DE60124910T2

DE60124910T2 - Menschliche twik-8 moleküle und ihre verwendung

Info

Publication number: DE60124910T2
Application number: DE60124910T
Authority: DE
Inventors: Alexandra Maria Lexington GLUCKSMANN
Original assignee: Bayer Healthcare AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: EP1290164B1; US20020034781A1; ES2277920T3; ATE346926T1; WO2001077329A3; EP1290164A2; WO2001077329A2; DE60124910D1; WO2001077329A8; AU2001251410A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Kalium-(K⁺-) Kanäle sind allgegenwärtige Proteine, die in das Einstellen des Membranruhepotentials involviert sind sowie auch in die Modulation der elektrischen Aktivität der Zellen. In reizbaren Zellen beeinflussen K⁺-Kanäle die Wirkung potentieller Wellenformen, die Entladungsrate und die Neurotransmittersekretion (B. Rudy, Neuroscience 25, 729-749 (1988); B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Auflage (1992)). In nicht reizbaren Zellen sind sie in die Hormonsekretion, in die Regulation des Zellvolumens und potentiell in die Zellproliferation und -differenzierung involviert (Lewis et al., Annu. Rev. Immunol. 13, 623-653 (1995)). Entwicklungen in der Elektrophysiologie haben die Identifikation und Charakterisierung einer erstaunlichen Vielfalt an K⁺-Kanälen ermöglicht, die sich in ihren biophysikalischen Eigenschaften, ihrer Pharmakologie, ihrer Regulierung und Gewebeverteilung unterscheiden (B. Rudy, Neuroscience 25, 729-749 (1988); B. Hille, Ionic Channels of Excitable Membranes, 2. Auflage (1992)). Erst vor kurzem enthüllten Klonierungsversuche in beachtlichem Ausmaß die Mechanismen, die diese funktionelle Diversität bestimmen. Weiters ergaben Analysen der Beziehung zwischen Struktur und Funktion eine wichtige Reihe an Daten bezüglich der molekularen Basis der biophysikalischen Eigenschaften (Selektivität, Schleusenverhalten, Anordnung) und der pharmakologischen Eigenschaften klonierter K⁺-Kanäle.
Die funktionelle Diversität von K⁺-Kanälen ist hauptsächlich auf die Existenz einer großen Anzahl an Genen zurückzuführen, die für porenbildende Untereinheiten sowie für andere assoziierte regulatorische Untereinheiten kodieren. Zwei Hauptstrukturfamilien porenbildender Untereinheiten wurden identifiziert. Die erste besteht aus Untereinheiten mit einem konservierten hydrophoben Kern, der sechs Transmembrandomänen (TMDs) enthält. Diese K⁺-Kanal-α-Untereinheiten sind an der Bildung nach außen gerichteter, spannungsgesteuerter (Kv-) Rektifizier- und Ca²⁺-abhängiger K⁺-Kanäle beteiligt. Die vierte TMD enthält wiederholte positive Ladungen, die in die Spannungssteuerung dieser Kanäle involviert sind und daher auch in ihre nach außen gerichtete Rektifikation (Logothetis et al., Neuron 8, 531-540 (1992); Bezanilla et al., Biophys. J. 66, 1011-1021 (1994)).
Die zweite Familie porenbildender Untereinheiten besitzt nur zwei TMDs. Diese sind essentielle Untereinheiten nach innen rektifizierender (IRK-), G-Protein-gekoppelter (GIRK-) und ATP-empfindlicher (K_ATP-) K⁺-Kanäle. Die nach innen gerichtete Rektifikation ist das Resultat einer spannungsabhängigen Blockade durch zytoplasmatisches Mg²⁺ und Polyamine (H. Matsuda, Annu. Rev. Physiol. 53, 289-298 (1991)). Eine konservierte Domäne, genannt die P-Domäne, ist in allen Mitgliedern beider Familien vorhanden (O. Pongs, J. Membr. Biol. 136, 1-8 (1993); Heginbotham et al., Biophys. J. 66, 1061-1067 (1994); R. Mackinnon, Neuron 14, 889-892 (1995); Pascual et al., Neuron 14, 1055-1063 (1995)). Diese Domäne ist ein essentielles Element der wässrigen K⁺-selektiven Pore. In beiden Gruppen ist die Anordnung von vier Untereinheiten erforderlich, um einen funktionellen K⁺-Kanal zu bilden (R. Mackinnon, Nature 350, 232-235 (1991); Yang et al., Neuron 15, 1441-1447 (1995)).
Sowohl in den sechs-TMD- als auch in den zwei-TMD-porenbildenden Untereinheitfamilien können sich verschiedene Untereinheiten, die von verschiedenen Genen kodiert werden, zusammenschließen, um Heterotetramere mit neuen Kanaleigenschaften auszubilden (Isacoff et al., Nature 345, 530-534 (1990)). Eine selektive Formation heteropolymerer Kanäle kann es jeder Zelle ermöglichen, das beste K⁺-Stromrepertoire auszubilden, das ihrer Funktion entspricht. Porenbildende α-Untereinheiten von Kv-Kanälen werden gemäß ihrer Sequenzähnlichkeit in verschiedene Unterfamilien eingeteilt (Chandy et al., Trends Pharmacol. Sci. 14, 434 (1993)). Man nimmt an, dass die Tetramerisierung vorzugsweise zwischen Mitgliedern jeder Untergruppe stattfindet (Covarrubias et al., Neuron 7, 763-773 (1991)). Die für diese selektive Assoziierung verantwortliche Domäne wird in der N-terminalen Region lokalisiert und wird zwischen Mitgliedern der derselben Untergruppe beibehalten. Diese Domäne ist für die hetero-, jedoch nicht für die homo-multimere Anordnung innerhalb einer Unterfamilie erforderlich und verhindert die Co-Anordnung zwischen verschiedenen Unterfamilien. Vor kurzen wurde gezeigt, dass sich porenbildende Untereinheiten mit zwei TMDs co-anordnen, um Heteropolymere auszubilden (Duprat et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 212, 657-663 (1995)). Diese Heteropolymerisierung erscheint notwendig zu sein, um funktionelle GIRKs zu ergeben. IRKs sind als Homopolymere aktiv, bilden jedoch auch Heteropolymere.
Es wurden vor kurzem sowohl in Menschen als auch in Hefe neue strukturelle Typen von K⁺-Kanälen identifiziert. Diese Kanäle besitzen zwei P-Domänen in ihrer funktionellen Untereinheit anstatt nur einer (Ketchum et al., Nature 376, 690-695 (1995); Lesage et al., J. Biol. Chem. 271, 4183-4187 (1996); Lesage et al., EMBO J. 15, 1004-1011 (1996); Reid et al., Receptors Channels 4, 51-62 (1996)). Der menschliche Kanal, genannt TWIK-1, besitzt vier TMDs. TWIK-1 wird auf breiter Ebene in menschlichen Geweben exprimiert und ist besonders häufig im Herzen und im Gehirn zu finden. TWIK-1-Stromflüsse sind zeitunabhängig und nach innen gerichtet rektifizierend. Diese Eigenschaften deuten darauf hin, dass TWIK-1-Kanäle in die Kontrolle der Hintergrund-K⁺-Membran-Leitfähigkeit involviert sind (Lesage et al., EMBO J. 15, 1004-1011 (1996)). Fink et al., EMBO J. 17, 3297-3308 (1998), berichten über die Klonierung von TRAAK, einem 398-Aminosäure-Protein, das ein neues Mitglied dieser Klasse an K⁺-Kanälen ist. WO 0026253 offenbart h-TRAAK-Polypeptide und -Polynucleotide.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung neuer Mitglieder der TWIK-artigen (steht für Tandem an P-Domänen in einem schwachen, nach innen rektifizierenden K⁺-Kanal) Familie an Kaliumkanälen, die hierin als TWIK-8-Nucleinsäure und -Proteinmoleküle bezeichnet werden. Die TWIK-8-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind als Ziele zur Entwicklung modulierender Agenzien nützlich, um eine Reihe zellulärer Prozesse zu modulieren. Dementsprechend stellt diese Erfindung in einem Aspekt isolierte Nucleinsäuremoleküle bereit, die für TWIK-8-Proteine oder biologisch aktive Teile dieser kodieren, sowie Nucleinsäurefragmente, die als Primer oder Hybridisierungssonden zur Detektion von für TWIK-8 kodierenden Nucleinsäuren geeignet sind.
In einer Ausführungsform besitzt ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül der Erfindung zumindest eine Identität von 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr gegenüber der Nucleotidsequenz (z.B. gegenüber der gesamten Länge der Nucleotidsequenz), die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigt wird, oder einem Komplement davon. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigte Nucleotidsequenz oder ein Komplement davon. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül die Seq.-ID Nr. 3 sowie die Nucleotide 1-83 aus Seq.-ID Nr. 1. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül die Seq.-ID Nr. 3 sowie die Nucleotide 1344-1408 aus Seq.-ID Nr. 1. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform besteht das Nucleinsäuremolekül aus der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Nucleotidsequenz.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein mit einer Aminosäuresequenz kodiert, die eine ausreichende Identität mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, das eine Aminosäuresequenz-Identität von zumindest 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr gegenüber der gesamten Länge der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kodiert ein isoliertes Nucleinsäuremolekül für die Aminosäuresequenz von menschlichem TWIK-8. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 kodiert.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt die Verwendung von Nucleinsäuremolekülen dar, vorzugsweise von TWIK-8-Nucleinsäuremolekülen, die im Vergleich zu Nucleinsäuremolekülen, die für Nicht-TWIK-8-Proteine kodieren, TWIK-8-Nucleinsäuremoleküle spezifisch detektieren. In einer Ausführungsform z.B. ist ein solches Nucleinsäuremolekül zumindest 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500 oder mehr Nucleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül, das die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz umfasst, oder einem Komplement davon.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kodiert das Nucleinsäuremolekül für eine natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin das Nucleinsäuremolekül unter stringenten Bedingungen mit einem Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül bereit, das sich in einer Antisense-Ausrichtung gegenüber einem TWIK-8-Nucleinsäuremolekül befindet, z.B. der kodierende Strang eines TWIK-8-Nucleinsäuremoleküls.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung stellt einen Vektor bereit, der ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül umfasst. In einigen Ausführungsformen ist der Vektor ein rekombinanter Expressionsvektor. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die einen Vektor der Erfindung in sich trägt. In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung eine Wirtszelle bereit, die ein Nucleinsäuremolekül der Erfindung enthält. Die Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung eines TWIK-8-Proteins bereit, indem eine Wirtszelle, z.B. eine Säugetierwirtszelle wie etwa eine nicht menschliche Säugetierzelle, der Erfindung, die einen rekombinanten Expressionsvektor enthält, in einem geeigneten Medium gezüchtet wird, sodass das Protein hergestellt wird.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung stellt isolierte oder rekombinante TWIK-8-Proteine dar.
Ein TWIK-8-Protein umfasst zumindest eine oder mehrere der folgenden Domänen: eine Transmembrandomäne, eine Poren-Schleifen-Domäne, eine Sieben-Transmembranrezeptordomäne, eine zyklische nucleotidgesteuerte Kanaldomäne, eine TRAAK-Kaliumkanaldomäne, eine Kaliumkanal-Proteindomäne, eine spannungsge steuerte Kaliumkanaldomäne, eine Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne sowie eine nach außen gerichtete Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne und besitzt eine Aminosäuresequenz, die zumindest 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität gegenüber der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
In einer anderen Ausführungsform besitzt ein TWIK-8-Protein die Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein TWIK-8-Protein dar, das durch ein Nucleinsäuremolekül kodiert wird, das aus einer Nucleotidsequenz besteht, die zumindest 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität gegenüber der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 aufweist, oder einem Komplement davon.
Die Proteine der vorliegenden Erfindung können operativ an ein Nicht-TWIK-8-Polypeptid gebunden werden (z.B. heterologe Aminosäuresequenzen), um Fusionsproteine auszubilden. Weiters stellt die Erfindung Antikörper, wie z.B. monoklonale oder polyklonale Antikörper, dar, die spezifisch an Proteine der Erfindung binden. Zusätzlich können die TWIK-8-Proteine in pharmazeutische Zusammensetzungen inkorporiert werden, die gegebenenfalls pharmazeutisch annehmbare Träger umfassen.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines TWIK-8-Nucleinsäuremoleküls oder -Proteins in einer biologischen Probe durch Kontaktieren der biologischen Probe mit einem Agens, das in der Lage ist, ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül oder -Protein zu detektieren, bereit, sodass die Gegenwart eines TWIK-8-Nucleinsäuremoleküls oder -Proteins in der biologischen Probe detektiert wird.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Detektion der Gegenwart der TWIK-8-Aktivität in einer biologischen Probe durch Kontaktieren der biologischen Probe mit einem Agens, das in der Lage ist, einen Indikator für die TWIK-8-Aktivität zu dektieren, bereit, sodass die Gegenwart der TWIK-8-Aktivität in der biologischen Probe detektiert wird.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Modulation der TWIK-8-Aktivität bereit, umfassend das Kontaktieren einer Zelle, die in der Lage ist, TWIK-8 mit einem Antikörper zu exprimieren, der die TWIK-8-Aktivität moduliert, sodass die TWIK-8-Aktivität in der Zelle moduliert wird. In einer Ausführungsform inhibiert der Antikörper die TWIK-8-Akviität. In einer anderen Ausführungsform stimuliert der Antikörper die TWIK-8-Aktivität. Der Antikörper ist ein Antikörper, der spezifisch an ein TWIK-8-Protein bindet.
In einer Ausführungsform werden die Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet, um ein Individuum mit einer Störung zu behandeln, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Protein- oder -Nucleinsäureexpression oder -Aktivität charakterisiert ist, und zwar durch Verabreichen eines Antikörpers an das Individuum, der als TWIK-8-Modulator fungiert. Der Antikörper oder ein immunologisch aktiver Teil davon bindet selektiv an das TWIK-8-Protein. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Störung, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Protein- oder -Nucleinsäureexpression charakterisiert ist, um eine Erkrankung des Zentralnervensystems, wie z.B. eine kognitive oder neurodegenerative Störung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Störung, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Protein- oder -Nucleinsäureexpression charakterisiert ist, um eine kardiovaskuläre Erkrankung. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Störung, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Protein- oder -Nucleinsäureexpression charakterisiert ist, um eine Muskelerkrankung. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Störung, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Aktivität charakterisiert ist, um eine Störung der Zellproliferation, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung oder der Zellmigration. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Störung, die durch eine abnormale oder ungewollte TWIK-8-Aktivität charakterisiert ist, um eine Schmerzstörung oder eine Störung, die durch eine schlechte Steuerung schmerzsignalisierender Mechanismen charakterisiert ist.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenso diagnostische Tests zur Identifikation der Gegenwart oder der Abwesenheit einer genetischen Veränderung bereit, die durch zumindest einen der folgenden Faktoren charakterisiert ist: (i) abnormale Modifikation oder Mutation eines Gens, das für ein TWIK-8-Protein kodiert; (ii) Fehlsteuerung des Gens; und (iii) abnormale posttranslationale Modifikation eines TWIK-8-Proteins, worin eine Wildtyp-Form des Gens für ein Protein mit einer TWIK-8-Aktivität kodiert.
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Verfahren zur Identifikation einer Verbindung bereit, die an ein TWIK-8-Protein bindet oder deren Aktivität moduliert, und zwar durch Bereitstellung einer Indikatorzusammensetzung, die ein TWIK-8-Protein mit TWIK-8-Aktivität umfasst, wobei die Indikatorzusammensetzung mit einer Testverbindung kontaktiert wird und die Wirkung der Testverbindung auf die TWIK-8-Aktivität in der Indikatorzusammensetzung bestimmt wird, um eine Verbindung zu identifizieren, die die Aktivität eines TWIK-8-Proteins moduliert.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung werden aus der folgenden ausführlichen Beschreibung und den Ansprüchen ersichtlich werden.
Kurzbeschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die cDNA-Sequenz und die vorhergesagte Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8. Die Nucleotidsequenz entspricht den Nucleinsäuren 1 bis 1408 der Seq.-ID Nr. 1. Die Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 1 bis 419 der Seq.-ID Nr. 2. Die kodierende Region ohne die 3'-untranslatierte Region des menschlichen TWIK-8-Gens wird in Seq.-ID Nr. 3 dargestellt.
2 zeigt die Resultate der Analyse der menschlichen TWIK-8-Aminosäuresequenz (Seq.-ID Nr. 2) durch das Signal-P-Programm (Henrik et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997)), was auf die Gegenwart eines Signalpeptids etwa an den Resten 1-46 des nativen Moleküls hinweist.
3 zeigt die Resultate einer Suche, die gegen die MEMSAT-Datenbank durchgeführt wurde und zu der Identifikation von sechs Transmembrandomänen in dem nativen menschlichen TWIK-8-Protein (Seq.-ID Nr. 2) und fünf Transmembrandomänen in der reifen Form des menschlichen TWIK-8-Proteins geführt hat.
4 zeigt die Resultate einer Suche, die gegen die HMM-Datenbank durchgeführt wurde und die Gegenwart einer „Sieben-Transmembranrezeptordomäne" und einer „zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne" in der Aminosäuresequenz von menschlichem TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) identifizierte.
5 zeigt die Resultate einer Suche, die gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt wurde und die Gegenwart einer „TRAAK-Kaliumkanaldomäne", einer „Kaliumkanal-Proteindomäne", einer „spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne", einer „nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne" und einer „Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne" in der Aminosäuresequenz von menschlichem TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) identifizierte.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung neuer Moleküle, die hierin als TWIK-8-Nucleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden, die neue Mitglieder der TWIK-artigen (steht für Tandem an P-Domänen in einem schwachen, nach innen rektifizierenden K⁺-Kanal) Familie an Kaliumkanälen, darstellen. Diese neuen Moleküle sind z.B. in der Lage, eine kaliumkanalvermittelte Aktivität in einer Zelle zu modulieren, z.B. in einer neuronalen Zelle oder einer Muskelzelle.
Wie hierin verwendet umfasst ein „Kaliumkanal" ein Protein oder ein Polypeptid, das in den Erhalt, die Weiterleitung und Übertragung von Signalen in einer elektrisch reizbaren oder einer elektrisch nicht reizbaren Zelle, z.B. einer neuronalen Zelle oder einer Muskelzelle (z.B. eine Herzmuskelzelle), involviert ist. Kaliumkanäle sind kaliumionenselektiv und können die Reizbarkeit der Membranen bestimmen (z.B. die Fähigkeit eines Neurons, auf einen Stimulus zu reagieren und ihn in einen Impuls umzuwandeln). Kaliumkanäle können ebenso das Ruhepotential von Membranen, Wellenformen und Frequenzen von Aktionspotentialen sowie Reizschwellen beeinflussen. Kaliumkanäle werden typischerweise in elektrisch reizbaren Zellen, z.B. Neuronen, Muskelzellen, endokrinen Zellen und Eizellen, exprimiert und können heteromultimere Strukturen bilden, z.B. aus porenbildenden α- und zytoplasmatischen β-Untereinheiten zusammengesetzt. Kaliumkanäle sind ebenso in nicht reizbaren Zellen (z.B. Milz- oder Prostata-Zellen) zu finden, wo sie z.B. in der Signalübertragung eine Rolle spielen können. Beispiele für Kaliumkanäle umfassen: (1) die spannungsgesteuerten Kaliumkanäle, (2) die ligandgesteuerten Kaliumkanäle, z.B. neurotransmittergesteuerte Kaliumkanäle, und (3) zyklische nucleotidgesteuerte Kaliumkanäle. Die spannungsgesteuerten und ligandgesteuerten Kaliumkanäle werden im Gehirn exprimiert, z.B. in monoaminergen Neuronen des Hirnstamms und cholinergen Neuronen des Vorderhirns, wo sie in die Freisetzung von Neurotransmittern involviert sind, oder aber in den Dendriten der hippokampalen und neokortikalen Pyramidenzellen, wo sie in den Prozess des Lernens sowie die Bildung des Gedächtnisses involviert sind. Für eine ausführliche Beschreibung der Kaliumkanäle siehe E.R. Kandel et al., Principles of Neural Science, 2. Auflage (Elsevier Science Publishing Co. Inc., N.Y. (1985)), wobei der Inhalt hierin durch Verweis aufgenommen ist. Da die TWIK-artigen Proteine der vorliegenden Erfindung kaliumkanalvermittelte Aktivitäten modulieren können, können sie für die Entwicklung neuer diagnostischer und therapeutischer Agenzien für kaliumkanalassoziierte Störungen nützlich sein.
