EP1472374A2 - Mutations du gene eif4e et resistance aux potyvirus - Google Patents

Mutations du gene eif4e et resistance aux potyvirus

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EP1472374A2
EP1472374A2 EP03718850A EP03718850A EP1472374A2 EP 1472374 A2 EP1472374 A2 EP 1472374A2 EP 03718850 A EP03718850 A EP 03718850A EP 03718850 A EP03718850 A EP 03718850A EP 1472374 A2 EP1472374 A2 EP 1472374A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
eif4e
protein
sequence
plants
potyviruses
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP03718850A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Carole Caranta
Sandrine Ruffel
Adbelhafid Bendahmane
Alain Mas le Pigeonnier PALLOIX
Christophe Robaglia
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genoplante Valor SAS
Original Assignee
Genoplante Valor SAS
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Filing date
Publication date
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Application filed by Genoplante Valor SAS filed Critical Genoplante Valor SAS
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8283—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for virus resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
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    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
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    • C12Q2600/13—Plant traits
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    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the present invention relates to a process for selecting or obtaining plants resistant to potyviruses.
  • the method is particularly applicable to plants of the nightshade family, cucurbits, crucifers and compounds.
  • the invention also includes the sequences making it possible to confer resistance to potyviruses and / or to mark the genes for resistance or sensitivity to these potyviruses.
  • potyviruses whose type member is the potato virus Y or PVY for Potato Virus Y is the most important group of plant viruses. In fact, potyviruses are capable of infecting more than 30 families of plants currently listed. This group includes at least 180 members, which corresponds to a third of the currently known plant viruses. Transmission of potyviruses is carried out by aphids (for example, Myzus persicaé) in a non-persistent mode. Symptoms caused by potyviruses are abnormal coloring of the leaves (mosaics, yellowing of the veins), deformations of the leaves, necrosis of the nerves which can lead to necrosis of the whole plant, and significant reductions in the size of the diseased plant strongly influencing productivity.
  • Solanaceae, cucurbits, crucifers and compounds are particularly sensitive to potyviruses.
  • Solanaceae and more particularly tomatoes and peppers (or peppers) are infected with at least seven distinct potyviruses around the world: potato virus Y (PVY) is present in all areas of cultivation while the rest are confined to one continent (Tobacco Etch virus, Pepper Mottle Virus and Peru Tomato Virus on the American continent, Pepper Veinai Mottle Virus and Potyvirus E in Africa, and chili Veinai Mottle Virus in Asia).
  • PVY potato virus Y
  • This compartmentalisation is however no longer absolute, several potyviruses having been identified outside their area of origin. In France, and more generally in the Mediterranean basin, the predominant potyvirus is PVY.
  • Potyviruses have a non-enveloped filamentous structure (Langenberg and Zhang, 1997) 680 to 900 nm long and 11-15 nm wide (Dougherty and Carrington, 1988; Riechmann et al., 1992).
  • the viral genome consists of a single strand sense RNA with an approximate length of 10 kb.
  • Single-stranded RNA has a poly A tail at its 3 'end and binds 5' to a viral protein called VPg (Murphy et al., 1990, Takahashi et al., 1997).
  • Viral RNA codes for 10 proteins involved in the cleavage of polyproteins, genome replication, cell-to-cell movement and long distance movement, aphid transmission ...
  • the fight against viruses is not feasible indirectly. Indeed, it is only possible to eliminate the vector of the disease (aphids in this case) or to cultivate varieties resistant to viral infection and / or vectors.
  • the plant Faced with an attack by a pathogen (virus, bacteria, fungi or nematodes), the plant has several strategies to defend itself or resist infection. Among the defense strategies, the plant can implement:
  • non-host resistance when all the entities of a species are resistant to a given pathogen
  • host resistance when at least one entity of the species is sensitive to a strain of l 'pathogen.
  • Host resistance the best known to date and the best characterized, is that involving a major, dominant gene. When the major gene is in the presence of a specific avirulence gene for the pathogen, the incompatibility between the plant and the pathogen is established and the plant is resistant. This interaction, described by Flor
  • Point mutations in the viral gene encoding the protein VPg have been shown to be involved in the bypass of resistance to potyviruses in several host-pathogen pairs. This has been shown in TVMV / Nicotiana tabacum (va gene), PVY / tomato (pot-1 gene), LMV / Lettuce (mol gene) and PSbMV / pea (sbml gene) pairs (Keller et al, 1998, Morel , 2001, Redondo, 2001, Nicolas et al, 1997). This does not exclude that other viral genes can also intervene.
  • the eIF4E gene codes for a eukaryotic factor initiating the translation of RNA.
  • eIF4E corresponds to one of the eIF4F translation factor subunits (in wheat germ, it corresponds to the p26 subunit).
  • the translation factor eIF4E binds to the mRNA cap at the level of m 7 G.
  • the structure of eIF4E is characterized by a region rich in tryptophan residues (10 in Arabidopsis thaliana, 11 in wheat and 12 in mammals). These tryptophan residues are thought to be involved in binding to the functional group m 7 G (Rudd, K. Et al., 1998).
  • the eIF4E translation factor is encoded by a multigene family.
  • eIF4E For example in Arabidopsis thaliana, 4 copies of eIF4E have been identified (Rodriguez et al., 1998, Robaglia et al., Pers. Com.). These copies have, two by two, between 44 and 82% identity.
  • - X 5 and X 14 represent a basic amino acid
  • - Xi i represents an acidic amino acid
  • - D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, and L have their usual meaning in code 1 - letter.
  • neutral amino acid any amino acid chosen from the following: alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophan, phenylalanine, methionine, glycine, serine, threonine, tyrosine, cysteine, glutamine, asparagine.
  • charged amino acid any amino acid chosen from the following: histidine, lysine, arginine, glutamate, aspartate. Among these charged amino acids, histidine, lysine or arginine are basic amino acids, and glutamate and aspartate are amino acids.
  • sequence (I) is also represented in the annexed sequence list under the number SEQ ID NO: 1
  • these mutations do not concern amino acids that are very conserved in eukaryotes, nor those involved in the essential functions of eIF4E, namely recognition of the cap or the interaction between eIF4E and eIF4G or 4E-binding protein.
  • these mutations have an effect on the VPg / eIF4E interaction by modifying the structure of eIF4E at the level of the region or regions thereof involved in this interaction.
  • This modification of the structure probably results from the substitution of amino acids by amino acids of different charge (replacement of neutral amino acids by charged amino acids, or conversely of charged amino acids by neutral amino acids, or amino acids of opposite charge) which constitutes the common point of all the mutations highlighted by the Inventors. It can therefore be reasonably assumed that other mutations of the same type in a plant eIF4E protein, at the level of the region defined by the sequence (I) will cause similar structural modifications, producing the same effect on the VPg / eIF4E interaction.
  • the present invention relates more particularly to a method for selecting plants resistant to potyviruses, characterized in that it comprises detection in the plants to be tested:
  • wild type eIF4E protein comprising a region defined by the sequence (I) above, or of a sequence coding for said protein
  • mutant eIF4E protein comprising a region derived from that defined by the sequence (I) above, by substitution of at least one neutral amino acid of said sequence (I) with a charged amino acid, preferably a basic amino acid and / or substitution of at least one charged amino acid of said sequence (I) by a neutral amino acid or an amino acid of opposite charge, or of a sequence coding for said protein ;
  • the subject of the present invention is also a process for selecting plants which can be used for obtaining plants resistant to potyviruses, characterized in that it comprises the detection in the plants to be tested of the presence or absence of a protein mutant eIF4E as defined above or of a sequence coding for said protein, and the selection of plants where said mutant eIF4E protein or a sequence coding for said protein is detected.
  • said mutant eIF4E protein comprises a region derived from that defined by the sequence (I) above, by: a) substitution of at least one of the amino acids X ⁇ ; X j X 3 or X 4> of said sequence
  • the detection of the presence or absence of a wild-type or mutant eIF4E protein can be carried out in particular using antibodies specifically directed against the desired form of the eIF4E protein. They may in particular be antibodies directed either against the wild form or against the mutant form of the region of eIF4E defined by the sequence (I).
  • a sequence coding for a wild type eIF4E protein or of a sequence coding for a mutant eIF4E protein may include polynucleotides derived from the sequence of the eIF4E gene and in particular from polynucleotides capable of hybridizing selectively either with a wild-type allele or with a mutant allele of eIF4E, as defined above or of polynucleotides allowing the amplification of the region of eIF4E containing the mutation sought; they may also be restriction enzymes recognizing a target sequence present in the wild form, but not in the mutated form (or vice versa).
  • a subject of the present invention is therefore the use of a selection tool chosen from: a) a polynucleotide coding for a wild type or mutant eIF4E protein, as defined above; b) a polynucleotide complementary to polynucleotide a); c) a fragment of at least 10 bp of a polynucleotide a) or b); d) an antibody directed against a wild-type or mutant eIF4E protein, as defined above; for the selection of plants resistant to potyviruses.
  • a selection tool chosen from: a) a polynucleotide coding for a wild type or mutant eIF4E protein, as defined above; b) a polynucleotide complementary to polynucleotide a); c) a fragment of at least 10 bp of a polynucleotide a) or b); d) an antibody directed against a wild-type or mutant eIF
  • the invention relates to a method of selecting plants resistant to potyviruses characterized in that it comprises the implementation of at least one selection means chosen from the group of genetic (or related) tools comprising: * A / all or part of at least one of the sequences selected from the subgroup comprising:
  • the selection means are selected from the subgroups of tools A / and / or B /, and more preferably still from the subgroup of tools A /.
  • the process which is the subject of the invention is particularly applicable to solanaceae, cucurbits, crucifers and compounds and more specifically to plants of the genera Lycopersicon, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lactuca, Cucumis, Arabidopsis etc ...
  • Potyviruses concerned are, for example, potato virus Y (PVY), tobacco burning virus (TEV) and / or lettuce mosaic virus (LMV), and / or virus yellow zucchini mosaic (ZYMV) and / or turnip mosaic virus (TuMV).
  • PVY potato virus Y
  • TMV tobacco burning virus
  • LMV lettuce mosaic virus
  • ZYMV virus yellow zucchini mosaic virus
  • TuMV turnip mosaic virus
  • nucleotide sequences and / or peptide sequences or restriction enzymes are used as detection means, probes or primers, to select plants resistant or sensitive to potyviruses.
  • These detection means include in particular nucleotide probes or primers.
  • Primer is understood to mean, within the meaning of the present invention, any polynucleotide sequence which can be used to amplify a sequence of an eIF4E gene capable of comprising a mutation associated with resistance to potyviruses. These are in particular polynucleotides which can be used to amplify all or part of the sequence of eIF4E coding for the region of eIF4E defined by the sequence (I), or of the mutant sequence which is derived therefrom.
  • the term "probe” means any polynucleotide sequence which hybridizes with a wild type eIF4E gene or with a mutant elF4E gene as defined above. This notably includes the nucleotide sequences capable of hybridizing selectively either with an allele of the eIF4E gene associated with resistance to potyviruses, or with an allele of the elF4E gene associated with sensitivity to potyviruses. These probes and primers can be used as specific markers for plants resistant or sensitive to potyviruses.
  • SEQ ID NO: 2, 4, 6, and 8 correspond to eIF4E genes of different solanaceae involved in resistance to potyviruses coding for a eukaryotic factor initiating the translation of RNA.
  • SEQ ID NO: 8 corresponds to a recessive allele eIF4E of resistance to a potyvirus, while SEQ ID NO: 2, 4, and 6 represent dominant alleles eIF4E of sensitivity to a potyvirus.
  • the selection process according to the invention can involve the two types of selection means or benchmarks separately or together.
  • the invention also encompasses all the equivalents to these nucleotide sequences (A) SEQ ID NO :: 2, 4, 6, and 8, which retain the function of genetic benchmark eIF4E for sensitivity / resistance to potyviruses specific to the reference sequences .
  • DNA these are in particular the analogs of genetic degeneration and cDNA sequences complementary to the reference sequences.
  • the polynucleotide equivalents of the reference sequences (A) are also found among their transcription products (RNA) (B).
  • Proteins (C) from (A) and (B) constitute other intracellular landmarks allowing the selection of plants resistant or sensitive to potyviruses.
  • the selection means of the invention can also be nucleotide probes capable of hybridizing with complementary nucleotide targets (A) and (B), or even protein detection means (antibody D) capable of pairing with specific antigenic targets (C). It is possible to combine all these equivalent means (A), (B), (C) & (D) to form a selection tool (E).
  • fragment is meant, according to the invention:
  • polyamino acid of at least 3, 6, 10, 15, 30, 60, 100, 150, 200 contiguous amino acids of the reference sequence; preferred fragments are those which are capable of selectively hybridizing under stringent conditions with said reference sequence.
  • the method is characterized in that:
  • At least one detection means comprising at least one of the tools A, B, C, D, E according to claim 1 and / or at least one restriction enzyme, with at least one genomic extract and / or protein from a plant to be tested, - said genomic and / or protein extract, optionally paired and / or hybrid and / or digested, is subjected to at least one separation,
  • any pairings and / or hybridizations and / or digestions likely to occur are revealed, - and the results are read to finally conclude on the presence or absence of a resistance allele (pvr2) or an allele of sensitivity (pvr + ) to at least one potyvirus.
  • pvr2 resistance allele
  • pvr + allele of sensitivity
  • This process is part of known methodologies in the field of detection and recognition of genetic characteristics of plants.
  • the method can respond to the following methodology:
  • the coding sequence of the eIF4E gene is amplified by PCR, from the DNA of the plant to be tested, for example using primers SEQ ID NO: 18 and / or 19, the amplification product is digested with a suitable restriction enzyme;
  • Any fragments obtained are separated, and resistant or sensitive plants are selected according to the restriction profile of said amplification product.
  • plants susceptible to potyviruses can be detected by a restriction profile revealing the presence of a site of cleavage by the enzyme
  • TspRI or one of its isoschizomers and plants resistant to potyviruses can be detected by a restriction profile showing the absence of said cleavage site by
  • TspRI or one of its isoschizomers and the presence of a cleavage site by the enzyme Mvnl or one of its isoschizomers.
  • the method preferably consists of:
  • Hybridization of the single-stranded molecules of the probe and of the target is preferably carried out under stringent hybridization conditions allowing selective hybridization, which can be determined in a manner well known to those skilled in the art.
  • the hybridization and washing temperature is at least 5 ° C. lower than the Tm of the reference sequence at a given pH and for a given ionic strength.
  • the hybridization temperature is at least 30 ° C for a polynucleotide of 15 to 50 nucleotides and at least 60 ° C for a polynucleotide of more than 50 nucleotides.
  • the level of the signal generated by the interaction between the sequence capable of selective hybridization and the reference sequences is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of the interaction of the other DNA sequences generating the background noise.
  • a probe labeled for example with a radioactive element, such as 32 P, or a grafted enzyme, such as peroxidase hybridization is easily revealed qualitatively and quantitatively.
  • the DNA used in the first or second mode of implementation can be either total DNA or cDNA.
  • the method preferably consists in detecting the presence of a polypeptide partly consisting of all or part of one of the amino acid sequences described below and included in the invention.
  • the method may consist in bringing the test sample into contact with an antibody as described above and then in detecting the antigen / antibody complex formed.
  • the selection method according to the invention is reliable and sensitive.
  • the present invention also relates to a polynucleotide coding for a mutant eIF4E protein comprising a region derived from that defined by the sequence (I) above, by substitution of at least one neutral amino acid of said sequence (I) with a charged amino acid, preferably a basic amino acid and / or substitution of at least one amino acid charged with said sequence (I) by a neutral amino acid or an amino acid of opposite charge.
  • said polynucleotide codes for a mutant eIF4E protein which comprises a region derived from that defined by the sequence (I) above, by: a) substitution of at least one of the amino acids X ⁇ X 2 ⁇ X 3 or X > of said sequence (I) with a charged amino acid, and b) substitution of at least one of the other neutral amino acids of said sequence (I) with a charged amino acid and / or substitution of at least an amino acid charged with said sequence (I) by a neutral amino acid or an amino acid of opposite charge.
  • Polynucleotides in accordance with the invention are, for example, those which code for the variants of the sequences SEQ ID NO: 22 or 23 associated with resistance to potyviruses.
  • the invention relates to a nucleotide sequence characterized in that it is described by a sequence chosen from the group comprising all or part of the following sequences:
  • the nucleotide sequence SEQ ID NO: 2 is a cDNA sequence obtained from tobacco DNA and corresponding to the tobacco gene.
