EP1511756A2 - Ganglioside mit modifizierter acylfunktion - Google Patents

Ganglioside mit modifizierter acylfunktion

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Publication number
EP1511756A2
EP1511756A2 EP03735484A EP03735484A EP1511756A2 EP 1511756 A2 EP1511756 A2 EP 1511756A2 EP 03735484 A EP03735484 A EP 03735484A EP 03735484 A EP03735484 A EP 03735484A EP 1511756 A2 EP1511756 A2 EP 1511756A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
gangliosides
ganglioside
fatty acid
acyl
mixture according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03735484A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Christopher Beermann
Lars Bode
Günther Boehm
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nutricia NV
Original Assignee
Nutricia NV
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nutricia NV filed Critical Nutricia NV
Publication of EP1511756A2 publication Critical patent/EP1511756A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H15/00—Compounds containing hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals directly attached to hetero atoms of saccharide radicals
    • C07H15/02—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures
    • C07H15/04—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical
    • C07H15/10—Acyclic radicals, not substituted by cyclic structures attached to an oxygen atom of the saccharide radical containing unsaturated carbon-to-carbon bonds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/105—Plant extracts, their artificial duplicates or their derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; PREPARATION OR TREATMENT THEREOF
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/40—Complete food formulations for specific consumer groups or specific purposes, e.g. infant formula
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7028—Compounds having saccharide radicals attached to non-saccharide compounds by glycosidic linkages
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/02—Nutrients, e.g. vitamins, minerals

Definitions

  • the invention relates to a ganglioside mixture, the use of this ganglioside mixture for the production of a dietetic, pharmaceutical and nutritional agent and a corresponding agent.
  • Gangliosides are complex glycolipids that are predominantly located on the outer surface of the plasma membrane of a cell. They contain a polar part (head) composed of sugars and sugar derivatives and possibly N-acetylneuraminic acid as well as several non-polar aliphatic chains composed of fatty acids and their derivatives.
  • the structure of the ganglioside oligosaccharide chain directly determines the cell-cell interaction (cell adhesions), receptor coverage (e.g. IL-2, selectins), compare Robb, RJ, J. Immunol. 1986, 136,971-976, enterotoxin binding (antibacterial / antiviral and prebiotic Effects), see also Rueda, R., Sabetel, JL, Maldonaldo, J., Molinos-Font, JA, Gil, AJ Pediatr.
  • the fatty acid composition is responsible for the spatial arrangement of the molecules in a membrane (microdomain formation / clustering) and is a determining factor for the substrate-specific conversion of the glycolipids in the metabolism (enzyme-substrate specificity).
  • a distinction is often not made between the two non-polar aliphatic chains, both of which are called fatty acids.
  • These fatty acids are a structure and function-determining element, compare Ladisch, S., Hasegawa, A :, Li, R., Kiso, M. Biochemistry 1999, 34, 1197-1202.
  • the N-acylsphingosin portion of gangliosides (ceramide) is important as an intracellular signal-mediating molecule.
  • the long-chain acyl groups of gangliosides are omnipresent fatty acids in biological systems and give these gangliosides a high level of bioactivity in their diverse functions.
  • Gangliosides are enzymatically (lysosomal enzymes) intracellularly converted to ceramide, this to sphingomyelin and further to sphingosine, sphingosine-1P. Ceramide also influences the synthesis of diacylglycerol and phosphoryldiacylglycerol via the sphingomyelin conversion. These substances are all highly potent signal-mediating molecules. Gangliosides and gangliosides converted to ceramide thus determine the metabolism and cell functions in a variety of ways. While the 3-keto bound fatty acid of ganglioside contains all metabolites of ceramide e.g. Sphingosine structurally and functionally determined i.e.
  • N-acylated (amide) fatty acid is only contained as a fatty acid composition of the ceramide itself and corresponding glycosyl derivatives and is split off in the metabolism of the secondary messenger substances.
  • acylation of the molecule determines the potency of gangliosides / ceramides and their metabolites as signal-mediating molecules.
  • the metabolism of ganglioside derivatives by substrate-specific enzymes sphingomyelinase, ceramidase, sphingosine acyltransferase
  • ceramide dehydrogenase ceramide dehydrogenase
  • Ceramidkinase is determined by the acyl pattern as a structural element. Saturated fatty acids also cause a Carbon length up to C 24 a fast ganglioside metabolism (de novo synthesis / conversion). The specific acylation of the molecule is also relevant for the influence of gangliosides on various intracellular, regulatory enzymes (phosphokinase C, phospholipase D and various protein phosphatases / kinases).
  • Anticarcinogenic effects (induces apoptosis, stops cell growth), compare Vesper, HL, Schmelz, E.-M., Nikolova-Karakashian, M.N., Dillehay, D.L., Lynch, D.V., Merril, A.H.Jr. J. Nutr. 1999, 129, 1239-1250; Farooqui, A., Harrocks, L.A., Farooqui, T., Chemistry and Physics 2000, 106, 1-29.
  • T cell differentiation is induced (induction of cell maturation); Inhibition of the T cell response, see also Yanagihava, K., Kato, E :, Hitomi, S., Sunamoto, J., Wada, H. Glycoconjugate J. 1999, 16, 59-65.
  • gangliosides which have been extensively described in the literature, are mainly associated with the composition of the oligosaccharide chain.
  • the Lip ⁇ d portion is considered less functional, although it is known that the bioactivity of the gangliosides is caused by the
  • Fatty acid composition is determined. Most of the existing patents are therefore mainly concerned with the oligosaccharide chain or do not specify any specification of the fatty acids, see JP 92105616. Others only provide information on the ratio of saturated to unsaturated fatty acids, see JP 3101691.
  • US Pat. No. 5,366,963 22/94 describes the relationship between the proportion of fatty acids and a chain length ⁇ C18 and> C20 and the immunosuppressive effect of a ganglioside mixture.
  • the fatty acids C18 and C20 are expressly excluded.
  • the object of the present invention is therefore to provide a ganglioside mixture with an improved biological activity.
  • the gangliosides correspond to the following general formula I:
  • This general formula I describes those gangliosides which form the basis for the mixture according to the invention. It is not a matter of providing gangliosides of this type as such, since the mixture according to the invention can even consist of known gangliosides. Rather, the invention consists in that of the gangliosides, which fall under the formula given above and the radicals in this general formula defined in the context of the present documents, the group -CO-R1 is made up of certain fatty acids in certain amounts.
  • the general formula I thus defines the mathematical and material reference base on which the material and obtain quantitative information. It is possible, for example, to obtain mixtures according to the invention exclusively by newly mixing gangliosides or ganglioside mixtures which are already known. Of course, modifications etc. of the gangliosides can also be made, which will be discussed in more detail below.
  • the radical R 2 here denotes a straight, saturated alkyl radical or a straight alkenyl radical, where both radicals have 10 or more carbon atoms, for example up to 30 carbon atoms.
  • the radical R 2 can thus have 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 and 30 carbon atoms exhibit.
  • the number of carbon atoms is preferably an even number, for example 14, 16 and 18.
  • the alkenyl radical can have one, two or three double bonds.
  • the radical R 1 denotes a straight, saturated alkyl radical with 10 or more carbon atoms, for example up to 30 carbon atoms.
  • the radical R 1 can thus have 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 and 30 carbon atoms exhibit.
  • the number of carbon atoms is preferably an even number, for example 18, 20, 22 and 24.
  • the radical R 1 together with the keto group bonded to it represents a fatty acid which is bonded to the rest of the molecule in the form of an amide.
  • This radical -CO-R 1 is referred to as acyl fatty acids in the context of the present documents.
  • an essential aspect of the present invention is that in the ganglioside mixture according to the invention the C20: 0 fatty acid makes up at least 10% by weight of the acyl fatty acids (and thus the group -CO-R 1 ; see above).
