreur sur la valeur expérimentale
B. RESULTATS Si l'étude cinétique de la réaction d'hydrolyse in situ des lipides du colza après mise en interaction des glycérides et de la lipase par homogénéisation donne une bonne idée des possibilités de ce type de procédé en terme de réactivité, l'étude de l'extractibilité des acides gras formés est primordiale. En effet, c'est surtout en vue d'améliorer le rendement d'extraction des lipides que l'homogénéisation a été testée en tant qu'outil de cassage cellulaire. Ces essais vont donc permettre de comparer l'extractibilité à l'eau des lipides suivant le type de procédé utilisé.
Le pourcentage cumulé des lipides totaux extraits après chaque cycle de lavage est présenté sur la figure 3. La comparaison des résultats obtenus pour une hydrolyse faisant intervenir la sonication ou l'homogénéisation nous montre une extractibilité des lipides identique lors du premier cycle. Cependant, le pourcentage total des lipides extraits au cours des cycles suivants est nettement plus élevé si le milieu a subi un traitement d'homogénéisation sous pression. En effet, une différence de 6,5% est observée sur le rendement total. Cette différence montre que l'homogénéisation du milieu à haute pression libère une plus grande quantité d'acides gras sous forme d'émulsion. Ceci suggère que la rupture des parois cellulaires est plus étendue que lors des expériences faisant intervenir la sonication. La similitude entre les rendements d'extraction lors du premier cycle de centrifugation semblerait indiquer que les interactions entre les particules de l'émulsion et les débris cellulaires sont à peu près équivalentes dans les deux cas.
Conclusion
La préparation des milieux d'hydrolyse par broyage suivi d'homogénéisation permet d'améliorer nettement le rendement total d'extraction des acides gras produits lors de la réaction. La différence mesurée après 4 cycles de lavage / centrifugation est de 6,5%. Par contre, l'extractibilité observée après le premier cycle d'extraction aqueuse laisse penser que les interactions entre les gouttelettes d'émulsion et les débris cellulaires du culot sont du même ordre dans le cas de l'utilisation des ultrasons ou de l'homogénéisation sous pression.
EXEMPLE 5 : Conditions optimales de guantités de graines dans le milieu de broyage de départ
A. MATERIEL ET METHODES.
Quantité de graines.
La proportion de graines introduites dans le milieu conditionne directement le taux de remplissage du réacteur en substrat glycéridique. En effet, lors de l'augmentation de la teneur en graines du milieu, celui-ci est logiquement enrichi en glycérides et en protéines, qui représentent respectivement 46,5 et 18 % de la masse fraîche des graines de colza utilisées .En conséquence, on a fait varier la quantité de graines dans le milieu dans la limite des possibilités du matériel. La réponse mesurée au cours de cette étude est l'évolution du degré d'hydrolyse (DH) au cours du temps. Procédé
Le protocole de mesure des cinétiques réactionnelles est réalisé avec utilisation du broyage humide comme étape de prétraitement avant sonication. Afin que cette dernière étape du procédé ne soit pas limitante, la sonde à ultrasons a été réglée à sa puissance maximale, soit 82 W avec une période active de 100 %. Deux teneurs en graines ont été testées : 10 et 13,5%. Au delà, la sonde à ultrasons s'échauffe, ce qui présente un risque de détérioration du matériel. Comme précédemment, chaque essai a été réalisé à trois reprises afin de s'assurer de la reproductibilité.
B. RESULTATS
Les cinétiques obtenues, présentées sur la figure 4, sont superposables, aux erreurs expérimentale près. La vitesse d'hydrolyse y est rapide pendant les 30 premières minutes, pour se ralentir ensuite progressivement jusqu'à atteindre un pallier après 60 minutes de réaction, pour une valeur optimale de DH de 95%.
De toute évidence, l'efficacité de la lipase ne semble pas être affectée par cette variation de la teneur en matière sèche. Ceci semble logique car si la proportion de graines introduite dans le milieu diffère, le rapport enzyme / graine ne varie pas. Ceci signifie que ni le ratio glycérides / lipase ni la proportion de protéines par rapport à l'enzyme n'ont évolué. Ainsi, l'apport de composés potentiellement inhibiteurs est contrebalancé par l'ajout en parallèle d'une proportion identique de lipase. Le seul paramètre qui aurait pu être limitant est la quantité d'eau disponible pour que la réaction ait lieu. Les résultats expérimentaux montrent que ce n'est pas le cas.