  • the nucleotide sequence SEQ ID NO: 4 is a sequence encoding an eIF4E protein from a variety of Lycopersicon esculentum sensitive to potyviruses.
  • the sequences SEQ ID NO: 6 and 8 are sequences coding for proteins eIF4E of chilli (Capsicum annuum), varieties Yolo Wonder and Yolo Y respectively.
  • the present invention also relates to primers allowing the amplification of an eIF4E gene, or of a portion thereof capable of containing at least one mutation, as defined above, associated with resistance to potyviruses; these are in particular primers allowing the amplification of the sequence of eIF4E coding for the region of eIF4E defined by the sequence (I), or of a mutant sequence which is derived therefrom.
  • Primers according to the invention can be easily defined by a person skilled in the art, from the nucleotide or peptide sequences described in the present invention.
  • the amplification primers constituted by the nucleotide primer sequences SEQ ID NO: 18 &19; the primers cloning SEQ ID NO: 10 to 17; the BAC library screening primers constituted by the nucleotide sequences SEQ ID NO: 20 & 21.
  • SEQ ID NOs: 18 & 19 are primers derived from the coding sequence of eIF4E of the Yolo Wonder chili pepper, allowing in particular by PCR amplification then by enzymatic digestion, the detection of the nucleotide sequences carrying alleles of pvr2 resistance and of pvr + sensitivity to potyvirus.
  • the degenerate SEQ ID NO: 10 & 11 cloning primers and the non-degenerate SEQ ID NO: 12 to 17 were defined on an alignment of the tobacco, tomato and Arabidopsis eIF4E sequences and used for probe synthesis (RACE) EIF4E detection cDNA in the tomato and chili genome.
  • the primers SEQ ID NO: 20 & 21 for screening the BAC bank are not degenerate. These primers SEQ ID NO: 10 to 17, 20 & 21 can possibly be used directly or indirectly (construction of selection tools) in the detection of resistance or sensitivity characteristics to potyviruses.
  • the subject of the present invention is also a mutant eIF4E protein comprising a region derived from that defined by the sequence (I) above, by substitution of at least one neutral amino acid of the said sequence (I) with a charged amino acid, preferably a basic amino acid and / or substitution of at least one amino acid charged with said sequence (I) by a neutral amino acid or an amino acid of opposite charge.
  • said mutant eIF4E protein comprises a region derived from that defined by the sequence (I) above, by: a) substitution of at least one of the amino acids Xi, X 2 , X 3 or X > of said sequence (I) with a charged amino acid, and b) substitution of at least one of the other neutral amino acids of said sequence (I) with a charged amino acid and / or substitution of at least one charged amino acid of said sequence (I) with a neutral amino acid or an amino acid of opposite charge.
  • the present invention also covers the translation products of the nucleotide sequences SEQ ID NO: 2, 4, 6, and 8, namely the polypeptides chosen from the group comprising all or part of the following sequences:
  • the means for selecting resistance / sensitivity of plants to potyviruses, consisting of amino acid sequences, are preferably used as targets for locating. These are therefore indirect selection means which underlie the implementation of specific detection means for these peptide targets.
  • These detection means are advantageously antibodies which constitute another object of the present invention.
  • said antibodies are characterized in that they are specifically directed against all or part of at least one of the translation products C, and more particularly of the amino acid sequences SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 22, or 23 or a fragment of at least 6 amino acids thereof.
  • These antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • Antibodies against the polypeptides as defined above can be prepared according to conventional techniques well known to those skilled in the art (for example, Kohler and Milstein, 1975; Kozbor et al. 1983, Martineau et al., 1998).
  • An antibody according to the invention may comprise an isotopic or non-isotopic, for example fluorescent, detectable marker, or alternatively be coupled to a molecule such as biotin according to techniques well known to those skilled in the art.
  • Another aspect of the invention relates to the selection means formed by probes for the detection of plants resistant to at least one potyvirus, these probes being taken in themselves.
  • probes for the detection of plants resistant to at least one potyvirus we define probes for the detection of plants resistant to at least one potyvirus.
  • a first category of probes is characterized in that each probe comprises at least one sequence corresponding to all or part of SEQ ID NOs: 2, 4, 6, and 8.
  • the probes comprising at least one sequence corresponding to all or part of SEQ ID NO: 2, 4, 6, and 8, and in particular to all or part of the portion coding for the region of the eIF4E protein defined by the general sequence (I) are very particularly preferred.
  • SEQ ID NO: 6 is a sensitivity probe from the Yolo Wonder pepper. It differs from SEQ ID NO: 8, which is a resistance probe derived from the Yolo Y pepper, by two nucleotide bases. These mutations shown on SEQ ID NO: 6 & 8, correspond to the restriction sites TspRI for SEQ ID NO: 6 and MnvI for SEQ ID NO: 8, respectively marking the sensitivity to potyviruses in Yolo Wonder and the resistance to potyviruses in Yolo Y .
  • probes are used to distinguish resistant and sensitive plants, either by selective hybridization and detection of the presence or absence of a hybridization signal, or by digestion with an appropriate restriction enzyme capable of differentially cleaving the allele.
  • an appropriate restriction enzyme capable of differentially cleaving the allele.
  • sensitivity and the resistance allele for example EcoRI, TspRI, or MnvI followed by hybridization of the probe with the restriction product.
  • the distinction between sensitive plants and resistant plants is made in the latter case by the difference in size of the hybrid fragments.
  • the present invention also provides tools making it possible to carry out another selection method in accordance with the first embodiment of the method according to the invention, as defined above.
  • an amplification by PCR of the eIF4E sequence is first performed. Amplification is followed by selective digestion with a restriction enzyme.
  • the tools involved are therefore of two types: restriction enzyme (s) and PCR primer (s) for amplifying the eIF4E sequence.
  • the subject of the present invention is in particular a kit making it possible to detect an allele of eIF4E associated with resistance or sensitivity to potyviruses, characterized in that it comprises:
  • At least one restriction enzyme chosen from: a) an enzyme recognizing a restriction site I present in at least one allele of eIF4E associated with sensitivity to potyviruses, and absent from the alleles of eIF4E associated with resistance to potyviruses; b) an enzyme recognizing a restriction site II present in at least one allele of eIF4E associated with resistance to potyviruses, and absent from the alleles of eIF4E associated with sensitivity to potyviruses; and - a pair of nucleotide primers making it possible to amplify eIF4E or a portion thereof comprising the restriction site I and / or the restriction site II.
  • the restriction enzyme is TspRI, or one of its isoschizomers, recognizing a restriction site defined by the sense sequence: NNCASTGNN A and the antisense sequence ⁇ NNGTSACNN.
  • the nucleotide primers are chosen so as to allow the amplification of the entire sequence of eIF4E or of at least a portion thereof comprising the TspRI site; - to detect an allele of eIF4E associated with resistance to potyviruses, such as that represented by the sequence SEQ ID NO: 8 the restriction enzyme is Mvnl, or one of its isoschizomers, recognizing a restriction site defined by the sense sequence: CG ⁇ CG and the antisense sequence: GC ⁇ GC.
  • the nucleotide primers are chosen so as to allow the amplification of the entire sequence of eIF4E or of at least a portion thereof comprising the site
  • primers SEQ ID NO: 18 and SEQ ID NO: 19 can be used, for example.
  • the detection of plants sensitive or resistant to potyviruses can also be carried out by detection of the presence or absence of the wild or mutant form of the protein eIF4E.
  • the present invention encompasses the use of a wild type or mutant eIF4E protein, as defined above, or of an antibody specific for one of said proteins, for the selection of plants resistant to potyviruses.
  • said eIF4E protein is chosen from: - the protein represented by the polypeptide sequence SEQ ID NO: 3;
  • a category of means for detecting resistance to potyviruses in accordance with the invention is characterized in that each of these means comprises at least one antibody specific for all or part of a mutant eIF4E protein in accordance with the invention, and in particular a fragment of at least 6 amino acids thereof carrying a mutation associated with resistance, as defined above.
  • a means of detecting resistance can consist of an antibody specific for all or part of a polypeptide sequence as defined above, in particular of a fragment of at least 6 amino acids thereof carrying a mutation associated with resistance.
  • the invention also relates to means for detecting sensitivity or resistance to potyviruses, each consisting of at least one amino acid sequence chosen from the group comprising the following sequences: - SEQ ID NO: 3;
  • the invention relates more particularly to means for detecting sensitivity to potyviruses, each consisting of at least one antibody specific for an amino acid sequence chosen from the group comprising the following sequences:
  • each aforementioned nucleotide probe or other means of detection is provided with at least one marker, useful as a witness to the nucleotide hybridization or the antigen / antibody pairing at the heart of the detection of the sensitive sequence.
  • this marker is detectable by spectroscopic, photochemical, biochemical, immunochemical or even chemical means.
  • a marker can consist of a radioactive isotope of P, H, a fluorescent molecule (5-bromodeoxyuridine, fluorescein, acetylaminofluorene) or also a ligand such as biotin.
  • nucleotide probes their labeling is preferably done by incorporating labeled molecules within the polynucleotides by extension of primers or else by adding to the 3 ′ or 5 ′ ends.
  • sequences used to detect plants resistant to potyviruses are used as nucleotide probes or primers.
  • nucleic acids can be labeled, if desired, by incorporating a detectable molecule or label as set out above. Examples of non-radioactive labeling of nucleic acid fragments are described in particular in French patent No. FR 78 10 975 or also in the articles by Urréa et al., (1988) or Sanchez-Pescador et al. (1988).
  • the present invention relates to the use of the detection means defined above for the detection of plants resistant / sensitive to at least one potyvirus.
  • oligonucleotide marker (s) of resistance / sensitivity to potyviruses the restriction sites Mvn1 and / or TspRI, which are, moreover, known, eIF4E sequences.
  • restriction sites used as oligonucleotide reper (s) correspond: - to the sense sequence: CG ⁇ CG and to the antisense sequence: GC ⁇ GC
  • restriction sites as benchmarks (or marks or labels) for resistance to potyviruses on expressed sequences, is to be compared to the first mode of implementation of the above-described detection method, in which recourse is had to restriction enzymes (for example: Mvnl and / or TspRI) and to primers for amplification of the sequence eIF4E, for example: SEQ ID NO 18 and / or 19.
  • restriction enzymes for example: Mvnl and / or TspRI
  • primers for amplification of the sequence eIF4E for example: SEQ ID NO 18 and / or 19.
  • the present invention also encompasses the use, as oligonucleotide marker (s) of resistance / sensitivity to potyviruses, of the above-mentioned Mvnl & TspRI restriction sites, and, preferably , of the restriction site corresponding to the sense sequence: CG ⁇ CG and to the antisense sequence: GC ⁇ GC and / or of the restriction site corresponding to the sense sequence: NNCASTGNN ⁇ and to the antisense sequence: ⁇ NNGTSACNN.
  • oligonucleotide marker (s) of resistance / sensitivity to potyviruses of the above-mentioned Mvnl & TspRI restriction sites, and, preferably , of the restriction site corresponding to the sense sequence: CG ⁇ CG and to the antisense sequence: GC ⁇ GC and / or of the restriction site corresponding to the sense sequence: NNCASTGNN ⁇ and to the antisense sequence: ⁇ NNGTSACNN.
  • the present invention relates to a kit for selecting plants resistant / sensitive to potyviruses comprising at least one means of detection of antibody or polynucleotide type as defined above.
  • the kit includes, where appropriate, the reagents necessary for carrying out a hybridization or amplification reaction.
  • the subject of the invention is also the plants resulting from the process described above and / or from the implementation of the tools and / or from the use and / or from the selection kit defined above.
  • these plants belong to the family of nightshades, cucurbits, crucifers and compounds. Even more preferably, they are chosen from tomatoes, peppers and / or lettuce.
  • the inventors carry out the method which is the subject of the invention by following the RFLP (restriction fragment length polymorphism) analysis protocol.
  • the inventors used a conventional RFLP protocol in which the probes which are the subject of the invention are labeled with 32 P and in which the DNA of the chilli plants to be analyzed is digested with the restriction enzyme EcoRI.
  • EcoRI restriction enzyme
  • the invention does not only concern the selection of plants resistant or sensitive to potyviruses. Indeed, since the inventors have been able to identify the eIF4E gene determining recessive resistance to potyviruses, it is now possible to obtain new varieties of genetically modified plants, resistant (or sensitive) to at least one potyvirus.
  • the invention therefore relates to a non-biological process for obtaining new varieties of genetically modified plants, resistant (or sensitive) to at least one potyvirus, characterized in that it consists essentially in ensuring that appears and / or introduce an allele of eIF4E associated with resistance (or sensitivity) to said potyvirus in the genome of these plants.
  • the appearance of the resistance allele is caused by the implementation of a method selected from the group comprising:
  • the present invention thus relates to any genetic unit constructed comprising a polynucleotide in accordance with the invention coding for a mutant eIF4E protein, placed under the control of appropriate elements for controlling transcription, and optionally translation.
  • Said mutant eIF4E protein can advantageously be chosen from variants of sequences SEQ ID NO: 22 or 23 associated with resistance to potyviruses.
  • the present invention also relates to any constructed genetic unit characterized in that it comprises: - at least one genetic tool A / and / or B / as defined above,
  • nucleotide sequence chosen from the group comprising all or part of the following sequences:
  • Another genetic transformation tool covered by the invention consists of any plant cell transformation vector comprising at least one genetic unit constructed as referred to above. It can be any known and appropriate cloning vector (phages / plasmids / cosmids). Plant cells and microorganisms transformed using at least one vector or at least one constructed genetic unit as defined above, are also targeted by the invention.
  • the invention encompasses plants transformed with at least one vector and / or at least one constructed genetic unit and / or transformed plant cells and / or transformed microorganisms, such as they have have been described above.
  • FIG. 1 shows the gel from a southern blot analysis and showing the differences in profiles of the eIF4E marker for resistance to potyviruses, observed for different sensitive or resistant peppers.
  • Pepper genomic DNA is digested with the EcoRI enzyme and hybridized with tobacco eIF4E cDNA - SEQ ID NO: 1
  • - Figure 2 shows the gel showing the PCR amplifications of the eIF4E gene involved in resistance to potyviruses in chilli and highlights a differential Mvnl restriction site between sensitive and resistant, (Example 4).
  • - Figure 3 represents the alignment of the protein sequence of eIF4E of different varieties of chilli, sensitive or resistant to potyviruses.
  • Figure 4 represents the alignment of the protein sequence of eIF4E of different varieties of tomato, sensitive or resistant to potyviruses.
  • the tomato and chili cDNAs were obtained by the 3 'and 5' RACE technique (System for Rapid Amplification of cDNA Ends sold by the company Invitrogen TM) from the extraction of total RNA from tomato and chili and using degenerate primers defined on an alignment of the eIF4E sequences of tobacco, tomato and Arabidopsis.
  • the 3 'part of the cDNA was cloned by 3'RACE. Primers defined between the TAG and the polyA tail of the sequences obtained by 3 'RACE were used to obtain the complete cDNAs by 5' RACE.
  • the protocol followed uses 2.5U of enzyme / ⁇ g of DNA.
  • the enzymatic volume must be less than 10% of the reaction volume.
  • the reaction volume is calculated according to the size of the well: it depends on the type of tank and comb used and on the volume of the gel (300 ml in general).
  • the volume of the specific buffer of the enzyme and of spermidine must each represent 10% of the reaction volume:
  • Digestion is carried out at 37 ° C overnight.
  • samples of phage ⁇ digested with Hind III are prepared: 0.5 ⁇ g / well.
  • proper digestion of DNA is checked on 1% agarose gel, TAE IX with 1 ⁇ l of digestion product. If the digestion is correct, the loading buffer is then added.
  • the charge buffer must represent at least 10% of the total volume (or 20%).
  • the deposition is then carried out on a 300 ml gel, NEB IX, 1% agarose containing 10 ⁇ l of BET. The migration takes place at 25V for 24 hours in NEB IX buffer (migration stops 2 cm from the edge of the gel). Transfer on nylon membrane
  • a Hybond N + membrane and 1 Wattman paper the size of the gel are cut.
  • the gel is soaked for 30 min. under stirring (blue becomes yellow).
  • the blotteur is prepared by:
  • the gel is rinsed in a tank containing distilled H 2 O, then placed on the cover of the jogger, avoiding bubbles and checking the tightness of the system.