  • This information therefore only concerns one of the non-polar aliphatic chains of gangliosides. No statement is made about the other non-polar aliphatic chain and the sugar unit. This other aliphatic chain can be known and / or of any nature.
  • the statement C20: 0 denotes an acyl group with 20 C atoms (the carbon atom of the CO group is counted here) without a double bond (: 0).
  • the C20: 0 fatty acid makes up 10 to 15% by weight.
  • all intermediate values, all narrower ranges and in particular all integer intermediate values are included and disclosed, e.g. B. 1 1, 12, 13 and 14 wt .-%.
  • the weight ratio of the C18: 0 acyl fatty acid in the group -CO-R 1 to the C20: 0 acrylic fatty acid in the group -CO-R 1 is 1.0 to 3.0.
  • This range specification also includes all intermediate values, all narrower ranges and in particular individual values, for example 1, 1, 1, 2, 1, 3, 1, 4, 1, 5, 1, 6, 1, 7, 1, 8, 1, 9, 2.0, 2.1, 2.2, 2.3, 2.4, 2.5, 2.6, 2.7, 2.8 and 2.9.
  • the ganglioside mixture according to the invention can be obtained on the basis of animal (the term “animal” or “animal” used here does not refer to humans and also no sources of human origin) and / or vegetable lipid extracts and / or synthetically produced gangliosides, including those obtained from fungi and unicellular organisms ,
  • the gangliosides can be modified from the lipid extracts given above.
  • lipid extracts of this type with isolates of gangliosides with an enriched fatty acid specification. It is also possible to add chemically synthesized gangliosides to such lipid extracts.
  • the gangliosides that make up the mixture can be made entirely synthetic. It is also possible to combine different types of modifications and / or productions with one another. However, it is preferred to start from native gangliosides. These can then be modified.
  • the mixtures according to the invention are thus preferably composed of native unmodified gangliosides which are mixed with gangliosides were obtained from native gangliosides and then modified. Some of the options for modification are listed below:
  • N-Deacylase EC 351 - new specific fatty acid esterification by acid / alkaline catalyzed chemical esterification or specific fatty acid derivatization according to Anand, J.K., Sadozai, K.K., Hakomori, S. Lipids 1996, 31, 995-998 using free fatty acids.
  • the biological activity of the gangliosides can be increased by modifying the acyl fatty acids in the sense of the invention. This increase in biological activity applies to the most diverse functions of gangliosides. If, for example, a ganglioside has a certain biological activity, the change or modification of the lipid content without, for example, changing the sugar unit increases the corresponding, already existing biological activity. This is due to the fact that the inventive modification of the lipid portion of the gangliosides improves the mobility of the molecule in the membranes.
  • receptor-mediated signals influences cell surface receptors
  • the activity of ion channels e.g. Na / K ATPase
  • membrane-bound enzymes e.g. phosphokinase C
  • gangliosides can be increased by modifying the lipid content (more precisely the acyl fatty acids).
  • the ganglioside mixture according to the invention can be used both in pure form and in the form of an emulsion, in particular an aqueous emulsion.
  • the ganglioside mixture can also be used together with other lipids, it being assumed that the further lipids do not influence the biological activity of the ganglioside mixture or the gangliosides which make it up. This means that the biological activity of the gangliosides is only influenced by the fatty acids in the lipid component of the ganglioside, but not by the fatty acids that are also used.
  • the ganglioside mixture according to the invention can be added to any conventional food and also to a pharmaceutical, insofar as it is expedient.
  • the invention also relates to food, dietetic and pharmaceutical compositions which contain a ganglioside mixture according to the invention.
  • formula food is understood to be one that has been formulated on the basis of animal (but not human) and vegetable starting materials or products.
  • the ganglioside mixture according to the invention can be added, for example, as admixtures or additives to the following products, although this list is not exhaustive: milk and milk products, infant and Children's food, chocolate bars, yoghurt drinks, nutritional supplements, tube food, infusion solutions and products for pregnant women.
  • the ganglioside mixture according to the invention can also be administered in the form of a pharmaceutical agent alone or together with one or more additional active ingredient (s).
  • a pharmaceutical agent alone or together with one or more additional active ingredient (s).
  • These agents can be formulated, for example, as tablets / capsules.
  • customary adjuvants, carriers, auxiliaries, diluents, moisturizing agents, thickeners, flavors, sweeteners, etc. can be used.
  • the pharmaceutical agents can be administered to a patient (i.e., human and animal) in any conventional manner (e.g., parenterally or enterally). However, it is expedient to use agents which are suitable for oral or lingual administration and are formulated in accordance with the mode of administration.
  • a ganglioside-containing mixture or a ganglioside-containing agent of the type described here contains a ganglioside mixture according to the invention, it is only necessary to determine the amount of gangliosides belonging to general formula I and then to analyze whether the specifications given here relate to the acyl group -CO-R1 are fulfilled.
  • the foods, dietetic agents and pharmaceutical agents which contain the ganglioside mixture according to the invention can be used, inter alia, to improve the development of the intestinal tract, the intestinal immune system and the neuronal system and to treat destructive changes in the intestinal tract, the intestinal immune system and the neuronal system.
  • Target groups for the ganglioside mixture according to the invention can be called all ages from newborns to seniors.
  • Ganglioside mixtures While Examples 5 to 8 illustrate application examples or formulation examples for the agents according to the invention.
  • the gangliosides of the ganglioside mixture according to the invention are known compounds, or they can be prepared by known processes.
  • Glycosphingolipids are made from natural matrices (egg, soy, animal milk, colostral milk, buttermilk, animal tissue, etc.) according to Ladisch and Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231 ) extracted with chloroform-methanol and purified by partitioning with diisopropyl ether-1-buthanol-aqueous NaCl solution. The separation of the individual ganglioside species with different saccharide composition can be done using normal phases HPLC according to Gazzotti (Gazzotti G., Sonnino S. Ghidoni R.
  • Glycosphingohpide are directly in the natural matrix (egg, soy, animal milk, colostral milk, buttermilk, animal tissue etc.) or after extraction according to Ladisch and Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231) subjected to transesterification with specific free fatty acids.
  • the substrate is transesterified using a substrate-specific ceramide N-deacylase E.C. 3.5.1.
  • Triton X100 N-acyl chain hydrolysis at pH 5.0-6.0; condensation of the lysospingolipid with free fatty acids at pH 7.0
  • Triton X100 N-acyl chain hydrolysis at pH 5.0-6.0; condensation of the lysospingolipid with free fatty acids at pH 7.0
  • Ito M Kurita T., Kita K.
  • the modified glycosphingohpides can either be used directly with a mixing ratio of the acyl chain specification or can be reassembled according to a mixing ratio of the acyl chain specification with other components.
  • Glycosphingohpide are made from natural matrices (egg, soy, animal milk, colostral milk, buttermilk, animal tissue etc.) according to Ladisch and Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231 ) extracted and purified (see above).
  • the Extract according to Gasa, S (Gasa S., Kamio K., Makita A. Improved preparation method for Isogangliosides. 1992 J. Lipid Res.
  • the new acyl chain specificity of lysogangliosides with specific, free fatty acids, methyl or ethyl esters is demonstrated by acid / alkaline-catalyzed chemical esterification. It is also possible to specifically acrylate the resulting glycosphingohpides with specific fatty acids according to Anand (Anand JK, Sadozai KK, Hakomori SA simple method for the synthesis of ceramides and radiolabeied analogues. 1996 Lipids 31, 995-998).
  • the sphingolipid amines are coupled with specific fatty acids using diethylphosphoryl cyanide in combination with triethylamine.
  • the reaction is free of racemates.
