EP1441825A2 - Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren in form eines trockenschnelltestes - Google Patents

Verfahren zum nachweis von nukleinsäuren in form eines trockenschnelltestes

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EP1441825A2
EP1441825A2 EP02795061A EP02795061A EP1441825A2 EP 1441825 A2 EP1441825 A2 EP 1441825A2 EP 02795061 A EP02795061 A EP 02795061A EP 02795061 A EP02795061 A EP 02795061A EP 1441825 A2 EP1441825 A2 EP 1441825A2
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EP
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nucleic acid
sequence
detected
zone
specific nucleic
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Withdrawn
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EP02795061A
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Inventor
Michael Weizenegger
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Hain Lifescience GmbH
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Publication date
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    • G01N30/90—Plate chromatography, e.g. thin layer or paper chromatography

Definitions

  • the present invention relates to the field of diagnosis of nucleic acids.
  • the present invention relates in particular to a highly sensitive method for the detection, differentiation and characterization of nucleic acids in the form of a rapid dry test; the rapid dry test comprising a chromatographic material
  • the sequence-specific nucleic acid probes are immobilized via a polymer linker and further characterized in that the method comprises the following steps: i) in the case of double-stranded nucleic acids, the nucleic acid to be detected is denatured and then neutralized , ii) the nucleic acid to be detected is applied to the sample receiving zone in a running buffer which contains mildly denaturing agents, iii) the nucleic acid to be detected moves from the sample receiving zone towards the liquid-absorbing zone, iv) the nucleic acid to be detected is in the binding area of the separation zone with the sequence-specific nucleic acid probe brought into contact and hybridized to the sequence-specific nucleic acid probe v) the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected a n
  • the sequence-specific nucleic acid probe is detected via a label which is attached to the nucleic acid to be detected or via a
  • Detection with an antibody conjugate against a DNA double strand or a DNA / RNA double strand is therefore also considered as a marker.
  • the present invention furthermore relates to a device to carry out the method according to the invention.
  • nucleic acids with probes The detection of nucleic acids with probes is described in the prior art. Methods for quick and easy detection of nucleic acids are becoming increasingly important in the fields of medicine, the environment, food and forensics. Due to the high specificity and sensitivity of nucleic acid-based methods, these tests are of great importance for the identification and differentiation of pathogens, contaminating organisms or for the subtyping of bacteria or viruses and the investigation of genetic polymorphisms.
  • the nucleic acid to be detected is amplified.
  • Various reactions can be used as the nucleic acid amplification reaction.
  • the polymerase chain reaction (PCR) is preferably used.
  • the various configurations of the PCR technique are known to the person skilled in the art, see e.g. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48 (8), 579-582.
  • NASBA nucleic acid strand based amplification
  • TMA transcriptase mediated amplification
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ß-Q replicase Q-beta replicase amplification
  • SDA single strand displacement amplification
  • the amplify is e.g. cut specifically by digestion with a restriction enzyme and the resulting ethidium bromide-stained fragments were analyzed on an agarose gel.
  • Hybridization systems are also widespread. The hybridization usually takes place in such a way that either the composition containing the amplification product or a part thereof or the probe is immobilized on a solid phase and brought into contact with the other hybridization partner in each case.
  • solid phases for example nylon, nitrocellulose, polystyrene, silicate materials, etc. It is also conceivable that a microtiter plate is used as the solid phase.
  • the target sequence can also hybridize with a capture probe beforehand in solution and then the capture probe is bound to a solid phase.
  • At least one probe or at least one primer is labeled during the amplification of the nucleic acid to be detected.
  • Various labels are conceivable, such as fluorescent dyes, biotin or digoxigenin.
  • Known fluorescent labels are fluorescein, FITC (fluoroisothiocyanate), cyanine dyes, etc.
  • the labels are usually covalently linked to the oligonucleotides. While a fluorescent label can be detected directly, biotin and digoxigenin labels can be detected after incubation with suitable binding molecules.
  • a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution that contains streptavidin coupled to an enzyme, the enzyme, for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence ,
  • the enzyme for example peroxidase or alkaline phosphatase, converting a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence
  • This object was achieved according to the invention by a highly sensitive method for the detection, differentiation and characterization of nucleic acids in the form of a rapid dry test; the dry rapid test containing a chromatographic material comprising a sample receiving zone,
  • the method comprises the following steps: i) the nucleic acid to be detected is denatured in the case of double-stranded nucleic acids and then neutralized, ii) the nucleic acid to be detected is applied to the sample receiving zone in a Running buffer containing mildly denaturing agents is applied, iii) the nucleic acid to be detected moves from the sample receiving zone in the direction of the liquid-absorbing zone, iv) the nucleic acid to be detected is brought into contact with the sequence-specific nucleic acid probe in the binding region of the separation zone and hybridizes to the sequence-specific one Nucleic acid probe v) the nucleic acid to be detected or the hybridization of the nucleic acid to be detected to the sequence-specific nucleic acid probe is detected by means of a label on the nucleic acid to be detected is attached or via
  • nucleic acid and oligonucleotide refers to primers, samples, probes and oligomer fragments which are detected.
  • nucleic acid and oligonucleotide is also generic to polydesoxyribonucleotides (containing 2-deoxy-D-ribose) and to polyribonucleotides (containing D-ribose) or to any other type of polynucleotide that is an N-glycoside of a purine base or a pyrimidine base , or a modified purine base or a modified pyrimidine base.
  • PNAs are thus also included according to the invention, i. H. Polyamides with purine / pyrimidine bases.
  • nucleic acid and oligonucleotide are not considered to be different within the meaning of the present invention; in particular, the use of the terms is not intended to mean any differentiation in terms of length. These terms include double-stranded or single-stranded DNA as well as double-stranded or single-stranded RNA.
  • a rapid dry test in the sense of the present invention is to be understood as a device which chromatographically separates the product to be analyzed. made possible.
  • a chromatographic material with a pore size of 4 ⁇ m and larger, most preferably larger than 8 ⁇ m.
  • the analyte is brought to the reaction zones such as the separation zone by capillary forces of the chromatographic material.
  • the chromatographic material may comprise inorganic powders such as silicate materials, magnesium sulfate and aluminum, may further comprise synthetic or modified naturally occurring polymers such as nitrocellulose, cellulose sulfate, cellulose, polyvinyl chloride or acetate, polyacrylamide, nylon, cross-linked dextran, agarose, polyacrylate etc. may also include coated materials such as ceramic materials and glass. Most preferred is the use of nitrocellulose as the chromatographic material.
  • the introduction of positively charged ion groups in e.g. Nitrocellulose or nylon membranes improve the hydrophilic properties of the chromatographic material.
  • the rapid dry test comprises a sample receiving zone, a separation zone with a binding region in which one or more sequence-specific nucleic acid probes are immobilized and a liquid-absorbing zone lying behind the separation zone with a binding region.
  • the quick dry test can have several separation zones.
  • the rapid dry test can additionally comprise zones which contain marking substances which bind to the analytes as they pass this zone. For example, a zone containing a gold conjugate for labeling the passing analyte is customary.
  • the quick dry test can in particular have the form of a test strip.
  • the chromatographic material can be mounted in a housing or the like.
  • This housing is usually water-insoluble, rigid and can consist of a variety of organic and inorganic materials. It is important that the housing does not interfere with the capillary properties of the chromatographic material, that the housing does not bind test components non-specifically, and that the housing does not interfere with the detection system. It is preferred according to the invention that the length of the polymer linker or the polymer linker with anchoring molecule is more than 30 nm.
  • the length of the linker is crucial to achieve a high sensitivity of the immobilized probe.
  • the linker acts as a spacer between the probe and the membrane. In the present case, these are mostly polymers which extend the part of the probe which is complementary to the target sequence at the 5 'or 3' end, but are not themselves coding. These can be base sequences of a non-coding nucleic acid structure or other polymer units such as e.g. Polyether, polyester and others
  • the linker must be such that it does not affect the hybridization properties of the probe or only weakly negatively. This can be avoided by the fact that there are no self-complementary structures. The chemical prerequisites for the irreversible coupling of the probe to the carrier material must also be met.
  • a key prerequisite for the probe to function well beyond its properties of forming a stable hybrid with the target sequence is the chemistry of the coupling to the surface.
  • the length of the polymer linker or the polymer linker with anchoring molecule is more than 30 nm, particularly preferably more than 40 nm.
  • the linker is polythymidine. The length of synthetic linkers is often limited.
  • the yield and product quality are reduced so much after a number of synthesis steps that the length of the oligonucleotide is limited to approximately 100 monomers. Depending on the monomer, this corresponds to a length of approx. 30 - 40 nm.
  • a terminal transferase always results in a mixture of long (up to several hundred monomers) and very short oligonucleotides.
  • the sequence-specific nucleic acid probes are preferably immobilized on the membrane or the chromatographic material via a polymer linker which is connected to an anchoring molecule.
  • the anchor molecule is psoralen.
  • psoralen offers the possibility of forming very long linkers from fully synthetic oligonucleotides.
  • Psoralen is a polycyclic compound that is able to photochemically couple with pyridine residues under UV light with a wavelength of approx. 360 nm. The reaction with thymidine residues is particularly good.
  • probes which, for example, 5 'end a psoralen-containing polythymidine possessed by the effect of UV light by cross-linking of the molecules extensions of the spacers or linkers.