Cependant, le type de procédé utilisé ne permet guère d'augmenter plus la quantité de graine présente dans le milieu, car la sonde à ultrasons s'échauffe rapidement. Par ailleurs, le broyage devient impossible à réaliser dès 20% de teneur en graines pour cause de trop forte viscosité. Enfin, la décantation centrifuge n'est plus possible si la proportion de phase solide (culot) est trop élevée. Conclusion
La réactivité ne semble pas affectée par l'augmentation de la teneur en matière sèche dans le réacteur. Cependant, la viscosité du milieu croissant rapidement avec la proportion de graines, notre matériel ne permet pas de réaliser des essais avec un milieu comportant une quantité plus élevée de graines.
EXEMPLE 6 : Conditions optimales de l'homogénéisation par sonication - Puissance des ultrasons
On a montré que l'efficacité de la lipase lors de l'hydrolyse des glycérides dépend étroitement des interactions que ces deux familles de molécules parviennent à établir entre elles. Les ondes ultrasonores étant l'outil de cette mise en contact par le biais de la création d'interface, il est donc raisonnable de penser que de leur intensité va dépendre la réactivité dans le milieu.
Procédé Un mélange contenant 15 % de graines de colza dans l'eau distillée est broyé pendant 5 minutes dans un mixeur ménager de type « Warring blendor ». Parallèlement, la lipase issue de Candida rugosa (Lipolyve, Lyven, Cagny, France) est solubilisée dans l'eau de manière à obtenir une concentration de 10 mg / ml. Quatre-vingt-dix grammes du broyât de graine précédemment obtenu sont additionnées de 10 grammes de solution enzymatique dans un bêcher à double enveloppe de 150 ml. A ce stade, le milieu contient 13,5 % en masse de graines de colza et une quantité de lipase correspondant à 333 UL / g de graines. Le mélange est ensuite traité par les ultrasons (Vibracell, Bioblock Scientific, lllkirch, France) 5 minutes à 12, 28, 47, 64 ou 82 W (100% de période active) selon les essais. Le milieu est refroidi pendant la sonication par circulation d'eau froide dans la paroi du bêcher. Après cette étape, le courant d'eau froide est immédiatement remplacé par celui provenant d'un bain thermostaté à 37°C. On laisse alors le milieu évoluer sous agitation magnétique (250 rpm) pendant 120 minutes. Le suivi de la réaction est assuré par une série de prélèvement réalisés à des temps prédéterminés. Lors de ceux-ci, 1 ,5 ml de milieu sont transférés dans un tube contenant 1 ml d'acide chlorhydrique et 5 ml de chloroforme. Après agitation vigoureuse, la phase organique est prélevée, séchée avec Na2S04 anhydre, puis diluée 10 fois avant d'être injectée en CPG pour analyse. Chaque essai a été réalisé à trois reprises pour déterminer l'erreur sur la valeur expérimentale
B. RESULTATS L'effet de la puissance ultrasonore dissipée dans le milieu reactionnel est présenté sur la Figure 5. La superposition des courbes de cinétique d'hydrolyse en fonction du temps nous permet une comparaison des différents résultats obtenus. Il apparaît de suite sur ce graphique que plus la puissance ultrasonore utilisée est forte, plus la vitesse de réaction est élevée.