  • the desired products are produced with a yield of 85 - 90%.
  • the advantage of this method is that the specifically esterified gangliosides are in a highly pure form.
  • the modified Glycosphingohpide can according to a mixing ratio of
  • Glycosphingohpide are synthesized chemically or chemoenzymatically with specific fatty acids by complete chemical synthesis according to Duclos (Duclos R.I., The total synthesis of ganglioside GM3. 2000 Carbohydr. Res. 328, 489-507).
  • the synthetically purely produced glycosphingohpids with a defined fatty acid specificity can be reassembled according to a mixture ratio of the acyl chain specification with other components.
  • Buttermilk dry matter is used to provide glycosphingolipids for the manufacture of baby food.
  • the fatty acid distribution of ganglioside extracts from buttermilk with a fat distribution of the N-acyl fatty acids of C18: 0 (10-20% by weight) and C20: 0 (0.01-0.5% by weight) based on the total amount of N- Acyl fatty acids are obtained by mixing in a ratio of 1 to 6 with a raw material modified in the fatty acid distribution (see below), with a fat distribution of the N-acyl fatty acids of C18: 0 (6-9% by weight) and C20: 0 ( 60-90% by weight) to a new N-acyl fatty acid distribution of C18: 0 1-3% by weight and C20: 0 10-15% by weight.
  • the raw material modified in the fatty acid distribution of glycosphingolipids is produced based on 100 g solids content of a formula, as follows:
  • the fatty acid modification is carried out as follows: 1 g of glycosphinolipid extract (approx. 0.83 mmol for MG 1200) is suspended in 10 ml of 20 mM sodium phosphate solution with 0.1% Triton X100, 100 U of ceramide N-deacylase are added and the mixture is stirred for 1-2 hours Incubated at 37 ° C. The hydrolysis of the N-acyl fatty acids takes place at pH 5-6. The solution is then adjusted to a final concentration of 25 mM sodium phosphate by adding sodium phosphate. The specific free fatty acid is added in a molar ratio 1:10 to the glycosphingolipid used (8.3 mmol C20: 0).
  • the transesterification takes place at 37 ° C at pH 7-8 in 1-2 hours.
  • the modified glycosphingohpids are purified using preparative chromatography (RPC18).
  • the phase is conditioned with chloroform / methanol / 0.1 M KCI solution (v / v / v) 3:98:74.
  • the reaction solution is applied to the column.
  • the column is washed with chloroform / methanol / 0.1 M KCI solution (v / v / v) 3:98:74, water and with methanol / water (v / v) 1: 1.
  • the subsequent elution of the glycosphingohpide takes place with ethanol and chloroform / methanol (v / v) 2: 1.
  • the eluate obtained is evaporated to dryness.
  • the process results in approx. 0.8 g glycosphingohpide per liter buttermilk with a fat distribution of the N-acyl fatty acids of C18: 0 (6-9% by weight) and C20: 0 (60-90% by weight) based on the Total amount of N-acyl fatty acids.
  • a baby milk formula (Aptamil® from Milupa) with 11.8 g of protein, 56.9 g of carbohydrates, 24.9 g of fat, 2.5 g of minerals, vitamins and 45 mg of taurine is produced in the form of a pearlate in the usual way.
  • the ganglioside mixture described in a) is added in an amount of 0.2-500 mg / 100 mg, based on the solids content of the formula.
  • Ganglioside extracts from cow colostral milk, egg lecithin or buttermilk were modified by modifying the N-acyl fatty acid distribution or by mixing a raw material with a raw material modified in the fatty acid distribution (see above) with a fat distribution of the N-acyl fatty acids from to a fatty acid distribution of 1-3 % By weight C18.0 and 10-15% by weight C20: 0 based on the total amount of N-acyl fatty acids.
  • the ganglioside mixture described is formulated in softgel capsules at 10 to 50 mg / capsule.
  • An effervescent tablet (final weight 4.15 g) (Neovin® from Milupa is produced by adding 10 to 50 mg of the described ganglioside mixture in a manner known per se. One tablet is dissolved in 150 ml of water and drunk daily.
  • a balanced powdered diet (Dilsana® from Milupa) with 22.5 g protein, 7.7 g fat, 60.8 g carbohydrates, 5.4 g minerals and vitamins is prepared in a manner known per se with the incorporation of 0.2- 500 mg of the ganglioside mixture described based on 100 mg solids content of the formula food. Up to 3 x 50 g of food are dissolved and administered in 150 ml of water daily.

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Abstract

Bereitgestellt wird eine Gangliosidmischung, die Ganglioside der folgenden allgemeinen Formel: (Zucker)-OCH2-CH(-NH-CO-R<1>)-CH(OH)-CH=CH-R<2>, worin (Zucker) für einen Zuckerrest steht, die Gruppe -CO-R<1> eine Acyl-Fettsäure darstellt, die in Form eines Amides an den Rest des Moleküls gebunden ist, R<l> einen geraden, gesättigten Alkylrest mit mindestens 10 C-Atomen bedeutet und R<2> einen geraden, gesättigten Alkylrest mit mindestens 10 C-Atomen oder einen geraden Alkenylrest mit mindestens 10 C-Atomen und einer, zwei oder drei Doppelbindung(en) bedeutet, enthält oder daraus besteht. Diese Mischung zeichnet sich dadurch aus, dass von den vorhandenen Gangliosiden der allgemeinen Formel I mindestens 10 Gew.-% der Gruppe -CO-R<1> und somit der Acyl-Fettsäuren eine C20:0 Fettsäure sind. Diese Mischungen verfügen über eine verbesserte biologische Aktivität.

Description

Titel: Ganglioside mit modifizierter Acylfunktion
BESCHREIBUNG
Die Erfindung betrifft eine Gangliosidmischung, die Verwendung dieser Gangliosidmischung zur Herstellung eines diätetischen, pharmazeutischen und Nahrungs-Mittels sowie ein entsprechendes Mittel.
Ganglioside sind kompliziert aufgebaute Glycolipide, die vorwiegend auf der äußeren Oberfläche der Plasmamembran einer Zelle lokalisiert sind. Sie enthalten einen polaren, aus Zuckern sowie Zuckerderivaten und ggf. N-Acetylneuraminsäure aufgebauten Teil (Kopf) sowie mehrere unpolare, aus Fettsäuren und deren Derivate aufgebaute aliphatische Ketten.
Die Struktur der Oligosaccharidkette der Ganglioside bestimmt direkt die Zeil-Zeil Interaktion (Zelladhäsionen), Rezeptorabdeckung (z.B. IL-2, Selektine), vergleiche dazu Robb, R.J., J. Immunol.1986, 136,971-976, Enterotoxinbindung (antibakterielle/antivirale und prebiotische Effekte), vergleiche dazu Rueda, R., Sabetel, J.L., Maldonaldo, J., Molinos-Font, J.A., Gil, A. J. Pediatr. 1998, 133, 90-94, Adhäsion/Antikörperbindung vergleiche dazu Weite, K. , Miller, G., Chapman, P.B., Yuasa H., Natoli, E., Kunicka, J.E., Cordon-Cardo, C, Buhrer C, Old, L.J., Houghton A.N., J. Immunol. 1987, 139, 1763-1771 und zelluläre Signaltransduktion (GM3 bei T-Zellen), vergleiche dazu Rippo, M.R., Malisan, F., Ravagnan, , Tomassini, B., Condo I., Constantini, P., Susin, S:A., Rufini, A., Todaro, M., Kroemer, G., Testi, R. FASEB J. 2000, 14, 2047-2057.