  • a mixture of pure polythymidine without anchoring molecule and polythymidine with psoralen modification as an anchoring molecule at the end of the polythymidine linker can be used to build network structures which prove to be advantageous for the hybridization efficiency and the sensitivity of the probes.
  • the DNA can be mixed with psoralen-labeled oligonucleotides and photocrosslinked. This improves the attachment of the probe to the surface.
  • anchoring molecules such as, for example: derivatives of psoralen, such as, for example, bis (PIP) Cn-psoralen, or other photoreactive crosslinking and labeling reagents known to the person skilled in the art, such as, for example, simple aryl-azide crosslinking agents, fluorinated aryl azide - Crosslinkers or crosslinkers based on benzophenone.
  • derivatives of psoralen such as, for example, bis (PIP) Cn-psoralen
  • PIP bis
  • crosslinking and labeling reagents known to the person skilled in the art, such as, for example, simple aryl-azide crosslinking agents, fluorinated aryl azide - Crosslinkers or crosslinkers based on benzophenone.
  • Probe oligonucleotides can be bound to the membrane surface via proteins, for example.
  • the proteins loaded with the probe can then be bound to the porous membrane using standard methods.
  • Standard methods are, for example, coupling via homobifunctional coupling reagents or heterobifunctional coupling reagents.
  • the reactive groups are the same.
  • these are amines and / or thiols.
  • Thiols can be synthetically coupled directly to oligonucleotides and react under oxidative conditions with, for example, cysteine residues to form disulfide bridges.
  • amines as homobifunctional coupling reagents can be directly synthetically coupled to oligonucleotides and bound to the surface or the protein via imido esters or succinimide esters.
  • the reactive groups are different and allow the coupling of different functional groups.
  • the formation of amino-thiol couplings is preferred.
  • Thiolated oligonucleotides can be coupled with a heterobifunctional coupling reagent which contains both a succinimide ester maleimide or iodoacetimide.
  • Another important coupling agent are the carbodiimides, which couple carbinyl residues to amines.
  • the nucleic acid probes are immobilized on the solid phase, and then this solid phase is brought into contact with the composition which contains the labeled nucleic acids to be detected or a part thereof.
  • the composition which contains the labeled nucleic acids to be detected or a part thereof Preferably at least two probes are immobilized on the solid phase, more preferably at least five probes, more preferably at least ten probes. Different probes can be immobilized in different zones.
  • the nucleic acid to be detected is marked.
  • fluorescent labels are fluorescein, FITC, cyanine dyes, rhodamines,
  • a radioactive marking is also conceivable, e.g. I, S, P, P.
  • Particle marking such as e.g. with latex. Such particles are usually dry, in the micron range and uniform.
  • the labels are usually covalently linked to the oligonucleotides.
  • a fluorescent label can be detected directly
  • biotin and digoxigenin labels can be detected after incubation with suitable binding molecules or conjugate partners.
  • Other binding partners than, for example, biotin / streptavidin are antigen / antibody systems, hapten / anti-hapten systems, biotin / avidin, folic acid / folate-binding proteins, complementary nucleic acids, proteins A, G and immunoglobulin etc. (M: N : Bobrov, et al., J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989).
  • a biotin-labeled oligonucleotide can be detected by contacting it with a solution containing streptavidin coupled to an enzyme, the Enzyme, eg peroxidase or alkaline phosphatase, converts a substrate that produces a dye or leads to chemical luminescence.
  • the Enzyme eg peroxidase or alkaline phosphatase
  • Possible enzymes for this purpose are hydrolases, lyases, oxido reductases, transferases, isomerases and ligases.
  • Further examples are peroxidases, glucose oxidases, phosphatases, Suchases are known per se to the person skilled in the art (Wetmur JG. Grit Rev Biochem Mol Biol 1991; (3-4): 227-59; Temsamani J. et al.
  • Another preferred conjugate comprises an enzyme which is coupled to an antibody (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984).
  • nucleic acid to be detected with a gold streptavidin conjugate
  • a biotin-labeled Binding partners which form covalent bonds with one another, for example sulfhydryl-reactive groups such as maleimides and haloacetyl derivatives and amine-reactive groups such as isothiocyanates, succinimidyl esters and sulfonyl halides, are also conceivable.
  • the detectable conjugate can be applied to a zone of the rapid dry test which is passed through by the nucleic acid to be detected, the conjugate partner being introduced into this nucleic acid to be detected. If the nucleic acids to be detected are labeled, the probes are usually not labeled. The nucleic acids to be detected are thus essentially labeled using the methods described in the prior art (see also US Pat. No. 6,037,127).
  • the labeling can be introduced into the nucleic acid to be detected by chemical or enzymatic methods, or by direct incorporation of labeled bases into the nucleic acid to be detected.
  • sequences to be detected which have incorporated labels are produced by labeled bases or labeled primers during the PCR.
  • Labeled primers can be made by chemical synthesis e.g. by means of the phosphoramidite method by substituting bases of the primer with labeled phosphoramidite bases during the primer synthesis.
  • primers can be prepared with modified bases to which labels are chemically bound after the primer synthesis. Methods are also conceivable without the nucleic acid to be detected being amplified or provided with a modification.
  • ribosomal RNA species can hybridize specifically with a DNA probe and can be detected as an RNA / DNA hybrid with an RNA / DNA-specific antibody.
  • T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme Another possibility is the introduction of labels using the T4 polynucleotide kinase or a terminal transferase enzyme.
  • the introduction of radioactive or fluorescent labels (Sambrook et. Al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. Al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal Biochem, 174, 101 (1988).
  • Markers can be introduced into one or both ends of the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be detected. Markings can also be made within the nucleus acid sequence of the nucleic acid to be detected. Several markings can be introduced into a nucleic acid to be detected.
  • the denaturation according to process step i) is carried out with NaOH and the neutralization according to process step i) with a phosphate buffer or Tris buffer. Denaturation can also be achieved by other measures such as cooking at a temperature higher than 95 ° C, possibly with the addition of mildly denaturing chemicals. Denaturation of the nucleic acid to be detected is always necessary if double-stranded nucleic acids are present in the sample. It is further preferred according to the invention that the running buffer according to process step ii) is phosphate or TRIS buffer and that one or more of the following are contained in the running buffer as mildly denaturing agent: formamide, DMSO, urea. For neutralization and as a running buffer, however, all running buffers listed below can be used according to the invention. The buffer used for neutralization can be identical to the running buffer.
  • Buffers and solvents which can be used for the process according to the invention are known and examples are described in US Pat. No. 4,740,468 and US Pat. No. 6,037,127.
  • the pH for the running buffer is normally in the range 4-11, preferably in the range 5-11 and most preferably in the range 6-9.
  • the pH is chosen so that a considerable degree of binding affinity is maintained between all binding partners, including the hybridizing nucleic acids, and an optimal signal can also be obtained from the signal-producing system.
  • Typically used buffers contain borate, phosphate, carbonate, tris, barbital and the like.
  • the choice of the suitable buffer normally does not play a critical role for the method according to the invention. However, some buffers may be more suitable than others for special tests.
  • hybridization processes are carried out with heated solutions in hybridization ovens or water baths. This is typically done at 30 ° to 70 ° C, preferably at 50 ° C.
  • work must be carried out at room temperature. To achieve good sensitivities, it is therefore necessary to add the mildly denaturing agents mentioned above to the running buffer.
  • the process according to the invention can of course be carried out at all temperatures between 4 ° C. and 50 ° C. Most convenient and therefore preferred is room temperature.
  • hybridization refers to the formation of duplex structures by double-stranded nucleic acids due to complementary base pairing.
  • Hybridization can take place between complementary nucleic acid strands or between nucleic acid strands that have smaller regions of mismatch.
  • the stability of the nucleic acid duplex is measured by the melting temperature T m .
  • the melting temperature T m is the temperature (under defined ionic strength and pH) at which 50% of the base pairs are dissociated.
  • Stringent hybridization conditions are known to the person skilled in the art (for example Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). In general, stringent conditions are selected so that the melting temperature is 5 ° C lower than the T m for the specific sequence at a defined ionic strength and pH. If the hybridization is performed under less stringent conditions, then sequence mismatches are tolerated. The extent of sequence mismatches can be controlled by changing the hybridization conditions.
  • Stringent in the sim e of the present invention means that the detection method allows a clear distinction between a positive reaction and a negative reaction in the reaction field of the strip. This can be achieved in particular by the following measures:
  • Structure of the probe by the length of the structure of the probe complementary to the target sequence; 15 to 20 mers are preferred.
  • Running buffer The stringency is influenced by the salinity.
  • the ionic strength is preferably between 100-400 mM, particularly preferably around 250 mM.
  • the stringency can be individually adjusted and optimized by the above-mentioned mildly denaturing substances in the running buffer (DMSO, formamide, urea).
  • the stringency is also influenced by the pH value of the running buffer.
  • all of the above-mentioned measures are measures which have an influence on hydrogen bonds.
  • the sequence-specific nucleic acid probe is a nucleic acid with a specific sequence which hybridizes to the nucleic acid to be detected under stringent hybridization conditions.
  • Specific sequence means that a defined nucleic acid structure can be distinguished from many other structures. This can be to differentiate between microorganisms and viruses, but also to differentiate nucleic acid polymorphisms in genetic or epidemiological questions.
  • the nucleic acid to be detected can be isolated from a multitude of organisms such as bacterial and viral pathogens.
  • the nucleic acid to be detected can also be the subject of diagnostic evidence for a genetic disease.