Wie hierin verwendet umfasst eine „kaliumkanalassoziierte Störung" eine Störung, eine Erkrankung oder ein Leiden, die/das durch eine Fehlsteuerung einer kaliumkanalvermittelten Aktivität charakterisiert ist. Kaliumkanalassoziierte Störungen können die Übertragung sensorischer Impulse aus der Peripherie an das Gehirn und/oder die Leitfähigkeit motorischer Impulse vom Gehirn an die Peripherie; die Integration von Reflexen; die Interpretation sensorischer Impulse und emotionale, intellektuelle (z.B. Lernen und Gedächtnis) oder motorische Prozesse nachteilig beeinflussen.
Beispiele für kaliumkanalassoziierte Störungen umfassen Erkrankungen des Zentralnervensystems, wie z.B. kognitive und neurodegenerative Störungen, wobei Beispiele dafür Folgende umfassen, jedoch nicht auf diese eingeschränkt sind: Alzheimer-Krankheit, Demenzarten, die mit der Alzheimer-Krankheit in Verbindung gebracht werden (wie z.B. die Pick-Krankheit), die Parkinson- und andere verbreitete diffuse Lewy-Körper-Erkrankungen, senile Demenz, die Huntington-Krankheit, das Gilles-de-la-Tourette-Syndrom, Multiple Sklerose, amyotrophe laterale Sklerose, Bewegungsstörungen, progressive supranukleäre Lähmung, Epilepsie, mit AIDS assoziierte Demenz sowie die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit; autonome Funktionsstörungen, wie z.B. Bluthochdruck und Schlafstörungen, sowie neuropsychiatrische Störungen, wie z.B. Depressionen, Schizophrenie, schizoaffektive Störungen, die Korsakow-Psychose, Manie, Angststörungen oder phobische Störungen; Lern- und Gedächtnisstörungen, z.B. Amnesie oder altersbedingter Gedächtnisverlust, Aufmerksamkeitsstörungen, dysthymische Störungen, schwerwiegende depressive Störungen, Manie, Zwangsstörung, Störungen, die durch die Verwendung psychoaktiver Substanzen hervorgerufen werden, Angstzustände, Phobien, Panikstörungen sowie bipolare affektive Störung, z.B. schwerwiegende bipolare affektive (Stimmungs-) Störung (BP-1) und bipolare affektive neurologische Störungen, z.B. Migräne und Obesität. Weitere ZNS-bezogene Störungen umfassen z.B. jene, die im Diagnostischen und Statistischen Handbuch Mentaler Störungen (DSM) der American Psychiatric Association aufgelistet sind, wobei die aktuellste Version desselben hierin durch Verweis in ihrer Gesamtheit aufgenommen ist.
Weitere Beispiele für kaliumkanalassoziierte Störungen umfassen das Herz betreffende Störungen. Kardiovaskuläre Systemstörungen, in die die TWIK-8-Moleküle der Erfindung direkt oder indirekt involviert sein können, umfassen Arteriosklerose, Ischämie-Reperfusionsverletzungen, Restenose, arterielle Entzündungen, Gefäßwandneumodellierung, ventrikuläre Neumodellierung, schnelles ventrikuläres Pacing, koronare Mikroembolie, Tachykardie, Bradykardie, Drucküberbelastung, Aortabiegung, Koronararterienligation, vaskuläre Herzerkrankung, atriale Fibrillation, Jervell-Syndrom, Lange-Nielsen-Syndrom, langes-QT-Syndrom, kongestives Herzversagen, Sinusknoten-Dysfunktion, Angina, Herzversagen, Hypertonie, atriale Fibrillation, atriales Flattern, dilatierte Kardiomyopathie, idiopathische Kardiomyopathie, Myokardinfarkt, Koronararterienerkrankung, Koronararterienkrampf und Arrhythmie. TWIK-8-vermittelte oder -verwandte Störungen umfassen ebenso Störungen des Bewegungsapparats, wie z.B. Paralyse und Muskelschwäche, z.B. Ataxie, Myotonie und Myokymie.
Weitere Beispiele für kaliumkanalassoziierte Störungen umfassen Schmerzstörungen. Schmerzstörungen umfassen jene Störungen, die Schmerzsignalisierungsmechanismen beeinträchtigen. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Schmerzsignalisierungsmechanismen" die zellulären Mechanismen, die in die Entstehung und Regulation von Schmerz involviert sind, z.B. Schmerz, der durch schädliche chemische, mechanische oder thermische Stimuli bei einem Individuum, z.B. einem Säugetier, wie z.B. einem Menschen, hervorgerufen wird. Bei Säugetieren tritt die anfängliche Detektion schädlicher chemischer, mechanischer oder thermischer Stimuli, ein Prozess, der als „Nozizeption" bezeichnet wird, vorwiegend an den peripheren Enden spezialisierter sensorischer Neuronen mit geringem Durchmesser auf. Diese sensorischen Neuronen leiten die Information an das Zentralnervensystem weiter, wodurch eine Empfindung von Schmerz oder Unbehagen hervorgerufen wird und die geeigneten Schutzreflexe in Gang gesetzt werden. Die TWIK-8-Moleküle der vorliegenden Erfindung können auf diesen sensorischen Neuronen vorhanden sein und können daher in die Detektion dieser schädlichen chemischen, mechanischen oder thermischen Stimuli und die Übertragung dieser Information in Membran-Depolarisierungsvorkommnisse involviert sein. Daher können die TWIK-8-Moleküle durch ihre Involvierung in Schmerzsignalmechanismen die Auslösung von Schmerz modulieren und als Ziele für die Entwicklung neuer diagnostischer Ziele und therapeutischer Agenzien zur Schmerzbekämpfung dienen. Beispiele für Schmerzstörungen umfassen Kopfschmerzen, posttherapeutische Neuralgie, diabetische Neuropathie, Postmastektomie-Schmerzsyndrom, Stumpfschmerz, Algodystrophie-Syndrom, Trigeminus-Neuralgie, neuropathischer Schmerz, orofazialer neuropathischer Schmerz, Osteoarthritis, Arthritis, z.B. rheumatoide Arthritis, Fibromyalgie-Syndrom, Spannungs-Myalgie, Guillian-Barre-Syndrom, Meralgia paraesthetica, Brennender-Mund-Syndrom, Fibrocitis, myofasziales Schmerzsyndrom, idiopathische Schmerz störung, temporomandibuläres Gelenksyndrom, atypische Odontalgie, Lendenschmerz, Hämaturie-Syndrom, nicht kardialer Brustschmerz, Rückenschmerzen, chronischer nicht spezifischer Schmerz, mit Operationen assoziierter Schmerz, psychogene Schmerzen, Zahnschmerzen, Störung durch Schmerzen im Bewegungsapparat, chronische Pelvisschmerzen, nicht organischer chronischer Kopfschmerz, Kopfschmerzen vom Spannungstyp, Cluster-Kopfschmerz, Migräne, komplexes regionales Schmerzsyndrom, Vaginismus, Nervenstamm-Schmerz, somatoforme Schmerzstörungen, zyklische Mastodynie, chronisches Erschöpfungssyndrom, multiples Somatisierungssyndrom, chronische Schmerzstörung, Krebsschmerzen, Somatisierungsstörung, Syndrom X, Gesichtsschmerz, idiopathischer Gesichtsschmerz, posttraumatische rheumatische Schmerzmodulationsstörung (Fibrositis-Syndrom), Hyperalgesie und die Tangier-Erkrankung.
Kaliumkanalstörungen umfassen ebenso Störungen der Zellproliferation, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung oder der Zellmigration. Störungen der Zellproliferation, des Zellwachstums, der Zelldifferenzierung oder der Zellmigration umfassen jene Störungen, die die Vorgänge der Zellproliferation, der Zellwachstums, der Zelldifferenzierung oder der Zellmigration beeinflussen. Wie hierin verwendet, ist ein „Zellenproliferations-, Zellenwachstums-, Zellendifferenzierungs- oder Zellenmigrationsprozess" ein Prozess, in dem eine Zelle in ihrer Anzahl, ihrer Größe oder ihrem Inhalt zunimmt, in dem eine Zelle eine Reihe spezialisierter Charakteristika entwickelt, die sich von jenen anderer Zellen unterscheiden, oder in dem eine Zelle sich näher an einen bestimmen Ort oder Stimulus bewegt oder sich weiter von diesem entfernt. Die TWIK-8-Moleküle der vorliegenden Erfindung sind in Signalübertragungsmechanismen involviert, die bekannterweise in Zellwachstums-, Zelldifferenzierungs- und Zellmigrationsprozesse involviert sind. Daher können die TWIK-8-Moleküle Zellwachstum, Zelldifferenzierung oder Zellmigration modulieren und eine Rolle bei Störungen spielen, die durch anormal gesteuertes) Wachstum, Differenzierung oder Migration charakterisiert sind. Solche Störungen umfassen Krebs, z.B. Karzinome, Sarkome oder Leukämie; Tumor-Angiogenese und Metastase; skeletale Dysplasie; neuronale Defizienzen, die das Ergebnis gestörter neuraler Induktion und Mustererkennung sind; sowie blutbildende und/oder myeloproliferative Störungen.
TWIK-8-assoziierte oder -verwandte Störungen umfassen ebenso Störungen in Geweben, in denen das TWIK-8-Protein exprimiert wird, z.B. Cortex, Hypothalamus und dorsale Wurzelganglien.
Wie hierin verwendet umfasst eine „kaliumkanalvermittelte Aktivität" eine Aktivität, die einen Kaliumkanal involviert, z.B. einen Kaliumkanal in einer neuronalen Zelle oder einer Muskelzelle (z.B. eine Herzmuskelzelle), der mit dem Erhalt, der Leitung und Übertragung von Signalen z.B. in das Nervensystem assoziiert ist. Kaliumkanalvermittelte Aktivitäten umfassen die Freisetzung von Neurotransmittern, z.B. Dopamin oder Norepinephrin, aus Zellen, z.B. neuronalen Zellen; die Modulation des Ruhepotentials vom Membranen, Wellenformen und Frequenzen von Aktionspotentialen und Reizschwellen; sowie die Modulation von Prozessen, wie z.B. die Integration synaptischer Antworten, die unter dem Schwellenwert liegen, das Leitvermögen backpropagierender Aktionspotentiale z.B. in neuronalen Zellen oder in Muskelzellen, die Beteiligung an Signalübertragungswegen sowie die Beteiligung an der Nozizeption.
Mit dem Begriff „Familie" werden in Bezug auf die Protein- und Nucleinsäuremoleküle der Erfindung zwei oder mehr Proteine oder Nucleinsäuremoleküle gemeint, die eine) gemeinsames) strukturelles) Domäne oder Motiv besitzen und, wie hierin definiert, eine ausreichende Aminosäure- oder Nucleotidsequenzhomologie aufweisen. Solche Familienmitglieder können natürlich oder nicht natürlich vorkommen und können sowohl aus derselben oder verschiedenen Spezies stammen. Eine Familie kann z.B. ein erstes Protein menschlichen Ursprungs enthalten sowie andere, unterschiedliche Proteine menschlichen Ursprungs oder, alternativ dazu, kann sie Homologe nicht menschlichen Ursprungs, z.B. Affenproteine, enthalten. Die Mitglieder einer Familie können ebenso gemeinsame funktionelle Charakteristika aufweisen. Diese Mitglieder einer Familie stellen keinen Teil dieser Erfindung dar, es sei denn, sie fallen in den Umfang der Ansprüche.
Die Familie der TWIK-8-Proteine umfasst z.B. zumindest eine „Transmembrandomäne" und vorzugsweise sechs Transmembrandomänen. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Transmembrandomäne" eine Aminosäuresequenz mit einer Länge von etwa 15 Aminosäureresten, die die Plasmamembran durchdringt. Noch bevorzugter umfasst eine Transmembrandomäne zumindest etwa 20, 25, 30, 35, 40 oder 45 Aminosäurereste und durchdringt die Plasmamembran. Transmembrandomänen sind reich an hydrophoben Resten und besitzen typischerweise eine α-Helixstruktur. In einer bevorzugten Ausführungsform sind zumindest 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % oder mehr der Aminosäuren einer Transmembrandomäne hydrophob, z.B. Leucine, Isoleucine, Tyrosine oder Tryptophane. Transmembrandomänen werden z.B. in W.N. Zagotta et al., Annual Rev. Neurosci. 19, 235-263 (1996), beschrieben, wobei der Inhalt desselben hierin mittels Verweis aufgenommen ist. Von den Aminosäureresten 32-50, 116-137, 144-165, 195-219, 226-242 und 260-283 des nativen TWIK-8-Proteins und den Aminosäureresten 70-91, 98-119, 149-173, 180-196 und 214-237 des reifen TWIK-8-Proteins wird prognostiziert, dass sie Transmembrandomänen umfassen (siehe 3).
In einer anderen Ausführungsform wird ein TWIK-8-Molekül basierend auf der Gegenwart einer Poren-Schleife (P-Schleife) identifiziert. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Poren-Schleife" oder „P-Schleife" eine Aminosäuresequenz von etwa 15-45 Aminosäureresten in der Länge, vorzugsweise etwa 15-35 Aminosäureresten in der Länge und noch bevorzugter etwa 15-25 Aminosäureresten in der Länge, die in die Auskleidung der Kaliumkanalpore involviert ist. Eine P-Schleife ist typischerweise zwischen Transmembrandomänen von Kaliumkanälen zu finden, und es wird angenommen, dass sie eine Hauptdeterminante der Ionenselektivität in Kaliumkanälen ist. Vorzugsweise enthalten P-Schleifen eine G-[HYDROPHOBE AMINOSÄURE]-G-Sequenz, z.B. eine GYG-, GLG- oder GFG-Sequenz. P-Schleifen werden z.B. in Warmke et al., Science 252, 1560-1562 (1991); W.N. Zagotta et al., Annual Rev. Neurosci. 19, 235-263 (1996); O. Pongs, J. Membr. Biol. 136, 1-8 (1993); Heginbotham et al., Biophys. J. 66, 1061-1067 (1994); R. Mackinnon, Neuron 14, 889-892 (1995); Pascual et al., Neuron 14, 1055-1063 (1995), beschrieben. Die Aminosäurereste 243-259 des nativen menschlichen TWIK-8-Proteins und die Reste 197-213 des prognostizierten reifen menschlichen TWIK-8-Proteins umfassen eine P-Schleife.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die TWIK-8-Moleküle zumindest eine und vorzugsweise sechs Transmembrandomänen und zumindest eine P-Schleifen-Domäne.
In einer weiteren Ausführungsform wird ein TWIK-8-Molekül basierend auf der Gegenwart einer „Sieben-Transmembranrezeptordomäne" im Protein oder dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert. Sieben-Transmembranrezeptordomänen werden z.B. in Hamann et al., Genomics 32, 144-147 (1996), beschrieben. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Sieben-Transmembranrezeptordomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 150-320 Aminosäureresten. Eine Sieben-Transmembranrezeptordomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 200-250 oder noch bevorzugter etwa 220 Aminosäurereste. Um die Gegenwart einer Sieben-Transmembranrezeptordomäne in einem TWIK-8-Protein zu identifizieren und um die Bestimmung, dass ein Protein von Interesse ein bestimmtes Profil aufweist, durchzuführen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die HMM-Datenbank) durchsucht. Der Sieben-Transmembranrezeptordomäne (HMM) wurde der PFAM-Zugriffscode PF00002 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html) zugewiesen. Es wurde eine Suche gegen die HMM-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer Sieben-Transmembranrezeptordomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 25-244 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 4 dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne" im Protein oder in dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Zyklische nucleotidgesteuerte Kanaldomänen werden z.B. in Yau, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 3481-3483 (1994), beschrieben. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „zyklische nucleotidgesteuerte Kanaldomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 100-225 Aminosäureresten. Vorzugsweise umfasst eine zyklische nucleotidgesteuerte Kanaldomäne zumindest etwa 150-200 oder noch bevorzugter etwa 178 Aminosäurereste. Um die Gegenwart einer zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne in einem TWIK-8-Protein zu i dentifizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die HMM-Datenbank) abgesucht. Der zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne (HMM) wurde der PFAM-Zugriffscode PF00914 (http://genome.wustl.edu/Pfam/html) zugewiesen. Es wurde eine Suche gegen die HMM-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 27-204 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 4 dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „TRAAK-Kaliumkanaldomäne" im Protein oder in dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „TRAAK-Kaliumkanaldomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 20-150 Aminosäureresten und mit einem Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die TRAAK-Kaliumkanaldomäne von zumindest 115-175. Eine TRAAK-Kaliumkanaldomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 23-100 oder noch bevorzugter etwa 25, 55 oder 95 Aminosäurereste und besitzt einen Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die TRAAK-Kaliumkanaldomäne von zumindest 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 oder höher. Der TRAAK-Kaliumkanaldomäne wurden die ProDom-Einträge 73512, 98483 und 105542 zugeordnet. Um die Gegenwart einer TRAAK-Kaliumkanaldomäne in einem TWIK-8-Protein zu identifizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung der Vorgabeparameter (erhältlich auf http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die ProDom-Datenbank) abgesucht. Es wurde eine Suche gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer TRAAK-Kaliumkanaldomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 50-104, 175-199 und 288-382 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in den 5A, 5B und 5D dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „Kaliumkanalproteindomäne" im Protein oder dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Kaliumkanalproteindomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 20-100 Aminosäureresten und mit einem Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die Kaliumkanalproteindomäne von zumindest 101. Eine Kaliumkanalproteindomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 40-75 oder noch bevorzugter etwa 55 Aminosäurereste und besitzt einen Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die Kaliumkanalproteindomäne von zumindest 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 oder höher. Der Kaliumkanalproteindomäne wurde der ProDom-Eintrag 129403 zugeordnet. Um die Gegenwart einer Kaliumkanalproteindomäne in einem TWIK-8-Protein zu identifizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung der Vorgabeparameter (erhältlich auf http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die ProDom-Datenbank) abgesucht. Es wurde eine Suche gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer Kaliumkanalproteindomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 99-153 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 5F dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne" im Protein oder in dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „spannungsgesteuerte Kaliumkanaldomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 20-100 Aminosäureresten und mit einem Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die Kaliumkanalproteindomäne von zumindest 115. Eine spannungsgesteuerte Kaliumkanaldomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 40-75 oder noch bevorzugter etwa 55 Aminosäurereste und besitzt einen Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die spannungsgesteuerte Kaliumkanaldomäne von zumindest 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110 oder höher. Der spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne wurde der ProDom-Eintrag 36 zugeordnet. Um die Gegenwart einer spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne in einem TWIK-8-Protein zu identi fizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung der Vorgabeparameter (erhältlich auf http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die ProDom-Datenbank) abgesucht. Es wurde eine Suche gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 102-168 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 5E dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne" im Protein oder in dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „nach außen gerichtete Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 25-100 Aminosäureresten und mit einem Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die nach außen gerichtete Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne von zumindest 70. Eine nach außen gerichtete Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 40-75 oder noch bevorzugter etwa 56 Aminosäurereste und besitzt einen Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die nach außen gerichtete Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne von zumindest 20, 30, 40, 50, 60 oder höher. Der nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne wurde der ProDom-Eintrag 32818 zugeordnet. Um die Gegenwart einer nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne in einem TWIK-8-Protein zu identifizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung der Vorgabeparameter (erhältlich auf http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die ProDom-Datenbank) abgesucht. Es wurde eine Suche gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 215-270 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 5G dargelegt.