Die Fettsäurezusammensetzung ist hingegen verantwortlich für die räumliche Anordnung der Moleküle in einer Membran (Microdomainbildung/ Clustering) und ist mitbestimmend für den substratspezifischen Umsatz der Glycolipide im Stoffwechsel (Enzym- Substratspezifität). Wenn in der Literatur im Zusammenhang mit Gangliosiden von deren Fettsäurezusammensetzung die Rede ist, wird häufig nicht zwischen den beiden unpolaren aliphatischen Ketten unterschieden, die beide als Fettsäuren bezeichnet werden. Diese Fettsäuren sind dabei ein struktur- und funktionsbestimmendes Element, vergleiche dazu Ladisch, S., Hasegawa, A:, Li, R., Kiso, M. Biochemistry 1999, 34, 1197-1202. Der N- Acylsphingosin Anteil von Gangliosiden (Ceramid) ist als intrazelluläres Signal vermittelndes Molekül bedeutend. Die langkettigen Acylgruppen von Gangliosiden sind in biologischen Systemen allgegenwärtige Fettsäuren und verleihen diesen Gangliosiden in ihren vielfältigen Funktionen eine hohe Bioaktivität.
Ganglioside werden enzymatisch (lysosomale Enzyme) intrazellulär zu Ceramid, dieses zu Sphingomyelin und weiter zu Sphingosin, Sphingosin- 1 P umgesetzt. Ceramid beeinflusst über den Sphingomyelin-Umsatz auch die Synthese von Diacylglycerol und Phosphoryldiacylglycerol. Diese Stoffe sind alle hochpotente signalvermittelnde Moleküle. Ganglioside und zu Ceramid umgesetzte Ganglioside bestimmen so in vielfältiger Weise den Stoffwechsel und die Zellfunktionen. Während die 3-keto gebundene Fettsäure des Gangliosides alle Stoffwechselprodukte des Ceramides z.B. Sphingosin strukturell und funktionell mitbestimmt d.h. diese aliphatische Kette bleibt im Stoffwechsel unberührt, ist die N- acylierte (Amid)= Fettsäure nur als Fettsäurekomposition des Ceramids selbst und entsprechenden Glycosylderivaten enthalten und wird im Stoffwechsel der sekundären Botenstoffe abgespalten.
Die spezifische Acylierung des Moleküls bestimmt die Potenz von Gangliosiden/ Ceramiden und deren Stoffwechselprodukten als signalvermittelnde Moleküle. Der Stoffwechsel von Gangliosid-Derivaten durch substratspezifische Enzyme (Sphingomyelinase, Ceramidase, Sphingosinacyltransferase) und die enzymatische Regulation der Ceramidaktivität als Signalmolekül (Ceramidehydrogenase,
Ceramidkinase), ist durch das Acyl-Muster als Strukturelement mitbestimmt. Zudem bedingen gesättigte Fettsäuren mit einer Kohlenstofflänge bis C 24 einen schnellen Gangliosid-Stoffwechsel (de novo Synthese/ Umsatz). Die spezifische Acylierung des Moleküls ist auch relevant für den Einfluss von Gangliosiden auf verschiedene intrazellulär, regulative Enzyme (Phosphokinase C, Phospholipase D und verschiedene Proteinphosphatasen/ -kinasen).
Bisher bekannte biologische Funktionen von Gangliosiden sind:
• Entwicklung des Intestinaltraktes des Neugeborenen; intestinale Immunsystem-Entwicklung, vergleiche dazu Rueda, R:, Maldonado, J., Narbona, E:, Gil, A. Early human Development 1998, 53, S135- S147; Jensen, R. Lipids 1999, 34, 1243-1271.
• Anticarzinogene Wirkungen (induziert Apoptose, stoppt das Zellwachstum), vergleiche dazu Vesper, HL, Schmelz, E.-M., Nikolova-Karakashian, M.N., Dillehay, D.L., Lynch, D.V., Merril, A.H.Jr. J. Nutr.1999, 129, 1239-1250; Farooqui, A., Harrocks, L.A., Farooqui, T., Chemistry and Physics 2000, 106, 1-29.
• T-Zellen Differenzierung wird induziert (Induktion der Zellreifung); Inhibition der T-Zell Antwort, vergleiche dazu Yanagihava, K., Kato, E:, Hitomi, S., Sunamoto, J., Wada, H. Glycoconjugate J. 1999, 16, 59-65.
• Prostaglandin-Synthese und COX-Genexpression wird verstärkt, vergleiche dazu Wu, G., Lu, Z., Ledeen, R.W. Glycoconjugate J. 1996, 13, 235-239.
Die umfangreich in der Literatur beschriebenen biologischen Funktionen der Ganglioside werden vor allem mit der Zusammensetzung der Oligosaccharidkette in Verbindung gebracht. Dagegen wird dem Lipϊd- Anteil weniger funktionelle Bedeutung beigemessen, obwohl bekannt ist, dass die Bioaktivität der Ganglioside durch die
Fettsäurezusammensetzung mitbestimmt wird. Die meisten der bisher existierenden Patente befassen sich daher vorwiegend mit der Oligosaccharidkette oder geben keine Spezifikation der Fettsäuren an, man vergleiche JP 92105616. Andere machen nur Angaben für das Verhältnis der gesättigten zu ungesättigten Fettsäuren, man vergleiche JP 3101691.
Im US-Patent 5366963 22/94 wird der Zusammenhang zwischen dem Anteil der Fettsäuren und einer Kettenlänge <C18 und >C20 und der immunsuppressiven Wirkung einer Gangliosidmischung beschrieben. Dabei sind die Fettsäuren C18 und C20 ausdrücklich ausgenommen.
Es wurde nun überraschend gefunden, dass die Lipidkomponente bei den Gangliosiden eine wesentlich höhere Bedeutung hat, als dies bisher angenommen wurde.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, eine Gangliosidmischung mit einer verbesserten biologischen Aktivität bereitzustellen.
Gelöst wird diese Aufgabe durch die Lehre der Ansprüche.
Die Ganglioside entsprechen dabei der folgenden allgemeinen Formel I:
(Zucker)-OCH2-CH(-NH-CO-R1)-CH(OH)-CH=CH-R2 (I)
Diese allgemeine Formel I beschreibt formelmäßig diejenigen Ganglioside, welche die Basis für die erfindungsgemäße Mischung darstellen. Es geht hier nicht um die Bereitstellung von derartigen Gangliosiden als solchen, denn die erfindungsgemäße Mischung kann sogar insgesamt aus bekannten Gangliosiden bestehen. Vielmehr besteht die Erfindung darin, dass von den Gangliosiden, welche unter die oben angegebene Formel und die im Rahmen der hier vorliegenden Unterlagen definierten Reste in dieser allgemeinen Formel fallen, die Gruppe -CO-R1 aus bestimmten Fettsäuren in bestimmten Mengen aufgebaut ist. Die allgemeine Formel I legt somit die rechnerische und stoffliche Bezugsbasis fest, auf die sich die hier gemachten stofflichen und mengenmäßigen Angaben beziehen. Es ist beispielsweise möglich, erfindungsgemäße Mischungen ausschließlich durch ein neues Vermischen bereits bekannter Ganglioside oder Gangliosidgemischen zu erhalten. Natürlich können auch Modifizierungen etc. der Ganglioside vorgenommen werden, worauf nachstehend näher eingegangen wird.
Der Rest R2 bedeutet dabei einen geraden, gesättigten Alkylrest oder einen geraden Alkenylrest, wobei beide Reste 10 oder mehr C-Atomen, beispielsweise bis zu 30 C-Atomen, besitzen. Der Rest R2 kann somit 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 C-Atome aufweisen. Vorzugsweise ist die Anzahl der C-Atome geradzahlig, beispielsweise 14, 16 und 18. Der Alkenylrest kann eine, zwei oder drei Doppelbindung(en) besitzen.
