EP1419254A2 - Genprodukte aus ashbya gossypii, die mit dem transmembran-transport assoziiert sind - Google Patents

Genprodukte aus ashbya gossypii, die mit dem transmembran-transport assoziiert sind

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Publication number
EP1419254A2
EP1419254A2 EP02758453A EP02758453A EP1419254A2 EP 1419254 A2 EP1419254 A2 EP 1419254A2 EP 02758453 A EP02758453 A EP 02758453A EP 02758453 A EP02758453 A EP 02758453A EP 1419254 A2 EP1419254 A2 EP 1419254A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
sequence
acid sequence
seq
vitamin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02758453A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Marvin Karos
Henning ALTHÖFER
Burkhard Kröger
Jose L. Revuelta Doval
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from DE2001139455 external-priority patent/DE10139455A1/de
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1419254A2 publication Critical patent/EP1419254A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/42—Cobalamins, i.e. vitamin B12, LLD factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi

Definitions

  • the present invention relates to novel polynucleotides from Ashbya gossypu; oligonucleotides hybridizing therewith; Expression cassettes and vectors containing these polynucleotides; microorganisms transformed therewith; polypeptides encoded by these polynucleotides; and the use of the new polypeptides and polynucleotides as targets for modulating transmembrane transport and in particular for improving vitamin B2 production in microorganisms of the genus Ashbya.
  • Vitamin B2 (riboflavin, lactoflavin) is an alkali and light sensitive vitamin that fluoresces yellow-green in solution. Vitamin B2 deficiency can lead to ectoderm damage, in particular lens opacification, keratitis, comea vascularization, neurovegetative and urogenital disorders. Vitamin B2 is the precursor for the biological hydrogen transfer molecules FAD and FMN, which are important in addition to NAD + and NADP + . These are formed from vitamin B2 by phosphorylation (FMN) and subsequent adenylation (FAD).
  • FMN biological hydrogen transfer molecules
  • Vitamin B2 is synthesized in plants, yeasts and many microorganisms from GTP and ribulose-5-phosphate.
  • the pathway begins with the opening of the imidazole ring from GTP and the cleavage of a phosphate residue.
  • 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidinone is formed by deamination, reduction and elimination of the remaining phosphate.
  • the reaction of this compound with 3,4-dihydroxy-2-butanone-4-phosphate leads to the bicyclic molecule 6,7-dimethyl-8-ribityllumazine.
  • This compound is converted into the tricyclic compound riboflavin by dismutation in which a 4-carbon unit is transferred.
  • Vitamin B2 is found in many vegetables and meat, less in cereal products. An adult's daily vitamin B2 requirement is around 1.4 to 2 mg. The main breakdown product of the FMN and FAD coenzymes in humans is again riboflavin, which is excreted as such.
  • Vitamin B2 is therefore an important nutritional supplement for humans and animals. There is therefore a desire to make vitamin B2 accessible on a technical scale. It has therefore been proposed to synthesize vitamin B2 in a microbiological way.
  • Useful microorganisms for this are, for example, Bacillus subtilis, the Ascomycetes Eremothecium ashbyii, Ashbya gossypu and the yeasts Candida flareriuxx ⁇ Saccharomyces cerevisiae.
  • the nutrient media used for this include molasses or vegetable oils as a carbon source, inorganic salts, amino acids, animal or vegetable peptones and proteins as well as vitamins. minzu accounts.
  • vitamin B2 The microbiological production of vitamin B2 is described, for example, in WO-A-92/01060, EP-A-0405 370 and EP-A-0 531 708.
  • vitamin B2 An overview of the meaning, occurrence, production, biosynthesis and use of vitamin B2 can be found, for example, in Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, volume A27, pages 521 ff.
  • the cell membranes serve a number of functions in a cell. First of all, a membrane differentiates the cell content from the environment, so that the cell maintains integrity. The membranes also serve as barriers so that dangerous or undesired connections cannot flow in and desired connections cannot flow out.
  • cell membranes are inherently impermeable to the not facilitated diffusion of hydrophilic compounds such as proteins, water molecules and ions: a double layer of lipid molecules in which the polar head groups protrude outwards (out of the cell or into the cell interior) and that protruding non-polar tails to the middle of the double layer and forming a hydrophobic core (for a general overview of the structure and function of the membrane see Gennis, RB (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg).
  • This barrier enables the cells to contain a relatively higher concentration of desired compounds and a relatively smaller concentration of undesired compounds than the surrounding medium, since the diffusion of these compounds through the membrane is efficiently blocked.
  • the membrane also provides an effective barrier against the import of desired molecules and the export of waste molecules.
  • the cell membranes contain many types of transporter proteins that can facilitate the transmembrane transport of various types of compounds: pores or channels and transporters.
  • the former are integral membrane proteins, sometimes protein complexes, that form a regulated opening through the membrane.
  • This regulation or "gating" is usually specific to the substrates to be transported through the pore or channel, so that these transmembrane constructs are specific to a specific class of substrates; for example, a potassium channel is constructed such that only ions with a similar charge and Size like potassium can get through.
  • Channel and pore proteins have certain hydrophobic and hydrophilic domains so that the hydrophobic portion of the protein can attach to the interior of the membrane, whereas the hydrophilic portion defines the interior of the channel, providing a protected hydrophilic environment through which the selected hydrophilic Molecule can arrive.
  • Many such pores / channels are known in the art, including those for potassium, calcium, sodium and chloride ions.
  • This system which is mediated by pores and channels, is restricted to very small molecules, such as ions, since pores or channels which are sufficiently large that they enable the passage of complete proteins by facilitating diffusion would also not be able to pass through smaller ones To prevent molecules.
  • the transport of molecules through this process is sometimes referred to as "facilitated diffusion” because the driving force of a concentration gradient is required for the transport to take place.
  • Permeases also facilitate the easier diffusion of larger molecules, such as glucose or other sugars, into the cell if the concentration of these molecules is greater on one side of the membrane than on the other (also referred to as "uniport").
  • these integral proteins (which often have 6 to 14 membrane-spanning helices) do not form open channels through the membrane, but do bind to the target molecule on the membrane surface and then undergo a conformational change, so that the target molecule on the opposite set side of the membrane is released.
  • the object of the present invention is therefore to provide new targets for influencing the transmembrane transport in microorganisms of the genus Ashbya, in particular in Ashbya gossypu.
  • the task is to improve the transmembrane transport in such microorganisms.
  • Another task is the improvement of vitamin B2 production by such microorganisms.
  • the above object is achieved in particular by providing coding nucleic acid sequences which are up or down-regulated in Ashbya gossypu during vitamin B2 production (based on results determined using the MPSS analysis method described in more detail in the experimental part).
  • polynucleotides which can be isolated from Ashbya gossypu and which code for a protein which is associated with transmembrane transport and / or is a transmembrane protein and in particular has a structural (for example sequence homology) and / or functional structure which is given in Table 1 Possess property (eg enzyme activity); specifically:
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 19”. According to a further preferred embodiment, a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 19v”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 1.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 3 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 19” and “Oligo 19v” have significant homologies with the MIPS tag "Ygr257c” from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 3, respectively
  • the corresponding counter strand of SEQ ID NO: 1 or of the coding strand derived according to SEQ ID NO: 3 has an amino acid sequence or partial amino acid sequence which has significant sequence homology with a mitochondrial energy-transferring protein from S. cerevisiae.
  • ABC ATP binding cassette proteins act as transport systems and are involved in the uptake or release of substrates from the cell. The transport process is driven by ATP hydrolysis.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 24”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 24”.
  • One object of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 5.
  • Another object of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 8 or a fragment thereof. of.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 24" and “Oligo 24v” have significant homologies with the MIPS tag "Mdl2" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 8, respectively, that of the corresponding opposite strand amino acid sequence or partial amino acid sequence derived from SEQ ID NO: 5 or from coding strand according to SEQ ID NO: 8 has significant sequence homology with an ABC transport protein from S. cerevisiae.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 109”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 109v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 10.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 12 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 109" and “Oligo 109v” have significant homologies with the MIPS tag "Prp12" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 10 and SEQ ID NO: 12, respectively.
  • the coding strand derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a membrane-integrated mitochondrial protein from S. cerevisiae.
  • a cDNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 163”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and bears the internal name “Oligo 163v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 14.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 17 or fragments thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 163" and “Oligo 163v” have significant homologies with the MIPS tag "Flx1" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 14 and SEQ ID NO: 17.
  • the coding strand derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a mitochondrial inner membrane transport protein from S. cerevisiae.
  • e a, preferably downregulated nucleic acid sequence which codes for a protein with the function of a non-vacuolar 102 kD subunit of the H + -ATPase-VO domain.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 31”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 31v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 19.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 21 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 31" and “Oligo 31 v” have significant homologies with the MIPS tag "STV1" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 19 and SEQ ID NO: 21, respectively Strand-derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a non-vacuolar 102 kD subunit of the H + -ATPase-VO domain from S. cerevisiae.
  • a, preferably upregulated, nucleic acid sequence which is suitable for a protein with a
  • a cDNA clone was isolated according to the invention which codes for a characteristic part-sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 4”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 4v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 23.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 26 or the sequence complementary thereto according to SEQ ID NO: 25.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 4" and “Oligo 4v” have significant homologies with the MIPS tag "OPT2" from S. cerevisiae.
  • the insert comprises a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 23 and 25, respectively.
  • the coding strand (comprising SEQ ID NO: 26) derived amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a protein from S. cerevisiae with a similarity to the isp4 protein from S. pombe.
  • the activity of an oligopeptide transporter is therefore assigned to the proteins according to the invention.
  • a, preferably upregulated, nucleic acid sequence which codes for a protein with the function of a VAC1 protein from S. cerevisiae, a cytosolic and peripheral membrane protein with three zinc fingers.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 6”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 6v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 28.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 31 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 6" and “Oligo 6v” have significant homologies with the MIPS tag "VAC1" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 28 and SEQ ID NO: 31, respectively, that of the corresponding opposite strand to SEQ ID NO: 28 or from the strand according to SEQ ID NO: 31 amino acid sequence or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a VAC1 protein, a cytosolic and peripheral membrane protein with three zinc fingers, from S. cerevisiae.
  • h a, preferably upregulated, nucleic acid sequence which codes for a protein with an ATPase-like function.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 146”. According to a further preferred embodiment, a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 146v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 33.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 35 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 146" and “Oligo 146v” have significant homologies with the MIPS tag "Ymr162c" from S. ce revisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 35, respectively the corresponding counter strand of SEQ ID NO: 33 or the amino acid sequence or partial amino acid sequence derived from the coding strand according to SEQ ID NO: 35 has significant sequence homology with a protein with an ATPase or ATPase-like function from S. cerevisiae.
  • a, preferably upregulated nucleic acid sequence which is suitable for a protein with the
  • PH085 is a kinase and is involved in various cellular processes including regulation of the PHO gene, glycogen metabolism, regulation of the Zeil cycle and Zeil morphology.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 56”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 56v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 37.
  • Another subject of the invention relates to a
  • Polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 40 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides are preferably from a microorganism of the genus Ashbya, especially A. gossypii isolable.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 56" and “Oligo 56v” have significant homologies with the MIPS tag "Ypl110c” from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 37 and SEQ ID NO: 40, respectively. That of the corresponding opposite strand for SEQ ID NO: 37 or SEQ ID NO: 40 derived from the coding strand genetically, or partial amino acid sequence has significant sequence homology with a PH085 protein from S. remplivisiae.
  • k a, preferably upregulated, nucleic acid sequence which codes for a protein with the function comparable to that of a p24 protein from S. cerevisiae involved in membrane traffic.
  • Members of the p24 protein family are small type I transmembrane proteins with a short cytoplasmic COOH terminus. These have a transport function in the early secretory way and are e.g. involved in the transport of various secretory proteins from the endoplasmic reticulum to the Golgi apparatus.
  • a DNA clone was isolated which codes for a characteristic partial sequence of the nucleic acid sequence according to the invention and which bears the internal name “Oligo 167”.
  • a DNA clone was isolated according to the invention which codes for the full sequence of the nucleic acid according to the invention and which bears the internal name “Oligo 167v”.
  • a first subject of the present invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 42.
  • Another subject of the invention relates to a polynucleotide comprising a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 44 or a fragment thereof.
  • the polynucleotides can preferably be isolated from a microorganism of the genus Ashbya, in particular A. gossypii.
  • the invention also relates to the complementary polynucleotides; and the sequences derived from these polynucleotides by degenerating the genetic code.
  • the inserts of "Oligo 167" and “Oligo 167v” have significant homologies with the MIPS tag "ERP5" from S. cerevisiae.
  • the inserts have a nucleic acid sequence according to SEQ ID NO: 42 and SEQ ID NO: 44, respectively. That of the corresponding opposite strand to SEQ ID NO: 42 and amino acid sequences derived from the coding strand of SEQ ID NO: 44 have significant sequence homology with the p24 protein from S. cerevisiae involved in membrane traffic.
  • Another object of the invention relates to oligonucleotides which hybridize with one of the above polynucleotides, in particular under stringent conditions.
  • the invention furthermore relates to polynucleotides which hybridize with one of the oligonucleotides according to the invention and code for a gene product from microorganisms of the genus Ashbya or a functional equivalent of this gene product.
  • the invention further relates to polypeptides or proteins which are encoded by the polynucleotides described above; and peptide fragments thereof which have an amino acid sequence which have at least 10 contiguous amino acid residues according to SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11, 13, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 29, 30 , 32, 34, 36, 38, 39, 41, 43 or SEQ ID NO: 45; and functional equivalents of the polypeptides or proteins according to the invention.