Ein TWIK-8-Molekül kann basierend auf der Gegenwart einer „Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne" im Protein oder in dem entsprechenden Nucleinsäuremolekül identifiziert werden. Wie hierin verwendet umfasst der Begriff „Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne" eine Proteindomäne mit einer Aminosäuresequenz von etwa 25-125 Aminosäureresten und mit einem Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne von zumindest 156. Eine Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne umfasst vorzugsweise zumindest etwa 40-100 oder noch bevorzugter etwa 72 Aminosäurereste und besitzt einen Bit-Score für die Anordnung der Sequenz an die Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne von zumindest 20, 30, 40, 50, 60 oder höher. Der Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne wurde der ProDom-Eintrag 1641 zugeordnet. Um die Gegenwart einer Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne in einem TWIK-8-Protein zu identifizieren und um die Bestimmung eines bestimmten Profils eines Proteins von Interesse zu ermöglichen, wird die Aminosäuresequenz des Proteins unter Verwendung der Vorgabeparameter (erhältlich auf http://www.toulouse.inra.fr/prodom.html) gegen eine Datenbank bekannter Proteindomänen (z.B. die ProDom-Datenbank) abgesucht. Es wurde eine Suche gegen die ProDom-Datenbank durchgeführt, die zu der Identifikation einer Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 216-287 der Seq.-ID Nr. 2 führte. Die Resultate der Suche werden in 5C dargelegt.
Isolierte Proteine der vorliegenden Erfindung, wie sie in den Ansprüchen definiert sind, besitzen eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von zumindest 95 % im Vergleich zu der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder werden von einer Nucleotidsequenz kodiert, die zumindest 95 % Identität im Vergleich zu Seq.-ID Nr. 1 oder 3 aufweisen.
Wie hierin austauschbar verwendet bezieht sich eine „TWIK-8-Aktivität", „biologische Aktivität von TWIK-8" oder „funktionelle Aktivität von TWIK-8" auf eine Aktivität, die von einem TWIK-8-Protein-, -Polypeptid- oder -Nucleinsäuremolekül auf eine) TWIK-8-reaktives) Zelle oder Gewebe ausgeübt wird oder auf ein TWIK-8-Proteinsubstrat, wie es in vivo oder in vitro gemäß Standardverfahren bestimmt wird. In einer Ausfüh rungsform ist eine TWIK-8-Aktivität eine direkte Aktivität, wie z.B. eine Assoziation mit einem TWIK-8-Zielmolekül. Wie hierin verwendet, ist ein „Zielmolekül" oder „Bindungspartner" ein Molekül, an das ein TWIK-8-Protein in der Natur bindet oder mit dem es wechselwirkt, sodass eine TWIK-8-vermittelte Funktion erreicht wird. Ein TWIK-8-Zielmolekül kann ein nicht-TWIK-8-Molekül oder ein TWIK-8-Protein oder -Polypeptid der vorliegenden Erfindung sein. In einer beispielhaften Ausführungsform ist ein TWIK-8-Zielmolekül ein TWIK-8-Ligand, z.B. eine porenbildende Kaliumkanal-Untereinheit oder ein Kaliumkanalligand. Alternativ dazu ist eine TWIK-8-Aktivität eine indirekte Aktivität, wie z.B. eine zelluläre Signalaktivität, die durch die Wechselwirkung des TWIK-8-Proteins mit einem TWIK-8-Liganden vermittelt wird. Hierin werden die biologischen Aktivitäten von TWIK-8 beschrieben. Die TWIK-8-Proteine der vorliegenden Erfindung können z.B. eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten aufweisen: (1) Wechselwirkung mit einem nicht-TWIK-Proteinmolekül; (2) Aktivierung eines TWIK-abhängigen Signalübertragungswegs; (3) Modulierung der Freisetzung von Neurotransmittern; (4) Modulierung der Membran-Reizbarkeit; (5) Beeinflussung des Ruhepotentials von Membranen, Wellenformen und Frequenzen von Aktionspotentialen und Reizbarkeits-Schwellenwerten; (6) Modulierung von Prozessen, die dem Lernen und dem Gedächtnis zugrunde liegen, wie z.B. die Integration synaptischer Antworten, die unter dem Schwellenwert liegen, und das Leitvermögen backpropagierender Aktionspotentiale, sowie (7) die Vermittlung der Nozizeption.
Die Nucleotidsequenz der isolierten menschlichen TWIK-8-cDNA und die prognostizierte Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8-Polypeptids werden in 1 und in den Seq.-ID Nr. 1 bzw. 2 gezeigt.
Das menschliche TWIK-8-Gen, das etwa 1408 Nucleotide in der Länge umfasst, kodiert für ein Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 46,1 kD, das etwa 419 Aminosäurereste in der Länge umfasst.
In den folgenden Unterkapiteln werden verschieden Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
I. Isolierte Nucleinsäuremoleküle
Ein Aspekt der Offenbarung betrifft isolierte Nucleinsäuremoleküle, die für TWIK-8-Proteine oder biologisch aktive Teile davon kodieren, sowie Nucleinsäurefragmente, die für eine Verwendung als Hybridisierungssonden ausreichen, um für TWIK-8-kodierende Nucleinsäuremoleküle (z.B. TWIK-8-mRNA) zu identifizieren, sowie Fragmente zur Verwendung als PCR-Primer zur Amplifikation oder Mutation von TWIK-8-Nucleinsäuremolekülen. Wie hierin verwendet soll der Begriff „Nucleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) sowie Analoga der DNA oder RNA umfassen, die unter Verwendung von Nucleotidanaloga hergestellt wurden. Das Nucleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist vorzugsweise jedoch doppelsträngige DNA.
Der Begriff „isoliertes Nucleinsäuremolekül" umfasst Nucleinsäuremoleküle, die von anderen Nucleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle der Nucleinsäure vorhanden sind, getrennt sind. Im Hinblick auf genomische DNA z.B. umfasst der Begriff „isoliert" Nucleinsäuremoleküle, die vom Chromosom, mit dem die genomische DNA natürlich assoziiert ist, getrennt sind. Eine „isolierte" Nucleinsäure ist vorzugsweise frei von Sequenzen, die natürlicherweise die Nucleinsäure in der genomischen DNA des Organismus flankieren (d.h. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nucleinsäure befinden), von dem die Nucleinsäure abstammt. In verschiedenen Ausführungsformen kann das isolierte TWIK-8-Nucleinsäuremolekül z.B. weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nucleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nucleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle flankieren, von der die Nucleinsäure abstammt. Weiters kann ein „isoliertes" Nucleinsäuremolekül, wie z.B. ein cDNA-Molekül, im Wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es mittels Rekombinationsverfahren hergestellt wird, oder es kann bei chemischem Synthetisieren im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien sein.
Ein Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, d.h. ein Nucleinsäuremolekül mit der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 oder 95 % Identität mit dieser, kann unter Verwendung von molekularbiologischen Standardverfahren sowie der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Unter Verwendung der ganzen oder eines Teils der Nucleinsäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 als Hybridisierungssonde können TWIK-8-Nucleinsäuremoleküle unter Verwendung von Standard-Hybridisierungs- und -Klonierungsverfahren isoliert werden (z.B. wie in J. Sambrook, E.F. Fritsh und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), beschrieben).
Weiters kann ein Nucleinsäuremolekül, das die gesamte oder einen Teil der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst, mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung synthetischer Oligonucleotidprimer isoliert werden, die auf der Sequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 basieren.
Eine Nucleinsäure der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA, mRNA oder, alternativ dazu, genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonucleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifikationsverfahren amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nucleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiters können unter Verwendung von Standard-Syntheseverfahren, z.B. mittels eines automatisierten DNA-Synthesegeräts, Oligonucleotide hergestellt werden, die TWIK-8-Nucleotidsequenzen entsprechen.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung die in Seq.-ID Nr. 1 dargestellte Nucleotidsequenz. Die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 entspricht der menschlichen TWIK-8-cDNA. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die für das menschliche TWIK-8-Protein kodieren (d.h. „die kodierende Region" von den Nucleotiden 84-1343), sowie 5'-untranslatierte Sequenzen (Nucleotide 1-83) und 3'-untranslatierte Sequenzen (Nucleotide 1344-1408). Alternativ dazu kann das Nucleinsäuremolekül nur die kodierende Region der Seq.-ID Nr. 1 umfassen (z.B. Nucleotide 84-1343, entsprechend Seq.-ID Nr. 3).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung ein Nucleinsäuremolekül, das ein Komplement der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz ist. Ein Nucleinsäuremolekül, das zu der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz komplementär ist, ist eines, das in ausreichendem Maß zu der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz komplementär ist, sodass es an die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellte Nucleotidsequenz hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex gebildet wird.
In noch einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung eine Nucleotidsequenz, die zumindest 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr Identität mit der gesamten Länge der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 dargestellten Nucleotidsequenz aufweist.
Die durch das Klonieren des TWIK-8-Gens bestimmte Nucleotidsequenz ermöglicht die Herstellung von Sonden und Primern, die zur Verwendung in der Identifikation und/oder Klonierung anderer Mitglieder der TWIK-8-Familie sowie von TWIK-8-Homologen anderer Spezies gedacht sind. Die/der Sonde/Primer umfasst typischerweise im Wesentlichen gereinigtes Oligonucleotid. Das Oligonucleotid umfasst typischerweise eine Region einer Nucleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an zumindest etwa 12 oder 15, vorzugsweise etwa 20 oder 25, noch bevorzugter etwa 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150 oder 200 oder mehr aufeinander folgende Nucleotide einer Sense-Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3, einer Antisense-Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 oder einer natürlich vorkommenden Allelvariante oder eines Mutanten von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hybridisiert.
Auf den TWIK-8-Nucleotidsequenzen basierende Sonden können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen zu detektieren, die für dieselben oder homologe Proteine kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde weiters eine daran gebundene Markierungsgruppe, z.B. kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein. Solche Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Sets zur Identifikation von Zellen oder Gewebe verwendet werden, die ein TWIK-8-Protein feh lexprimieren, z.B. durch Messen eines Ausmaßes einer für TWIK-8 kodierenden Nucleinsäure in einer Probe von Zellen eines Individuums, z.B. das Messen der TWIK-8-mRNA-Mengen oder das Bestimmen, ob ein genomisches TWIK-8-Gen mutiert oder deletiert wurde.
Ein für einen „biologisch aktiven Teil eines TWIK-8-Proteins" kodierendes Nucleinsäurefragment kann durch Isolieren eines Teils der Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3, der für ein Polypeptid kodiert, das eine biologische Aktivität von TWIK-8 aufweist (die biologischen Aktivitäten der TWIK-8-Proteine werden hierin beschrieben), Exprimieren des kodierten Teils des TWIK-8-Proteins (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Beurteilen der Aktivität des kodierten Teils des TWIK-8-Proteins hergestellt werden.
Weiters umfasst die Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die sich von der in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten Nucleotidsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher für dieselben TWIK-8-Proteine kodieren wie jene, für die die in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigte Nucleotidsequenz kodiert. In einer weiteren Ausführungsform besitzt ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, das eine in Seq.-ID Nr. 2 dargestellte Aminosäuresequenz aufweist.
Zusätzlich zu den in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 gezeigten TWIK-8-Nucleotidsequenzen wird der Fachmann anerkennen, dass DNA-Sequenzpolymorphismen, die zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen der TWIK-8-Proteine führen, innerhalb einer Population (z.B. der menschlichen Bevölkerung) existieren können. Dieser genetische Polymorphismus in den TWIK-8-Genen kann unter Individuen innerhalb einer Bevölkerung aufgrund von natürlicher Allelvariation existieren. Wie hierin verwendet bezeichnen die Begriffe „Gen" und „rekombinantes Gen" Nucleinsäuremoleküle, die einen offenen Leseraster umfassen, der für ein TWIK-8-Protein, vorzugsweise ein Säugetier-TWIK-8-Protein, kodiert, und können weiters nicht kodierende Regulationssequenzen und Introns umfassen.
Allelvarianten des menschlichen TWIK-8 umfassen sowohl funktionelle als auch nicht funktionelle TWIK-8-Proteine. Funktionelle Allelvarianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des menschlichen TWIK-8-Proteins, die die Fähigkeit beibehalten, einen TWIK-8-Liganden zu binden und/oder Schmerzsignalisierungsmechanismen, die Membranreizbarkeit oder die Freisetzung von Neurotransmittern zu modulieren. Funktionelle Allelvarianten enthalten typischerweise nur eine konservative Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren aus Seq.-ID Nr. 2 oder eine Substitution, Deletion oder Insertion nicht kritischer Reste in nicht kritischen Regionen des Proteins.
Nicht funktionelle Allelvarianten sind natürlich vorkommende Aminosäuresequenzvarianten des menschlichen TWIK-8-Proteins, die nicht die Fähigkeit besitzen, einen TWIK-8-Liganden zu binden und/oder eine beliebige der hierin beschriebenen TWIK-8-Aktivitäten zu modulieren. Nicht funktionelle Allelvarianten enthalten typischerweise eine nicht konservative Substitution, eine Deletion oder Insertion oder eine vorzeitige Trunkierung der Aminosäuresequenz aus Seq.-ID Nr. 2 oder eine Substitution, Insertion oder Deletion an kritischen Resten oder kritischen Regionen.
Nucleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten und Homologen der TWIK-8-cDNAs der Erfindung entsprechen, können basierend auf ihrer Homologie zu den hierin offenbarten TWIK-8-Nucleinsäuren unter Verwendung der hierin offenbarten cDNAs oder eines Teils davon als Hybridisierungssonde gemäß Standardhybridisierungsverfahren unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. Nucleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten und Homologen der TWIK-8-cDNAs der Erfindung entsprechen, können weiters durch Kartierung gegen dasselbe Chromosom oder denselben Locus wie das TWIK-8-Gen isoliert werden.
Dementsprechend hybridisiert in einer anderen Ausführungsform ein isoliertes Nucleinsäuremolekül der Erfindung unter stringenten Bedingungen an das Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfasst. Wie hierin verwendet, soll der Ausdruck „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen zur Hybridisierung und zum Waschen beschreiben, unter denen Nucleotidse quenzen, die signifikant identisch oder homolog zueinander sind, aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass Sequenzen, die zumindest etwa 70 %, noch bevorzugter zumindest etwa 80 %, noch bevorzugter zumindest etwa 85 % oder 90 %, Identität zueinander aufweisen, aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und sind in Current Protocols in Molecular Biology, Abschnitte 2, 4 und 6, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons, Inc. (1995), zu finden. Zusätzliche stringente Bedingungen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Kapitel 7, 9 und 11, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), zu finden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen umfasst die Hybridisierung in 4X-Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 65-70 °C (oder Hybridisierung in 4X SSC plus 50 % Formamid bei etwa 42-50 °C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 1X SSC bei etwa 65-70 °C. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel hochgradig stringenter Hybridisierungsbedingungen umfasst die Hybridisierung in 1X SSC bei etwa 65-70 °C (oder Hybridisierung in 1X SSC plus 50 % Formamid bei etwa 42-50 °C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,3X SSC bei etwa 65-70 °C. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel für Hybridisierungsbedingungen reduzierter Stringenz umfasst die Hybridisierung in 4X SSC bei etwa 50-60 °C (oder alternativ dazu die Hybridisierung in 6X SSC plus 50 % Formamid bei etwa 40-45 °C), gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 2X SSC bei etwa 50-60 °C. Werte in einer Bandbreite, die zwischen den oben genannten Werten liegt, z.B. bei 65-70 °C oder bei 42-50 °C, sollen von der vorliegenden Erfindung ebenso umfasst sein. SSPE (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl, 10 mM NaH₂PO₄ und 1,25 mM EDTA, pH 7,4) kann als Ersatz für SSC (1 × SSPE ist 0,15 M NaCl und 15 mM Natriumcitrat) in der Hybridisierung und den Waschpuffern verwendet werden; Waschschritte werden je 15 Minuten lang durchgeführt, nachdem die Hybridisierung vollendet wurde. Die Hybridisierungstemperatur für Hybride, von denen erwartet wird, dass sie weniger als 50 Basenpaare lang sind, sollte 5-10 °C weniger betragen als die Schmelztemperatur (T_m) des Hybrids, wobei T_m gemäß folgender Gleichungen bestimmt wird. Für Hybride, die weniger als 18 Basenpaare lang sind, beträgt T_m (°C) = 2 (Anzahl der A- + T-Basen) + 4 (Anzahl der G + C-Basen). Für Hybride, die zwischen 18 und 49 Basenpaare lang sind, beträgt T_m (°C) = 81,5 + 16,6 (log₁₀[Na⁺]) + 0,41 (%G + C) – (600/N), wobei N die Anzahl der Basen im Hybrid ist und [Na⁺] die Konzentration an Natriumionen im Hybridisierungspuffer ist ([Na⁺] für 1 × SSC = 0,165 M). Es ist für den erfahrenen Fachmann ebenso klar ersichtlich, dass zusätzliche Reagenzien zu der Hybridisierung und/oder den Waschpuffern hinzugefügt werden können, um die nicht spezifische Hybridisierung von Nucleinsäuremolekülen an Membranen, z.B. Nitrozellulose- oder Nylonmembranen, unter anderem, jedoch nicht eingeschränkt auf, Blocker-Agenzien (z.B. BSA- oder Lachs- oder Hering-Spermienträger-DNA), Detergenzien (z.B. SDS), Chelatbildner (z.B. EDTA), Ficoll, PVP und dergleichen, zu verringern. Insbesondere bei der Verwendung von Nylonmembranen ist ein zusätzliches, bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel stringenter Hybridisierungsbedingungen die Hybridisierung in 0,25-0,5 M NaH₂PO₄, 7 % SDS bei etwa 65 °C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten bei 0,02 M NaH₂PO₄, 1 % SDS bei etwa 65 °C, siehe z.B. Church und Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 1991-1995 (1984) (oder alternativ dazu 0,2X SSC, 1 % SDS).
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül hybridisiert vorzugsweise unter stringenten Bedingungen an die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 und entspricht einem natürlich vorkommenden Nucleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet bezieht sich ein „natürlich vorkommendes" Nucleinsäuremolekül auf ein RNA- oder ein DNA-Molekül mit einer Nucleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z.B. für ein natürliches Protein kodiert).
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Allelvarianten der TWIK-8-Sequenzen, die in der Bevölkerung existieren können, wird der Fachmann weiters die Tatsache zu schätzen wissen, dass Veränderungen mittels Mutation in die Nucleotidsequenzen von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 eingeführt werden können, was zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz der kodierten TWIK-8-Proteine führt, ohne dass dabei die funktionelle Fähigkeit der TWIK-8-Proteine verändert wird. Nucleotidsequenzen, die z.B. zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht essentiellen" Aminosäureresten führen, kön nen in der Sequenz aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hergestellt werden. Ein „nicht essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtyp-Sequenz von TWIK-8 verändert werden kann (z.B. die Sequenz aus Seq.-ID Nr. 2), ohne die biologische Aktivität zu verändern, wohingegen ein „essentieller" Aminosäurerest für die biologische Aktivität erforderlich ist. Von Aminosäureresten, die unter den TWIK-8-Proteinen der vorliegenden Erfindung konserviert sind, z.B. jenen, die in einer Transmembrandomäne vorhanden sind, wird z.B. prognostiziert, sie wären besonders unzugänglich bezüglich Veränderungen. Weiters sind zusätzliche Aminosäurereste, die zwischen den TWIK-8-Proteinen der vorliegenden Erfindung und anderen Mitgliedern der TWIK-Familie konserviert sind, wahrscheinlich nicht für Veränderungen zugänglich.
Dementsprechend betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung Nucleinsäuremoleküle, die für TWIK-8-Proteine kodieren, die Veränderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die Aktivität nicht essentiell sind. Diese TWIK-8-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von Seq.-ID Nr. 2, halten jedoch ihre biologische Aktivität bei. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nucleinsäuremolekül eine Nucleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit einer Identität von zumindest 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr zu Seq.-ID Nr. 2 aufweist.