  • the nucleic acid to be detected can come from any conceivable source if the detection of the nucleic acid or parts thereof are to be detected, differentiated or characterized. In most cases, the nucleic acid to be detected is not detected directly, but has to be amplified beforehand. (For the illustration of possible amplification methods see also US 6,037,127.)
  • the nucleic acid to be detected is a fragment from the genome of a periodontitis-associated bacterium or is complementary to this.
  • the sequence-specific nucleic acid probe is a nucleic acid with a species-specific sequence which hybridizes to the nucleic acid to be detected under stringent hybridization conditions.
  • the sequence-specific nucleic acid probe is preferably selected from one of the following sequences or is complementary to these sequences: SEQ ID No .: 1-29, or is a fragment thereof (see also FIGS. 6 and 7)
  • probes which differ slightly from the probes according to the invention, but still work. It is also conceivable to use probes that have the sequences SEQ ID no. 1-29 at the 5 'and / or 3' end have extensions or truncations by at least one, two or three nucleotides. It is also conceivable that individual or a few nucleotides of a probe can be exchanged for other nucleotides as long as the specificity of the probe is not changed too much and the The melting point of the probe is not changed too much. This includes that when modified, the melting temperature of the modified probe does not deviate too much from the melting temperature of the original probe.
  • a composition which contains the nucleic acid to be detected or a part thereof is hybridized with one or more probes.
  • the present invention furthermore relates to a device for carrying out a method according to the invention in the form of a rapid dry test comprising a chromatographic material
  • a liquid-absorbing zone located behind the separation zone with the binding area, characterized in that the sequence-specific nucleic acid probes are immobilized via a polymer linker.
  • the preferred embodiments of the device essentially correspond to those of the method according to the invention.
  • the sequence-specific nucleic acid probes are preferably immobilized on the membrane via a polymer linker which is connected to an anchoring molecule.
  • the length of the polymer linker or the polymer linker with anchoring molecule is is more than 30 nm.
  • the length of the polymer linker or of the polymer linker with anchoring molecule is preferably more than 40 nm.
  • the linker is polythymidine.
  • the anchor molecule is psoralen.
  • the chromatographic material of the device according to the invention is preferably nitrocellulose. It is further preferred that the chromatographic material has a pore size of 4 ⁇ m and larger.
  • the sequence-specific nucleic acid probe is a nucleic acid which hybridizes under stringent hybridization conditions to a fragment from the genome of a periodontitis-associated bacterium or to the sequence complementary thereto.
  • the sequence-specific nucleic acid probe is selected from one of the following sequences or is complementary to these sequences: SEQ ID No .: 1-29 or contains fragments thereof.
  • the present invention furthermore relates to the use of the device according to the invention for the detection, differentiation and characterization of nucleic acids, in particular for the detection, differentiation and characterization of periodontitis-associated bacteria.
  • the present invention furthermore relates to the use of the method according to the invention and the device according to the invention for the detection of amplification products from amplification methods such as the polymerase chain reaction (PCR) and the nucleic acid strand-based amplification (NASBA).
  • amplification products may also have been created by other nucleic acid amplification techniques such as e.g. by transcriptase mediated amplification (TMA), reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR), Q-beta replicase amplification (ß-Q-replicase) and single-strand displacement amplification (SDA).
  • TMA transcriptase mediated amplification
  • RT-PCR reverse transcriptase polymerase chain reaction
  • ß-Q-replicase Q-beta replicase amplification
  • SDA single-strand displacement amplification
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.:16,
  • Porphyromonas gingivalis 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.:21 and
  • Figure 4 Influence of the psoralen marking on the sensitivity.
  • the probe SEQ ID No.16 was immobilized with polythymidine linker from 85 thymidine residues without psoralen labeling and in (B) with psoralen labeling.
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans (Prime ⁇ aar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) was amplified in each case.
  • Denatured Actinobacillus actinomycetemcomitans -Amplifikat (Prime ⁇ aar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) was with hybridization buffer (A) without DMSO, (B) 10% DMSO, 20% DMSO and 30% DMSO applied to the quick dry test. (Probe SEQ ID No. 16, psoralen-marked and with the polymidine linker with 85 polymidine residues).
  • the probes SEQ ID No. 1-29 (the probes are modified at the 5 'end with psoralen) onto a nitrocellulose membrane and bound by UV radiation.
  • the structure of the rapid test is shown in Figure 1.
  • DNA isolation For this purpose, bacterial material was removed from solid media using a sterile inoculation loop and suspended in 300 ⁇ l lOmM Tris / HCl pH 7.5. 1 ml was removed from liquid cultures, centrifuged for 5 min at 13,000 m m in a table centrifuge, the supernatant was discarded and resuspended in 300 ⁇ l lOmM Tris / HCl pH 7.5. The cell suspensions obtained in this way were incubated for 15 minutes at 95 ° C.
  • thermomixer Eppendorf, Hamburg, Germany
  • sonicated for 15 minutes in an ultrasonic bath Bandelin electronic, Berlin, Germany
  • 10 minutes at 13,000 ⁇ m in a table centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany centrifuged. 5 ⁇ l of the supernatant were used in the amplification reaction.
  • the oligonucleotides were applied to the membrane after they had dried completely , in a UV crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) at 1200 joules / cm 2.
  • UV crosslinker UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA
  • the coated membrane was glued to a vinyl backing and pretreated with a sample pad (grade 903 paper, Schleicher & Schüll) 0.0 IM sodium tetraborate, 1% Triton X-100, pH 7.4) and a traction cushion (grade 470 paper, Schleicher & Schüll)
  • the cut strips were packed in a plastic housing.
  • Gold particles 20 nm conjugated with streptavidin (British Biocell, Cambridge, Great Britain) OD524, 4.0 were used for the detection. 3 ⁇ l of this gold particle suspension were mixed with 20 ⁇ l biotinylated amplificate and incubated for 5min. The denaturation of the amplificate was achieved by adding a NaOH solution (final concentration 200 mM). After five minutes of incubation, the solution was neutralized in 150 ⁇ l running buffer consisting of 250 mM phosphate buffer, pH 7.5, 50 mM NaCl, 0.1% Tween 20 and 20% DMSO (SIGMA, Munich, Germany) and added completely to the application zone , The developed zones can be read after approx. 5 min.
  • the detection was carried out for the subsequent experiments without conjugated particles, but rather staining with NBT / BCIP catalyzed by an alkaline phosphatase.
  • the strip was removed from the housing after the target nucleic acid had hybridized in the dry rapid test method and washed once in 1 ⁇ SSC for 1 min.
  • 5 g / l blocking reagent Röche, Mannheim, Germany
  • maleic acid buffer pH 7.5 (8.26 g NaCl and 10.06 g
  • streptavidin-alkaline phosphatase conjugate (1: 5000 dilution, Dianova, Hamburg, Germany) for 15 min.
  • the hybridized DNA could be incubated in substrate buffer (274mM Tris / Cl pH 7.5, 68.6mM Na 3 citrate, 200mM NaCl, 27.4 mM MgCl 2 x 6 H 2 O) with NBT (75 mg / ml nitro blue tetrazolium salt in 70% dimethylformamide) and BCIP (50 mg / ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphate-toluidinium salt in 100%) dimethylformamide) ,
  • the probe SEQ ID No.16 without polythymidine linker the same probe with polythymidine linker consisting of 20 thymidine residues and with 100 thymidine residues, and hybridized with NBT / BCIP were hybridized on the strips as described in Example 1.
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans (Prime ⁇ aar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) was used as the amplificate.
  • a clear sensitivity gradation can be seen correlating with the length of the linker (see Figure 3).
  • the probe whose linker is 100 thymidine residues long shows the highest sensitivity.
  • the probe SEQ ID No.16 was hybridized on the strip as described in Example 1 with polythymidine linker from 100 thymidine residues with and without 5 'porsoral labeling and developed with NBT / BCIP.
  • Actinobacillus actinomycetemcomitans (Prime ⁇ aar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) was used as the amplificate.
  • a clear gradation of sensitivity can be seen correlating with the presence of the psoralen label. (Fig. 4). Psorally labeled probes are more sensitive.
  • the probe SEQ ID No.16 was hybridized on the strip as described in Example 1 with polythymidine linker from 100 thymidine residues and with 5 'p-oral labeling and developed with NBT / BCIP.
  • Denatured Actinobacillus actinomycetemcomitans -Amplifikat was with hybridization buffer (A) without DMSO, (B) 10% DMSO, 20% DMSO and 30% DMSO applied to the quick dry test. That is, the running buffer contains increasing concentrations of DMSO n 0, 10, 20 and 30%. The test becomes more sensitive at DMSO concentrations of more than%. (Fig. 5)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Nukleinsäuren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein hock sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trocken-schnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend - eine Probenaufnahmezone, - eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nu-kleinsäuresonden immobilisiert sind and - eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, dass die sequenzspezifischen Nukleinsäuresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren folgende Schritte umfasst: i) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschliessend neutralisiert,ii) die nachzuweisende Nukleinsäure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsäure bewegt sich von der robenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsäure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der se-quenzspezifischen Nukleinsäuresonde in Kontakt gebracht and hybridisiert an die sequenz-spezifische Nukleinsäuresonde v) die nachzuweisende Nukleinsäure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisen-den Nukleinsäure an die sequenzspezifische Nukleinsäuresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsäure angebracht ist oder über die Detektion einer Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges. Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Durchftihrung des erfindungsgemässen Verfahrens.