Cette observation vérifie l'importance du rôle de l'étape de sonication du milieu. En effet, elle conditionne en grande partie la réactivité, et ces essais montrent que le contrôle de la puissance ultrasonore dissipée est primordial. Nous avions vu que les ultrasons permettent de briser les parois cellulaires et ainsi de libérer les lipides que renferme la graine. Le mécanisme de cette rupture cellulaire est lié à la cavitation engendrée par les ultrasons. L'intensité de celle-ci dépendant de la puissance des ondes acoustiques qui la génère, il semble donc logique que l'augmentation de la puissance fournie par la sonotrode se concrétise au sein du milieu par une meilleure mise en interaction des lipides et de la lipase. II s'ensuit alors une exaltation de la réactivité, que l'on peut observer au travers de l'amélioration des cinétiques de croissance du DH lors de l'augmentation de la puissance de sonication utilisée. Ainsi, les résultats obtenus confirment l'importance de la mise en interaction de la lipase et des lipides pour que l'hydrolyse des glycérides ait lieu de manière optimale. Conclusion
La comparaison des cinétiques d'hydrolyse in situ des lipides de la graine pour différentes puissances de sonication utilisées durant la préparation du milieu nous permet de montrer une influence positive de la puissance ultrasonore utilisée. L'augmentation de celle-ci permet un meilleur cassage des cellules de la graine, ce qui améliore la mise en interactions des lipides et de la lipase. Ces résultats confirment donc l'hypothèse de travail selon laquelle la réactivité du milieu reactionnel est étroitement liée aux interactions lipides /lipase.
EXEMPLE 7 : Conditions optimales de l'homogénéisation par sonication - Durée de la sonication.
Nous venons de montrer que la puissance de sonication influe fortement sur la cinétique réactionnelle. Ce paramètre est également à coupler avec la durée de traitement ultrasonore appliqué. Dans cet exemple, on vise à déterminer l'influence du temps de sonication.
Procédé
La période de sonication a été fixée tour à tour à 30 sec, 1 min., 2 min., 3 min. et 5 min pour une puissance ultrasonore fixée à 64 W. L'évolution du DH en fonction du temps est utilisé comme réponse, chaque essai étant répété à trois reprises pour s'assurer de sa reproductibilité.
β RESULTATS
Les résultats sont présentés sur la Figure 6. Les cinétiques obtenues lors de l'hydrolyse des lipides du colza in situ avec différentes durées de sonication à 64W sont représentées sur la figure 6. Les vitesses d'hydrolyse observées sont d'autant plus rapides que la durée de la période de passage du milieu aux ultrasons est longue. Cependant, les courbes obtenues pour 3 et 5 minutes de traitement du milieu par les ultrasons sont superposables, aux erreurs expérimentales près.D'après ces résultats, la durée de sonication du milieu joue donc un rôle positif jusqu'à un certain point. Pour des temps de traitement supérieurs, un plateau est atteint.
L'effet positif de la durée de sonication semble logique au vu des résultats obtenus dans le cadre des essais sur l'impact de la puissance ultrasonore dissipée dans le milieu. L'augmentation du temps de passage aux ultrasons favorise leur action. Il s'ensuit une disruption plus complète des parois cellulaires, ce qui améliore l'accessibilité de la lipase à son substrat lipidique. Autrement dit, l'augmentation de la durée de sonication favorise les interactions entre l'huile de la graine et la lipase, ce qui explique une augmentation de la réactivité. Le pallier se justifie quant à lui l'aboutissement à un maximum du processus de lyse cellulaire pour lequel la puissance sonore introduite dans le milieu devient limitante pour la poursuite de la dégradation des structures biologiques de la graine. En conséquence, on atteint un maximum de réactivité pour une puissance ultrasonore donnée.
Les résultats présentés dans l'exemple indiquent qu'une période de sonication de 3 minutes est suffisante pour mener l'hydrolyse dans des conditions optimales. Par contre, pour toute durée inférieure de traitement, la réactivité sera moindre.
Conclusion
La durée de sonication du milieu est un paramètre important, qui joue un rôle positif sur la réactivité. L'explication de ces observations est proche de celle avancée pour justifier l'influence de la puissance ultrasonore appliquée au milieu. Un maximum est observé pour une durée de traitement supérieure ou égale à 3 minutes, au delà desquelles il n'y a plus d'amélioration des interactions entre la lipase et son substrat.
EXEMPLE 8 : Conditions optimales de l'étape d'hydrolyse des lipides - Température de la réaction d'hydrolyse. A. MATERIEL ET METHODES
La puissance ultrasonore dissipée dans le milieu est de 82 W et la température est fixée à 22, 27, 32, 37 ou 42°C. Les différentes cinétiques de DH obtenues sont comparées entre elles. Chaque essai est répété 3 fois et un écart-type est calculé.
