MXPA04007718A - Mutaciones del gen eif4e y resisntencia a los potyvirus. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para la obtencion de plantas resistentes a los potyvirus que presentan una o varias mutaciones en una region conservada del factor de traduccion elF4E, definida por la siguiente secuencia general (1):DX1X2X3X4KSX5QX6AWGSSX7RX8 X9YTFSX10VEX11FWX12X13YNNIHX14PSKLX15X16GADen la que:* -X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 X10 X11 X12 X13 X14 X15 y X16 representan cada uno un aminoacido neutro;-X5 y X14 representan un aminoacido basico;-X11 representa un aminoacido acido;D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, y L Tienen su significado habitual en el codigo de 1-letra.

Description

MUTACIONES DEL GEN EIF4E Y RESISTENCIA A LOS POTYVIRUS La presente invención se refiere a un procedimiento de selección o de obtención de plantas resistentes a los potyvirus. El procedimiento se puede aplicar en particular a las plantas de la familia de las solanáceas, cucurbitáceas, cruciferas y compuestas. La invención también incluye las secuencias que permiten conferir la resistencia a los potyvirus y/o marcar los genes de resistencia o de sensibilidad a estos potyvirus. El grupo de los potyvirus, cuyo miembro más conocido es el virus Y de la patata o PVY por Potato Virus Y, es el grupo de virus vegetales más importante. En efecto, actualmente se sabe que los potyvirus son capaces de infectar a más de 30 familias de plantas. Este grupo incluye al menos 180 miembros, lo que corresponde a un tercio de los virus de plantas que se conocen en la actualidad. La transmisión de. los potyvirus la realizan los pulgones (por ejemplo, Myzus persicae) según el modo no persistente. Los síntomas causados por los potyvirus son: anomalías en la coloración de las hojas (mosaicos, aclaramiento de las nervaduras), deformaciones de las hojas, necrosis de los nervios que puede conducir a la necrosis de toda la planta, e importante reducción del tamaño de la planta enferma, lo que influye mucho en la productividad. Las solanáceas, cucurbitáceas, cruciferas y compuestas son plantas especialmente sensibles a los potyvirus. Las solanáceas, y en particular el tomate y el pimiento (o pimiento morrón), se infectan por al menos siete potyvirus distintos en todo el mundo: el virus Y de la patata (PVY) está presente en todo el conjunto de las zonas de cultivo mientras que los otros quedan limitados a un continente (Tobacco Etch virus, Pepper Mottle Virus y Perou Tomato Virus en el continente americano, Pepper Veinal Mottle Virus y Potyvirus E en África, y Chili Veinal Mottle Virus en Asia). No obstante, esta delimitación no es absoluta y se han identificado varios potyvirus fuera de su zona de origen. En Francia, y de forma más general en la cuenca mediterránea, el potyvirus que predomina es el PVY. Las epidemias de PVY, que aparecieron en los años 70, sé han desarrollado en cultivos al aire libre y, posteriormente, en cultivos en invernaderos donde se han observado , desde 1 982, nuevos aislados de PVY que causan síntomas de necrosis especialmente grayes en el tomate (Gebre-Selassie et al., 1987). En algunos de estos potyvirus, se puede clasificar los aislados según su capacidad para eludir alelos de resistencia. Es el caso del PVY respecto al gen pvr2 en el pimiento, único gen de resistencia utilizado desde hace tiempo por los seleccionadores pero evitados en las zonas del área mediterránea y en las zonas tropicales. A pesar del predominio del PVY en Francia, la internacionalización del 1 mercado de la semilla hace que los seleccionadores que venden sus semillas en el extranjero deban utilizar genes que controlen la resistencia a jos diferentes tipos de potyvirus. De forma más general , considerando la importancia económica de las infecciones por potyvirus y la ausencia de medios directos de lucha contra este tipo de infección, el estudio de variedades vegetales resistentes constituye uno de los ejes principales para la mejora de las plantas.

Los potyvirus tienen una estructura filamentosa sin envuelta (Langenberg et Zhang, 1 997) de 680 a 900 nm de largo y de 1 1 a 15 nm de ancho (Dougherty et Carrington, 1988; Riechmann et al., 1992). El genoma vírico está compuesto por un ARN de hebra simple con una longitud aproximada de 10 kb. El ARN de hebra simple presenta en su extremo 3' una cola poly A y en 5' se une a una proteína vírica denominada VPg (Murphy et ai, 1990, Takahashi et al., 1997). El ARN vírico codifica para 10 proteínas implicadas en la diferenciación de las poliproteínas, la replicación del genoma, el movimiento célula a célula y el movimiento a larga distancia, la transmisión por pulgones, etc. La lucha contra los virus sólo se puede realizar indirectamente. En efecto, sólo se puede eliminar el vector de la enfermedad (en este caso, los pulgones) o cultivar variedades resistentes a la infección vírica y/o a los vectores. Frente a una agresión por un patógeno (virus, bacterias, hongos o nematodos), la planta posee diferentes estrategias para defenderse o resistir a la infección. Entre las estrategias de defensa, la planta puede utilizar: sistemas de defensa mecánicos elaborando y reforzando barreras físicas constituidas por una cutícula gruesa sobre las hojas y/o un depósito de callosa o de lignina sobre las paredes celulares. Así, se dificultan la entrada y el movimiento de los patógenos en la planta , sistemas de defensa químicos o bioqu ímicos sintetizando compuestos tóxicos como por ejemplo, los taninos, las fitoalexinas y diferentes complejos proteicos. Entre las estrategias de resistencia, se distingue la resistencia no huésped (cuando todos los elementos de una especie son resistentes a un, patógeno dado) de la resistencia huésped (cuando al menos un miembro de la especie es sensible a una cepa del agente patógeno). La resistencia huésped, la más conocida hoy día y la mejor caracterizada, es aquella en la que interviene un gen dominante. Cuando el gen dominante se encuentra en presencia de un gen específico de avirulencia del agente patógeno, se establece una incompatibilidad entre la planta y el patógeno, y la planta es resistente. Esta interacción descrita por Flor (1 955) también se denomina "modelo gen a gen" y con mucha frecuencia está asociado a una necrosis localizada del tejido vegetal en el sitio de la infección (reacción de hipersensibilidad). Aunque está muy extendido, este modelo "gen a gen" no es universal porque ciertos sistemas de resistencia descritos no funcionan según este modelo, y las diferencias residen especialmente en el modo de acción del gen de resistencia. Existen genes recesivos, superdominantes o que ejercen una dominancia incompleta. Varios genes de avirulencia pueden ¡nteractuar con un mismo gen de resistencia. Muchas resistencias también son poligénicas, y en estos casos varios genes presentes en la planta están implicados en la resistencia, cada uno de ellos con un efecto de protección parcial y que puede controlar mecanismos diferentes. Hasta la fecha, se han clonado numerosos genes dominantes que siguen el modelo "gen a gen". Poseen estructuras genéticas relacionadas aunque actúen contra agentes patógenos variados (virus, hongos, bacterias, insectos, nematodos). La presencia de dominios conservados ha permitido definir 4 grandes clases (Hammond-Kosack et Jones, 1997) de genes dominantes. De forma singular, se estima que el 40% de las resistencias a los potyvirus son recesivas mientras que en los otros grupos virales esta proporción no alcanza más que al 20% como media. Fraser (1992) ha emitido la hipótesis de que las resistencias recesivas serían diferentes a las resistencias dominantes de tipo "gen a gen" y serían el resultado de un déficit o de una alteración específica del producto de un gen del huésped necesario para la realización del ciclo vírico en la planta. Los alelos dominantes de sensibilidad corresponderían a la disponibilidad de este producto implicado en las interacciones planta/patógeno. Se ha demostrado que las mutaciones puntuales en el gen vírico que codifica para la proteína VPg están implicadas en la evitación de la resistencia a los potyvirus en varias parejas huéspedes-patógenos. Esto se ha demostrado en las parejas JVUN/Nicotiana tabacum (gen va), PVY/tomate (gen pot- 1), L V/Lechuga (gen mol) y PSbMV/guisante (gen sbml), fKeller et al., 1 998, Morel, 2001 , Redondo, 2001 , Nicolás et al., 1997). Esto no excluye que además puedan intervenir otros genes virales. Así mismo, Wittman et al. (1 997) han demostrado que una isoforma del factor de iniciación de la traducción cucariótica elF4E de Arabidospsis thaliana interactúa con la proteína vírica VPg del virus del mosaico del nábo (TuMV). Esta misma interacción se ha detectado entre la VPg del TEV y el elF4E de tabaco y de tomate (Schaad ef al., 2000). El gen elF4E codifica para un factor eucariótico de iniciación de la traducción de los ARN. elF4E corresponde a una de las subunidades del factor de traducción elF4F (en el germen de trigo, corresponde a la subunidád p26). El factor de traducción elF4E se fija al capa de los ARNm a nivel de m7G. La estructura de elF4E se caracteriza por tener una región rica en residuos triptófano (10 en Arabidopsis thaliana, 1 1 en el trigo y 12 en los mamíferos). Estos residuos de triptófano estarían implicados en la unión al grupo funcional m7G (Rudd , K. et al., 1998). El factor de traducción elF4E está codificado por una familia multigénica. Por ejemplo, en Arabidopsis thaliana, se han identificado 4 copias de elF4E (Rodríguez et al. , 1 998, Robaglia et coll. , com. pers.). Estas copias presentan , dos a dos, entre un 44 y un 82% de identidad. Todos estos trabajos estudian la correlación entre la interacción elF4E/VPg y la sensibilidad de la planta a los potyvirus; pero ninguno señala y ni siquiera sugiere que esta interacción podría motivar una resistencia. Por el contrario, incluso en Schaad et al. , 2000 se indica que la intéracción VPg/elF4E no juega ningún papel en la resistencia, porque los determinantes genéticos de la interacción VPg/elF4E son diferentes a los que permiten a los potyvirus (vía la VPg) eludir la resistencia. En el estado en el que se encuentra la técnica, hay que reconocer el mérito de los investigadores por haber obtenido las proteínas elF4E, así como los genes correspondientes, que intervienen en la resistencia o la sensibilidad de las plantas a los potyvirus. Los investigadores han constatado especialmente que diferentes plantas resistentes a los potyvirus presentaban mutaciones puntuales situadas en una misma región de la proteína elF4E; esta región, muy conservada entre las proteínas elF4E obtenidas de diversas especies vegetales, en especial de solanáceas, se define por la secuencia general (1 ) siguiente: DX1X2X3X4 SX5QX6AWGSSX7RX8X9YTFSX1oVEX1 i FWX12Xi3YN IHX14PSKL Xi sXieGAD en la que: - X-i , X2, X3 , X4 , ?ß, X7, ?ß, X9 , X10, X12. ?? 3 · Xi 5 i y Xie representan cada uno un aminoácido neutro; X5 y X14 representan un aminoácido básico; X1 1 representa un aminoácido ácido; D, K, S, Q, A, W, G , R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, y L tienen su significado habitual en el código de 1 -letra. Definimos aquí como «aminoácido neutro», a cualquiera de los aminoácidos siguientes: alanina , valina, leucina, isoleucina, prolina, triptófano, fenilalanina, metionina, glicina, serina, treonina, tirosina, cisteína, glutamina, asparagina. Se define como «aminoácido cargado» , a cualquiera de los aminoácidos siguientes: histidina , Usina , arginina, glutamato, aspartato. De estos aminoácidos cargados, la histidina, la lisina y la arginina son aminoácidos básicos, y el glutamato y el aspartato son aminoácidos ácidos. La secuencia (1 ) también está representada en la lista de secuencias en el anexo con el número SEQ ID NO: 1 Las mutaciones observadas por los investigadores en el pimiento son las siguientes: la sustitución del aminoácido neutro X3 de la secuencia (1 ) por un aminoácido básico; - la sustitución del aminoácido neutro X7 de la secuencia (1 ) por un aminoácido básico; la sustitución del residuo aspartato en posición C- terminal de la secuencia ( 1 ) por un aminoácido neutro. La mutación de X3 se ha observado en líneas de pimiento que presentan dos tipos diferentes de resistencia a los potyvirus (pvr2, y pvr22); los pimientos que presentan el fenotipo pvr21 poseen además la mutación en posición X7 l y los pimientos que presentan el fenotipo pvr22 poseen además la mutación en posición C-terminal. En el tomate, los investigadores han observado especialmente las siguientes mutaciones: la sustitución del aminoácido neutro X, de la secuencia (1 ) por un aminoácido básico; la sustitución del residuo Ala de la estructura AWG SS de la secuencia (1 ) por un aminoácido ácido; Gracias a la muy alta conservación de secuencia de los genes elF4E en los eucariotas y a la disponibilidad de la estructura en 3D de las proteínas elF4E del ratón y de la levadura (Marcotrigiano et al., 1997, Cell 89: 951 -961 , Matsuo et al., 1 997, Nat. Struct. Biol. 4: 71 7-724), se pueden determinar las posiciones de las mutaciones con respecto a la estructura en 3D de elF4E en el pimiento y en el tomate. Todas estas mutaciones están físicamente cerca y en la superficie de la proteína. Además, estas mutaciones no afectan a los aminoácidos muy conservados en los eucariotas, ni a los que están implicados en las funciones esenciales de elF4E, es decir, en el reconocimiento de la capa o en la interacción entre elF4E y elF4G o la proteína de unión 4E. Sin embargo, es posible que estas mutaciones ejerzan un efecto sobre la interacción VPg/elF4E mediante la modificación de la estructura de elF4E a nivel de la o de las regiones implicadas en esta interacción. Probablemente, está modificación de la estructura sea el resultado de la sustitución de unos aminoácidos por aminoácidos de carga diferente (sustitución de aminoácidos neutros por aminoácidos cargados o a la inversa, de aminoácidos cargados por aminoácidos neutros, o de aminoácidos de carga opuesta), hecho que constituye un punto en común en el conjunto de las mutaciones observadas por los investigadores. Por tanto, se puede suponer razonablemente que otras mutaciones del mismo tipo en una proteína elF4E vegetal, a nivel de la región definida por la secuencia (1 ), provocarán modificaciones de estructura similar produciendo el mismo efecto sobre la interacción VPg/elF4E. En particular, parece que la sustitución de a) menos uno de los aminoácidos neutros Xi , X2, X3 o X4, por jn aminoácido cargado, en especial un aminoácido básico, desempeña un papel importante en la resistencia a los potyvirus. Estas observaciones permiten proponer ciertas herramientas, en, particular herramientas genéticas, de cribado y/o de obtención de plantas resistentes o sensibles a los potyvirus.