Description

Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Diagnostik von Nukleinsäuren. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist insbesondere ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
- eine Probenaufnahmezone,
- eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und
- eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsauresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt: i) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, ii) die nachzuweisende Nukleinsaure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsaure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der se- quenzspezifischen Nukleinsauresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenz- spezifische Nukleinsauresonde v) die nachzuweisende Nukleinsaure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsaure an die sequenzspezifische Nukleinsauresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsaure angebracht ist oder über eine Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die De- tektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z.B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.) Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Der Nachweis von Nukleinsäuren mit Sonden ist im Stand der Technik beschrieben. Methoden für einen schnellen und einfachen Nachweis von Nukleinsäuren gewinnen in den Bereichen Medizin, Umwelt, Lebensmittel und der Forensik zunehmend an Bedeutung. Aufgrund der hohen Spezifität und Sensitivität nukleinsäurebasierender Verfahren kommt diesen Testen für die Identifizierung und Differenzierung von Krankheitserregern, kontaminierenden Organismen oder auch für die Subtypisierung von Bakterien oder Viren und der Untersuchung genetischer Polymorphismen ein hoher Stellenwert zu.
Liegt die nachzuweisende Nukleinsaure nur in geringen Mengen in der Probe vor, wird die nachzuweisende Nukleinsaure amplifiziert. Als Nukleinsäureamplifikationsreaktion können verschiedene Reaktionen eingesetzt werden. Bevorzugt wird die Polymerasekettenreaktion (PCR) eingesetzt. Die verschiedenen Ausgestaltungen der PCR-Technik sind dem Fachmann bekannt, siehe z.B. Mullis (1990) Target amplification for DNA analysis by the polymerase chain reaction. Ann Biol Chem (Paris) 48(8), 579-582. Weitere Amplifikationstechniken, die zur Anwendung kommen können, sind die Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA), die Transkriptase vermittelte Amplifikation (TMA), ), Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (ß-Q-Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplifikation (SDA). NASBA und andere Transkriptions-basierte Amplifikationsmethoden werden in Chan und Fox, Reviews in Medical Microbiology (1999), 10 (4), 185-196 erläutert.
In der einfachsten Form der Detektion der nachzuweisenden Nukleinsaure wird das Amplifi- kat z.B. durch Verdau mit einem Restriktionsenzym spezifisch geschnitten und die entstandenen ethidiumbromidgefärbten Fragmente auf einem Agarosegel analysiert. Weit verbreitet sind auch Hybridisierungsysteme. Die Hybridisierung findet üblicherweise so statt, daß entweder die Zusammensetzung, die das Amplifikationsprodukt oder einen Teil davon enthält, oder die Sonde auf einer festen Phase immobilisiert wird und mit dem jeweils anderen Hybri- disierungspartner in Kontakt gebracht wird. Als feste Phasen sind verschiedenste Materialien vorstellbar, beispielsweise Nylon, Nitrozellulose, Polystyrol, silikatische Materialien usw. Es ist auch denkbar, daß als feste Phase eine Mikrotiterplatte eingesetzt wird. Die Zielsequenz kann dabei auch in Lösung zuvor mit einer Fangsonde hybridisieren und danach wird die Fangsonde an eine feste Phase gebunden.
In der Regel ist wenigstens eine Sonde oder wenigstens ein Primer bei der Amplifikation der nachzuweisenden Nukleinsaure markiert. Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder Digoxigenin. Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC (Fluorisothiocyanat), Cyaninfarbstoffe usw. Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen nachgewiesen werden. Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt.
Alle diese Verfahren sind arbeitsaufwendig und benötigen in der Regel mehrere Stunden. Eine Automatisierung dieser Verfahren kann den manuellen Aufwand und die Analysezeit drastisch verkürzen, benötigt aber Geräte mit einem hohen Preis für Anschaffung und Unterhalt, die nur bei hohen Probenzahlen und in spezialisierten Laboratorien zum Einsatz kommen. Dies steht vor allem bei den Anforderungen einer „point of care" Diagnostik im Wege, wo schnell und möglichst ohne für Nukleinsäuretechniken speziell geschultes Personal nuklein- säurebasierende Diagnostik auch als Einzelnachweis betrieben werden soll.
Ein einfaches Verfahren zum Nachweis von nicht denaturierten Nukleinsäuren ist in U.S. 6,037,127 beschrieben. Dieser Test wird in Form eines Trockenschnelltestes durchgeführt, bei dem in einer Ausführungsform Nukleinsauresonden auf dem chromatographischen Material des Teststreifens immobilisiert sind. Die hier beschriebenen Testverfahren sind jedoch nicht hoch sensitiv.
Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine hoch sensitives Verfahren zum Nachweis von Nukleinsäuren zu entwickeln, welches als Schnelltest einfach durchzuführen ist und welches eine sequenzspezifische Identifizierung, Differenzierung und Charakterisierung von Nukleinsäuren ermöglicht.
Diese Aufgabe wurde erfindungsgemäß gelöst durch ein hoch sensitives Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend eine Probenaufnahmezone,
- eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und
- eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsauresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt: i) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, ii) die nachzuweisende Nukleinsaure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsaure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsauresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenz- spezifische Nukleinsauresonde v) die nachzuweisende Nukleinsaure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsaure an die sequenzspezifische Nukleinsauresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsaure angebracht ist oder über eine Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges. Als Markierung gilt somit beispielsweise auch die De- tektion mit einem Antikörperkonjugat gegen einen DNS-Doppelstrang oder einen DNS/RNS- Doppelstrang (letzteres z.B. im Falle, daß die Sonde oder die Zielsequenz RNS ist.)
Der Begriff Nukleinsaure und Oligonukleotid bezieht sich im Sinne der vorliegenden Erfindung auf Primer, Proben, Sonden und Oligomerfragmente, welche detektiert werden. Der Begriff Nukleinsaure und Oligonukleotid ist weiterhin generisch zu Polydesoxyribonukleotiden (enthaltend 2-Deoxy-D-Ribose) und zu Polyribonukleotiden (enthaltend D-Ribose) oder zu jedem weiteren Typ von Polynukleotid, das ein N-Glykosid einer Purinbase oder einer Pyri- midinbase ist, beziehungsweise einer modifizierten Purinbase oder einer modifizierten Pyri- midinbase. Eingeschlossen sind somit erfindungsgemäß auch PNA's, d. h. Polyamide mit Purin-/Pyrimidin-Basen. Die Begriffe Nukleinsaure und Oligonukleotid werden im Sinne der vorliegenden Erfindung nicht als verschieden angesehen, insbesondere soll die Verwendung der Begriffe keine Unterscheidung in Bezug auf die Länge bedeuten. Diese Begriffe schließen sowohl doppel- beziehungsweise einzelsträngige DNA, als auch doppel- beziehungsweise einzelsträngige RNA ein.
Unter Trockenschnelltest im Sinne der vorliegenden Erfindung ist eine Vorrichtung zu verstehen, welche eine chromatographische Auftrennnung des zu analysierenden Produkts er- möglicht. Besonders bevorzugt im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung eines chromato graphischen Materials mit einer Porengröße von 4 μm und größer, am meisten bevorzugt größer als 8 μm. Der Analyt wird durch Kapillarkräfte des chromatographischen Materials zu den Reaktionszonen wie z.B. die Trennzone gebracht.
Da der Analyt hauptsächlich hydrophiler Natur ist, sind hydrophile Eigenschaften des chromatographischen Materials des Teststreifens wichtig für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das chromatographische Material kann umfassen anorganische Puder wie silikatische Materialien, Magnesiumsulfat und Aluminium, kann weiterhin umfassen synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere wie Nitrozellulose, Zelluloseace- tat, Zellulose, Polyvinylchlorid oder -acetat, Polyacrylamid, Nylon, vernetztes Dextran, Aga- rose, Polyacrylat u.s.w., kann weiterhin umfassen beschichtete Werkstoffe wie keramische Materialien und Glas. Am meisten bevorzugt ist die Verwendung von Nitrozellulose als chromatographisches Material. Zusätzlich kann die Einführung von positiv geladenen Ionengruppen in z.B. Nitrozellulose oder Nylonmembranen die hydrophilen Eigenschaften des chromatographischen Materials verbessern.
Der Trockenschnelltest umfaßt eine Probenaufnahmezone, eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone. Der Trockenschnelltest kann mehrere Trennzonen aufweisen. Der Trockenschnelltest kann zusätzlich Zonen umfassen, die markierende Substanzen enthalten, welche an den Ana- lyten beim Passieren dieser Zone binden. Üblich ist zum Beispiel eine Zone enthaltend ein Goldkonjugat zum Markieren des passierenden Analyten. Der Trockenschnelltest kann insbesondere die Form eines Teststreifens aufweisen.
Weitere gebräuchliche Varianten den Trockenschnelltest betreffend sowie das chromatographische Material betreffend, sind im Stand der Technik, insbesondere in US 6,103,127 beschrieben.
Das chromatographische Material kann in einem Gehäuse oder ähnlichem montiert sein. Dieses Gehäuse ist in der Regel Wasser unlöslich, rigid und kann aus einer Vielzahl von organischen und anorganischen Materialien bestehen. Wichtig ist, daß das Gehäuse nicht mit den kapillaren Eigenschaften des chromatographischen Materials interferiert, daß das Gehäuse nicht Testkomponenten unspezifisch bindet, und daß das Gehäuse nicht mit dem Detektions- system interferiert. Erfmdungsgemäß bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül mehr als 30 nm beträgt.