  • the blotter is started at 50 mb max. A little 0.4N soda is poured onto the gel. Two sponges soaked in soda are placed on the gel which will be covered with soda until saturation.
  • the transfer takes 2 to 3 hours.
  • the membranes are rinsed in a SSC 2X bath for 10 to 15 minutes, then dried in the open air and cooked for 2 hours at 80 ° C.
  • Probe preparation
  • the preparation of the probes by PCR labeling with 32 P relates to probes of 3 kb maximum, amplified by PCR or directly on plasmids, making it possible to reveal the major bands for a probe, of concentration between 1 and 5 ng / ⁇ l.
  • the labeling of the probes is done during 30 PCR cycles of:
  • the probes are then denatured according to the following protocol: add each probe to a tube containing 160 ⁇ l of 0.8 N NaOH + 2 to 5 ⁇ l of labeled Lambda (by random priming) incubate for 5 min
  • hybridization buffer * 20 ml are used per tube for 2 to 6 half blots. 25 ml of buffer beyond, without exceeding 10 half blots per tube.
  • the membranes are moistened in a box containing hybridization buffer before being slightly drained then rolled (all together) and put in the tube. Check during prehybridization that the tubes are tight and that the membranes are going well, otherwise change their direction.
  • composition of the pre-hybridization and hybridization buffer For 500 ml: 21.91 g NaCl; 18.38 g Na Citrate; 380 mL H2O; 15 mL SDS 20%; 25 mL NaPO4 IM pH 7.5; 25 mL Denhardt 100X; 5 mL 0.25M EDTA; 50 mL Dextran sulfate 50%.
  • the temperature of the tubes is allowed to decrease before opening them to avoid wetting the thread.
  • the denatured probe is added (5 min in 0.8 M NaOH then cessation of denaturation Tris-HCl IM). Under these conditions, the hybridization can last 48 or 72 hours.
  • the viral material used in these infection tests are the PVY N-605 isolates obtained from Solanum tuberosum (Jakab et al., 1997), or PVY-LYE84, or PVY-LYE240r for tomatoes (Légnani et al. , 1995) and the PVY-To72, PVY-Si 15 isolates for chilli (Dogimont et al., 1996) as well as the CAA-10 isolate from TEV (Légnani et al, 1996).
  • the same protocol is used for all other PVY and VTE isolates that are controlled by the pvr2 / pvrl / pvr5 and / or pot-1 loci.
  • the isolates are maintained according to the Bos procedure (Bos, 1969) and propagated on plants of Nicotiana tabacum cv. Xanthii before inoculation of tomato or pepper plants in the cotyledon stage with two spreading leaves.
  • the viral inoculum is prepared as described in the articles by Légnani et al. (1995, 1996) and de Dogimont et al. (1996).
  • the cotyledons and the first two leaves of the plants are inoculated mechanically.
  • the lines are evaluated under controlled conditions in a culture chamber (14 hours day, 18 ° C night and 24 ° C day) to monitor their reaction after inoculation.
  • the genomic DNA of chilli is digested with the enzyme EcoRI and hybridized with the tobacco cDNA eIF4E - SEQ ID NO: 2 - (the same RFLP profiles are obtained by hybridization with the tomato cDNA or the chili cDNA).
  • the first point mutation corresponds to a restriction site
  • TspRI (or its isoschizomers) existing only at Yolo Wonder.
  • This differential restriction site was validated by PCR on the cDNA of Yolo Wonder and Yolo Y: definition of primers 5 ′ and 3 ′ of cDNA and digestion of the PCR amplifier by the enzyme
  • the second point mutation corresponds to an Mvnl restriction site (or its isoschizomers) existing only in Yolo Y.
  • This differential restriction site was validated by PCR on the cDNA of Yolo Wonder and Yolo Y: definition of primers in 5 ′ and 3 'to cDNA and digestion of the PCR amplifier with the enzyme Mvnl.
  • PCR reaction on cDNA :
  • Florida VR2 Florida / pvr2 2
  • C69 HD line from the FI hybrid between CM334 and Yolo Wonder / pvr5
  • CM334 Criollo de Morelos 334 / pvr5
  • Per Perennial / partial resistance (QTL) at the pvr2 locus
  • Highlighted black mutation specific to the PMI 008 genotype.
  • b RFLP markers are obtained using random tomato genomic DNA
  • TG tomato leaf epidemic cDNA probes
  • CD and CT tomato leaf epidemic cDNA probes
  • DNA samples from 6 F2 plants (from the self-fertilization of the FI hybrid between Lycopersicon esculentum Mospomorist and L. hirsutum PI247087) (pot- l + / pot-l + ) having generated F3 families completely sensitive to PVY strain N 605 and the DNA samples of 9 F2 plants which have generated F3 families completely resistant to potyvirus are pooled for a bulk segregating analysis and for an AFLP labeling of pot-1.
  • AFLP markers are generated according to the protocol of Vos et al. (1995) with the restriction enzymes EcoRl, HindIII, and Msel.
  • the first amplification is carried out using a combination of primers with a single selective nucleotide and a second combination with 3 selective nucleotides.
  • AFLP markers linked to pot-1 are mapped on the introgression lines of L. hirsutum in L. esculentum (Montforte and Tanksley, 2001) in order to assign pot-1 to a tomato chromosome.
  • the assignment is validated by mapping RFLP markers located on the target chromosome.
  • the RFLP procedure is described by Saliba-Colombani et al. (2000). The screening of the polymorphism between Lycopersicon esculentum Mospomorist (sensitive to potyviruses) and L.
  • hirsutum PI247087 (resistant to potyviruses) is carried out with 3 restriction enzymes (EcoRI, HindIII and Xbal) and RFLP markers previously mapped in tomatoes (CT, cDNA of tomato derived from mRNA of epidermal tissue from tomato, TG, clones of genomic DNA from tomato; the CAB3 probe coding for a polypeptide linked to chlorophyll a and b, Tanksley et al., 1992)
  • CT cDNA of tomato derived from mRNA of epidermal tissue from tomato
  • TG clones of genomic DNA from tomato
  • CAB3 probe coding for a polypeptide linked to chlorophyll a and b Tanksley et al., 1992
  • Segregation analysis for molecular markers (AFLP, RFLP) and for resistance data are analyzed by Mapmaker / Exp v software. 3.0 with a minimum Lod of 4.0 and a maximum recombination percentage of 0.3. The percentage of recombination is then converted into mapping distance in centiMorgans (cM) using the Kosambi mapping function (Kosambi, 1944).
  • the tomato cDNA eIF4E was mapped by the RFLP method described previously on the introgression lines of L. pennellii in L. esculentum (Eshed and Zamir, 1995). This work made it possible to locate 5 copies of the eIF4E gene in tomatoes. One of these copies was located on chromosome 3, in the same genomic region as the pot-1 gene, thus confirming the synteny between chilli and tomato for resistance to potyviruses and therefore the possibility of using eIF4E as markers and tools for resistance selection.
  • the coding sequence of this gene (variety 'Mospomorist' from. Esculentum, sensitive to PVY and TEV) is represented in the sequence list under the number
  • the eIF4E protein of L. hirsutum PI 134417 and that of L. hirsutum PI247087 are also represented by the sequence SEQ ID NO: 23
  • Example 6 Screening of the BAC library of the chili genome with primers defined on the eIF4E coding sequence of the genotype Yolo Wonder, demonstration of co-segregation with resistance and determination of the genomic structure of the eIF4E gene which co-segregates with pvr2.
  • a BAC chili bank was constructed from an HD208-lined haploid line derived from the FI hybrid of a cross between Capsicum annuum
  • the BAC chili library is made up of 239,232 clones with an average insert size of 125kb, which corresponds to a theoretical representativeness of 10 genome equivalents (size of the genome of chilli 3000 Mpb). This BAC library was organized into 623 DNA pools for PCR screening (1 pool corresponds to the DNA mixture of 384 clones).
  • Example 7 Experiment of transient expression of cDNA eIF4E from Yolo Wonder in a resistant pepper genotype (carrying the pvr21 allele) for validation of the role of eIF4E in sensitivity to Potyviruses.
  • the cDNA eIF4E derived from the sensitive Yolo Wonder genotype is cloned in an oriented manner into an expression vector PVX-CES-35S at the Clal cloning site and
  • Yolo Y is co-inoculated with this recombinant plasmid and with Potato Virus Y pathotype 0 (PVY).
  • PVY Potato Virus Y pathotype 0
  • the transient expression of the eIF4E gene from the sensitive Yolo Wonder genotype via the recombinant PVX vector allows the PVY to multiply in the resistant genotype.
  • PVY is detected by the ELISA or RT-PCR method (Legnani et al., 1995, 1996, Dogimont et al., 1996).
  • Example 8 Search for mutants in the eIF4E gene and in the genes of the RNA translation initiation complex for the creation of plants resistant to potyviruses.
  • eIF4E multi-gene family belong to a complex of at least 8 proteins forming the translation initiation complex in eukaryotic cells (Browning 1996).
  • Example 9 Creation of plants resistant to potyviruses by methods which may involve the transgenesis. Alternatively to example 8, the resistance allele of the eIF4E gene
  • any other allele of eIF4E which confers resistance to potyviruses can be transferred in planta by methods of the directed mutagenesis type (Hohn et al., 1999) , homologous recombination (Kempin et al., 1997) or by overexpression methods.
  • the allele of eIF4E which confers resistance is expressed under a strong promoter of the 35S type of the CaMV virus by transgenesis in planta (Jones et al., 1992; Bevan 1984).
  • Resistance plants can also be created by knockout of the endogenous eIF4E gene by methods of the “gene silencing” type (Post Transcriptional Gene Silencing) and the simultaneous expression by transgenesis of the form of eIF4E conferring resistance to potyviruses.
  • a specific knockout by PTGS can be carried out by digesting it against the 5 'UTR of the endogenous eIF4E gene; the form of eIF4E which confers the resistance expressed by transgenesis will not carry the 5 ′ UTR sequence of the endogenous eIF4E. This specificity of the PTGS knockout against the 5 'UTR is based on new data resulting from the understanding of the mechanism of PTGS (Nishikura 2001).

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Abstract

La présente invention concerne l'obtention de plantes résistantes aux potyvirus présentant une ou plusieurs mutations dans une région conservée du facteur de traduction eIF4E, définie par la séquence générale (I)suivante :DX1X2X3X4KSX5QX6AWGSSX7RX8X9YTFSX10VEX11FWX12X13YNNIHX14PSKLX15X16GAD dans laquelle :- X1, X2, X3, X4, X6, X7, X8, X9, X10, X12, X13, X15, et X16 représentent chacun un acide aminé neutre ; - X5 et X14 représentent un acide aminé basique ;- X11 représente un acide aminé acide ;- D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, et L ont leur signification usuelle en code 1-lettre.

Description

MUTATIONS DU GENE eIF4E ET RESISTANCE AUX POTYVIRUS
La présente invention concerne un procédé de sélection ou d'obtention de plantes résistantes aux potyvirus. Le procédé est particulièrement applicable aux plantes de la famille des solanacées, des cucurbitacées, des crucifères et des composées. L'invention comprend également les séquences permettant de conférer la résistance aux potyvirus et/ou de marquer les gènes de résistance ou de sensibilité à ces potyvirus.
Le groupe des potyvirus dont le membre type est le virus Y de la pomme de terre ou PVY pour Potato Virus Y est le groupe de virus végétaux le plus important. En effet, les potyvirus sont capables d'infecter plus de 30 familles de plantes actuellement recensées. Ce groupe comprend au moins 180 membres ce qui correspond au tiers des virus de plantes actuellement connus. La transmission des potyvirus est réalisée par les pucerons (par exemple, Myzus persicaé) selon le mode non-persistant. Les symptômes causés par les potyvirus sont des anomalies de coloration des feuilles (mosaïques, jaunissement des nervures), des déformations des feuilles, des nécroses nervaires pouvant conduire à la nécrose de la plante entière, et des réductions importantes de la taille de la plante malade influant fortement sur la productivité.
' Les solanacées, cucurbitacées, crucifères et composées sont particulièrement sensibles aux potyvirus. Les solanacées et plus particulièrement la tomate et le piment (ou poivron) sont infectées par au moins sept potyvirus distincts à travers le monde : le virus Y de la pomme de terre (PVY) est présent sur l'ensemble des zones de culture alors que les autres sont cantonnés à un continent (Tobacco Etch virus, Pepper Mottle Virus et Pérou Tomato Virus sur le continent américain, Pepper Veinai Mottle Virus et Potyvirus E en Afrique, et Chili Veinai Mottle Virus en Asie). Cette compartimentation n'est cependant plus absolue, plusieurs potyvirus ayant été identifiés hors de leur zone d'origine. En France, et plus généralement dans le bassin méditerranéen, le potyvirus prédominant est le PVY. Apparues dans les années 70, les épidémies de PVY se sont développées dans les cultures de plein champ puis dans les cultures sous abri où ont été mis en évidence, à partir de 1982, de nouveaux isolats de PVY causant des symptômes de nécrose particulièrement graves sur la tomate (Gebre-Selassie et a , 1987). Pour certains de ces potyvirus, il est possible de classer les isolats selon leur aptitude à contourner des allèles de résistance. C'est le cas du PVY vis-à-vis du gène pvr2 chez le piment, seul gène de résistance utilisé de longue date par les sélectionneurs mais contourné dans les zones du pourtour méditerranéen et dans les zones tropicales. Malgré la prédominance du PVY en France, l'internationalisation du marché de la semence rend nécessaire l'utilisation de gènes contrôlant la résistance à ces différents potyvirus par les sélectionneurs qui vendent leurs semences à l'étranger. Plus généralement, considérant l'importance économique des infections par potyvirus et l'absence de moyens directs de lutte contre ce type d'infection, la recherche de variétés végétales résistantes constitue un des axes principaux de l'amélioration des plantes.
Les potyvirus ont une structure filamenteuse non-enveloppée (Langenberg et Zhang, 1997) de 680 à 900 nm de long et de 1 1 à 15 nm de large (Dougherty et Carrington, 1988 ; Riechmann et al., 1992). Le génome viral est constitué d'un ARN simple brin sens d'une longueur approximative de 10 kb. L'ARN simple brin possède à son extrémité 3' une queue poly A et se lie en 5' à une protéine virale appelée VPg (Murphy et al., 1990, Takahashi et al., 1997). L'ARN viral code pour 10 protéines impliquées dans le clivage des polyprotéines, la réplication du génome, le mouvement de cellule-à-cellule et le mouvement longue distance, la transmission par pucerons... La lutte contre les virus n'est réalisable qu'indirectement. En effet, il est seulement possible d'éliminer le vecteur de la maladie (les pucerons dans ce cas) ou de cultiver des variétés résistantes à l'infection virale et/ou aux vecteurs.
Face à une agression par un pathogène (virus, bactéries, champignons ou nématodes), la plante possède plusieurs stratégies pour se défendre ou résister à l'infection. Parmi les stratégies de défense, la plante peut mettre en place :
- des systèmes de défense mécaniques en élaborant et en renforçant des barrières physiques constituées d'une cuticule épaisse sur les feuilles et/ou d'un dépôt de callose ou de lignines sur les parois cellulaires. Ainsi, l'entrée et le mouvement des pathogènes dans la plante sont rendus plus difficiles.
- des systèmes de défense chimiques ou biochimiques en synthétisant des composés toxiques comme par exemple, les tanins, les phytoalexines et différents complexes protéiques.
Parmi les stratégies de résistance, on distingue la résistance non-hôte (lorsque toutes les entités d'une espèce sont résistantes à un pathogène donné) de la résistance hôte (lorsque au moins une entité de l'espèce est sensible à une souche de l'agent pathogène). La résistance hôte, la plus connue à ce jour et la mieux caractérisée, est celle faisant intervenir un gène majeur, dominant. Lorsque le gène majeur se trouve en présence d'un gène spécifique d'avirulence de l'agent pathogène, l'incompatibilité entre la plante et le pathogène est mise en place et la plante est résistante. Cette interaction, décrite par Flor
(1955) est également appelée "modèle gène-à-gène" et est très souvent associée à une nécrose localisée du tissu végétal au site d'infection (réaction d'hypersensibilité). Bien qu'assez largement répandu, ce modèle "gène-à-gène" n'est pas universel car certains systèmes de résistance décrits ne fonctionnent pas selon ce modèle, les différences résidant notamment dans le mode d'action du gène de résistance. Il existe des gènes récessifs, superdominants ou exerçant une dominance incomplète. Plusieurs gènes d'avirulence peuvent interagir avec un même gène de résistance. De nombreuses résistances sont également polygéniques, plusieurs gènes présents dans la plante sont alors impliqués dans la résistance, chacun d'eux ayant un effet de protection partielle et pouvant contrôler des mécanismes différents.