B. RESULTATS Les résultats obtenus pour chaque température sont représentés sur la figure 7 pour permettre une comparaison. On observe que les cinétiques obtenues pour les hydrolyses réalisées à 42°C et 37°C sont totalement superposables et semblent très légèrement supérieures à celles obtenues pour une température de 32°C ou 27°C. L'évolution du DH pour les réactions menées à 27°C est quant à elle la plus faible, mais reste malgré tout assez proche de celle observée pour les autres températures.
Ces résultats démontrent clairement qu'une réactivité correcte peut avoir lieu pour des températures inférieures à 37°C. En fait, ce paramètre paraît avoir une faible incidence sur la vitesse d'hydrolyse dans la plage de 20°C explorée. Selon toute vraisemblance, il doit être possible de réaliser l'hydrolyse des triglycérides du colza sans que celle des glucosinolates ne se produise. En effet, une température de réaction proche, voire inférieure à 30°C paraît défavorable pour une activité optimale de la myrosinase (enzyme responsable de l'hydrolyse des glucosinolates), puisque son optimum de fonctionnement se situe entre 40 et 70°C (Maheshwari et al., 1981 Maheshwari P.N., Stanley D.W., Gray J.J., 1981 , Detoxification of rapeseed products. J. Food Protection, Vd. 44(6) : 459-470). A contrario, la lipase montre une activité optimale ou sub-optimale pour des températures de l'ordre de 30°C.
La capacité pour la lipase de travailler à des températures inférieures à celles utilisées jusqu'à présent présente également un intérêt au niveau de la consommation énergétique, qui peut de cette façon être diminuée. Enfin, ces essais montrent qu'une régulation très précise de la température n'est pas nécessaire, puisque la lipase assure l'hydrolyse optimale des triglycérides de la graine en acides gras sur une plage d'environ 10°C et perd peu d'activité au delà. Conclusion
Les essais de modification de température du milieu lors de l'hydrolyse in situ de lipides de la graine de colza montrent que cette réaction est peu sensible à ce paramètre. Ceci nous ouvre des perpectives en terme d'élimination de la réaction parasite d'hydrolyse des glucosinolates hydrosolubles et inoffensifs pour la santé en des composés soufrés gênants par leur toxicité tant sur le plan nutritionnel que pour le catalyseurs industriels d'hydrogénation. Une réflexion plus approfondie est donc à poursuivre sur ce point. La faible sensibilité de la réaction à la température permet également une économie énergétique supplémentaire et l'absence de nécessité d'assurer une régulation fine de ce paramètre.
EXEMPLE 9 : Conditions optimales de l'étape d'hydrolyse des lipides - Rapport Unités de lipase/Poids de graines de départ.
La quantité de lipase est un second facteur déterminant pour la réactivité. La détermination de ce paramètre permet ainsi de déterminer l'influence du rapport enzyme / graines sur la réactivité et sur l'efficacité de la lipase, notamment en ce qui concerne des inhibitions de l'enzyme par des composés de la graine.
A. MATERIEL ET METHODES
Procédure
Le protocole suivi est identique aux exemples précédents, avec une puissance ultrasonore fixée à 82 W, une température de 37°C. La quantité de lipase est quant à elle variable selon les essais, les différents rapports lipase / graines testés étant de 27,7, 55, 111 , 222 et 333 UL / g de graines. Tout comme lors des expérimentations précédentes, chaque point a été réalisé 3 fois afin de déterminer la barre d'erreur expérimentale. B.RESULTATS
Les cinétiques obtenues pour les différentes concentrations en lipase sont exposées sur la figure 8. On observe que la croissance du
DH en fonction du temps est d'autant plus rapide que la quantité d'enzyme introduite est élevée. D'autre part aucun optimum de réactivité en fonction de la quantité de lipase ajoutée ne semble atteint.
Ces résultats confirment le rôle positif du rapport enzyme /substrat sur la réactivité.
Afin de mieux appréhender la relation entre le rapport lipase /graine et la cinétique réactionnelle, on a étudié les vitesses initiales moyennes d'hydrolyse mesurées entre 0 et 15 minutes. La différence de DH entre 0 et 15 minutes a par conséquent été calculée à partir des résultats présentés sur cette figure.