Die Länge des Linkers ist von entscheidender Bedeutung, um eine hohe Sensitivität der immobilisierten Sonde zu erreichen. Der Linker fungiert als Abstandshalter der Sonde zur Membran. Dies sind im vorliegenden Falle meist Polymere, die den zur Zielsequenz komplementären Teil der Sonde am 5'- oder 3 '-Ende verlängern, aber selbst nicht kodierend sind. Dies können Basenabfolgen einer nichtkodierender Nukleinsäuresäurestruktur sein oder andere Polymereinheiten wie z.B. Polyether, Polyester u.a. Der Linker muß so beschaffen sein, daß er die Hybridisierungseigenschaften der Sonde nicht oder nur schwach negativ beeinflußt wird. Dies kann dadurch vermieden werden, daß keine selbstkomplementären Strukturen vorhanden sind. Auch müssen die chemischen Voraussetzungen für die irreversible Kopplung der Sonde an das Trägermaterial gegeben sein. Eine entscheidende Voraussetzung für ein gutes Funktionieren der Sonde über ihre Eigenschaften ein stabiles Hybrid mit der Zielsequenz zu bilden hinaus, ist die Chemie der Kopplung an die Oberfläche. Es müssen chemische Gruppen vorhanden sein, die bei den verwendeten Immobilisierungstechniken eine irreversible Bindung ermöglichen. Dies können Amine-, Thiolgruppen, Carboimide, Succinimide u.a. sein. Bevorzugt ist, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül mehr als 30 nm beträgt, insbesondere bevorzugt mehr als 40 nm. Weiterhin ist erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist. Die Länge synthetischer Linker ist oft limitiert. Bei der chemischen Synthese von Oligonukleotiden als Linker nach der Phos- phoramidit-Methode beispielsweise werden Ausbeute und Produktqualität nach einer Anzahl von Syntheseschritten so stark reduziert, daß die Länge des Oligonukleotids auf ca. 100 Mo- nomere beschränkt ist. Dies entspricht je nach Monomer in etwa einer Länge von ca. 30 - 40 nm. Bei enzymatischen Methoden der Oligonukleotidverlängerung z.B. durch eine terminale Transferase, ergibt sich immer ein Gemisch aus langen (bis mehreren hundert Monomeren) und sehr kurzen Oligonukleotiden.
Die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsauresonden an die Membran bzw. das chromatographische Material erfolgt bevorzugt über einen Polymerlinker, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist. Am meisten bevorzugt ist, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist. Psoralen bietet als Crosslinkingreagenz die Möglichkeit, sehr lange Linker aus vollsynthetischen Oligonukleotiden zu bilden. Psoralen ist eine polyzyklische Verbindung, die in der Lage ist, bei UV-Licht einer Wellenlänge von ca. 360 nm photochemisch mit Pyri- midinresten zu koppeln. Besonders gut ist die Reaktion mit Thymidinresten. Durch die Kopplung von Sonden, die beispielsweise 5 'endig eine Psoralen-haltige Polythymidinverlän- gerung besitzen, können durch Einwirkung von UV-Licht mittels Quervernetzung der Moleküle Verlängerungen der Abstandshalter bzw. Linker entstehen. Durch eine Mischung von reinem Polythymidin ohne Verankerungsmolekül und Polythymidin mit Psoralenmodifikation als Verankerungsmolekül am Ende des Polythymidin-Linkers können Netzwerkstrukturen aufgebaut werden, die sich für die Hybridisierungseffizienz und die Sensitivität der Sonden als vorteilhaft erweisen. Des weiteren kann die DNS mit Psoralen-markierten Oligonukleotiden gemischt und photo- vernetzt werden. Dies verbessert die Anheftung der Sonde an die Oberfläche. Als Verankerungsmolekül können erfindungsgemäß auch weitere Moleküle eingesetzt werden, wie z.B: Derivate des Psoralen, wie z.B. Bis(PIP) Cn-Psoralen oder andere dem Fachmann bekannte photoreaktive Vernetzungs- und Markierungsreagenzien, wie z.B. einfache Aryl-Azid- Vernetzer, fiuorinierte Aryl-Azid- Vernetzer oder auf Benzophenon basierende Vernetzer.
Dem Fachmann sind jedoch auch andere Möglichkeiten bekannt, Abstandshalter beziehungsweise Linker zwischen der Sonde und der Membran zu schaffen. Sondenoligonukleotide können beispielsweise über Proteine an die Membranoberfläche gebunden werden. Die mit der Sonde beladenen Proteine können dann nach Standardverfahren an die poröse Membran gebunden werden. Standardverfahren sind zum Beispiel die Kopplung über homobifunktionelle Kopplungsreagenzien oder heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien. Bei homobifunktio- nellen sind die reaktiven Gruppen gleich. Typischerweise sind dies Amine und/oder Thiole. Thiole können synthetisch direkt an Oligonukleotide gekoppelt werden und unter oxidativen Bedingungen mit z.B. Cysteinresten zu Disulfidbrücken reagieren. Für die Kopplung Amin- Amin können Amine als homobifunktionelle Kopplungsreagenzien direkt synthetisch an Oligonukleotide gekoppelt werden und über Imidoester oder Succinimidester an die Oberfläche oder das Protein gebunden werden. Bei heterobifunktionelle Kopplungsreagenzien sind die reaktiven Gruppen unterschiedlich und erlauben die Kopplung von verschiedenen funktio- nellen Gruppen. Bevorzugt ist die Ausbildung von Amino-Thiol-Kopplungen. Mit einem he- terobifunktionellen Kopplungsreagenz, welches sowohl eine Succinimidester-Maleimid oder Iodacetimid beinhaltet, können thiolierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Ein weiteres wichtiges Kopplungsagenz sind die Carbodiimide, die Carbinylreste an Amine koppeln. Wichtigster Vertreter ist hier das l-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDAC). Hier können an Membranen mit Carbonylresten aminmodifizierte Oligonukleotide gekoppelt werden. Bei dieser Chemie wird das Kopplungsreagenz nicht in die Verbindung eingebaut. Erfindungsgemäß werden die Nukleinsauresonden auf der festen Phase immobilisiert, und anschließend wird diese feste Phase mit der Zusammensetzung, welche die nachzuweisenden markierten Nukleinsäuren oder einen Teil davon enthält, in Kontakt gebracht. Vorzugsweise werden wenigstens zwei Sonden auf der festen Phase immobilisiert, bevorzugter wenigstens fünf Sonden, noch bevorzugter wenigstens zehn Sonden. Verschiedene Sonden können in verschiedenen Zonen immobilisiert sein.
Gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren ist die nachzuweisende Nukleinsaure markiert.
Verschiedenste Markierungen sind dabei denkbar, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe, Biotin oder
Digoxigenin.
Bekannte Fluoreszenzmarkierungen sind Fluoreszein, FITC, Cyaninfarbstoffe, Rhodamine,
Rhodamin60oR-phycoerythrin, Texas Red usw.
Vorstellbar ist auch eine radioaktive Markierung, wie z.B. I, S, P, P. Vorstellbar ist auch eine Partikelmarkierung wie z.B. mit Latex. Solche Partikel sind üblicherweise trocken, im Micron-Bereich und uniform.
Die Markierungen sind üblicherweise kovalent mit den Oligonukleotiden verbunden. Während eine Fluoreszenzmarkierung beispielsweise direkt nachgewiesen werden kann, können Biotin- und Digoxigeninmarkierungen nach Inkubation mit geeigneten Bindemolekülen oder Konjugatspartnern nachgewiesen werden. Andere Bindungspartner als beispielsweise Bio- tin/Streptavidin sind Antigen/Antibody-Systeme, Hapten/Anti-Hapten- Systeme, Biotin/ Avidin, Folsäure/Folat-bindende Proteine, Komplementäre Nukleinsäuren, Proteine A, G und Immunoglobulin usw. (M:N:Bobrov, et al. J. Immunol. Methods, 125, 279, (1989). Beispielsweise kann ein Biotin-markiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden, indem es mit einer Lösung in Kontakt gebracht wird, die Streptavidin gekoppelt an ein Enzym enthält, wobei das Enzym, z.B. Peroxidase oder alkalische Phosphatase, ein Substrat umsetzt, das einen Farbstoff erzeugt oder zu Chemielumineszenz führt. Mögliche Enzyme für diesen Verwendungszweck sind Hydrolasen, Lyasen, Oxido-Reduktasen, Transferasen, Isomerasen und Ligasen. Weitere Beispiele sind Peroxidasen, Glukoseoxidasen, Phosphatasen, Esterasen, und Glykosidasen. Derartige Verfahren sind dem Fachmann an sich bekannt (Wetmur JG. Grit Rev Biochem Mol Biol 1991 ; (3-4) : 227-59; Temsamani J. et al. Mol Biotechnol 1996 Jun;5(3):223-32). Bei manchen Methoden, bei denen Enzyme als Konjugatspartner fungieren, müssen farbändernde Substanzen anwesend sein (Tijssen, P. Practice and Theory of Enzyme Immunoassays in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, eds. R. H. Burton and P.H. van Knippenberg (1998). Ein weiteres bevorzugtes Konjugat umfaßt ein Enzym, welches an einen Antikörper gekoppelt wird (Williams, J. Immunol. Methods, 79, 261 (1984). Weiterhin ist üblich die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsaure mit einem Gold Streptavidin Konjugat, wobei dann ein Biotin-markiertes Zielnukleotid nachgewiesen werden kann. Vorstellbar sind jedoch auch Bindungspartner, die kovalente Bindungen miteinander eingehen, wie z.B. Sulfhydryl- reaktive Gruppen wie Maleimide und Haloacetyl-Derivate und Amin-reaktive Gruppen wie Isothiocyanate, Succinimidylester und Sulfonylhalide.