La presente invención se centra más concretamente sobre un procedimiento de selección de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracteriza por detectar en las plantas a estudiar: la presencia o la ausencia de una proteína elF4E (denominada posteriormente: « proteína elF4E de tipo salvaje») que comprende una región definida por la anterior secuencia (1 ), o de una secuencia que codifica para la mencionada proteína; la presencia o la ausencia de una proteína elF4E mutante que comprende una región derivada de la definida por la anterior secuencia (1 ), por sustitución de al menos un aminoácido neutro de la mencionada secuencia (1 ) por un aminoácido cargado, preferentemente un aminoácido básico y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia ( 1 ) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta, o de una secuencia que codifica para la mencionada proteína; y la selección de las plantas donde . se detecta una proteína elF4E mutante o una secuencia que codifique para la mencionada proteína, y donde no se detecta la proteína elF4E de tipo salvaje ni la secuencia que codifica para la mencionada proteína. La presente invención también tiene como objeto un procedimiento de selección dé plantas que se pueda utilizar para la obtención de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracteriza por detectar en las plantas a estudiar la presencia o la ausencia de una proteína elF4E mutante tal y como se define anteriormente o de una secuencia que codifique, para la mencionada proteína, y la selección de las plantas donde se detecta la mencionada proteína elF4E mutante o una secuencia que codifica para la mencionada próteína. Según el modo de aplicación que se elige para l este trabajo, la mencionada proteína elF4E mutante incluye una región derivada de la definida por la anterior secuencia (1 ) por: a) sustitución de al menos uno de los aminoácidos Xi , X2, X3 o X4. , de la mencionada secuencia (1 ) por un aminoácido cargado, y b) sustitución de al menos uno de los otros aminoácidos neutros de la mencionada secuencia (1 ) por un aminoácido cargado y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (1 ) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta. La detección de la presencia o de la ausencia de una proteína e lF4E de tipo salvaje o mutante, puede efectuarse con anticuerpos específicamente dirigidos contra la forma estudiada de la proteína elF4E. Pueden ser anticuerpos dirigidos contra la forma salvaje o contra la forma mutante de la región de elF4E definida por la secuencia (1 ). Para detectar la presencia o la ausencia de una secuencia que codifique para una proteína elF4E de tipo salvaje o de una secuencia que codifique para una proteína elF4E muíante, disponemos de numerosas herramientas; pueden ser polinucleótidos derivados de la secuencia del gen elF4E y, en particular, de polinucleótidos capaces de hibridarse selectivamente bien con un alelo salvaje, bien con un alelo mutante de elF4E, tal y como se definen anteriormente o de polinucleótidos que permitan la amplificación de la región de elF4E que contiene la mutación estudiada; también puede tratarse de enzimas de restricción que reconocen una secuencia blanco presente en la forma salvaje, pero no en la forma mutada (o a la inversa). El presente trabajo también tiene como objeto la utilización de una herramienta de selección elegida entre : a) un polinucleótido que codifica para una proteína elF4E de tipo salvaje o mutante, tal y como se definen anteriormente; b) un polinucleótido complementario del polinuelcótido a); c) un fragmento de al menos 1 0 pb de un polinucleótido a) o b); d) un anticuerpo dirigido contra una proteína elF4E de tipo salvaje o mutante, tal y como se definen anteriormente; para la selección de plantas resistentes a los potyvirus. En particular, la investigación estudia un procedimiento de selección de plantas resistentes a los potyvirus que se caracteriza por la aplicación de al menos un medio de selección elegido en el grupo de las herramientas genéticas (o relacionadas) que comprende: * A / todo o parte de al menos una de las secuencias seleccionadas en el subgrupo que incluye: SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:6 et 8, cualquier análogo de estas secuencias que resulte de la degeneración del código genético, cualquier secuencia de ADNc complementario de al menos una de estas secuencias y/o de al menos uno de sus análogos; * B / todo o parte de al menos uno de los productos de transcripción de las secuencias A; * C / todo o parte de al menos uno de jos productos de traducción de las secuencias A; * D / todo o parte de al menos un anticuerpo específico de al menos un producto de traducción de C/; * E / y cualquier asociación de las herramientas A, B, C, D. Preferentemente, los medios de selección se seleccionan entre los subgrupos de herramientas A/ y/o B/, y de forma más preferente aún, entre el subgrupo de herramientas A/. Mediante esta localización simple, fácil y fiable de plantas resistentes o sensibles a los potyvirus, los investigadores han elaborado un nuevo procedimiento basándose en el uso de secuencias correspondientes al gen elF4E. Et procedimiento objeto de la invención se aplica en especial a las solanáceas, cucurbitáceas, cruciferas y compuestas y, más concretamente, a las plantas de los géneros Lycopersicon, Capsicum, Nicotiana, Solanum, Lactuca, Cucumis, Arabidopsis etc. Los potyvirus implicados son , por ejemplo, el virus Y de la patata (PVY), el virus del grabado del tabaco (TEV) y/o el virus del mosaico de la lechuga (LMV), y/p el virus del mosaico amarillo del calabacín (ZYMV) y/o el virus del mosaico del nabo (TuMV). Para efectuar el procedimiento según la investigación , se utilizan secuencias nucleotídicas y/o secuencias peptídicas o enzimas de restricción como medios de detección, sondas o cebadores, para seleccionar plantas resistentes o sensibles a los potyvirus. . Estos medios de detección incluyen en particular sondas o cebadores nucleotídicos. En la presente invención se entiende por «cebador» a cualquier secuencia polinucleotídica que se puede utilizar para amplificar una secuencia de un gen elF4E susceptible de incluir una mutación asociada a la resistencia a los potyvirus. Se trata de polinucleótidos . utilizables para amplificar toda o parte de la secuencia de elF4E que codifica para la región de elF4E definida por la secuencia ( 1 ), o de la secuencia mutante que se deriva. En la presente invención se entiende por «sonda» a cualquier secuencia polinucleotídica que se hibride con un gen elF4E de tipo salvaje o con un gen elF4E mutante tal y como de define anteriormente. Aquí también se incluyen las secuencias nucleotídicas capaces de hibridarse selectivamente bien con un alelo del gen elF4E asociado a la resistencia a los potyvirus, bien con un alelo del gen elF4E asociado a la sensibilidad a los potyvirus.