A ce jour, de nombreux gènes dominants suivant le modèle "gène-à- gène" ont été clones. Ils possèdent des structures géniques apparentées bien qu'ils agissent contre des agents pathogènes variés (virus, champignons, bactéries, insectes, nématodes). La présence de domaines conservés a permis de définir 4 grandes classes (Hammond- Kosack et Jones, 1997) de gènes dominants.
Singulièrement, on estime que 40% des résistances aux potyvirus sont récessives alors que dans les autres groupes viraux, cette proportion n'atteint que 20% en moyenne. Fraser (1992) a émis l'hypothèse que les résistances récessives seraient différentes des résistances dominantes de type "gène-à-gène" et résulteraient d'un déficit ou d'une altération spécifique du produit d'un gène de l'hôte nécessaire à l'accomplissement du cycle viral dans la plante. Les allèles dominants de sensibilité correspondraient donc à la disponibilité de ce produit impliqué dans les interactions plante/pathogène.
Il a été montré que des mutations ponctuelles dans le gène viral codant pour la protéine VPg sont impliquées dans le contournement de la résistance aux potyvirus chez plusieurs couples hôtes-pathogènes. Ceci a été montré chez les couples TVMV/Nicotiana tabacum (gène va), PVY/tomate (gène pot-1), LMV/Laitue (gène mol) et PSbMV/pois (gène sbml), (Keller et al, 1998, Morel, 2001 , Redondo, 2001 , Nicolas et al, 1997). Cela n'exclut pas que d'autres gènes viraux puissent également intervenir.
Par ailleurs, Wittman et al. (1997) ont montré qu'une isoforme du facteur d'initiation de la traduction eucaryotique eIF4E d'Arabidospsis thaliana interagit avec la protéine virale VPg du virus de la mosaïque du navet (TuMV). Cette même interaction a été détectée entre la VPg du TEV et le eIF4E de tabac et de tomate (Schaad et al., 2000).
Le gène eIF4E code pour un facteur eucaryotique d'initiation de la traduction des ARN. eIF4E correspond à une des sous-unités du facteur de traduction eIF4F (chez le germe de blé, il correspond à la sous-unité p26). Le facteur de traduction eIF4E se fixe à la coiffe des ARNm au niveau des m7G. La structure de eIF4E se caractérise par une région riche en résidus tryptophane (10 chez Arabidopsis thaliana, 11 chez le blé et 12 chez les mammifères). Ces résidus tryptophane seraient impliqués dans la liaison au groupe fonctionnel m7G (Rudd, K . et al., 1998). Le facteur de traduction eIF4E est codé par une famille multigénique. Par exemple chez Arabidopsis thaliana, 4 copies de eIF4E ont été identifiées (Rodriguez et al., 1998, Robaglia et coll., com. pers.). Ces copies présentent, deux à deux, entre 44 et 82% d'identité.
Tous ces travaux font état de la corrélation entre l'interaction eIF4E/VPg et la sensibilité de la plante aux potyvirus; mais aucun ne souligne ni même ne suggère que cette interaction pourrait conduire à une résistance. Au contraire, il est même indiqué dans Schaad et al, 2000 que l'interaction VPg/eIF4E ne joue pas de rôle dans la résistance, car les déterminants génétiques de l'interaction VPg/eIF4E sont distincts de ceux permettant aux potyvirus (via la VPg ) de contourner la résistance. II est donc du mérite des Inventeurs, dans un tel état de la technique, d'avoir mis en évidence des protéines eIF4E, ainsi que les gènes correspondants, intervenant dans la résistance ou la sensibilité des plantes aux potyvirus.
Les Inventeurs ont notamment constaté que différentes plantes résistantes aux potyvirus présentaient des mutations ponctuelles situées dans une même région de la protéine eIF4E ; cette région, qui est très conservée entre les protéines eIF4E issues de diverses espèces végétales, notamment de solanacées, est définie par la séquence générale (I) suivante :
DX1X2X3X4KSX5QX6AWGSSX7RX8X9 FSXιoVEXιιF X12X13Y NIHXi4PSKLXi5Xι6GA D dans laquelle :
- Xi, X2> X3, X4> X6, X , X8, X9, Xio, Xι2, Xι3, X15, et X16 représentent chacun un acide aminé neutre ;
- X5 et X14 représentent un acide aminé basique ;
- Xi i représente un acide aminé acide ; - D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, et L ont leur signification usuelle en code 1 -lettre.
On définit ici comme « acide aminé neutre », tout acide aminé choisi parmi les suivants : alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, tryptophane, phénylalanine, méthionine, glycine, serine, thréonine, tyrosine, cystéine, glutamine, asparagine. On définit comme « acide aminé chargé », tout acide aminé choisi parmi les suivants : histidine, lysine, arginine, glutamate, aspartate. Parmi ces acides aminés chargés, histidine, la lysine ou l 'arginine sont des acides aminés basiques, et le glutamate et l'aspartate des acides aminés acides.
La séquence (I) est également représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID NO: 1
Les mutations mises en évidence par les Inventeurs chez le poivron sont les suivantes :
- la substitution de l'acide aminé neutre X3 de la séquence (I) par un acide aminé basique ; - la substitution de l'acide aminé neutre X7 de la séquence (I) par un acide aminé basique ;
- la substitution du résidu aspartate en position C-terminale de la séquence (I) par un acide aminé neutre. La mutation de X3 a été observée chez des lignées de poivron présentant deux types différents de résistance aux potyvirus (pvr2' ctpvr22) ; les poivrons présentant le phénotype pvr2* possèdent en outre la mutation en position X7, et les poivrons présentant le phénotype pvr22 possèdent en outre la mutation en position C-terminale. Chez la tomate, les Inventeurs ont notamment observé les mutations suivantes :
- la substitution de l'acide aminé neutre Xi de la séquence (I) par un acide aminé basique ;
- la substitution du résidu Ala du motif A GSS de la séquence (I) par un acide aminé acide ;
Grâce à la très forte conservation de séquence des gènes eIF4E chez les eucaryotes et à la disponibilité de structure 3D des protéines eIF4E de la souris et de la levure (Marcotrigiano et al., 1997, Cell 89 : 951-961 ; Matsuo et al., 1997, Nat. Struct. Biol. 4 : 717-724), les positions des mutations par rapport à la structure 3D de eIF4E chez le piment et la tomate peuvent être déterminées. Toutes ces mutations sont physiquement proches et en surface de la protéine. Par ailleurs, ces mutations ne concernent pas des acides aminés très conservés chez les eucaryotes, ni ceux impliqués dans les fonctions essentielles de eIF4E, à savoir la reconnaissance de la coiffe ou l'interaction entre eIF4E et eIF4G ou les 4E-binding protein. Toutefois, il est probable que ces mutations exercent un effet sur l'interaction VPg/eIF4E par modification de la structure de eIF4E au niveau de la ou des régions de celle-ci impliquées dans cette interaction. Cette modification de la structure résulte vraisemblablement de la substitution d'acides aminés par des acides aminés de charge différente (remplacement d'acides aminés neutres par des acides aminés chargés, ou à l'inverse d'acides aminés chargés par des acides aminés neutres, ou des acides aminés de charge opposée) qui constitue le point commun à l'ensemble des mutations mises en évidence par les Inventeurs. On peut donc raisonnablement supposer que d'autres mutations de même type dans une protéine eIF4E végétale, au niveau de la région définie par la séquence (I) entraîneront des modifications de structure similaire, produisant le même effet sur l'interaction VPg/eIF4E.
En particulier, il apparaît que la substitution d'au moins un des acides aminés neutres Xi, X2, X3 ou X4, par un acide aminé chargé, notamment un acide aminé basique, joue un rôle important dans la résistance aux potyvirus.
Ces observations permettent de proposer des outils, notamment des outils génétiques, de criblage et/ou d'obtention de plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus. La présente invention concerne plus particulièrement un procédé de sélection de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans les plantes à tester :
- de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E (dénommée ci-après : « protéine eIF4E de type sauvage ») comprenant une région définie par la séquence (I) ci-dessus, ou d'une séquence codant pour ladite protéine ;
- de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E mutante comprenant une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par substitution d'au moins un acide aminé neutre de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, de préférence un acide aminé basique et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée, ou d'une séquence codant pour ladite protéine ;
- et la sélection des plantes où l'on détecte une protéine eIF4E mutante ou une séquence codant pour ladite protéine, et où l'on ne détecte pas de protéine eIF4E de type sauvage ou de séquence codant pour ladite protéine.
La présente invention a également pour objet un procédé de sélection de plantes utilisable pour l'obtention de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans les plantes à tester de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E mutante telle que définie ci-dessus ou d'une séquence codant pour ladite protéine, et la sélection des plantes où l'on détecte ladite protéine eIF4E mutante ou une séquence codant pour ladite protéine.
Selon un mode de mise en oeuvre préféré de l'invention, ladite protéine eIF4E mutante comprend une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par : a) substitution d'au moins un des acides aminés Xι; X j X3 ou X4> de ladite séquence
(I) par un acide aminé chargé, et b) substitution d'au moins un des autres acides aminés neutres de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée.
La détection de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, peut s'effectuer notamment à l'aide d'anticorps spécifiquement dirigés contre la forme recherchée de la protéine eIF4E. Il peut s'agir notamment d'anticorps dirigés soit contre la forme sauvage soit contre la forme mutante de la région de eIF4E définie par la séquence (I).
Pour la détection de la présence ou de l'absence d'une séquence codant pour une protéine eIF4E de type sauvage ou d'une séquence codant pour une protéine eIF4E mutante, on dispose de nombreux outils ; il peut s'agir notamment de polynucléotides dérivés de la séquence du gène eIF4E et en particulier de polynucléotides capables de s'hybrider sélectivement soit avec un allèle sauvage soit avec un allèle mutant de eIF4E, tels que définis ci-dessus ou de polynucléotides permettant l'amplification de la région de eIF4E contenant la mutation recherchée ; il peut s'agir également d'enzymes de restriction reconnaissant une séquence-cible présente dans la forme sauvage, mais non dans la forme mutée (ou l'inverse).
La présente invention a ainsi pour objet l'utilisation d'un outil de sélection choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, telles que définies ci-dessus ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide a) ou b) ; d) un anticorps dirigé contre une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, telles que définies ci-dessus ; pour la sélection de plantes résistantes aux potyvirus.
En particulier, l'invention concerne en un procédé de sélection de plantes résistantes aux potyvirus caractérisé en ce qu'il comprend la mise en œuvre d'au moins un moyen de sélection choisi dans le groupe des outils génétiques (ou apparentés) comprenant : * A / tout ou partie d'une au moins des séquences sélectionnées dans le sous-groupe comportant :
- SEQ ID NO: 2,
- SEQ ID NO:4,
- SEQ ID NO:6 et 8, - tout analogue de ces séquences résultant de la dégénérescence du code génétique,
- toute séquence d'ADNc complémentaire d'au moins l'une de ces séquences et/ou d'au moins un de leurs analogues;
* B / tout ou partie d'un au moins des produits de transcription des séquences A ; * C / tout ou partie d'un au moins des produits de traduction des séquences A;
* D / tout ou partie d'au moins un anticorps spécifique d'au moins un produit de traduction de C/;
* E / et toute association des outils A, B, C, D. De préférence, les moyens de sélection sont sélectionnés parmi les sous- groupes d'outils A/ et/ou B/, et plus préférentiellement encore parmi le sous-groupe d'outils A/. Par ce repérage simple, aisé et fiable de plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus, les inventeurs ont ainsi mis au point un nouveau procédé s'appuyant sur l'utilisation de séquences correspondant au gène eIF4E.
Le procédé objet de l'invention s'applique particulièrement aux solanacées, cucurbitacées, crucifères et composés et plus précisément aux plantes des genres Lycopersicon, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lactuca, Cucumis, Arabidopsis etc....
Les potyvirus concernés sont, par exemple, le virus Y de la pomme de terre (PVY), le virus de la gravure du tabac (TEV) et/ou le virus de la mosaïque de la laitue (LMV), et/ou le virus de la mosaïque jaune de la courgette (ZYMV) et/ou le virus de la mosaïque du navet (TuMV).
Pour mettre en œuvre le procédé selon l'invention, on utilise des séquences nucléotidiques et/ou des séquences peptidiques ou des enzymes de restriction en tant que moyens de détection, sondes ou amorces, pour sélectionner des plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus.
Ces moyens de détections comprennent en particulier des sondes ou amorces nucléotidiques.
On entend par « amorce » au sens de la présente invention toute séquence polynucléotidique utilisable pour amplifier une séquence d'un gène eIF4E susceptible de comprendre une mutation associée à la résistance aux potyvirus. Il s'agit notamment de polynucléotides utilisables pour amplifier tout ou partie de la séquence de eIF4E codant pour la région de eIF4E définie par la séquence (I), ou de la séquence mutante qui en est dérivée.
On entend par «sonde» au sens de la présente invention toute séquence polynucléotidique, s'hybridant avec un gène eIF4E de type sauvage ou avec un gène elF4E mutant tel que définis ci-dessus. Ceci inclut notamment les séquences nucléotidiques capables de s'hybrider sélectivement soit avec un allèle du gène eIF4E associé à la résistance aux potyvirus, soit avec un allèle du gène elF4E associé à la sensibilité aux potyvirus. Ces sondes et ces amorces peuvent être employées comme marqueurs spécifiques des plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus.
Conformément à l'invention, on est en mesure de faire le tri entre les plantes sensibles et les plantes résistantes aux potyvirus au moyen des outils génétiques (ou apparentés) (A) à (E), voire d'enzymes de restriction spécifiques. Ces dernières seront décrites infra.
Les séquences (A) nucléotidiques SEQ ID NO: 2, 4, 6, et 8 correspondent à des gènes eIF4E de différentes solanacées impliqués dans la résistance aux potyvirus codant pour un facteur eucaryotique d'initiation de la traduction des ARN. La SEQ ID NO: 8 correspond à un allèle récessif eIF4E de résistance à un potyvirus, tandis que SEQ ID NO: 2, 4, et 6 représentent des allèles dominants eIF4E de sensibilité à un potyvirus.
Il a donc été découvert conformément à l'invention des moyens de sélection ou repères génétiques de résistance ou de sensibilité aux potyvirus. Le procédé de sélection suivant l'invention peut faire intervenir séparément ou ensemble les deux types de moyens de sélection ou repères.
Naturellement, l'invention englobe également tous les équivalents à ces séquences (A) nucléotidiques SEQ ID NO:: 2, 4, 6, et 8, qui conservent la fonction de repère génétique eIF4E de sensibilité/résistance aux potyvirus propres aux séquences de référence. Pour ce qui concerne les ADN, il s'agit notamment des analogues de dégénérescence génétique et des séquences d'ADNc complémentaires des séquences de référence. Les équivalents polynucléotidiques des séquences (A) de référence se trouvent également parmi leurs produits (ARN) de transcription (B). Les protéines (C) issues de (A) et de (B) constituent d'autres repères intracellulaires permettant la sélection de plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus. Outre les cibles (A), (B), (C), les moyens de sélection de l'invention peuvent aussi être des sondes nucléotidiques aptes à s'hybrider avec des cibles nucléotidiques (A) et (B) complémentaires, ou bien encore des moyens de détection protéiques (anticorps D) aptes à s'apparier avec des cibles antigéniques (C) spécifiques. Il est envisageable de combiner tous ces moyens équivalents (A), (B), (C) & (D) pour former un outil de sélection (E).
Les moyens selon l'invention couvrent également tout fragment des séquences (A), (B), (C) & (D). Par "fragment" on entend, selon l'invention :
- soit un polynucléotide d'au moins 10, 20, 30, 50, 100, 200, 300, 400, 500 nucléotides contigus de la séquence de référence ; des fragments préférés sont ceux qui sont capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec ladite séquence de référence.
- soit un polyaminoacide d'au moins 3, 6, 10, 15, 30, 60, 100, 150, 200 aminoacides contigus de la séquence de référence ; des fragments préférés sont ceux qui sont capables de s'hybrider sélectivement en conditions stringentes avec ladite séquence de référence.