Ein isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein TWIK-8-Protein kodiert, das mit dem Protein aus Seq.-ID Nr. 2 identisch ist, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nucleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in die Nucleotidsequenz von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 hergestellt werden, sodass eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in Seq.-ID Nr. 1 oder 3 mittels Standardverfahren, wie z.B. ortsspezifische Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingeführt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren prognostizierten, nicht essentiellen Aminosäurerest(en) durchgeführt. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in der der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird. Familien an Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten wurden nach dem Stand der Technik definiert. Diese Familien um fassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht polaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), β-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Ein prognostizierter nicht essentieller Aminosäurerest in einem TWIK-8-Protein wird daher vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ dazu können in einer anderen Ausführungsform Mutationen nach dem Zufallsprinzip entlang der gesamten oder eines Teils der für TWIK-8 kodierenden Sequenz eingeführt werden, wie z.B. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf biologische TWIK-8-Aktivität gescreent werden, um Mutanten zu identifizieren, die die Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von Seq.-ID Nr. 1 oder 3 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Mutanten-TWIK-8-Protein auf die Fähigkeit getestet werden, (1) mit einem nicht-TWIK-Proteinmolekül wechselzuwirken; (2) einen TWIK-abhängigen Signalübertragungsweg zu aktivieren; (3) die Freisetzung von Neurotransmittern zu modulieren; (4) die Membranreizbarkeit zu modulieren; (5) das Ruhepotential von Membranen, die Wellenformen und Frequenzen von Aktionspotentialen und Schwellenwerte für die Reizbarkeit zu beeinflussen; (6) Prozesse zu modulieren, die dem Lernen und dem Gedächtnis zugrunde liegen, wie z.B. die Integration synaptischer Antworten, die unter dem Schwellenwert liegen, und das Leitvermögen backpropagierender Aktionspotentiale, sowie (7) die Nozizeption zu vermitteln.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen, für TWIK-8-Proteine kodierenden Nucleinsäuremolekülen betrifft ein anderer Aspekt der Erfindung isolierte Nucleinsäuremoleküle, die eine Antisense-Ausrichtung zu diesen aufweisen. Eine „Antisense"-Nucleinsäure umfasst eine Nucleotidsequenz, die zu einer „Sense"-Nucleinsäure komplementär ist, die für ein Protein kodiert, z.B. komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Dementsprechend kann eine Antisense-Nucleinsäure eine Wasserstoffbrückenbindung zu einer Sense-Nucleinsäure bilden. Die Antisense-Nucleinsäure kann zu einem gesamten für TWIK-8 kodierenden Strang oder nur einem Teil desselben komplementär sein. In einer Ausführungsform besitzt ein Antisense-Nucleinsäuremolekül eine Antisense-Ausrichtung zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nucleotidsequenz, die für TWIK-8 kodiert. Der Begriff „kodierende Region" bezieht sich auf die Region der Nucleotidsequenz, umfassend Codons, die in Aminosäurereste translatiert werden (z.B. die kodierende Region des menschlichen TWIK-8 entspricht Seq.-ID Nr. 3). In einer anderen Ausführungsform besitzt das Antisense-Nucleinsäuremolekül eine Antisense-Ausrichtung zu einer „nicht kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nucleotidsequenz, die für TWIK-8 kodiert. Der Begriff „nicht kodierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet).
In Anbetracht der hierin offenbarten, für TWIK-8 kodierenden Sequenzen des kodierenden Strangs (z.B. Seq.-ID Nr. 3) können Antisense-Nucleinsäuren der Erfindung gemäß den Basenpaarungs-Regeln von Watson und Crick kreiert werden. Das Antisense-Nucleinsäuremolekül kann komplementär zu der gesamten kodierenden Region der TWIK-8-mRNA sein, ist jedoch vorzugsweise ein Oligonucleotid, das eine Antisense-Ausrichtung zu nur einem Teil der kodierenden oder nicht kodierenden Region der TWIK-8-mRNA aufweist. Das Antisense-Oligonucleotid kann z.B. komplementär zu der Region sein, die die Translationsinitiationsstelle der TWIK-8-mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonucleotid kann z.B. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nucleotide lang sein. Diese Fragmente sind nicht Teil der Erfindung. Eine Antisense-Nucleinsäure kann unter Verwendung von chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen mittels Verfahren konstruiert werden, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind. Eine Antisense-Nucleinsäure (z.B. ein Antisense-Oligonucleotid) kann z.B. chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung natürlich vorkommender Nucleotide oder verschieden modifizierter Nucleotide, die kreiert wurden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder um die physikali sche Stabilität des Duplexes zu steigern, der sich zwischen den Antisense- und den Sense-Nucleinsäuren gebildet hat, z.B. können Thiophosphat-Derivate und Acridinsubstituierte Nucleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nucleotide, die verwendet werden können, um die Antisense-Nucleinsäure herzustellen, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, β-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-Thiouracil, β-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Alternativ dazu kann die Antisense-Nucleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors hergestellt werden, in den eine Nucleinsäure in einer Antisense-Ausrichtung subkloniert wurde (d.h. von der insertierten Nucleinsäure transkribierte RNA besitzt eine Antisense-Ausrichtung zu einer Ziel-Nucleinsäure von Interesse, im folgenden Unterabschnitt weiter beschrieben).
Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle werden typischerweise einem Individuum verabreicht oder in situ erzeugt, sodass sie mit zellulärer mRNA und/oder mit genomischer DNA hybridisieren oder an diese binden, die für ein TWIK-8-Protein kodiert, um dadurch die Expression des Proteins zu inhibieren, z.B. durch Inhibieren der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nucleotidkomplementarität erfolgen, um einen stabilen Duplex zu bilden, oder, z.B. im Fall eines Antisense-Nucleinsäuremoleküls, das an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der Hauptfurche der Doppelhelix. Ein Beispiel für einen Verabreichungsweg von Antisense-Nucleinsäuremolekülen der Erfindung umfasst die direkte Injektion an einer Gewebestelle. Alternativ dazu können die Anti sense-Nucleinsäuremoleküle modifiziert werden, um auf ausgewählte Zellen abzuzielen, und anschließend systemisch verabreicht werden. Zur systemischen Verabreichung z.B. können die Antisense-Moleküle modifiziert werden, sodass sie spezifisch an Rezeptoren oder Antigene binden, die auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, z.B. durch Binden der Antisense-Nucleinsäuremoleküle an Peptide oder Antikörper, die an Zelloberflächenrezeptoren oder Antigene binden. Die Antisense-Nucleinsäuremoleküle können unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren ebenso an Zellen geliefert werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen der Antisense-Moleküle zu erreichen, werden Vektorkonstrukte bevorzugt, in denen das Antisense-Nucleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken pol-II- oder pol-III-Promotors platziert wird.
In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nucleinsäuremolekül ein α-anomeres Nucleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nucleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, in der, im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., Nucleic Acids Res 15, 6625-6641 (1987)). Das Antisense-Nucleinsäuremolekül kann ebenso ein 2'-o-Methylribonucleotid (Inoue et al., Nucleic Acids Res. 15, 6131-6148 (1987)) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon umfassen (Inoue et al., FEBS Lett. 215, 327-330 (1987)).
In noch einer weiteren Ausführungsform ist eine Antisense-Nucleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuclease-Aktivität, die fähig sind, eine einzelsträngige Nucleinsäure, wie z.B. eine mRNA, zu spalten, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen. Ribozyme (z.B. Hammerkopf-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach, Nature 334, 585-591 (1988))) können daher verwendet werden, um TWIK-8-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um dadurch die Translation von TWIK-8-mRNA zu inhibieren. Ein Ribozym mit der Spezifität für eine für eine TWIK-8 kodierende Nucleinsäure kann basierend auf der Nucleotidsequenz einer hierin offenbarten TWIK-8-cDNA kreiert werden (d.h. Seq.-ID Nr. 1 oder 3). Ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA kann z.B. konstruiert werden, in dem die Nucleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nucleotidsequenz ist, die in einer für TWIK-8 kodierenden mRNA zu spalten ist. Siehe z.B. Cech et al., US-Patent Nr. 4.987.071, und Cech et al., US-Patent Nr. 5.116.742. Alternativ dazu kann TWIK-8-mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuclease-Aktivität aus einem Pool an RNA-Molekülen auszuwählen. Siehe z.B. D. Bartel und J.W. Szostak, Science 261, 1411-1418 (1993).
Alternativ dazu können die Expressionscharakteristika eines endogenen TWIK-8-Gens innerhalb einer Zelllinie oder eines Mikroorganismus durch Einfügen eines heterologen DNA-Regulationselements in das Genom einer stabilen Zelllinie oder eines klonierten Mikroorganismus modifiziert werden, sodass das insertierte Regulationselement operativ an das endogene TWIK-8-Gen gebunden ist. Ein endogenes TWIK-8-Gen z.B., das normalerweise „in Bezug auf die Transkription stumm" ist, d.h. ein TWIK-8-Gen, das normalerweise nicht exprimiert wird oder nur in sehr geringem Ausmaß in einer Zelllinie oder einem Mikroorganismus exprimiert wird, kann durch Insertieren eines Regulationselements aktiviert werden, das in der Lage ist, die Expression eines normal exprimierten Genprodukts in dieser Zelllinie oder dem Mikroorganismus zu fördern. Alternativ dazu kann ein in Bezug auf die Transkription stummes, endogenes TWIK-8-Gen durch die Insertion eines promiskuitiven Regulationselements aktiviert werden, dass über verschiedene Zelltypen hinweg arbeitet.
Ein heterologes Regulationselement kann in eine stabile Zelllinie oder einen klonierten Mikroorganismus insertiert werden, sodass es unter Verwendung von Verfahren, wie z.B. zielgerichteter homologer Rekombination, die dem Fachmann wohlbekannt sind und z.B. in Chappel, US-Patent Nr. 5.272.071; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/06667, veröffentlicht am 16. Mai 1991, beschrieben sind, operativ an ein endogenes TWIK-8-Gen gebunden wird.
II. Isolierte TWIK-8-Proteine und Anti-TWIK-8-Antikörper
Ein Aspekt der Erfindung bezieht sich auf isolierte TWIK-8-Proteine zur Verwendung als Immunogene, um Anti-TWIK-8-Antikörper zu züchten. In einer Ausführungsform können native TWIK-8-Proteine aus Zellen oder Gewebequellen durch ein geeignetes Reinigungsverfahren unter Verwendung von Standard-Proteinreinigungsverfahren isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform werden TWIK-8-Proteine mittels DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt. Alternativ zu der rekombinanten Expression kann ein TWIK-8-Protein chemisch synthetisiert werden, und zwar unter Verwendung von Standard-Peptidsyntheseverfahren.
Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein ist im Wesentlichen frei von zellulärem Material oder anderen kontaminierenden Proteinen aus der Zelle oder der Gewebequelle, aus der das TWIK-8-Protein stammt, oder im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst Präparate von TWIK-8-Protein, in denen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, aus denen es isoliert wird oder rekombinant produziert wird, getrennt ist. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" Präparate an TWIK-8-Protein mit weniger als etwa 30 % (nach Trockengewicht) an nicht-TWIK-8-Protein (hierin auch als ein „kontaminierendes Protein" bezeichnet), noch bevorzugter weniger als etwa 20 % an nicht-TWIK-8-Protein und noch bevorzugter weniger als etwa 10 % an nicht-TWIK-8-Protein und insbesondere weniger als etwa 5 % an nicht-TWIK-8-Protein. Wird das TWIK-8-Protein rekombinant hergestellt, so ist es im Wesentlichen auch frei von Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium stellt weniger als etwa 20 %, noch bevorzugter weniger als etwa 10 % und noch bevorzugter weniger als etwa 5 %, des Volumens des Proteinpräparats dar.
Der Ausdruck „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen oder anderen Chemikalien" umfasst Präparate von TWIK-8-Protein, in denen das Protein von chemischen Vorläuferstoffen und anderen Chemikalien, die in die Synthese des Proteins involviert sind, getrennt ist. In einer Ausführungsform umfasst der Ausdruck „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläuferstoffen und anderen Chemikalien" Präparate von TWIK-8-Protein mit weniger als etwa 30 % (nach Trockengewicht) an chemischen Vorläuferstoffen oder nicht-TWIK-8-Chemikalien, noch bevorzugter weniger als etwa 20 % chemischer Vorläuferstoffe oder nicht-TWIK-8-Chemikalien, noch be vorzugter weniger als etwa 10 % chemischer Vorläuferstoffe oder nicht-TWIK-8-Chemikalien und insbesondere weniger als etwa 5 % chemischer Vorläuferstoffe oder nicht-TWIK-8-Chemikalien.
In einer bevorzugten Ausführungsform besitzt das TWIK-8-Protein eine Aminosäuresequenz, wie sie in Seq.-ID Nr. 2 gezeigt wird. In anderen Ausführungsformen ist das TWIK-8-Protein mit Seq.-ID Nr. 2 im Wesentlichen identisch und behält die funktionelle Aktivität des Proteins aus Seq.-ID Nr. 2 bei, unterscheidet sich jedoch in der Aminosäuresequenz aufgrund natürlicher Allelvariationen oder Mutagenese, wie ausführlich in dem oben stehenden Unterkapitel I beschrieben. Dementsprechend ist das TWIK-8-Protein in einer anderen Ausführungsform ein Protein, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zumindest zu 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder mehr identisch mit Seq.-ID Nr. 2 ist.
Um den Prozentsatz der Identität von zwei Aminosäuresequenzen oder zwei Nucleinsäuresequenzen zu bestimmen, werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke angeordnet (z.B. Lücken können in eine oder beide einer ersten und einer zweiten Aminosäure- oder Nucleinsäuresequenz zur optimalen Anordnung eingefügt werden und nicht identische Sequenzen können für Vergleichszwecke beiseite gelassen werden). Die Aminosäurereste oder Nucleotide an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nucleotidpositionen werden anschließend verglichen. Ist eine Position in der ersten Sequenz durch denselben Aminosäurerest oder dasselbe Nucleotid besetzt wie die korrespondierende Position in der zweiten Sequenz, so sind die Moleküle an dieser Position identisch (wie hierin verwendet, ist der Begriff Aminosäure- oder Nucleinsäure-„Identität" äquivalent zum Begriff der Aminosäure- oder Nucleinsäure-„Homologie"). Der Prozentsatz der Identität zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben, in Betrachtnahme der Anzahl an Lücken und der Länge jeder Lücke, die zur optimalen Anordnung der beiden Sequenzen eingeführt werden müssen.
Der Vergleich der Sequenzen und die Bestimmung der Sequenzidentität zwischen zwei Sequenzen kann unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Needleman-Wunsch-Algorithmus (J. Mol. Biol. 48, 444-453 (1970)) ermittelt, der in das GAP-Programm im GCG-Software-Paket inkorporiert wurde (erhältlich unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung von entweder einer Blosum-62-Matrix oder einer PAM250-Matrix und eines Lückengewichts von 16, 14, 12, 10, 8, 6 oder 4 und eines Längengewichts von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Nucleotidsequenzen unter Verwendung des GAP-Programms im GCG-Software-Paket bestimmt (erhältlich unter http://www.gcg.com), und zwar unter Verwendung einer NWSgapdna.CMP-Matrix und eines Lückengewichts von 40, 50, 60, 70 oder 80 und eines Längengewichts von 1, 2; 3, 4, 5 oder 6. In einer weiteren Ausführungsform wird der Prozentsatz der Identität zwischen zwei Aminosäure- oder Nucleotidsequenzen unter Verwendung des Algorithmus von E. Meyers und W. Miller bestimmt (CABIOS 4, 11-17 (1989)), der in das Programm ALIGN (Version 2.0) inkorporiert wurde, unter Verwendung einer PAM120-Gewichtresttabelle, einer „gap length penalty" von 12 und einer „gap penalty" von 4.
Weiters können die Nucleinsäure- und Proteinsequenzen der vorliegenden Erfindung als eine „Abfrage-Sequenz" verwendet werden, um eine Suche in Gegenüberstellung mit öffentlichen Datenbanken durchzuführen, um z.B. andere Mitglieder der Familie oder verwandte Sequenzen zu identifizieren. Solche Suchoperationen können unter Verwendung der Programme NBLAST und XBLAST (Version 2.0) von Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-10 (1990), durchgeführt werden. BLAST-Nucleotidsuchoperationen können mit dem NBLAST-Programm durchgeführt werden, Score = 100, Wortlänge = 12, um Nucleotidsequenzen zu erhalten, die zu den TWIK-8-Nucleinsäuremolekülen der Erfindung homolog sind. BLAST-Proteinsuchoperationen können mit dem XBLAST-Programm durchgeführt werden, Score = 100, Wortlänge = 3, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die zu den TWIK-8-Proteinmolekülen der Erfindung homolog sind. Um Anordnungen mit Lücken zu Vergleichszwecken zu erhalten, kann Gapped BLAST, beschrieben in Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997), verwendet werden. Falls BLAST- und Gapped-BLAST gramme verwendet werden sollten, so können die Vorgabeparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Siehe http://www.ncbi.nlm.nih.gov.
Die Erfindung stellt ebenso TWIK-8-Chimär- oder -Fusionsproteine bereit. Wie hierin verwendet umfasst ein TWIK-8-„Chimärprotein" oder „-Fusionsprotein" ein TWIK-8-Polypeptid, das operabel an ein nicht-TWIK-8-Polypeptid gebunden ist. Ein „TWIK-8-Polypeptid" bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die TWIK-8 entspricht, wohingegen sich ein „nicht-TWIK-8-Polypeptid" auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, die einem Protein entspricht, das im Wesentlichen nicht homolog zu dem TWIK-8-Protein ist, z.B. ein Protein, das sich vom TWIK-8-Protein unterscheidet und das vom selben oder einem anderen Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff „operativ gebunden" darauf hindeuten, dass das TWIK-8-Polypeptid und das nicht-TWIK-8-Polypeptid im Leseraster aneinander fusioniert sind. Das nicht-TWIK-8-Polypeptid kann an den N-Terminus oder den C-Terminus des TWIK-8-Polypeptids fusioniert werden.
In einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein z.B. ein GST-TWIK-8-Fusionsprotein, in dem die TWIK-8-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinantem TWIK-8 erleichtern.
In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein TWIK-8-Protein, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. In gewissen Wirtszellen (z.B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion von TWIK-8 durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Vorzugsweise wird ein TWIK-8-Chimär- oder -Fusionsprotein der Erfindung durch Standard-DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt. Es werden z.B. DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptidsequenzen kodieren, im Leseraster aneinander ligiert, und zwar gemäß herkömmlicher Verfahren, z.B. unter Verwendung stumpfer oder versetzter Termini zur Ligation, Restriktionsenzym-Verdau, um die geeigneten Termini bereitzustellen, Auffüllen kohäsiver Enden, je nach Angemessenheit, alkalischer Phosphatasebehandlung, um unerwünschte Bindungen zu vermeiden, und enzymatischer Ligation. In einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen mittels herkömmlicher Verfahren, unter anderem automatisierter DNA-Synthetisiergeräte, synthetisiert werden. Alternativ dazu kann die PCR-Amplifikation von Gen-Fragmenten unter Verwendung von Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinander folgenden Gen-Fragmenten verursachen, die schließlich mittels Annealing und Reamplifikation behandelt werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe z.B. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. (Hrsg.), John Wiley & Sons (1992)). Weiters sind viele Expressionsvektoren im Handel erhältlich, die bereits für eine Fusionsgruppierung kodieren (z.B. für ein GST-Polypeptid). Eine für TWIK-8 kodierende Nucleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, sodass die Fusionsgruppierung im Leseraster an das TWIK-8-Protein gebunden ist.
Ein isoliertes TWIK-8-Protein oder ein Teil oder Fragment davon kann als Immunogen verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die TWIK-8 unter Verwendung von Standardverfahren zur Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper binden. Ein TWIK-8-Protein voller Länge oder, alternativ dazu, Antigen-Peptidfragmente von TWIK-8 kann/können als Immunogene verwendet werden. Das Antigen-Peptid von TWIK-8 umfasst zumindest 8 Aminosäurereste der in Seq.-ID Nr. 2 gezeigten Aminosäure und umfasst ein Epitop von TWIK-8, sodass ein Antikörper, der gegen das Peptid gezüchtet wurde, einen spezifischen Immunkomplex mit TWIK-8 bildet. Vorzugsweise umfasst das Antigen-Peptid zumindest 10 Aminosäurereste, noch bevorzugter zumindest 15 Aminosäurereste, noch bevorzugter zumindest 20 Aminosäurereste und insbesondere zumindest 30 Aminosäurereste.
