WO2002022823A2 - An der stressantwort beteiligte proteine und dafür codierende gene aus ashbya gossypii - Google Patents

An der stressantwort beteiligte proteine und dafür codierende gene aus ashbya gossypii Download PDF

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WO2002022823A2
WO2002022823A2 PCT/EP2001/010573 EP0110573W WO0222823A2 WO 2002022823 A2 WO2002022823 A2 WO 2002022823A2 EP 0110573 W EP0110573 W EP 0110573W WO 0222823 A2 WO0222823 A2 WO 0222823A2
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nucleic acid
protein
acid molecule
cell
amino acid
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Henning ALTHÖFER
Jose L. Revuelta Doval
Maria Santos
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Basf Aktiengesellschaft
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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi

Definitions

  • the invention relates to novel nucleic acid molecules that can be used to identify or classify Ashbya gossypii or related types of microorganisms.
  • A. gossypii is a filamentous fungus that can be used in industry for large-scale production of a number of fine chemicals.
  • the nucleic acid molecules can therefore be used to identify microorganisms which can be used for the production of fine chemicals, for example by fermentation processes.
  • Certain products and by-products of naturally occurring metabolic processes in cells are suitable for many industries, including the food, feed, cosmetic and pharmaceutical industries.
  • These molecules collectively referred to as "fine chemicals", include organic acids, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, nucleotides and nucleosides, lipids and fatty acids, diols, carbohydrates, aromatic compounds, vitamins and cofactors, and enzymes. They are best produced by growing large-scale microorganisms that have been developed to produce and secrete large quantities of the desired molecule.
  • a suitable organism for this purpose is Ashbya gossypii, a filamentous fungus. Through strain selection, a number of mutant strains have been developed that produce a range of desirable compounds. However, selecting strains that are improved in the production of a particular molecule is a time consuming and difficult process.
  • the new nucleic acid molecules encode proteins that are referred to here as stress response, DNA repair and detoxification proteins (SA proteins).
  • SA proteins have, for example, a function in protecting the cell from harmful external influences (for example radical formation, osmotic stress, etc.) as found in fermenters in A. gossypii. Due to the availability of cloning vectors which can be used in Ashbya gossypii, such as, for example, disclosed in Wright and Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., And of techniques for the genetic manipulation of A.
  • the nucleic acid molecules according to the invention can be used for the genetic manipulation of this organism in order to produce it of one or more fine chemicals to make them better and more efficient.
  • This improved production or efficiency of the production of a fine chemical can take place due to a direct effect of the manipulation of a gene according to the invention or due to an indirect effect of such a manipulation.
  • the mutagenesis of one or more SA proteins according to the invention can also lead to SA proteins with changed activities which indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals from A. gossypii.
  • the concentration of radicals reduced by SA proteins can maintain the function of essential metabolic processes, since radicals generally attack and inactivate proteins.
  • these processes also include the structure of the cell walls, transcription, translation, and the biosynthesis of compounds that are necessary for the growth and division of cells (e.g. nucleotides, amino acids, vitamins, lipids, etc.) (Lengeier et al. (1999)).
  • This invention provides new nucleic acid molecules which encode the proteins referred to here as SA proteins, which can, for example, perform a function which is involved in the stress response and thus in cellular protective mechanisms in Ashbya gossypii.
  • Nucleic acid molecules that encode an SA protein are referred to here as SA nucleic acid molecules.
  • SA protein is used in DNA repair, detoxification and the general stress response. Examples of such proteins are those encoded by the genes shown in Table 1.
  • nucleic acid molecules for example cDNAs
  • isolated nucleic acid molecules comprising a nucleotide sequence which encodes an SA protein or biologically active sections thereof, and also nucleic acid fragments which can be used as primers or hybridization probes for the detection or for the amplification of SA coding nucleic acid (for example. DNA or iuRNA) are suitable.
  • the isolated nucleic acid molecule comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A or the coding region of one of these nucleotide sequences or a complement thereof.
  • the isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleotide sequence which hybridizes to a nucleotide sequence specified in Appendix A or at least about 80%, preferably at least about 85%, more preferably at least about 90% and even more preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more identical to it, or a portion thereof.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes one of the amino acid sequences listed in Appendix B.
  • the preferred SA proteins according to the invention likewise preferably have at least one of the SA activities described here.
  • the isolated nucleic acid molecule encodes a protein or a portion thereof, the protein or its portion containing an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence in Appendix B, for example to an amino acid sequence in Appendix B, is sufficiently identical that the protein or its portion retains SA activity.
  • the protein or portion thereof encoded by the nucleic acid molecule retains the ability to perform a function in Ashbya gossypii involved in stress response, detoxification or DNA repair.
  • the protein encoded by the nucleic acid molecule is at least about 80%, preferably at least about 85%, and more preferably at least about 90%, and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98% or 99% or more identical to an amino acid sequence in Appendix B (for example a complete amino acid sequence selected from the sequences mentioned in Appendix B).
  • the protein is a full-length A. gossypii protein which forms a complete amino acid sequence in Appendix B (that of a encoded open reading frame shown in Appendix A) is substantially homologous.
  • the isolated nucleic acid molecule comes from A. gossypii and encodes a protein (eg an SA fusion protein) which comprises a biologically active domain which is at least about 80% or more homologous to one of the amino acid sequences in Appendix B and can perform a function involved in DANN repair, detoxification or stress response through processes such as radical interception in Ashbya gossypii or has one or more of the activities listed in Table 1, and also contains heterologous nucleic acid sequences that contain a heterologous polypeptide or regulatory Code areas.
  • a protein eg an SA fusion protein
  • a biologically active domain which is at least about 80% or more homologous to one of the amino acid sequences in Appendix B and can perform a function involved in DANN repair, detoxification or stress response through processes such as radical interception in Ashbya gossypii or has one or more of the activities listed in Table 1, and also contains heterologous nucleic acid sequences that contain a heterologous poly
  • the isolated nucleic acid molecule is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions to a nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the isolated nucleic acid molecule preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • the isolated nucleic acid more preferably encodes a naturally occurring A. gossypii SA protein or a biologically active portion thereof.
  • Another aspect of the invention relates to vectors, for example recombinant expression vectors which contain the nucleic acid molecules according to the invention, and host cells into which these vectors have been introduced.
  • this host cell is used to produce an SA protein by growing the host cell in a suitable medium. The SA protein can then be isolated from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to a genetically modified microorganism in which an SA gene has been introduced or modified.
  • the genome of the microorganism has been changed by introducing a nucleic acid molecule according to the invention which encodes the SA wild-type or the mutated SA sequence as a transgene.
  • an endogenous SA gene in the genome of the microorganism has been changed, for example functionally disrupted, by homologous recombination with an altered SA gene.
  • the microorganism belongs to the genus Eremothecium / Ashbya, with Ashbya gossypii being particularly preferred.
  • the microorganism is also used to produce a desired compound, used as a vitamin, with riboflavin being particularly preferred.
  • an isolated SA protein or a section for example a biologically active section thereof.
  • the isolated SA protein or its section can perform a function involved in detoxification, DNA repair or stress response in Ashbya gossypii.
  • the isolated SA protein or a portion thereof is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B that the protein or its portion retains the ability to participate in a stress response through processes such as radical removal Function in Ashbya gossypii.
  • the invention also relates to an isolated SA protein preparation.
  • the SA protein comprises an amino acid sequence from Appendix B.
  • the invention relates to an isolated full-length protein which essentially forms a complete amino acid sequence from Appendix B (which is encoded by an open reading frame in Appendix A) is homologous.
  • the protein is at least about 50%, preferably at least about 60%, more preferably at least about 70%, 80% or 90% and most preferably at least about 95%, 96%, 97%, 98%, or 99% or even more homologous to a complete amino acid sequence from Appendix B.
  • the isolated SA protein comprises an amino acid sequence which is at least about 50% or more homologous to one of the amino acid sequences from Appendix B and one to the stress response , DNA repair, or detoxification through processes such as radical trapping, may have an involved function in Ashbya gossypii, or may have one or more of the activities listed in Table 1.