Selon une modalité avantageuse de l'invention, le procédé est caractérisé en ce que :
- on met en présence au moins un moyen de détection comprenant au moins l'un des outils A,B,C,D,E selon la revendication 1 et/ou au moins une enzyme de restriction, avec au moins un extrait génomique et/ou protéique d'une plante à tester, - on soumet ledit extrait génomique et/ou protéique, éventuellement apparié et/ou hybride et/ou digéré, à au moins une séparation,
- on révèle les éventuels appariements et/ou hybridations et/ou digestions susceptibles de se produire, - et on procède à la lecture des résultats pour conclure finalement sur la présence ou l'absence d'un allèle de résistance (pvr2 ) ou d'un allèle de sensibilité (pvr+) à au moins un potyvirus.
Ce procédé s'inscrit dans le cadre des méthodologies connues dans le domaine de la détection et de la reconnaissance de caractéristiques génétiques de végétaux.
Selon un premier mode de mise en œuvre du procédé, dans lequel le principe de sélection est fondé sur l'utilisation d'une ou plusieurs enzymes de restriction spécifiques, le procédé peut répondre à la méthodologie suivante :
- on amplifie par PCR la séquence codante du gène eIF4E, à partir de l'ADN de la plante à tester, par exemple à l'aide des amorces SEQ ID NO: 18 et/ou 19, on digère le produit d'amplification avec une enzyme de restriction appropriée ;
- on sépare les éventuels fragments obtenus, et on sélectionne les plantes résistantes ou sensibles selon le profil de restriction dudit produit d'amplification. Par exemple, des plantes sensibles aux potyvirus peuvent être détectées par un profil de restriction faisant apparaître la présence d'un site de coupure par l'enzyme
TspRI ou l'un de ses isoschizomères et les plantes résistantes aux potyvirus peuvent être détectées par un profil de restriction faisant apparaître l'absence dudit site de coupure par
TspRI ou l'un de ses isoschizomères et la présence d'un site de coupure par l'enzyme Mvnl ou l'un de ses isoschizomères.
Selon un deuxième mode de mise en œuvre du procédé, correspondant au cas où le mode de sélection est l'hybridation de séquences nucléotidiques complémentaires, le procédé consiste de préférence :
- à extraire l'ADN des plantes, - à soumettre éventuellement cet ADN à une digestion enzymatique à l'aide d'au moins une enzyme de restriction,
- à dénaturer l'ADN éventuellement digéré,
- à mettre en présence l'ADN ainsi dénaturé, avec la sonde elle-même préalablement dénaturée et dotée d'au moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation,
- à éliminer l'ADN et la sonde non hybridée,
- à révéler l'hybridation à l'aide du marqueur, - et à sélectionner des plantes qui possèdent un profil d'hybridation correspondant à la co-ségrégation de la cible hybridée avec la sonde marquée et de l'allèle de résistance ou de sensibilité.
La distinction entre les plantes sensibles et les plantes résistantes peut s'effectuer, dans le cas où l'ADN a été digéré par une enzyme de restriction, par la différence de taille des fragments hybrides.
Elle peut également s'effectuer à l'aide d'une sonde capable de s'hybrider sélectivement avec l'allèle de résistance ou l'allèle de sensibilité. L'hybridation des molécules simple brin de la sonde et de la cible est effectuée de préférence dans des conditions d'hybridation stringentes permettant une hybridation sélective, qui peuvent être déterminées de manière bien connue de l'homme du métier. En général la température d'hybridation et de lavage est inférieure d'au moins 5°C au Tm de la séquence de référence à un pH donné et pour une force ionique donnée. Typiquement la température d'hybridation est d'au moins 30°C pour un polynucléotide de 15 à 50 nucléotides et d'au moins 60°C pour un polynucléotide de plus de 50 nucléotides.
Le niveau du signal généré par l'interaction entre la séquence capable de s'hybrider de manière sélective et les séquences de référence est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Avec une sonde marquée par exemple à l'aide d'un élément radioactif, tel que le 32P,ou d'une enzyme greffée, telle que la peroxydase, l'hybridation est aisément révélée qualitativement et quantitativement.
L'ADN utilisé dans le premier ou le deuxième mode de mise en œuvre peut être soit de l'ADN total, soit de l'ADNc. Selon un troisième mode de mise en œuvre (parmi d'autres) du procédé selon l'invention, correspondant au cas où le mode de sélection est l'appariement anticorps/antigène, le procédé consiste, de préférence, à détecter la présence d'un polypeptide en partie constitué de tout ou partie d'une des séquences d'acides aminés décrites ci-dessous et incluses dans l'invention. Le procédé peut consister à mettre en contact l'échantillon à tester avec un anticorps tel que décrit ci-dessus puis à détecter le complexe antigène / anticorps formé.
Quel que soit le mode de sélection, le procédé de sélection selon l'invention est fiable et sensible.
La présente invention a également pour objet un polynucléotide codant pour une protéine eIF4E mutante comprenant une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par substitution d'au moins un acide aminé neutre de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, de préférence un acide aminé basique et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée.
Selon un mode de réalisation préféré, ledit polynucléotide code pour une protéine eIF4E mutante qui comprend une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par : a) substitution d'au moins un des acides aminés X^ X2ι X3 ou X > de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, et b) substitution d'au moins un des autres acides aminés neutres de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée.
Des polynucléotides conformes à l'invention sont par exemple ceux qui codent pour les variants des séquences SEQ ID NO: 22 ou 23 associés à la résistance aux potyvirus. Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne une séquence nucléotidique caractérisée en ce qu'elle est décrite par une séquence choisie dans le groupe comprenant tout ou partie des séquences suivantes:
- SEQ ID NO: 2
- SEQ ID NO: 4 - SEQ ID NO: 6
- SEQ ID NO: 8
La séquence nucléotidique SEQ ID NO:2 est une séquence d' ADNc obtenue à partir d'ADN de tabac et correspondant au gène de tabac. La séquence nucléotidique SEQ ID NO:4 est une séquence codant pour une protéine eIF4E d'une variété de Lycopersicon esculentum sensible aux potyvirus. Les séquences SEQ ID NO: 6 et 8 sont des séquences codant pour des protéines eIF4E de piment (Capsicum annuum), variétés Yolo Wonder et Yolo Y respectivement.
La présente invention a également pour objet des amorces permettant l'amplification d'un gène eIF4E, ou d'une portion de celui-ci susceptible de contenir au moins une mutation, telle que définie ci-dessus, associée à la résistance aux potyvirus ; il s'agit notamment d'amorces permettant l'amplification de la séquence de eIF4E codant pour la région de eIF4E définie par la séquence (I), ou d'une séquence mutante qui en est dérivée.
Des amorces conformes à l'invention peuvent être aisément définies par l'homme du métier, à partir des séquences nucléotidiques ou peptidiques décrites dans la présente invention.
A titre d'exemples non-limitatifs, on citera : les amorces d'amplification constituées par les séquences-amorces nucléotidiques SEQ ID NO: 18 & 19 ; les amorces de clonage SEQ ID NO: 10 à 17 ; les amorces de criblage de banque BAC constituées par les séquences nucléotidiques SEQ ID NO : 20 & 21.
Les SEQ ID NO : 18 & 19 sont des amorces issues de la séquence codante de eIF4E du piment Yolo Wonder, permettant notamment par amplification PCR puis par digestion enzymatique, la détection des séquences nucléotidiques porteuses des allèles de résistance pvr2 et de sensibilité pvr+ aux potyvirus. Les amorces de clonage SEQ ID NO : 10 & 11 dégénérées et les SEQ ID NO : 12 à 17 non dégénérées, ont été définies sur un alignement des séquences de eIF4E de tabac, tomate et Arabidopsis et utilisées pour la synthèse (RACE) de sondes ADNc de détection d'eIF4E dans le génome de tomate et de piment. Les amorces SEQ ID NO: 20 & 21 de criblage de banque BAC sont non dégénérées. Ces amorces SEQ ID NO: 10 à 17, 20 & 21 peuvent éventuellement être utilisées directement ou indirectement (construction d'outils de sélection) dans la détection de caractéristiques de résistance ou de sensibilité aux potyvirus.
La présente invention a également pour objet une protéine eIF4E mutante comprenant une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par substitution d'au moins un acide aminé neutre de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, de préférence un acide aminé basique et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée. Selon un mode de réalisation préféré, ladite protéine eIF4E mutante comprend une région dérivée de celle définie par la séquence (I) ci-dessus, par : a) substitution d'au moins un des acides aminés Xi, X2, X3 ou X > de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, et b) substitution d'au moins un des autres acides aminés neutres de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée.
La présente invention couvre aussi les produits de traduction des séquences nucléotidiques SEQ ID NO: 2, 4, 6, et 8, à savoir les polypeptides choisis dans le groupe comprenant tout ou partie des séquences suivantes:
- SEQ ID NO: 3
- SEQ ID NO: 5
- SEQ ID NO: 7
- SEQ ID NO: 9. Les moyens de sélection résistance / sensibilité des plantes aux potyvirus, constitués par des séquences d'acides aminés, sont de préférence utilisés comme cibles permettant le repérage. Il s'agit alors de moyens de sélection indirects qui sous- tendent la mise en œuvre de moyens de détection spécifiques de ces cibles peptidiques. Ces moyens de détection sont avantageusement des anticorps qui constituent un autre objet de la présente invention. Ainsi, lesdits anticorps sont caractérisés en ce qu'ils sont spécifiquement dirigés contre tout ou partie d'un au moins des produits de traduction C, et plus particulièrement des séquences d'acides aminés SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 22, ou 23 ou un fragment d'au moins 6 acides aminés de celle-ci. Ces anticorps peuvent être monoclonaux ou polyclonaux.
Les anticorps contre les polypeptides tels que définis ci-dessus peuvent être préparés selon les techniques classiques bien connues de l'homme de métier (par exemple, Kohler et Milstein, 1975 ; Kozbor et al. 1983, Martineau et al., 1998). Un anticorps selon l'invention pourra comprendre un marqueur détectable isotopique ou non isotopique, par exemple fluorescent, ou encore être couplé à une molécule telle que la biotine selon des techniques bien connues de l'homme de métier.
Un autre volet de l'invention a trait aux moyens de sélection formés par des sondes pour la détection de plantes résistantes à au moins un potyvirus, ces sondes étant prises en elles-mêmes. On définit dans ce volet des sondes pour la détection de plantes résistantes à au moins un potyvirus.
Une première catégorie de sondes est caractérisée en ce que chaque sonde comprend au moins une séquence correspondant à tout ou partie des SEQ ID NO: 2, 4, 6, et 8. Au sein de cette première catégorie, les sondes comprenant au moins une séquence correspondant à tout ou partie de SEQ ID NO: 2, 4, 6, et 8, et notamment à tout ou partie de la portion codant pour la région de la protéine eIF4E définie par la séquence générale (I) sont tout spécialement préférées.
SEQ ID NO: 6 est une sonde de sensibilité issue du piment Yolo Wonder. Elle se distingue de SEQ ID NO: 8, qui est une sonde de résistance issue du piment Yolo Y, par deux bases nucléotidiques. Ces mutations montrées sur SEQ ID NO: 6 & 8, correspondent aux sites de restriction TspRI pour SEQ ID NO: 6 et MnvI pour SEQ ID NO: 8, marquant respectivement la sensibilité aux potyvirus dans Yolo Wonder et la résistance aux potyvirus dans Yolo Y.
Ces sondes sont utilisées pour distinguer les plantes résistantes et sensibles, soit par hybridation sélective et détection de la présence ou de l'absence d'un signal d'hybridation, soit par digestion par une enzyme de restriction appropriée capable de cliver différentiellement l'allèle de sensibilité et l'allèle de résistance, par exemple EcoRI, TspRI, ou MnvI suivie de l'hybridation de la sonde avec le produit de restriction. La distinction entre les plantes sensibles et les plantes résistantes se fait dans ce dernier cas par la différence de taille des fragments hybrides.
La présente invention fournit également des outils permettant de réaliser un autre procédé de sélection conforme au premier mode de mise en oeuvre du procédé selon l'invention, tel que défini ci-dessus. Selon ce premier mode, une amplification par PCR de la séquence eIF4E est tout d'abord effectuée. L'amplification est suivie d'une digestion sélective par une enzyme de restriction. Les outils qui interviennent sont donc de deux types : enzyme(s) de restriction et amorce(s) PCR permettant d'amplifier la séquence eIF4E. La présente invention a notamment pour objet un kit permettant de détecter un allèle de eIF4E associé à la résistance ou à la sensibilité aux potyvirus, caractérisée en ce qu'il comprend :
- au moins une enzyme de restriction choisie parmi : a) une enzyme reconnaissant un site de restriction I présent dans au moins un allèle de eIF4E associé à la sensibilité aux potyvirus, et absent des allèles de eIF4E associés à la résistance aux potyvirus ; b) une enzyme reconnaissant un site de restriction II présent dans au moins un allèle de eIF4E associé à la résistance aux potyvirus, et absent des allèles de eIF4E associés à la sensibilité aux potyvirus ; et - une paire d'amorces nucléotidiques permettant d'amplifier eIF4E ou une portion de celui-ci comprenant le site de restriction I et/ou le site de restriction II.
Par exemple : pour détecter un allèle de eIF4E associé à la sensibilité aux potyvirus, tel que celui représenté par la séquence SEQ ID NO: 6, l' enzyme de restriction est TspRI, ou l'un de ses isoschizomères, reconnaissant un site de restriction défini par la séquence sens: NNCASTGNNA et la séquence antisens ΛNNGTSACNN.
Les amorces nucléotidiques sont choisies de manière à permettre l'amplification de la totalité de la séquence de eIF4E ou d'au moins une portion de celle-ci comprenant le site TspRI ; - pour détecter un allèle de eIF4E associé à la résistance aux potyvirus, tel que celui représenté par la séquence SEQ ID NO: 8 l'enzyme de restriction est Mvnl, ou l'un de ses isoschizomères, reconnaissant un site de restriction défini par la séquence sens: CGΛCG et la séquence antisens : GCΛGC. Les amorces nucléotidiques sont choisies de manière à permettre l'amplification de la totalité de la séquence de eIF4E ou d'au moins une portion de celle-ci comprenant le site
Mvnl ;
Dans les deux cas on peut utiliser par exemple les amorces SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19.
Comme indiqué ci-dessus, la détection de plantes sensibles ou résistantes aux potyvirus peut également s'effectuer par détection de la présence ou de l'absence de la forme sauvage ou mutante de la protéine eIF4E. Ainsi, la présente invention englobe l'utilisation d'une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, telles que définies ci-dessus, ou d'un anticorps spécifique d'une desdites protéines, pour la sélection de plantes résistantes aux potyvirus.
De préférence, ladite protéine eIF4E est choisie parmi : - la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 3 ;
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 5 ;
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 7 ; la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 9 ; le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 22 ; le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 23 ;
Ainsi, une catégorie de moyens de détection de la résistance aux potyvirus conformes à l'invention est caractérisée en ce que chacun de ces moyens comprend au moins un anticorps spécifique de tout ou partie d'une protéine eIF4E mutante conforme à l'invention, et notamment d'un fragment d'au moins 6 acides aminés de celle-ci portant une mutation associée à la résistance, telle que définie ci-dessus.
Par exemple, un moyen de détection de la résistance peut être constitué par un anticorps spécifique de tout ou partie d'une séquence polypeptidique telle que définie ci-dessus, notamment d'un fragment d'au moins 6 acides aminés de celle-ci portant une mutation associée à la résistance.