Bevorzugte Epitope, die das Antigen-Peptid umfasst, sind Regionen von TWIK-8, die sich auf der Oberfläche des Proteins befinden, z.B. hydrophile Regionen, sowie Regionen mit hoher Antigenität.
Ein TWIK-8-Immunogen wird typischerweise verwendet, um Antikörper durch Immunisierung eines geeigneten Individuums (z.B. Kaninchen, Ziege, Maus oder ein anderes Säugetier) mit dem Immunogen herzustellen. Ein geeignetes Immunogenpräparat kann z.B. rekombinant exprimiertes TWIK-8-Protein oder ein chemisch synthetisiertes TWIK-8-Polypeptid umfassen. Das Präparat kann weiters ein Adjuvans, wie z.B. komplettes oder inkomplettes Freundsches Adjuvans, oder ein ähnlich immunstimulierend wirkendes Agens umfassen. Die Immunisierung eines geeigneten Individuums mit einem immunogenen TWIK-8-Präparat induziert eine polyklonale Anti-TWIK-8-Antikörper-Reaktion.
Dementsprechend betrifft ein anderer Aspekt Anti-TWIK-8-Antikörper. Der Begriff „Antikörper", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d.h. Moleküle, die eine Antigenbindungsstelle enthalten, die spezifisch an ein Antigen bindet (mit diesem eine Immunreaktion bildet), wie z.B. TWIK-8. Beispiele für immunologisch aktive Teile von Immungolublinmolekülen umfassen F(ab)- und F(ab')₂-Fragmente, die durch Behandlung des Antikörpers mit einem Enzym, wie z.B. Pepsin, erzeugt werden können. Die Erfindung stellt polyklonale und monoklonale Antikörper bereit, die TWIK-8 spezifisch binden. Der Begriff „monoklonaler Antikörper" oder „monoklonale Antikörperzusammensetzung", wie hierin verwendet, bezieht sich auf eine Population an Antikörpermolekülen, die lediglich eine Spezies einer Antigen-Bindungsstelle enthalten, die in der Lage ist, mit einem bestimmten Epitop von TWIK-8 eine Immunreaktion einzugehen. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung zeigt daher eine einzelne Bindungsaffinität für ein bestimmtes TWIK-8-Protein, mit dem es eine Immunreaktion eingeht.
Polyklonale Anti-TWIK-8-Antikörper können wie oben beschrieben durch Immunisierung eines geeigneten Individuums mit einem TWIK-8-Immunogen hergestellt werden. Der Anti-TWIK-8-Antikörpertiter in dem immunisierten Individuum kann über eine Zeitspanne mittels Standardverfahren, wie z.B. mit einer enzymgekoppelten Immunadsorptionsbestimmung (ELISA) unter Verwendung von immobilisiertem TWIK-8, beobachtet werden. Falls gewünscht können die gegen TWIK-8 gerichteten Anti körpermoleküle aus dem Säugetier (z.B. aus dem Blut) isoliert werden und mittels wohlbekannter Verfahren, wie z.B. Protein-A-Chromatographie, weiter gereinigt werden, um die IgG-Fraktion zu erhalten. Zu einer geeigneten Zeit nach der Immunisierung, z.B. wenn die Anti-TWIK-8-Antikörpertiter am höchsten sind, können Antikörper produzierende Zellen aus dem Individuum erhalten werden und verwendet werden, um monoklonale Antikörper herzustellen, und zwar unter Verwendung von Standardverfahren, wie z.B. dem Hybridom-Verfahren, ursprünglich von Kohler und Milstein, Nature 256, 495-497 (1975), beschrieben (siehe auch Brown et al., J. Immunol. 127, 539-46 (1981); Brown et al., J. Biol. Chem. 255, 4980-83 (1980); Yeh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 2927-31 (1976), und Yeh et al., Int. J. Cancer 29, 269-75 (1982)), dem etwas jüngeren menschlichen B-Zellen-Hybridom-Verfahren (Kozbor et al., Immunol. Today 4, 72 (1983)), dem EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 77-96, Alan R. Liss Inc. (1985)) oder Triom-Verfahren. Die Technologie zur Herstellung monoklonaler Antikörper-Hybridome ist wohlbekannt (siehe im Allgemeinen R.H. Kenneth, Monoklonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E.A. Lerner, Yale J. Biol. Med. 54, 387-402 (1981); M.L. Gefter et al., Somatic Cell Genet. 3, 231-36 (1977)). Kurz gesagt wird eine unsterbliche Zelllinie (typischerweise ein Myelom) an Lymphozyten (typischerweise Splenozyten) von einem Säugetier fusioniert, das mit einem TWIK-8-Immunogen wie oben beschrieben immunisiert wurde, und die Kulturüberstände der resultierenden Hybridomzellen werden gescreent, um ein Hybridom zu identifizieren, das einen monoklonalen Antikörper produziert, der TWIK-8 bindet.
Eine beliebige der zahlreichen wohlbekannten Arbeitsvorschriften, die für das Fusionieren von Lymphozyten und unsterblichen Zelllinien verwendet werden, kann zur Erreichung des Zwecks, einen monoklonalen Anti-TWIK-8-Antikörper zu erzeugen, angewandt werden (siehe z.B. G. Galfre et al., Nature 266, 55052 (1977); Gefter et al., Somatic Cell Genet., s.o.; Lerner, Yale J. Biol. Med., s.o.; Kenneth, Monoclonal Antibodies, s.o.). Weiters wird der durchschnittliche Fachmann die Tatsache schätzen, dass es viele Variationen dieser Verfahren gibt, die ebenso nützlich sein könnten. Typischerweise stammt die unsterbliche Zelllinie (z.B. eine Myelomzelllinie) aus der selben Säugetierspezies wie die Lymphozyten. Murine Hybridome z.B. können durch Fusionieren von Lymphozyten einer Maus, die mit einem immunogenen Präparat der vorliegenden Erfindung immunisiert wurde, mit einer unsterblich gemachten Mauszelllinie hergestellt werden. Bevorzugte unsterbliche Zelllinien sind Maus-Myelomzelllinien, die auf Kulturmedium empfindlich reagieren, das Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin enthält („HAT-Medium"). Eine beliebige einer Anzahl an Myelomzelllinien kann gemäß Standardverfahren als Fusionspartner verwendet werden, z.B. die P3-NS1/1-Ag4-1-, P3-x63-Ag8.653- oder Sp2/O-Ag14-Myelomzellinien. Diese Myelomlinien sind bei der ATCC erhältlich. Typischerweise werden HAT-empfindliche Maus-Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglycol („PEG") an Maus-Splenozyten fusioniert. Hybridomzellen, die das Resultat der Fusion sind, werden danach unter Verwendung von HAT-Medium ausgewählt, das nicht fusionierte und unproduktiv fusionierte Myelomzellen abtötet (unfusionierte Splenozyten sterben nach einigen Tagen, da sie nicht transformiert werden). Hybridomzellen, die einen monoklonalen Antikörper der Erfindung produzieren, werden mittels Screening der Hybridomkulturüberstände auf Antikörper detektiert, die TWIK-8 binden, z.B. unter Verwendung eines Standard-ELISA-Tests.
Als Alternative zu der Herstellung monoklonale Antikörper sekretierender Hybridome kann ein monoklonaler Anti-TWIK-8-Antikörper mittels Screening einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulinbibliothek (z.B. einer Antikörper-Phagen-Display-Bibliothek) mit TWIK-8 identifiziert und isoliert werden, um dadurch Immunglobulinbibliotheksmitglieder zu isolieren, die TWIK-8 binden. Sets zur Herstellung und zum Screening von Phagen-Display-Bibliotheken sind im Handel erhältlich (z.B. das „Recombinant Phage Antibody System" von Pharmacia, Katalog Nr. 27-9400-01; und das „SurfZAP^TM Phage Display Kit" von Stratagene, Katalog Nr. 240612). Zusätzlich dazu sind Beispiele für Verfahren und Reagenzien, die zur Verwendung in der Herstellung und im Screening einer Antikörper-Display-Bibliothek besonders geeignet sind, z.B. in Ladner et al., US-Patent Nr. 5.223.409; Klang et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/18619; Dower et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 91/17271; Winter et al., Internationale PCT-Veröffentlichung WO 92/20791; Markland et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/15679; Breitling et al., Internationale PCT-Veröffentlichung WO 93/01288; McCafferty et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/01047; Garrard et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 92/09690; Ladner et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9, 1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3, 81-85 (1992); Huse et al., Science 246, 1275-1281 (1989); Griffiths et al., EMBO J. 12, 725-734 (1993); Hawkins et al., J. Mol. Biol. 226, 889-896 (1992); Clarkson et al., Nature 352, 624-628 (1991); Gram et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3576-3580 (1992); Garrad et al., Bio/Technology 9, 1373-1377 (1991); Hoogenboom et al., Nucl. Acid Res. 19, 4133-4137 (1991); Barbas et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 7978-7982 (1991); und McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), zu finden.
Zusätzlich dazu befinden sich rekombinante Anti-TWIK-8-Antikörper, wie z.B. chimäre und humanisierte monoklonale Antikörper, die sowohl menschliche als auch nicht menschliche Teile umfassen, die unter Verwendung von Standard-DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden können, innerhalb des Umfangs der Erfindung. Solche chimären und humanisierten monoklonalen Antikörper können mittels DNA-Rekombinationsverfahren nach dem Stand der Technik hergestellt werden, z.B. unter Verwendung von Verfahren, die in Robinson et al., Internationale Anmeldung Nr. PCT/US86/02269; Akira et al., Europäische Patentanmeldung 184.187; M. Taniguchi, Europäische Patentanmeldung 171.496; Morrison et al., Europäische Patentanmeldung 173.494; Neuberger et al., Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 86/01533; Cabilly et al., US-Patent Nr. 4.816.567; Cabilly et al., Europäische Patentanmeldung 125.023; Better et al., Science 240, 1041-1043 (1988); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 3439-3443 (1987); Liu et al., J. Immunol. 139, 3521-3526 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 214-218 (1987); Nishimura et al., Canc. Res. 47, 999-1005 (1987); Wood et al., Nature 314, 446-449 (1985); und Shaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80, 1553-1559 (1988); S.L. Morrison, Science 229, 1202-1207 (1985); Oi et al., BioTechniques 4, 214 (1986); Winter, US-Patent Nr. 5.225.539; Jones et al., Nature 321, 552-525 (1986); Verhoeyan et al., Science 239, 1534 (1988); und Beidler et al., J. Immunol. 141, 4053-4060 (1988), beschrieben werden.
Ein Anti-TWIK-8-Antikörper (z.B. ein monoklonaler Antikörper) kann verwendet werden, um TWIK-8 mittels Standardverfahren, wie z.B. Affinitätschromatographie oder Immunopräzipitation, zu isolieren. Ein Anti-TWIK-8-Antikörper kann die Reinigung von natürlichem TWIK-8 von Zellen und die Reinigung von rekombinant produziertem TWIK-8, das in Wirtszellen exprimiert wird, erleichtern. Weiters kann ein Anti-TWIK-8-Antikörper verwendet werden, um TWIK-8-Protein zu detektieren (z.B. in einem zellulären Lysat oder einem Zellüberstand), um die Menge und das Muster der Expression des TWIK-8-Proteins zu evaluieren. Anti-TWIK-8-Antikörper können diagnostisch verwendet werden, um Proteinmengen in Gewebe als Teil eines klinischen Testverfahrens zu beobachten, z.B. um die Wirksamkeit eines bestimmten Behandlungsregimes zu bestimmen. Die Detektion kann durch Koppeln (d.h. physisches Binden) des Antikörpers an eine detektierbare Substanz erleichtert werden. Beispiele detektierbarer Substanzen umfassen verschiedene Enzyme, prosthetische Gruppen, fluoreszierende Materialien, lumineszierende Materialien, biolumineszierende Materialien und radioaktive Materialien. Beispiele geeigneter Enzyme umfassen Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, β-Galactosidase oder Acetylcholinesterase; Beispiele geeigneter prosthetischer Gruppenkomplexe umfassen Streptavidin/Biotin und Avidin/Biotin; Beispiele geeigneter fluoreszierender Materialien umfassen Umbelliferon, Fluorescein, Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Dichlortriazinylaminfluorescein, Dansylchlorid oder Phycoerythrin; ein Beispiel für ein lumineszierendes Material umfasst Luminol; Beispiele biolumineszierender Materialien umfassen Luciferase, Luciferin und Aequorin, und Beispiele geeigneter radioaktiver Materialien umfassen ¹²⁵I, ¹³¹I, ³⁵S oder ³H.
III. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nucleinsäure enthalten, die für ein TWIK-8-Protein kodiert. Wie hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Vektor" auf ein Nucleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nucleinsäure, an die es gebunden wurde, zu transportieren. Ein Typ Vektor ist ein „Plasmid", das sich auf eine ringförmige doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein ande rer Typ Vektor ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind in der Lage, sich in einer Wirtszelle, in die sie eingeführt werden, autonom zu replizieren (z.B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsstartpunkt und episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht episomale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle nach Einführung in eine Wirtszelle integriert und werden dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Weiters sind gewisse Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, an die sie operativ gebunden sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen besitzen Expressionsvektoren, die in DNA-Rekombinationsverfahren von Nutzen sind, oftmals die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid" und „Vektor" synonym verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch jene anderen Formen an Expressionsvektoren umfassen, wie z.B. virale Vektoren (z.B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und adenoassoziierte Viren), die äquivalente Funktionen erfüllen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nucleinsäure der Erfindung in einer Form, die für die Expression der Nucleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehr Regulationssequenz(en) umfassen, ausgewählt auf der Basis der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen, die operativ an die zu exprimierende Nucleinsäuresequenz gebunden sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll „operabel gebunden" bedeuten, dass die Nucleotidsequenz von Interesse an die Regulationssequenz(en) gebunden ist, und zwar auf eine Art und Weise, die eine Expression der Nucleotidsequenz ermöglicht (z.B. in einem In-vitro-Transkriptions/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff „Regulationssequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Solche Regulationssequenzen werden z.B. in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben. Regulationssequenzen umfassen jene, die die konstitutive Expression einer Nucleotidse quenz in vielen Typen von Wirtszellen steuern, und jene, die die Expression der Nucleotidsequenz nur in gewissen Wirtszellen steuern (z.B. gewebespezifische Regulationssequenzen). Der Fachmann wird die Tatsache zu schätzen wissen, dass das Design des Expressionsvektors von Faktoren, wie z.B. der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Ausmaß an Proteinexpression und dergleichen, abhängen kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um dadurch Proteine oder Peptide zu produzieren, unter anderem Fusionsproteine oder -peptide, für die, wie hierin beschrieben, Nucleinsäuren kodieren (z.B. TWIK-8-Proteine, Mutantenformen von TWIK-8-Proteinen, Fusionsproteine und dergleichen).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können für die Expression von TWIK-8-Proteinen in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen kreiert werden. TWIK-8-Proteine können z.B. in bakteriellen Zellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Insekten-Zellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990), beschrieben. Alternativ dazu kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. unter Verwendung der T7-Promotor-Regulationssequenzen und der T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird am häufigsten in E. coli durchgeführt, und zwar mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von entweder Fusions- oder nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe an Aminosäuren zu einem darin kodierten Protein hinzu, normalerweise zu dem Aminoterminus des rekombinanten Proteins. Solche Fusionsvektoren dienen typischerweise drei Zwecken: 1) zur Steigerung der Expression von rekombinantem Protein; 2) zur Steigerung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins und 3) zur Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Fungieren als Ligand in der Affinitätsreinigung. Oftmals wird in Fusionsexpressionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle an der Kontaktstelle der Fusionsgruppierung und des rekombinanten Proteins eingeführt, um eine Trennung des rekombi nanten Proteins von der Fusionsgruppierung nach der Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre verwandten Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase. Typische Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; D.B. Smith und K.S. Johnson, Gene 67, 31-40 (1988)), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren.
Gereinigte Fusionsproteine können in TWIK-8-Aktivitätstests verwendet werden (z.B. direkte oder kompetitive Tests, wie sie unten stehend ausführlich beschrieben werden) oder um Antikörper zu erzeugen, die z.B. für TWIK-8-Proteine spezifisch sind. In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein TWIK-8-Fusionsprotein, das in einem retroviralen Expressionsvektor der vorliegenden Erfindung exprimiert wird, verwendet werden, um Knochenmarkzellen zu infizieren, die anschließend in bestrahlte Rezipienten transplantiert werden. Die Pathologie des Rezipientenindividuums wird nun untersucht, nachdem ausreichend Zeit vergangen ist (z.B. sechs (6) Wochen).
Beispiele geeigneter induzierbarer nicht-Fusions-E.-coli-Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., Gene 69, 301-315 (1988)) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 60-89, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)). Die Zielgenexpression aus dem pTrc-Vektor basiert auf Wirts-RNA-Polymerasetranskription aus einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor. Die Zielgenexpression aus dem pET-11d-Vektor basiert auf der Transkription aus einem T7-gn10-lac-Fusionspromotor, vermittelt durch eine coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) aus einem residenten Prophage bereitgestellt, die ein T7-gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV-5-Promotors in sich trägt.
Eine Strategie zur Maximierung rekombinanter Proteinexpression in E. coli ist, das Protein in Wirtsbakterien mit gestörter Fähigkeit, das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten, zu exprimieren (S. Gottesman, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, 119-128, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990)).
Eine weitere Strategie ist es, die Nucleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor einzuführenden Nucleinsäure zu verändern, sodass die einzelnen Codons für jede Aminosäure jene sind, die vorzugsweise in E. coli verwendet werden (Wada et al., Nucleic Acids Res. 20, 2111-2118 (1992)). Solche Veränderungen der Nucleinsäuresequenzen der Erfindung können mittels Standard-DNA-Syntheseverfahren durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der TWIK-8-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele von Vektoren zur Expression in Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSec1 (Baldari et al., Embo J. 6, 229-234 (1987)), pMFa (Kurjan und Herskowitz, Cell 30, 933-943 (1982)), pJRY88 (Schultz et al., Gene 54, 113-123 (1987)), pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) und picZ (InVitrogen Corp., San Diego, CA).
Alternativ dazu können TWIK-8-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirusvektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (z.B. Sf9-Zellen) erhältlich sind, umfassen die pAc-Serien (Smith et al., Mol. Cell Biol. 3, 2156-2165 (1983)) und die pVL-Serien (Lucklow und Summers, Virology 170, 31-39 (1989)).
In einer weiteren Ausführungsform wird eine Nucleinsäure der Erfindung in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetierexpressionsvektors exprimiert. Beispiele an Säugetierexpressionsvektoren umfassen pCDM8 (B. Seed, Nature 329, 840 (1987)) und pMT2PC (Kaufman et al., EMBO J. 6, 187-195 (1987)). Wird er in Säugetierzellen verwendet, so werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig von viralen Regulationselementen bereitgestellt. Häufig verwendete Promotoren stammen z.B. von Polyoma-, Adenovirus 2, Zytomegalievirus und Simian-Virus 40 ab. Für weitere geeignete Expressionssysteme sowohl für prokaryotische als auch für eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 aus J. Sambrook, E.F. Fritsh und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989).
In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säugetierexpressionsvektor in der Lage, die Expression der Nucleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu steuern (z.B. gewebespezifische Regulationselemente werden verwendet, um die Nucleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische Regulationselemente sind nach dem Stand der Technik bekannt. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter gewebespezifischer Promotoren umfassen den Albumin-Promotor (leberspezifisch; Pinkert et al., Genes Dev. 1, 268-277 (1987)), lymphoidspezifische Promotoren (Calame und Eaton, Adv. Immunol. 43, 235-275 (1988)), insbesondere Promotoren von T-Zellenrezeptoren (Winoto und Baltimore, EMBO J. 8, 729-733 (1989)) und Immunglobuline (Banerji et al., Cell 33, 729-740 (1983); Queen und Baltimore, Cell 33, 741-748 (1983)), neuronenspezifische Promotoren (z.B. den Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5473-5477 (1989)), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., Science 230, 912-916 (1985)) und brustdrüsenspezifische Promotoren (z.B. den Molke-Promotor, US-Patent Nr. 4.873.316 und Europäische Anmeldung Veröffentlichung Nr. 264.166). Durch die Entwicklung gesteuerte Promotoren sind ebenso umfasst, z.B. die murinen hox-Promotoren (Kessel und Gruss, Science 249, 374-379 (1990)) und der α-Fötoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, Genes Dev. 3, 537-546 (1989)).