Im Falle der Markierung mit Konjugaten, kann das detektierbare Konjugat auf eine Zone des Trockenschnelltestes aufgetragen werden, die von der nachzuweisenden Nukleinsaure passiert wird, wobei in diese nachzuweisende Nukleinsaure der Konjugatspartner eingebracht wurde. Werden die nachzuweisenden Nukleinsäuren markiert, dann sind die Sonden in der Regel nicht markiert. Die Markierung der nachzuweisenden Nukleinsäuren erfolgt somit im wesentlichen nach im Stand der Technik beschriebenen Methoden (siehe auch US 6,037,127). Das Einbringen der Markierung in die nachzuweisende Nukleinsaure kann durch chemische oder enzymatische Methoden erfolgen, oder durch direkte Inkorporation von markierten Basen in die nachzuweisende Nukleinsaure. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nachzuweisende Sequenzen, die Markierungen inkorporiert haben, durch markierte Basen oder markierte Primer während der PCR hergestellt. Markierte Primer können hergestellt werden durch chemische Synthese z.B. mittels der Phosphoramidit-Methode durch die Substitution von Basen des Primers durch markierte Phosphoramiditbasen während der Primer- Synthese. Alternativ dazu können Primer hergestellt werden mit modifizierten Basen, an welche nach der Primer-Synthese Markierungen chemisch gebunden werden. Denkbar sind auch Verfahren ohne daß die zu detektierende Nukleinsaure amplifiziert oder mit einer Modifikation versehen wird. Beispielsweise können ribosomale RNS Spezies mit einer DNS-Sonde spezifisch hybridisieren und mit einem RNS/DNS -spezifischen Antikörper als RNS/DNS-Hybrid nachgewiesen werden.
Eine andere Möglichkeit ist das Einbringen von Markierungen mit Hilfe der T4 Polynucleoti- de-Kinase oder eines terminalen Transferase-Enzyms. Vorstellbar sind so das Einbringen von radioaktiven oder fluoreszierenden Markierungen (Sambrook et. al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Vol. 2, 9.34-9.37 (1989); Cardullo et. al. PNAS, 85, 8790; Morrison, Anal. Biochem, 174, 101 (1988).
Markierungen können in eines oder in beide Enden der Nukleinsäuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsaure eingebracht werden. Markierungen können auch innerhalb der Nuklein- säuresequenz der nachzuweisenden Nukleinsaure eingebracht werden. In eine nachzuweisende Nukleinsaure können mehrere Markierungen eingebracht werden.
Es ist erfmdungsgemäß bevorzugt, daß die Denaturierung gemäß Verfahrensschritt i) mit NaOH erfolgt und die Neutralisierung gemäß Verfahrensschritt i) mit einem Phosphatpuffer oder Tris-Puffer. Eine Denaturierung ist auch durch andere Maßnahmen zu erreichen wie beispielsweise Kochen bei einer Temperatur größer als 95 °C, eventuell unter Zusatz mild denaturierender Chemikalien. Eine Denaturierung der nachzuweisenden Nukleinsaure ist immer dann notwendig, wenn doppelsträngige Nukleinsäuren in der Probe vorliegen. Es ist weiterhin erfindungsgemäß bevorzugt, daß der Laufpuffer gemäß Verfahrensschritt ii) Phosphat- bzw. TRIS-Puffer ist und als mild denaturierendes Agens eines oder mehrere der nachfolgend genannten im Laufpuffer enthalten sind: Formamid, DMSO, Harnstoff. Zur Neutralisierung und als Laufpuffer können jedoch erfindungsgemäß alle unten aufgeführten Laufpuffer verwendet werden. Der Puffer, der zur Neutralisierung verwendet wird, kann identisch sein zum Laufpuffer.
Puffer und Lösungsmittel, die für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können, sind bekannt und Beispiele sind beschrieben in US 4,740,468 und US 6,037,127. Der pH für den Laufpuffer befindet sich normalerweise im Bereich von 4-11, bevorzugt im Bereich 5- 11 und am meisten bevorzugt im Bereich von 6-9. Der pH wird so gewählt, daß ein erhebliches Maß an Bindungsaffinität zwischen allen Bindungspartnern inklusive der hybridisierenden Nukleinsäuren erhalten bleibt und auch ein optimales Signal vom Signal-produzierenden System erhalten werden kann. Typischerweise verwendete Puffer enthalten Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und ähnliches. Normalerweise spielt die Wahl des geeigneten Puffers keine kritische Rolle für das erfindungsgemäße Verfahren. Für spezielle Tests können jedoch einige Puffer mehr geeignet sein als andere. Herkömmliche Hybridisierungsverfahren werden mit erwärmten Lösungen in Hybridisierungsöfen oder Wasserbädern durchgeführt. Dies erfolgt typischerweise bei 30° bis 70°C, bevorzugt bei 50°C. Für ein Nukleinsäurenachweissy- stem im Trockenschnelltestformat muß bei Raumtemperatur gearbeitet werden. Um gute Sen- sitivitäten zu erzielen, ist es daher notwendig, die oben erwähnten mild denaturierenden Agenzien dem Laufpuffer hinzuzufügen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann natürlich bei allen Temperaturen zwischen 4°C und 50°C durchgeführt werden. Am zweckmäßigsten und daher bevorzugt ist jedoch die Raumtemperatur. Der Begriff Hybridisierung bezieht sich auf die Bildung von Duplexstrukturen durch zwei- einzelsträngige Nukleinsäuren aufgrund von komplementärer Basenpaarung. Hybridisierung kann zwischen komplementären Nukleinsäuresträngen oder zwischen Nukleinsäuresträngen erfolgen, welche kleinere Regionen an Fehlpaarung aufweisen. Die Stabilität des Nukleinsäu- ren-Duplexes wird gemessen durch die Schmelztemperatur Tm. Die Schmelztemperatur Tm ist die Temperatur (unter definierter Ionenstärke und pH), bei welcher 50% der Basenpaare dissoziiert sind.
Bedingungen, bei denen lediglich vollständig komplementäre Nukleinsäuren hybridisieren, werden als stringente Hybridisierungsbedingungen bezeichnet. Stringente Hybridisierungsbe- dingungen sind dem Fachmann bekannt ( z.B. Sambrook et al., 1085, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Im allgemeinen, werden stringente Bedingungen so ausgewählt, daß die Schmelztemperatur 5°C niedriger ist als die Tm für die spezifische Sequenz bei einer definierten Ionenstärke und pH. Wenn die Hybridisierung unter weniger stringenten Bedingungen durchgeführt wird, dann werden Sequenz-Fehlpaarungen toleriert. Das Ausmaß an Sequenz-Fehlpaarungen kann durch Veränderung der Hybridisierungsbedingungen kontrolliert werden.
Die Durchführung der Hybridisierung unter stringenten Bedingungen ist besonders wichtig für das erfindungsgemäße Verfahren. Stringent im Sim e der vorliegenden Erfindung bedeutet, daß das Detektionsverfahren eine eindeutige Unterscheidung zwischen einer positiven Reaktion und einer negativen Reaktion im Reaktionsfeld des Streifens zuläßt. Dies kann insbesondere durch folgende Maßnahmen erzielt werden:
Struktur der Sonde: Durch die Länge der zur Zielsequenz komplementären Struktur der Sonde; bevorzugt sind 15 bis 20mere.
Laufpuffer: Durch den Salzgehalt wird die Stringenz beeinflußt. Die Ionenstärke liegt bevorzugt zwischen 100-400 mM, insbesondere bevorzugt um 250 mM.
Weiterhin kann durch die oben erwähnten mild denaturierenden Substanzen im Laufpuffer (DMSO, Formamid, Harnstoff) die Stringenz individuell eingestellt und optimiert werden. Die Stringenz wird auch durch den pH- Wert des Laufpuffers beeinflußt. Alle der oben genannten Maßnahmen sind letztlich Maßnahmen, die Einfluß auf Wasserstoffbrückenbindungen haben. Erfindungsgemäß bevorzugt ist, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde eine Nukleinsaure mit einer spezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsaure hybridisiert. Spezifische Sequenz bedeutet, daß eine definierte Nukleinsäurestruktur von vielen anderen Strukturen unterschieden werden kann. Dies kann zur Differenzierung von Mikroorganismen und Viren aber auch zu Unterscheidung von Nukleinsäurepolymoφhismen bei genetischen oder epidemiologischen Fragestellungen sein.
Die nachzuweisende Nukleinsaure kann isoliert werden aus einer Vielzalil von Organismen wie bakteriellen und viralen Pathogenen. Die nachzuweisende Nukleinsaure kann auch Gegenstand eines diagnostischen Nachweises für eine genetisch bedingte Krankheit sein. Die nachzuweisende Nukleinsaure kann jeder vorstellbaren Quelle entstammen, wenn die Detek- tion der Nukleinsaure oder Teile davon nachgewiesen, differenziert oder charakterisiert werden sollen. Meistens wird die nachzuweisende Nukleinsaure nicht direkt nachgewiesen, sondern muß vorher amplifiziert werden. (Für die Darstellung von möglichen Amplifikations- methoden siehe auch US 6,037,127.)