Estas sondas y estos cebadores pueden utilizarse como marcadores específicos de las plantas resistentes o sensibles a los potyvirus. En conformidad con la invención, podremos efectuar una separación entre las plantas sensibles y las plantas resistentes a los potyvirus mediante las herramientas genéticas (o relacionadas) (A) a (E), e incluso con las enzimas de restricción específicas. Estas últimas se describirán más adelante. Las secuencias (A) nueleotídicas SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8 corresponden a genes elF4E de diferentes solanáceas implicadas en la resistencia a los potyvirus que codifican para un factor eucariótico de iniciación de la traducción de los ARN. La SÉQ ID NO: 8 corresponde a un alelo recesivo elF4E de resistencia a un potyvirus, mientras que SEQ ID NO: 2, 4, y 6 representan alelos dominantes elF4E de sensibilidad a un potyvirus. En conformidad con la invención se han descubierto medios de selección o localizaciones genéticas de resistencia o de sensibilidad a los potyvirus. El proceso de selección según el estudio puede emplear separada o conjuntamente los dos tipos de medios de selección o localizaciones. La investigación también engloba a todos los equivalentes de estas secuencias (A) nueleotídicas SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8, que conservan la función de localización genética elF4E de sensibilidad/resistencia a los potyvirus propias a las secuencias de referencia. En lo que respecta a los ADN, se trata de análogos de degeneración genética y de secuencias de ADNc complementarias de las secuencias de referencia. Los equivalentes polinucleotídicos de las secuencias (A) de referencia también se encuentran entre sus productos (ARN) de transcripción (B). Las proteínas (C) obtenidas de (A) y de (B) constituyen otros localizadores intracelulares que permiten la selección de plantas resistentes o sensibles a los potyvirus. Además de los blancos (A), (B), (C) , los medios de selección de la invención también pueden ser sondas nucleotídicas aptas para hibridarse con blancos nucleotídicos (A) y (B) complementarios, o bien medios de detección proteicos (anticuerpos D) aptos para apartarse con blancos antigénicos (C) específicos. Lo ideal es combinar todos estos medios equivalentes (A), (B), (C) & (D) para obtener una herramienta de selección (E). Los medios según el estudio también cubren cualquier fragmento de las secuencias (A), (B), (C) & (D). Por "fragmento" se entiende, según este trabajo: bien un polinucleótido de al menos 10, 20, 30, 5.0, 100, 2009 300, 400, 500 nucleótidos contiguos a la secuencia de referencia; los fragmentos preferidos son aquellos capaces de hibridarse selectivamente en condiciones restrictivas con la mencionada secuencia de referencia. bien un poliaminoácido de al menos 3, 6, 10, 15, 30, 60, 100, 150, 200 aminoácidos contiguos a la secuencia de referencia; los fragmentos preferido son aquellos capaces de hibridarse selectivamente en condiciones restrictivas con la mencionada secuencia de referencia.

Según una modalidad favorable de la invención, el procedimiento se caracteriza porque: se emplea al menos un medio de detección que incluye al menos una de las herramientas A, B, C, D, E según la reivindicación 1 y/o al menos una enzima de restricción , con al menos un extracto genómico y/o proteico de una planta a estudiar, se somete dicho extracto genómico y/o proteico, eventualmente aparcado y/ó hibridado y/o digerido al menos a una separación, se muestran los posibles apareamientos y/o hibridaciones y/o digestiones que se pueden producir, y se procede a la lectura de los resultados para concluir finalmente sobre la presencia o la ausencia de un alelo de resistencia (pvr21) o de un alelo de sensibilidad (pvr+) ai menos a un potyvirus. Este procedimiento se inscribe en el marco de las metodologías conocidas en el campo de la detección y del reconocimiento de las características genéticas de vegetales. Según una primera forma de aplicar el procedimiento, en el que el principio de selección se basa en la utilización de una o varias enzimas de restricción específicas, el procedimiento puede responder a la ' siguiente metodología : se amplifica por POR la secuencia codificadora del gen elF4E, a partir del ADN de la planta a estudiar, por ejemplo con ayuda de los cebadores SEQ ID NO: 1 8 y/o 19, se digiere el producto de amplificación con una enzima de restricción adecuada; se separan los posibles fragmentos obtenidos, y se seleccionan las plantas resistentes o sensibles según el perfil de restricción del producto de amplificación. Por ejemplo, las plantas sensibles a los potyvirus pueden detectarse con un perfil de restricción en el que aparezca la presencia de un sitio de corte por la enzima TspRI o uno de sus isosquizómeros; las plantas resistentes a los potyvirus pueden detectarse por un perfil de restricción en el que se muestra la ausencia de dicho sitio de corte por TspRI o uno de sus isosquizómeros y la presencia de un sitio de corte por la enzima Mvnl o uno de sus isosquizómeros. Según una segunda forma de aplicar el procedimiento que corresponde al caso en el que el modo de selección es la hibridación de secuencias nucleotídicas complementarias, el . procedimiento consiste preferentemente: en extraer el AON de las plantas, en someter eventualmente este ADN a una digestión enzimática con la ayuda de al menos una enzima de restricción , en desnaturalizar el ADN eventualmente digerido, . en poner en contacto el ADN desnaturalizado, con la sonda que previamente se ha desnaturalizado y presenta al menos un marcador, de forma que se efectúe la hibridación, en eliminar el ADN y la sonda no hibridada, en revelar la hibridación con la ayuda del marcador, y en seleccionar plantas que presenten un perfil de hibridación correspondiente a la co-segregación del blanco hibridado con la sonda marcada y del alelo de resistencia o de sensibilidad. La diferenciación entre las plantas sensibles y las plantas resistentes se puede efectuar, en caso en que el ADN haya sido digerido por una enzima de restricción, por la diferencia de tamaño de los fragmentos hibridados. También se puede efectuar con una sonda capaz de hibridarse selectivamente con el alelo de resistencia o el alelo de sensibilidad. La hibridación de las moléculas de hebra simple de la sonda y del blanco se efectúa preferentemente en unas condiciones de hibridación restrictivas que permiten una hibridación selectiva y que el especialista sabe determinar. En general, la temperatura de hibridación y de lavado es inferior en al menos 5°C a Tm de la secuencia de referencia a un pH dado y para una fuerza iónica dada. Normalmente, la temperatura de hibridación es de al menos 30°C para un polinucleótido de 1 5 a 50 nucleótidos y de al menos 60°C para un polinucleótido de más de 50 nucleótidos. El nivel de la señal generada por la interacción entre la secuencia capaz de hibridarse de manera selectiva y las secuencias de referencia es generalmente 1 0 veces, y preferentemente 100 veces más intensa que el de la interacción de las otras secuencias de ADN que generan el ruido de fondo. Con una sonda marcada, por ejemplo con ayuda de un elemento radioactiva como el 32P o de una enzima injertada como la peroxidasa, la hibridación se determina fácilmente de forma cualitativa y cuantitativa. El ADN utilizado en la primera y en la segunda forma de aplicar el procedimiento puede ser ADN total o ADNc. Una tercera forma (entre otras) de aplicar el procedimiento corresponde al caso en el que el modo de selección sea el apareamiento antícuerpo/antígeno, y el procedimiento se basa en detectar la presencia de un polipéptido constituido en todo o en parte por una de las secuencias de aminoácidos que se describirán más tarde e incluidas en la invención. El procedimiento puede consistir en poner en contacto la muestra a ensayar con un anticuerpo como se describe anteriormente y en detectar posteriormente el complejo antígeno / anticuerpo formado. Sea cuál sea el modo de selección , el procedimiento de selección según el estudio es fiable y sensible. La presente invención también tiene como objeto un polinucleótido que codifica para una proteína elF4E mutante que incluye una región derivada de la definida por la anterior secuencia (I), mediante la sustitución de al menos un aminoácido neutro de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, preferentemente un aminoácido básico y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta. Según un modo de realización preferido, el mencionado polinucíeótido codifica para una proteína elF4E mutante que incluye una región derivada de la definida por la anterior secuencia (1 ), por: a) sustitución de al menos uno de los aminoácidos Xi , X2, X3 o X4> de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, y b) sustitución de al menos uno de los otros aminoácidos neutros de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta. Los polinucleótidos en conformidad con la investigación son, por ejemplo, los que codifican para las variantes de las secuencias SEQ ID NO: 22 o 23 asociadas a la resistencia a los potyvirus. Según otro de los aspectos, la invención también se centra en una secuencia nucleotídica caracterizada por estar descrita por una secuencia elegida en el grupo que incluye todas o parte de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 6 SEQ ID . NO: 8 La secuencia nucleotídica SEQ I D NO:2 es una secuencia de ADNc obtenida a partir de ADN de tabaco y que corresponde al gen de tabaco. La secuencia nueleotídica S EQ ID NO:4 es una secuencia que codifica para una proteína e l F4E de una variedad de Lycopersicon esculentum sensible a los potyvirus. Las secuencias SEQ I D NO: 6 y 8 son secuencias que codifican para proteínas elF4E de pimiento (Capsicum armuum), variedades Yolo Wonder y Yolo Y respectivamente. La presente invención también tiene como objeto a los cebadores que permiten la amplificación de un gen elF4E, o de una porción de éste que pueda contener al menos una mutación, tal y como se define anteriormente, asociada a la resistencia a los potyvirus; en especial , se trata de cebadores que permiten la amplificación de la secuencia de elF4E que codifica para la región de elF4E definida por la secuencia (I), o de una secuencia mulante que se deriva. Los especialistas pueden definir fácilmente los cebadores en conformidad con la investigación a partir de las secuencias nucleotídicas o peptídicas descritas en la presente invención. A título de ejemplos no limitativos se pueden citar: los cebadores de amplificación constituidos por las secuencias de cebadores nueleotídicas SEQ ID NO : 1 8 & 1 9 ; los cebadores de clonación SEQ I D NO: 1 0 a 1 7 ; los cebadores de cribado de banco BAC constituidos por las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 20 & 21 . Las SEQ ID NO : 1 8 & 19 son cebadores obtenidos de la secuencia que codifica elF4E del pimiento Yolo Wonder permitiendo , especialmente por amplificación por PCR y posteriormente por d igéstión enzimática, la detección de las secuencias nucleotídicas portadoras de los alelos de resistencia pw2 y de sensibilidad pvr*, a los potyvirus. Los cebadores de clonación SEQ ID NO: 1 0 & 1 1 degenerados y las SEQ ID NO: 12 a 1 7 no degenerados, se han definido sobre una alineación de las secuencias de elF4E de tabaco, tomate y Arabidopsis y se utilizan para la síntesis (RACE) de sondas ADNc de detección de elF4E en el genoma de tomate y de pimiento. Los cebadores SEQ ID NO: 20 & 21 de cribado de banco BAC son no degenerados. Estos cebadores SEQ ID NO: 10 a 17, 20 & 21 pueden eventuaimente utilizarse directa o indirectamente (construcción de herramientas de selección) en la detección de características de resistencia o de sensibilidad a los potyvirus. La presente invención también tiene como objeto una proteína elF4E mutante que incluye una región derivada de la definida por la secuencia (I) anterior, por sustitución de al menos un aminoácido neutro de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, de preferencia un aminoácido básico y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta. Según un modo de realización preferido, la mencionada proteína elF4E mutante incluye una región derivada de la definida por la secuencia (I) anterior, por: a) sustitución de al menos uno de los aminoácidos Xi , X2, X3 o X , de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, y b) sustitución de al menos uno de los otros aminoácidos neutros de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta. La presente invención también estudia los productos de traducción de las secuencias nucleotídicas SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8, es decir, los polipéptidos elegidos en el grupo que incluye toda o parte de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3 - SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9. Los medios de selección resistencia / sensibilidad de las plantas a los potyvirus, constituidos por secuencias de aminoácidos, se utilizan preferentemente como blancos que permiten la localización. Se trata pues de medios de selección indirectos que en los que se basa el empleo de medios de detección específicos de estos blancos peptídicos. Favorablemente, estos medios de detección son anticuerpos que constituyen otro objeto de la presente invención. Así, los mencionados anticuerpos se caracterizan por estar específicamente dirigidos contra todo o parte de al menos uno de los productos de traducción C y, más especialmente, de las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 3, 5, 7, 9, 22 , o 23 o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de ésta. Estos anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Los anticuerpos contra los polipéptidos tal y como se han definido anteriormente pueden prepararse según las técnicas clásicas que dominan los especialistas (por ejemplo, Kohier et Milstein, 1975; Kozbor et al. 1983, artineau et al., 1 998). Un anticuerpo según este trabajo podrá incluir un marcador detectable isotópico o no isotópico, por ejemplo fluorescente, o incluso estar unido a una molécula como la biotina según técnicas bien conocidas por los especialistas. Otra parte de la invención trata sobre los medios de selección formados por sondas para la detección de plantas resistentes al menos a un potyvirus, estando estas sondas incluidas en ellas. En esta parte se definen las sondas para la detección de plantas resistentes al menos a un potyvirus. Una primera categoría de sondas se caracteriza, en que cada sonda incluye al menos una secuencia correspondiente a toda o a parte de las SEQ ID NO: 2, 4, 6, y 8. En esta primera categoría , las sondas que incluyen al menos una secuencia correspondiente a todo o á parte de SEQ ID NO: 2 , 4, 6, y 8, y en especial a toda o a parte de la porción que codifica para la región de la proteína elF4E definida por la secuencia general (1 ) son las que se eligen preferentemente. SEQ ID NO: 6 es una sonda de sensibilidad obtenida del pimiento Yolo Wonder. Se distingue de SEQ ID NO: 8, que es una sonda de resistencia obtenida del pimiento Yolo Y, en dos bases nucleotídicas. Estas mutaciones demostradas en SEQ ID NO: 6 & 8, corresponden a los sitios de restricción TspRI para SEQ ID NO: 6 y Mnvl para SEQ ID NO: 8, que marcan respectivamente la sensibilidad a los potyvirus en Yolo Wonder y la resistencia a los potyvirus en Yolo Y.