  • the SA polypeptide or a biologically active portion thereof can be operably linked to a non-SA polypeptide to form a fusion protein.
  • this fusion protein has a different activity than the SA protein alone.
  • this fusion protein performs a function in Ashbya gossypii involved in stress response, DNA repair or detoxification through processes such as radical trapping.
  • the integration of this fusion protein into a host cell modulates the production of a desired compound from the cell in particularly preferred embodiments.
  • Another aspect of the invention relates to a method for producing a fine chemical. The method provides for the cultivation of a cell which contains a vector which effects the expression of an SA nucleic acid molecule according to the invention, so that a fine chemical is produced.
  • this method further comprises the step of obtaining a cell which contains such a vector, the cell being transfected with a vector which brings about the expression of an SA nucleic acid.
  • this method also comprises the step in which the fine chemical is obtained from the culture.
  • the cell belongs to the genus Eremothecium / Ashbya or is selected from the strains shown in Table 2.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the production of a molecule from a microorganism. These methods involve contacting the cell with a substance that modulates SA protein activity or SA nucleic acid expression so that a cell-associated activity is changed compared to the same activity in the absence of the substance.
  • the cell is modulated for one or more processes involved in stress response, DNA repair, or detoxification, such as radical trapping, so that the yield or speed of production of a desired fine chemical by this microorganism is improved.
  • the substance that modulates SA protein activity can be a substance that stimulates SA protein activity or SA nucleic acid expression. Examples of substances that stimulate SA protein activity or SA nucleic acid expression include small molecules, active SA proteins, and nucleic acids that encode SA proteins and have been introduced into the cell. Examples of substances that inhibit SA activity or expression include small molecules and SA antisense nucleic acid molecules.
  • Another aspect of the invention relates to methods for modulating the yields of a desired compound from a cell, comprising introducing into a cell a wild-type or mutant SA gene that either remains on a separate plasmid or is integrated into the genome of the host cell.
  • the integration into the genome can be random or by homologous recombination, so that the native gene is replaced by the integrated copy, which causes the production of the desired compound from the cell to be modulated.
  • these yields are increased.
  • the chemical is a fine chemical, which in a particularly preferred embodiment is a vitamin. In a particularly preferred embodiment, this vitamin is riboflavin.
  • the present invention provides SA nucleic acid and protein molecules that are involved in stress response, DNA repair, or detoxification through processes such as radical trapping in Ashbya gossypii.
  • the molecules according to the invention can either be used directly (for example if the prolonged viability of the cell has a direct effect on the yield, production and / or efficiency of the production of, for example, pyruvate from modified A .
  • fine chemical is known in the art and includes molecules that are produced by an organism and are used in various industries, such as, but not limited to, the pharmaceutical, agricultural, and cosmetic industries. These compounds include organic acids such as tartaric acid, itaconic acid and diaminopimelic acid, both proteinogenic and non-proteinogenic amino acids, purine and pyrimidine bases, nucleosides and
  • Nucleotides (as described, for example, in Kuninaka, A. (1996) Nucleotides and related compounds, pp. 561-612, in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim and the quotes contained therein), Lipids, saturated and unsaturated fatty acids (e.g. arachidonic acid), diols (e.g. propanediol and butanediol), carbohydrates (e.g. hyaluronic acid and trehalose), aromatic compounds (e.g. aromatic amines, vanillin and indigo), vitamins and cofactors (as described in Ull ann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A27, "Vitamins", pp.
  • saturated and unsaturated fatty acids e.g. arachidonic acid
  • diols e.g. propanediol and butanediol
  • carbohydrates e.g. hyaluronic acid and trehalose
  • Vitamins, cofactors and nutraceuticals comprise a group of molecules. Higher animals have lost the ability to synthesize them and must therefore absorb them, although they are easily synthesized by other organisms such as bacteria. These molecules are either biologically active molecules per se or precursors of biologically active substances that serve as electron carriers or intermediates in a number of metabolic pathways. In addition to their nutritional value, these compounds also have a significant industrial value as dyes, antioxidants and catalysts or other processing aids. (For an overview of the structure, activity and the industrial applications of these compounds, see, for example, Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Vol. A27, pp. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). The term “vitamin” is known in the art and encompasses nutrients which are required by an organism for normal function, but which cannot be synthesized by this organism itself. The group of vitamins can
  • Cofactors and nutraceutical compounds include.
  • the term "cofactor” includes non-proteinaceous compounds that are necessary for normal enzyme activity to occur. These compounds can be organic or inorganic; the cofactor molecules according to the invention are preferably organic.
  • the term “nutraceutical” encompasses food additives which are beneficial to plants and animals, in particular humans. Examples of such molecules are vitamins, antioxidants and also certain lipids (e.g. polyunsaturated fatty acids).
  • Thiamine (vitamin Bi) is formed by chemical coupling of pyrimidine and thiazole units.
  • Riboflavin (vitamin B) is synthesized from guanosine 5 'triphosphate (GTP) and ribose 5' phosphate. Riboflavin in turn is used to synthesize flavin mononucleotide (FMN) and flavin adenine dinucleotide (FAD).
  • the family of compounds commonly referred to as "Vitamin Bg” e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5'-phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Vitamin Bg e.g. pyridoxine, pyridoxamine, pyridoxal 5'-phosphate and the commercially used pyridoxine hydrochloride
  • Panthothenate (pantothenic acid, R- (+) -N- (2, 4-di-hydroxy-3, 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanine) can be produced either by chemical synthesis or by fermentation.
  • the final steps in pantothenate biosynthesis consist of the ATP-driven condensation of ß-alanine and pantoic acid.
  • the enzymes responsible for the biosynthetic steps for the conversion into pantoic acid, into ß-alanine and for the condensation into pantothenic acid are known.
  • the metabolically active form of pantothenate is coenzyme A, whose biosynthesis takes place over 5 enzymatic steps.
  • Pantothenate pyridoxal-5 '-phosphate, cysteine and ATP are the precursors of coenzyme A. These enzymes not only catalyze the formation of pantothenate, but also the production of (R) -pantoic acid, (R) -pantolactone, (R) - Panthenol (provitamin B 5 ), Pantethein (and its derivatives) and coenzyme A.
  • Lipoic acid is derived from octanoic acid and serves as a coenzyme in energy metabolism, where it becomes part of the pyruvate dehydrogenase complex and the ⁇ -ketoglutarate dehydrogenase complex.
  • Folates are a group of substances that are all derived from folic acid, which in turn is derived from L-glutamic acid, p-aminobenzoic acid and 6-methyl-pterine.
  • folic acid and its derivatives have been extensively investigated in certain microorganisms.
  • Corrinoids such as the cobalamins and especially vitamin B ⁇ 2
  • the porphyrins belong to a group of chemicals that are characterized by a tetrapyrrole ring system.
  • the biosynthesis of vitamin B] _ 2 is sufficiently complex that it has not been fully characterized, but a large part of the enzymes and substrates involved is now known.
  • Nicotinic acid (nicotinate) and nicotinamide are pyridine derivatives, which are also called "niacin".
  • Niacin is the precursor of the important coenzymes NAD (nicotinamide adenine dinucleotide) and NADP (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) and their reduced forms.
  • amino acids comprise the basic structural units of all proteins and are therefore essential for normal cell functions in all organisms.
  • amino acid is known in the art.
  • the proteinogenic amino acids of which there are 20 species, serve as structural units for proteins in which they are linked to one another via peptide bonds, whereas the non-proteinogenic amino acids (of which hundreds are known) are usually not found in proteins (see Ulimann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, pp. 57-97 VCH: Weinheim (1985)).
  • the amino acids can be in the optical D or L configuration, although L-amino acids are usually the only type found in naturally occurring proteins.
  • Biosynthetic and degradation pathways of each of the 20 proteinogenic amino acids are well characterized in both prokaryotic and eukaryotic cells (see, for example, Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, pp. 578-590 (1988)).