Die im folgenden beschriebene Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens soll die Erfindung näher erläutern. In dieser Ausführungsform ist die nachzuweisende Nukleinsaure ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder komplementär zu diesem. In dieser Ausführungsform ist die sequenzspezifische Nukleinsauresonde eine Nukleinsaure mit einer speziesspezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsaure hybridisiert. Bevorzugt ist die sequenzspezifische Nukleinsauresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1 -29, beziehungsweise ist ein Fragment davon, (siehe auch Abbildung 6 und 7)
Dem Fachmann ist bewußt, daß ausgehend von der Lehre der vorliegenden Erfindung auch Sonden entworfen werden können, die geringfügig von den erfindungsgemäßen Sonden abweichen, aber dennoch funktionieren. So sind auch Sonden denkbar, die gegenüber den erfindungsgemäßen Sonden mit den Sequenzen SEQ ID No. 1 - 29 am 5'-und/oder 3'-Ende Verlängerungen öder Verkürzungen um wenigstens ein, zwei oder drei Nukleotide aufweisen. Ebenso ist denkbar, daß einzelne oder wenige Nukleotide einer Sonde durch andere Nukleotide austauschbar sind, solange die Spezifität der Sonde nicht zu stark verändert wird und der Schmelzpunkt der Sonde nicht zu stark verändert wird. Das schließt ein, daß bei Abwandlung die Schmelztemperatur der abgewandelten Sonde nicht zu stark von der Schmelztemperatur der ursprünglichen Sonde abweicht. Die Schmelztemperatur wird dabei nach der G ( =4°C) + C ( =2°C) Regel ermittelt. Dem Fachmann ist klar, daß neben den üblichen Nukleotiden A, G, C, T auch modifizierte Nukleotide wie Inosin usw. zur Anwendung kommen können. Die Lehre der vorliegenden Erfindung ermöglicht solche Modifikationen, ausgehend vom Gegenstand der Ansprüche.
Erfindungsgemäß wird eine Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsaure oder einen Teil davon enthält, mit einer oder mehreren Sonden hybridisiert. Prinzipiell ist möglich, das durch Hybridisierung mit einer einzelnen spezifischen Sonde die nachzuweisende Nukleinsaure und damit beispielsweise die Bakterienspezies zu bestimmen. Es ist aber auch möglich, die Zusammensetzung, welche die nachzuweisende Nukleinsaure oder einen Teil davon enthält, mit mehr als einer Sonde zu hybridisieren. Dadurch wird die Aussagekraft des Verfahrens erhöht. Man erhält dann ein genaues Profil und kann die nachzuweisende Nukleinsaure und damit beispielsweise die Bakterienspezies mit hoher Sicherheit bestimmen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren eine Vorrichtung zur Durchführung eines erfindungsgemäßen Verfahrens in Form eines Trockenschnelltestes enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
- eine Probenaufnahmezone,
- eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und
- eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsauresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind.
Die bevorzugten Ausfuhrungsformen der Vorrichtung entsprechen im wesentlichen denen des erfindungsgemäßen Verfahrens.
Bevorzugt erfolgt die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsauresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist. Die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, beträgt mehr als 30 nm beträgt. Bevorzugt beträgt die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm. Insbesondere ist bevorzugt, daß der Linker Polythymidin ist.
Des weiteren ist bevorzugt, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist. Bevorzugt ist das chromatographische Material der erfindungsgemäßen Vorrichtung Nitrozellulose. Es ist weiterhin bevorzugt, daß das chromatographische Material eine Porengröße von 4 μm und größer aufweist.
In einer besonderen Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die sequenz- spezifische Nukleinsauresonde eine Nukleinsaure, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder an die dazu komplementäre Sequenz hybridisiert. In dieser Ausführungsform ist insbesondere bevorzugt, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1 -29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist des weiteren die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren, insbesondere zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Parodontitis assoziierten Bakterien.
Des weiteren ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens und der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Nachweis von Amplifikati- onsprodukten aus Amplifikationsverfahren wie der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) und der Nukleinsäurestrang basierende Amplifikation (NASBA). Es wird darauf hingewiesen, daß die Amplifikationsprodukte auch durch andere Nukleinsäureamplifikationstechniken entstanden sein können wie z.B. durch die Transcriptase vermittelte Amplifikation (TMA), Reverse Transcriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR), Q-beta Replicase Amplifikation (ß-Q- Replicase) und die Einzelstrangverdrängungs Amplification (SDA).
Abbildungsbeschreibung
Abbildung 1
Abbildung eines Teststreifens geeignet für den erfindungsgemäßen Trockenschnelltest Abbildung 2:
Trockenschnelltest (A) positiv für Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis und Bacteroides forsythus, sowie Trockenschnelltest (B) positiv fax Actinobacillus actinomycetemcomitans. 150 μl Testansatz wurden auf das Auftragskissen des Tests getropft und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Als Sonden für (A) wurden (von oben nach unten) eine Laufkontrolle (Biotin-BSA) und die Sonden für
Actinobacillus actinomycetemcomitans: 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.:16,
Porphyromonas gingivalis: 5'-PsoC6-T85-SEQ ID No.:21 und
Bacteroides forsythus:5'?soC6-TZ4-SΕQ ID No.:23 auf der Nitrozellulosemembran immobilisiert. Das heißt, daß alle Sonden jeweils 5 'Psoralen markiert sind und einen Polythymidinlinker von 85 Thymidinen aufweisen. In (A) ist eine für alle drei Sonden positive Probe gezeigt, während in (B) nur ein Amplifikat des Actinobacillus actinomycetemcomitans spezifisch detektiert wurde. Die Amplifikation wurde mit einem speziesspezifischen Primeφaar durchgeführt (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).
In Abbildung 2 verwendete Sonden:
SEQ ID No.: 16 5'PsoC6-T85- ccgaagaagaactcag (A. actinomycetemcomitans) SEQ ID No.: 21 5'PsoC6-T85- catacacttgtattattgc (Porphyromonas gingivalis) SEQ ID No.: 23 5'PsoC6-T85- aacaggggttccgca (Bacteroides forsythus)
In Abbildung 2 verwendete Primer:
SEQ ID No.: 14: 5 ' -Biotin- ggattggggtttagcccc
SEQ ID No. 4.: 5'-Biotin- ggataagggttgcgctcgtt
Abbildung 3:
Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität. Variation der Sonde SEQ ID No.: 16 im Polythymidinlinker: (A) ohne Linker, (B) 20 Thymidinresten und (C) 100 Thymidinresten. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).
Abbildung 4: Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität. In (A) wurde die Sonde SEQ ID No.16 mit Polythymidinlinker von 85 Thymidinresten ohne Psoralenmarkierung und in (B) mit Psoralenmarkierung immobilisiert. Amplifiziert wurde jeweils Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).
Abbildung 5:
Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetemcomitans -Amplifikat (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) wurde mit Hybridisierungspuffer (A) ohne DMSO, (B) 10 % DMSO, 20 % DMSO und 30 % DMSO auf den Trockenschnelltest aufgetragen. (Sonde SEQ ID No. 16, psoralenmar- kiert und mit dem Polymidinlinker mit 85 Polymidinresten).
Abbildung 6 und Abbildung 7
Sequenzen SEQ ID No. 1- 29, Nukleinsauresonden für den Nachweis Parodontitis assoziierter
Bakterien
Beispiel 1
Nachweis Parodontitis assoziierter Bakterien mit Hilfe des erfindungsgemäßen Trockenschnelltestes
Dazu werden die Sonden SEQ ID No. 1-29 ( die Sonden sind am 5'-Ende mit Psoralen modifiziert) auf eine Nitrozellulosemembran aufgebracht und durch UV-Bestrahlung gebunden. Der Aufbau des Schnelltestes ist in Abbildung 1 dargestellt.
DNS-Isolierung: Dazu wurde von Festmedien mit einer sterilen Impföse bakterielles Material entnommen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 suspendiert. Aus Flüssigkulturen wurde 1ml entnommen, 5min bei 13.000φm in einer Tischzentrifuge zentrifugiert, der Überstand verworfen und in 300μl lOmM Tris/HCl pH 7,5 resuspendiert. Die so erhaltenen Zellsuspensionen wurden 15min bei 95 °C in einem Thermomixer (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) inkubiert, 15min in einem Ultraschallbad (Bandelin electronic, Berlin, Deutschland) beschallt und 10min bei 13.000φm in einer Tischzentrifuge (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) zentrifugiert. Vom Überstand wurden jeweils 5μl in die Amplifikationsreaktion eingesetzt.
Amplifikation:
Alle Primer wurden kommerziell synthetisiert (Interactiva, Ulm, Deutschland). Der PCR-
Ansatz enthielt 1 x Taq-Puffer (Qiagen, Hilden, Deutschland), je lμM Primer, 200μM dNTP (Röche, Mannheim, Deutschland) und 1U Hotstar Taq-Polymerase (Qiagen, Hilden, Deutschland). Die PCR-Amplifikation wurde auf einem Thermocycler PE 9600 (ABI, Weiterstadt, Deutschland) mit 15min 95 °C, 10 Zyklen mit 30sek 95 °C und 2min 60°C und mit 20 Zyklen lOsek 95°C, 50sek 55°C und 30sek 70°C durchgeführt. DNS-Amplifikat wurde mit einem ethidiumbromidgefärbtem Agarosegel nachgewiesen.