Die Erfindung stellt weiters einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein DNA-Molekül der Erfindung umfasst, das in den Expressionsvektor in einer Antisense-Ausrichtung kloniert wurde. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ an eine Regulationssequenz gebunden, und zwar auf eine Art und Weise, die die Expression (mittels Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls ermöglicht, das eine Antisense-Orientierung gegenüber TWIK-8-mRNA aufweist. Regulationssequenzen, die operativ an eine Nucleinsäure gebunden sind, die in der Antisense-Ausrichtung kloniert wurde, können ausgewählt werden, wobei diese die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Reihe an Zelltypen steuern, z.B. virale Promotoren und/oder Enhancer, oder Regulationssequenzen können ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann die Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus aufweisen, in dem Anti sense-Nucleinsäuren unter der Kontrolle einer hochgradig effizienten Regulationsregion produziert werden, deren Aktivität durch den Zelltyp bestimmt werden kann, in den der Vektor eingeführt wird. Für eine Diskussion bezüglich der Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen siehe H. Weintraub et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Band 1 (1) (1986).
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül der Erfindung eingeführt ist, z.B. ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors oder ein TWIK-8-Nucleinsäuremolekül, das Sequenzen enthält, die es ihm ermöglichen, an einer spezifischen Stelle des Genoms der Wirtszelle homolog zu rekombinieren. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin synonym verwendet. Es ist anzumerken, dass diese Begriffe sich nicht nur auf die spezifische Zelle des Subjekts beziehen, sondern auf die Nachkommenschaft oder die potentielle Nachkommenschaft einer solchen Zelle. Da entweder aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, kann diese Nachkommenschaft tatsächlich nicht mit der Zelle, von der sie abstammt, identisch sein, sie ist jedoch trotzdem innerhalb des Umfangs des Begriffes, wie er hierin verwendet wird, inkludiert.
Eine Wirtszelle kann eine beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Ein TWIK-8-Protein kann z.B. in bakteriellen Zellen, wie z.B. E.-coli-Zellen, Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie z.B. Chinahamster-Eierstockzellen (CHO-Zellen) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionsverfahren eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen sich die Begriffe „Transformation" und „Transfektion" auf eine Reihe auf dem Gebiet der Erfindung anerkannter Verfahren zur Einführung fremder Nucleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, unter anderem Kalziumphosphat- oder Kalziumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen sind in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), und anderen Labormanualen zu finden.
Für eine stabile Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, dass, in Abhängigkeit vom Expressionsvektor und dem verwendeten Transfektionsverfahren, nur ein geringer Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und auszuwählen, wird ein Gen, das für einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) kodiert, im Allgemeinen zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszelle eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen jene, die Resistenz gegen Wirkstoffe verleihen, wie z.B. G418, Hygromycin und Methotrexat. Nucleinsäure, die für einen selektierbaren Marker kodiert, kann in eine Wirtszelle auf demselben Vektor eingeführt werden wie jene, der für ein TWIK-8-Protein kodiert, oder kann auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die stabil mit der eingeführten Nucleinsäure transfiziert wurden, können mittels Wirkstoffselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die das selektierbare Markergen inkorporiert haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Eine Wirtszelle der Erfindung, wie z.B. eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein TWIK-8-Protein zu produzieren (d.h. zu exprimieren). Dementsprechend stellt die Erfindung weiters Verfahren zur Herstellung eines TWIK-8-Proteins bereit, und zwar unter Verwendung der Wirtszellen der Erfindung. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Züchten der Wirtszelle der Erfindung (in die ein für ein TWIK-8-Protein kodierender rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, sodass ein TWIK-8-Protein hergestellt wird. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren weiters das Isolieren eines TWIK-8-Proteins aus dem Medium oder der Wirtszelle.
IV. Pharmazeutische Zusammensetzungen
Weiters kann ein Antikörper (oder ein Fragment davon) an eine therapeutische Gruppierung, wie z.B. ein Zytotoxin, ein therapeutisches Agens oder ein radioaktives Metallion, konjugiert werden. Ein Zytotoxin oder ein zytotoxisches Agens umfasst ein beliebiges Agens, das für Zellen schädlich ist. Beispiele umfassen Taxol, Cytochalasin B, Gramicidin D, Ethidiumbromid, Emetin, Mitomycin, Etoposid, Tenoposid, Vincristin, Vinblastin, Colchicin, Doxorubicin, Daunorubicin, Dihydroxyanthracindion, Mitoxantron, Mithramycin, Actinomycin D, 1-Dehydrotestosteron, Glucocorticoide, Procain, Tetracain, Lidocain, Propranolol und Puromycin und Analoga oder Homologe davon. Therapeutische Agenzien umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, Antimetaboliten (z.B. Methotrexat, 6-Mercaptopurin, 6-Thioguanin, Cytarabin, 5-Fluoruracildecarbazin), Alkylierungsmittel (z.B. Mechlorethamin, Thioepachlorambucil, Melphalan, Carmustin (BSNU) und Lomustin (CCNU), Cyclothosphamid, Busulfan, Dibrommannitol, Streptozotocin, Mitomycin C und cis-Dichlordiaminplatin-(II) (DDP) (Cisplatin), Anthracycline (z.B. Daunorubicin (ehemals Daunomycin) und Doxorubicin), Antibiotika (z.B. Dactinomycin (ehemals Actinomycin), Bleomycin, Mithramycin und Anthramycin (AMC)) und antimitotische Agenzien (z.B. Vincristin und Vinblastin).
Die Konjugate der Erfindung können zur Modifikation einer bestimmten biologischen Reaktion verwendet werden, die Wirkstoffgruppierung soll nicht als auf klassische chemische therapeutische Agenzien limitiert verstanden werden. Die Wirkstoffgruppierung kann z.B. ein Protein oder Polypeptid sein, das eine gewünschte biologische Aktivität besitzt. Solche Proteine können z.B. ein Toxin, wie z.B. Abrin, Ricin A, Pseudonomas-Exotoxin oder Diphtherie-Toxin, umfassen; ein Protein, wie z.B. Tumornekrosefaktor, α-Interferon, β-Interferon, Nervenwachstumsfaktor, aus Blutplättchen gewonnener Wachstumsfaktor, Gewebe-Plasminogen-Aktivator, oder Modifizierer der biologischen Reaktion, wie z.B. Lymphokine, Interleukin-1 („IL-1"), Interleukin-2 („IL-2"), Interleukin-6 („IL-6"), Granulocytenmakrophagenkolonie-stimulierender Faktor („GM-CSF"), Granulozytenkoloniestimulierender Faktor („G-CSF") oder andere Wachstumsfaktoren.
Verfahren zum Konjugieren solcher therapeutischen Gruppierungen an Antikörper sind wohlbekannt, siehe z.B. Arnon et al., Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, 243-56, Reisfeld et al. (Hrsg.) (Alan R. Liss, Inc. (1985)); Hellstrom et al., Antibodies For Drug Delivery, in Controlled Drug Delivery, 2. Auflage, 623-53, Robinson et al. (Hrsg.) (Marcel Dekker, Inc. (1987)); Thorpe, Antibody Carriers of Cytotoxic Agents in Cancer Therapy: A Review, in Monoclonal Antibodies 84: Biological and Clinical Applications, 475-506, Pinchera et al. (Hrsg.) (1985); Analysis, Results and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cancer Therapy, in Monoclonal Antibodies for Cancer Detection And Therapy, 303-16, Baldwin et al. (Hrsg.) (Academic Press (1985)), und Thorpe et al., The Preparation And Cytotoxic Properties of Antibody-Toxin Conjugates, Immunol. Rev. 62, 119-58 (1982). Alternativ dazu kann ein Antikörper an einen zweiten Antikörper konjugiert werden, um ein Antikörper-Heterokonjugat zu bilden, wie von Segal im US-Patent Nr. 4.676.980 beschrieben.
V. Verwendung und Verfahren der Erfindung
Die hierin beschriebenen Nucleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe und Antikörper können in einem oder mehrerem der folgenden Verfahren verwendet werden: a) Screening-Tests; b) prognostische Medizin (z.B. diagnostische Tests). Wie hierin beschrieben besitzt ein TWIK-8-Protein der Erfindung eine oder mehrere der folgenden Aktivitäten: (1) Wechselwirkung mit einem nicht-TWIK-Proteinmolekül; (2) Aktivierung eines TWIK-abhängigen Signalübertragungswegs; (3) Modulation der Freisetzung von Neurotransmittern; (4) Modulation der Reizbarkeit der Membran; (5) Beeinflussung des Ruhepotentials von Membranen, Wellenformen und Frequenzen von Aktionspotentialen und Reizschwellen, (6) Modulation von Prozessen, die dem Lernen oder dem Gedächtnis zugrunde liegen, wie z.B. die Integration synaptischer Reaktionen, die unter dem Schwellenwert liegen, und das Leitvermögen backpropagierender Aktionspotentiale, und (7) die Vermittlung der Nozizeption.
Die isolierten Nucleinsäuremoleküle der Erfindung können z.B. verwendet werden, um TWIK-8-Protein zu exprimieren (z.B. mittels eines rekombinanten Expressionsvektors in einer Wirtszelle in Gentherapieanwendungen), um TWIK-8-mRNA (z.B. in einer biologischen Probe) oder eine genetische Veränderung in einem TWIK-8-Gen zu detektieren, und um die TWIK-8-Aktivität, wie unten stehend weiters beschrieben, zu modulieren. Zusätzlich dazu können die TWIK-8-Proteine verwendet werden, um auf natürlich vorkommende TWIK-8-Substrate zu screenen und um auf Wirkstoffe oder Verbindungen zu screenen, die die TWIK-8-Aktivität modulieren.
A. Screening-Tests:
Die Erfindung stellt ein Verfahren (hierin auch als ein „Screening-Test" bezeichnet) zur Identifikation von Modulatoren bereit, d.h. Kandidaten- oder Testverbindungen oder Agenzien (z.B. Peptide, Peptidmimetika, kleine Moleküle oder andere Wirkstoffe), die an TWIK-8-Proteine binden, eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf z.B. die TWIK-8-Expression oder die TWIK-8-Aktivität haben oder eine stimulierende oder inhibierende Wirkung auf z.B. die Expression oder die Aktivität eines TWIK-8-Substrats haben.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung Tests für das Screening von Kandidaten- oder Testverbindungen bereit, die Substrate eines TWIK-8-Proteins oder -Polypeptids oder eines biologisch aktiven Teils davon sind. In einer anderen Ausführungsform stellt die Erfindung Tests für das Screening von Kandidaten- oder Testverbindungen bereit, die die Aktivität eines TWIK-8-Proteins oder -Polypeptids oder eines biologisch aktiven Teils davon modulieren oder an diese binden. Die Testverbindungen der vorliegenden Erfindung können unter Verwendung eines beliebigen der zahlreichen Ansätze in Verfahren bezüglich kombinatorischer Bibliotheken, die nach dem Stand der Technik bekannt sind, erhalten werden, unter anderem: biologische Bibliotheken, räumlich adressierbare, parallele Festphasen- oder Lösungsphasen-Bibliotheken; synthetische Bibliotheksverfahren, die eine Dekonvolution erfordern; das „eine-Perle-eine-Verbindung"-Bibliotheksverfahren; und synthetische Bibliotheksverfahren, die die Affinitätschromatographieselektion verwenden. Der Ansatz der biologischen Bibliothek ist auf Peptidbibliotheken limitiert, während die anderen vier Ansätze auf Peptid-, nicht-Peptid-Oligomer- oder Kleinmolekül-Bibliotheken von Verbindungen anwendbar sind (K.S. Lam, Anticancer Drug Des. 12, 145 (1997)).
Beispiele von Verfahren für die Synthese von molekularen Bibliotheken sind nach dem Stand der Technik z.B. in der folgenden Literatur zu finden: DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6909 (1993); Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 11422 (1994); Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37, 2678 (1994); Cho et al., Science 261, 1303 (1993); Carrel et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2059 (1994); Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33, 2061 (1994); und in Gallop et al., J. Med. Chem. 37, 1233 (1994).
Bibliotheken von Verbindungen können in einer Lösung vorhanden sein (z.B. Houghten, Biotechniques 13, 412-421 (1992)) oder auf Perlen (Lam, Nature 354, 82-84 (1991)), Chips (Fodor, Nature 364, 555-556 (1993)), Bakterien (Ladner, USP 5.223.409), Sporen (Ladner, USP '409), Plasmiden (Cull et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 1865-1869 (1992)) oder auf Phagen (Scott und Smith, Science 249, 386-390 (1990)); (Devlin, Science 249, 404-406 (1990)); (Cwirla et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 6378-6382 (1990)); (Felici, J. Mol. Biol. 222, 301-310 (1991)); (Ladner, s.o.).
In einer Ausführungsform ist ein Test ein auf Zellen basierender Test, in dem eine Zelle, die ein TWIK-8-Protein oder einen biologisch aktiven Teil davon exprimiert, mit einer Testverbindung kontaktiert wird und die Fähigkeit der Testverbindung, die TWIK-8-Aktivität zu modulieren, bestimmt wird. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die TWIK-8-Aktivität zu modulieren, kann z.B. durch Überwachung der Freisetzung eines Neurotransmitters aus einer Zelle erreicht werden, die TWIK-8 exprimiert. Die Zelle kann z.B. von einem Säugetier stammen, z.B. eine neuronale Zelle, eine Herzzelle oder eine Hautzelle.
Die Fähigkeit der Testverbindung, die TWIK-8-Bindung an ein Substrat zu modulieren oder an TWIK-8 zu binden, kann ebenso bestimmt werden. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die TWIK-8-Bindung an ein Substrat zu modulieren, kann z.B. durch Koppeln des TWIK-8-Substrats an ein Radioisotop oder eine enzymatische Markierung erreicht werden, sodass die Bindung des TWIK-8-Substrats an TWIK-8 durch Detektieren des markierten TWIK-8-Substrats in einem Komplex bestimmt werden kann. Alternativ dazu könnte TWIK-8 an ein Radioisotop oder eine enzymatische Markierung gebunden werden, um die Fähigkeit einer Testverbindung, die TWIK-8-Bindung an ein TWIK-8-Substrat zu modulieren, in einem Komplex zu beobachten. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, TWIK-8 zu binden, kann z.B. durch Koppeln der Verbindung mit einem Radioisotop oder einer enzymatischen Markierung erreicht werden, sodass die Bindung der Verbindung an TWIK-8 durch Detektieren der markierten TWIK-8-Verbindung in einem Komplex bestimmt werden kann. Verbindungen (z.B. TWIK-8-Substrate) können z.B. mit ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³H entweder direkt oder indirekt markiert werden, und das Radioisotop kann durch direkte Zählung der Radioemission oder durch Szintillationszählung detektiert werden. Alternativ dazu können Verbindungen z.B. mit Meerrettichperoxidase, alkalischer Phosphatase oder Luciferase enzymatisch markiert werden, und die enzymatische Markierung kann durch die Bestimmung der Umwandlung eines geeigneten Substrats in ein Produkt detektiert werden.
Es fällt ebenso in den Umfang dieser Erfindung, die Fähigkeit einer Verbindung (z.B. eines TWIK-8-Substrats) zu bestimmen, mit TWIK-8 wechselzuwirken, und zwar ohne einen der wechselwirkenden Stoffe zu markieren. So kann z.B. ein Mikrophysiometer verwendet werden, um die Wechselwirkung einer Verbindung mit TWIK-8 ohne die Markierung der Verbindung noch von TWIK-8 zu detektieren. H.M. McConnell et al., Science 257, 1906-1912 (1992). Wie hierin verwendet, ist ein „Mikrophysiometer" (z.B. Cytosensor) ein analytisches Instrument, das die Geschwindigkeit misst, mit der eine Zelle ihre Umwelt ansäuert, und zwar unter Verwendung eines lichtadressierbaren potentiometrischen Sensors (LAPS). Veränderungen in dieser Ansäuerungsrate können als Indikator für die Wechselwirkung zwischen einer Verbindung und TWIK-8 verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform ist ein Test ein auf Zellen basierender Test, der das Kontaktieren einer Zelle, die ein TWIK-8-Zielmolekül (z.B. ein TWIK-8-Substrat) exprimiert, mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung umfasst, die Aktivität des TWIK-8-Zielmoleküls zu modulieren (z.B. zu stimulieren oder zu inhibieren). Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität eines TWIK-8-Zielmoleküls zu modulieren, kann z.B. durch die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins erreicht werden, das TWIK-8-Zielmolekül zu binden oder mit diesem wechselzuwirken.
Die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins oder eines biologisch aktiven Fragments davon, an ein TWIK-8-Zielmolekül zu binden oder mit diesem wechselzuwirken, kann durch eines der oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der direkten Bindung erreicht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins, an ein TWIK-8-Zielmolekül zu binden oder mit diesem wechselzuwirken, durch die Bestimmung der Aktivität des Zielmoleküls erreicht werden. Die Aktivität des Zielmoleküls kann z.B. durch Detektion der Induktion einer zellulären Reaktion (d.h. Veränderungen in intrazellulären K⁺-Mengen) bestimmt werden, durch Detektion der katalytischen/enymatischen Aktivität des Ziels auf ein geeignetes Substrat, durch Detektion der Induktion eines Reportergens (umfassend ein Ziel-reagierendes Regulationselement, das operativ an eine Nucleinsäure gebunden ist, die für einen detektierbaren Marker kodiert, z.B. Luciferase) oder durch Detektion einer zielregulierten zellulären Reaktion.
Ein Test ist ein zellfreier Test, in dem ein TWIK-8-Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon mit einer Testverbindung kontaktiert wird, und die Fähigkeit der Testverbindung, an das TWIK-8-Protein oder den biologisch aktiven Teil davon zu binden, wird bestimmt. Bevorzugte biologisch aktive Teile der TWIK-8-Proteine, die in Tests vewrendet werden sollen, umfassen Fragmente, die an Wechselwirkungen mit nicht-TWIK-8-Molekülen beteiligt sind, z.B. Fragmente mit hohen Oberflächen-Wahrscheinlichkeitswerten. Die Bindung der Testverbindung an das TWIK-8-Protein kann, wie oben beschrieben, entweder direkt oder indirekt bestimmt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Test das Kontaktieren des TWIK-8-Proteins oder des biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die TWIK-8 bindet, um ein Testgemisch zu bilden, das Kontaktieren des Testgemisches mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem TWIK-8-Protein wechselzuwirken, worin die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit einem TWIK-8-Protein wechselzuwirken, die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, im Vergleich zu der bekannten Verbindung vorzugsweise an TWIK-8 oder biologisch aktive Teile davon zu binden, umfasst.
In einer anderen Ausführungsform ist der Test ein zellfreier Test, in dem ein TWIK-8-Protein oder ein biologisch aktiver Teil davon mit einer Testverbindung kontaktiert wird, und die Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität des TWIK-8-Proteins oder des biologisch aktiven Teils davon zu modulieren (z.B. zu stimulieren oder zu inhibieren), wird bestimmt. Die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität eines TWIK-8-Proteins zu modulieren, kann z.B. durch die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins, an ein TWIK-8-Zielmolekül zu binden, mittels eines der oben beschriebenen Verfahren zur Bestimmung der direkten Bindung erreicht werden. Die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins, an ein TWIK-8-Zielmolekül zu binden, kann ebenso unter Verwendung eines Verfahrens wie z.B. der Echtzeit-Biomolekular-Wechselwirkungsanalyse (BIA) erreicht werden. S. Sjolander und C. Urbaniczky, Anal. Chem. 63, 2338-2345 (1991), und Szabo et al., Curr. Opin. Struct. Biol. 5, 699-705 (1995). Wie hierin verwendet, ist "BIA" ein Verfahren zur Untersuchung biospezifischer Wechselwirkungen in Echtzeit ohne Markierung eines der wechselwirkenden Stoffe (z.B. BIAcore). Veränderungen im optischen Phänomen der Oberflächen-Plasmonresonanz (SPR) können als Indikator für Echtzeit-Reaktionen zwischen biologischen Molekülen verwendet werden.