  • the "essential" amino acids histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan and valine
  • 11 "non-essential" amino acids alanine, arginine, asparagine, aspartate,
  • Lysine is not only an important amino acid for human nutrition, but also for monogastric animals such as poultry and pigs.
  • Glutamate is most commonly used as a flavor additive (monosodium glutamate, MSG) and is widely used in the food industry, as well as aspartate, phenylalanine, glycine and cysteine.
  • Glycine, L-methionine and tryptophan are all used in the pharmaceutical industry.
  • Glutamine, valine, leucine, isoleucine, histidine, arginine, proline, serine and alanine are used in the pharmaceutical and cosmetic industries. Threonine, tryptophan and D- / L-methionine are widespread feed additives (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, pp. 466-502 in Rehm et al., (Ed.) Biotechnology Vol. 6, chapter 14a, VCH: Weinheim). It has been discovered that these amino acids can also be used as precursors for the synthesis of synthetic amino acids and proteins such as N-acetylcysteine, S-carboxymethyl-L-cysteine,
  • Cysteine and glycine are each produced from serine, the former by condensation of homocysteine with serine, and the latter by transferring the side chain ⁇ -carbon atom to tetrahydrofolate in a reaction catalyzed by serine transhydroxymethylase.
  • Phenylalanine and tyrosine are derived from the precursors of the glycolysis and pentose phosphate pathways, erythrose 4-phosphate and phosphoenol pyruvate synthesized a 9-step biosynthetic pathway that only differs in the last two steps after the synthesis of prephenate. Tryptophan is also produced from these two starting molecules, but its synthesis takes place in an 11-step process.
  • Tyrosine can also be prepared from phenylalanine in a reaction catalyzed by phenylalanine hydroxylase.
  • Alanine, valine and leucine are each biosynthetic products from pyruvate, the end product of glycolysis.
  • Aspartate is made from oxaloacetate, an intermediate of the citrate cycle.
  • Asparagine, methionine, threonine and lysine are each produced by converting aspartate.
  • Isoleucine is made from threonine.
  • histidine is formed from 5-phosphoribosyl-1-pyrophosphate, an activated sugar.
  • Amino acids the amount of which exceeds the protein biosynthesis requirement, cannot be stored and are instead broken down, so that intermediate products are provided for the main metabolic pathways of the cell (for an overview see Stryer, L., Biochemistry, 3rd edition, chapter 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle”; S 495-516 (1988)).
  • the cell is able to convert undesired amino acids into useful metabolic intermediates, the production of amino acids is expensive in terms of energy, precursor molecules and the enzymes required for their synthesis.
  • amino acid biosynthesis is regulated by feedback inhibition, the presence of a particular amino acid slowing down or completely stopping its own production (for an overview of feedback mechanisms in amino acid biosynthetic pathways, see Stryer, L., Biochemistry , 3rd edition, chapter 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", pp. 575-600 (1988)).
  • the output of a certain amino acid is therefore restricted by the amount of this amino acid in the cell.
  • nucleic acid molecules which include a nitrogenous base, a pentose sugar (for RNA, the sugar is ribose, for DNA, the sugar is D-deoxyribose) and phosphoric acid.
  • nucleoside includes molecules that act as precursors of nucleotides serve, but in contrast to the nucleotides have no phosphoric acid unit.
  • nucleic acid molecules By inhibiting the biosynthesis of these molecules or their mobilization to form nucleic acid molecules, it is possible to inhibit RNA and DNA synthesis; if this activity is specifically inhibited in cancer cells, the ability of tumor cells to divide and replicate can be inhibited.
  • nucleotides that do not form nucleic acid molecules but serve as energy stores (ie AMP) or as coenzymes (ie FAD and NAD).
  • nucleotide Synthesis "Curr. Opin. Struct. Biol. 5: 752-757; (1995) Biochem. Soc. Transact. 23: 877-902).
  • purine and pyrimidine bases, nucleosides and nucleotides also have other possible uses: as intermediates in the biosynthesis of various fine chemicals (e.g. thiamine, S-adenosyl methionine, folate or riboflavin), as energy sources for the cell (e.g. ATP or GTP) and for chemicals themselves, which are usually used as flavor enhancers (e.g.
  • IMP or GMP for many medical applications (see, for example, Kuninaka, A., (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Vol. 6, Rehm et al., Ed. VCH: Weinheim, pp. 561-612).
  • Enzymes involved in purine, pyrimidine, nucleoside or nucleotide metabolism are also increasingly becoming targets against which crop protection chemicals, including fungicides, herbicides and insecticides, are being developed.
  • the purine nucleotides are made from ribose 5-phosphate via a Series of steps synthesized via the intermediate compound inosine 5 'phosphate (IMP), which leads to the production of guanosine 5' monophosphate (GMP) or adenosine 5 'monophosphate (AMP), which form the triphosphate forms used as nucleotides easy to manufacture.
  • IMP inosine 5 'phosphate
  • GMP guanosine 5' monophosphate
  • AMP adenosine 5 'monophosphate
  • Pyrimidine biosynthesis takes place via the formation of uridine 5 'monophosphate (UMP) from ribose 5-phosphate. UMP in turn is converted to cytidine 5 'triphosphate (CTP).
  • the deoxy forms of all nucleotides are produced in a one-step reduction reaction from the diphosphate ribose form of the nucleotide to the diphosphate deoxyribose form of the nucleotide. After phosphorylation, these molecules can participate in DNA synthesis.
  • Trehalose consists of two glucose molecules that are linked by an ⁇ , ⁇ -l, 1 bond. It is commonly used in the food industry as a sweetener, as an additive for dried or frozen foods, and in beverages. However, it is also used in the pharmaceutical, cosmetics and biotechnology industries (see, e.g., Nishimoto et al., (1998) US Patent No. 5,759,610; Singer, MA and Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16: 460-467; Paiva,
  • Trehalose is produced by enzymes from many microorganisms and is naturally released into the surrounding medium from which it can be obtained by methods known in the art.
  • the organism is exposed to a number of stress factors. These factors can be categorized according to their impact types as follows:
  • the cells have systems of the stress response that are able to adapt the cell to the stress or to eliminate the cause of the stress.
  • the cell's response to stress includes processes of growth control, signal transduction, transcription, and post-translational control.
  • Oxidative stress a less than optimal osmolarity, mechanical stress (shear stress caused by stirring), a less than optimal supply of nutrients and contact with toxic products of the metabolism can be expected here. Aerobic organisms have to maintain a reduced, cellular redox environment, parallel to the pro-oxidative conditions that an aerobic life entails.
  • ROI redox-active oxygen intermediates
  • Oxidative stress results from abnormally high levels of ROIs that disrupt cellular redox status and damage lipids, proteins, DNA and RNA (Godon, C. et al. The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273, 22480-22489 ).
  • the cell checks the osmostatus and reacts to changes by activating genes and gene products that set harmless osmolar conditions (Blomberg, A, Electrophoresis, 1997, 18, 1429-1440). The same applies to mechanical stress and stress due to the limitation of nourishment. 45 When organisms are confronted with poisons, genes or gene products are activated that either render the poison harmless by modification, or activate transport systems that are in the Are able to remove the toxins from the cell (Baumeister, W, Critical Reviews in Microbiology, 1997, 23, 1-46).
  • the present invention is based, at least in part, on the discovery of new molecules, referred to here as SA nucleic acid and protein molecules, which can participate in the stress response, DNA repair or detoxification through processes such as radical trapping.
  • the SA molecules participate in the stress response, DNA repair, or detoxification through processes such as radical trapping in Ashbya gossypii.
  • the activity of the SA molecules according to the invention in contributing to the stress response, DNA repair and detoxification in A. gossypii has, in a preferred embodiment, an effect on the production of a desired fine chemical by this organism.
  • the activity of the SA molecules according to the invention is modulated so that the metabolic and energy pathways of A.
  • gossypii in which the SA proteins according to the invention participate are modulated with regard to the yield, production and / or efficiency of production, which either directly or indirectly modulate the yield, production and / or efficiency of production of a desired fine chemical from A. gossypii.