L'invention concerne également des moyens de détection de la sensibilité ou de la résistance aux potyvirus, constituées chacun par au moins une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences suivantes : - SEQ ID NO: 3 ;
- SEQ ID NO: 5 ;
- SEQ ID NO: 7 ;
- SEQ ID NO: 9 ;
- SEQ ID NO: 22 ; - SEQ ID NO: 23 ;
L'invention concerne plus particulièrement des moyens de détection de la sensibilité aux potyvirus, constitués chacun par au moins un anticorps spécifique d'une séquence d'acides aminés choisie dans le groupe comprenant les séquences suivantes :
- SEQ ID NO: 3 ; - SEQ ID NO: 5 ;
- SEQ ID NO: 7 ;
- SEQ ID NO: 9 ;
- SEQ ID NO: 22 ; - SEQ ID NO: 23 ; ou un fragment d'au moins 6 acides aminés de l'une desdites séquences, notamment un fragment de la région de celle-ci définie par la séquence
(I). De préférence, chaque sonde nucléotidique ou autre moyen de détection susvisé est pourvu d'au moins un marqueur, utile comme témoin de l'hybridation nucléotidique ou l'appariement antigène/anticorps au cœur de la détection de la séquence sensible. Avantageusement, ce marqueur est détectable par moyens spectroscopiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou encore chimiques. Par exemple un tel marqueur peut consister en un isotope radioactif de P, H, en une molécule fluorescente (5-bromodéoxyuridine, fluorescéine, acétylaminofluorène) ou encore en un ligand tel que la biotine. Concernant plus spécialement les sondes nucléotidiques, leur marquage est fait de préférence par incorporation de molécules marquées au sein des polynucléotides par extension d'amorces ou bien par ajout sur les extrémités 3' ou 5'. De manière préférentielle, les séquences utilisées pour détecter les plantes résistantes aux potyvirus sont utilisées en tant que sondes ou amorces nucléotidiques.
Il va de soi que tous les moyens de détection susvisés ne sont pas limités strictement aux séquences désignées, mais englobent tous les équivalents constitués notamment par les séquences similaires conservant la fonction concernée et telles que définies ci-dessus.
L'homme du métier connaît parfaitement les différentes méthodes de préparation de sondes et d'amorces, y compris par clonage et par l'action d'enzymes de restriction, ou encore par synthèse chimique directe selon des techniques telles que la méthode au phosphodiester de Brown et al. (1979) ou la technique de support solide décrite dans le brevet européen N° EP 0707592. Les acides nucléiques peuvent être marqués, si désiré, en incorporant une molécule ou un marqueur détectable comme exposé ci-dessus. Des exemples de marquage non radioactifs de fragments d'acides nucléiques sont décrits notamment dans le brevet français N° FR 78 10 975 ou encore dans les articles de Urdéa et al., (1988) ou Sanchez-Pescador et al. (1988).
Selon un autre de ses aspects, la présente invention concerne l'utilisation des moyens de détection définis ci-dessus pour la détection de plantes résistantes/ sensibles à au moins un potyvirus.
Conformément à l'invention, on met en œuvre en tant que repère(s) oligonucléotidique(s) de résistance/sensibilité aux potyvirus, les sites de restriction Mvnl et/ou TspRI, au demeurant connus, des séquences eIF4E.
De préférence, les sites de restriction utilisés comme reρère(s) oligonucléotidique(s) correspondent : - à la séquence sens : CGΛCG et à la séquence antisens : GCΛGC
- et/ou à la séquence sens: NNCASTGNNΛ et à la séquence antisens : ΛNNGTSACNN.
L'exploitation de ces sites de restriction comme repères (ou marques ou étiquettes) de résistance aux potyvirus sur des séquences exprimées, est à rapprocher du premier mode de mise en œuvre du procédé de détection sus-décrit, dans lequel on a recours à des enzymes de restriction (par exemple : Mvnl et/ou TspRI ) et à des amorces d'amplification de la séquence eIF4E , par exemple :SEQ ID NO 18 et/ou 19.
Eu égard à la spécificité des sites de restriction Mvnl & TspRI, la présente invention englobe également l'utilisation comme repère(s) oligonucléotidique(s) de résistance/sensibilité aux potyvirus, des susdits sites de restriction Mvnl & TspRI, et, de préférence, du site de restriction correspondant à la séquence sens : CGΛCG et à la séquence antisens : GCΛGC et/ou du site de restriction correspondant à la séquence sens: NNCASTGNNΛ et à la séquence antisens : ΛNNGTSACNN. Selon encore un autre de ses aspects, la présente invention concerne un kit de sélection de plantes résistantes/ sensibles aux potyvirus comprenant au moins un moyen de détection de type anticorps ou polynucléotide tels que définis supra. Le kit comprend le cas échéant les réactifs nécessaires à la réalisation d'une réaction d'hybridation ou d'amplification. L'invention a également pour objet les plantes issues du procédé ci- dessus décrit et/ou de la mise en œuvre des outils et/ou de l'utilisation et/ou du kit de sélection définis ci-dessus. De préférence, ces plantes appartiennent à la famille des solanacées, des cucurbitacées, des crucifères et des composées. De manière encore plus préférée, elles sont choisies parmi les tomates, piments et/ou la laitue. A titre d'exemple, les inventeurs réalisent le procédé objet de l'invention en suivant le protocole d'analyse RFLP (polymorphisme de longueur de fragments de restriction). Pour ce faire, les inventeurs ont utilisés un protocole classique de RFLP dans lequel les sondes objets de l'invention sont marquées au 32P et dans lequel l'ADN des plantes de piment à analyser est digéré par l'enzyme de restriction EcoRI. A l'issue de ce procédé, les inventeurs obtiennent des profils d'hybridation différents entre les plantes résistantes aux potyvirus et les plantes sensibles, permettant ainsi de sélectionner les plantes sensibles ou résistantes. Ces dernières pourront ensuite entrer dans un programme d'amélioration des plantes par croisements successifs.
L'invention ne concerne pas seulement la sélection de plantes résistantes ou sensibles aux potyvirus. En effet, dans la mesure où les inventeurs ont pu identifier le gène eIF4E déterminant une résistance récessive aux potyvirus, il est désormais envisageable d'obtenir de nouvelles variétés de plantes génétiquement modifiées, résistantes (ou sensibles) à au moins un potyvirus. L'invention concerne donc un procédé non biologique d'obtention de nouvelles variétés de plantes génétiquement modifiées, résistantes (ou sensibles) à au moins un potyvirus, caractérisé en ce qu'il consiste essentiellement à faire en sorte qu'apparaisse et/ou à introduire un allèle de eIF4E associé à la résistance (ou à la sensibilité) audit potyvirus dans le génome de ces plantes.
Selon un mode avantageux de mise en œuvre de ce procédé, l'apparition de l'allèle de résistance est provoquée par la mise en oeuvre d'une méthode sélectionnée dans le groupe comprenant :
- mutagenèse, avantageusement "Tilling", - recombinaison homologue,
- surexpression,
- insertion/délétion,
- "gène silencing" / transgenèse,
- et leurs combinaisons. Les outils susceptibles d'être mis en œuvre dans le susdit procédé non biologique d'obtention font également partie intégrante de la présente invention.
La présente invention a ainsi pour objet toute unité génétique construite comprenant un polynucléotide conforme à l'invention codant pour une protéine eIF4E mutante, placé sous contrôle d'éléments appropriés de contrôle de la transcription, et éventuellement de la traduction.
Ladite protéine eIF4E mutante peut avantageusement être choisie parmi les variants des séquences SEQ ID NO: 22 ou 23 associés à la résistance aux potyvirus.
La présente invention a aussi pour objet toute unité génétique construite caractérisée en ce qu'elle comprend : - au moins un outil génétique A/ et/ou B/ tel que défini supra,
- et/ou au moins une séquence nucléotidique choisie dans le groupe comprenant tout ou partie des séquences suivantes :
- SEQ ID NO: 6
- SEQ ID NO: 8 - et/ou au moins une séquence nucléotidique codant pour facteur eIF4E et comprenant au moins un site de restriction Mvnl. et/ou TspRI, et, de préférence, au moins un site de restriction correspondant à la séquence sens : CGACG et à la séquence antisens : GCΛGC et/ou un site de restriction correspondant à la séquence sens: NNCASTGN Λ et à la séquence antisens : ΛNNGTSACN . Un autre outil de transformation génétique couvert par l'invention est constitué par tout vecteur de transformation de cellules végétales comportant au moins une unité génétique construite telle que visée ci-dessus. Il peut s'agir de tout vecteur de clonage connu et approprié (phages / plasmides / cosmides ). Les cellules végétales et les microorganismes transformés au moyen d'au moins un vecteur ou d'au moins une unité génétique construite tels que définis supra, sont également visées par l'invention.
A un niveau supérieur, l'invention englobe les plantes transformées au moyen d'au moins un vecteur et/ou d'au moins une unité génétique construite et/ou de cellules végétales transformées et/ou de microorganismes transformés, tels qu'ils ont été décrits ci-dessus.
L'homme du métier connaît bien toutes les techniques directes ou indirectes de modification génétique . Des détails complémentaires sont donnés dans les exemples qui suivent.
DESCRIPTION DES FIGURES
- La Figure 1 représente le gel issu d'une analyse par southern blot et montrant les différences de profils du marqueur eIF4E de résistance aux potyvirus, observées pour différents piments sensibles ou résistants. L'ADN génomique de piment est digéré par l'enzyme EcoRI et hybride avec le cDNA eIF4E de tabac - SEQ ID
NO: 2 - (exemple 3).
- La Figure 2 représente le gel montrant les amplifications PCR du gène eIF4E impliqué dans la résistance aux potyvirus chez le piment et met en évidence un site de restriction Mvnl différentiel entre sensible et résistant, (exemple 4). - La Figure 3 représente l'alignement de la séquence protéique de eIF4E de différentes variétés de piment, sensibles ou résistantes aux potyvirus.
- . La Figure 4 représente l'alignement de la séquence protéique de eIF4E de différentes variétés de tomate, sensibles ou résistantes aux potyvirus.
EXEMPLES ; Exemple 1 : Obtention des sondes tomate et piment
Les cDNA de tomate et de piment ont été obtenus par la technique de 3' et 5' RACE (System for Rapid Amplification of cDNA Ends commercialisé par la société Invitrogen ™) à partir de l'extraction d'ARN total de tomate et de piment et à l'aide d'amorces dégénérées définies sur un alignement des séquences de eIF4E de tabac, tomate et Arabidopsis. La partie 3' du cDNA a été clonée par 3'RACE. Des amorces définies entre le TAG et la queue polyA des séquences obtenues par 3 'RACE ont été utilisées pour obtenir les cDNA complets par 5' RACE.
Amorces utilisées pour les deux étapes de la 3' RACE : Etape 1 : TCTAGATACAAYAATATCCAYCACCCAAGCAA = SEQ ID NO: 10 Etape 2 : TCTAGATGGGRGCAGACTTTCAYTGTTT= SEQ ID NO: 11
Les amorces utilisées pour les trois étapes de la 5'RACE sont illustrées par le Tableau I ci-après: TABLEAU 1
Exemple 2 : Test d'hybridation et de sélection des plantes résistantes aux potyvirus (résistance contrôlée par le locus pvr2/pvrl/pvr5) Extraction de l'ADN des plantes à analyser L'extraction de l'ADN des plantes (Solanacées, Cucurbitacées,
Crucifères et Composées) suit les protocole d'extraction standard basée sur le protocole de micro-extraction d'ADN de Fui ton et Tanksley, 1995 Digestion de l'ADN et séparation sur gel d'agarose
Le protocole suivi utilise 2,5U d'enzyme / μg d'ADN. Le volume enzymatique doit être inférieur à 10% du volume réactionnel. Le volume réactionnel est calculé en fonction de la taille du puits : il dépend du type de cuve et de peigne utilisés et du volume du gel (300ml en général). Le volume du tampon spécifique de l'enzyme et de spermidine doivent représenter chacun 10% du volume réactionnel :
- x μl ADN - IX tampon
- IX spermidine (4 mM)
- 2.5 U d'enzyme / μg d'ADN
- qsp H2O volume réactionnel
La digestion est réalisée à 37°C toute la nuit. En parallèle, sont préparés des échantillons de phages λ digérés par Hind III : 0,5μg / puits. Après digestion, la bonne digestion des ADN est vérifiée sur gel d'agarose 1%, TAE IX avec 1 μl de produit de digestion. Si la digestion est correcte, le tampon de charge est alors ajouté. Le tampon de charge doit représenter au minimum 10% du volume total (ou 20%). Le dépôt est alors effectué sur un gel de 300ml, NEB IX, 1% d'agarose contenant lOμl de BET. La migration se fait à 25V pendant 24h dans du tampon NEB IX (arrêt de la migration à 2 cm du bord du gel). Transfert sur membrane de nylon
Une membrane Hybond N+ et 1 papier Wattman à la taille du gel sont découpés. Dans une cuve plate contenant IL HC1 0,25N, le gel est mis à tremper 30 min. sous agitation (le bleu devient jaune). Pendant ce temps, le blotteur est préparé en :
- mouillant une feuille de papier Wattman dans du SSC 2X et en la plaçant sur la plaque poreuse du blotteur.
- puis en mouillant la membrane et en la plaçant sur le Wattman qui sera recouvert par le cache plastique.
Le gel est rincé dans une cuve contenant de l'H2O distillée, puis placé sur le cache du blotteur en évitant les bulles et en vérifiant l'étanchéité du système. Le blotteur est mis en route à 50 mb max. Un peu de soude 0,4N est versée sur le gel. Deux éponges imbibées de soude sont placées sur le gel qui sera recouvert de soude jusqu'à saturation.
Le transfert s'effectue en 2h à 3h. Les membranes sont rincées dans un bain de SSC 2X durant 10 à 15 min puis séchées à l'air libre et cuites 2h à 80°C. Préparation des sondes
La préparation des sondes par marquage PCR au 32P concerne des sondes de 3 kb maximum, amplifiées par PCR ou directement sur plasmides, permettant de révéler les bandes majeures pour une sonde, de concentration entre 1 et 5 ng/μl.
Les conditions de réaction sont résumées dans le tableau 2 ci-après TABLEAU 2
Concentration finale
H2O 25,6 μl
Tp Promega 10 X 4 μl IX
MgC12 Promega 2,4 μl
Mix (ATG 50 μM+dCTP 5μM)* 2 μl ATG 2,5μM , dCTP 0,25 μM
Taq 2U/μl 1 μl
Primer (5pM) 1 μl α32P-dCTP (lOOOCi/mmole, lOμCi/μl) 3 μl
ADN sonde 1 μl
Volume réactionnel final 40 μl
* : Mix (ATG 50μM+dCTP5μM) pour marquage des sondes RFLP par PCR. Dilution de dATP, dTTP, dGTP à 10 mM, à partir des solutions mères à lOOmM
- 5 μl dNTP à l00mM
- 45μl H2O
Dilution de dCTP à 1 mM, à partir de la solution mère à 100 M :
- 0,5μl dCTP à l00 mM
- 49,5 μl H2O Mix ATG + dCTP :
- 2,5 μl dATP à l0 mM concentration finale : 50μM
- 2,5 μl dTTP à l0 mM concentration finale : 50μM
- 2,5 μl dGTP à l0 mM concentration finale : 50μM - 2,5 μl dCTP à 1 mM concentration finale : 5μM
- 490 μl H2O
Le marquage des sondes se fait au cours de 30 cycles PCR de :
- 30 s à 94°C - 45 s à 52 °C
- 1 min 30 à 72 °C
Une fois marquées, les sondes sont ensuite dénaturées selon le protocole suivant : ajouter chaque sonde dans un tube contenant 160 μl de NaOH 0,8 N + 2 à 5 μl de Lambda marqué (par random priming) incuber 5 min
- neutraliser avec 200 μl de Tris HC1 IM Hybridation
Protocole d'après Church et Gilbert, (1984) a- Préhybridation à 65°C toute la nuit
On utilise 20 ml de tampon d'hybridation* par tube pour 2 à 6 demi blots. 25 ml de tampon au delà, sans dépasser 10 demi blots par tube. Les membranes sont humidifiées dans une boite contenant du tampon d'hybridation avant d'être légèrement égouttées puis roulées (toutes ensemble) et mises dans le tube. Vérifier pendant la préhybridation que les tubes sont étanches et que les membranes se déroulent bien, sinon les changer de sens.