Estas sondas se utilizan para distinguir las plantas resistentes y sensibles, bien por hibridación selectiva y detección de la presencia o de la ausencia de una señal de hibridación, bien por digestión con una enzima de restricción adecuada y capaz de separar diferencialmente el alelo de sensibilidad del alelo de resistencia, por ejemplo EcoRI, TspRI, o Mnvl seguida de la hibridación de la sonda con el producto de restricción. La separación entre las plantas sensibles y las plantas resistentes se efectúa en este último caso por la diferencia de tamaño de los fragmentos hibridados. La presente invención también proporciona herramientas que permiten realizar otro procedimiento de selección en conformidad con el primer modo de aplicación dei procedimiento según la invención, tai y como se define anteriormente. Según este primer modo, inicialmente se efectúa una amplificación por PCR de la secuencia elF4E. Tras la amplificación se realiza una digestión selectiva con una enzima de restricción. Así pues, las herramientas que intervienen son de dos tipos: enzima(s) de restricción y cebador(s) PCR que permitan amplificar la secuencia elF4E. La presente invención también tiene como objeto un kit que permita detectar un alelo de e-IF4E asociado a la resistencia o a la sensibilidad a los potyvirus, que se caracterice por incluir: al menos una enzima de restricción elegida entre: a) una enzima que reconozca un sitio de restricción I presente en al menos un alelo de elF4E asociado a la sensibilidad a los potyvirus, y ausencia de alelos de elF4E asociados a la resistencia a los potyvirus; b) una enzima que reconozca un sitio de restricción II presente en al menos un alelo efe e-IF4E asociado a la resistencia a los potyvirus, y ausencia de alelos de elF4E asociados a la sensibilidad a los potyvirus; y un par de cebadores nucleotídicos que permitan amplificar elF4E o una porción de éste que incluya el sitio de restricción I y/o el sitio de restricción II. Por ejemplo: para detectar un alelo de elF4E asociado a la sensibilidad a los potyvirus, como el representado por la secuencia SEQ ID NO: 6, la enzima de restricción es la TspRI, o uno de sus isosquizómeros, que reconoce un sitio de restricción definido por la secuencia sentido: NNCASTGNNA y la secuencia antisentido ANNGTSACNN. Los cebadores nucleotídicos se eligen de forma que permitan la amplificación de toda la secuencia de elF4E 0 de al menos una porción de ésta que incluya el sitio TspRI; para detectar un alelo de elF4E asociado a la resistencia a los potyvirus, como el representado por la secuencia SEQ 10 NO: 8, la enzima de restricción es Mvnl, o uno de sus isosquizómeros, que reconoce un sitio de restricción definido por la secuencia sentido: CGACG y la secuencia antisentido: GCAGC. Los cebadores nucleotídicos se eligen de forma que permitan la amplificación de toda la secuencia de elF4E o de al menos una porción de ésta que incluya el sitio Mvnl; En ambos casos se pueden utilizar, por ejemplo, los cebadores SEQ ID NO: 18 y SEO. ID NO: 1 9. Como se ha indicado anteriormente, la detección de plantas sensibles o resistentes a los potyvirus también puede efectuarse mediante la detección de la presencia o de la ausencia de la forma salvaje o mutante de la proteína elF4E. Así, la presente invención engloba! el uso de una proteína elF4E de tipo salvaje o mutante, tal y como se definen anteriormente, o de un anticuerpo específico de una de las mencionadas proteínas, para la selección de plantas resistentes a los potyvirus. Preferentemente, la mencionada proteína 6IF4E se elige entre: la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 3; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 5; la proteína representada por la secuencia polipeptídica S Q ID NO: 7; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 9; el grupo de proteínas representado por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 22; . - el grupo de proteínas representado por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 23; Así, una modalidad de medios de detección de la resistencia a los potyvirus en conformidad con la invención se caracteriza porque cada uno de estos medios incluye al menos un anticuerpo específico de toda o parte de una proteína elF4E mutante en conformidad con la invención, y en especial de un fragmento de al menos 6 aminoácidos de ésta qué incluya una mutación asociada a la resistencia, tal y como se define anteriormente. Por ejemplo, un medio de detección de la resistencia puede estar constituido por un anticuerpo específico de toda o parte de una secuencia polipeptídica tal y como se define anteriormente, y en especial de un fragmento de al menos 6 aminoácidos de ésta que incluya una mutación asociada a la resistencia. La invención también se refiere a los medios de detección de la sensibilidad o de la resistencia a los potyvirus, constituidos cada uno por al menos una secuencia de aminoácidos elegida en el grupo que incluye las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3; SEQ ID NO: 5; - SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; La invención se refiere más especialmente a los medios de detección de la sensibilidad a los potyvirus, constituidos cada uno por al menos un anticuerpo específico de una secuencia de aminoácidos elegida en el grupo que incluye las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 3; - SEQ ID NO: 5; - SEQ ID NO: 7; SEQ ID NO: 9; SEQ ID NO: 22; SEQ ID NO: 23; o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de una de dichas secuencias, en especial un fragmento de la región de ésta definida por la secuencia (I). Preferentemente, cada sonda nucleotídica u otro posible medio de detección estará provisto de al menos de un marcador, que servirá como control de la hibridación nucleotídica o del aparcamiento antígeno/anticuerpo en el centro de la detección de la secuencia sensible. De forma favorable, este marcador se detecta por medios espectroscópicos, fotoquímicos, bioqu ímicos, inmunoquimicos o incluso químicos. Por ejemplo, dicho marcador podría consistir en un isótopo radioactiva de 32P, 3H , en una molécula fluorescente (5-bromodeoxiuridina, fluoresceína, acetilaminofluóreno) o incluso en un ligando como la biotina. Centrándonos más en las sondas nucleótídicas, su mareaje se efectúa preferentemente mediante la incorporación de moléculas marcadas dentro de los polinucleótidos por extensión de cebadores o bien añadiéndolos en los extremos 3' o 5'. ' De manera preferente, las secuencias utilizadas para detectar las plantas resistentes a los potyvirus se utilizan como sondas y como cebadores nucleotidicos. Es evidente que todos los posibles medios de detección no se limitan estrictamente a las secuencias señaladas, sino que engloban a todos ios equivalentes constituidos por las secuencias similares que conservan la función implicada, tal y como se definen anteriormente. El especialista conoce perfectamente los diferentes métodos de preparación de sondas y cebadores, incluyendo la clonación y la acción de enzimas de restricción, e incluso la síntesis química directa según ciertas técnicas como el método del fosfodiester de Brown et al. (1 979) o la técnica de soporte sólido descrita en la patente europea ?ß EP 0707592.