  • SA protein or "SA polypeptide” encompasses proteins that can perform a function in Ashbya gossypii that is involved in stress response, DNA repair or detoxification through processes such as radical trapping.
  • SA proteins include those encoded by the SA genes listed in Table 1 and Appendix A.
  • SA gene or "SA nucleic acid sequence” encompass nucleic acid sequences which encode an SA protein which consists of a coding region and corresponding untranslated 5 'and 3' sequence regions. Examples of SA genes are those listed in Table 1. The terms
  • Production or “productivity” are known in the art and include the concentration of the fermentation product (e.g. the desired fine chemical) that is formed within a specified period and a specified fermentation volume (e.g. kg product per hour per 1).
  • concentration of the fermentation product e.g. the desired fine chemical
  • fermentation volume e.g. kg product per hour per 1.
  • yield encompasses the efficiency of converting the carbon source into the product (ie, the fine chemical). For example, this is usually expressed as kg product per kg carbon source.
  • biosynthesis or “biosynthetic pathway” are known in the art and encompass the synthesis of a compound, preferably an organic compound, by a cell from intermediate compounds, for example in a multi-step or highly regulated process.
  • degradation or “degradation path” are known in the art and include the cleavage of a compound, preferably an organic compound, by a cell into degradation products (more generally, smaller or less complex molecules), e.g. in a multi-step or highly regulated Process.
  • degradation product is known in the art and includes degradation products of a compound.
  • the SA molecules according to the invention are capable of modulating the production of a desired molecule, such as a fine chemical, in a microorganism, such as A. gossypii.
  • a desired molecule such as a fine chemical
  • a microorganism such as A. gossypii.
  • SA proteins can also lead to SA proteins with modified activities that indirectly affect the production of one or more desired fine chemicals from A. gossypii. For example, improving the removal of radicals in the cell ensures that essential metabolic processes run smoothly. These processes include the construction of the cell walls, transcription, translation, the biosynthesis of compounds necessary for the growth and division of cells (e.g. nucleotides, amino acids, vitamins, lipids etc.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Prokaryontes, Thieme Verlag: Stuttgart, pp. 88-109 ; 913-918; 875-899).
  • the isolated nucleic acid sequences according to the invention are located in the genome of an Ashbya gossypii staic ⁇ xies, which is available from the American Type Culture Collection under the name ATCC 10895.
  • the nucleotide sequence of the isolated A. gossypii-SA cDNAs / genomic clones and the predicted amino acid sequences of the A. gossypii-SA proteins are shown in Appendix A and B, respectively.
  • Computer analyzes were carried out which classified and / or identified these nucleotide sequences as sequences which code for proteins which have a function in Ashbya gossypii which is involved in the stress response, DNA repair or detoxification by processes such as radical trapping.
  • the present invention also relates to proteins whose amino acid sequence is essentially homologous to an amino acid sequence in Appendix B.
  • a protein whose amino acid sequence is substantially homologous to a selected amino acid sequence is at least about 50% homologous to the selected amino acid sequence, e.g., the entire selected amino acid sequence.
  • a protein whose amino acid sequence is substantially homologous to a selected amino acid sequence can also be at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90% or 90 to 95%, and most preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or even more homologous to the selected amino acid sequence.
  • An SA protein according to the invention or a biologically active section or fragment thereof can be involved in the stress response, DNA repair or detoxification by processes such as radical trapping in Ashbya gossypii or can have one or more of the activities listed in Table 1.
  • processes such as radical trapping in Ashbya gossypii or can have one or more of the activities listed in Table 1.
  • nucleic acid molecules which encode SA molecules or biologically active sections thereof, and to nucleic acid fragments which are sufficient for use as hybridization probes or primers for identifying or amplifying SA-encoding nucleic acids (e.g. SA-DNA).
  • nucleic acid molecule as used herein is intended to encompass DNA molecules (e.g. cDNA or genomic DNA) and RNA molecules (e.g. mRNA) as well as DNA or RNA analogs which are generated by means of nucleotide analogs.
  • This term also includes the untranslated sequence located at the 3 'and 5' ends of the coding gene region: at least about 100 nucleotides of the sequence upstream of the 5 'end of the coding region and at least about 20 nucleotides of the sequence downstream of the 3' -End of the coding region of the gene.
  • the nucleic acid molecule can be single-stranded or double-stranded, but is preferably double-stranded DNA.
  • An "isolated" nucleic acid molecule is separated from other nucleic acid molecules that are present in the natural source of the nucleic acid.
  • an "isolated" nucleic acid preferably has no sequences which naturally flank the nucleic acid in the genomic DNA of the organism from which the nucleic acid originates (for example sequences which are located at the 5 'or 3' end of the nucleic acid ).
  • the isolated SA nucleic acid molecule can contain less than about 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, or 0.1 kb of the nucleotide sequences that naturally comprise the nucleic acid molecule in the genomic DNA of the Flank the cell from which the nucleic acid originates (for example an A. gossypii cell).
  • An "isolated" nucleic acid molecule such as a cDNA molecule, can also be substantially free of other cellular material or culture medium if it is produced by recombinant techniques, or of chemical precursors or other chemicals if it is chemically synthesized.
  • a nucleic acid molecule according to the invention for example a nucleic acid molecule with a nucleotide sequence from Appendix A or a section thereof, can be isolated by means of standard molecular biological techniques and the sequence information provided here.
  • an A. gossypii-SA cDNA can be isolated from an A. gossypü-Ba ⁇ k by using a complete sequence from Appendix A or a portion thereof as a hybridization probe and standard hybridization techniques (as described, for example, in Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a nucleic acid molecule comprising a complete sequence from Annex A or a section thereof can be isolated by polymerase chain reaction, using the oligonucleotide primers which have been prepared on the basis of this sequence (for example a nucleic acid molecule comprising a complete sequence can be used Appendix A, or a portion thereof, can be isolated by polymerase chain reaction using oligonucleotide primers made from this same sequence from Appendix A).
  • mRNA can be isolated from normal endothelial cells (for example by the guanidinium thiocyanate extraction method of Chirgwin et al.
  • cDNA can be obtained by means of reverse transcriptase (for example Moloney-MLV reverse transcriptase) at Gibco / BRL, Bethesda, MD, or AMV reverse transcriptase, available from Seikagaku America, Inc., St. Louis, FL).
  • reverse transcriptase for example Moloney-MLV reverse transcriptase
  • Gibco / BRL Gibco / BRL
  • Bethesda MD
  • AMV reverse transcriptase available from Seikagaku America, Inc., St. Russia, FL.
  • Synthetic oligonucleotide primers for the amplification via polymerase chain reaction can be created on the basis of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • a nucleic acid according to the invention can be amplified using cDNA or alternatively genomic DNA as a template and suitable oligonucleotide primers according to standard PCR amplification techniques.
  • nucleic acid amplified in this way can be cloned into a suitable vector and characterized by DNA sequence analysis.
  • Oligonucleotides which correspond to an SA nucleotide sequence can also be produced by standard synthesis methods, for example using an automatic DNA synthesizer.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises one of the nucleotide sequences listed in Appendix A.
  • the sequences of Appendix A correspond to the SA cDNAs from Ashbya gossypii according to the invention. These cDNAs include sequences, the SA proteins (i.e. the "coding region” shown in each sequence in Appendix A), and the 5 'and 3' untranslated sequences, which are also listed in Appendix A.
  • the nucleic acid molecule can alternatively comprise only the coding region of one of the sequences in Appendix A.
  • each of the sequences given in Appendix A has an RXA identification number, 5 digits being listed behind the name “RXA” (for example RXA00013).
  • RXA for example RXA00013.
  • Each of these sequences comprises up to three sections: an upstream 5 'area, a coding area, and a downstream area. Each of these three areas is identified by the same RXA designation to avoid confusion.
  • Appendix A "then stands for one of the sequences in Appendix A, which can be distinguished by their different RXA numbers.
  • the coding region of each sequence is translated into the corresponding amino acid sequence given in Appendix B. 0
  • the sequences in Appendix B. identified by the same RXA numbers as in Appendix A so that they can be easily assigned.