Composition du tampon de pré-hybridation et d'hybridation : Pour 500 mL : 21,91 g NaCl; 18,38 g Na Citrate; 380 mL H2O; 15 mL SDS 20%; 25 mL NaPO4 IM pH 7,5; 25 mL Denhardt 100X; 5 mL EDTA 0,25M; 50 mL Dextran sulfate 50%. b- Hybridation à 65°C au moins 16 heures
On laisse décroître la température des tubes avant de les ouvrir pour éviter de mouiller le pas de vis. On ajoute la sonde dénaturée (5 min dans NaOH 0,8 M puis arrêt de la dénaturation Tris-HCl IM). Dans ces conditions, l'hybridation peut durer 48 ou 72 heures. c- Lavages
Les boites (ou bacs) sont lavées dans un large excès de tampon (1% SDS (Serva) 40mM NaPi préchauffé à 65°C. Pour environ 5-10 demi membranes :
- 1 lavage de 20 min. à 65 °C sous agitation. Pour laver, transférer membrane par membrane dans un nouveau bac contenant le tampon préchauffé. Les tampons de lavage radioactifs (au moins les 2 premiers) sont versés dans un bidon prévu à cet effet. - 1 rinçage de 2-3 min. dans un tampon neuf chauffé à 65°C. d- Exposition Les membranes sont essorées sur un lit de papier absorbant constitué d'un champ de papier bleu recouvert de papier blanc type rouleau de Tork ; elles ne doivent pas sécher. Elles sont ensuite mises dans des pochettes plastiques pour l'exposition, placées dans une cassette avec 1 écran intensificateur.
Selon le signal mesuré au compteur Geiger, elles sont exposées à -80°C de une nuit à quelques jours. e- Déshybridation des membranes avant réhybridation
Les membranes sont déshybridées dans une solution 0,1 % SDS 1 mM EDTA chauffée à 80°C (1 litre pour 40 demi -membranes) pendant 20 min à température ambiante. Les membranes sont ensuite rincées 10 min. dans une solution 2X SSC. Enfin, les membranes sont essorées puis stockées humides dans des pochettes en plastique à 4°C. Exemple 3 : Corrélation entre la résistance aux potyvirus et eIF4E
Le matériel viral employé dans ces tests d'infection sont les isolats N- 605 du PVY obtenus à partir de Solanum tuberosum (Jakab et al., 1997), ou PVY-LYE84, ou PVY-LYE240r pour la tomate (Légnani et al., 1995) et les isolats PVY-To72, PVY- Si 15 pour le piment (Dogimont et al., 1996) ainsi que l'isolât CAA- 10 du TEV (Légnani et al, 1996). Le même protocole est utilisé pour tous les autres isolats de PVY et de TEV qui sont contrôlés par les locus pvr2/pvrl/pvr5 et/ou pot-1. Les isolats sont maintenus selon la procédure Bos (Bos, 1969) et multipliés sur des plants de Nicotiana tabacum cv. Xanthii avant inoculation des plantes de tomate ou de piment au stade cotylédons à deux feuilles étalées. L'inoculum viral est préparé comme décrit dans les articles de Légnani et al. (1995, 1996) et de Dogimont et al. (1996). Les cotylédons et les deux premières feuilles des plantes sont inoculés mécaniquement. Les lignées sont évaluées sous conditions contrôlées en chambre de culture (14 heures de jour, 18°C nuit et 24°C jour) pour suivre leur réaction après inoculation. 4 semaines après inoculation, toutes les plantes sont évaluées individuellement pour la présence ou l'absence de l'antigène de capside du PVY ou du TEV par test ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) comme décrit par Légnani et al, (1995, 1996) et Dogimont et al. (1996). D'autres protocoles parfaitement connus de l'homme du métier peuvent également être utilisés pour l'inoculation mécanique de potyvirus aux plantes. Le gel présenté en Figure 1 annexée montre la différence de profils observée entre le marqueur eIF4E et la résistance aux potyvirus contrôlée par le locus pvr2. Cette co-ségrégation complète entre la résistance aux potyvirus et une copie du gène eIF4E a été observée sur une descendance en ségrégation de plus de 500 plantes.
L'ADN génomique de piment est digéré par l'enzyme EcoRI et hybride avec le cDNA eIF4E de tabac - SEQ ID NO: 2 - (les mêmes profils RFLP sont obtenus par hybridation avec le cDNA de tomate ou le cDNA de piment).
Les plantes sensibles (S) possèdent le fragment de restriction à 7 kb "bas" alors que les plantes résistantes (R) possèdent les fragments de restriction à 7 kb "haut". Les plantes hétérozygotes (Ht) présentent les deux fragment de restriction et sont sensibles (car gène récessif). Exemple 4 :Mise en évidence de mutations de eIF4E associées à la résistance aux potyvirus
1) Mise en évidence de sites de restriction différentiels entre les copies de d'un génotype de piment sensible aux potyvirus et d'un génotype résistant.
Par les techniques de séquençage classique, des mutations ponctuelles entre le gène eIF4E de la variété de piment "Yolo Wonder" (sensible au potyvirus et porteuse de l'allèle pvr2+) et celui de la variété de piment "Yolo Y" (résistant aux potyvirus et porteur de l'allèle pvr2') ont été mises en évidence. Ainsi, en position 200, la séquence SEQ ID NO: 6 codante du eIF4E dans Yolo Wonder présente un T tandis que la séquence SEQ ID NO: 8 codante du eIF4E dans Yolo Y présente un A. De la même façon en position 236, la séquence codante de Yolo Wonder présente un T tandis que la séquence codante de Yolo Y présente un G.
La première mutation ponctuelle correspond à un site de restriction
TspRI (ou ses isoschizomères) existant uniquement chez Yolo Wonder. Ce site de restriction différentiel a été validé par PCR sur le cDNA de Yolo Wonder et Yolo Y: définition d'amorces en 5' et en 3' du cDNA et digestion de l'amplifiât PCR par l'enzyme
TspRI .
(Même protocole que ci-dessous pour l'enzyme Mvnl sauf que la digestion se fait à 70°C pour cette enzyme).
La seconde mutation ponctuelle correspond à un site de restriction Mvnl (ou ses isoschizomères) existant uniquement chez Yolo Y. Ce site de restriction différentiel a été validé par PCR sur le cDNA de Yolo Wonder et Yolo Y: définition d'amorces en 5' et en 3' du cDNA et digestion de l'amplifiât PCR par l'enzyme Mvnl. Réaction de PCR sur le cDNA :
Amorce sens : AAA AGC ACA CAG CAC CAA CA = SEQ ID NO: 18 Amorce antisens : TAT TCC GAC ATT GCA TCA AGA A = SEQ ID NO: 19
Les conditions de réaction sont illustrées par le tableau 3 ci-après. TABLEAU 3
Digestion par l'enzyme Mvnl : 8 μl de produit PCR + 2 U d'enzyme + 1,3 μl de tampon de l'enzyme + 13,5 μl H2O 2h à 37°C. Migration sur gel d'agarose 1,2% TAE IX. Le gel présenté en Figure 2 annexée montre les amplifications PCR du gène eIF4E impliqué dans la résistance aux potyvirus chez le piment et met en évidence un site de restriction Mvnl différentiel entre sensible et résistant. Bande 1 :
• amplifiât PCR du gène eIF4E du piment Yolo Wonder sensible (S) au potyvirus - allèle pvr2+ -
• et absence de digestion enzymatique par Mvnl. Bande 2 :
• amplifiât PCR du gène eIF4E du piment Yolo Y résistant (R) au potyvirus - allèle pvr2' » et mise en évidence du site de restriction Mvnl. Bande 3 :
• Marqueur de taille 1 kb ladder.
2) Mise en évidence de mutations de eIF4E associées à la résistance aux potyvirus.
Le séquençage du gène eIF4E de différentes variétés de piment sensibles ou résistantes aux potyvirus a fait apparaître des mutations, associées à la résistance aux potyvirus, dans la même région de eIF4E.
L'alignement de la séquence protéique de eIF4E de ces différentes variétés est représenté sur la Figure 3.
Légende de la figure 3 : YW = Yolo Wonder S / pvr2+
DDL = Doux Long des Landes S / pvr2+
PMI 008 = Résistant au PVY(0)
YY = Yolo Y / pvr2'
Avelar = allèle pvr2* Vania = allèle pvr2!
PM994 = Résistant au PVY(0)
Florida VR2 = Florida / pvr22 C69 = lignée HD issue de l'hybride FI entre CM334 et Yolo Wonder / pvr5
CM334 = Criollo de Morelos 334 / pvr5
PMI 014 = Résistant au PVY(0)
Per = Perennial / résistance partielle (QTL) au locus pvr2
Souligné gras = mutation commune à tous les résistant sauf PMI 008
Surligné gris = mutation spécifique à l'allèle pvr2*
Gras non souligné = mutation spécifique à l'allèle pvr2
Souligné non gras = mutation spécifique à l'allèle pvr5
Surligné noir = mutation spécifique au génotype PMI 008.
Ces différents variants sont également représentés dans la séquence SEQ ID NO: 22
Exemple 5 : Mise en évidence de la syntenie entre piment et tomate pour les gènes récessifs de résistance aux potyvirus (gène pot-1 chez la tomate et locus pvr2 chez le piment)
Cinq gènes majeurs et plusieurs QTL impliqués dans la résistance aux potyvirus sont cartographiés sur le génome du piment. Grâce à l'utilisation de sondes RFLP communes pour cartographier le génome et grâce à la forte conservation de l'ordre des marqueurs entre le génome de la tomate et celui du piment, les facteurs de résistance aux potyvirus du piment sont placés sur la carte de la tomate. La localisation des loci de résistance aux potyvirus du piment sur les chromosomes de tomate ainsi que celle des marqueurs RFLP liés est récapitulée dans le tableau 4 avec les références d'origine. Dans l'objectif d'établir précisément la correspondance entre les régions génomiques du piment et de la tomate avec les gènes de résistance aux potyvirus, les marqueurs RFLP TG135 et Cab3 sont ajoutés à la carte pré-existante de liaison génétique du piment (Lefebvre et al, soumis).
a seul le spectre général de résistance est indiqué pour chaque gène, certains de ces gènes de résistance peuvent être détournés par des souches virulentes. b les marqueurs RFLP sont obtenus en utilisant au hasard d'ADN génomique de tomate
(TG) ou des sondes ADNc d'épidémie de feuille de tomate (CD and CT) . c nd = non déterminé a- Marquage AFLP et RFLP du gène pot-1 L'ADN total est extrait à partir d'environ 1 g de feuilles fraîches de plantes F2 (Caranta et al, 1997).
Les échantillons d'ADN de 6 plantes F2 (issues de l'autofécondation de l'hybride FI entre Lycopersicon esculentum Mospomorist et L. hirsutum PI247087) (pot- l+/pot-l+) ayant généré des familles F3 complètement sensibles au PVY souche N 605 et les échantillons d'ADN de 9 plantes F2 ayant généré des familles F3 complètement résistantes au potyvirus sont groupés pour une analyse ségrégeante en masse (bulked segregeant analysis) et pour un étiquetage AFLP de pot- 1.
Les marqueurs AFLP sont générés selon le protocole de Vos et al. (1995) avec les enzymes de restrictions EcoRl, HindIII, et Msel. La première amplification est réalisée en utilisant une combinaison d'amorces avec un seul nucléotide sélectif et une seconde combinaison avec 3 nucléotides sélectifs.
Les marqueurs AFLP liés à pot-1 sont cartographiés sur les lignées d'introgression de L. hirsutum dans L. esculentum (Montforte and Tanksley, 2001) afin d'assigner pot-1 à un chromosome de la tomate. L'assignation est validée par la cartographie de marqueurs RFLP localisés sur le chromosome cible. La procédure RFLP est décrite par Saliba-Colombani et al. (2000). Le criblage du polymorphisme entre Lycopersicon esculentum Mospomorist (sensible aux potyvirus) et L. hirsutum PI247087 (résistant aux potyvirus) est réalisé avec 3 enzymes de restrictions (EcoRI, HindIII et Xbal) et des marqueurs RFLP préalablement cartographiés chez la tomate (CT, ADNc de tomate dérivé de l'ARNm de tissu épidermique de tomate, TG, clones d'ADN génomique de tomate ; la sonde CAB3 codant pour un polypeptide lié à la chlorophylle a et b, Tanksley et al ., 1992) Ce criblage permet de cartographier des marqueurs supplémentaires sur le chromosome 3.
L'analyse de ségrégation pour les marqueurs moléculaires (AFLP, RFLP) et pour les données de résistance sont analysés par le logiciel Mapmaker/Exp v. 3.0 avec un Lod minimum de 4.0 et un pourcentage de recombinaison maximum de 0,3. Le pourcentage de recombinaison est alors converti en distance de cartographie en centiMorgans (cM) en utilisant la fonction de cartographie Kosambi (Kosambi, 1944).
Ces résultats ont permis de localiser le gène pot-1 de résistance au PVY chez la tomate sur le chromosome 3 et de montrer que ce gène est encadré par les mêmes marqueurs RFLP que le locus pvr2 chez le piment. b- Cartographie de eIF4E chez la tomate
En parallèle, le cDNA eIF4E de tomate a été cartographie par la méthode RFLP décrite précédemment sur les lignées d'introgression de L. pennellii dans L. esculentum (Eshed and Zamir, 1995). Ce travail a permis de localiser 5 copies du gène eIF4E chez la tomate. Une de ces copies a été localisée sur le chromosome 3, dans la même région génomique que le gène pot-1 confirmant ainsi la syntenie entre piment et tomate pour la résistance aux potyvirus et par conséquent la possibilité d'utiliser eIF4E comme marqueurs et outils de sélection de la résistance.
Cette mise en évidence de syntenie entre le piment et la tomate pour les gènes récessifs de résistance aux potyvirus permet de dire que si eIF4E est le gène de résistance chez le piment, alors eIF4E est également le gène de résistance chez la tomate. c-Clonage d'un gène eIF4E de tomate associé à la résistance aux potyvirus.
Selon la méthode 3' et 5' RACE PCR décrite dans l'exemple 1, l'ADNc d'un gène eIF4E de tomate similaire à celui isolé chez le piment a été isolé et clone chez la tomate ; ce gène a été dénommé eIF4E-2.
La séquence codante de ce gène (variété 'Mospomorist' de . Esculentum, sensible au PVY et au TEV) est représentée dans la liste de séquences sous le numéro
SEQ ID NO: 2.
Par des techniques de séquençage classique, des mutations ponctuelles entre le gène eIF4E-2 des génotypes de tomate L. esculentum 'Mospomorist' et L. hirsutum
PI134417 (sensibles aux PVY et au TEV) et celui du génotype L. hirsutum PI247087
(résistant au PVY et au TEV, résistance contrôlée par le gène récessif pot-1) ont été mises en évidence.
L'alignement de séquences est représenté sur la Figure 4. Légende : Mospo=Mospomorist; PI13=PI134417; PI24=PI247087
En gras et souligné : mutation observée seulement chez PI247087 ; En gras non souligné : mutation interspécifique entre L. esculentum et L. hirsutum.
La protéine eIF4E de L. hirsutum PI 134417 et celle de L. hirsutum PI247087 sont également représentées par la séquence SEQ ID NO: 23 Exemple 6 : Criblage de la banque BAC du génome du piment avec des amorces définies sur la séquence codante eIF4E du génotype Yolo Wonder, démonstration de la co-ségrégation avec la résistance et détermination de la structure génomique du gène eIF4E qui co-ségrège avecpvr2.
Une banque BAC de piment a été construite à partir d'une lignée haploïde doublée HD208 issue de l'hybride FI d'un croisement entre Capsicum annuum
Yolo Wonder et C. annuum Perennial. HD208 contient l'allèle dominant de sensibilité pvr2+. L'ADN de haut poids moléculaire a été extrait selon la méthode décrite dans http://www.ncgr.org/research/jag/papers00/paper300/indexpage300.html. L'ADN a ensuite été digéré partiellement et séparément par trois enzymes de restriction (EcoRI,
BamHI et HindIII) afin d'augmenter la représentativité de l'ensemble du génome. L'ADN digéré a été clone dans le vecteur pCUGIB AC 1.
La banque BAC de piment est constituée de 239 232 clones avec une taille moyenne d'insert de 125kb ce qui correspond à une représentativité théorique de 10 équivalents génome (taille du génome du piment 3000 Mpb). Cette banque BAC a été organisée en 623 pools d'ADN en vue d'un criblage par PCR (1 pool correspond au mélange d'ADN de 384 clones).
Les amorces suivantes ont été définies sur la séquence codante de eIF4E de Yolo Wonder :
- Piml : 5' AGA CTT TCA TTG TTT CAA GCA TAA 3' = SEQ ID NO: 20
- Pim4 : 5 ' GAT TAG AAA GTG CAA ACA CCA ATA C 3 ' = SEQ ID NO: 21 Ce couple d'amorces amplifie sur le cDNA une bande de 493 pb et sur l'ADN génomique de HD208 une bande de 1800 pb. Ce couple d'amorces a été utilisé pour cribler la banque BAC de piment. Quatre clones BAC ont été identifiés portant la bande de 1800 pb (Clones 27-BI, 5-2H, 111-4H et 184-4H).