Der Rest R1 bedeutet einen geraden, gesättigten Alkylrest mit 10 oder mehr C-Atomen, beispielsweise bis zu 30 C-Atomen. Der Rest R1 kann somit 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 und 30 C-Atome aufweisen. Vorzugsweise ist die Anzahl der C-Atome geradzahlig, beispielsweise 18, 20, 22 und 24. Der Rest R1 stellt zusammen mit der daran gebundenen Ketogruppe eine Fettsäure dar, die in Form eines Amides an den Rest des Moleküls gebunden ist. Dieser Rest -CO-R1 wird im Rahmen der vorliegenden Unterlagen als Acyl-Fettsäuren bezeichnet.
Ein wesentlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt darin, dass bei der erfindungsgemäßen Gangliosidmischung die C20:0 Fettsäure mindestens 10 Gew.-% der Acylfettsäuren (und somit der Gruppe -CO-R1 ; siehe oben) ausmacht. Diese Angabe betrifft somit nur eine der unpolaren aliphatischen Ketten der Ganglioside. Über die andere unpolare aliphatische Kette und die Zuckereinheit ist damit keine Aussage gemacht. Diese andere aliphatische Kette kann bekannter und/oder beliebiger Natur sein. Die Angabe C20:0 bezeichnet nach der üblichen Nomenklatur eine Acylgruppe mit 20 C-Atomen (das Kohlenstoffatom der CO-Gruppe wird dabei mitgezählt) ohne Doppelbindung (:0).
Nach einer bevorzugten Ausführungsform macht die C20:0 Fettsäure 10 bis 15 Gew.-% aus. Mit dieser Bereichsangabe sind alle Zwischenwerte, alle engeren Bereiche und insbesondere alle ganzzahligen Zwischenwerte umfasst und offenbart, z. B. 1 1 , 12, 13 und 14 Gew.-%.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform beträgt das Gew. -Verhältnis der C18:0 Acyl-Fettsäure in der Gruppe -CO-R1 zu der C20:0 Acryl- Fettsäure in der Gruppe -CO-R1 1 ,0 bis 3,0. Auch diese Bereichsangabe umfasst alle dazwischenliegenden Werte, alle engeren Bereiche und insbesondere Einzelwerte, beispielsweise 1 ,1 , 1 ,2, 1 ,3, 1 ,4, 1 ,5, 1 ,6, 1 ,7, 1 ,8, 1 ,9, 2,0, 2,1 , 2,2, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8 und 2,9.
Die erfindungsgemäße Gangliosidmischung kann auf Basis tierischer (der hier verwendete Begriff 'Tier' oder 'tierisch' bezeichnet nicht den Menschen und auch keine Quellen humanen Ursprungs) und/oder pflanzlicher, einschließlich von Pilzen und Einzellern gewonnener Lipidextrakte und/ oder synthetisch hergestellter Ganglioside erhalten werden. Um die erfindungsgemäße Zusammensetzung der Acyl- Fettsäuren zu erreichen, können die Ganglioside aus den oben gegebenen Lipidextrakten modifiziert werden. Zudem ist es möglich, derartige Lipidextrakte mit Isolaten von Gangliosiden mit angereicherter Fettsäurespezifikation zu versetzen. Auch ist es möglich, derartige Lipidextrakte mit chemisch synthetisierten Gangliosiden zu versetzen. Ferner können die Ganglioside, welche die Mischung ausmachen, vollständig synthetisch hergestellt sein. Auch ist es möglich, verschiedene Arten der Modifizierungen und/ oder Herstellungen miteinander zu kombinieren. Vorzugsweise wird jedoch von nativen Gangliosiden ausgegangen. Diese können dann modifiziert werden. Vorzugsweise sind die erfindungsgemäßen Mischungen somit aufgebaut aus nativen unmodifizierten Gangliosiden, die mit Gangliosiden vermischt wurden, die ausgehend von nativen Gangliosiden erhalten und dann modifiziert wurden. Einige der Möglichkeiten der Modifizierung sind nachfolgend aufgeführt:
• Acylkettenspezifikation von nativen/ isolierten Gangliosiden/ Ceramiden durch enzymatische Abspaltung des N-Acylrestes (Sphingolipid/ Ceramid
N-Deacylase EC 351 -) und neue spezifische Fettsäureveresterung durch sauer/ alkalisch katalysierte chemische Veresterung oder spezifischer Fettsäure Derivatisierung nach Anand, J.K., Sadozai, K.K., Hakomori, S. Lipids 1996, 31 , 995-998 mittels freien Fettsäuren.
• Interesterifikation von Gangliosiden durch die Ceramid N-Deacylase EC351 mit spezifischen freien Fettsäuren, Methyl-, Ethylestern oder Triacylglyceriden bei optimiertem pH-Wert und Temperatur.
• Acylkettenspezifikation von nativen, isolierten Gangliosiden/ Ceramiden durch Deacylierung zu Lysogangliosiden nach Gasa, S., Kamio, K., Makita, A. J. Lipid Res. 1992, 33, 1079-1084, gefolgt von einer sauer/ alkalisch katalysierten chemischen Veresterung spezifischer Fettsäuren mittels freien Fettsäuren, Methyl-, Ethylestern oder Triacylglyceriden.
Auf diese Möglichkeiten der Modifizierung wird nachstehend in den Beispielen noch näher eingegangen.
Durch die Modifizierung der Acyl-Fettsäuren im erfindungsgemäßen Sinne kann die biologische Aktivität der Ganglioside erhöht werden. Diese Erhöhung der biologischen Aktivität gilt für die unterschiedlichsten Funktionen der Ganglioside. Verfügt ein Gangliosid beispielsweise über eine bestimmte biologische Aktivität, wird durch die Veränderung bzw. die Modifizierung des Lipid-Anteils, ohne dass beispielsweise die Zuckereinheit verändert wird, die entsprechende, bereits vorhandene biologische Aktivität erhöht. Dies beruht darauf, dass durch die erfindungsgemäße Modifizierung des Lipid-Anteils der Ganglioside eine verbesserte Mobilität des Moleküls in den Membranen erreicht wird . Die hohe Mobilität und die durch die erfindungsgemäße Fettsäure- Zusammensetzung induzierte räumliche Anordnung von Gangliosiden in der Membran (Clustering, Cholesterol/ Glycolipid Mikrodomainen) führen zu einer Verstärkung Rezeptor-vermittelter Signale (beeinflusst Zelloberflächen-Rezeptoren), der Aktivität von lonenkanälen (z.B.: Na/K ATPase) und der Aktivität membranständiger Enzyme (z.B. Phosphokinase C), vergleiche dazu Zeller, C.B., Marchase, R,B., Am. J. Physiol. 1992, 262, C1341-C1355.
Durch die Modifizierung des Lipid-Anteils (genauer der Acyl-Fettsäuren) kann die bereits vorhandene biologische Aktivität von Gangliosiden verstärkt werden.
Die erfindungsgemäße Gangliosidmischung kann sowohl in reiner Form als auch in Form einer Emulsion, insbesondere einer wässrigen Emulsion Anwendung finden. Die Gangliosidmischung kann auch mit anderen Lipiden zusammen eingesetzt werden, wobei davon ausgegangen wird, dass die weiteren Lipide die biologische Aktivität der Gangliosidmischung bzw. der diese ausmachenden Ganglioside nicht beeinflusst. Dies bedeutet, dass die biologische Aktivität der Ganglioside nur durch die Fettsäuren in der Lipid-Komponente des Gangliosides, aber nicht durch die Fettsäuren, die zusätzlich Anwendung finden, beeinflusst wird.
Die erfindungsgemäße Gangliosidmischung kann jedem üblichen Nahrungsmittel und auch einem Pharmazeutikum, soweit es zweckdienlich ist, zugesetzt werden. Mit anderen Worten, Gegenstand der Erfindung sind auch Nahrungs-, diätetische und pharmazeutische Mittel, die eine erfindungsgemäße Gangliosidmischung enthalten.