Cette réponse est bien représentative de la vitesse moyenne d'hydrolyse pendant cette période, puisque :
[AG]
DH = xlOO
[AG] + [MG] + 2 [DG] + 3[TG]
Où : [AG] est la concentration molaire en AG, [MG] est la concentration molaire en MG,
[DG] est la concentration molaire en DG,
[TG] est la concentration molaire en TG.
Dans la formule ci-dessus, le dénominateur représente concentration totale en radicaux acides gras, qu'il soient sous forme libre ou liée au glycérol. Cette somme reste par conséquent constante, quel que soit le DH. La différence de DH entre 0 et 15 minutes est donc égale à la quantité d'acides gras produits durant cette période, normalisée par la quantité de radicaux acide gras totaux.
Par ailleurs, on a également rapporté la vitesse initiale moyenne d'hydrolyse à la masse de poudre enzymatique introduite dans le milieu. L'activité spécifique moyenne (AS) ainsi calculée nous permettra ainsi de déceler un éventuel effet du rapport lipase /graine sur les performances de cette enzyme. Les résultats des calculs, accompagnés de leur barre d'erreur expérimentale sont présentés sur la figure 9. La différence de DH entre 0 et 15 minutes semble varier linéairement avec le rapport lipase /graines. Un ajustement linéaire a été réalisé pour confirmer cette tendance. Le coefficient de détermination de cette droite est de 0,97, ce qui signifie une bonne linéarité des résultats. Par ailleurs, la droite d'ajustement passe par toutes les barres d'erreurs, ce qui suggère que les écarts observés entre la théorie et les valeurs expérimentales sont explicables.
La proportionnalité entre la quantité d'enzyme et la vitesse initiale de réaction nous indique que ce facteur est limitant de l'hydrolyse, pour des conditions de procédé de mise en contact données. Par ailleurs, la droite de régression passe par zéro. On ne trouve donc pas d'inhibition pour les faibles quantités de lipase.
Cette observation est par ailleurs confortée par les calculs d'activité spécifique qui indiquent que l'enzyme conserve, aux erreurs expérimentales près, une efficacité relativement constante quelle qu'en soit la concentration.
Cependant, ces données n'indiquent pas pour autant que l'efficacité de la lipase à l'interface est optimale. En effet, les résultats obtenus dans les exemples précédents montrent que les étapes de cassage des parois cellulaires jouent un rôle très important sur celle-ci. L'exemple le plus illustratif est la puissance de sonication du milieu, qui doit être optimale. Malgré la linéarité de la vitesse initiale de réaction en fonction de la quantité de lipase ajoutée, une inhibition compétitive à l'interface des lipides en emulsion reste présente.
Conclusion
Conformément à ce qui a déjà été évoqué dans la littérature ou dans les précédents rapports d'avancement, la quantité de lipase introduite a un effet positif sur la cinétique d'hydrolyse des lipides de la graine. Le calcul des vitesses initiales nous permet de montrer que cette réponse varie linéairement avec la quantité d'enzyme ajoutée au milieu, l'activité spécifique restant quant à elle relativement stable. Il en est déduit que malgré une inhibition engendrée par une compétition pour la fixation à l'interface, la quantité de lipase introduite dans le milieu est un facteur limitant de l'hydrolyse. EXEMPLE 10 : Caractéristigues de l'homogénat. A. MATERIEL ET METHODES
Mode opératoire
Les milieux observés sont préparés selon le même protocole que lors de l'étude de la réactivité présentée dans l'exemple précédent. Le rapport lipase / graine est fixé à 333 UL / g de graines. Le cassage cellulaire est pour sa part assuré par un broyage humide 5 minutes suivi d'une période de 5 min. de sonication à 82 W. La proportion de graine introduite est de 13,5 % en masses. Les milieux ainsi obtenus sont laissés à réagir jusqu'à hydrolyse totale.