  • the amino acid sequence labeled RXA00013 in Appendix B is a translation of the coding region of the nucleotide sequence of the nucleic acid molecule RXA00013 in Appendix A. 5
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention comprises a nucleic acid molecule which is complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A or a portion thereof, which is a "nucleic acid molecule which is sufficiently complementary to one of the nucleotide sequences shown in Appendix A that it is compatible with one of the sequences given in Appendix A can hybridize, resulting in a stable duplex.
  • the nucleic acid molecule of the invention may further comprise only a portion of the coding region of one of the sequences in Appendix A, for example., A fragment that can be used as a probe or primer or a fragment encoding a biologically active portion of an SA protein. Consisting of 0 cloning of the SA genes from determined A. gossypii nucleotide sequences of the generation of probes and primers for identifying and / or cloning SA homologs in other cell types and organisms and SA homologues allow interpreted by other Ermothecien or related species are.
  • the probe or 5 of the primers usually comprises essentially purified oligonucleotide.
  • the oligonucleotide usually comprises a nucleotide sequence region which, under stringent conditions, comprises at least about 12, preferably about 25, more preferably about 40, 50 or 75 successive nucleotides of a sense strand from one of the sequences given in Appendix A, an antisense strand hybridized by one of the sequences given in Appendix A or naturally occurring mutants thereof.
  • Primers based on a nucleotide sequence from Appendix A can be used in PCR reactions for cloning SA homologs. Probes based on the SA nucleotide sequences can be used to detect transcripts or genomic sequences that encode the same or homologous proteins.
  • the probe also includes a label group attached to it, for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • a label group attached to it for example a radioisotope, a fluorescent compound, an enzyme or an enzyme cofactor.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes a protein or a section thereof which comprises an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B that the protein or a section
  • the term "sufficiently homologous" refers to proteins or portions thereof, the amino acid sequences of which are minimal
  • the protein is at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%, 35 90 to 95% and most preferably at least about 96%, 97%, 98%, 99% or even more homologous to a complete amino acid sequence in Appendix B.
  • Sections of proteins which are encoded by the SA-40 nucleic acid molecules according to the invention are preferably biologically active sections of one of the SA proteins.
  • biologically active portion of an SA protein is intended to include a portion, e.g., a domain / motif of an SA protein, that is involved in the stress response, DNA repair, or detoxification Processes such as radical trapping in A. gossypii is involved or has an activity shown in Table 1.
  • a test of the enzymatic activity can be carried out.
  • Additional nucleic acid fragments encoding biologically active portions of an SA protein can be obtained by isolating a portion of one of the sequences in Appendix B, expressing the encoded portion of the SA protein or peptide (e.g., by recombinant expression in vitro) and determining the activity of the encoded portion of the SA protein or peptide.
  • the invention also encompasses nucleic acid molecules that differ from one (and portions thereof) of one of the nucleotide sequences shown in Appendix A because of the degenerate genetic code and thus encode the same SA protein as that encoded by the nucleotide sequences shown in Appendix A.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention has a nucleotide sequence which encodes a protein with an amino acid sequence shown in Appendix B.
  • the nucleic acid molecule according to the invention encodes an A. gossypii full-length protein which is essentially homologous to an amino acid sequence from Appendix B (encoded by an open reading frame shown in Appendix A).
  • A. gossypii SA nucleotide sequences shown in Appendix A those skilled in the art are aware that DNA sequence polymers that result in changes in the amino acid sequences of SA proteins are within a population (e.g., A gossypii population) can exist. These genetic polymorphisms in the SA gene can exist between individuals within a population due to the natural variation.
  • the terms "gene” and "recombinant gene” mean nucleic acid molecules with an open reading frame that encodes an SA protein, preferably an A. ossypii SA protein. These natural variations usually cause a 1 to 5% variance in the nucleotide sequence of the SA gene.
  • an isolated nucleic acid molecule according to the invention is at least 15 nucleotides long and hybridizes under stringent conditions with the nucleic acid molecule which comprises a nucleotide sequence from Appendix A.
  • the nucleic acid is at least 30, 50, 100, 250 nucleotides long or longer.
  • hybridizes under stringent conditions as used here is intended to describe hybridization and washing conditions under which nucleotide sequences which are at least 60% homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • the conditions are preferably such that sequences that are at least about 65%, more preferably at least about 70%, and even more preferably at least about 75% or more homologous to one another usually remain hybridized to one another.
  • stringent conditions are known to the person skilled in the art and can be found in Ausubel et al. , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1989), 6.3.1-6.3.6. Find.
  • a preferred, non-limiting example of stringent hybridization conditions is one
  • An isolated nucleic acid molecule according to the invention which hybridizes to a sequence from Appendix A under stringent conditions preferably corresponds to a naturally occurring nucleic acid molecule.
  • a "naturally occurring" nucleic acid molecule refers to an RNA or DNA molecule with a nucleotide sequence that occurs in nature (e.g., encodes a natural protein). In one embodiment, the nucleic acid encodes a naturally occurring A. gossypii SA protein.
  • nucleotide sequence of Appendix A which leads to a change in the amino acid sequence of the encoded SA protein without affecting the functionality of the SA protein.
  • nucleotide substitutions which lead to amino acid substitutions at "non-essential" amino acid residues can be produced in a sequence from Appendix A.
  • a "non-essential" amino acid residue is a residue that is found in the wild type sequence of one of the SA proteins (Appendix B) can be changed without changing the activity of the SA protein, whereas an "essential" amino acid residue is required for the SA protein activity.
  • other amino acid residues for example non-preserved or only semi-preserved amino acid residues in the domain with SA activity
  • nucleic acid molecules that encode SA proteins that contain altered amino acid residues that are not essential for SA activity. These SA proteins differ in amino acid sequence from a sequence in Appendix B, but still retain at least one of the SA activities described here.
  • the isolated nucleic acid molecule in one embodiment, comprises a nucleotide sequence encoding a protein comprising an amino acid sequence that is at least about 50% homologous to an amino acid sequence from Appendix B and on the stress response, DNA repair, or detoxification by processes such as radical trapping , may be involved in Ashbya gossypii or has one or more of the activities listed in Table 1.
  • the protein encoded by the nucleic acid molecule preferably has at least about 50 to 60%, more preferably at least about 60 to 70%, even more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%, 90 to 95%, and most preferably at least about 96%, 97%, 98% or 99% homology to any of the sequences in Appendix B.
  • the sequences are written with one another for optimal comparison purposes (for example, gaps can be inserted into the sequence of a protein or a nucleic acid) so that an optimal alignment with the other protein or the other nucleic acid is produced).
  • the amino acid residues or the nucleotides are then compared with one another at the corresponding amino acid or nucleotide positions. If a position in one sequence (e.g. one of the sequences from Appendix B) is occupied by the same amino acid residue or nucleotide as at the corresponding position in the other sequence (e.g.
  • An isolated nucleic acid molecule encoding an SA protein that is homologous to a protein sequence from Appendix B can be generated by incorporating one or more nucleotide substitutions, additions or deletions into a nucleotide sequence from Appendix A such that one or more amino acid substitutions , additions or deletions are introduced into the encoded protein.
  • the mutations can be introduced into one of the sequences from Appendix A using standard techniques such as site-directed mutagenesis and PCR-mediated mutagenesis.
  • conservative amino acid substitutions are introduced on one or more of the predicted non-essential amino acid residues.
  • the amino acid residue is replaced by an amino acid residue with a similar side chain. Families of amino acid residues with similar side chains have been defined in the art. These families include amino acids with basic side chains (e.g. lysine, arginine, histidine), acidic side chains (e.g. aspartic acid, glutamic acid), uncharged polar side chains (e.g.
  • glycine asparagine, glutamine, serine, threonine, tyrosine, cysteine
  • non-polar side chains for example alanine, valine, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, methionine, tryptophan
  • beta-branched side chains for example threonine, valine, isoleucine
  • aromatic side chains for example tyrosine, phenylalanine, tryptophan, histidine.