  • Functional equivalents differ from the products specifically disclosed according to the invention in their amino acid sequence by addition, insertion, substitution, deletion or inversion to at least one, such as 1 to 30 or 1 to 20 or 1 to 10, sequence positions without losing the protein function originally observed and which can be derived by comparing the sequence with other proteins. This means that equivalents can have essentially identical, higher or lower activities compared to the native protein.
  • inventions relate to expression cassettes for the recombinant production of proteins according to the invention, comprising in operative linkage with at least one regulatory nucleic acid sequence one of the nucleic acid sequences defined above; as well as recombinant vectors comprising at least one such expression cassette according to the invention.
  • prokaryotic or eukaryotic hosts are also provided which are transformed with at least one vector of the above type.
  • such prokaryotic or eukaryotic hosts are provided in which the functional expression of at least one gene is modulated (eg inhibition or overexpression) which codes for a polypeptide according to the invention as defined above; or in which the biological activity of a polypeptide is reduced or increased as defined above is.
  • Preferred hosts are selected from Ascomycetes (tubular mushrooms), in particular those of the genus Ashbya and preferably strains of A. gossypii.
  • Modulation of gene expression in the above sense includes both its inhibition, e.g. by blocking an expression level (in particular transcription or translation) or by deliberately overexpressing a gene (e.g. by modifying regulatory sequences or increasing the number of copies of the coding sequence).
  • the invention further relates to the use of an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention or a host according to the invention for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof.
  • Another object of the invention relates to the use of an expression cassette according to the invention, a vector according to the invention or a host according to the invention for the recombinant production of a polypeptide according to the invention as defined above.
  • a method for the detection or validation of an effector target for the modulation of the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is also provided.
  • a microorganism which is capable of microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is treated with an effector which interacts with a target selected from a polypeptide according to the invention as defined above or a nucleic acid sequence coding therefor (such as, for example, binds to these non-covalently), validates the influence of the effector on the amount of the microbiologically produced vitamin B2 and / or the precursor and / or a derivative thereof; and optionally isolating the target.
  • the validation is preferably carried out by direct comparison with the microbiological vitamin B2 production in the absence of the effector under otherwise identical conditions.
  • the invention further relates to a method for modulating (in terms of quantity and / or speed) the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof, using a microorganism which is responsible for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof is treated with an effector which interacts with a target selected from a polypeptide according to the invention as defined above or a nucleic acid sequence coding therefor.
  • Preferred examples of the above-mentioned effectors are: a) antibodies or antigen-binding fragments thereof; b) polypeptide ligands which differ from a) and which interact with a polypeptide according to the invention; c) low molecular weight effectors which modulate the biological activity of a polypeptide according to the invention; d) antisense nucleic acid sequences which interact with a nucleic acid sequence according to the invention.
  • Another object of the invention relates to a method for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof, wherein a host is cultivated according to the above definition under conditions which favor the production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof and isolate the desired product (s) from the culture batch. It is preferred that the host is treated with an effector according to the above definition before and / or during cultivation.
  • a preferred host is selected from microorganisms of the genus Ashbya; especially transformed, as described above.
  • a last subject of the invention relates to the use of a polynucleotide or polypeptide according to the invention as a target for modulating the production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof in a microorganism of the genus Ashbya.
  • FIG. 1 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to position 609 to 1 in SEQ ID NO: 1) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Ygr257c from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are given between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 2 shows an alignment between a partial amino acid sequence according to the invention (SEQ ID NO: 6) (corresponding to the opposite strand to positions 1494 to 1387 in SEQ ID NO: 5) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Mdl2 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 3 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the coding strand in position 15 to 455 in SEQ ID NO: 10) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Prp12 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 4 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the coding strand in position 246 to 1118 in SEQ ID NO: 14) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Flx1 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 5 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the coding strand in positions 2 to 790 in SEQ ID NO: 19) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag STV1 from S. cerevisiae (lower sequence) , Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 6 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 869 to 522 in SEQ ID NO: 23) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag OPT2 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 7A shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 356 to 243 in SEQ ID NO: 28) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag VAC1 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 7B shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to position 166 to 2 in SEQ ID NO: 28) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag VAC1 from S . cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 8 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the opposite strand to positions 904 to 707 in SEQ ID NO: 33) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Ymr162c from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 9 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 898 to 5 in SEQ ID NO: 37) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag Ypl110c from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • FIG. 10 shows an alignment between an amino acid partial sequence according to the invention (corresponding to the counter strand to positions 931 to 806 in SEQ ID NO: 42) (upper sequence) and a partial sequence of the MIPS tag ERP5 from S. cerevisiae (lower sequence). Identical sequence positions are indicated between the two sequences. Similar sequence positions are marked with "+”.
  • the nucleic acid molecules according to the invention encode proteins or proteins which are referred to here as proteins of the trans-membrane transport (for example with activity with regard to the transmembrane transport systems) or briefly as “TMT proteins”.
  • TMT proteins have, for example, a function in the control of membrane-based transporter systems, transport the desired proteins into the cell using energy against a concentration gradient.
  • the TMT proteins can influence the cell response to external conditions and thereby regulate eg the metabolism of the cell. Due to the availability of cloning vectors usable in Ashbya gossypii, as disclosed for example in Wright and Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., And techniques for the genetic manipulation of A.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of these organisms, in particular of A gossyp /, to use them as To make producers of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof better and more efficient.
  • This improved production or efficiency can take place due to a direct effect of the manipulation of a gene according to the invention or due to an indirect effect of such a manipulation.
  • the present invention is based on the provision of new molecules, which are referred to here as TMT nucleic acids and TMT proteins, and on the transmembrane transport, in particular in Ashbya gossypii, (for example in the synthesis or regulation of transport protein nen) are involved.
  • TMT nucleic acids and TMT proteins for example in the synthesis or regulation of transport protein nen
  • the activity of the TMT molecules according to the invention is preferably modulated such that the metabolic and / or energy pathways of A.
  • gossypii in which the TMT proteins according to the invention participate, with regard to the yield, production and / or efficiency of vitamin B2 production be modulated, which directly or indirectly modulates the yield, production and / or efficiency of vitamin B2 production in A gossypii.
  • nucleic acid sequences provided according to the invention can be isolated, for example, from the genome of an Ashbya gossyp // strain which is freely available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 10895.
  • the cell response of the cell can be strengthened and thus the formation of desired valuable products can be increased.
  • the mutagenesis of one or more TMT proteins according to the invention can also lead to TMT proteins with changed (increased or decreased) activities which indirectly influence the production of the desired product from Agossypii.
  • the TMT proteins can be used to adapt the cells to new or changed external conditions. By improving the growth and reproduction of these altered cells, it is possible to increase the viability of the cells in cultures on a large scale and also to improve the division rate. Finally, this can increase the yield of the desired target products produced by these cells.
  • the invention relates to polypeptides which comprise the above-mentioned amino acid sequences or characteristic partial sequences thereof and / or are encoded by the nucleic acid sequences described herein. Also included according to the invention are “functional equivalents” of the specifically disclosed new polypeptides.
  • “Functional equivalents” or analogs of the specifically disclosed polypeptides are, within the scope of the present invention, different polypeptides which furthermore have the desired biological activity (such as substrate specificity).
  • “functional equivalents” are understood to mean, in particular, mutants which, in at least one of the above-mentioned sequence positions, have a different amino acid than the one specifically mentioned, but nevertheless have one of the above-mentioned biological activities.
  • “Functional equivalents” thus encompass the mutants obtainable by one or more amino acid additions, substitutions, deletions and / or inversions, the changes mentioned being able to occur in any sequence position as long as they lead to a mutant with the property profile according to the invention.
  • Functional equivalence is particularly given when the reactivity patterns between mutant and unchanged polypeptide match qualitatively, i.e. for example, the same substrates can be implemented at different speeds.
  • “Functional equivalents” in the above sense are also precursors of the described polypeptides and functional derivatives and salts of the polypeptides.
  • the term “salts” means both salts of carboxyl groups and acid addition salts of amino groups of the protein molecules according to the invention.
  • Salts of carboxyl groups can be prepared in a manner known per se and include inorganic salts, such as, for example, sodium, calcium, ammonium, iron and zinc salts, and salts with organic bases, such as, for example, amines, such as triethanolamine, arginine, lysine , Piperidine and the like.
  • Acid addition salts such as, for example, salts with mineral acids, such as hydrochloric acid or sulfuric acid, and salts with organic acids, such as acetic acid and oxalic acid, are also a subject of the invention.
  • “Functional derivatives” of polypeptides according to the invention can also be prepared on functional amino acid side groups or on their N- or C-terminal end using known techniques. Such derivatives include, for example, aliphatic esters of carboxylic acid groups, amides of carboxylic acid groups, obtainable by reaction with ammonia or with a primary or secondary amine; N-acyl derivatives of free amino groups, prepared by reaction with acyl groups; or O-acyl derivatives of free hydroxyl groups, produced by reaction with acyl groups.
  • “Functional equivalents” naturally also include polypeptides that are accessible from other organisms, as well as naturally occurring variants. For example, regions of homologous sequence regions can be determined by sequence comparison and equivalent enzymes can be determined based on the specific requirements of the invention.
  • “Functional equivalents” also include fragments, preferably individual domains or sequence motifs, of the polypeptides according to the invention which, for example, have the desired biological function.
  • “Functional equivalents” are also fusion proteins which contain one of the abovementioned polypeptide sequences or functional equivalents derived therefrom and at least one further, functionally different, heterologous sequence in functional N- or C-terminal linkage (ie without mutual substantial functional impairment of the fusion protein parts).
  • heterologous sequences are, for example, signal peptides, enzymes, immunoglobulins, surface antigens, receptors or receptor ligands.
  • “Functional equivalents” encompassed according to the invention are homologs to the specifically disclosed proteins. These have at least 60%, preferably at least 75%, in particular at least 85%, such as 90%, 95% or 99%, homology to one of the specifically disclosed Sequences calculated according to the algorithm of Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85 (8), 1988, 2444-2448.
  • equivalents according to the invention include proteins of the type described above in deglycosylated or glycosylated form and also modified forms obtainable by changing the glycosylation pattern.
  • homologs of the proteins or polypeptides of the invention can be generated by mutagenesis, e.g. by point mutation or shortening of the protein.
  • the term "homolog” as used here refers to a variant form of the protein which acts as an agonist or antagonist of protein activity.
  • Homologs of the proteins according to the invention can be identified by screening combinatorial banks of mutants, such as, for example, shortening mutants.
  • a varied bank of protein variants can be generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level, such as, for example, by enzymatic ligation of a mixture of synthetic oligonucleotides.
  • processes that are potential for making banks Homologs from a degenerate oligonucleotide sequence can be used. Chemical synthesis of a degenerate gene sequence can be performed in an automated DNA synthesizer, and the synthetic gene can then be ligated into an appropriate expression vector.
  • degenerate set of genes makes it possible to provide all sequences in a mixture which encode the desired set of potential protein sequences.
  • Methods for the synthesis of degenerate oligonucleotides are known to those skilled in the art (eg Narang, SA (1983) Tetrahedron 39: 3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11: 477).
  • banks of fragments of the protein codon can be used to generate a varied population of protein fragments for screening and for the subsequent selection of homologues of a protein according to the invention.
  • a bank of coding sequence fragments can be obtained by treating a double-stranded PCR fragment of a coding sequence with a nuclease under conditions under which nicking occurs only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, renaturing the DNA to form double-stranded DNA Sense / antisense pairs of different nodded products can be removed, single-stranded sections removed from newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector.
  • This method can be used to derive an expression bank which encodes N-terminal, C-terminal and internal fragments with different sizes of the protein according to the invention.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • the polypeptides according to the invention can be produced recombinantly (cf. the following sections) or can be in native form using conventional biochemical procedures (cf.
  • the invention also relates to nucleic acid sequences (single and double stranded DNA and RNA sequences, such as cDNA and mRNA) coding for one of the above polypeptides and their functional equivalents, which e.g. are accessible using artificial nucleotide analogs.
  • the invention relates both to isolated nucleic acid molecules which code for polypeptides according to the invention or proteins or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which e.g. can be used for use as hybridization probes or primers for the identification or amplification of coding nucleic acids according to the invention.
  • nucleic acid molecules according to the invention can also contain untranslated sequences from the 3 'and / or 5' end of the coding gene region.
  • nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid and, moreover, can be substantially free of other cellular material or culture medium when produced by recombinant techniques, or free of chemical precursors or other chemicals be when it's chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention can be isolated using standard molecular biological techniques and the sequence information provided according to the invention.
  • cDNA can be isolated from a suitable cDNA library by using one of the specifically disclosed complete sequences or a section thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising one of the disclosed sequences or a Isolate portion thereof by polymerase chain reaction using the oligonucleotide primers created based on this sequence.
  • the nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • the oligonucleotides according to the invention which correspond to a TMT nucleotide sequence can also be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • the invention further comprises the nucleic acid molecules complementary to the specifically described nucleotide sequences or a section thereof.
  • the nucleotide sequences according to the invention enable the generation of probes and primers which can be used for the identification and / or cloning of homologous sequences in other cell types and organisms.
  • probes or primers usually comprise a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, can contain at least about 12, preferably at least about 25, e.g. about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand of a nucleic acid sequence according to the invention or a corresponding antisense strand are hybridized.
  • nucleic acid sequences according to the invention are derived from SEQ ID NO: 1, 3, 5, 8, 10, 12, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 31, 33, 35, 37, 40, 42 or SEQ ID NO: 44 and differ from them by addition, substitution, insertion or deletion of one or more nucleotides, but continue to code for polypeptides with the desired property profile.