Auf eine Nitrozellulosemembran AE 99 (Schleicher & Schüll, Dassel, Deutschland) wurden in Form von Linien durch einen Probenautomat 3 „Freemode" (CAMAG, Berlin, Deutschland) 5'-Psoralenmarkierte Oligonukleotidsonden (Aal, Pg2, Bf) gelöst in 3 x SSC (10 x SSC-Lösung 1,5M NaCl, 0,15M Trinatriumcitrat) aufgetragen. Als Färbekontrolle wurde eine Linie Biotin-BSA (SIGMA, München, Germany) lmg/ml aufgesprüht. Die Oligonukleotide wurden auf der Membran, nachdem sie vollständig getrocknet waren, in einem UV- Crosslinker (UV-Stratalinker 2400, Stratagene, La Jolla, USA) bei 1200 Joule/cm2 fixiert. Die beschichtete Membran wurde auf einen Vinylrücken geklebt und mit einem Probenkissen (Grad 903 Papier, Schleicher & Schüll, vorbehandelt mit 0,0 IM Natriumtetraborat, 1% Triton X-100, pH 7,4) und einem Zugkissen (Grad 470 Papier, Schleicher & Schüll) versehen. Die geschnittenen Streifen wurden in ein Kunststoffgehäuse eingepackt.
Für die Detektion wurden mit Streptavidin konjugierte Goldpartikel 20nm (British Biocell, Cardiff, Großbritannien) OD524, 4,0 benützt. 3μl dieser Goldpartikelsuspension wurden mit 20μl biotiniliertem Amplifikat vermischt 5min inkubiert. Die Denaturierung des Amplifikats wurde durch Zugabe einer NaOH-Lösung (Endkonzentration 200 mM) erreicht. Nach fünfminütiger Inkubation wurde die Lösung in 150μl Laufpuffer bestehend aus 250 mM Phos- phatpuffef, pH 7,5, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20 und 20% DMSO (SIGMA, München, Germany) neutralisiert und komplett auf die Auftragszone gegeben. Nach ca. 5 min können die entwickelten Zonen abgelesen werden.
Beispiel 2:
Einfluß der Länge des Linkerarms auf die Sensitivität
Um eine größere Sensitivität zur Verfügung zu haben, wurde die Detektion für die nachfolgenden Experimente ohne konjugierte Partikel, sondern durch eine Alkalische Phosphatase katalysierte Färbung mit NBT/BCIP durchgeführt. Dazu wurde der Streifen, nachdem die Zielnukleinsäure im Trockenschnelltestverfahren hybridisiert hatte, aus dem Gehäuse genommen und einmal in 1 x SSC für 1 min gewaschen. Durch Inkubation in 5g/l Blockingrea- genz (Röche, Mannheim, Deutschland) in Maleinsäurepuffer pH 7,5 (8,26 g NaCl und 10,06 g Maleinsäure in 1 1 Wasser) mit Streptavidin-Alkalische Phosphatase-Konjugat (1:5000 Verdünnung, Dianova, Hamburg, Deutschland) für 15 min. Nach dreimaligem Waschen mit Waschpuffer (3 x SSC, 0,1%) Tween 20) konnten die hybridisierte DNS durch Inkubation in Substratpuffer (274mM Tris/Cl pH 7,5, 68,6 mM Na3Citrat, 200mM NaCl, 27,4 mM MgCl2 x 6 H2O) mit NBT (75 mg/ml Nitroblautetrazoliumsalz in 70% Dimethylformamid) und BCIP (50 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indonylphosphat-toluidiniumsalz in 100%) Dimethylformamid) gefärbt werden.
Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No.16 ohne Polythymidinlinker, die gleiche Sonde mit Polythymidinlinker aus 20 Thymidinresten und mit 100 Thymidinresten hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4). Es ist eine deutliche Sensitivitätsabstufung korrelierend mit der Länge des Linkers zu sehen (siehe Abbildung 3). Die Sonde deren Linker 100 Thymidinresten lang ist, zeigt die höchste Sensitivität.
Beispiel 3:
Einfluß der Psoralenmarkierung auf die Sensitivität
Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No.16 mit Polythymidinlinker aus 100 Thymidinresten mit und ohne 5 '-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Als Amplifikat diente Actinobacillus actinomycetemcomitans (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4).Es ist eine deutliche Sensitivitätsabstufung korrelierend mit dem Vorhandensein der Psoralenmarkierung zu sehen. (Abb. 4). Psoralenmarkierte Sonden sind sensitiver.
Beispiel 4
Einfluß mild denaturierender Verbindungen auf die Sensitivität:
Auf den Streifen wurden wie unter Beispiel 1 beschrieben die Sonde SEQ ID No.16 mit Polythymidinlinker aus 100 Thymidinresten und mit 5 '-Psoralenmarkierung hybridisiert und mit NBT/BCIP entwickelt. Denaturiertes Actinobacillus actinomycetemcomitans -Amplifikat (Primeφaar 5'-Biotin-SEQ ID No.:14; 5'-Biotin-SEQ ID No.4) wurde mit Hybridisierungspuffer (A) ohne DMSO, (B) 10 % DMSO, 20 % DMSO und 30 % DMSO auf den Trockenschnelltest aufgetragen. Das heißt, der Laufpuffer enthält steigende Konzentration von DMSO n 0, 10, 20 und 30%. Der Test wird sensitiver bei DMSO Konzentrationen von mehr als %. (Abb. 5)

Claims

Ansprüche
1. Verfahren zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren in Form eines Trockenschnelltestes; der Trockenschnelltest enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
- eine Probenaufhahmezone,
- eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und
- eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsauresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind und weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren folgende Schritte umfaßt: i) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Falle doppelsträngiger Nukleinsäuren denaturiert und anschließend neutralisiert, ii) die nachzuweisende Nukleinsaure wird auf die Probenaufnahmezone in einem Laufpuffer, welcher mild denaturierende Agenzien enthält, aufgetragen, iii) die nachzuweisende Nukleinsaure bewegt sich von der Probenaufnahmezone in Richtung Flüssigkeit absorbierende Zone, iv) die nachzuweisende Nukleinsaure wird im Bindungsbereich der Trennstrecke mit der sequenzspezifischen Nukleinsauresonde in Kontakt gebracht und hybridisiert an die sequenzspezifische Nukleinsauresonde v) die nachzuweisende Nukleinsaure beziehungsweise die Hybridisierung der nachzuweisenden Nukleinsaure an die sequenzspezifische Nukleinsauresonde wird detektiert über eine Markierung, die an der nachzuweisenden Nukleinsaure angebracht ist oder über die Detektion einer Markierung des Nukleinsäuredoppelstranges.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsauresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 30 nm beträgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm beträgt.
5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker . Polytl ymidin ist.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsaure mit Biotin oder Fluoreszein markiert ist.
8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Material Nitrozellulose ist.
9. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Denaturierung gemäß Verfahrensschritt i) mit NaOH erfolgt und die Neutralisierung gemäß Verfahrensschritt i) mit einem Phosphatpuffer erfolgt.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Laufpuffer gemäß Verfahrensschritt ii) Phosphatpuffer ist und als mild denaturierendes Agens eines oder mehrere der nachfolgend genannten im Laufpuffer enthalten sind: Formamid, DMSO, Harnstoff.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekermzeichnet, daß die nachzuweisende Nukleinsaure ein Fragment aus dem Genom eines Parodontitis assoziierten Bakteriums oder komplementär zu diesem ist.
12. Verfahren gemäß Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde eine Nukleinsaure mit einer speziesspezifischen Sequenz ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an die nachzuweisende Nukleinsaure hybridisiert.
13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist:
SEQ ID No.: 1 —29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
14. Vorrichtung zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13 in Form eines Trockenschnelltestes enthaltend ein chromatographisches Material umfassend
- eine Probenaufnahmezone,
- eine Trennzone mit Bindungsbereich in welchem eine oder mehrere sequenzspezifische Nukleinsauresonden immobilisiert sind und
- eine hinter der Trennzone mit Bindungsbereich liegende Flüssigkeit absorbierende Zone, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifischen Nukleinsauresonden über einen Polymerlinker immobilisiert sind.
15. Vorrichtung gemäß Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Immobilisierung der sequenzspezifische Nukleinsauresonden an die Membran über einen Polymerlinker erfolgt, der mit einem Verankerungsmolekül verbunden ist.
16. Vorrichtung gemäß Anspruch 13 und 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 30 nm beträgt.
17. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Länge des Polymerlinkers bzw. des Polymerlinkers mit Verankerungsmolekül, mehr als 40 nm beträgt.
18. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, daß der Linker Polythymidin ist.
19. Vorrichtung gemäß Anspruch 14 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß das Verankerungsmolekül Psoralen ist.
20. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß das chromatographische Material Nitrozellulose ist.
21. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 20 dadurch gekennzeichnet, daß daß das chromatographische Material eine Porengröße von 4 μm und größer aufweist.
22. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde eine Nukleinsaure ist, welche unter stringenten Hybridisierungsbedingungen an ein Fragment aus dem Genom eines Paradontitis assoziierten Bakteriums oder an die dazu komplementäre Sequenz hybridisiert.
23. Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß die sequenzspezifische Nukleinsauresonde ausgewählt ist aus einer der folgenden Sequenzen beziehungsweise komplementär zu diesen Sequenzen ist: SEQ ID No.: 1 -29 beziehungsweise Fragmente davon enthält.
24. Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-23 zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Nukleinsäuren.
25.Verwendung einer Vorrichtung gemäß einem der Ansprüche 14-23 zum Nachweis, zur Differenzierung und zur Charakterisierung von Parodontitis assoziierten Bakterien.
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