Une aliquote du milieu d'hydrolyse est ensuite dilué 10 fois avant d'être monté entre lame et lamelle. L'observation se fait par transmission à l'aide d'un microscope optique Nikon Eclipse E600 (Nikon, Japon), muni d'oculaires grossissant 10χ et d'objectifs plan fluor χ10, χ40 et χ100 du même fournisseur. Les prises de vues sont réalisées grâce à une caméra digitale DMX . 1200 (Nikon, Japon), les images étant enregistrées dans un ordinateur par le logiciel Lucia G (Nikon, Japon). Aucun retraitement de celles-ci n'a été effectué ultérieurement
B. RESULTATS
Trois grossissements ont été utilisés pour la réalisation des clichés. Une vue d'ensemble a tout d'abord été prise. La Figure 10 illustre les différents constituants du milieu ainsi que son organisation après broyage et hydrolyse. C'est au sein de celle-ci que la lipase évolue et réagit avec les lipides de la graine.
Sur la Figure 10, on peut déjà distinguer les différentes structures observées macroscopiquement lors de la centrifugation du milieu. Les lipides situés au premier plan sont nets, tandis que les plus grosses particules qui reposent sur la lamelle après décantation sont plus floues. Sur la figure 10, les débris de coque très importants en taille sont notamment présents. Leurs dimensions sont de l'ordre de 100 à 200μm. Etant donné leur faible épaisseur, il n'est quasiment jamais possible de les voir autrement que de face. Les restes des cellules lysées sont également visibles. Si certaines de celles-ci, telles celles situées en haut de la figure 10, sont totalement vides, d'autres semblent en revanche moins affectées par les différents traitements de cassage subis. C'est le cas de l'amas cellulaire sombre localisé en bas de la figure 9. Les acides gras en emulsion sont également visible au premier plan.
Sur la figure 10, les acides gras apparaissent sous la forme d'une granulation présente sur toute la surface observée. On remarque que les gouttelettes lipidiques ne semblent pas se disperser mais plutôt s'agréger en petits amas. Ce phénomène est important pour l'efficacité de l'étape d'extraction car il indique que les tensioactifs de toutes natures qui garnissent les globules gras ne créent pas de répulsion entre ces derniers. En cas de difficultés pour la rupture de l'émulsion, seule la rigidité de l'interface peut être mise en cause.
Une meilleure vision de l'émulsion est possible à plus fort grossissement. C'est ce type de vue qui est montrée dans la figure 11. Cette photographe a été prise à partir de la couche grasse séparée par centrifugation, à un grossissement total de 1 OOOx. Cette illustration permet d'observer plus précisément les gouttelettes lipidiques. Une barre d'échelle fournit une référence pour la taille de ces gouttes grasses. Leurs dimensions sont comprises entre 5 et 15 μm. Leur surface apparaît fine et lisse, ce qui suggère que la stabilisation de l'interface est moléculaire, et ne fait pas intervenir de particule solide. Ainsi, cette observation microscopique montre que l'hydrolyse in situ se déroule au niveau d'un système émulsionné liquide /liquide.
Par ailleurs, la photo de la Figure 11 met en évidence que la centrifugation du milieu permet une bonne séparation des lipides et des débris cellulaires issus du cassage de la graine. Par ailleurs, la tendance déjà observée à plus faible grossissement qu'ont les gouttelettes à s'associer pour former des agrégats est confirmée par cette prise de vue plus fine. Enfin, au vu de la taille des globules gras observés, comprise globalement entre 5 et 15 μm, il est vraisemblable qu'un début de coalescence ait déjà eu lieu. En effet, d'après Wâsche et al. (1993), (Wâsche A., Luck T., Holley W., 1993. Influence of technological parameters and protein properties on the aqueous extraction and demulsification of oil from rapeseed, In Food proteins : Structure and functionality developed from the 4th Symposium on food, Schwenke K.D. (cf.) Weinheim 198-200), la taille des oléosomes de la graine de colza est comprise entre 0,5 et 1 ,5 μm, soit 10 fois moindre que celle observée ici. Cette coalescence peut résulter soit de la fusion de globules gras durant le traitement de cassage des structures cellulaires natives, soit d'une instabilité naturelle de l'émulsion formée. La première hypothèse semble cependant la plus vraisemblable, car aucune évolution visible de la taille des globules gras ne semble avoir eu lieu durant la centrifugation.