In einer alternativen Ausführungsform kann die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, die Aktivität eines TWIK-8-Proteins zu modulieren, durch die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins erreicht werden, die Aktivität eines stromab gelegenen Effektors eines TWIK-8-Zielmoleküls weiter zu modulieren. Die Aktivität des Effektormoleküls auf einem geeigneten Ziel kann z.B. bestimmt werden, oder die Bindung des Effektors an ein geeignetes Ziel kann, wie zuvor beschrieben, bestimmt werden.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst der zellfreie Test das Kontaktieren eines TWIK-8-Proteins oder eines biologisch aktiven Teils davon mit einer bekannten Verbindung, die das TWIK-8-Protein bindet, um ein Testgemisch zu bilden, das Kontaktieren des Testgemisches mit einer Testverbindung und das Bestimmen der Fähigkeit der Testverbindung, mit dem TWIK-8-Protein wechselzuwirken, worin die Bestimmung der Fähigkeit der Testverbindung, mit dem TWIK-8-Protein wechselzuwirken, die Bestimmung der Fähigkeit des TWIK-8-Proteins, vorzugsweise an ein TWIK-8-Zielmolekül zu binden oder die Aktivität eines TWIK-8-Zielmoleküls zu modulieren, umfasst.
In mehr als einer Ausführungsform der oben genannten Testverfahren kann es erwünscht sein, entweder TWIK-8 oder dessen Ziel-Molekül zu immobilisieren, um die Trennung von in Komplexen auftretenden Formen von nicht in Komplexen auftretenden Formen eines oder beider der Proteine zu erleichtern sowie um eine Automatisierung des Tests zu ermöglichen. Die Bindung einer Testverbindung an ein TWIK-8-Protein oder die Wechselwirkung eines TWIK-8-Proteins mit einem Zielmolekül in Gegenwart oder in Abwesenheit einer Kandidatenverbindung kann in jedem Gefäß erreicht werden, das geeignet ist, die Reaktanten zu enthalten. Beispiele solcher Gefäße umfassen Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. In einer Ausführungsform kann ein Fusionsprotein bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die es ermöglicht, eines oder beide der Proteine an eine Matrix zu binden. Glutathion-S-Transferase/TWIK-8-Fusionsproteine oder Glutathion-S-Transferase/Ziel-Fusionsproteine z.B. können auf Glutathion-Sepharose-Perlen (Sigma Chemical, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierten Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit der Testverbindung oder der Testverbindung und entweder dem nicht adsorbierten Ziel-Protein oder TWIK-8-Protein kombiniert werden, und das Gemisch wird unter Bedingungen inkubiert, die der Bildung von Komplexen förderlich ist (z.B. unter physiologischen Bedingungen für Salz und pH). Nach der Inkubation werden die Perlen oder die Mikrotiterplattenwells gewaschen, um jegliche ungebundenen Komponenten zu entfernen, die Matrix wird im Falle der Perlen immobilisiert, und der Komplex wird, wie oben beschrieben, z.B. entweder direkt oder indirekt bestimmt. Alternativ dazu können die Komplexe von der Matrix dissoziiert werden, und das Ausmaß der TWIK-8-Bindung oder -Aktivität kann unter Verwendung von Standardverfahren bestimmt werden.
Es können ebenso andere Verfahren zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrizen in den Screening-Tests der Erfindung verwendet werden. Z.B. kann entweder ein TWIK-8-Protein oder ein TWIK-8-Zielmolekül unter Verwendung der Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte TWIK-8-Protein- oder -Ziel-Moleküle können aus Biotin-NHS (N-Hydroxysuccinimid) unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet der Erfindung bekannt sind (z.B. Biotinylierungs-Set, Pierce Chemicals, Rockford, IL), hergestellt werden und in den Wells von Streptavidin-beschichteten 96-Well-Platten (Pierce Chemical) immobilisiert werden. Alternativ dazu können mit TWIK-8-Protein- oder -Ziel-Molekülen reaktive Antikörper, die jedoch nicht die Bindung des TWIK-8-Proteins an dessen Zielmolekül stören, an die Wells der Platte derivatisiert werden, und ungebundenes Ziel- oder TWIK-8-Protein kann in den Wells mittels Antikörper-Konjugation gefangen werden. Verfahren zur Detektion solcher Komplexe, zusätzlich zu jenen, die oben stehend für die GST-immobilisierten Komplexe beschrieben wurden, umfassen die Immunodetektion von Komplexen mittels Antikörper, die mit dem TWIK-8-Protein- oder -Ziel-Molekül reagieren, sowie enzymgebundene Tests, die auf der Detektion einer enzymatischen Aktivität beruhen, die mit dem TWIK-8-Protein oder Ziel-Molekül assoziiert sind.
In einer anderen Ausführungsform werden Modulatoren der TWIK-8-Expression in einem Verfahren identifiziert, worin eine Zelle mit einer Kandidatenverbindung kontaktiert wird, und die Expression der TWIK-8-mRNA oder des TWIK-8-Proteins in der Zelle wird bestimmt. Das Ausmaß der Expression der TWIK-8-mRNA oder des TWIK-8-Proteins in Gegenwart der Kandidatenverbindung wird mit dem Ausmaß der Expression der TWIK-8-mRNA oder des TWIK-8-Proteins in Abwesenheit der Kandidatenverbindung verglichen. Basierend auf diesem Vergleich kann die Kandidatenverbindung danach als ein Modulator der TWIK-8-Expression identifiziert werden. Ist die Expression von TWIK-8-mRNA oder -Protein z.B. in Gegenwart der Kandidatenverbindung höher (statistisch signifikant größer) als in dessen Abwesenheit, so wird die Kandidatenverbindung als ein Stimulator für TWIK-8-mRNA- oder -Protein expression identifiziert. Alternativ dazu wird, wenn die Expression von TWIK-8-mRNA oder -Protein in Gegenwart der Kandidatenverbindung geringer (statistisch signifikant niedriger) als in dessen Abwesenheit ist, die Kandidatenverbindung als ein Inhibitor der TWIK-8-mRNA- oder -Proteinexpression identifiziert. Das Ausmaß der TWIK-8-mRNA- oder -Proteinexpression in den Zellen kann mittels der hierin beschriebenen Verfahren zur Detektion von TWIK-8-mRNA oder -Protein bestimmt werden.
In einem weiteren Aspekt können die TWIK-8-Proteine als „Köder-Proteine" in einem Zwei-Hybrid-Test oder in einem Drei-Hybrid-Test verwendet werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 5.283.317; Zervos et al., Cell 72, 223-232 (1993); Madura et al., J. Biol. Chem. 268, 12046-12054 (1993); Bartel et al., Biotechniques 14, 920-924 (1993); Iwabuchi et al., Oncogene 8, 1693-1696 (1993); und Brent WO 94/10300), um andere Proteine zu identifizieren, die an TWIK-8 binden oder mit diesem wechselwirken („TWIK-8-bindende Proteine" oder „TWIK-8-bp") und in die TWIK-8-Aktivität involviert sind. Diese TWIK-8-bindenden Proteine sind wahrscheinlich auch in die Verbreitung von Signalen durch die TWIK-8-Proteine oder TWIK-8-Ziele involviert, wie z.B. stromab gelegene Elemente eines TWIK-8-vermittelten Signalwegs. Alternativ dazu sind solche TWIK-8-bindenden Proteine wahrscheinlich TWIK-8-Inhibitoren.
Das Zwei-Hybrid-System basiert auf der modularen Natur der meisten Transkriptionsfaktoren, die aus trennbaren DNA-Bindungs- und -Aktivierungs-Domänen bestehen. Kurz gesagt, verwendet der Test zwei verschiedene DNA-Konstrukte. In einem Konstrukt wird das Gen, das für ein TWIK-8-Protein kodiert, an ein Gen fusioniert, das für die DNA-Bindungsdomäne eines bekannten Transkriptionsfaktors kodiert (z.B. GAL-4). In dem anderen Konstrukt wird eine DNA-Sequenz aus einer Bibliothek an DNA-Sequenzen, die für ein unidentifiziertes Protein kodiert („Beute" oder „Probe"), an ein Gen fusioniert, das für die Aktivierungsdomäne des bekannten Transkriptionsfaktors kodiert. Falls die „Köder"- und die „Beute"-Proteine fähig sind, in vivo wechselzuwirken, und einen TWIK-8-abhängigen Komplex bilden, so werden die DNA-Bindungs- und -Aktivierungsdomänen des Transkriptionsfaktors einander stark angenähert. Diese Nähe ermöglicht eine Transkription eines Reportergens (z.B. LacZ), das operabel an eine Transkriptions-Regulationsstelle gebunden ist, die auf den Transkriptionsfaktor reagiert. Die Expression des Reportergens kann detektiert werden, und Zellkolonien, die den funktionellen Transkriptionsfaktor enthalten, können isoliert und verwendet werden, um das klonierte Gen zu erhalten, das für das Protein kodiert, das mit dem TWIK-8-Protein wechselwirkt.
In einem anderen Aspekt betrifft die Offenbarung eine Kombination aus zwei oder mehr der hierin beschriebenen Tests. Ein modulierendes Agens z.B. kann unter Verwendung eines zellbasierten oder eines zellfreien Tests identifiziert werden, und die Fähigkeit des Agens, die Aktivität eines TWIK-8-Proteins zu modulieren, kann in vivo bestätigt werden, z.B. in einem Tier, wie z.B. einem Tiermodell für Schmerz.
B. Detektions-Tests
Teile oder Fragmente der hierin identifizierten cDNA-Sequenzen (und die korrespondierenden kompletten Gensequenzen) können auf zahlreiche Arten als Polynucleotid-Reagenzien verwendet werden. Diese Sequenzen können z.B. verwendet werden, um: (i) ihre jeweiligen Gene auf einem Chromosom zu kartieren und somit Genregionen zu lokalisieren, die mit genetischen Erkrankungen assoziiert sind; (ii) ein Individuum aufgrund einer winzigen biologischen Probe (Gewebetypisierung) zu identifizieren; und (iii) um bei der forensischen Identifikation einer biologischen Probe zu helfen. Diese Anwendungen werden in den unten stehenden Unteraschnitten beschrieben.
C. Beobachtung von Wirkungen während klinischer Versuche
Die Beobachtung des Einflusses von Agenzien (z.B. Wirkstoffen) auf die Expression oder Aktivität eines TWIK-8-Proteins (z.B. die Modulation von Schmerzsignalisierungsmechanismen, Neurotransmitter-Freisetzung und/oder Membran-Reizbarkeit) kann nicht nur auf grundlegendes Wirkstoff-Screening angewandt werden, sondern auch in klinischen Tests. Die durch einen, wie hierin beschriebenen, Screening-Test bestimmte Wirksamkeit eines Agens, die TWIK-8-Genexpression und -Proteinlevels zu steigern oder die TWIK-8-Aktivität hinaufzuregulieren, kann in klinischen Versuchen mit Individuen, die eine verringerte TWIK-8-Genexpression, -Proteinlevels oder hinabregulierte TWIK-8-Aktivität aufweisen, beobachtet werden. Alternativ dazu kann die Wirksamkeit eines durch einen Screening-Test bestimmten Agens, die TWIK-8-Genexpression und -Proteinlevels zu verringern oder die TWIK-8-Aktivität hinabzuregulieren, in klinischen Versuchen mit Individuen, die eine erhöhte TWIK-8-Genexpression, -Proteinlevels oder hinaufregulierte TWIK-8-Aktivität aufweisen, beobachtet werden. In solchen klinischen Versuchen kann die Expression oder die Aktivität eines TWIK-8-Gens, und vorzugsweise anderer Gene, die z.B. in eine TWIK-8-assoziierte Störung verwickelt sind, als „Read-out" oder Marker des Phänotyps einer bestimmten Zelle verwendet werden.
So können z.B., nicht einschränkend, Gene, unter anderem TWIK-8, die in Zellen mittels einer Behandlung mit einem Agens (z.B. Verbindung, Wirkstoff oder kleines Molekül) moduliert werden, das die TWIK-8-Aktivität moduliert (die z.B. in einem Screening-Test, wie oben beschrieben, identifiziert wurde), identifiziert werden. Um also die Wirkungen von Agenzien auf TWIK-8-assoziierte Störungen (z.B. Störungen, die durch eine Deregulierung der Schmerzsignalisierungsmechanismen, der Neurotransmitter-Freisetzung und/oder der Membran-Reizbarkeit charakterisiert sind) zu studieren, können z.B. in einem klinischen Versuch Zellen isoliert werden, und RNA kann hergestellt und auf das Ausmaß der Expression an TWIK-8 und anderen Genen analysiert werden, die in die jeweilige TWIK-8-assoziierte Störung verwickelt sind. Das Ausmaß der Genexpression (z.B. ein Genexpressionsmuster) kann mittels Northern-Blot-Analyse oder RT-PCR, wie hierin beschrieben, quantifiziert werden oder, alternativ dazu, mittels Messung der Menge des produzierten Proteins unter Verwendung eines der hierin beschriebenen Verfahrens oder mittels Messung der Aktivitätslevels von TWIK-8 oder von anderen Genen. Auf diese Art und Weise kann das Genexpressionsmuster als ein Marker dienen, der die physiologische Reaktion der Zellen auf das Agens anzeigt. Dementsprechend kann dieser reaktive Zustand vor und zu verschiedenen Zeitpunkten während der Behandlung des Individuums mit dem Agens bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Beobachtung der Wirksamkeit der Behandlung eines Individuums mit einem Agens (z.B. einem Agonist, Antagonist, Peptidmimetikum, Protein, Peptid, einer Nucleinsäure, einem kleinen Molekül oder einem anderen Wirkstoffkandidat, der durch die hierin beschriebenen Screening-Tests identifiziert wurde) bereit, das folgende Schritte umfasst: (i) das Erhalten einer Vor-Verabreichungs-Probe aus einem Individuum vor der Verabreichung des Agens; (ii) das Detektieren des Ausmaßes der Expression eines TWIK-8-Proteins, einer TWIK-8-mRNA oder genomischen TWIK-8-DNA in der Vor-Verabreichungs-Probe; (iii) das Erhalten einer oder mehrerer Proben nach der Verabreichung an das Subjekt; (iv) das Detektieren des Expressions- oder Aktivitäts-Levels des TWIK-8-Proteins, der TWIK-8-mRNA oder der genomischen TWIK-8-DNA in den Proben nach der Verabreichung; (v) das Vergleichen des Expressions- oder Aktivitätslevels des TWIK-8-Proteins, der TWIK-8-mRNA oder der genomischen TWIK-8-DNA in der Probe vor der Verabreichung mit dem TWIK-8-Protein, der TWIK-8-mRNA oder der genomischen TWIK-8-DNA in der/den Probe(n) nach der Verabreichung und (vi) das dementsprechende Verändern der Verabreichung des Agens an das Individuum. Eine erhöhte Verabreichung des Agens kann z.B. erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von TWIK-8 auf höhere Levels als die detektierten anzuheben, d.h. um die Wirksamkeit des Agens zu steigern. Alternativ dazu kann eine verringerte Verabreichung des Agens erwünscht sein, um die Expression oder Aktivität von TWIK-8 auf niedrigere Levels als die detektierten abzusenken, d.h. um die Wirksamkeit eines Agens zu verringern. Gemäß einer solchen Ausführungsform kann die TWIK-8-Expression oder -Aktivität als ein Indikator der Wirksamkeit eines Agens verwendet werden, sogar in Abwesenheit einer beobachtbaren phänotypischen Reaktion.
D. Therapeutische Verfahren
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulierung der TWIK-8-Expression oder -Aktivität zu therapeutischen Zwecken. Dementsprechend umfasst das Modulationsverfahren der Erfindung das Kontaktieren einer Zelle mit einem TWIK-8 oder einem Agens, das eine oder mehrere der Aktivitäten der TWIK-8- Proteinaktivität, die mit der Zelle assoziiert ist/sind, moduliert. Dieses Agens, das die TWIK-8-Proteinaktivität moduliert, ist ein Antikörper oder ein immunologisch aktiver Teil davon, der selektiv an TWIK-8 bindet. Diese Modulationsverfahren können in vitro (z.B. durch Kultivierung der Zelle mit dem Antikörper) oder, alternativ dazu, in vivo (z.B. durch Verabreichung des Antikörpers an ein Individuum) durchgeführt werden. Als solches stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Behandlung eines Individuums bereit, das unter einer Krankheit oder Störung leidet, die durch eine abnormale oder ungewollte Expression oder Aktivität eines TWIK-8-Proteins oder eines TWIK-8-Nucleinsäuremoleküls charakterisiert ist. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Verabreichung eines Antikörpers.
Die Stimulierung der TWIK-8-Aktivität ist in Situationen erwünscht, in denen TWIK-8 abnormal hinunterreguliert ist und/oder in denen eine erhöhte TWIK-8-Aktivität wahrscheinlich positive Wirkungen besitzt. Ebenso ist eine Inhibierung der TWIK-8-Aktivität in Situationen gewünscht, in denen TWIK-8 abnormal hinaufreguliert ist und/oder in denen eine verringerte TWIK-8-Aktivität wahrscheinlich positive Wirkungen besitzt.
Beispiele
Beispiel 1: Identifikation und Charakterisierung von menschlicher TWIK-8-cDNA
In diesem Beispiel wird die Identifikation und Charakterisierung des Gens beschrieben, das für das menschliche TWIK-8 (Klon Fbh12303) kodiert.
Isolierung der TWIK-8-cDNA
Die Erfindung basiert, zumindest teilweise, auf der Entdeckung eines menschlichen Gens, das für ein neues Protein kodiert, das hierin als TWIK-8 bezeichnet wird. Die gesamte Sequenz des menschlichen Klons Fbh12303 wurde bestimmt, und es wur de herausgefunden, dass sie einen offenen Leseraster enthielt, der als menschliches „TWIK-8" bezeichnet wurde.
Die für das menschliche TWIK-8-Protein kodierende Nucleotidsequenz wird in 1 dargestellt und als Seq.-ID Nr. 1 dargelegt. Das von dieser Nucleinsäure kodierte Protein umfasst etwa 419 Aminosäuren und besitzt die in 1 dargestellte und als Seq.-ID Nr. 2 dargelegte Aminosäuresequenz. Die kodierende Region (offener Leseraster) aus Seq.-ID Nr. 1 wird als Seq.-ID Nr. 3 dargelegt.
Analyse des menschlichen TWIK-8-Moleküls
Die Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 wurde unter Verwendung des Programms PSORT (http://www.psort.nibb.ac.jp) analysiert, um die Lokalisierung der Proteine innerhalb der Zelle zu prognostizieren. Dieses Programm überprüft die Gegenwart verschiedener Targeting- und Lokalisierungs-Aminosäuresequenzen innerhalb der Abfrage-Sequenz. Die Resultate der Analyse zeigen, dass menschliches TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) an das endoplasmatische Retikulum oder das Mitochondrium lokalisiert werden kann.
Eine Analyse der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 unter Verwendung des Signal-P-Programms (Henrik et al., Protein Engineering 10, 1-6 (1997)) identifizierte die Gegenwart eines Signalpeptids von Aminosäuren 1-46 (2).
Es wurde eine Suche gegen die Memsat-Datenbank (3) durchgeführt, die zu der Identifikation von sechs Transmembrandomänen in der Aminosäuresequenz des nativen menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) etwa an den Resten 32-50, 116-137, 144-165, 195-219, 226-242 und 260-283 führte. Diese Suche identifizierte weiters fünf Transmembrandomänen in der Aminosäuresequenz der prognostizierten reifen Form dieses Proteins, etwa an den Resten 70-91, 98-119, 149-173, 180-196 und 214-237. Die Resultate dieser Suche werden in 3 dargelegt.
Es wurde eine Suche gegen die HMM-Datenbank (4) durchgeführt, die zu der Identifikation einer „Sieben-Transmembranrezeptordomäne" etwa von den Resten 25-244 und einer „zyklischen nucleotidgesteuerten Kanaldomäne" etwa von den Resten 27-204 in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2) führte.