  • nucleic acid sequences which comprise so-called silent mutations or which have been modified in accordance with the codon usage of a specific source or host organism, in comparison to a specifically named sequence, as well as naturally occurring variants, such as e.g. Splice variants or allele variants, thereof.
  • Sequences obtainable by conservative nucleotide substitutions i.e. the amino acid in question is replaced by an amino acid of the same charge, size, polarity and / or solubility are also a subject of the invention.
  • the invention also relates to the molecules derived from the specifically disclosed nucleic acids by sequence polymorphisms. These genetic polymorphisms can exist between individuals within a population due to natural variation. These natural variations usually cause a variance of 1 to 5% in the nucleotide sequence of a gene. Furthermore, the invention also encompasses nucleic acid sequences which hybridize with the above-mentioned coding sequences or are complementary thereto. These polynucleotides can be found when screening genomic or cDNA libraries and, if appropriate, can be amplified therefrom using suitable primers by means of PCR and then isolated, for example, using suitable probes.
  • polynucleotides according to the invention can also be synthesized chemically.
  • the property of being able to “hybridize” to polynucleotides means the ability of a poly- or oligonucleotide to bind to an almost complementary sequence under stringent conditions, while under these conditions non-specific bindings between non-complementary partners are avoided.
  • the sequences should be closed 70-100%, preferably 90-100%, of complementary nature
  • the property of complementary sequences to be able to specifically bind to one another is demonstrated, for example, in the Northern or Southern blot technique or in primer binding in PCR or RT-PCR, usually using oligonucleotides with a length of 30 base pairs or more.
  • Another aspect of the invention relates to "antisense" nucleic acids.
  • This comprises a nucleotide sequence that is complementary to a coding "sense" nucleic acid.
  • the antisense nucleic acid can be complementary to the entire coding strand or only to a portion thereof
  • the antisense nucleic acid molecule is antisense to a non-coding region of the coding strand of a nucleotide sequence.
  • non-coding region relates to the sequence sections designated as 5 'and 3' untranslated regions.
  • An antisense oligonucleotide can be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides in length.
  • An antisense nucleic acid according to the invention can by chemical synthesis and enzymatic ligation reactions can be constructed using methods known in the art.
  • An antisense nucleic acid can be chemically synthesized using naturally occurring nucleotides or variously modified nucleotides that are designed to increase the biological stability of the molecules or to increase the physical stability of the duplex that is between the antisense and Sense nucleic acid has arisen. For example, phosphorothioate derivatives and acridine substituted nucleotides can be used.
  • modified nucleosides that can be used to generate the antisense nucleic acid include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-ioduracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxyhydroxymethyl) uracil, 5- carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2,2-dimethylguanine, 2-methyladenine, 2-methylguanine 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-mannosylqueosine, 5'-methoxycarboxymethylura
  • the antisense nucleic acid molecules according to the invention are usually administered to a cell or generated in situ so that they hybridize with or bind to the cellular mRNA and / or a coding DNA so that the expression of the protein, e.g. by inhibiting transcription and / or translation.
  • the antisense molecule can be modified to specifically bind to a receptor or to an antigen that is expressed on a selected cell surface, e.g. by linking the antisense nucleic acid molecule to a peptide or an antibody that binds to a cell surface receptor or antigen.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be administered to cells using the vectors described herein. To achieve sufficient intracellular concentrations of the antisense molecules, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is under the control of a strong bacterial, viral or eukaryotic promoter are preferred.
  • the antisense nucleic acid molecule according to the invention is an alpha-anomeric nucleic acid molecule.
  • An alpha-anomeric nucleic acid molecule forms specific double-stranded hybrids with complementary RNA, whereby the strands run parallel to each other in contrast to ordinary alpha units.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be a 2'-0-methyl ribonucleotide (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett 215: 327-330).
  • the invention also relates to ribozymes.
  • ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave a single-stranded nucleic acid, such as an mRNA, to which they have a complementary region.
  • ribozymes e.g. Hammerhead ribozymes (described in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)
  • a ribozyme with specificity for a coding nucleic acid according to the invention can e.g. on the basis of a cDNA specifically disclosed herein.
  • a derivative of a Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed, the nucleotide sequence of the active site being complementary to the nucleotide sequence which is to be cleaved in a coding mRNA according to the invention.
  • mRNA can be used to select a catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA molecules (see e.g. Bartel, D., and Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418).
  • sequences according to the invention can alternatively be inhibited by directing nucleotide sequences which are complementary to the regulatory region of a nucleotide sequence according to the invention (for example to a promoter and / or enhancer of a coding sequence) in such a way that triple helix structures are formed which correspond to the transcription of the prevent the gene in target cells (Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6 (6) 569-584; Helene, C. et al., (1992) Ann. NY Acad. Sci. 660: 27- 36; and Mower. LJ (1992) Bioassays 14 (12): 807-815).
  • the invention also relates to expression constructs containing, under the genetic control of regulatory nucleic acid sequences, a nucleic acid sequence coding for a polypeptide according to the invention; and vectors comprising at least one of these expression constructs.
  • Such constructs according to the invention preferably comprise a promoter 5'-upstream of the respective coding sequence and 3'-downstream a terminator sequence and, if appropriate, further customary regulatory elements, in each case operatively linked to the coding sequence.
  • An "operative link” means the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and optionally further regulatory elements is such that each of the regulatory elements can fulfill its function in the expression of the coding sequence as intended.
  • sequences which can be linked operatively are targeting sequences and enhancers, polyadenylation signals and the like.
  • Other regulatory elements include selectable markers, amplification signals, origins of replication and the like. Suitable regulatory sequences are described, for example, in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
  • the natural regulatory sequence can still be present before the actual structural gene. This natural regulation can possibly be switched off by genetic modification and the expression of the genes increased or decreased.
  • the gene construct can, however, also have a simpler structure, that is to say no additional regulation signals are inserted in front of the structural gene and the natural promoter with its regulation is not removed. Instead, the natural regulatory sequence is mutated so that regulation no longer takes place and gene expression is increased or decreased.
  • the nucleic acid sequences can be contained in one or more copies in the gene construct.
  • Examples of useful promoters are: cos, tac, trp, tet, trp-tet, Ipp, lac, Ipp-lac, laclq, T7, T5, T3, gal, tre -, ara, SP6, ⁇ -PR or in the ⁇ -PL promoter, which are advantageously used in gram-negative bacteria; as well as the gram-positive promoters amy and SP02, the yeast promoters ADC1, MF ⁇ , AC, P-60, CYC1, GAPDH or the plant promoters CaMV / 35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1, B33, not or the ubiquitin or phaseolin promoter.
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter
  • inducible promoters such as, for example, light-inducible and in particular temperature-inducible promoters, such as the P r P r promoter
  • all natural promoters with their regulatory sequences can be used.
  • synthetic promoters can also be used advantageously.
  • the regulatory sequences mentioned are intended to enable the targeted expression of the nucleic acid sequences. Depending on the host organism, this can mean, for example, that the gene is only expressed or overexpressed after induction, or that it is expressed and / or overexpressed immediately.
  • the regulatory sequences or factors can preferably have a positive influence on the expression and thereby increase or decrease it.
  • the regulatory elements can advantageously be strengthened at the transcription level by using strong Transcription signals such as promoters and / or "enhancers" can be used.
  • an increase in translation is also possible, for example, by improving the stability of the mRNA.
  • An expression cassette is produced by fusing a suitable promoter with a suitable coding nucleotide sequence and a terminator or polyadenylation signal.
  • Common recombination and cloning techniques such as those described in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in T.J. Silhavy, M.L. Berman and L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987).
  • the recombinant nucleic acid construct or gene construct is advantageously inserted into a host-specific vector which enables optimal expression of the genes in the host.
  • Vectors are well known to those skilled in the art and can be found, for example, in "Cloning Vectors" (Pouwels P.H. et al., Ed., Elsevier, Amsterdam-New York-Oxford, 1985).
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus and adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, cosmids, and linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or can be replicated chromosomally.
  • fusion expression vectors such as pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) which glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST glutathione-S-transferase
  • Non-fusion protein expression vectors such as pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 60-89).
  • yeast expression vector for expression in the yeast S. cerevisiae such as pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113-123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vectordevelop- mentforfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, JF Peberdyetal., ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and the pVL Series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • Plant expression vectors such as those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border” , Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • Mammalian expression vectors such as pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • recombinant microorganisms can be produced which, for example, have been transformed with at least one vector according to the invention and can be used to produce the polypeptides according to the invention.
  • the recombinant constructs according to the invention described above are advantageously introduced and expressed in a suitable host system.
  • Common cloning and transfection methods known to the person skilled in the art such as, for example, co-precipitation, protoplast fusion, electroporation, retroviral transfection and the like, are preferably used here in order to express the nucleic acids mentioned in the respective expression system. Suitable systems are described, for example, in Current Protocols in Molecular Biology, F.
  • a vector which contains at least a section of a gene or a coding sequence according to the invention, in which, if necessary, at least one amino acid deletion, addition or substitution has been introduced in order to change the sequence according to the invention, for example to functionally disrupt it
  • the introduced sequence can, for example, also be a homolog from a related microorganism or can be derived from a source of mammals, yeasts or insects.
  • the vector used for homologous recombination can alternatively be designed in such a way that the endogenous gene with homologous recom-.
  • the altered section of the TMT gene is in the homologous recombination vector suitable he homologous recombination vector is described, for example, in Thomas, KR and Capecchi, MR (1987) Cell 51: 503.
  • Host organisms are, for example, bacteria, fungi, yeasts, plant or animal cells.
  • Preferred organisms are bacteria, such as those of the genus Escherichia, such as. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus or Pseudomonas, eukaryotic microorganisms such as Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, higher eukaryotic cells from animals or plants, for example Sf9 or CHO cells.
  • Preferred organisms are selected from the Ashbya genus, in particular from A. gossypii strains.
  • Successfully transformed organisms can be selected using marker genes which are also contained in the vector or in the expression cassette.
  • marker genes are genes for antibiotic resistance and for enzymes which catalyze a coloring reaction which stains the transformed cell. These can then be selected using automatic cell sorting.
  • Microorganisms successfully transformed with a vector and carrying an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromycin
  • an appropriate antibiotic resistance gene e.g. G418 or hygromycin
  • Marker proteins that are presented on the cell surface can be used for selection by means of affinity chromatography.
  • the combination of the host organisms and the vectors which match the organisms such as plasmids, viruses or phages, such as, for example, plasmids with the RNA polymerase / promoter system, the phages ⁇ or ⁇ or other temperate phages or
  • An expression system forms transposons and / or further advantageous regulatory sequences.
  • expression system means the combination of mammalian cells, such as CHO cells, and vectors, such as pcDNA3neo vector, which are suitable for mammalian cells.
  • the gene product can also be expressed in transgenic organisms such as transgenic animals, such as in particular mice, sheep or transgenic plants.
  • the invention furthermore relates to processes for the recombinant production of a polypeptide according to the invention or functional, biologically active fragments thereof, wherein a polypeptide-producing microorganism is cultivated, where appropriate the expression of the polypeptides is induced and these are isolated from the culture.
  • the polypeptides can thus also be produced on an industrial scale, if this is desired.
  • the recombinant microorganism can be cultivated and fermented by known methods. Bacteria can be propagated, for example, in TB or LB medium and at a temperature of 20 to 40 ° C and a pH of 6 to 9. Suitable cultivation conditions are described in detail, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the cells are then disrupted and the product is obtained from the lysate using known protein isolation methods.
  • the cells can optionally be operated by high-frequency ultrasound, by high pressure, e.g. in a French pressure cell, by osmolysis, by the action of detergents, lytic enzymes or organic solvents, by homogenizers or by a combination of several of the processes listed.
  • Purification of the polypeptides can be achieved with known chromatographic methods, such as molecular sieve chromatography (gel filtration), such as Q-Sepharose chromatography, ion exchange chromatography and hydrophobic chromatography, and with other conventional methods such as ultrafiltration, crystallization, salting out, dialysis and native Gel electrophoresis. Suitable methods are described, for example, in Cooper, TG, Biochemical Working Methods, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York or in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin.
  • vector systems or oligonucleotides which extend the cDNA by certain nucleotide sequences and thus code for modified polypeptides or fusion proteins, which are used, for example, for easier purification.
  • suitable modifications are, for example, so-called “tags” which act as anchors, such as, for example, the modification known as hexa-histidine anchors or epitopes which can be recognized as antigens of antibodies (described for example in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor (NY) Press).
  • These anchors can be used to attach the proteins to a solid support, such as a polymer matrix, for example, which can be filled in a chromatography column, or can be used on a microtiter plate or on another support.
  • these anchors can also be used to recognize the proteins.
  • customary markers such as fluorescent dyes, enzyme markers, which form a detectable reaction product after reaction with a substrate, or radioactive markers, alone or in combination with the anchors, can be used to derivatize the proteins.
  • the invention also relates to a method for the microbiological production of vitamin B2 and / or precursors and / or derivatives thereof.
  • the microorganisms are preferably first cultivated in the presence of oxygen and in a complex medium, such as e.g. at a cultivation temperature of about 20 ° C or more, and a pH of about 6 to 9 until a sufficient cell density is reached.
  • a complex medium such as e.g. at a cultivation temperature of about 20 ° C or more, and a pH of about 6 to 9 until a sufficient cell density is reached.
  • an inducible promoter is preferred.
  • the cultivation is continued for 12 hours to 3 days after the induction of vitamin B2 production in the presence of oxygen.