  • a predicted non-essential amino acid residue in an SA protein is thus preferably replaced by another amino acid residue of the same side chain family.
  • the mutations can alternatively be introduced randomly over all or part of the SA coding sequence, for example by saturation mutagenesis, and the resulting mutants can be examined for SA activity described here in order to identify mutants which have a Maintain SA activity.
  • the encoded protein can be expressed recombinantly, and the activity of the protein can be determined, for example, using the tests described here (see Example 8 of the example section).
  • an antisense nucleic acid comprises a nucleotide sequence which is complementary to a "sense” nucleic acid which encodes a protein, for example complementary to the coding strand of a double-stranded cDNA molecule or complementary to a KNA sequence.
  • An antisense nucleic acid can consequently bind to a sense nucleic acid via hydrogen bonds.
  • the antisense nucleic acid can form the entire SA coding strand or be complementary to only a portion thereof.
  • an antisense nucleic acid molecule is antisense to a "coding region" of the coding strand of a nucleotide sequence that encodes an SA protein.
  • coding region refers to the region of the nucleotide sequence that includes codons that are translated into amino acid residues.
  • the antisense nucleic acid molecule is antisense to a “non-coding region” of the coding strand of a nucleotide sequence that encodes SA.
  • non-coding region relates to 5 '- and
  • the antisense nucleic acids according to the invention can be designed in accordance with the rules of the Watson-Crick base pairing.
  • the antisense nucleic acid molecule can be complementary to the entire coding region of SA-ir RNA, but is more preferably an oligonucleotide that is antisense to only a portion of the coding or non-coding region of the SA mRNA.
  • the antisense oligonucleotide can be complementary to the region surrounding the translation start site of SA mRNA.
  • An antisense oligonucleotide can be, for example, about 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 or 50 nucleotides in length.
  • An antisense nucleic acid according to the invention can be constructed by chemical synthesis and enzymatic ligation reactions using methods known in the art.
  • An antisense nucleic acid e.g. an antisense oligonucleotide
  • modified nucleotides that can be used to generate the antisense nucleic acid include 5-fluorouracil, 5-bromouracil, 5-chlorouracil, 5-iodouracil, hypoxanthine, xanthine, 4-acetylcytosine, 5- (carboxy-hydroxyl ethyl) ) uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thiouridine, 5-carboxymethylaminomethyluracil, dihydrouracil, beta-D-galactosylqueosine, inosine, N6-isopentenyladenine, 1-methylguanine, 1-methylinosine, 2, 2-dimethylguanine, 2-methyladenine guanine, 3-methylcytosine, 5-methylcytosine, N6-adenine, 7-methylguanine, 5-methylaminomethyluracil, 5-methoxy
  • the antisense nucleic acid can alternatively be produced biologically by using an expression vector in which a nucleic acid has been subcloned in the antisense direction (ie RNA which is transcribed by the introduced nucleic acid is oriented in the antisense direction to a target nucleic acid of interest , which is further described in the subsection below).
  • the antisense nucleic acid molecules according to the invention are usually administered to a cell or generated in situ so that they hybridize or bind to the cellular mRNA and / or the genomic DNA which codes for an SA protein, so that the expression of the protein, for example by inhibiting transcription and / or translation.
  • the hybridization can be carried out by conventional nucleotide complementarity with formation of a stable duplex or, for example, in the case of an antisense nucleic acid molecule which binds DNA duplexes, by specific interactions in the major groove of the double helix.
  • the antisense molecule can be modified so that it specifically binds to a receptor or to an antigen that is expressed on a selected cell surface, for example, by linking the antisense nucleic acid molecule to a peptide or an antibody that is attached to a cell surface - binds receptor or antigen.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be administered to cells using the vectors described herein. To achieve sufficient intracellular concentrations of the antisense molecules, vector constructs in which the antisense nucleic acid molecule is under the control of a strong bacterial, viral or eukaryotic promoter are preferred.
  • the antisense nucleic acid molecule according to the invention is an ⁇ -anomeric nucleic acid molecule.
  • An ⁇ -anomeric nucleic acid molecule forms specific double-stranded hybrids with complementary RNA, the strands running parallel to one another in contrast to conventional ⁇ -units.
  • the antisense nucleic acid molecule can also be a 2'-O-methylribonucleotide (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15: 6131-6148) or a chimeric RNA-DNA analog (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215: 327-330).
  • an antisense nucleic acid according to the invention is a ribozyme.
  • Ribozymes are catalytic RNA molecules with ribonuclease activity that can cleave a single-stranded nucleic acid, such as an mRNA, to which they have a complementary region.
  • ribozymes e.g. hammerhead ribozymes (described in Haselhoff and Gerlach (1988) Nature 334: 585-591)
  • a ribozyme specific for an SA coding nucleic acid can be designed based on the nucleotide sequence of an SA cDNA disclosed herein (i.e. RXA00001 in Appendix A). For example.
  • a derivative of a Tetrahymena L-19 IVS RNA can be constructed, the nucleotide sequence of the active site being complementary to the nucleotide sequence that is to be cleaved in an SA-encoding mRNA. See, for example, Cech et al., U.S. Patent No. 4,987,071 and Cech et al., U.S. Patent No. 5,116,742.
  • SA-mRNA can be used to select a catalytic RNA with specific ribonuclease activity from a pool of RNA Molecules are used. See, e.g., Bartel, D., and Szostak, J.W. (1993) Science 261: 1411-1418.
  • the SA gene expression can alternatively be inhibited by directing nucleotide sequences that are complementary to the regulatory region of an SA nucleotide sequence (for example to an SA promoter and / or enhancer) in such a way that triple helix structures are formed which transcribe prevent an SA gene in target cells.
  • nucleotide sequences that are complementary to the regulatory region of an SA nucleotide sequence (for example to an SA promoter and / or enhancer) in such a way that triple helix structures are formed which transcribe prevent an SA gene in target cells.
  • vectors preferably expression vectors, containing a nucleic acid encoding an SA protein (or a portion thereof).
  • vector refers to a nucleic acid molecule that can transport another nucleic acid to which it is attached.
  • plasmid which is a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector Another type of vector is a viral vector, whereby additional DNA segments can be ligated into the viral genome.
  • Certain vectors can be autonomous in a host cell into which they have been introduced replicate (for example bacterial vectors, with bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • vectors are integrated into the genome of a host cell when introduced into the host cell and thereby replicated together with the host genome.
  • certain vectors can control the expression of genes to which they are operably linked. These vectors are referred to here as "expression vectors".
  • the expression vectors that can be used in recombinant DNA techniques are usually in the form of plasmids.
  • plasmid and “vector” can be used interchangeably because the plasmid is the most commonly used vector form.
  • the invention is intended to encompass these other expression vector forms, such as viral vectors (e.g. replication-deficient retroviruses, adenoviruses and adeno-related viruses), which perform similar functions.
  • the recombinant expression vectors according to the invention comprise a nucleic acid according to the invention in a form which is suitable for the expression of the nucleic acid in a host cell, that is to say that the recombinant expression vectors comprise one or more regulatory sequences, selected on the basis of the host cells to be used for expression, with the are operably linked to the nucleic acid sequence to be expressed.
  • “operably linked” means that the nucleotide sequence of interest is bound to the regulatory sequence (s) in such a way that expression of the nucleotide sequence is possible (for example in an in vitro transcription / translation system or in a host cell when the vector is introduced into the host cell).
  • regulatory sequence is intended to include promoters, enhancers and other expression control elements (for example polyadenylation signals). These regulatory sequences are described, for example, in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatory sequences include those that control the constitutive expression of a nucleotide sequence in many host cell types and those that control the expression of the nucleotide sequence only in certain host cells. The person skilled in the art is aware that the design of an expression vector can depend on factors such as the choice of the host cell to be transformed, the desired level of protein expression etc.
  • the expression vectors according to the invention can be introduced into the host cells so that proteins or peptides, including the fusion proteins or peptides that are encoded by the nucleic acids as described here, are produced (e.g. SA- Proteins, mutated forms of SA proteins, fusion proteins, etc.).