Es wurde ebenso eine Suche gegen die ProDom-Datenbank (5) durchgeführt, die zu der Identifikation von „TRAAK-Kaliumkanaldomänen" etwa von den Resten 50-104 (Score = 175), 175-199 (Score = 115) und 288-382 (Score = 135) führte; einer „Kaliumkanalproteindomäne" etwa von den Resten 99-153 (Score = 101); einer „spannungsgesteuerten Kaliumkanaldomäne" etwa von den Resten 102-168 (Score = 115); einer „nach außen gerichteten Rektifizier-TOK1-Kaliumkanaldomäne" etwa von den Resten 215-270 (Score = 70); und einer „Kaliumkanal-Untereinheitsdomäne" etwa von den Resten 216-287 (Score = 156) in der Aminosäuresequenz des menschlichen TWIK-8 (Seq.-ID Nr. 2).
Eine BLASTX-2.0.-Suche gegen die NRP/Protot-Datenbank unter Verwendung eines Scores von 100, einer Wortlänge von 3 und einer Blosum-62-Matrix (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403 (1990)) der translatierten Nucleotidsequenz des menschlichen TWIK-8 zeigte, dass menschliches TWIK-8 eine limitierte Sequenzhomologie gegenüber Mus-musculus-TRAAK-K+-Kanal-Untereinheit-mRNA besitzt (Zugriffsnr. AF056492), gegenüber Homo-sapiens-TREK-1-Kaliumkanal(KCNK2)-mRNA (Zugriffsnr. AF129399), gegenüber Mus-musculus-TREK-1-K+-Kanal-Untereinheit-mRNA (Zugriffsnr. U73488) und gegenüber zweiporiger Homo-sapiens-Kaliumkanal-TPKC1-mRNA (Zugriffsnr. AF004711).
Gewebeverteilung von TWIK-8-mRNA mittels PCR und In-situ-Hybridisierung
Die Gewebeverteilung der TWIK-8-mRNA wird mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf cDNA-Bibliotheken normaler menschlicher Gewebe unter Verwendung von Oligonucleotidprimern basierend auf der menschlichen TWIK-8-Sequenz bestimmt.
Die Gewebeverteilung der TWIK-8-mRNA wird ebenso unter Verwendung der In-situ-Hybridisierung bestimmt. Für die In-situ-Analyse werden zuerst verschiedene Gewebe, z.B. Gewebe, die aus dem Gehirn erhalten wurden, auf Trockeneis gefroren. Zehn Mikrometer dicke Schnitte der Gewebe werden mit 4 % Formaldehyd in DEPC-behandelter, 1X-phosphatgepufferter Salzlösung bei Raumtemperatur 10 Minuten lang nachfixiert, bevor sie zwei Mal in DEPC-1X-phosphatgepufferter Salzlösung und einmal in 0,1 M Triethanolamin-HCl (pH 8,0) gespült werden. Nach der Inkubation in 0,25 % Essigsäureanhydrid/0,1 M Triethanolamin-HCl 10 Minuten lang werden Schnitte in DEPC 2X SSC (1X SSC ist 0,15 M NaCl plus 0,015 M Natriumcitrat) gespült. Das Gewebe wird anschließend durch eine Reihe an Ethanol-Waschschritten dehydriert, in 100 % Chloroform 5 Minuten lang inkubiert und danach in 100 % Ethanol 1 Minute lang und in 95 % Ethanol 1 Minute lang gespült und lufttrocknen gelassen.
Die Hybridisierungen werden mit ³⁵S-radiomarkierten (5 × 10⁷ cpm/ml) cRNA-Sonden durchgeführt. Die Sonden werden in Gegenwart einer Lösung, die 600 mM NaCl, 10 mM Tris (pH 7,5), 1 mM EDTA, 0,01 % gescherte Lachsspermien-DNA, 0,01 % Hefe-tRNA, 0,05 % vollständige Hefe-RNA vom Typ X1, 1X-Denhardt-Lösung, 50 % Formamid, 10 % Dextransulfat, 100 mM Dithiothreit, 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS) und 0,1 % Natriumthiosulfat enthält, 18 Stunden lang bei 55 °C inkubiert.
Nach der Hybridisierung werden die Objektträger mit 2X SSC gewaschen. Schnitte werden danach sequentiell bei 37 °C in TNE (einer Lösung, die 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 500 mM NaCl und 1 mM EDTA enthält) 10 Minuten lang, in TNE mit 10 μg RNase A pro ml für eine Zeitspanne von 30 Minuten, und schließlich 10 Minuten lang in TNE inkubiert. Die Objektträger werden anschließend mit 2X SSC bei Raumtemperatur abgespült, mit 2X SSC bei 50 °C 1 Stunde lang gewaschen, mit 0,2X SSC bei 55 °C 1 Stunde lang gewaschen und mit 0,2X SSC bei 60 °C 1 Stunde lang gewaschen. Die Schnitte werden anschließend schnell durch serielle Ethanol/0,3 M Natriumacetat-Konzentrationen dehydriert, bevor sie luftgetrocknet werden, und 24 Stunden lang gegenüber einem Kodak-Biomax-MR-Scientific-Imaging-Film ausgesetzt und schließlich in NB-2-Photoemulsion getaucht und 7 Tage lang 4 °C ausgesetzt, bevor sie entwickelt und gegen-gefärbt werden.
Gewebeverteilung von menschlicher TWIK-8-mRNA mittels Taqman^TM-Analyse
Dieses Beispiel beschreibt die Gewebeverteilung menschlicher TWIK-8-mRNA in einer Vielzahl an Zellen und Geweben, wie sie unter Verwendung des TaqMan^TM-Verfahrens bestimmt wird. Das TaqMan^TM-Verfahren ist ein quantitativer, auf Umkehrtranskriptions-PCR basierender Ansatz zur Detektion von mRNA. Die RT-PCR-Reaktion nützt die 5'-Nucleaseaktivität von AmpliTaq-Gold^TM-DNA-Polymerase, um eine TaqMan^TM-Sonde während der PCR zu spalten. Kurz gesagt, wurde die cDNA aus den Proben von Interesse erzeugt, z.B. aus verschiedenen menschlichen Gewebeproben, und als Ausgangsmaterial für die PCR-Amplifikation verwendet. Zusätzlich zu den genspezifischen 5'- und den 3'-Primern wurde eine genspezifische Oligonucleotidsonde (komplementär zu der zu amplifizierenden Region) in die Reaktion inkludiert (d.h. die Taqman^TM-Sonde). Die TaqMan^TM-Sonde umfasst das Oligonucleotid mit einer fluoreszierenden Reporterfarbe, die kovalent an das 5'-Ende der Sonde gebunden ist (wie z.B. FAM (6-Carboxyfluorescein), TET (6-Carboxy-4,7,2',7'-Tetrachlorfluorescein), JOE (6-Carboxy-4,5-dichlor-2,7-dimethoxyfluorescein) oder VIC), und einer Quencher-Farbe (TAMRA (6-Carboxy-N,N,N',N'-Tetramethylrhodamin)) am 3'-Ende der Sonde.
Während der PCR-Reaktion trennt eine Spaltung der Sonde die Reporterfarbe und die Quencher-Farbe, was zu einer erhöhten Fluoreszenz des Reporters führt. Eine Akkumulation der PCR-Produkte wird direkt durch eine Beobachtung der Steigerung der Fluoreszenz der Reporterfarbe detektiert. Ist die Sonde intakt, so führt die Nähe der Reporterfarbe zu der Quencher-Farbe zu einer Suppression der Reporterfluoreszenz. Während der PCR findet ein spezifisches Annealing zwischen den Vorwärts- und den Rückwärtsprimerstellen statt, falls das Ziel von Interesse vorhanden ist. Die 5'-3'-nucleolytische Aktivität der AmpliTaq^TM-Gold-DNA-Polymerase spaltet die Son de zwischen dem Reporter und dem Quencher nur, wenn die Sonde an das Ziel hybridisiert. Die Sondenfragmente werden anschließend aus dem Ziel verdrängt und die Polymerisation des Strangs geht weiter. Das 3'-Ende der Sonde wird blockiert, um eine Extension der Sonde während der PCR zu verhindern. Dieser Prozess ist in jedem Zyklus zu finden und stört die exponentielle Akkumulation des Produkts nicht. RNA wurde unter Verwendung des Trizolverfahrens hergestellt und mit DNase behandelt, um kontaminierende genomische DNA zu entfernen. cDNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren synthetisiert. Eine Schein-cDNA-Synthese in Abwesenheit von reverser Transkriptase führte zu Proben ohne detektierbare PCR-Amplifikation des Kontrollgens, was eine effiziente Entfernung der genomischen DNA-Kontamination bestätigt.
Die höchste Expression von TWIK-8-mRNA wurde in der Cortex detektiert, gefolgt von dorsalen Wurzelganglien und dem Hypothalamus. Eine schwache Expression wurde ebenso in erythroidem Gewebe detektiert, gefolgt von HUVEC, Rückenmark, Hämangiom, Niere, normalem Eierstock und Eierstocktumor, Megakaryozyten, normaler Prostata und Prostatatumor. Eine schwache Expression wurde ebenso in Brusttumoren detektiert, obwohl keine Expression in normalem Brustgewebe detektiert wurde.
Beispiel 2: Expression von rekombinantem TWIK-8-Protein in bakteriellen Zellen
In diesem Beispiel wird TWIK-8 als ein rekombinantes Glutathion-S-Transferase-(GST-) Fusionspolypeptid in E. coli exprimiert, und das Fusionspolypeptid wird isoliert und charakterisiert. Genauer gesagt, wird TWIK-8 an GST fusioniert, und dieses Fusionspolypeptid wird in C. coli exprimiert, z.B. Stamm PEB199. Die Expression des GST-TWIK-8-Fusionsproteins in PEB199 wird mit IPTG induziert. Das rekombinante Fusionspolypeptid wird von unbehandelten bakteriellen Lysaten des induzierten PEB199-Stamms mittels Affinitätschromatographie auf Glutathionperlen gereinigt. Unter Verwendung der Polyacrylamidgelelektrophorese-Analyse des von den bakteriellen Lysaten gereinigten Polypeptids wird das Molekulargewicht des resultierenden Fusionspolypeptids bestimmt.
Beispiel 3: Expression von rekombinantem TWIK-8-Protein in COS-Zellen
Um das TWIK-8-Gen in COS-Zellen zu exprimieren, wird der pcDNA/Amp-Vektor der Invitrogen Corporation (San Diego, CA) verwendet. Dieser Vektor enthält einen SV40-Replikationsstartpunkt, ein Ampicillin-Resistenzgen, einen E.-coli-Replikationsursprung, einen CMV-Promotor, gefolgt von einer Polylinker-Region, und ein SV40-Intron sowie eine Polyadenylierungsstelle. Ein für das gesamte TWIK-8-Protein kodierendes DNA-Fragment und eine HA-Markierung (Wilson et al., Cell 37, 767 (1984)) oder eine FLAG-Markierung, das/die im Leseraster an sein/ihr 3'-Ende des Fragments fusioniert ist, wird in die Polylinker-Region des Vektors kloniert, wodurch die Expression des rekombinanten Proteins unter die Kontrolle des CMV-Promotors gestellt wird.
Um das Plasmid zu konstruieren, wird die TWIK-8-DNA-Sequenz mittels PCR unter Verwendung von zwei Primern amplifiziert. Der 5'-Primer enthält die Restriktionsstelle von Interesse, gefolgt von etwa zwanzig Nucleotiden der für TWIK-8 kodierenden Sequenz, beginnend beim Initiationscodon; die 3'-Ende-Sequenz enthält komplementäre Sequenzen zu der anderen Restriktionsstelle von Interesse, ein Translationsstoppcodon, die HA-Markierung oder FLAG-Markierung und die letzten 20 Nucleotide der für TWIK-8 kodierenden Sequenz. Das PCR-amplifizierte Fragment und der pCDNA/Amp-Vektor werden mit den geeigneten Restriktionsenzymen verdaut, und der Vektor wird unter Verwendung des CIAP-Enzyms dephosphoryliert (New England Biolabs, Beverly, MA). Vorzugsweise sind die zwei ausgewählten Restriktionsstellen verschieden, sodass das TWIK-8-Gen in der korrekten Ausrichtung insertiert wird. Das Ligationsgemisch wird in E.-coli-Zellen transformiert (Stämme HB101, DH5α, SURE, erhältlich bei Strategene Cloning Systems, La Jolla, CA, können verwendet werden), die transformierte Kultur wird auf Ampicillinmediumplatten ausplattiert, und resistente Kolonien werden ausgewählt. Plasmid-DNA wird aus den Trans formanten isoliert und mittels Restriktionsanalyse auf die Gegenwart des korrekten Fragments untersucht.
COS-Zellen werden anschließend mit der TWIK-8-pcDNA/Amp-Plasmid-DNA unter Verwendung der Kalziumphosphat- oder Kalziumchlorid-Copräzipitationsverfahren, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion oder Elektroporation transfiziert. Andere geeignete Verfahren zur Transfektion von Wirtszellen sind in J. Sambrook, E.F. Fritsh und T. Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989), zu finden. Die Expression des TWIK-8-Polypeptids wird mittels Radiomarkierung (³⁵S-Methionin oder ³⁵S-Cystein, erhältlich bei NEN, Boston, MA, können verwendet werden) und Immunopräzipitation (E. Harlow und D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)) unter Verwendung eines HA-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert. Kurz gesagt, werden die Zellen 8 Stunden lang mit ³⁵S-Methionin (oder ³⁵S-Cystein) markiert. Die Kulturmedien werden anschließend gesammelt, und die Zellen werden unter Verwendung von Detergenzien (RIPA-Puffer, 150 mM NaCl, 1 % NP-40, 0,1 % SDS, 0,5 % DOC, 50 mM Tris, pH 7,5) lysiert. Sowohl das Zelllysat als auch die Kulturmedien werden mit einem HA-spezifischen monoklonalen Antikörper gefällt. Gefällte Polypeptide werden danach mittels SDS-PAGE analysiert.
Alternativ dazu wird die die für TWIK-8 kodierende Sequenz enthaltende DNA unter Verwendung der geeigneten Restriktionsstellen direkt in den Polylinker des pCDNA/Amp-Vektors kloniert. Das resultierende Plasmid wird auf die oben beschriebene Art und Weise in COS-Zellen transfiziert, und die Expression des TWIK-8-Polypeptids wird mittels Radiomarkierung und Immunopräzipitation unter Verwendung eines TWIK-8-spezifischen monoklonalen Antikörpers detektiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nucleinsäuremolekül, aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt: (a) Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 umfasst; (b) Nucleinsäuremolekül, das die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 3 umfasst; (c) isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, das die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (d) isoliertes Nucleinsäuremolekül, das für eine natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids kodiert, das die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst; (e) Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz, die zu zumindest 95 mit der Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 identisch ist, oder ein Komplement davon umfasst; und (f) Nucleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid kodiert, welches eine zu zumindest 95 % mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 identische Aminosäuresequenz umfasst.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das eine Nucleotidsequenz umfasst, die zur Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 komplementär ist.
Isoliertes Nucleinsäuremolekül, das ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 und eine für ein heterologes Polypeptid kodierende Nucleotidsequenz umfasst.
Vektor, ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 umfassend, worin der Vektor gegebenenfalls ein Expressionsvektor ist.
Wirtszelle, die mit einem Expressionsvektor nach Anspruch 4 transfiziert ist.
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids, umfassend das Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 5 in einem geeigneten Kulturmedium, um so das Polypeptid herzustellen.
Isoliertes Polypeptid, aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt: a) natürlich vorkommende Allelvariante eines Polypeptids, welche die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst, worin für das Polypeptid ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das unter stringenten Bedingungen an ein Nucleinsäuremolekül hybridisiert, das aus Seq.-ID Nr. 1 oder 3 besteht; b) Polypeptid, für das ein Nucleinsäuremolekül kodiert, das eine zu zumindest 95 % mit einer die Nucleotidsequenz der Seq.-ID Nr. 1 oder 3 umfassenden Nucleinsäure identische Nucleotidsequenz umfasst, und worin das Polypeptid eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu zumindest 95 % mit der Aminosäure der Seq.-ID Nr. 2 identisch ist; c) Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu zumindest 95 mit der Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 identisch ist; und d) Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der Seq.-ID Nr. 2 umfasst.
Polypeptid nach Anspruch 7, weiters heterologe Aminosäuresequenzen umfassend.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon, der selektiv an ein Polypeptid nach Anspruch 7 bindet.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 9, der aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) polyklonale Antikörper; (b) monoklonale Antikörper; (c) F(ab)-Fragmente; und (d) F(ab')2-Fragmente.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 9 oder 10, der aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) humanisierte Antikörper; und (b) chimäre Antikörper.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach einem der Ansprüche 9 bis 11, der an eine detektierbare Substanz, therapeutische Gruppierung oder einen zweiten Antikörper gebunden ist.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 12, worin die detektierbare Substanz aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) Enzyme; (b) prosthetische Gruppen; (c) fluoreszierende Materialien; (d) lumineszierende Materialien; (e) biolumineszierende Materialien; und (f) radioaktive Materialien.
Antikörper oder immunologisch aktiver Teil davon nach Anspruch 12, worin die therapeutische Gruppierung aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: (a) Zytotoxine; (b) therapeutische Wirkstoffe; und (c) radioaktive Metallionen.
Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Polypeptids nach Anspruch 7 in einer Probe, umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einem Antikörper, der selektiv an das Polypeptid bindet; und b) das Bestimmen, ob der Antikörper an das Polypeptid in der Probe bindet, um die Gegenwart eines Polypeptids nach Anspruch 7 zu detektieren.
Set, einen Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 11 und Gebrauchsanleitungen umfassend.
Verfahren zur Detektion der Gegenwart eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 in einer Probe, umfassend: a) das Kontaktieren der Probe mit einer Nucleinsäuresonde oder einem Primer, die/der selektiv an das Nucleinsäuremolekül hybridisiert; und b) das Bestimmen, ob die Nucleinsäuresonde oder der Primer an ein Nucleinsäuremolekül in der Probe bindet, um so die Gegenwart eines Nucleinsäuremoleküls nach Anspruch 1 in der Probe zu detektieren; worin die Probe gegebenenfalls mRNA-Moleküle umfasst und mit einer Nucleinsäuresonde kontaktiert wird.
Verwendung einer Nucleinsäuresonde oder eines Primers, die/der selektiv an ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 hybridisiert, um ein Nucleinsäuremolekül nach Anspruch 1 zu identifizieren.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, die an ein Polypeptid nach Anspruch 7 hybridisiert, umfassend: a) das Kontaktieren des Polypeptids oder einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert, mit einer Testverbindung; und b) das Bestimmen, ob das Polypeptid an die Testverbindung bindet, worin die Bindung zwischen der Testverbindung und dem Polypeptid gegebenenfalls durch ein Verfahren detektiert wird, das aus der aus Folgendem bestehenden Gruppe ausgewählt ist: i) Detektion einer Bindung durch direkte Detektion einer Testverbindung/Polypeptid-Bindung; ii) Detektion einer Bindung unter Einsatz eines Konkurrenzbindungstests; und iii) Detektion einer Bindung unter Einsatz eines Tests für TWIK-8-Aktivität.
In-vitro-Verfahren zur Modulation der Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7, umfassend das Kontaktieren des Polypeptids oder einer Zelle, die das Polypeptid exprimiert, mit einem Antikörper nach einem der Ansprüche 9 bis 11, der an das Po lypeptid bindet, in ausreichender Konzentration, um die Aktivität des Polypeptids zu modulieren.
In-vitro-Verfahren zur Modulation der Expression einer Nucleinsäure nach Anspruch 1, umfassend das Kontaktieren der Nucleinsäure oder einer Zelle, welche die Nucleinsäure exprimiert, mit einer Antisense-Nucleinsäure oder einem Ribozym, die/das an die Nucleinsäure bindet, um so die Aktivität der Nucleinsäure zu modulieren.
Verfahren zur Identifikation einer Verbindung, welche die Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 moduliert, umfassend: a) das Kontaktieren eines Polypeptids nach Anspruch 7 mit einer Testverbindung; und b) das Bestimmen der Wirkung der Testverbindung auf die Fähigkeit des Polypeptids, eine kaliumkanalvermittelte Aktivität zu modulieren, um so eine Verbindung zu identifizieren, welche die Aktivität des Polypeptids moduliert.