Los ácidos nucleicos pueden estar marcados, si se desea, incorporando una molécula o un marcador detestable como se ha expuesto anteriormente. En la patente francesa N° FR 78 1 0 975 y en los artículos de Urdéa et al., (1 988) o Sánchez-Pescador et al. (1 988) se describen ejemplos de mareaje no radioactiva de fragmentos de ácidos nucleicos. En otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a la utilización de los medios de detección definidos anteriormente para la detección de plantas resistentes/ sensibles al menos a un potyvirus. En conformidad con la invención, se utilizan como localización(ones) oligonucleotídica(s) de resistencia/sensibilidad a los potyvirus, los sitios de restricción Mvnl y/o TspRI, por lo menos conocidos, de las secuencias elF4E. De preferencia, los sitios de restricción utilizados como localización(ones) oligonucleotídica (s) corresponden: a la secuencia sentido: CGACG y a la secuencia antisentido: GCAGC y/o a la secuencia sentido: NNCASTGNNA y a la secuencia antisentido: ANNGTSACNN. El empleo de estos sitios de restricción como localizaciones (o marcas o etiquetas) de resistencia a los potyvirus sobre secuencias expresadas, hace recordar el primer modo de aplicación del procedimiento de detección anteriormente descrito, en el que se utilizaban enzimas de restricción (por ejemplo: Mvnl y/o TspRI ) y cebadores de amplificación de la secuencia elF4E, por ejemplo: SEQ ID NO 1 8 y/o 19. En consideración a la especificidad de los sitios de restricción Mvnl & TspRI, la presente invención abarca también el uso como localización(ones) oligonucleotídica (s) de resistencia/sensibilidad a los potyvirus, dichos sitios de restricción Mvnl & TspRI, y, de forma preferente, el sitio de restricción correspondiente a la secuencia sentido: CGACG y a la secuencia antisentido: GCAGC y/o el sitio de restricción correspondiente a la secuencia sentido: NNCASTGNNA y a la secuencia antisentido: ANNGTSACNN. En otro de sus aspectos, la presente invención se refiere a un kit de selección de plantas resistentes/sensibles a los potyvirus que incluye al menos un medio de detección de tipo anticuerpo o polinucleótido como se han definido más arriba. Llegado el caso, el kit incluye los reactivos necesarios para efectuar una reacción de hibridación o de amplificación. La invención también tiene como objeto las plantas obtenidas por el procedimiento anteriormente descrito y/o por la aplicación de las herramientas y/o por la utilización del kit de selección definidos anteriormente. De forma preferente, estas plantas pertenecen a la familia de las solanáceas, de las cucurbitáceas, de las cruciferas y de las compuestas. Oe manera aún más preferente, se eligen entre los tomates, pimientos y/o lechuga. A título de ejemplo, los investigadores realizan el procedimiento objeto de la invención siguiendo el protocolo de análisis RFLP (polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción). Para ello, los investigadores han utilizado un protocolo clásico de RFLP en el que las sondas objeto de la investigación están marcadas con 32P y en el que el AD de las plantas de pimiento a analizar se digiere con la enzima de restricción EcoRI. Como resultado de este procedimiento, los investigadores obtienen perfiles de hibridación diferentes entre las plantas resistentes a los potyvirus y las plantas sensibles, permitiendo así seleccionar las plantas sensibles o resistentes. Estas últimas podrán entrar posteriormente en un programa de mejora de plantas por cruzamientos sucesivos. La invención no sólo se refiere a la selección de plantas resistentes o sensibles a los potyvirus. En efecto, en la medida en la que los investigadores han podido identificar el gen elF4E que determina una resistencia recesiva a los potyvirus, sería deseable obtener nuevas variedades de plantas genéticamente modificadas, resistentes (o sensibles) al menos a un potyvirus. Por tanto, la invención también se refiere a un procedimiento no biológico de obtención de nuevas variedades de plantas genéticamente modificadas, resistentes (o sensibles) al menos a un potyvirus, y que dicho procedimiento consista esencialmente en procurar que aparezca y/o en introducir un alelo de elF4E asociado a la resistencia (o a la sensibilidad) a dicho potyvirus en el genoma de estas plantas. Según un modo de aplicar este procedimiento, la aparición del alelo de resistencia está provocada por la aplicación de un método seleccionado en el grupo que incluye: mutagénesis, de forma favorable "Tilling", recombinación homologa, sobre-expresión, inserción/deleción, "gene silencing" / transgénesis, y sus combinaciones. Las herramientas que pueden utilizarse en dicho procedimiento no biológico de obtención también forman parte de la presente invención. La presente, invención también tiene como objeto cualquier unidad genética construida que incluya un polinucleótido, en conformidad con la investigación , que codifique para una proteína elF4E muíante," colocada bajo el dominio de elementos adecuados de control de la transcripción y, eventualmente, de la traducción. La mencionada proteína elF4E muíante se puede , elegir entre las variantes de las secuencias SEQ ID NO: 22 o 23 asociadas a la resistencia a los potyvirus. La presente invención también tiene como objeto cualquier unidad genética construida caracterizada por incluir: al menos una herramienta genética A/ y/o B/ tal y como se define más arriba, y/o al menos una secuencia nucleotídica elegida dentro del grupo que incluye todas o parte de las siguientes secuencias: SEQ ID NO: 6 SEO. ID NO: 8 y/o al menos una secuencia nueleotídica que codifique para el factor elF4E e incluya al menos un sitio de restricción Mvnl y/o TspRI y, de forma preferente, al menos un sitio de restricción que corresponda a la secuencia sentido: CGACG y a la secuencia antisentido: GCAGC y/o un sitio de restricción que corresponda a la secuencia sentido: NNCASTGNNA y a la secuencia antisentido: ANNGTSACNN. Otra herramienta de transformación genética tratada en la invención está constituida por todo vector de transformación de células vegetales que al menos incluya una unidad genética construida tal y como se indica más arriba. Puede tratarse de cualquier vector de clonación conocido y adecuado (fagos / plásmídos / cósmidos, etc). En la invención también se investigan las células vegetales y los microorganismos transformados con al menos un vector o al menos una unidad genética construida como se define más arriba. A un nivel superior, la invención engloba las plantas transformadas con al menos un vector y/o al menos una unidad genética construida y/o células vegetales transformadas y/o microorganismos transformados, tal y como se han descrito anteriormente. El especialista conoce bien todas las técnicas directas o indirectas de modificación genética. En los ejemplos siguientes se proporcionan otros detalles complementarios.

DESCRIPCIÓN DÉ LAS FIGURAS La Figura 1 representa el ge! que se obtiene de un análisis por southern blot y que muestra las diferencias de los perfiles del marcador elF4E de resistencia a los potyvirus, observadas con diferentes pimientos sensibles o resistentes. El ADN genómico de pimiento se digiere con la enzima EcoRI y se híbrida con el cADN elF4E de tabaco - SEQ ID NO: 2 -(ejemplo 3). La Figura 2 representa el gel que muestra las amplificaciones por P.CR del gen elF4E implicado en la resistencia a los potyvirus en el pimiento y establece un sitio de restricción MvnI diferencial entre sensible y resistente (ejemplo 4). La Figura 3 representa la alineación de la secuencia proteica de elF4E de diferentes variedades de pimiento, sensibles o resistentes a los potyvirus. La Figura 4 representa la alineación de la. secuencia proteica de elF4E de diferentes variedades de tomate, sensibles o resistentes a los potyvirus.

EJEMPLOS: Ejemplo 1: Obtención de las sondas de tomate y pimiento Los cADN de tomate y pimiento se obtienen por la técnica de 3' y 5' RACE (System for Rapid Amplificación df cADN Ends, comercializada por la sociedad Invitrogen™) a partir de la extracción de ARN total de tomate y de pimiento, con cebadores degenerados definidos sobre una alineación de las secuencias de elF4E de tabaco, tomate y Arabidopsis. La parte 3' del cADN se clona por 3'RACE. Los cebadores definidos entre el TAG y la cola poiya de las secuencias obtenidas por 3'RACE se utilizan para obtener los cADN completos por 5'RACE. Cebadores utilizados en las dos etapas de la 3'RACE: Etapa 1 : TCTAGATACAAYAATATCCAYCACCCAAGCAA = SEQ ID NO: 1 0 Etapa 2: TCTAGATGGGRGCAGACMCAYTGM= SEQ ID NO: 1 1 Los cebadores utilizados para las tres etapas de la 5'RACE se muestran en la siguiente Tabla 1 : TABLA 1 Ejemplo 2: Prueba de hibridación y de selección de las plantas resistentes a los potyvirus (resistencia controlada por el locus pvr2/pvr1/pvr5) Extracción del ADN dé las plantas a analizar La extracción del ADN de las plantas (Solanáceas, Cucurbitáceas, Cruciferas y Compuestas) sigue el protocolo de extracción estándar basado en el protocolo de micro-extracción de ADN de Fulton et Tanksley, 1 995.

Digestión del ADN y separación en gel de agarosa El protocolo que se sigue utiliza 2.5U de enzima / µg de ADN.

El volumen enzimático debe ser inferior al 1 0% del volumen de reacción. El volumen de reacción se calcula en función del tamaño del pocilio: depende del tipo de cubeta y de peine utilizados y del volumen del gel (en general, 300 mi). El volumen del tampón específico de la enzima y de espermidina deben ser, cada uno, el 10% del volumen de reacción: x µ? ADN 1 X tampón 1 X espermidina (4 mM) 2, 5 U de enzima / µg de ADN - qsp H20 volumen de reacción La digestión se efectúa a 37°C durante toda la noche. En paralelo, se preparan muestras de lagos , digeridas por Hind III.-0, 5µg/pocillo. Posteriormente, se comprueba la correcta digestión de los ADN en gel de agarosa 1 %, TAE IX con 1 µ? de producto de digestión. Si la digestión es correcta, se añade entonces el tampón de carga. El tampón de carga debe representar al menos el 1 0% del volumen total (o 20%). A continuación, el depósito se eféctúa sobre un gel de 300 mi, NEB 1 X, 1 % de agarosa que contenga 10 µ? de BET. La migración se realiza a 25V durante 24h en tampón NEB IX (detener la migración a 2 cm del borde del gel).

Transferencia a una membrana de nylon Se cortan una membrana Hybond N+ y papel Wattman con el tamaño del gel. En una cubeta plana que contenga IL de HCI 0.25N , se sumerge el gel en el líquido durante 30 min. con agitación (el azul se vuelve amarillo). Durante este tiempo, se prepara el blotter: mojando una hoja de papel Wattman en SSC 2X y colocándola sobre la placa porosa del blotter, mojando la membrana y colocándola sobre el Wattman que se cubrirá con la estructura de plástico. El gel se aclara en una cubeta que contenga H20 destilada, y a continuación se coloca sobre la estructura del blotter evitando las burbujas y comprobando la estanqueidad del sistema. El blotter se inicia a 50 mb máx. Se añade sobre el gel un poco dé sosa 0,4N. Se colocan dos esponjas empapadas con sosa sobre el gel, que sé cubrirá de sosa hasta la saturación. La transferencia se efectúa en 2h a 3h. Las membranas se aclaran en un baño de SSC 2X durante 10 a 1 5 min y posteriormente se secan al aire libre y se mantienen en estufa 2h a 80°C.

Preparación de las sondas La preparación de las sondas por mareaje por PCR con 32P se refiere a sondas de 3 kb como máximo, atnplificadas por PCR o directamente sobre plásmidos, que permitan mostrar bandas importantes para una sonda de concentración entre 1 y 5 ng/µ?. Las condiciones de reacción se resumen en la siguiente Tabla 2.

TABLA 2 *: Mix (ATG 50µ??^???5µ?) para mareaje de las sondas RFLP por PCR. Dilución de dATP, dTTP, dGTP a 10 mM, a partir de soluciones madre 100 mM: 5 µ^??? 100 ?t?? 45 µ? H20 Dilución de dCTP 1 mM, a partir de la solución madre 100 mM: 0,5µ? dCTP a 100mM 49,5 µ? H20 Mix ATG + DCTP: 2,5 µ? dATP 10 mM concentración final: 50µ? 2,5 µ? dTTP 10 mM concentración final: 50µ? 2,5 µ? dGTP 10 mM concentración final: 50µ 2,5 µ? DCTP 1 mM concentración final: 50µ? 490 µ? H20 El mareaje de las sondas se realiza con 30 ciclos PCR de: 30 seg a 94°C 45 seg á 52°C 1 min 30 seg a 72°C Una vez marcadas, las sondas se desnaturalizan según el siguiente protocolo: añadir cada sonda en un tubo que contenga 160 µ? de NAOH 0,8 N + 2 a 5 µ? de Lambda marcado (por random priming) incubar 5 min neutralizar con 200µ? deTris HCf 1 M Hibridación Protocolo según Church et Gilbert, (1984) a-Prehibrídación a 65" C toda la noche Se utilizan 20 mi de tampón de hibridación* por tubo para 2 a 6 semiblots. Con 25 mi de tampón, no pasar de 10 semiblots por tubo; Las membranas se humidifican en una caja que contenga tampón de hibridación antes de escurrirlas ligeramente y enrollarlas (todas juntas) y ponerlas en el tubo. Durante la prehibridación comprobar que los tubos son estancos:y que las membranas se desenrollan bien, si no es así cambiar ei sentido. 'composición del tampón de prehibridación y de hibridación: Para 500 mL: 21 ,91 g NaCI; 18,38 g Na Citrato; 380 mL H20; 15 mL SDS 20%; 25 mL NaP04 1 M pH 7,5; 25 mL Denhardt 1 00X; 5 mL EDTA 0.25M; 50 mL Dextran sulfato 50%. b-Hibridación a 65*C al menos 16 horas Se deja que disminuya la temperatura de los tubos antes de abrirlos para no mojar el paso de rosca. Se añade la sonda desnaturalizada (5 min en NaOH 0,8 M y parada de la desnaturalización con Tris-HCI IM). En estas condiciones, la hibridación puede durar 48 o 72 horas. c- Lavados Las cajas (o cubetas) se lavan con exceso de tampón (1 % SDS (Serva) 40mM NaPi precalentado a 65°C. Pára aproximadamente 5-10 semimembranas: 1 lavado de 20 min a 65°C con agitación. Para lavar, transferir membrana a membrana a una nueva cubeta que contenga tampón precalentado. Los tampones de lavado radioactivos (al menos los 2 primeros) se echan en un bidón previsto al efecto. 1 aclarado de 2-3 min. en un tampón nuevo y calentado a 65°C. d- Exposición Las membranas se escurren sobre un lecho de papel absorbente compuesto por una superficie de papel azul recubierto de papel blanco en rollo tipo; no deben secarse. A continuación se introducen en bolsitas de plástico para la exposición, y se colocan en un cassette con 1 pantalla intensificadora. Según la señal medida con el contador Geiger, se exponen a -80°C desde una noche hasta varios días. e- Deshibridación de las membranas antes de la rehibridación Las membranas se deshibridan en una solución 0, 1 % SDS 1 mM EDTA calentada a 80°C (1 litro para 40 semi-membranas) durante 20 min a temperatura ambiente. Las membranas se aclaran a continuación 10 min. en una solución 2X SSC. Por último, las membranas se escurren y se guardan húmedas en bolsitas de plástico a 4°C.