  • the cloning steps performed within the scope of the present invention e.g. Restriction cleavage, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of Nucleic acids on nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, multiplication of phages and sequence analysis of recombinant DNA were carried out as in Sambrook et al. (1989) described above.
  • the cultivation of recombinant E. coli strains DH5 ⁇ was carried out in LB-Amp medium (trypton 10.0 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 5.0 g, ampicillin 100 g / ml H 2 O ad 1000 ml) at 37 ° C cultured.
  • LB-Amp medium trypton 10.0 g, NaCl 5.0 g, yeast extract 5.0 g, ampicillin 100 g / ml H 2 O ad 1000 ml
  • one colony was transferred from an agar plate into 5 ml LB-Amp using an inoculation loop.
  • 400 ml of medium were inoculated with 4 ml of culture in a 2 l flask.
  • P450 expression was induced in E. coli after an OD578 value between 0.8 and 1.0 was reached by inducing heat shock at 42 ° C. for three to four hours.
  • the desired product can be obtained from the microorganism or from the culture supernatant by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment.
  • the cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted from the cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is retained for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification processes is subjected to chromatography with a suitable resin, the desired molecule either being retained on the chromatography resin or passing through it with higher selectivity than the impurities. These chromatography steps can be repeated if necessary using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is skilled in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective application for a particular molecule to be purified.
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • the identity and purity of the isolated compounds can be determined by prior art techniques. These include high performance liquid chromatography (HPLC), spectroscopic methods, staining methods, thin layer chromatography, NIRS, enzyme test or microbiological tests. These analysis methods are summarized in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60: 133-140; Malakhova et al. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; and Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19: 67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Vol. A27, VCH: Weinheim, pp. 89-90, p. 521-540, pp. 540-547, p.
  • HPLC high performance liquid chromatography
  • NIRS enzyme test or microbiological tests.
  • MPSS technology massive parallel signature sequencing, as described by Brenner et al, Nat.Biotechnol. (2000) 18, 630-634; to which express reference is made
  • MPSS technology was applied to the filamentous mushroom Ashbya gossypii which produces vitamin B2.
  • This technology it is possible to obtain quantitative statements about the expression strength of a large number of genes in a eukaryotic organism with high accuracy.
  • the mRNA of the organism is isolated at a specific point in time X, transcribed into cDNA with the aid of the reverse transcriptase enzyme and then cloned into special vectors which have a specific tag sequence.
  • the number of vectors with different tag sequences is chosen so high (about 1000 times higher) that, statistically speaking, each DNA molecule is cloned into a vector that is unique due to its tag sequence. Then the vector inserts are cut out together with the tag. The DNA molecules thus obtained are then incubated with microspheres that have the molecular counterparts of the tags mentioned. After incubation, it can be assumed that each microsphere is loaded with only one type of DNA molecule via the specific tags or counterparts. The beads are transferred to a special flow cell and fixed there, so that it is possible to carry out a mass sequencing of all beads using an adapted sequencing method based on fluorescent dyes and using a digital color camera.
  • sequence length is sufficient to allow a clear assignment between sequence and gene in most organisms (20 bp have a sequence frequency of -1x10 12 , the human genome has "only" a size of -3x10 9 bp in comparison).
  • the data obtained in this way are evaluated by counting the number of the same sequences and comparing their frequencies with one another. Frequently occurring sequences reflect a high level of expression, occasionally occurring sequences reflect a low level of expression. If the mRNA isolation took place at two different times (X and Y), it is possible to set up a temporal expression pattern of individual genes.
  • Ashbya gossypii was cultivated in a manner known per se (nutrient medium: 27.5 g / l yeast extract; 0.5 g / l magnesium sulfate; 50 ml / l soybean oil; pH 7). Ashbya gossypii mycelium samples are taken at different times during the fermentation (24h, 48h and 72h) and the corresponding RNA or mRNA is prepared according to the protocol of Sambrook et al. (1989) isolated from it.
  • Isolated mRNA from A gossypii is then subjected to MPSS analysis as explained above.
  • the determined data sets are subjected to a statistical evaluation and broken down according to the significance of the differences in expression. Both in terms of increase or
  • a classification is based on a classification of the Expression change in a) monotonous change, b) change after 24h, and c) change after 48h.
  • the 20bp sequences which represent an expression change and are determined by MPSS analysis, are then used as probes and hybridized against an Ashbya gossypii gene library with an average insert size of approximately 1 kb.
  • the hydriding temperature was in the range from about 30 to 57 ° C.
  • chromosomal DNA is first isolated using the method of Wright and Philippsen (Gene (1991) 109: 99-105) and Mohr (1995, PhD thesis, Biotechnik University Basel, Switzerland).
  • the DNA is partially digested with Sau3A.
  • Sau3A 6 ⁇ g genomic DNA is subjected to Sau3A digestion with different amounts of enzyme (0.1 to 1 U).
  • the fragments are fractionated in a sucrose density gradient.
  • the 1 kb region is isolated and subjected to QiaEx extraction.
  • the largest fragments are ligated with the BamHI cut vector pRS416 (Sikorski and Hieter, Genetics (1988) 122; 19-27) (90 ng BamHI cut, dephosphorylated vector; 198 ng insert DNA; 5 ml water; 2 ⁇ l 10x ligation buffer; 1U ligase) , With this ligation approach, E. coli laboratory strain XL-1 blue is transformed and the resulting clones are used to identify the insert.
  • nucleic acid sequences obtained i.e. their functional assignment to a functional amino acid sequence was carried out using a BLASTX search in sequence databases. Almost all of the amino acid sequence homologies found concerned Saccharomyces cerevisiae (baker's yeast). Since this organism has already been completely sequenced, more detailed information regarding these genes can be found at: http://www.mips.gsf.de/proi/veast/search/code search.htm.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 1 has significant sequence homology with a mitochondrial energy-transferring protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 609 to 1 from SEQ ID NO: 1) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 1.
  • SEQ ID NO: 2 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a mitochondrial energy-transferring protein.
  • SEQ ID NO: 5 The amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 5 has significant sequence homology with an ABC transport protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (SEQ ID NO: 6) (corresponding to nucleotides 1494 to 1387 from SEQ ID NO: 5) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 2.
  • SEQ ID NO: 7 shows a further amino acid partial sequence according to the invention.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of an ABC transport protein.
  • the amino acid sequence derived from the coding strand to SEQ ID NO: 10 has significant sequence homology with a membrane-integrated mitochondrial protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 15 to 455 from SEQ ID NO: 10) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 3.
  • SEQ ID NO: 11 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a membrane-integrated mitochondrial protein.
  • the amino acid sequence derived from the coding strand to SEQ ID NO: 14 has significant sequence homology with a mitochondrial inner membrane transport protein from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 415 to 1215 from SEQ ID NO: 14) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 4.
  • SEQ ID NO: 15 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a mitochondrial inherent membrane transport protein.
  • amino acid sequence derived from the coding strand to SEQ ID NO: 19 has significant sequence homology with a non-vacuolar 102 kD subunit of the H + -ATPase-
  • S. cerevisiae An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 2 to 790 from SEQ ID NO: 19) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 5.
  • SEQ ID NO: 20 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned to the function of a non-vacuolar 102 kD subunit of the H + -ATPase-VO domain.
  • amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 23 has significant sequence homology with a protein from S. cerevisiae with a
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 869 to 522 from SEQ ID NO: 23) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 6.
  • SEQ ID NO: 24 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned to the function of a protein with a similarity to the isp4 protein from S. pombe and thus to the activity of an oligopeptide transporter.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 28 has significant sequence homology with a VAC1 protein, a cytosolic and peripheral membrane protein with three zinc fingers, from S. cerevisiae.
  • a partial amino acid sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 356 to 243 from SEQ ID NO: 28) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 7A.
  • Another amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 166 to 2 from SEQ ID NO: 28) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 7B.
  • SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30 each show an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned to the function of a VAC1 protein, a cytosolic and peripheral membrane protein with three zinc fingers.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding opposite strand to SEQ ID NO: 33 has significant sequence homology with a protein with an ATPase-like function from S. cerevisiae.
  • An amino acid partial sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 904 to 707 from SEQ ID NO: 33) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 8.
  • SEQ ID NO: 34 shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence found could thus be assigned the function of an ATPase-like protein.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID NO: 37 has significant sequence homology with a PH085 protein from S. cerevisiae.
  • a partial amino acid sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 898 to 5 from SEQ ID NO: 37) with a partial sequence of the S. cerevisiae enzyme is shown in FIG. 9.
  • the amino acid sequences according to SEQ ID NO: 38 and SEQ ID NO: 39 correspond to partial amino acid sequences derived from the opposite strand to positions 950 to 900 and 898 to 5 in SEQ ID NO: 37.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned the function of a PH085 protein.
  • the amino acid sequence derived from the corresponding counter-strand to SEQ ID N0: 42 has significant sequence homology with the p24 protein from S. cerevisiae involved in membrane traffic.
  • a partial amino acid sequence derived therefrom (corresponding to nucleotides 931 to 806 from SEQ ID NO: 42) with a partial sequence of the S. cerevisiae protein is shown in FIG. 10.
  • SEQ ID NO: 42 each shows an N-terminally extended amino acid partial sequence.
  • the A. gossypii nucleic acid sequence determined could thus be assigned to the function of a p24 protein involved in membrane traffic.
  • A. gossypii high molecular weight cellular DNA was prepared from a 2 day old 100 ml culture grown in a liquid MA2 medium (10 g glucose, 10 g peptone, 1 g yeast extract, 0.3 g Myo-Inositad 1000 ml). The mycelium was filtered off, twice with H 2 0 dest. washed, suspended in 10 ml of 1M sorbitol, 20 mM EDTA, containing 20 mg of zymolyase-20T, and incubated at 27 ° C. for 30 to 60 minutes with gentle shaking.
  • the protoplast suspension was adjusted to 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 mM EDTA and 0.5% sodium dodecyl sulfate (SDS) and incubated at 65 ° C. for 20 min. After two extractions with phenol-chloroform (1: 1 vol / vol), the DNA was precipitated with isopropanol, suspended in TE buffer, treated with RNase, precipitated again with isopropanol and resuspended in TE.
  • SDS sodium dodecyl sulfate
  • An A gossyp // cosmid library was prepared by binding genomic DNA selected in size and partially digested with Sau3A to the dephosphorylated arms of the cosmid vector Super-Cos1 (Stratagene).
  • the Super Cos1 vector was opened between the two cos sites by digestion with Xba / and dephosphorylation with alkaline calf intestinal phosphatase (Boehringer), followed by opening the cloning site with BamHI. The ligations were carried out overnight at 15 ° C.
  • coli NM554 (recA13, araD139, ⁇ (ara, leu) 7696, ⁇ (lac) 17A, galil, galK, hsrR, rpsfetf), mcrA, mcrB) and on ampicillin (50 ⁇ g / ml) containing LB plates. Transformants were obtained, which contained an average length of 30-45 kb.
  • a total of 4 x 10 4 fresh single colonies were individually in wells of 96-well microtiter plates (Falcon, No. 3072) in 100 ⁇ l LB medium, supplemented with the freezing medium (36 mM K 2 HP0 4 / 13.2 mM KH 2 P0 4 , 1 , 7 mM sodium citrate, 0.4 mM MgSO 4 , 6.8 mM (NH 4 ) 2 SO 4 , 4.4% (wt / vol) glycerol) and ampicillin (50 ⁇ g / ml), inoculated, overnight at 37 Let it grow with shaking and freeze at -70 ° C.
  • the plates were quickly thawed and then duplicated in fresh medium using a 96 series replicator which had been sterilized in an ethanol bath followed by evaporation of the ethanol on a hot plate. Before freezing and after thawing (before any other measures), the plates were briefly shaken in a microtiter shaker (Infors) to ensure a homogeneous cell suspension. Individual clones were placed on nylon membranes by means of a robot system (bio-robotics) with which small amounts of liquid can be transferred from 96 wells of a microtiter plate to nylon membrane (GeneScreen Plus, New England Nuclear).
  • the membranes were placed on the surface of LB agar with ampicillin (50 ⁇ g / ml) in 22 ⁇ 22 cm culture dishes (Nunc) and overnight at 37 ° C. incubated. Before reaching cell confluence, the membranes were processed as described by Herrmann, BG, Barlow, DP and Lehrach, H. (1987) in Cell 48, pp. 813-825, with a 5 as an additional treatment after the first denaturation step -minute steaming of the filters on a pad soaked in denaturing solution is added over a boiling water bath.
  • the membranes were prehybridized and 6 to 12 h at 42 ° C in 50% (vol / vol) formamide, 600 mM sodium phosphate, pH 7.2, 1 mM EDTA, 10% dextran sulfate, 1% SDS, and 10x Denhardt's solution, containing salmon sperm DNA (50 ug / ml) hybridized with 32 P-labeled probes (0.5-1 x 10 6 cpm / ml). Typically, washing steps were carried out for about 1 hour at 55 to 65 ° C.
  • the filters were 12 to 24 hours at -70 ° C autoradiographed with Kodak amplifier plates. So far, individual membranes have been successfully reused more than 20 times. Between the autoradiographs, the filters were stripped by incubation at 95 ° C for 2 x 20 min in 2 mM Tris-HCl, pH 8.0, 0.2 mM EDTA, 0.1% SDS.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 3.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 8.
  • Oligo 109v ".
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 12.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 21.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 26.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 31.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence in accordance with SEQ ID NO: 35.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence measured SEQ ID NO: 40.
  • the insert comprising the full sequence has a nucleic acid sequence as shown in SEQ ID NO: 44.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Polynukleotide aus Ashbya gossypii, damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten und Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; und die Anwendung den Polypeptide und Polynukleotide als Targets zur Verbesserung des Transmembran-Transports und insbesondere der Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mikroorganismen der Gattung Ashbya.