Ces quatre clones BAC ont été digérés par EcoRI et les profils de restriction montrent qu'ils sont chevauchants et correspondent donc bien à un même locus.
Tous les clones BAC révèlent une bande EcoRI de 7 kb qui a été clonée dans un vecteur pGEM3Zf. Cette bande de 7kb, obtenue par digestion EcoRI correspond à celle qui co- ségrège avec la sensibilité aux potyvirus (voir exemple 3)
(1 = clone 27-BI ; 2 =clone 5-2H ; 3 = clone 1 1 1-4H ; 4 = clone 184-4H) La présence de l'amplifiât de 1800 pb dans ce fragment de 7 kb confirme que ces quatre clones BAC portent le gène eIF4E correspondant au cDNA clone.
Le séquençage de cet insert de 7 kb a permis de définir la taille du gène qui est de 5500 pb et de définir la structure exon/intron : 5 exons et 4 introns.
Exemple 7 : Expérience d'expression transitoire du cDNA eIF4E de Yolo Wonder dans un génotype de piment résistant (porteur de l'allèle pvr21) pour validation du rôle de eIF4E dans la sensibilité aux Potyvirus.
Afin de valider l'hypothèse que l'allèle de sensibilité pvr2+ correspond au gène eIF4E de Yolo Wonder, des expériences d'expression transitoire du cDNA eIF4E de Yolo Wonder via un vecteur viral PVX (Potato Virus X) (Chapman et al., 1992) sont réalisées sur un génotype résistant Yolo Y, porteur de l'allèle pvr2'.
Le cDNA eIF4E issu du génotype sensible Yolo Wonder est clone de manière orientée dans un vecteur d'expression PVX-CES-35S au site de clonage Clal et
Sali. Le génotype résistant (porteur de l'allèle pvr2!) Yolo Y est co-inoculé avec ce plasmide recombinant et avec le pathotype 0 du Potato Virus Y (PVY). L'expression transitoire du gène eIF4E issu du génotype sensible Yolo Wonder via le vecteur PVX recombinant permet au PVY de se multiplier dans le génotype résistant. Le PVY est détecté par la méthode ELISA ou RT-PCR (Legnani et al., 1995, 1996, Dogimont ét al., 1996).
Les deux génotypes de C. annuum Yolo Wonder et Yolo Y ayant reçu le plasmide recombinant sont sensibles au PVY : on détecte le virus par ELISA et RT-PCR sur feuilles inoculées et feuilles systémiques 10 jours après inoculation. De la même manière, des allèles eIF4E issus de Yolo Wonder et Yolo Y, qui sont tous les deux sensibles aux TEV (Tobacco etch virus), ont été exprimés chez un génotype de piment résistant au TEV : Florida VR2. On observe que cette expression permet la multiplication du TEV (détectée par ELISA et RT-PCR) chez ce géniteur résistant. Le cDNA eIF4E-2 de tomate obtenu à partir de la variété Mospomorist
(portant l'allèle de sensibilité SEQ ID NO: 4) a également été exprimé selon le même protocole dans le génotype de piment résistant Yolo Y.
On observe également la restauration de la sensibilité au PVY des piments Yolo Y exprimant le cDNA eIF4E-2 de tomate. Ces résultats confirment l'implication de eIF4E dans la sensibilité à différents potyvirus, et montre en outre que ce système fonctionne en hétérologue (gène de la tomate qui fonctionne chez le piment).
Exemple 8 : Recherche de mutants dans le gène eIF4E et dans les gènes du complexe d'initiation de la traduction des ARN pour la création de plantes résistantes aux potyvirus.
Les membres de la famille multi-génique eIF4E appartiennent à un complexe d'au moins 8 protéines formant le complexe d'initiation de la traduction dans les cellules eucaryotes (Browning 1996).
L'identification et la caractérisation de mutants dans eIF4E et dans les autres gènes du complexe d'initiation de la traduction pour la création de plantes résistantes aux potyvirus se déroule en 4 étapes et utilise un système de TILLING (Targeting Induced Local Lésions IN Génomes, McCallum et al., 2000) :
(1) Génération d'une collection de mutants de tomate par mutagénèse chimique. Le génotype choisi est une microtomate, Lycopersicon esculentum Microtom qui présente des caractéristiques biologiques intéressantes (Meissner et al., 2000) : sensible aux potyvirus (PVY, TEV et PVMV), croissance à haute densité (1000 plantes/m2) et temps de génération de 3-4 mois. Les mutations sont obtenues par mutagénèse chimique à l'éthyl-méthyl sulfonate (EMS) (Koornneef et al., 1982) : mutagénèse sur 30 000 graines, semis des mutants et fabrication de la génération M2 à partir de 5000 plantes Ml .
(2) Extraction d'ADN de 20 plantes par famille M2 et constitution de pools d'ADN en 3 dimensions à partir d'une population de 100 000 plantes M2 (5000 familles).
(3) Amplification par PCR des gènes cibles et recherche des mutations par HPLC dénaturante. Les séquences des gènes impliqués dans le complexe d'initiation de la traduction sont disponibles sur le site http:/www.tigr.org/tdb/lgi. Les produits PCR sont ensuite dénaturés puis appariés pour permettre la formation dtiétéroduplexes. Les mutations sont ensuite détectées soit par HPLC dénaturante (McCallum et al., 2000) soit par une enzyme qui permet la détection des "mismatch" dans les hétéroduplex (enzyme CEL1, Oleykowski et al., 1998).
(4) Caractérisation des mutants pour évaluation de leur comportement vis-à-vis des potyvirus : passage d'un phénotype sensible à un phénotype résistant. La procédure d'inoculation et de détection des potyvirus (Potato virus Y, Tobacco etch virus, Pepper veinai mottle virus) est identique à celle décrite dans l'exemple 3. Exemple 9 : Création de plantes résistantes aux potyvirus par des méthodes pouvant impliquer la transgenèse. Alternativement à l'exemple 8, l'allèle de résistance du gène eIF4E
(identifié ici chez le piment) ou tout autre allèle de eIF4E qui confère la résistance aux potyvirus (identifié à la base des exemples 1 à 8) peut être transféré in planta par des méthodes de type mutagénèse dirigée (Hohn et al., 1999), recombinaison homologue (Kempin et al., 1997) ou par des méthodes de surexpression. Dans les expériences de surexpression, l'allèle d'eIF4E qui confère la résistance est exprimé sous un promoteur fort de type 35S du virus CaMV par transgenèse in planta (Jones et al., 1992; Bevan 1984).
Des plantes résistance peuvent également être crées par knock-out du gène eIF4E endogène par des méthodes de type "gène silencing" (Post Transcriptionnal Gène Silencing) et l'expression simultanées par transgenèse de la forme de eIF4E conférant la résistance aux potyvirus. Un knock-out spécifique par PTGS peut-être réalisé en le digérant contre le 5' UTR du gène eIF4E endogène; la forme d'eIF4E qui confère la résistance exprimée par transgenèse ne portera pas la séquence 5' UTR du eIF4E endogène. Cette spécificité du knock-out par PTGS contre les 5' UTR est basée sur les nouvelles données issues de la compréhension du mécanisme de PTGS (Nishikura 2001). Bibliographie
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Claims

REVENDICATIONS
1) Procédé de sélection de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans les plantes à tester :
- de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E (dénommée ci- après : « protéine eIF4E de type sauvage ») comprenant une région définie par la séquence
(I) ci-après
DXιX2X3X4KSX5QX6A GS SX7RX8X9YTFSX1oVEX11F Xι2X13YNN IHXi4 PSKL X15Xι6GAD dans laquelle : - Xi, X2, X3, X4, Xό, X7, Xs, X9, X10, X12, Xn, X15, et X16 représentent chacun un acide aminé neutre ;
- X5 et Xι4 représentent un acide aminé basique ;
- Xn représente un acide aminé acide ;
- D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, et L ont leur signification usuelle en code 1 -lettre, ou d'une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine ;
- de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E mutante comprenant une région dérivée de celle définie par la séquence (I), par substitution d'au moins un acide aminé neutre de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé, et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée, ou d'une séquence codant pour ladite protéine ;
- et la sélection des plantes où l'on détecte une protéine eIF4E mutante ou une séquence nucléotidique codant pour ladite protéine, et où l'on ne détecte pas de protéine eIF4E de type sauvage ou de séquence codant pour ladite protéine.
2) Procédé de sélection de plantes utilisables pour l'obtention de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce qu'il comprend la détection dans les plantes à tester de la présence ou de l'absence d'une protéine eIF4E mutante telle que définie dans la revendication 1, ou d'une séquence codant pour ladite protéine, et la sélection des plantes où l'on détecte ladite protéine eIF4E mutante ou une séquence codant pour ladite protéine.
3) Procédé selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite protéine eIF4E mutante comprend une région dérivée de celle définie par la séquence (I), par : a) substitution d'au moins un des acides aminés Xi, X2> X3 ou X4ι de ladite séquence
(I) par un acide aminé chargé, et b) substitution d'au moins un des autres acides aminés neutres de ladite séquence (I) par un acide aminé chargé et/ou substitution d'au moins un acide aminé chargé de ladite séquence (I) par un acide aminé neutre ou un acide aminé de charge opposée.
4) Utilisation d'un outil de sélection choisi parmi : a) un polynucléotide codant pour une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, telles que définies dans une quelconque des revendications 1 ou 3 ; b) un polynucléotide complémentaire du polynucléotide a) ; c) un fragment d'au moins 10 pb d'un polynucléotide a) ou b) ; pour la sélection de plantes résistantes aux potyvirus.
5) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que les plantes sélectionnées font partie du groupe des solanacées, du groupe des crucifères, du groupe des composées et/ou du groupe des cucurbitacées.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que les plantes sélectionnées sont des solanacées.
7) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ladite protéine eIF4E est choisie parmi :
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 3
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 5
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 7 la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 9 - le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO:
22 ;
- le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 23 ;
8) Utilisation selon la revendication 4, caractérisée en ce que ledit polynucléotide est choisi parmi :
- le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 2
- le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 4
- le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 6
- le polynucléotide de séquence SEQ ID NO: 8 ainsi que leurs complémentaires, ou les fragments d'au moins 10 pb desdits polynucléotides ou complémentaires.
9) Procédé de sélection de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce que :
- on digère l'ADN extrait d'une plante à tester par une enzyme de restriction appropriée ;
- on dénature l'ADN digéré ;
- on met ledit ADN dénaturé en présence d'une sonde constituée par un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 4 à 8, préalablement pourvu d'au moins un marqueur, de façon à réaliser l'hybridation entre ledit polynucléotide et ledit ADN ;
- on élimine l'ADN et la sonde non hybrides ;
- on révèle l'hybridation à l'aide du marqueur ; - on sélectionne les plantes qui possèdent un profil d'hybridation correspondant à la co-ségrégation de la cible hybridée avec la sonde marquée et de l'allèle de résistance ou de sensibilité, la distinction entre les plantes sensibles et les plantes résistantes se faisant par la différence de taille des fragments hybrides.
10) Procédé selon la revendication 9, caractérisé en ce que l'enzyme de restriction utilisée est EcoRI.
1 1) Procédé de sélection de plantes résistantes aux potyvirus, caractérisé en ce que :
- on amplifie par PCR la séquence codante du gène eIF4E, à partir de l'ADN de la plante à tester ; - on digère le produit d'amplification avec une enzyme de restriction appropriée ;
- on sépare les éventuels fragments obtenus ;
- et on sélectionne les plantes résistantes ou sensibles selon le profil de restriction dudit produit d'amplification.
12) Procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce que les plantes sensibles aux potyvirus sont détectées par un profil de restriction faisant apparaître la présence d'un site de coupure par l'enzyme TspRI ou l'un de ses isoschizomères et les plantes résistantes aux potyvirus sont détectées par un profil de restriction faisant apparaître l'absence dudit site de coupure par TspRI ou l'un de ses isoschizomères et la présence d'un site de coupure par l'enzyme Mvnl ou l'un de ses isoschizomères. 13) Procédé selon une quelconque des revendications 1 1 ou 12, caractérisé en ce que l'amplification par PCR de la séquence codante du gène eIF4E, est effectuée en utilisant comme amorces les oligonucléotides SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19.
14) Polynucléotide codant pour une protéine eIF4E mutante telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 3.
15) Polynucléotide selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est représenté par la séquence SEQ ID NO: 8
16) Polynucléotide utilisable comme amorce pour l'amplification par PCR d'une séquence codant pour une protéine eIF4E de plante, caractérisé en ce qu'il est choisi dans le groupe défini par les séquences suivantes :
- SEQ ID NO: 18
- SEQ ID NO: 19. 17) Kit pour la mise en œuvre d'un procédé selon la revendication 11, caractérisé en ce qu'il comprend :
- au moins une enzyme de restriction choisie parmi : a) une enzyme reconnaissant un site de restriction I présent dans au moins un allèle de eIF4E associé à la sensibilité aux potyvirus, et absent des allèles de eIF4E associés à la résistance aux potyvirus ; b) une enzyme reconnaissant un site de restriction II présent dans au moins un allèle de eIF4E associé à la résistance aux potyvirus, et absent des allèles de eIF4E associés à la sensibilité aux potyvirus ; et - une paire d'amorces nucléotidiques permettant d'amplifier eIF4E ou une portion de celui-ci comprenant le site de restriction I et/ou le site de restriction II.
18) Kit selon la revendication 17, caractérisé en ce qu'il comprend :
- une paire d'amorces définies par les séquences SEQ ID NO: 18 et SEQ ID NO: 19 ; - au moins une enzyme de restriction choisie parmi TspRI ou l'un de ses isoschizomères et Mvnl ou l'un de ses isoschizomères.
19) Utilisation d'un site de restriction par Mvnl correspondant de préférence à la séquence sens : CGΛCG et à la séquence antisens : GCΛGC, et/ou d'un site de restriction par TspRI correspondant de préférence à la séquence sens: NNCASTGNNΛ et à la séquence antisens : ΛNNGTSACNN, comme marqueur(s) oligonucléotidique(s) de résistance ou de sensibilité aux potyvirus.
20) Utilisation d'une protéine eIF4E de type sauvage ou mutante, telles que définies dans une quelconque des revendications 1 ou 3 , ou d'un anticorps spécifique d'une desdites protéines, pour la sélection de plantes résistantes aux potyvirus. 21) Utilisation selon la revendication 20, caractérisée en ce que ladite protéine eIF4E est choisie parmi :
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 3 ;
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 5 ;
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 7 ; - la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 9 ;
- le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 22 ; le groupe de protéines représenté par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 23 ; 22) Protéine eIF4E mutante telle que définie dans une quelconque des revendications 1 ou 3.
23) Protéine eIF4E mutante selon la revendication 22 choisie parmi :
- la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 9 ; - les variants de la protéine représentée par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 22 ;
- le groupe de la protéine représentée d par la séquence polypeptidique SEQ ID NO: 23 ; 24) Anticorps spécifiquement dirigés contre une protéine eIF4E mutante selon une quelconque des revendications 1 ou 3, ou un fragment d'au moins 6 acides aminés dudit polypeptide.
25) Procédé non biologique d'obtention de plantes résistantes à au moins un potyvirus caractérisé en ce qu'il comprend l'introduction d'un allèle du gène eIF4E associé à la résistance audit potyvirus dans le génome desdites plantes.
26) Procédé selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'apparition de l'allèle de résistance est provoquée par la mise en oeuvre d'une méthode sélectionnée dans le groupe comprenant :
- mutagénèse, avantageusement "Tilling", - recombinaison homologue,
- surexpression,
- insertion/délétion,
- "gène silencing" / transgenèse,
- et leurs combinaisons. 27) Unité génétique construite, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un polynucléotide tel que défini dans une quelconque des revendications 4 à 6, 8.
28) Vecteur de transformation de cellules végétales, caractérisé en ce qu'il comporte au moins une unité génétique selon la revendication 27.
29) Cellules végétales transformées au moyen d'au moins un vecteur selon la revendication 28 ou d'au moins une unité génétique selon la revendication 27.
30) Microorganismes transformés au moyen d'au moins un vecteur selon la revendication 28 ou d'au moins une unité génétique selon la revendication 27.
31) Plantes transformées au moyen d'au moins un vecteur selon la revendication 28 ou d'au moins une unité génétique selon la revendication 27.
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