Ejemplo 3: Correlación entre la resistencia a los potyvirus y elF4E El material vírico empleado en estas pruebas de infección son los aislados N-605 del PVY obtenidos a partir de Solanum tuberosum, fJakab eí al., 1 997), o PVY-LYE84, o PVY-LYE240r para el tomate (Legnani et al., 1995) y los aislados PVY-To72, PVY-SÍI5 para el pimiento (Dogimont et al. , 1 996) así como el aislado CAA-1 0 del TEV (Légnani eí al, 1996). También se utiliza el mismo protocolo para todos los demás aislados de PVY y de TEV que están controlados por los locus pvr2/pvr1/pvr5 y/o pot-1. Los aislados se mantienen según el procedimiento Bos (Bos, 1 969) y se multiplican sobre plantas de Nicotiana tabacum cv. Xanthii antes de la inoculación dé las plantas de tomate o de pimiento en el estadio cotiledones con dos hojas expuestas. El inoculo vírico se prepara como se describe en los artículos de Légnani et al. (1 995, 1 996) y de Dogimont et al. (1 996). Los cotiledones y las dos primeras hojas de las plantas se inoculan mecánicamente. Las líneas se evalúan bajo condiciones controladas en cámara de cultivo (14 horas de día, 1 8°C noche y 24°C día) para seguir su reacción tras la inoculación. Cuatro semanas después de la inoculación , todas las plantas se evalúan individualmente sobre la presencia o ausencia del antígeno de cápside del PVY o del TEV por el ensayo ELISA (Enzima Linked Immunosorbent Assay) como describe Légnani et al., (1 995, 1 996) y Dogimont ef al. (1 996). Para la inoculación mecánica de potyvirus a las plantas pueden utilizarse otros muchos protocolos existentes , y perfectamente conocidos por los especialistas. El gel que se presenta en la Figura 1 anexa muestra la diferencia de perfiles observada entre el marcador. elF4E y la resistencia a los potyvirus controlada por el locus pvr2. Esta co-segregación completa entre la resistencia a los potyvirus y una copia del gen elF4,E se ha observado en la segregación de la descendencia en más de 500 plantas. El ADN genómico de pimiento se digiere con la enzima EcoRI y se híbrida con él cADN elF4E de tabaco - SEO. ID NO: 2 - (se obtienen los mismos perfiles RFLP por hibridación con el cADN de tomate que con el cADN de pimiento). Las plantas sensibles (S) preséntan el fragmento de restricción de 7 kb "bajo" mientras que las plantas resistentes (R) poseen los fragmentos de restricción de 7 kb "alto". Las plantas heterocigotas (Ht) presentan los dos fragmentos de restricción y son sensibles (puesto que el gen es recesivo).

Ejemplo 4: Obtención de mutaciones de e-IF4E asociadas a la resistencia a los potyvirus 1 ) Obtención de los sitios de restricción diferenciales entre las copias de un genotipo de pimiento sensible a los potyvirus y de un genotipo resistente.

Mediante las técnicas de secuenciación clásicas, se han observado mutaciones puntuales entre el gen elF4E de la variedad de pimiento "Yolo Wonder" (sensible al potyvirus y portador del alelo pvr2*) y el de la variedad de pimiento "Yolo Y" (resistente a los potyvirus y portador del alelo pvr2+). Así, en la posición 200, ia secuencia SEQ ID NO: 6 codificadora del elF4E en Yolo Wonder presenta una T mientras que la secuencia SEQ ID NO: 8 codificadora del elF4E en Yolo Y presenta una A. Igualmente, en la posición 236, la secuencia codificadora de Yolo Wonder presenta una T mientras que la secuencia codificadora de Yolo Y presenta una G. La primera mutación puntual corresponde a un sitio de restricción TspRI (o sus isosquizómeros) que sólo existe en Yolo Wonder. Este sitio de restricción diferencial se ha validado mediante PCR en el cADN de Yolo Wonder y Yolo Y: definición de cebadores en 5' y en 3' del cADN y digestión del producto amplificado por PCR por la enzima TspRI. (Mismo protocolo que el posterior para la enzima Mvnl, excepto que para esta enzima la digestión se realiza a 70°C). La segunda mutación puntual corresponde a un sitio de restricción Mvnl (o sus isosquizémeros) que sólo existe en Yolo Y. Éste sitio de restricción diferencial se ha validado mediante PCR en el cADN de Yolo Wonder y Yolo Y: definición de cebadores en 5' y en 3' del cADN y digestión del producto amplificado por PCR por la enzima Mvnl. Reacción de PCR sobre el cADN: Cebador sentido: AAA AGC ACA CAG CAC CAA CA - SEQ ID NO: 1 8 Cebador antisentido: TAT TCC GAC ATT GCA TCA AGA A = SEQ ID NO: 1 9 Las condiciones de reacción se resumen en la siguiente Tabla 3. TABLA 3 Digestión con la enzima Mvnl- 8 µ? de producto PCR + 2 U de enzima + 1 , 3 µ?_ de tampón de la enzima + 1 3, 5 µ? H20 2h a 37°C. Migración sobre gel de agarosa 1 ,2% TAE IX. El gel que se presenta en la Figura 2 anexa muestra las amplificaciones por PCR del gen elF4E implicado en la resistencia a los potyvirus en el pimiento y muestra un sitio de restricción Mvnl diferencial entre sensible y resistente. Banda 1 : • producto amplificado por PCR del gen elF4E del pimiento Yolo Wonder sensible (S) al potyvirus - alelo pvr2+- · y ausencia de digestión enzimática por Mvnl. Banda 2: • producto amplificado por PCR del gen elF4E del pimiento Yolo Y resistente (R) al potyvirus - alelo pvr21 • y obtención del sitio de restricción Mvnl. Banda 3: • Marcador de tamaño 1 kb ladder. 2) Observación de las mutaciones de elF4E asociadas a la resistencia a los potyvirus.

La secuenciación del gen elF4E de diferentes variedades de pimiento sensibles o resistentes a los potyvirus ha demostrado la existencia de mutaciones, asociadas a ia resistencia a los potyvirus, en la misma región de elF4E. La alineación de la secuencia proteica de elF4E de estas diferentes variedades se representa en la Figura 3. Leyenda de la figura 3: YW = Yolo Wonder S / pvr2+ DDL = Especie Doux Long des Landes S / pvr2+ PM1 008 = Resistente al PVY(O) YY = Yolo Y / pvr21 Avelar = alelo pvr21 Vania = alelo pvr21 PM994 = Resistente al PVY(O) Florida VR2 = Florida 1 pvr22 C69 = linea UD obtenida del híbrido F1 entre CM334 y Yolo Wonder / pvr5 CM334 = Criollo de orelos 334 / pvr5 PM1014 = Resistente al PVY(O) Per = Perernial / resistencia parcial (QTL) al locus pvr2 Subrayado negrilla = mutación común a todos los resistentes excepto PM1008 Marcado en gris = mutación específica del alelo pvr21 Negrilla no subrayada = mutación específica del alelo pvr22 Subrayado sin negrilla = mutación específica del alelo pvr5 Marcado negro = mutación específica del genotipo PM1 008. Estas diferentes variantes también están representadas en la secuencia SEO. ID NO: 22 Ejemplo 5: Demostración de la sintenia entre pimiento y tomate para los genes recesivos de resistencia a los potyvirus (gen pot-i en el tomate y locus pvr2 en el pimiento) En el genoma del pimiento se han cartografiado cinco genes importantes y varios QTL implicados en la resistencia a los potyvirus. Gracias a la utilización de sondas RFLP comunes para cartografiar el genoma y gracias a la alta conservación en el orden de ios marcadores entre el genoma del tomate y el del pimiento, ios factores de resistencia a los potyvirus del pimiento se colocan en el mapa del tomate. En la Tabla 4 se incluye la localización de los loci de resistencia a los potyvirus del pimiento en los cromosomas del tomate así como la de los marcadores RFLP relacionados, junto con las referencias originales. Para establecer con precisión la correspondencia entre las regiones genómicas del pimiento y del tomate con los genes de resistencia a los potyvirus, los marcadores RFLP TG1 35 y Cab3 se añaden al mapa preexistente de ligamiento genético del pimiento (Lefebvre et al, presentado).