Description

Beschreibung
Neue Genprodukte aus Ashbya gossypu, die mit dem Transmembran-Transport assoziiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Polynukleotide aus Ashbya gossypu; damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten und Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; und die Anwendung der neuen Polypeptide und Polynukleotide als Targets zur Modulation des Transmembran-Transports und insbesondere der Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mikroorganismen der Gattung Ashbya.
Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) ist ein alkali- und lichtempfindliches, in Lösung gelbgrün fluoreszierendes Vitamin. Vitamin B2-Mangel kann zu Ektodermschäden, insbesondere Linsentrübung, Keratitis, Komeavaskularisation, zu neurovegetativen und urogenitalen Störungen führen. Vitamin B2 ist Vorläufer für die neben NAD+ und NADP+ wichtigen biologischen Wasserstoffüberträger-Moleküle FAD und FMN. Diese werden aus Vitamin B2 durch Phosphorylierung (FMN) und anschließende Adenylierung (FAD) gebildet.
Vitamin B2 wird in Pflanzen, Hefen und vielen Mikroorganismen aus GTP und Ribulose-5- phosphat synthetisiert. Der Reaktionsweg beginnt mit dem Öffnen des Imidazolrings von GTP und Abspaltung eines Phosphatrestes. Durch Desaminierung, Reduktion und Abspaltung des verbleibenden Phosphats entsteht 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidinon. Die Reaktion dieser Verbindung mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat führt zum bicyclischen Molekül 6,7- Dimethyl-8-ribityllumazin. Diese Verbindung wird durch Dismutation, bei dereine 4-Kohlenstoff- Einheit übertragen wird, in die tricyclische Verbindung Riboflavin umgesetzt.
Vitamin B2 kommt in vielen Gemüsen und in Fleisch vor, weniger in Getreideprodukten. Der tägliche Vitamin B2-Bedarf eines Erwachsenen liegt bei etwa 1 ,4 bis 2 mg. Hauptabbauprodukt der Coenzyme FMN und FAD beim Menschen ist wiederum Riboflavin, welches als solches ausge- schieden wird.
Vitamin B2 stellt damit ein wichtiges Nahrungsergänzungsmittel für Mensch und Tier dar. Es besteht daher das Bestreben, Vitamin B2 in technischem Maßstab zugänglich zu machen. Es wurde daher vorgeschlagen, Vitamin B2 auf mikrobiologischem Weg zu synthetisieren. Brauch- bare Mikroorganismen hierfür sind beispielsweise Bacillus subtilis, die Ascomyceten Eremothe- cium ashbyii, Ashbya gossypu sowie die Hefen Candida flareriuxxύ Saccharomyces cerevisiae. Die hierzu verwendeten Nährmedien umfassen Melasse oder Pflanzenöle als Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Aminosäuren, tierische oder pflanzliche Peptone und Proteine sowie Vita- minzusätze. In sterilen aeroben submersen Verfahren erhält man pro Liter Kulturbrühe Ausbeuten von mehr als 10 g Vitamin B2 innerhalb weniger Tage. Voraussetzung sind gute Belüftung der Kultur, sorgfältiges Rühren und Einstellung von Temperaturen unter etwa 30°C. Nach Abtrennen der Biomasse, Eindampfen und Trocknen des Konzentrates erhält man ein mit Vitamin B2 angereichertes Produkt.
Die mikrobiologische Produktion von Vitamin B2 ist beispielsweise beschrieben in der WO-A- 92/01060, der EP-A-0405 370 und EP-A-0 531 708.
Eine Übersicht über Bedeutung, Vorkommen, Herstellung, Biosynthese und Verwendung von Vitamin B2 ist beispielsweise in Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Band A27, Seiten 521 ff. zu finden.
Die Zellmembranen dienen in einer Zelle einer Reihe von Funktionen. Zuallererst differenziert eine Membran den Zellinhalt von der Umgebung, so dass die Zelle Integrität erhält. Die Membranen dienen auch als Schranken, damit gefährliche oder ungewünschte Verbindungen nicht einströmen können und gewünschte Verbindungen nicht ausströmen können. Zellmembranen sind aufgrund ihrer Struktur von Natur aus gegenüber der nicht erleichterten Diffusion hydrophiler Verbindungen, wie Proteine, Wassermolekülen und Ionen undurchlässig: eine Doppelschicht aus Lipidmolekülen, in der die polaren Kopfgruppen nach außen ragen (aus der Zelle heraus bzw. ins Zellinnere hinein) und die unpolaren Schwänze zur Mitte der Doppelschicht ragen und einen hydrophoben Kern bilden (für einen allgemeinen Überblick über die Struktur und Funktion der Membran siehe Gennis, R.B. (1989) Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg). Diese Schranke ermöglicht, dass die Zellen eine relativ höhere Konzent- ration an gewünschten Verbindungen und eine relativ kleinere Konzentration an ungewünschten Verbindungen als das umgebende Medium enthalten, da die Diffusion dieser Verbindungen durch die Membran effizient blockiert wird.
Die Membran liefert jedoch auch eine wirksame Schranke gegenüber dem Import von ge- wünschten Molekülen und dem Export von Abfallmolekülen. Zur Bewältigung dieser Schwierigkeit enthalten die Zellmembranen viele Arten von Transporterproteinen, die den Transmembrantransport verschiedenartiger Verbindungen erleichtern können: Poren oder Kanäle und Transporter. Die ersteren sind integrale Membranproteine, gelegentlich Proteinkomplexe, die eine regulierte Öffnung durch die Membran bilden. Diese Regulation oder dieses "Gating" ist gewöhnlich für die durch die Pore oder den Kanal zu transportierenden Substrate spezifisch, so dass diese Transmembrankonstrukte für eine spezifische Klasse von Substraten spezifisch sind; beispielsweise ist ein Kaliumkanal derart konstruiert, dass nur Ionen mit ähnlicher Ladung und Größe wie Kalium hindurchgelangen können. Kanal- und Porenproteine haben bestimmte hydrophobe und hydrophile Domänen, so dass sich der hydrophobe Anteil des Proteins an das Innere der Membran anlagern kann, wohingegen der hydrophile Anteil das Innere des Kanals ausmacht, wodurch eine geschützte hydrophile Umgebung bereitgestellt wird, durch die das ausgewählte hydrophile Molekül gelangen kann. Im Fachgebiet sind viele solche Poren/Kanäle bekannt, einschließlich solche für Kalium-, Calcium-, Natrium- und Chloridionen.
Dieses durch Poren und Kanäle vermittelte System ist auf sehr kleine Moleküle, wie Ionen, eingeschränkt, da Poren oder Kanäle, die hinreichend groß sind, dass sie den Durchtritt vollständi- ger Proteine durch erleichterte Diffusion ermöglichen, auch nicht dazu fähig wären, den Durchtritt kleinerer Moleküle zu verhindern. Der Transport von Molekülen durch diesen Prozeß wird gelegentlich als "erleichterte Diffusion" bezeichnet, da die treibende Kraft eines Konzentrationsgradienten erforderlich ist, damit der Transport stattfindet. Permeasen ermöglichen ebenfalls die erleichterte Diffusion größerer Moleküle, wie Glucose oder anderer Zucker, in die Zelle, wenn die Konzentration dieser Moleküle auf einer Seite der Membran größer ist als auf der anderen (e- benfalls als "Uniport" bezeichnet). Im Gegensatz zu Poren oder Kanälen bilden diese integralen Proteine (die oft 6 bis 14 membranüberspannende Helices aufweisen) keine offenen Kanäle durch die Membran, sie binden jedoch an das Zielmolekül an der Membranoberfläche und durchlaufen dann eine Konformationsänderung, so dass das Zielmolekül an der entgegenge- setzten Seite der Membran freigesetzt wird.
Zellen benötigen jedoch oft den Import oder Export von Molekülen gegen den bestehenden Konzentrationsgradienten ("aktiver Transport"), eine Situation, in der die erleichterte Diffusion nicht stattfinden kann. Es gibt zwei generelle Mechanismen, die von der Zelle für einen solchen Membrantransport verwendet werden; Symportoder Antiport, und energiegekoppelter Transport, wie derjenige, der durch ABC-Transporter vermittelt wird. Symport- und Antiportsysteme koppeln die Bewegung von zwei unterschiedlichen Molekülen über die Membran (über Permeasen mit zwei gesonderten Bindungsstellen für zwei unterschiedliche Moleküle); beim Symport werden beide Moleküle in die gleiche Richtung transportiert, wohingegen beim Antiport ein Molekül im- portiert und das andere Molekül exportiert wird. Dies ist energetisch möglich, da sich eines dieser beiden Moleküle entlang eines Konzentrationsgradienten bewegt, und dieses energetisch günstige Ereignis wird nur durch die gleichzeitige Bewegung einer gewünschten Verbindung gegen den herrschenden Konzentrationsgradienten ermöglicht. Einzelne Moleküle können gegen den Konzentrationsgradienten über die Membran in einem energiegetriebenen Prozeß transportiert werden, wie bspw. bei den ABC-Transportern. Bei diesem System hat das in der Membran lokalisierte Transportprotein eine ATP-bindende Cassette, beim Binden des Zielmoleküls wird ATP in ADP + Pi umgewandelt, und die resultierende freigesetzte Energie wird zum Antreiben der Bewegung des Zielmoleküls zur entgegengesetzten Seite der Membran verwendet, was durch den Transporter erleichtert wird. Für eingehendere Beschreibungen all dieser Transportsysteme, siehe Bamberg, E. et al., (1993) "Charge transport of ion pumps on lipid bi- layer membranes", Q. Rev. Biophys. 26: 1-25; Findlay, J.B.C. (1991) "Structure and function in membrane transport Systems", Curr. Opin. Struct. Biol. 1 : 804-810; Higgins, C.F. (1992) "ABC transporters from microorganisms to man", Ann. Rev. Cell. Biol. 8: 67-113; Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 270-322; und Nikaido, H. und Saier, H. (1992) "Transport proteins in bacteria: common themes in their design", Science 258: 936-942, und die in jeder dieser Zitate enthaltenen Literaturstellen. Die Nutzung von Genen des Transmembran-Transports zur Generierung von Mikroorganismen, vorzugsweise der Gattung Ashbya, insbesondere von Ashbya gossypu Stämmen, mit verändertenTransmembran-Transporteigenschaften ist noch nicht beschrieben.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Targets zur Beeinflussung des Transmembran-Transports in Mikroorganismen der Gattung Ashbya, insbesondere in Ashbya gossypu. Insbesondere besteht die Aufgabe, den Transmembran-Transport in derartigen Mikroorganismen zu verbessern. Eine weitere Aufgabe ist die Verbesserung der Vitamin B2- Produktion durch derartige Mikroorganismen.
Gelöst wird obige Aufgabe insbesondere durch Bereitstellung kodierender Nukleinsäure- sequenzen, welche in Ashbya gossypu während der Vitamin B2-Produktion hoch- bzw. niederreguliert (basierend auf Ergebnissen, ermittelt mit Hilfe der im experimentellen Teil näher beschriebenen MPSS-Analysenmethode) sind.
Gelöst wird obige Aufgabe insbesondere durch Bereitstellung von Polynukleotiden, welche aus Ashbya gossypu isolierbar sind und für ein Protein kodieren, das mit dem Transmembrantransport assoziiert ist und/oder ein Transmembranprotein ist und insbesondere eine in Tabelle 1 angegebene strukturelle (z.B. Sequenzhomologie) und/oder funktionale Eigenschaft (z.B. Enzymaktivität) besitzen; und zwar insbesondere:
a) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines mitochondrialen energieübertragenden Proteins kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 19" trägt. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 19v" trägt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 19" und „Oligo 19v" besitzen mit dem MIPS Tag „Ygr257c" aus S. cerevi- siae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 3. Die vom korrespondierenden Gegenstrang von SEQ ID NO: 1 bzw. von kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO: 3 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem mitochondrialen energieübertragenden Protein aus S. cerevisiae.
b) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion entsprechend der eines ABC-Transportproteins aus S. cerevisiae kodiert. ABC (ATP binding cassette) Proteine fungieren als Transportsysteme und sind an der Aufnahme oder der Abgabe von Substraten aus der Zelle beteiligt. Der Transportvorgang wird dabei durch ATP- Hydrolyse getrieben.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 24" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 24" trägt.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder ein Fragment da- von. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 24" und „Oligo 24v" besitzen mit dem MIPS Tag „Mdl2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 8. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:5 bzw. von kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO:8 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilse- quenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem ABC-Transportprotein aus S. cerevisiae.
c) eine, vorzugsweise niederregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines membranintegrierten mitochondrialen Proteins kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 109" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon iso- liert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 109v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 109" und „Oligo 109v" besitzen mit dem MIPS Tag „Prp12" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 bzw. SEQ ID NO: 12. Die vom kodierenden Strang abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem membranintegrierten mitochondrialen Protein aus S. cerevisiae. d) eine, vorzugsweise niederregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines mitochondrialen Innermembran-Transportproteins kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein cDNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 163" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, welcher für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 163v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 17 oder Fragmente davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar ist. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 163" und „Oligo 163v" besitzen mit dem MIPS Tag „Flx1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14 bzw. SEQ ID NO: 17. Die vom kodierenden Strang abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem mitochondrialen Innermembran-Transportprotein aus S. cerevisiae.