Zu diesen Mitteln zählen insbesondere Fertignahrungen, Nahrungssupplemente und Formelnahrungen. Unter einer Formelnahrung wird in diesem Zusammenhang eine solche verstanden, die auf Basis von tierischen (jedoch nicht humanen) und pflanzlichen Ausgangsstoffen bzw. -Produkten formuliert wurde. Die erfindungsgemäße Gangliosidmischung kann beispielsweise als Beimengungen oder Additive folgenden Produkten zugegeben werden, wobei diese Aufzählung nicht abschließend ist: Milch und Milchprodukte, Säuglings- und Kindernahrungen, Schokoriegel, Joghurtgetränke, Aufbaunahrung, Sondennahrung, Infusionslösungen und Produkten für Schwangere.
Die erfindungsgemäße Gangliosidmischung kann auch in Form eines pharmazeutischen Mittels alleine oder zusammen mit einem oder mehreren zusätzlichen Wirkstoff(en) verabreicht werden. Diese Mittel können beispielsweise als Tablette/Kapsel formuliert sein. Für die Formulierung derartiger Pharmazeutika können übliche Adjuvantien, Träger, Hilfsmittel Verdünnungsmittel, feucht-haltende Mittel, Verdickungsmittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel usw. Anwendung finden.
Die pharmazeutischen Mittel können auf jede übliche Weise ( z. B. parenteral oder enteral) an einen Patienten (d.h. Mensch und Tier) verabreicht werden. Zweckmäßigerweise handelt es sich jedoch um Mittel, die zur oralen oder lingualen Verabreichung geeignet und entsprechend der Verabreichungsart formuliert sind.
Um festzustellen, ob eine Ganglioside aufweisende Mischung oder ein Ganglioside aufweisendes Mittel der hier beschriebenen Art eine erfindungsgemäße Gangliosidmischung enthält, ist es lediglich erforderlich, die Menge der zu der allgemeinen Formel I gehörenden Ganglioside zu ermitteln und dann zu analysieren, ob die hier gegebenen Spezifikationen bezüglich der Acylgruppe -CO-R1 erfüllt sind.
Sollten auch Verbindungen oder Ganglioside vorhanden sein, die nicht unter die allgemeine Formel I fallen, was durchaus möglich ist, dann werden diese bei der Berechnung nicht berücksichtigt.
Die Nahrungsmittel, diätetischen Mittel und pharmazeutischen Mittel, welche die erfindungsgemäße Gangliosidmischung enthaltenden, können unter anderem zur Verbesserung der Entwicklung des Intestinaltraktes, des intestinalen Immunsystems und neuronalen Systems und Behandlung destruktiven Veränderungen des Intestinaltraktes, des intestinalen Immunsystems und neuronalen Systems eingesetzt werden. Als Zielgruppen für die erfindungsgemäße Gangliosidmischung können alle Altersstufen von Neugeborenen bis zu Senioren genannt werden.
Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert. Dabei beschreiben die Beispiele 1 bis 4 Verfahren zur Herstellung bzw. Modifizierung der erfindungsgemäßen Ganglioside bzw.
Gangliosidmischungen, während die Beispiele 5 bis 8 Anwendungsbeispiele bzw. Formulierungsbeispiele für die erfindungsgemäßen Mittel erläutern. Bei den Gangliosiden der erfindungsgemäßen Gangliosidmischung handelt es sich um bekannte Verbindungen, oder sie können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.
Beispiel 1 :
Extraktion und Separation aus Rohstoffen:
Glycosphingolipide werden aus natürlichen Matrizes (Ei, Soja, tierische Milch, Kolostralmilch, Buttermilch, tierische Gewebe u.a.) nach Ladisch und Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231) mit Chloroform-Methanol extrahiert und über eine Partitionierung mit Diisopropylether-1-Buthanol-wässriger NaCI Lösung aufgereinigt. Die Auftrennung der einzelnen Gangliosidspezies mit unterschiedlicher Saccharidkomposition kann über Normalphasen HPLC nach Gazzotti (Gazzotti G., Sonnino S. Ghidoni R. Normal phase high Performance liquid chromatograhpic Separation of non-derivatized ganglioside mixtures. 1985 J. Chromatogr. 348, 371-378) erfolgen. Die Separierung und Fraktionierung von Gangliosiden bezüglich der Acylkettenspezifität wird über RP-HPLC wie folgt durchgeführt: In Wasser gelöste Ganglioside werden über eine RP-8 Column mit einem Solventensystem aus Acetonitril mit 5mM Natriumphosphat-Puffer, pH7,0 aufgetrennt. Die Aufzeichnung des Chromatogramms erfolgt über UV/VIS Detektion (Wellenlänge: 195nm) nach Wagener (Wagener R. Kobbe B., Stoffel W. Quantification of gangliosides by microbore high Performance liquid chromatography, 1996 J. Lipid Res. 37, 18231829) oder über eine Light Scattering Detektion nach Caboni (Caboni M.F., Menotta S., Lercker G. Separation of phospholipids in different foods with light- scattering detector, 1996 JAOCS 73, 1561-1566). Die erhaltenen Fraktionen werden über eine Fünfpunktkallibrierung des Chromatogramms quantifiziert. Die einzelnen Acylkettenspezifitäten werden mittels automatischem Fraktionssammler akkumuliert und können entsprechend einem Mischungsverhältnis der Acylkettenspezifikation neu zusammengestellt werden.
Beispiel 2:
Enzymatische Transesterifikation:
Glycosphingohpide werden direkt in der natürlichen Matrix (Ei, Soja, tierische Milch, Kolostralmilch, Buttermilch, tierische Gewebe u.a.) oder nach Extraktion nach Ladisch und Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231 ) einer Transesterifikation mit spezifischen freien Fettsäuren unterzogen. Die Transresterifikation des Substrates erfolgt mittels einer Substrat-spezifischen Ceramide-N-Deacylase E.C. 3.5.1. - (Sigma-Aldrich, Inc., USA) mit spezifischen freien Fettsäuren bei optimalen pH-Werten in 0.1 % Triton X100 (N-Acylketten Hydrolyse bei pH-Wert 5.0-6.0; Kondensation des Lysospingolipids mit freien Fettsäuren bei pH-Wert 7.0) (Ito M,., Kurita T., Kita K. A novel enzyme that cleaves the N-acyl linkage of ceramides in various glycosphingolipids as well as sphingomyeline to produce their lysoforms. 1995 J. Biol. Chem. 270, 24370-24374; Kita K., Okino N., Ito M. Reverse hydrolysis reaction of a recombinant alkaline ceramidase of Pseudomonas aeruginosa. 2000 Biochim. Biophys. Acta 1485 (2-3), 111-120). Die modifizierten Glycosphingohpide können entweder direkt mit einem Mischungsverhältnis der Acylkettenspezifikation verwendet werden oder entsprechend einem Mischungsverhältnis der Acylkettenspezifikation mit anderen Komponenten neu zusammengestellt werden.