TABLA 4 para cada gen únicamente se indica él espectro general de resistencia; algunos de estos genes de resistencia pueden estar afectados por cepas virulentas. "los marcadores RFLP se obtienen utilizando aleatoriamente ADÑ genómico de tomate (TG) o sondas ADNc de epidermis dé hoja de tomate (CD y CT) cnd = no determinado a- Mareaje AFLP y RFLP de¡ gen pot-1 El ADN total se extrae a partir de aproximadamente 1 g de hojas frescas de plantas F2 (Caranta et al. , 1 997). Las muestras de ADN de 6 plantas F2 (obtenidas de la autofecundación del híbrido Fl entre Lycopersicon esculentum Mospomorist y L. hirsutum P1247Ó87) (pot- 1* /pot- 1*) que hayan producido familias F3 completamente sensibles al PVY cepa N 605 y las muestras de ADN de 9 plantas F2 que hayan producido familias F3 completamente resistentes al potyvirus se agrupan para efectuar un análisis de grupos de segregantes (bulked segregeant analysis) y para un etiquetado AFLP de pot-1. Los marcadores AFLP se obtienen según el protocolo de Vos ef al. (1 995) con las enzimas de restricción EcoR1, Hindlll, y Msel. La primera amplificación se realiza utilizando una combinación de cebadores con un único nucleótido selectivo y una segunda combinación con 3 nuelcótidos selectivos. Los marcadores AFLP relacionados con pot-1 se cartografian sobre líneas de introgresión de L. hirsutum en L. esculentum (Montforte and Tanksley, 2001 ) para asignar pot-1 a un cromosoma del tomate. La asignación se valida con la cartografía de marcadores RFLP localizados en el cromosoma blanco. El procedimiento RFLP está descrito por Saliba-Colombani et al. (2000). ' El cribado del polimorfismo entre Lycopersicon esculentum Mospomorist (sensible a los potyvirus) y L. hirsutum P1247087 (resistente a los potyvirus) se realiza con 3 enzimas de restricción (EcoRI, Hindlll y Xbal) y marcadores RFLP previamente cartografiados en el tomate (CT, ADNc de tomate derivado del ARNm de tejido epidérmico de tomate, TG, clones de ADN genómico de tomate; la sonda CAB3 que codifica para un polipéptido relacionado con la clorofila a y b, Tanksley et al. , 1992). Este cribado permite cartografiar marcadores suplementarios sobre el cromosoma 3. El análisis de segregación para los marcadores moleculares (AFLP, RFLP) y para los datos de resistencia se analizan con el programa Mapmaker/Exp Y. 3.0 con un Lod mínimo de 4.0 y un porcentaje de recombinación máximo de 0, 3. El porcentaje de recombinación se convierte entonces en distancia de cartografía en centimorgans (cM) utilizando la función de cartografía Kosambi (Kosainbi, 1944). Estos resultados permiten localizar el gen pot-1 de resistencia al PVY en el tomate sobre el cromosoma 3 y demostrar que este gen está encuadrado por los mismos marcadores RFLP que el locus pvr2 en el pimiento. b- Cartografía de elF4,E en el tomate Paralelamente, el cADN elF4E de tomate se cartografía por el método RFLP descrito anteriormente sobre las líneas de introgresión de L. pernnellii en L. esculentum (Eshed and Zamir, 1995). Este trabajo ha permitido localizar 5 copias del gen elF4E en el tomate. Una de estas copias se localiza en el cromosoma 3, en la misma región genómica que el gen pot-1, lo que confirma la sintenia entre pimiento y tomate para la resistencia a los potyvirus y, por tanto, la posibilidad de utilizar elF4E como marcadores y herramientas de selección de la resistencia. Esta demostración de sintenia entre el pimiento y el tomate para los genes recesivos de resistencia a los potyvirus permite decir que si elF4E es el gen de resistencia en el pimiento, elF4E es también el gen de resistencia en el tomate. c- Clonación de un gen elF4E de tomate asociado a la resistencia a lo s potyvirus.

Según el método 3' y 5" RACE PCR descrito en el ejemplo 1 , en el tomate se ha aislado y clonado el ADNc de un gen elF4E de tomate similar al aislado en el pimiento; este gen se denomina elF4E-2. La secuencia que codifica en este gen (variedad Mospomorist' de L. Esculentum, sensible a PVY y a TEV) está representada en la lista de secuencias con el número SEQ ID NO: 2. Mediante técnicas de secuenciación clásicas, se han obtenido las mutaciones puntuales entre el gen elF4E-2 de los genotipos de tomate L. esculentum 'Mospomorist' y L. hirsutum P1 1 34417 (sensibles a PVY y a TEV) y el del genotipo L. hirsutum P1247087 (resistente a PVY y a TEV, resistencia controlada por el gen recesivo pot- 1). En la Figura 4 se representa la alineación de secuencias.

Leyenda: Mospo=Mospomorist; PI 13=PI 1 3441 7 ; P 124=PI247087 En negrilla y subrayado: mutación observada sólo en P1247087; En negrilla no subrayado: mutación interespecífica entre L. esculentum y L. hirsutum. La protetna elF4E de L. hirsutum Pl 134 17 y la de L. hirsutum P1247087 también están representadas por la secuencia SEQ ID NO: 23.

Ejemplo 6: Cribado del banco BAC del genoma del pimiento con cebadores definidos sobre la secuencia codificadora elF4E del genotipo Yolo Wonder, demostración de la co-segregación con la resistencia y determinación de la estructura genómica del gen elF4E que cosegrega con pvr2.

Se ha construido un banco BAC de pimiento a partir de una línea haploide duplicada HD208 obtenida del híbrido Fl de un cruce entre Capsicufn annuum Yolo Wonder y C. annuum Perenial. HD208 contiene el alelo dominante de sensibilidad pvr2+. El ADN de alto peso molecular se ha extraído según el método descrito en http://www.negr.org/research/jag/papersOO/paper300/indexpage300.htMI. Posteriormente, el ADN se digiere parcialmente y se separa con tres enzimas de restricción (EcoRI, BamHI et Hindlll) para aumentar la representatividad del conjunto del genoma. El ADN digerido se clona en el vector PCUGIBAC I. El banco BAC de pimiento está compuesto por 239 232 clones con un tamaño medio de inserción de 125kb, lo que corresponde a una representatividad teórica de 1 0 equivalentes genoma (tamaño del genoma del pimiento 3000 Mpb). Este banco BAC se ha organizado en 623 grupos de ADN para un cribado por PCR (1 grupo está formado por la mezcla de ADN de 384 clones). Los siguientes cebadores se definen sobre la secuencia codificadora de 6IF4E de Yolo Wonder: Piml:5' AGA CTT TCA TTG TTT CAA GCA TAA3' = SEQ ID NO: 20 Pim4:5' GAT TAG AAA GTG CAA ACA CCA ATA C 3' = SEQ ID NO:21 Este par de cebadores amplifica sobre el cADN una banda de 493 pb y sobre el ADN genómico de HD208 una banda de 1800 pb. Este par de cebadores se ha utilizado para cribar el banco BAC de pimiento. Se han identificado cuatro clones BAC con una banda de 1800 pb (Clones 27-BI, 5 -2H, 1 1 1 -4H y 184-4H). Estos cuatro clones BAC se han digerido con EcoRI y los perfiles de restricción muestran que se solapan y por tanto corresponden a un mismo locus. Todos los clones BAC muestran una banda EcoR-1 de 7 kb que se ha clonado en un vector pGEM3Zf. Esta banda de 7kb, obtenida por digestión EcoRI , corresponde a la que co-segrega con la sensibilidad a los potyvirus (ver ejemplo 3). (1 s clon 27-BI; 2 = clon 5-2H; 3 = clon 1 1 1 -4H; 4 * clon 184- 4H) La presencia de¡ producto amplificado de 1800 pb en este · fragmento de 7 kb confirma que estos cuatro clones BAC tienen el gen elF4E correspondiente al cADN clonado. La secuenciación de esta inserción de 7 kb permite definir el tamaño del gen que es 5500 pb, y definir la estructura exón/intrón: 5 exones y 4 intrones.

Ejemplo 7: Experiencia de expresión transitoria del cADN elF4E de Yolo Wonder en un genotipo de pimiento resistente (portador del alelo pvr21) para la validación del papel de elF4E en la sensibilidad a los potyvirus.

Para validar la hipótesis de que el alelo de sensibilidad pvr2+ corresponde al gen elF4E de Yolo Wonder, se realizan unos ensayos de expresión transitoria del cADN elF4E de Yolo Wonder vía un vector vírico PVX (Potato Virus X) (Chapman et al. , 1992) en un genotipo resistente Yolo Y, portador del alelo pvr21. El cADN elF4E obtenido del genotipo sensible Yolo Wonder se clona de forma orientada en un vector de expresión PVX-CES-35S en el sitio de clonación Clal y Salí. El genotipo resistente (portador del alelo pvr21) Yolo Y se coinocula con este plásmido recombinante y con el patotipo 0 del Potato Virus Y (PVY). La expresión transitoria del gen elF4E obtenido del genotipo sensible Yolo Wonder vía el vector PVX recombinante permite al PVY multiplicarse en el genotipo resistente. El PVY se detecta por el método ELISA o RT-PCR (Legnani et al. , 1995, 1996, Dogimont et al. , 1996). Los dos genotipos de C. annuum Yolo Wonder y Yolo Y que han recibido el plásmido recombinante son sensiblés al PVY: el virus se detecta por ELISA y RT-PCR en hojas inoculadas y en hojas sistémicas 1 0 días después de la inoculación . De la misma forma, los alelos elF4E obtenidos de Yolo Wonder y Yolo Y, ambos sensibles a TEV (Tobacco etch virus), se han expresados en un genotipo de pimiento resistente a TEV: Florida VR2. Se observa que esta expresión permite la multiplicación del TEV (detectada por ELISA y RT-PCR) en este progenitor resistente. El cADN elF4E-2 de tomate obtenido a partir , de la variedad Mospomorist (que tiene el alelo de sensibilidad SEQ ID NO: 4) también se ha expresado según el mismo protocolo en el genotipo de pimiento resistente Yolo Y. Igualmente, se observa la recuperación de la sensibilidad al PVY de los pimientos Yolo Y que expresan el CDNA elF4E-2 de tomate. Estos resultados confirman la implicación de elF4E en la sensibilidad a diferentes potyvirus, y también muestran que este sistema funciona en heterólogo (gen del tomate que funciona en el pimiento).

Ejemplo 8: Estudio de mutantes en el gen elF4E y en los genes del complejo de iniciación de la traducción de los ARN para la creación de plantas resistentes a los potyvirus.

Los miembros de la familia multigénica elF4E pertenecen a un complejo de al menos 8 proteínas que forman el complejo de iniciación de la traducción en las células eucariotas (Broaming 1996). La identificación y la caracterización de mutantes en elF4E y en los otros genes del complejo de iniciación de la traducción para la creación de plantas resistentes a los potyvirus se desarrolla en 4 etapas y utiliza un sistema de TILLING (Targeting Induced Local Lesi ns IN Genomes, McCallum ef al., 2000): (1 ) Producción de una colección de mutantes de tomate por mutagénesis química. El genotipo elegido es, un microtomate, Lycopersicon esculentum Mierotom, que presenta unas características biológicas interesantes (Meissner et al. , 2000): sensible a los potyvirus (PVY, TEV y PVMV), crecimiento en alta densidad (1 000 plantas/m2) y tiempo de generación de 3-4 meses. Las mutaciones se obtienen por mutagénesis química con etil-metil sulfonato (EMS) (Koomneef et al. , 1 982): mutagénesis en 30.000 granos, siembra de mutantes y fabricación de la generación M2 a partir de 5000 plantas MI. (2) Extracción de ADN de 20 plantas por familia M2 y constitución de pools de ADN en 3 dimensiones a partir de una población de 1 00.000 plantas M2 (5000 familias). (3) Amplificación por PCR de los genes blanco y estudio de las mutaciones por MPLC desnaturalizante. Las secuencias de los genes implicados en el complejo de iniciación de la traducción están disponibles en http://www.tigr.org/tdb/lgi. Posteriormente, los productos de la PCR se desnaturalizan y se aparean para permitir la formación de heterodúplex. A continuación, las mutaciones se detectan bien por HPLC desnaturalizante (McCallum et al., 2000) bien por una enzima que permite la detección de los "mismatch" en los heterod-úplex (enzima CELI , Oleykowski et al., 1998). (4) Caracterización de los mutantes para evaluar su comportamiento frente a los potyvirus: paso de un fenotipo sensible a un fenotipo resistente. El procedimiento de inoculación y de detección de los potyvirus (Potato virus Y, Tobacco etch virus, Pepper veinal mottle virus) es idéntico al descrito en el ejemplo 3.