e) eine, vorzugsweise niederregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion einer nicht-vakuolären 102 kD-Untereinheit der H+-ATPase-VO-Domäne kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 31" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo 31v" trägt. Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 31" und „Oligo 31 v" besitzen mit dem MIPS Tag „STV1"aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19 bzw. SEQ ID NO: 21. Die vom kodierenden Strang abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer nicht-vakuolären 102 kD- Untereinheit der H+-ATPase-VO-Domäne aus S. cerevisiae.
f) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit einer
Funktion, die eine Ähnlichkeit zu der des isp4-Proteins aus S. pombe aufweist, kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde erfindungsgemäß ein cDNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz dererfindungsgemä- ßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 4" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 4v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 23. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 26 oder die dazu komplementäre Sequenz gemäß SEQ ID NO:25. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus ei- nem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar ist. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 4" und „Oligo 4v" besitzen mit dem MIPS Tag „OPT2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Das Insert umfasst eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 23 bzw. 25. Die vom kodierenden Strang (umfassend SEQ ID NO:26) abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae mit einer Ähnlichkeit zum isp4-Protein aus S. pombe. Den erfindungsgemäßen Proteinen wird daher die Aktivität eines Oligopeptid-Transporters zugeordnet.
g) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines VAC1 -Proteins aus S. cerevisiae, einem cytosolischen und peripheren Membranprotein mit drei Zinkfingern, kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 6" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 6v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 31 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 6" und „Oligo 6v" besitzen mit dem MIPS Tag „VAC1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28 bzw. SEQ ID NO: 31. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:28 bzw. vom Strang gemäß SEQ ID NO:31 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem VAC1 -Protein, einem cytosolischen und peripheren Membranprotein mit drei Zinkfingern, aus S. cerevisiae.
h) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit einer ATPase-ähnlichen Funktion kodiert.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 146" trägt. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 146v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 33. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 35 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu kom- plementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 146" und „Oligo 146v" besitzen mit dem MIPS Tag „Ymr162c" aus S. ce- revisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 33 bzw. SEQ ID NO: 35. Die vom korrespondierenden Gegenstrang von SEQ ID NO:33 bzw. vom kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO:35 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. A- minosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein mit einer ATPa- se oder ATPase-ähnlichen Funktion aus S. cerevisiae.
i) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der
Funktion vergleichbar zu derjenigen eines PH085-Proteins aus S. cerevisiae kodiert. PH085 ist eine Kinase und ist an verschiedenen zellulären Prozessen, einschließlich der Regulation des PHO-Gens, dem Glykogen-Metabolismus, der Regulation des Zeil-Zyklus und der Zeil- Morphologie beteiligt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 56" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 56v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 37. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein
Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 40 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 56" und „Oligo 56v" besitzen mit dem MIPS Tag „Ypl110c" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 37 bzw. SEQ ID NO: 40. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO: 37 bzw. vom kodierenden Strang genmäß SEQ ID NO: 40 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem PH085-Protein aus S. cere- visiae.
k) eine, vorzugsweise hochregulierte Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion vergleichbar zu der eines am Membranverkehr beteiligten p24-Proteins aus S. cerevisiae kodiert. Mitglieder der p24 Proteinfamilie sind kleine Typ I- Transmembranproteine mit kur- zem cytoplasmatischem COOH-Terminus. Diese üben eine Transportfunktion im frühen sekretorischen Weg aus und sind z.B. am Transport verschiedener sekretorischer Proteine aus dem endoplasmatischen Retikulum zum Golgi-Apparat beteiligt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 167" trägt.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo 167v" trägt.
Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 42. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 44 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
Die Inserts von „Oligo 167" und „Oligo 167v" besitzen mit dem MIPS Tag „ERP5" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 42 bzw. SEQ ID NO: 44. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zur SEQ ID NO: 42 bzw. vom kodierenden Strang der SEQ ID NO: 44 abgeleiteten Aminosäuresequenzen besitzen signifikante Sequenzhomologie mit dem am Membranverkehr beteiligten p24-Protein aus S. cerevisiae.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche mit einem der obigen Polynukleotide, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Polynukleotide, welche mit einem der erfindungsgemäßen Oligonukleotide hybridisieren und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses Genproduktes kodieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide bzw. Proteine, welche von den oben beschriebenen Polynukleotiden kodiert werden; sowie Peptidfragmente davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11 , 13, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 29, 30, 32, 34, 36, 38,39, 41 , 43 oder SEQ ID NO: 45 umfasst; sowie funktionale Äquivalente der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Proteine.
Funktionale Äquivalente unterscheiden sich dabei von den erfindungsgemäß konkret offenbarten Produkten in ihrer Aminosäuresequenz durch Addition, Insertion, Substitution, Deletion oder Inversion an wenigstens einer, wie z.B. 1 bis 30 oder 1 bis 20 oder 1 bis 10, Sequenzpositionen ohne die ursprünglich beobachtete und durch Sequenzvergleich mit anderen Proteinen ableitbare Proteinfunktion zu verlieren. Damit können Äquivalente im wesentlichen identische, höhere oder niedrigere Aktivitäten im Vergleich zum nativen Protein besitzen.
Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Expressionskassetten zur rekombinanten Produktion erfindungsgemäßer Proteine, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine der oben definierten Nukleinsäuresequenzen; sowie re- kombinante Vektoren, umfassend wenigstens eine solche erfindungsgemäße Expressionskassette.
Erfindungsgemäß bereitgestellt werden außerdem prokaryotische oder eukaryotische Wirte, welche mit wenigstens einem Vektor obigen Typs transformiert sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden solche prokaryotischen oder eukaryotischen Wirte bereitgestellt, in welchen die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert (z.B. Inhibition oder Über- expression) ist, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid nach obiger Definition kodiert; oder in welchen die biologische Aktivität eines Polypeptids nach obiger Definition erniedrigt oder erhöht ist. Bevorzugte Wirte sind ausgewählt unter Ascomyceten (Schlauchpilzen), insbesondere solchen der Gattung Ashbya und vorzugsweise Stämmen von A. gossypii.
Eine Modulation der Genexpression im obigen Sinn umfasst sowohl deren Inhibition, z.B. durch Blockade einer Expressionsstufe (insbesondere Transkription oder Translation) oder eine gezielte Überexpression eines Gens (z.B. durch Modifikation regulativer Sequenzen oder Erhöhung der Kopienzahl der kodierenden Sequenz).
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Ex- pressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur rekombinanten Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids nach obiger Definition.
Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Nachweis bzw. zur Validierung eines Effektortargets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon bereitgestellt. Dabei behandelt man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt ( wie z.B. an diese nicht-kovalent bindet), den Einfluß des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2 und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert. Die Validierung erfolgt dabei bevorzugt durch direkten Vergleich mit der mikrobiologischen Vitamin B2-Produktion in Abwesenheit des Effektors unter ansonsten gleichen Bedingungen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulation (in Bezug auf Men- ge und/oder Geschwindigkeit) der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt.
Als bevorzugte Beispiele für oben genannte Effektoren sind zu nennen: a) Antikörper oder antigenbindene Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid wechselwirken; c) niedermolekulare Effektoren, welche die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz wechselwirken.
Oben genannte Effektoren mit Spezifität für wenigstens eines der oben definierten erfϊndungs- gemäßen Tragets sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt gemäß obiger Definition unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkt(e) aus dem Kulturansatz isoliert. Bevorzugt ist dabei, dass man den Wirt vor und/oder während der Kultivierung mit einem Effektor nach obiger Definition behandelt. Ein bevorzugter Wirt ist dabei ausgewählt unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya; insbesondere transformiert, wie oben beschrieben.
Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Poly- nukleotids oder Polypeptids als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya.
Fiqurenbeschreibung:
Figur 1 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 609 bis 1 in SEQ ID NO:1) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Ygr257c aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenz- Positionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 2 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (SEQ ID NO: 6) (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 1494 bis 1387 in SEQ ID NO:5) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Mdl2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet. Figur 3 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem kodierenden Strang in Position 15 bis 455 in SEQ ID NO: 10) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Prp12 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 4 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem kodierenden Strang in Position 246 bis 1118 in SEQ ID NO:14) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Flx1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 5 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (ent- sprechend dem kodierenden Strang in Position 2 bis 790 in SEQ ID NO:19) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags STV1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 6 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 869 bis 522 in SEQ ID NO:23) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags OPT2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 7A zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 356 bis 243 in SEQ ID NO:28) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags VAC1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet. Figur 7B zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 166 bis 2 in SEQ ID NO:28) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags VAC1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 8 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 904 bis 707 in SEQ ID NO:33) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Ymr162c aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 9 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 898 bis 5 in SEQ ID NO:37) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Ypl110c aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Figur 10 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 931 bis 806 in SEQ ID NO:42) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags ERP5 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.
Detaillierte Beschreibung. der Erfindung:
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodieren Proteine bzw. Proteine, die hier als Proteine des Transmenbran-Transports (z.B. mit Aktivität bezüglich dertransmembranen Transportsysteme) oder kurz als „TMT-Proteine" bezeichnet werden. Diese TMT-Proteine haben z.B. eine Funktion bei der Steuerung membranständiger Transportersysteme, die gewünschte Proteine unter Energieverbrauch gegen einen Konzentrationsgradienten in die Zelle transportieren. Die TMT-Proteine können die Zellantwort auf äußere Bedingungen beeinflussen und dadurch z.B. den Stoffwechsel der Zelle regulieren. Aufgrund der Verfügbarkeit von in Ashbya gossypii verwendbaren Klonierungsvektoren, wie z.B. offenbart in Wright und Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., und von Techniken zur genetischen Manipulation von A. gossypii und den verwandten Hefe-Arien lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieser Organismen, insbesondere von A gossyp/ verwenden, um sie als Produ- zenten von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivate davon besser und effizienter zu machen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz kann aufgrund einer direkten Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder aufgrund einer indirekten Wirkung einer solchen Manipulation erfolgen.
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Bereitstellung neuer Molekülen, die hier als TMT- Nukleinsäuren und TMT-Proteine bezeichnet werden und an dem Transmembran-Transport, insbesondere in Ashbya gossypii, (z.B. bei der Synthese oder Regulation von Transportprotei- nen ) beteiligt sind. Die Aktivität der erfindungsgemäßen TMT-Moleküle in A. gossypii beeinflußt die Vitamin B2-Produktion durch diesen Organismus. Vorzugsweise wird die Aktivität der erfindungsgemäßen TMT-Moleküle so moduliert, dass die Stoffwechsel- und/oder Energiewege von A. gossypii, an denen die erfindungsgemäßen TMT-Proteine teilnehmen, hinsichtlich der Aus- beute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion moduliert werden, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion in A gossypii moduliert.
Die erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise aus dem Genom eines Ashbya gossyp//-Stammes isolierbar, der von der American Type Culture Collecti- on unter der Bezeichnung ATCC 10895 frei erhältlich ist.
Verbesserung der Vitamin B2-Produktion:
Es gibt eine Reihe von möglichen Mechanismen, über welche man durch Veränderung von Menge und/oder Aktivität eines erfindungsgemäßen MTM-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Vitamin B2 durch einem A gossyp//-Stamm direkt beeinflussen kann.
So kann durch ein effizienterer Transmembran-Transport, die Zellantwort der Zelle verstärkt und damit die Bildung von gewünschten Wertprodukten erhöht werden.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen TMT-Proteinen kann auch zu TMT-Proteinen mit geänderten (erhöhten oder verminderten) Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion des gewünschten Produkts aus A gossypii beeinflussen. Beispielsweise kann man mit Hilfe der TMT-Proteine die Zellen an neue oder veränderte äußere Bedingungen anpassen. Durch Verbesserung von Wachstums und Vermehrung dieser veränderter Zellen ist es möglich, die Lebensfähigkeit der Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern und auch die Teilungsrate zu verbessern. Schließlich kann dadurch die Ausbeute der gewünschten Zielprodukte, die von diesen Zellen hergestellt werden, erhöht werden.
Polypeptide:
Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide, welche die oben genannten Aminosäuresequenzen oder charakteristische Teilsequenzen davon umfassen und/oder von den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden. Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten neuen Polypeptide.
„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, (wie z.B. Substratspezifität) besitzen.
Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, welche in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologische Aktivitäten besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure- Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist ins- besondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.
„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Poly- peptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Ami- nogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und dergleichen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.
„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktionellen Aminosäure- Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen. "Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.
„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen o- der Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.
„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Po- lypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktioneil verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktionelle Beeinträchtigung der Fusionsproteinteile) aufweisen. Nichtlimitiemde Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Sig- nalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.
Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offenbarten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besonde- re wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.
Im Falle einer möglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße Äquivalente Prote- ine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante Form des Proteins, die als Agonist o- der Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.
Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure- ebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura etal. (1984) Annu. Rev. Biochem.53:323; Itakura etal., (1984) Science 198:1056; Ikeet al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477).
Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.
Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatori- scher Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811- 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331). Die erfindungsgemäßen Polypeptide können rekombinant hergestellt werden (vgl. folgende Abschnitte) oder können in nativer Form unter Anwendung klassischer biochemischer Arbeitsweisen (vgl. Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walterde Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin) aus Mikroorganismen, insbesondere solchen der Gattung Ashbya, isoliert werden.
Nukleinsäuresequenzen:
Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleo- tidanaloga zugänglich sind.
Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäure- fragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, die einer TMT-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.
Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugs- weise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.
Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1 , 3, 5, 8, 10, 12, 14, 17, 19, 21, 23, 25, 26, 28, 31, 33, 35, 37, 40, 42 oder SEQ ID NO: 44 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oder Deletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil.
Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) er- hältliche Sequenzen.
Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidse- quenz eines Gens. Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide lassen sich bei Durchmusterung von genomischen odercDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.
Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oder Oligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vor- zugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Sou- thern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unterstringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northern-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 °C, vorzugsweise 60 - 65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft "Antisense-'Nukleinsäuren. Diese umfaßt eine Nukleo- tidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die Antisense- Nukleinsäure kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementärsein. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül an- tisense zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft die als 5'- und 3'-untranslatierte Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.
Ein Antisense-Oligonukleotid kann bspw. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, dass sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabi- lität des Duplexes erhöhen, der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleoside, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-loduracil, Hy- poxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5- Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Be- ta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-lsopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2- Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D- Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6- isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2- Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5- oxyessigsäuremethylester, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6- Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann auch biologisch hergestellt werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist.
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so dass sie mit der zellulären mRNA und/oder einer kodierenden DNA hybridisieren oder daran binden, so dass die Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird.
Das Antisense-Molekül kann so modifiziert werden, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen bindet, das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, z.B. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das/der an einen Zelloberflächen rezeptor oder Antigen bindet. Das Antisense- Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Zur Erzielung hinreichender intrazellulärer Konzentrationen derAntisense- Moleküle sind Vektorkonstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken bakteriellen, viralen odereukaryotischen Promotors befindet, bevorzugt.
In einerweiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spe- zifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen alpha-Einheiten parallel zueinander verlaufen. (Gaultier et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-0- Methylribonukleotid (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330) umfassen.
Gegenstand der Erfindung sind auch Ribozyme. Dies sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribo- nukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie einen komplementären Bereich haben, spalten können. Somit können Ribozyme (z.B. Hammerhead- Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591 )) zur katalytischen Spaltung von erfindungsgemäßen Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation der entsprechenden Nukleinsäure zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine erfindungs- gemäße kodierende Nukleinsäure kann z.B. auf der Basis einer hierin konkret offenbarten cDNA gebildet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nukleotidsequenz ist, die in einer erfindungsgemäßen kodierenden mRNA gespalten werden soll. (vgl. z.B. US-A-4 987071 und US-A-5 116742). Alternativ kann mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden (siehe z.B. Bartel, D., und Szostak, J.W. (1993) Science 261 :1411-1418).
Die Genexpression erfindungsgemäßer Sequenzen läßt sich alternativ hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz sind (z.B. zu einem Promotor und/oder Enhancer einer kodierenden Sequenz) so dirigiert werden, dass Triple-Helixstrukturen gebildet werden, die die Transkription des entspre- chenden Gens in Ziel-Zellen verhindern (Helene, C. (1991 ) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-584; Helene, C. et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660:27-36; und Mäher. L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-815).
Expressionskonstrukte und Vektoren:
Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-strom- aufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- logy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).
Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürli- ehe Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.
Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, tre-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gramnegativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1 , MFα , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1 , B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduztierbarer Promotoren, wie der PrPrPromotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.
Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.
Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.
Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten kodierenden Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polyadenylie- rungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biolo- gy, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.
Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem ge- eigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, dereine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. etal., Hrsg, Elsevier, Amster- dam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.
Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden:
Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.
Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Aca- demic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89).
Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vectordevelop- mentforfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdyetal., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith etal., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156- 2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol.20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195).
Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.
Rekombinante Mikroorganismen:
Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeigne- tes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retroviraleTransfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben. Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierten Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, - Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu verändern, z.B. funktionell zu disrumpieren ("Knockouf-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem Verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, dass das endogene Gen bei homologer Rekom- bination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, dass dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des TMT-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503.
Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrerfunktionellen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsörganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche derGat- tungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, euka- ryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Bevorzugte Organismen sind aus der Gattung Ashbya, insbesondere aus A. gossypii-Stämmen ausgewählt.
Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zellpberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitätschromatographie genutzt werden.
Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA- Polymerase/Promoter-System, die Phagen λ oder μ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.
Gewünschtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden.
Rekombinante Herstellung der Polypeptide:
Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.
Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezemiert werden, auf- geschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lyti- schen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.
Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektropho- rese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben. Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nucleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Rei- nigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.
Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmar- ker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oder radioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden.
Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vorzugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z.B. bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Um die Reaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren Promotors. Die Kultivierung wird nach Induktion der Vitamin B2-Produktion in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt.
Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.
Allgemeine experimentelle Angaben
a) Allgemeine Klonierungsverfahren
Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschrittewiez.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt.
b) Polymerasekettenreaktion (PCR)
PCR wurde nach Standardprotokoll mit folgendem Standardansatz durchgeführt:
8 μl dNTP-Mix (200μM), 10 μl Taq-Polymerase-Puffer (10 x) ohne MgCI2, 8μl MgCI2 (25mM), je 1 μl Primer (0,1 μM), 1 μl zu amplifizierende DNA, 2,5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 μl demineralisiert.es Wasser.
c) Kultivierung von E.coli
Die Kultivierung von rekombinanten E. coli-Stämme DH5α wurde in LB-Amp Medium (Trypton 10,0g, NaCI 5,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, Ampicillin 100 g/ml H20 ad 1000 ml) bei 37 °C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei einer Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Me- dium in einem 2-l-Kolben mit 4 ml Kultur inokuliert. Die Induktion der P450-Expression in E. coli erfolgte nach Erreichen eines OD578-Wertes zwischen 0,8 und 1 ,0 durch eine drei- bis vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42 °C.
d) Reinigung des gewünschten Produktes aus der Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Mikroorganismus oder aus dem Kulturüberstand kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mecha- nische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden.
Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten. Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül mit höherer Selektivität als die Verunreinigungen entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird oder dieses passiert. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Stand der Technik sind viele Reinigungsverfahren bekannt. Diese Reinigungstechniken sind z.B. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill: New York (1986).
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova etal. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S.89-90, S.521-540, S. 540-547, S.559-566, 575- 581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
e) Allgemeine Beschreibung der MPSS-Methode, Klonidentifizierung und Homologiesuche
Die MPSS Technologie (Massive Parallele Signatur Sequenzierung, wie von Brenner etal, Nat. Biotechnol.(2000) 18, 630-634 beschrieben; worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird) wurde an dem filamentösen, Vitamin B2 produzierenden Pilz Ashbya gossypii angewendet. Mit Hilfe dieser Technologie ist es möglich, mit hoher Genauigkeit quantitative Aussagen über die Expressionsstärke einer Vielzahl von Genen in einem eukaryotischen Organismus zu erhalten. Dabei wird die mRNA des Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt X isoliert, mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben und anschließend in spezielle Vektoren Moniert, die eine spezifische Tag-Sequenz besitzen. Die Anzahl von Vektoren mit unterschiedlicher Tagsequenz wird dabei so hoch gewählt (etwa 1000-fach höher), dass statistisch gesehen, jedes DNA-Molekül in einen, durch seine Tag-Sequenz einzigartigen, Vektor klon iert wird. Anschließend werden die Vektorinserts zusammen mit dem Tag herausgeschnitten. Die so erhaltenen DNA-Moleküle werden dann mit Mikrokügelchen inkubiert, die die molekularen Gegenstücke zu den erwähnten Tags besitzen. Nach Inkubation kann davon ausgegangen werden, dass jedes Mikrokügelchen über die spezifischen Tags bzw. Gegenstücke mit nur einer Sorte von DNA Molekülen beladen ist. Die Kügelchen werden in eine spezielle Flußzelle überführt und dort fixiert, so dass es möglich ist, mit Hilfe eines adaptierten Sequenzierverfahrens, auf Basis von Fluoreszensfarbstoffen und mit Hilfe einer digitalen Farbkamera, eine Massensequenzierung aller Kügelchen vorzunehmen. Mit dieser Methode ist zwar eine zahlenmäßig hohe Auswer- tung möglich, die allerdings durch eine Leseweite von etwa 16 bis 20 Basenpaaren limitiert ist. Die Sequenzlänge reicht dennoch aus, um bei den meisten Organismen eine eindeutige Zuordnung zwischen Sequenz und Gen zu ermöglichen (20bp besitzen eine Sequenzhäufigkeit von -1x1012, das menschliche Genom besitzt im Vergleich dazu "nur" eine Größe von -3x109 bp).
Die auf diese Weise erhaltenen Daten werden ausgewertet, indem die Anzahl der gleichen Sequenzen gezählt und ihre Häufigkeiten miteinander verglichen werden. Häufig auftretende Sequenzen spiegeln eine hohe Expressionsstärke, vereinzelt auftretende Sequenzen eine niedrige Expressionsstärke wider. Erfolgte die mRNA-lsolation zu zwei Unterschiedlichen Zeitpunkten (X und Y), so ist es möglich ein zeitliches Expressionsmuster einzelner Gene aufzustellen.
Beispiel 1 :
Isolation von mRNA aus Ashbya gossypii
Ashbya gossypii wurde in an sich bekannter Weise kultiviert (Nährmedium: 27,5 g/l Hefeextrakt; 0,5 g/l Magnesiumsulfat; 50ml/l Sojaöl; pH 7). Myzelproben von Ashbya gossypii werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Fermentation (24h, 48h und 72h) entnommen und die entsprechende RNA bzw. mRNA wird nach dem Protokoll von Sambrook et al. (1989) daraus isoliert.
Beispiel 2: Anwendung der PSS
Isolierte mRNA von A gossypii wird dann einer MPSS-Analyse, wie oben erläutert, unterzogen.
Die ermittelten Datensätze werden einer statistischen Auswertung unterzogen und nach Signifi- kanz der Expressionsunterschiede gegliedert. Dabei wurde sowohl hinsichtlich Erhöhung bzw.
Erniedrigung der Expressionsstärke untersucht. Eine Einteilung erfolgt über eine Einstufung der Expressionsveränderung in a) monotone Veränderung, b) Veränderung nach 24h, und c) Veränderung nach 48h.
Die eine Expressionsveränderung repräsentierenden durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp- Sequenzen werden dann als Sonden verwendet und gegen eine Genbank von Ashbya gossypii, mit einer durchschnittlichen Insertgröße von etwa 1kb, hybridisiert. Die Hydridisierungstempera- tur lag dabei im Bereich von etwa 30 bis 57°C.
Beispiel 3: Erstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii
Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wird zunächst chromosomale DNA nach der Methode von Wright und Philippsen (Gene (1991 ) 109: 99-105) und Mohr (1995, PhD Thesis, Biozentrum Universität Basel, Schweiz) isoliert.
Die DNA wird partiell mit Sau3A verdaut. Dazu werden 6μg genomische DNA einem Sau3A Verdau mit unterschiedlichen Enzymmengen (0,1 bis 1 U) unterzogen. Die Fragmente werden in einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die 1 kb Region wird isoliert und einer QiaEx- Extraktion unterzogen. Die größten Fragmente werden mit dem BamHI geschnittenen Vektor pRS416 (Sikorski und Hieter, Genetics (1988) 122; 19-27) ligiert (90 ng BamHI geschnittener, dephosphorylierter Vektor; 198 ng Insert DNA; 5ml Wasser; 2 μl 10xLigationspuffer; 1U Ligase). Mit diesem Ligationsansatz wird E. coli Laborstamm XL-1 blue transformiert und die resultierenden Klone werden zur Identifizierung des Inserts eingesetzt.
Beispiel 4:
Herstellung einer geordneten Genbank (CHIP-Technologie)
Etwa 25,000 Kolonien der Ashbya gossypii Genbank (dies entspricht einer etwa 3-fachen Genomabdeckung) wurden geordnet auf eine Nylonmembran transferiert und anschließend nach der Methode der Koloniehybridisierung wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben, behandelt. Von den durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp-Sequenzen wurden Oligonukleotide synthetisiert und mit Hilfe von 32P radioaktiv markiert. Jeweils 10 markierte Oligonukleotide mit ähnlichem Schmelzpunkt werden vereinigt und gemeinsam gegen die Nylonmembranen hybridisiert. Nach Hybridisierungs- und Waschschritten werden positive Klone durch Autoradiographie identifiziert, und mit Hilfe von PCR-Sequenzierung direkt analysiert. Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 19" trägt und mit dem MIPS Tag „Ygr257c" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.
Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 24" trägt und mit dem MIPS Tag „Mdl2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 5.
Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeich- nung „Oligo 109" trägt und mit dem MIPS Tag „Prp 12" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10.
Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 163" trägt und mit dem MIPS Tag „Flx1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 14.
Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 31" trägt und mit dem MIPS Tag „STV1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19.
Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 4" trägt und mit dem MIPS Tag „OPT2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 23.
Auf diese Weise wurde ein weiterer Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 6" trägt und mit dem MIPS Tag „VAC1 " aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28.
Auf diese Weise wurde ein weiterer Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 146" trägt und mit dem MIPS Tag „Ymr162c" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 33.
Auf diese Weise wurde ein weiterer Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 56" trägt und mit dem MIPS Tag „YpH 10c" aus S. cerevisiae signifikante Homologien be- sitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 37. Auf diese Weise wurde einweiterer Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 167" trägt und mit dem MIPS Tag „ERP5" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 42.
Beispiel 5:
Auswertung der Sequenzdaten mit Hilfe einer BLASTX Suche
Eine Auswertung der erhaltenen Nukleinsäure-Sequenzen, d.h. deren funktionale Zuordnung zu einer funktionalen Aminosäuresequenz, erfolgte mittels einer BLASTX-Suche in Sequenz- Datenbanken. Fast alle der aufgefundenen Aminosäuresequenz-Homologien betrafen Saccha- romyces cerevisiae (Bäckerhefe). Da dieser Organismus bereits vollständig sequenziert worden ist, konnten genauere Informationen bezüglich dieser Gene unter: http://www.mips.gsf.de/proi/veast/search/code search.htm nachgeschlagen werden.