  • proteins or peptides including the fusion proteins or peptides that are encoded by the nucleic acids as described here, are produced (e.g. SA- Proteins, mutated forms of SA proteins, fusion proteins, etc.).
  • the recombinant expression vectors according to the invention can be designed for the expression of SA proteins in prokaryotic or eukaryotic cells.
  • SA genes can be found in bacterial cells such as A. gossypii, insect cells (with baculovirus expression vectors), yeast and other fungal cells (see Romanos, MA et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review", Yeast 8 : 423-488; van den Hondel, CAMJJ et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi” in: More Gene Manipulations in Fungi, JW Bennet & LL Lasure, ed., Pp.
  • T7 polymerase can be transcribed and translated in vitro.
  • Proteins are usually expressed in prokaryotes using vectors which contain constitutive or inducible promoters which control the expression of fusion or non-fusion proteins.
  • Fusion vectors contribute a number of amino acids to a protein encoded therein, usually at the amino terminus of the recombinant protein, but also at the C-terminus or fused within appropriate regions of the proteins. These fusion vectors usually have three functions: 1) to increase the expression of recombinant protein; 2) increasing the solubility of the recombinant protein; and 3) supporting the purification of the recombinant protein by acting as a ligand in affinity purification.
  • a proteolytic cleavage site is often introduced at the junction of the fusion unit and the recombinant protein, so that the recombinant protein can be separated from the fusion unit after the fusion protein has been purified.
  • These enzymes and their corresponding recognition sequences include factor Xa, thrombin and enterokinase.
  • Common fusion expression vectors include pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, DB and Johnson, KS (1988) Gene 67: 31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), in which Glutathione-S-transferase (GST), maltose E-binding protein or protein A is fused to the recombinant target protein.
  • GST Glutathione-S-transferase
  • the coding sequence of the SA protein is cloned into a pGEX expression vector, so that a vector is generated which encodes a fusion protein, comprising from the N-terminus to the C-terminus: GST - thrombin cleavage site - X - Protein.
  • the fusion protein can be purified by affinity chromatography using glutathione-agarose resin.
  • the recombinant SA protein, which is not fused to GST, can be obtained by cleaving the fusion protein with thrombin.
  • Suitable inducible non-fusion .E. coli expression vectors include pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) and pET lld (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60) -89).
  • Target gene expression from the pTrc vector is based on transcription by host RNA polymerase from a hybrid trp-lac fusion promoter.
  • the target gene expression from the pET lld vector is based on the transcription from a T7-gnl0-lac fusion promoter, which is mediated by a coexpressed viral RNA polymerase (T7 gnl). This viral polymerase is supplied by the BL 21 (DE3) or HMS174 (DE3) host strains from a resident ⁇ prophage which harbors a T7 gnl gene under the transcriptional control of the lacUV 5 promoter.
  • One strategy to maximize the expression of the recombinant protein is to express the protein in a host bacterium whose ability to proteolytically cleave the recombinant protein is impaired (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California ( 1990) 119-128).
  • Another strategy is to change the nucleic acid sequence of the nucleic acid to be inserted into an expression vector, so that the individual codons for each amino acid are those which are preferably used in a bacterium selected for expression, such as A. gossypii (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20: 2111-2118). This change in the nucleic acid sequences according to the invention can be carried out using standard DNA synthesis techniques.
  • the SA protein expression vector is a yeast expression vector.
  • yeast expression vectors for expression in the yeast include S. cerevisiae pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54: 113- 123) and pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • Vectors and methods of constructing vectors suitable for use in other fungi such as filamentous fungi include those described in detail in: van den Hondel, CAMJJ & Punt, PJ (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Geneties of Fungi, JF Peberdy et al., ed., pp. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
  • the SA proteins of the invention can be expressed in insect cells using baculovirus expression vectors.
  • Baculovirus vectors available for expression of proteins in cultured insect cells include the pAc series (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol .. 3: 2156-2165) and pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • the SA proteins according to the invention can be expressed in cells of single-cell plants (such as algae) or in plant cells of higher plants (for example spermatophytes, such as crops).
  • plant expression vectors include those described in detail in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. and Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border ", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197; and Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12: 8711-8721.
  • a nucleic acid according to the invention is expressed in mammalian cells with a mammalian expression vector.
  • mammalian expression vectors include pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329: 840) and pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • the control functions of the expression vector are often provided by viral regulatory elements. Commonly used promoters come, for example, from Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus and Simian Virus 40.
  • the recombinant mammalian expression vector can preferably bring about the expression of the nucleic acid in a specific cell type (for example, tissue-specific regulatory elements are used for the expression of the nucleic acid).
  • tissue-specific regulatory elements are known in the art.
  • suitable tissue-specific promoters include the albumin promoter (liver-specific; Pinkert et al. (1987) Genes Dev.
  • lymphoid-specific promoters Calame and Eaton (1988) Adv. Immunol. 43: 235- 275
  • promoters of T cell receptors Winoto and Baltimore (1989) EMBO J. 8: 729-733
  • immunoglobulins Bonerji et al. (1983) Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore (1983) Cell 33: 741-748
  • neuron-specific promoters e.g.
  • the invention also provides a recombinant expression vector comprising a DNA molecule according to the invention which is cloned into the expression vector in the antisense direction.
  • the DNA molecule is operably linked to a regulatory sequence in such a way that expression (by transcription of the DNA molecule) of an RNA molecule that is antisense to the SA mRNA becomes possible.
  • Regulatory sequences can be selected which are operably linked to a nucleic acid cloned in the antisense direction and which control the continuous expression of the antisense RNA molecule in a multiplicity of cell types, for example viral promoters and / or enhancers or regulatory sequences can be selected that control the constitutive, tissue-specific or cell-type-specific expression of antisense RNA.
  • the antisense expression vector can be in the form of a recombinant plasmid, phagemid or attenuated virus in which antisense nucleic acids are produced under the control of a highly effective regulatory region, the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • a highly effective regulatory region the activity of which is determined by the cell type into which the vector is introduced.
  • a host cell can be a prokaryotic or eukaryotic cell.
  • an SA protein can be expressed in bacterial cells such as A. gossypii, insect cells, yeast or mammalian cells (such as Chinese hamster ovary cells (CHO) or COS cells).
  • suitable host cells are known to the person skilled in the art.
  • Microorganisms which are related to Ashbya gossypii and which can be suitably used as host cells for the nucleic acid and protein molecules according to the invention are listed in Table 2.
  • vector DNA can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells.
  • transformation and “transfection”, “conjugation” and “ransductio” as used herein are intended to encompass a variety of methods known in the art for introducing foreign nucleic acid (e.g. DNA) into a host cell, including calcium phosphate - or calcium chloride coprecipitation, DEAE-dextran-mediated transfection, lipofection, natural competence, chemically mediated transmission or electroporation.
  • Suitable methods for transforming or transfecting host cells can be found in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) and other laboratory manuals.
  • a gene encoding a selectable marker (eg resistance to antibiotics) is usually introduced into the host cells together with the gene of interest.
  • selectable markers include those that are resistant to drugs such as G418, hygromycin and Methotrexate.
  • a nucleic acid encoding a selectable marker can be introduced into a host cell on the same vector as that encoding an SA protein, or can be introduced on a separate vector. Cells that have been stably transfected with the introduced nucleic acid can be identified, for example, by drug selection (for example, cells that have integrated the selectable marker survive, whereas the other cells die).
  • a vector which contains at least a section of an SA gene into which a deletion, addition or substitution has been introduced in order to change, for example functionally disrupt, the SA gene.
  • This SA gene is preferably an Ashbya gossypii SA gene, however a ho ologon from a related bacterium or even from a source of mammals, yeasts or insects can be used.
  • the vector is designed such that the endogenous SA gene is functionally disrupted when homologous recombination occurs (i.e. no longer encodes a functional protein; also referred to as a "knockout" vector).