Beispiel 3:
Chemische Fettsäuremodifikation:
Glycosphingohpide werden aus natürlichen Matrizes (Ei, Soja, tierische Milch, Kolostralmilch, Buttermilch, tierische Gewebe u.a.) nach Ladisch und Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231) extrahiert und aufgereinigt (siehe oben). Um die Acylkettenspezifikation von isolierten Gangliosiden zu verändern wird das Extrakt nach Gasa, S (Gasa S., Kamio K., Makita A. Improved preparation method for Isogangliosides. 1992 J. Lipid Res. 33, 1079- 1084) durch N-Trifluoroacetylierung des Sphingosines, gefolgt von einer N-Acetylierung und anschließender milden Verseifung, in korrespondierende dideacylierte Ganglioside (Schutzgruppe) umgesetzt. Diese werden chemisch zu Lysogangliosiden deacyliert. Die Abspaltung der Acylketten von nativen Gangliosiden kann auch über direkte chemische Hydrolyse nach Gaver und Sweeley (Gaver R.C. Sweeley C.C., Methods for methanolysis of sphingolipids and direct determination of long chain bases by gas chromatography. 1995 J. Lipid Res. 24, 1389- 1397) oder über eine saure Hydrolyse nach Andu (Kadowaki, H., Bremer, E:G:, Evans, J.E., Jungalwala, F.B., McCIuer, RH. Acetonitrile- hydrochloric acid hydrolisis of gangliosides for high Performance liquid Chromatographie analysis of their long chain bases. J. Lipid Res. 1983, 24, 1389-1397) mittels Inkubation des Substrates mit 0.5M HCI in Acetonitril (oder Methanol) und 4M H2O bei 75 °C, 2 Stunden erfolgen. Die resultierenden Lysoganglioside werden durch Anionenaustauscher- Chromatographie mittels Aminopropylphase von den freien Fettsäuren, Salzen und niedermolekularen Kontaminanten getrennt. Die neue Acylkettenspezifität der Lysoganglioside mit spezifischen, freien Fettsäuren, Methyl- oder Ethylestern wird durch sauer/ alkalisch katalysierte chemische Veresterung dargestellt. Es ist ebenfalls möglich, die resultierenden Glycosphingohpide mit spezifischen Fettsäuren chemisch nach Anand (Anand J.K., Sadozai K.K., Hakomori S.A simple method for the synthesis of ceramides and radiolabeied analogues. 1996 Lipids 31 , 995-998) spezifisch zu aeylieren. Unter Verwendung von Diethylphosphorylcyanid in Kombination von Triethylamin werden die Sphingolipid-Amine mit spezifischen Fettsäuren gekoppelt. Es ist so möglich, spezifische N-Fettsäure-Sphingolipide, Cerebroside und Ganglioside darzustellen. Die Reaktion ist frei von Razematen. Die gewünschten Produkte entstehen mit einer Ausbeute von 85 - 90 %. Vorteil dieser Methode ist es, dass die spezifisch veresterten Ganglioside in hoch reiner Form vorliegen. Die modifizierten Glycosphingohpide können entsprechend einem Mischungsverhältnis der
Acylkettenspezifikation mit anderen Komponenten neu zusammengestellt werden.
Beispiel 4:
Chemische Synthese:
Glycosphingohpide werden durch vollständige chemische Synthese nach Duclos (Duclos R.I., The total synthesis of ganglioside GM3. 2000 Carbohydr. Res. 328, 489-507) mit spezifischen Fettsäuren chemisch oder chemoenzymatisch synthetisiert. Die synthetisch rein erzeugten Glycosphingohpide mit einer definierten Fettsäurespezifität können entsprechend einem Mischungsverhältnis der Acylkettenspezifikation mit anderen Komponenten neu zusammengestellt werden.
Beispiel 5:
Herstellung von Babynahrungen:
Zur Bereitstellung von Glycosphingolipiden zur Herstellung von Babynahrung wird Buttermilchtrockenmasse verwendet. Die Fettsäureverteilung von Gangliosid-Extrakten aus Buttermilch mit einer Fettverteilung der N-Acyl-Fettsäuren von C18:0 (10-20 Gew.-%) und C20:0 (0.01- 0.5 Gew.-%) bezogen auf die Gesamtmenge der N-Acyl- Fettsäuren wird durch Mischen im Verhältnis 1 zu 6 mit einem in der Fettsäureverteilung modifizierten Rohstoff (siehe unten), mit einer Fettverteilung der N-Acyl-Fettsäuren von C18:0 (6-9 Gew.-%) und C20:0 (60- 90 Gew.-%) zu einer neuen N-Acyl-Fettsäureverteilung von C18:0 1- 3 Gew.-% und C20:0 10-15 Gew.-% eingestellt. Der in der Fettsäureverteilung von Glycosphingolipiden modifizierte Rohstoff wird, bezogen auf 100 g Feststoffgehalt einer Formelnahrung, wie folgt hergestellt: Die Glycosphingohpide, vorwiegend GM1 , GM3, GD1a, GD1 b aus Buttermilch (Uelzena, Germany) mit einem Fettanteil von 10-15%, wird nach Ladisch und Gillard (Ladisch S., Gillard B. A solvent partition method for morcoscale ganglioside purification. 1984 Analytical Biochemistry 146, 220-231 ) extrahiert und aufgereinigt. 10g Buttermilch Trockenmasse (entspricht ca. 1 Liter Milch) werden mit 50 ml Methanol und 50 ml Chloroform vermengt, 15 Minuten extrahiert und anschließend bei 4°C pelletiert. Der Überstand wird über Rotationsverdampfen oder Lyophilization auf ca. % des Ausgangsvolumens eingeengt. Darauffolgend werden die Proteinanteile der Lösung bei -20°C gefällt und pelletiert. Der Überstand wird bis zur Trockne eingeengt. Zur Partitionierung wird das Extrakt mit 60 ml Diisopropylether/1-Butanol (v/v) 60:40 resuspendiert und darauffolgend 30 ml Wasser zugegeben. Es erfolgt eine Phasentrennung. Die wässrige Phase enthält den Glycosphingolipidanteil (ca. 1 g/l) des Rohstoffs. Die Fettsäuremodifikation wird wie folgt durchgeführt: 1g Glycosphinolipid- Extrakt (ca. 0.83 mmol bei MG 1200) wird in 10 ml 20 mM Natriumphosphat-Lösung mit 0.1 % Triton X100 suspendiert, 100 U Ceramide-N-Deacylase hinzugefügt und 1-2 Stunden bei 37°C inkubiert. Die Hydrolyse der N-Acyl-Fettsäuren erfolgt bei pH 5-6. Darauffolgend wird die Lösung durch Natriumphosphatgabe auf 25 mM Natriumphosphat Endkonzentration eingestellt. Die spezifische freie Fettsäure wird im molaren Verhältnis 1 :10 zum eingesetzten Glycosphingolipid (8.3 mmol C20:0) zugegeben. Die Transesterifikation erfolgt bei 37°C bei pH 7-8 in 1 -2 Stunden. Die modifizierten Glycosphingohpide werden über eine präparative Chromatographie (RPC18) aufgereinigt. Hierbei erfolgt die Konditionierung der Phase mit Chloroform/Methanol/0.1 M KCI-Lösung (v/v/v) 3:98:74. Die Reaktionslösung wird auf die Säule appliziert. Die Säule wird mit Chloroform/Methanol/0.1 M KCI-Lösung (v/v/v) 3:98:74, Wasser und mit Methanol/Wasser (v/v) 1 :1 gewaschen. Die anschließende Elution der Glycosphingohpide erfolgt mit Ethanol und Chloroform/Methanol (v/v) 2:1. Das gewonnene Eluat wird bis zur Trockne eingeengt. Aus dem Prozess resultieren ca. 0.8 g Glycosphingohpide pro Liter Buttermilch mit einer Fettverteilung der N- Acyl-Fettsäuren von C18:0 (6-9 Gew.-%) und C20:0 (60- 90 Gew.-%) bezogen auf die Gesamtmenge der N-Acyl-Fettsäuren. Eine im Eiweiß adaptierte Säuglingsmilchnahrung (Aptamil® von Milupa) mit 11 ,8 g Eiweiß, 56,9 g Kohlenhydrate 24,9 g Fett, 2,5 g Mineralstoffen, Vitaminen und 45 mg Taurin wird auf übliche Weise in Form eines Perlates hergestellt. Die in a) beschriebene Gangliosidmischung wird in einer Menge von 0,2-500 mg/ 100 mg, bezogen auf den Feststoffgehalt der Formelnahrung zugegeben.