So wurden folgende Homologien mit einem Aminosäurefragment aus S. cerevisiae ermittelt. Das entsprechenden Alignment sind in den beiliegenden Figur 1 bis 10 gezeigt.
a) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:1 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem mitochondrialen energie- übertragenden Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 609 bis 1 aus SEQ ID NO:1 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 1 dargestellt. SEQ ID NO: 2 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines mitochondrialen energieübertragenden Proteins zugeordnet werden.
b) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:5 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem ABC-Transportprotein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (SEQ ID NO:6) (entsprechend den Nucleotiden 1494 bis 1387 aus SEQ ID NO:5 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 2 dargestellt. SEQ ID NO: 7 zeigt eine weitere erfindungsgemäße Aminosäure- Teilsequenz.
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines ABC- Transportproteins zugeordnet werden. c) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO: 10 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem membranintegrierten mitochondrialen Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 15 bis 455 aus SEQ ID NO: 10 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 3 dar- gestellt. SEQ ID NO: 11 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines membranintegrierten mitochondrialen Proteins zugeordnet werden.
d) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:14 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem mitochondrialen Innermembran-Transportprotein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 415 bis 1215 aus SEQ ID NO:14 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 4 dargestellt. SEQ ID NO: 15 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines mitochondrialen Inhermembran-Transportproteins zugeordnet werden.
e) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:19 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer nicht-vakuolären 102 kD-Untereinheit der H+-ATPase-
VO-Domaine aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 2 bis 790 aus SEQ ID NO:19 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 5 dargestellt. SEQ ID NO: 20 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure- Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion einer nicht-vakuolären 102 kD-Untereinheit der H+-ATPase-VO-Domaine zugeordnet werden.
f) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:23 abgeleitete Aminosäure- sequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae mit einer
Ähnlichkeit zum isp4-Protein aus S. pombe. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 869 bis 522 aus SEQ ID NO:23) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 6 dargestellt. SEQ ID NO: 24 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz . Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines Proteins mit einer Ähnlichkeit zum isp4-Protein aus S. pombe und damit der Aktivität eines Oligopeptid- Transporters .zugeordnet werden.
g) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:28 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem VAC1 -Protein, einem cytosolischen und peripheren Membranprotein mit drei Zinkfingern, aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 356 bis 243 aus SEQ ID NO:28 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 7A dargestellt. Eine weitere davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 166 bis 2 aus SEQ ID NO:28 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 7B gezeigt. SEQ ID NO: 29 und SEQ ID NO: 30 zeigen jeweils eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines VAC1 -Proteins, eines cytosolischen und peripheren Membranprteins mit drei Zinkfingern, zugeordnet werden.
h) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:33 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein mit einer ATPase-ähnlichen Funktion aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 904 bis 707 aus SEQ ID NO:33 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 8 dargestellt. SEQ ID NO: 34 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure- Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines ATPase- ähnlichen Proteins zugeordnet werden.
i) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:37 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem PH085-Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleitete Aminosäure-Teilsequenze (entsprechend den Nucleotiden 898 bis 5 aus SEQ ID NO:37 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 9 dargestellt. Die Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 38 und SEQ ID NO: 39 entsprechen Aminosäure- Teilsequenzen abgeleitet vom Gegenstrang zu Position 950 bis 900 bzw. 898 bis 5 in SEQ ID NO:37.
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines PH085- Proteins zugeordnet werden. k) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID N0:42 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit dem am Membranverkehr beteiligten p24- Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 931 bis 806 aus SEQ ID NO:42 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 10 dargestellt. SEQ ID NO: 42 zeigt jeweils eine N-terminal verlängerte Aminosäure- Teilsequenz .
Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines am Membranverkehr beteiligten p24-Proteins zugeordnet werden.
Beispiel 6:
Isolierung der Full-Length-DNA
a) Konstruktion einer A gossyp//-Genbank
Hochmolekulare zelluläre Gesamt-DNA von A. gossypii wurde aus einer 2 Tage alten, in einem flüssigen MA2-Medium (10g Glucose, 10g Pepton, 1g Hefeextrakt, 0,3g Myo-Inositad 1000 ml) gewachsenen 100 ml Kultur hergestellt. Das Myzel wurde abfiltriert, zweimal mit H20 dest. gewaschen, in 10 ml 1M Sorbitol, 20 mM EDTA, enthaltend 20 mg Zymolyase-20T, suspendiert und 30 bis 60 min unter Ißichtem Schütteln bei 27 °C inkubiert. Die Protoplasten-Suspension wurde auf 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 100 mM EDTA und 0,5-%igem Natriumdode- cylsulfat (SDS) eingestellt und 20 min bei 65 °C inkubiert. Nach zwei Extraktionen mit Phenol- Chloroform (1:1 vol/vol) wurde die DNA mit Isopropanol gefällt, in TE-Puffer suspendiert, mit RNase behandelt, erneut mit Isopropanol gefällt und in TE resuspendiert.
Eine A gossyp//-Kosmid-Genbank wurde hergestellt, indem man nach der Größe ausgewählte, mit Sau3A teilverdaute genomische DNA an die dephosphorylierten Arme des Cosmidvektors Super-Cos1 (Stratagene) band. Der Super-Cos1 -Vektor wurde zwischen den beiden cos-Stellen durch Verdau mit Xba/ und Dephosphorylierung mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (Boeh- ringer) geöffnet, gefolgt von einem Öffnen der Klonierungsstelle mit BamHI. Die Ligationen wurden über Nacht bei 15 °C in 20 μl, enthaltend 2,5 μg teilverdauter chromosomaler DNA, 1 μg Super-Cos1 -Vektorenarme, 40 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI2, 1mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP und 2 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden unter Verwendung der Extrakte und des Protokolls von Stratagene (Gigapack II Packa- ging Extract) in vitro verpackt. Das verpackte Material wurde zur Infizierung von E. coli NM554 (recA13, araD139, Δ(ara,leu)7696, Δ(lac)17A, galil, galK, hsrR, rpsfetf), mcrA, mcrB) verwendet und auf Ampicillin (50 μg/ml) enthaltende LB-Platten verteilt. Man erhielt Transformanten, welche ein A gossypii-\ nsert einer durchschnittlichen Länge von 30-45 kb enthielten.
b) Lagerung und Screening der Cosmid-Genbank
Insgesamt 4 x 104 frische Einzelkolonien wurden einzeln in Vertiefungen von 96-er Microtiterplatten (Falcon, Nr. 3072) in 100 μl LB-Medium, ergänzt mit dem Gefriermedium (36 mM K2HP04/13.2 mM KH2P04, 1,7 mM Natriumeitrat, 0,4 mM MgS04, 6,8 mM (NH4)2S04, 4,4% (wt/vol) Glycerin) und Ampicillin (50 μg/ml), inokuliert, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln wachsen gelassen und bei -70 °C eingefroren. Die Platten wurden rasch aufgetaut und danach unter Verwendung eines 96-er-Replikators, der in einem Ethanolbad unter anschließender Verdunstung des Ethanols auf einer heißen Platte sterilisiert worden war, in frisches Medium dupliziert. Vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen (vor irgendwelchen anderen Maßnahmen) wurden die Platten kurz in einem Mikrotiterschüttler (Infors) geschüttelt, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Mittels eines Robotersystems (Bio-Robotics), mit dem geringe Mengen an Flüssigkeit aus 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte auf Nylonmembran (GeneSc- reen Plus, New England Nuclear) transferiert werden können, wurden einzelne Klone auf Nylonmembranen platziert. Nach dem Transfer der Kultur aus den 96-er Mikrotiterplatten (1920 Klone) wurden die Membranen auf die Oberfläche von LB-Agar mit Ampicillin (50 μg/ml) in 22 x 22 cm Kulturschalen (Nunc) platziert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Vor Erreichen der Zell- konfluenz wurden die Membranen, wie von Herrmann, B. G., Barlow, D. P. und Lehrach, H. (1987) in Cell 48, S. 813-825 beschrieben, prozessiert, wobei als zusätzliche Behandlung nach dem ersten Denaturierungsschritt ein 5-minütiges Bedampfen der Filter auf einem in Denaturie- rungslösung getränkten Pad über einem kochenden Wasserbad hinzukommt.
Hit Hilfe des Random-Hexamer-Primer-Verfahrens (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem. 132, S. 6-13) wurden doppelsträngige Sonden durch Aufnahme von [alpha- 32P]dCTP mit hoher spezifischer Aktivität markiert. Die Membranen wurden prähybridisiert und 6 bis 12 h bei 42 °C in 50% (vol/vol) Formamid, 600 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1 mM EDTA, 10% Dextransulfat, 1% SDS, und 10x Denhardt-Lösung, enthaltend Lachssperma-DNA (50 μg/ml) mit 32P-markierten Sonden (0,5-1 x 106cpm/ml) hybridisiert. Typischerweise wurden Waschschritte etwa 1 h bei 55 bis 65 °C in 13 bis 30 mM NaCI, 1 ,5 bis 3 mM Natriumeitrat, pH 6,3, 0,1 % SDS durchgeführt und die Filter wurden 12 bis 24 h bei -70 °C mit Kodak- Verstärkerplatten autoradiographiert. Bislang wurden einzelne Membrane mehr als 20 mal erfolgreich wiederverwendet. Zwischen den Autoradiographien wurden die Filter durch Inkubation bei 95 °C für 2 x 20 min in 2 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 0,1 % SDS gestrippt.
c) Zurückgewinnung positiver Kolonien aus der aufbewahrten Genbank Gefrorene Bakterienkulturen in Microtiter-Wells wurden unter Verwendung steriler Einweg- Lanzetten abgekratzt und das Material wurde auf LB-Agar-Petrischalen enthaltend Ampicillin (50 μg/ml) ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden danach zur Inokulierung von Flüssigkulturen für Herstellung von DNA mittels Alkali-Lyse-Verfahren (Birnboim, H. C. und Doly, J. (1979), Nucleic Acids Res. 7, S. 1513-1523) verwendet.
d) Full-Length DNA
Auf die oben beschriebenen Weise konnten Klone identifiziert werden, derein Insert mit der entsprechenden Vollsequenz tagen. Diese Klone tragen die internen Bezeichnungen:
„Oligo 19v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 3.
„Oligo 24v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8.
Oligo 109v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12.
„Oligo 163v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 17.
„Oligo 31 v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21.
„Oligo 4v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 26.
„Oligo 6v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 31.
„Oligo 146v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz ge- maß SEQ ID NO: 35.
„Oligo 56v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz ge- maß SEQ ID NO: 40.
„Oligo 167v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 44.
Eine Übersicht über sämtliche erfindungsgemäße Teil- und Vollsequenzen ist in folgender Tabelle 1 zu finden:
Tabelle 1 : Sequenzübersicht

Claims

Patentansprüche
1. Polynukleotid, welches aus Ashbya gossypii isolierbar ist und für ein Protein kodiert, das mit dem Transmembrantransport assoziiert ist und/oder ein Transmembranprotein ist.
2. Polynukleotid, nach Anspruch 1 , das mit dem Transmembrantransport assoziiert ist und/oder ein Transmembranprotein ist und eine in Tabelle 1 angegebene strukturelle und/oder funktionale Eigenschaft besitzt.
3. Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 , 5, 10, 14, 19, 23, 28, 33, 37 oder 42, welche vorzugsweise aus Ashbya gossypii isolierbar ist; das dazu komplementäre Polynukleotid; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.
4. Polynukleotid nach Anspruch 4, welches eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:
3, 8, 12, 17, 21 , 26, 31, 35, 40 oder 44 oder ein Fragment davon umfasst.
5. Oligonukleotid, welches mit einem Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert.
6. Polynukleotid, welches mit einem Oligonukleotid nach Anspruch 5, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses Genproduktes kodiert.
7. Polypeptid, welches von einem Polynukleotid kodiert wird, das die Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1 bis 4 oder ein Fragment davon umfasst, oder von einem Polynukleotid nach Anspruch 6 kodiert wird; oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 4, 6, 7, 9, 11 , 13, 15, 16, 18, 20, 22, 24, 27, 29, 30, 32, 34, 36, 38, 39, 41 , 43 oder SEQ ID NO: 45 umfasst; sowie funktionale Äquivalente davon, insbesondere solche welche eine der in
Anspruch 2 angegebenen strukturellen und/oder funktionalen Eigenschaften besitzen.
8. Expressionskassette, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.
9. Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 8.
M/42291 PCT
10. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 9.
11. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, in welchem die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert ist, das für ein Polypeptid nach Anspruch 7 kodiert; oder in welchem die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 erniedrigt oder erhöht ist.
12. Wirt nach Anspruch 10 oder 11 aus der Gattung Ashbya.
13. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 9 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
14. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 7 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur rekombinanten Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 7.
15. Verfahren zum Nachweis eines Effektortargets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt, insbesondere bindet, den Einfluß des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2, und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert.
16. Verfahren zur Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäure- sequenz, wechselwirkt.
17. Effektor für ein Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wobei der Effektor ausgewählt ist unter: a) Antikörpern oder antigenbindenen Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 7 wechselwirken; c) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen.
18. Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkt(e) aus dem Kulturansatz isoliert.
19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei man vor und/oder während der Kultivierung des Wirts diesen mit einem Effektor nach Anspruch 17 behandelt.
20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Wirt ausgewählt ist unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Mikroorganismus ein Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.
22. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem Mikroorganismus der Gattung
Ashbya.
23. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation des Transmembran-Transports, der Aktivität eines Transmenbranproteins oder eines damit zusammenhängenden Folgezustandes in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya während der Kultivierung zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.
24. Wirt nach Anspruch 12 mit verbesserter Zellantwort auf äußere Bedingungen.
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