La figure 12 est un cliché photographique pris à un grossissement intermédiaire de 400χ, montre le détail d'un groupe de cellules ayant subi le procédé d'hydrolyse. Sur cette photographie, il est possible de distinguer nettement des cellules entièrement vidées de leur contenu, mais aussi des cellules renfermant encore une partie de leurs constituants.
Sur la figure 12, on observe qu'une homogénéisation par sonication aboutit à la perforation des parois cellulaires, sans casser complètemen t la cellule puisqu'un grand nombre de cellules sont vidées sans pour autant que leurs parois n'apparaissent endommagées à ce grossissement.
Conclusion
L'observation microscopique des milieux réactionnels est riche en enseignements. Elle permet ainsi de visualiser le milieu dans lequel évolue la lipase lors de la réaction. Les photomicrographies présentées dans les figures 10 à 12 nous permettent notamment de localiser les lipides et de mieux appréhender les interactions qui ont lieu à leur surface. Ainsi, on sait désormais que la stabilisation de l'interface lipides / eau ne fait pas intervenir de particules solides, l'hydrolyse des glycérides ayant par conséquent lieu au sein d'un système liquide /liquide. Par ailleurs, les globules gras ne paraissent pas se repousser, ce qui facilite l'extraction des acides gras. Au niveau cellulaire, les observations réalisées confirment que le broyage des graines les casse relativement grossièrement, tandis que la sonication agit plus finement en perforant les parois cellulaires sans en modifier la structure de masse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d'acides gras par hydrolyse in situ des lipides contenus dans les graines d'une plante, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) broyage des graines en milieu aqueux jusqu'à l'obtention d'une suspension de particules solides d'un diamètre inférieur à 500 μm ; b) ajout d'une lipase exogène dans la suspension obtenue à l'étape a) ; c) homogénéisation de la suspension contenant la lipase jusqu'à l'obtention d'un homogenat constitué d'une emulsion des lipides contenus initialement dans les graines, en mélange avec les particules solides des graines ; d) hydrolyse des lipides contenus dans l'homogénat obtenu à l'étape c) à une température comprise entre 15°C et 55°C, pendant une durée comprise entre 15 minutes et 5 heures ; e) récupération des acides gras résultant de l'hydrolyse des lipides réalisée à l'étape d).
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce qu'à l'étape a), les graines sont ajoutées au milieu aqueux à raison d'une proportion inférieure à 20%, de préférence inférieure à 15%, en poids total du milieu aqueux contenant les graines.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape b), la lipase est ajoutée à raison de 100 à 500 Unités, de préférence de 150 à 400 Unités de lipase par gramme du poids des graines traitées*- à l'étape a).
4. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que l'étape c) d'homogénéisation est réalisée par homogénéisation sous pression ou par homogénéisation par sonication.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'homogénéisation sous pression est réalisée par un ou plusieurs cycles d'homogénéisation à une pression comprise entre 25 et 1000 bars, de préférence entre 100 et 500 bars.
6. Procédé selon la revendication 5, caractérisé en ce que l'homogénéisation sous pression est réalisée par deux cycles d'homogénéisation à haute pression.
7. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que l'homogénéisation par sonication est réalisée à une puissance d'ultrasons supérieure à 20 Watts.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que l'étape e) de récupération des acides gras comprend les étapes suivantes : e1 ) séparation des acides gras des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d), sous la forme d'une emulsion ; e2) extraction des acides gras à partir de l'émulsion avec un solvant.
9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape e1), les acides gras sont séparés des autres constituants de l'homogénat obtenu à l'étape d) par obtention d'un milieu liquide à trois phases, respectivement une phase solide, une phase aqueuse et une phase d'émulsion lipidique, par centrifugation de l'homogénat, puis récupération de la phase d'émulsion lipidique.
10. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce qu'à l'étape e2) les acides gras sont extraits par l'eau ou par un solvant choisi parmi un alcool, un ester, un carbonate organique, une cétone.
11. Procédé selon l'une des revendications 8 à 10, caractérisé en ce que l'étape e2) d'extraction des acides gras est suivie d'une étape e3) de séchage de la solution contenant les acides gras.
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