Ejemplo 9: Creación de plantas resistentes a los potyvirus mediante métodos que puedan implicar la transgénesis.

De manera alternativa al ejemplo 8, el alelo de resistencia del gen elF4E (identificado aquí en el pimiento) o cualquier otro alelo de elF4E que confiere la resistencia a los potyvirus (identificada en los ejemplos 1 a 8) puede transferirse in planta mediante métodos de tipo mutagénesis dirigida (Hohn et al., 1999), recombinación homóloga (Kempin et al., 1997) o mediante métodos de sobre-expresión. En las experiencias de sobre-expresión , el alelo de elF4E que confiere la resistencia se expresa bajo un promotor fuerte de tipo 35S del virus CaMV por transgénesis in planta (Jones et al., 1992; Bevan 1984). También se pueden crear plantas resistentes por knock-out del gen &IF4E endógeno mediante métodos de tipo "gene silencing" (Post Transcriptiormal Gene Silencing) y la expresión simultánea por transgénesis de la forme de elF4E que confiere la resistencia a los potyvirus. Se puede realizar un knock-out específico por PTGS digiriéndolo contra el 5'UTR del gen elF4E endógeno; la forma de elF4E que confiere la resistencia expresada por transgénesis no incluye la secuencia 5' UTR del elF4E endógeno. Esta especificidad del knock-out por PTGS frente a los 5' UTR se basa en los nuevos datos obtenidos de ia comprensión del mecanismo de PTGS (Nishikura 2001 ).

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Claims (31)

REIVINDICACIONES

1. Procedimiento de selección de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracteriza por detectar en las plantas a estudiar: la presencia o la ausencia de una proteína elF4E (denominada posteriormente: «proteína elF4E de tipo salvaje») que comprende una región definida por la siguiente secuencia (I) DX1X2X3X4KSX5QX6AWGSSX7RX8X9YTFSX1oVEX11FWX12X13YNNIHX14PSKL X15X16GAD en la que: Xli X?. ß, ?· ? ß, X7, ?ß? ?9. ???? Xl2, Xl3, Xl5, V ?6 representan cada uno un aminoácido neutro; X5 y X14 representan un aminoácido básico; X11 representa un aminoácido ácido; - D, K, S, Q, A, W, G, R, Y, T, F, V, E, N, I, H, P, y L tienen su significado habitual en el código de 1 -letra, o una secuencia nucleotídica que codifica para la mencionada proteína; la presencia o la ausencia de una proteína elF4E muíante que comprende una región derivada de la definida por la secuencia (I), por sustitución de al menos un aminoácido neutro de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta, o de una secuencia que codifique para la mencionada proteína; y la selección de las plantas donde se detecta una proteína elF4E mutante o una secuencia nucleotídica que codifique para la mencionada proteína, y donde no se detecta la proteína elF4E de tipo salvaje ni la secuencia que codifica para la mencionada proteína.

2. Procedimiento de selección de plantas que se puedan utilizar paré la obtención de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracterice por detectar en las plantas a estudiar la presencia o la ausencia de una proteína elF4E mutante tal y como se define en la reivindicación 1 , o de una secuencia que codifique para la mencionada proteína, y la selección de las plantas donde se detecta la mencionada proteína elF4E mutante o una secuencia que codifique para la mencionada proteína.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, que se caracterice porque la mencionada proteína elF4E mutante incluya una región derivada de la definida por la secuencia (I), por: a) sustitución de al menos uno de los aminoácidos Xi , X2, X3 o X ) de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado, y b) sustitución de al menos uno de los otros aminoácidos neutros de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido cargado y/o sustitución de al menos un aminoácido cargado de la mencionada secuencia (I) por un aminoácido neutro o un aminoácido de carga opuesta.

4. Utilización de una herramienta de selección elegida entre: a) un polinucleótido que codifique para una proteína elF4E de tipo salvaje o muíante, tal y como se definen ' en las reivindicaciones 1 o 3; b) un polinucleótido complementario del polinucleótido a); c) un fragmento de al menos 1 0 pb de un polinucleótido a) o hipara la selección de plantas resistentes a los potyvirus.

5. Utilización según la reivindicación 4, que se caracterice porque las plantas seleccionadas formen parte del grupo de las solanáceas, del grupo de las cruciferas, del grupo de las compuestas y/o del grupo de las cucurbitáceas.

6. Utilización según la reivindicación 5, que se caracterice porque las plantas seleccionadas sean solanáceas.

7. Utilización según la reivindicación 4, que se caracterice porque la mencionada proteína elF4E se elija entre: la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID 0: 3; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 5; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ÍD NO: 7; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 9; el grupo de proteínas representado por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 22; - el grupo de proteínas representado por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 23;

8. Utilización según la reivindicación 4, que se caracterice porque dicho polinucleótido se elija entre: - el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 2; el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 4; el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 6; el polinucleótido de secuencia SEQ ID NO: 8; así como sus complementarios, o los fragmentos de al menos 10 pb de dichos polinucleótidos o complementarios.

9. Procedimiento de selección de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracterice porque: se digiere el ADN extraído de una planta a ensayar con una enzima de restricción adecuada; se desnaturaliza el ADN digerido; se pone el mencionado ADN desnaturalizado en presencia de una sonda compuesta por un polinucleótido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 a 8, previamente provisto de al menos un marcador, de forma que se efectúe la hibridación entre dicho polinucleótido y dicho ADN; se elimina el ADN y la sonda no hibridada; se revela la hibridación con la ayuda del marcador; se seleccionan las plantas que presenten un perfil de hibridación correspondiente a la co-segregación del blanco hibridado con la sonda marcada y del alelo de resistencia o de sensibilidad, efectuándose la distinción entre las plantas sensibles y las plantas resistentes por la diferencia de tamaño de los fragmentos hibridados.

1 0. Procedimiento según la reivindicación 9, que se caracteriza porque la enzima de restricción utilizada es EcoRI.

1 1 . Procedimiento de selección de plantas resistentes a los potyvirus, que se caracteriza porque: se amplifica por PCR la secuencia codificadora del gen elF4E, a partir del ADN de la planta a estudiar; se digiere el producto de amplificación con una enzima de restricción adecuada; se separan los posibles fragtnentos obtenidos, y se seleccionan las plantas resistentes o sensibles según el perfil de restricción del producto de amplificación.

1 2. Procedimiento según la reivindicación 1 1 , que se caracteriza porque las plantas sensibles a los potyvirus pueden detectarse por un perfil de restricción en el que aparezca la presencia de un sitio de corte por la enzima TspRI o uno dé sus isosquizómeros y las plantas resistentes a los potyvirus pueden detectarse por un perfil de restricción en el que se muestra la ausencia de dicho sitio de corte por TspRI o uno de sus isosquizómeros y la presencia de un sitio de corte por la enzima Mvnl o uno de sus isosquizómeros.

1 3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 1 o 12, que se caracterice porque la amplificación por PCR de la secuencia codificadora del gen elF4E, se eféctúa empleando como cebadores los oligonucleótidos SEQ ID NO: 1 8 y SEQ ID NO: 1 9.

14. Polinueleótido que codifica para una proteína elF4E mutante tal y como se define en alguna de las reivindicaciones 1 o 3.

15. Polinueleótido según la reivindicación 14, que sé caracterice porque está representado por la secuencia SEQ ID NO: 8

16. Polinucleótido que se pueda utilizar como cebador para lá amplificación por PCR de una secuencia que codifica para una proteína elF4E de planta, que se caracterice por estar elegida de entre el grupo definido por las siguientes secuencias: - SEQ ID NO: 1 8 SEO. ID NO: 1 9.

17. Kit para obtener un procedimiento según la reivindicación 1 1 , que se caracterice por incluir: - al menos una enzima de restricción elegida entre: a) una enzima que reconozca un sitio de restricción I presente en al menos un alelo de elF4E asociado a la sensibilidad a los potyvirus, y ausente en los alelos de elF4E asociados a la resistencia a los potyvirus; b) una enzima que reconozca un sitio de restricción II presente en al menos un alelo de elF4E asociado a la resistencia a los potyvirus, y ausente de los alelos de e\F4E asociados a la sensibilidad a los potyvirus; y un par de cebadores nucleotídicos que permitan amplificar elF4E o una porción que incluya el sitio de restricción I y/o el sitio de restricción II.

18. Kit según la reivindicación 1 7, que se caracterice por incluir: - un par de cebadores definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1 8 y SEO. ID NO: 19; al menos una enzima de restricción elegida entre TspRI o uno de sus isosquizórneros y Mvnl o uno de sus isosquizémeros.

1 9. Utilización de un sitio de restricción por Mvnl que corresponda preferentemente a la secuencia sentido: CGACG y a la secuencia antisentido: GCAGC, y/o de un sitio de restricción por TspRI que corresponda preferentemente a la secuencia sentido: NNCASTGNNA y a la secuencia antisentido: ANNGTSACNN, como marcadores oligonucleotídico(s) de resistencia o de sensibilidad a los potyvirus.

20. Utilización de una proteína elF4E de tipo salvaje o mutánte, tal y como se definen en una de las reivindicaciones 1 o 3 , o de un anticuerpo específico de las mencionadas proteínas, para la selección de plantas resistentes a los potyvirus.

21 . Utilización según la reivindicación 20, que se caracterice porque la mencionada proteína elF4E se elige entre: - la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 3; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 5; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 7; la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 9; el grupo de proteínas representado por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 22; el grupo de proteínas representado por la secuencia . polipeptídica SEQ ID NO: 23;

22. Proteína elF4E mutante tal y como se define en una de las reivindicaciones 1 o 3.

23. Proteína elF4E mutante según la reivindicación 22 elegida entre: la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 9; las variantes de la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 22; el grupo de la proteína representada por la secuencia polipeptídica SEQ ID NO: 23;

24. Anticuerpos específicamente dirigidos contra una proteína elF4E mutante según una de las reivindicaciones 1 o 3, o un fragmento de al menos 6 aminoácidos de dicho polipéptido.

25. Procedimiento no biológico de obtención de plantas resistentes al menos a un potyvirus que se caracterice por la introducción de un alelo del gen elF4E asociado a la resistencia a dicho potyvirus en el genoma de dichas plantas.

26. Procedimiento según la reivindicación 25, que se caracterice porque la aparición del alelo de resistencia se consigue con la aplicación de un método seleccionado de entre el grupo que incluye: mutagénesis, de forma favorable "Tilling", recombinación homóloga, sobre-expresión , - inserción/deleción, "gene silencing" / transgénesis, y sus combinaciones.

27. Unidad genética construida, que se caracterice por incluir al menos un polinucleótido tal y como se define en alguna de las ' reivindicaciones 4 a 6, 8.

28. Vector de transformación de células vegetales, que se caracterice por incluir al menos una unidad genética según la reivindicación 27.

29. Células vegetales transformadas con al menos un vector según la reivindicación 28 o al menos una unidad genética según la reivindicación 27.

30. Microorganismos transformados con al menos un vector según la reivindicación 28 o al menos una unidad genética según la reivindicación 27.

31 . Plantas transformadas con al menos un vector según la reivindicación 28 o al menos una unidad genética según la reivindicación 27.