Beispiel 6:
Nahrungssupplemente:
Gangliosid-Extrakte aus Kuh-Kolostralmilch, Eilecithin oder Buttermilch wurden Modifikation der N-Acylfettsäureverteiiung oder durch Mischen eines Rohstoffes mit einem in der Fettsäureverteilung modifizierten Rohstoff (siehe oben) mit einer Fettverteilung der N-Acyl-Fettsäuren von zu einer Fettsäureverteilung von 1-3 Gew.-% C18.0 und 10-15 Gew.-% C20:0 bezogen auf die Gesamtmenge der N-Acyl-Fettsäuren eingestellt.
Die beschriebenen Gangliosidmischung wird in Softgel Kapseln zu 10 bis 50 mg/Kapsel formuliert.
Beispiel 7:
Produkt für Schwangere
Eine Brausetablette (Endgewicht 4,15 g) (Neovin® von Milupa wird unter Beimengung von 10 bis 50 mg der beschriebenen Gangliosidmischung auf per se bekannte Weise hergestellt. Täglich wird eine Tablette in 150 ml Wasser gelöst und getrunken.
Beispiel 8:
Produkt für Ältere und geschwächte Personen
Eine bilanzierte pulverförmige Aufbaunahrung (Dilsana® von Milupa) mit 22,5 g Eiweiß, 7,7 g Fett, 60,8 g Kohlenhydrate, 5,4 g Mineralstoffen und Vitaminen wird auf per se bekannte Weise unter Einarbeitung von 0,2- 500 mg der beschriebenen Gangliosidmischung bezogen auf 100 mg Feststoffgehalt der Formelnahrung hergestellt. Täglich werden bis zu 3 x 50 g der Nahrung in 150 ml Wasser gelöst und verabreicht.

Claims

Titel: Ganglioside mit modifizierter AcylfunktionPATENTANSPRÜCHE
1. Gangliosidmischung enthaltend Ganglioside oder bestehend aus Gangliosiden der folgenden allgemeinen Formel I: (Zucker)-OCH2-CH(-NH-CO-R1)-CH(OH)-CH=CH-R2 (I), worin
(Zucker) für einen Zuckerrest steht, die Gruppe -CO-R1 eine Acyl-Fettsäure darstellt, die in Form eines
Amides an den Rest des Moleküls gebunden ist, R1 einen geraden, gesättigten Alkylrest mit mindestens 10 C-Atomen bedeutet und
R2 einen geraden, gesättigten Alkylrest mit mindestens 10 C-Atomen oder einen geraden Alkenylrest mit mindestens 10 C-Atomen und einer, zwei oder drei Doppelbindung(en) bedeutet, dadurch g eke n nzei chn et, dass bei den in der Mischung vorhandenen Gangliosiden der allgemeinen Formel I mindestens 10 Gew.-% der Gruppe -CO-R1 und somit der Acyl-Fettsäuren eine C20:0 Fettsäure sind.
2. Gangliosidmischung nach Anspruch 1, dadurch g eke n nzeichn et, dass die C20:0 Fettsäure 10 bis 15 Gew.-% der Gruppe -CO-R1 und somit der Acyl-Fettsäuren ausmacht.
3. Gangliosidmischung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch g eke n nzei c hn et, dass die Gruppe -CO-R1 eine C18:0 Fettsäure bedeuten kann und das
Gewichtsverhältnis dieser C18:0 Fettsäure zu der C20:0 Fettsäure der Gruppe -CO-R11,0 bis 3,0 beträgt.
4. Gangliosidmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g eke n nzeichnet, dass die Gruppe -CO-R1 eine C23:0 Fettsäure bedeuten kann, welche 10 Gew.-% oder weniger der Acyl-Fettsäuren im Lipidteil des Moleküls der Ganglioside ausmacht.
5. Gangliosidmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch geken n ze i ch n et, dass die Gangliosidmischung zusammengesetzt ist einerseits aus unmodifizierten Gangliosiden, die aus natürlich vorkommenden Quellen tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs gewonnen wurden, und andererseits aus Gangliosiden, die ebenfalls aus natürlich vorkommenden Quellen tierischen und/oder pflanzlichen Ursprungs gewonnen wurden und dann jedoch modifiziert wurden.
6. Gangliosidmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch geken n ze i ch n et , dass sie als wässrige Emulsion vorliegt.
7. Gangliosidmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch g eken n ze i ch net , dass sie einen Bestandteil einer Fettmischung darstellt.
8. Gangliosidmischung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch geke n n ze i ch net , dass sie einer Fertignahrung, einem Nahrungssupplement oder einer Formelnahrung einverleibt ist.
9. Verwendung einer Gangliosidmischung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Herstellung eines diätetischen, pharmazeutischen oder Nahrungs-Mittels.
10. Verwendung nach Anspruch 9, dadurch geken n ze i ch n et , dass es sich bei dem Nahrungs-Mittel um eine Fertignahrung, ein Nahrungssupplement oder eine Formelnahrung handelt.
11. Diätetisches, pharmazeutisches und Nahrungs-Mittel enthaltend eine Gangliosidmischung nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
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Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5465542B2 (ja) * 2008-02-22 2014-04-09 片山化学工業株式会社 合成糖脂質含有リポソーム
ES2798257T3 (es) 2008-09-08 2020-12-10 Childrens Medical Center Administración mucosa de moléculas, proteínas o partículas terapéuticas acopladas a lípidos de ceramida
US9609888B2 (en) 2013-07-31 2017-04-04 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing synergistic combination and uses thereof
US10709770B2 (en) 2013-07-31 2020-07-14 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing a prebiotic and lactoferrin and uses thereof
US10617701B2 (en) 2015-07-10 2020-04-14 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions containing phosphatidylethanolamine, sphingomyelin and docosahexaenoic acid
US10582714B2 (en) 2015-07-10 2020-03-10 Mead Johnson Nutrition Company Nutritional compositions and methods for promoting cognitive development
EP3700549A4 (de) 2017-10-27 2021-08-18 Children's Medical Center Corporation Kurzkettige ceramidbasierte lipide und verwendungen davon
AU2019252912A1 (en) 2018-04-12 2020-10-22 The Children's Medical Center Corporation Ceramide-like lipid-based delivery vehicles and uses thereof

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993002686A1 (en) * 1991-07-31 1993-02-18 The Regents Of The University Of California Gangliosides with immunosuppressive ceramide moieties
JP3042738B2 (ja) * 1992-03-31 2000-05-22 雪印乳業株式会社 ガングリオシドｇｍ３組成物及びその製造法
US5885632A (en) * 1993-12-14 1999-03-23 Nichimo Co., Ltd. Process for preparing a product from a pulse crop as a starting material and a food containing the product prepared from a pulse crop as a starting material
DE4430041A1 (de) * 1994-08-24 1996-02-29 Milupa Ag Allergieprotektive Formelnahrung
US5567684A (en) * 1994-09-14 1996-10-22 The Regents Of The University Of California Synthetic ganglioside derivatives
DE19602108A1 (de) * 1996-01-22 1997-07-24 Beiersdorf Ag Gegen Bakterien, Parasiten, Protozoen, Mycota und Viren wirksame Substanzen
US6992068B2 (en) * 2000-06-14 2006-01-31 Gifu Shellac Mfg., Co., Ltd. Cytokine production inhibitors, agents for protecting and promoting liver function, anti-inflammatory agents, immunosuppressants, drugs, cosmetics, foods and food materials

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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