  • the vector can be designed in such a way that the endogenous SA gene is mutated or otherwise changed during homologous recombination, but still encodes the functional protein (for example, the upstream regulatory region can be changed in such a way that the expression of the endogenous SA protein is changed.).
  • the modified portion of the SA gene is flanked in the homologous recombination vector at its 5 'and 3' ends by additional nucleic acid of the SA gene, which is a homologous recombination between the exogenous SA gene carried by the vector and one endogenous SA gene in a microorganism.
  • the additional flanking SA nucleic acid is long enough for successful homologous recombination with the endogenous gene.
  • the vector usually contains several kilobases flanking DNA (both at the 5 'and 3' ends) (see e.g. Thomas, K.R. and Capecchi, M.R. (1987) Cell 51: 503 for a description of homologous recombination vectors).
  • the vector is introduced into a microorganism (e.g. by electroporation) and cells in which the introduced SA gene is homologously recombined with the endogenous SA gene are selected using methods known in the art.
  • recombinant microorganisms can be produced which contain selected systems which allow regulated expression of the introduced gene.
  • a host cell according to the invention such as a prokaryotic or eukaryotic host cell in culture, can be used to produce (i.e., express) an SA protein.
  • the invention also provides methods for the production of SA proteins using the host cells according to the invention.
  • the method comprises culturing the host cell according to the invention (into which a recombinant expression vector encoding an SA protein has been introduced or into whose genome a gene encoding a wild-type or modified SA protein has been introduced) in a suitable medium until the SA protein has been produced.
  • the method comprises isolating the SA proteins from the medium or the host cell.
  • Another aspect of the invention relates to isolated SA proteins and biologically active portions thereof.
  • An "isolated” or “purified” protein or biologically active portion thereof is essentially free of cellular material when it is produced by recombinant DNA techniques, or of chemical precursors or other chemicals when it is chemically synthesized.
  • the term "essentially free of cellular material” encompasses SA protein preparations in which the protein is separated from cellular components of the cells in which it is produced naturally or recombinantly.
  • the term "substantially free of cellular material” includes SA protein preparations with less than about 30% (by dry weight) non-SA protein (also referred to as "contaminating protein”), more preferably less than about 20 %, more preferably less than about 10%, and most preferably less than about 5% non-SA protein.
  • the SA protein or a biologically active portion thereof after recombinant production contains essentially no culture medium, ie the culture medium makes up less than about 20%, more preferably less than about 10% and most preferably less than about 5% of the volume of the Protein preparation.
  • the term "substantially free of chemical precursors or other chemicals” includes SA protein preparations in which the protein is separated from chemical precursors or other chemicals involved in the synthesis of the protein.
  • the term "essentially free of chemical precursors or other chemicals” includes SA protein Preparations less than about 30% (by dry weight), more preferably less than about 20%, even more preferably less than about 10%, and most preferably less than about 5% chemical precursors or non-5 SA chemicals.
  • the isolated proteins or biologically active portions thereof have no contaminating proteins from the same organism from which the SA protein originates. These proteins are usually produced by recombinant expression, for example an A. gossypii-SA-10 protein, in a microorganism such as A. gossypii.
  • An isolated SA protein according to the invention or a section thereof can be involved in the stress response, DNA repair or detoxification by processes such as radical trapping or
  • the protein or a portion thereof comprises an amino acid sequence which is sufficiently homologous to an amino acid sequence from Appendix B that the protein or the portion thereof has the ability to
  • the portion of the protein is preferably a biologically active portion, as described here.
  • one according to the invention is a biologically active portion, as described here.
  • SA protein is one of the amino acid sequences shown in Appendix B.
  • the SA protein has an amino acid sequence which is encoded by a nucleotide sequence which, for example under stringent conditions, hybridizes to a nucleotide sequence from Appendix A. Another one
  • the SA protein has an amino acid sequence encoded by a nucleotide sequence and which is at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%, 80 to 90%, 90 to 95% and more preferably at least about 96%,
  • a preferred SA protein according to the invention comprises, for example, an amino acid sequence
  • the SA protein is essentially homologous to an amino acid sequence from Appendix B and retains the functional activity of the protein with one of the sequences from Appendix B and yet differs in amino acid sequence 5 due to the natural variation or mutagenesis, as in subsection I described in detail above.
  • the SA protein consequently comprises an amino acid sequence which is at least about 50 to 60%, preferably at least about 60 to 70%, more preferably at least about 70 to 80%,
  • the invention relates to an A. gossypii-
  • Biologically active portions of an SA protein include peptides with amino acid sequences that differ from the amino acid sequence of a
  • SA proteins are derived, for example an amino acid sequence shown in Appendix B or the amino acid sequence of a protein which is homologous to an SA protein, which have fewer amino acids than the full-length SA protein or the full-length protein which form an SA- Protein is homologous, and at least one activity of one
  • biologically active segments (peptides, for example peptides that are 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 or more amino acids long) comprise a domain or a motif with at least one activity of an SA protein.
  • biologically active sections peptides, for example peptides that are 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 or more amino acids long
  • other biologically active sections peptides, for example peptides that are 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 or more amino acids long
  • the biologically active sections of an SA protein preferably comprise one or more selected domains /
  • SA proteins are preferably produced by recombinant DNA techniques. For example, a nucleic acid molecule encoding the protein is converted into an expression vector (as described above)
  • the expression vector is introduced into a host cell (as described above) and the SA protein is expressed in the host cell.
  • the SA protein can then be isolated from the cells using a suitable purification scheme using standard protein purification techniques.
  • an expression of an SA protein, polypeptide, or peptide can be chemically synthesized using standard peptide synthesis techniques.
  • native SA protein can be obtained from cells (e.g. endo- cell cells), for example with an anti-SA antibody, which can be produced by standard techniques, using an SA protein according to the invention or a fragment thereof.
  • a "chimeric SA protein” or “SA fusion protein” comprises an SA polypeptide that is operably linked to a non-SA polypeptide.
  • An "SA polypeptide” refers to a polypeptide with an amino acid sequence that corresponds to an SA protein
  • a “non-SA polypeptide” refers to a polypeptide with an amino acid sequence that corresponds to a protein that is not substantially homologous to the SA protein is, e.g. a protein that differs from the SA protein and comes from the same or a different organism.
  • the term "functionally linked” is intended to mean that the SA polypeptide and the non-SA polypeptide are fused to one another in the reading frame.
  • the non-SA polypeptide can be attached to the N or C terminus of the SA polypeptide.
  • the fusion protein is, for example, a GST-SA fusion protein in which the SA sequences are linked to the C-terminus of the GST sequence. These fusion proteins can facilitate the purification of the recombinant SA protein.
  • the fusion protein is an SA protein that has a heterologous signal sequence at its N-terminus. In certain host cells (e.g., mammalian host cells), expression and / or secretion of an SA protein can be increased by using a heterologous signal sequence.
  • a chimeric SA protein or SA fusion protein according to the invention is produced by standard recombinant DNA techniques.
  • DNA fragments which encode different polypeptide sequences are ligated to one another in the reading frame according to conventional techniques, for example by using smooth or overhanging ends for ligation, restriction enzyme cleavage to provide suitable ends, filling in cohesive ends, if necessary, treatment with alkaline phosphatase to avoid unwanted linkages to avoid and enzymatic ligation.
  • the fusion gene can be synthesized by conventional techniques, including automatic DNA synthesizers.
  • PCR amplification of gene fragments can be carried out using anchor primers that generate complementary overhangs between successive gene fragments. These can then be hybridized with one another and reamplified, so that a chimeric gene sequence is generated (see, for example, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Ed., John Wiley & Sons: 1992).
  • anchor primers that generate complementary overhangs between successive gene fragments.
  • These can then be hybridized with one another and reamplified, so that a chimeric gene sequence is generated (see, for example, Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Ed., John Wiley & Sons: 1992).
  • expression vectors commercially available that already encode a fusion unit (for example a GST polypeptide). A nucleic acid encoding SA can be cloned into such an expression vector so that the fusion unit is linked to the SA protein in the reading frame.
  • Homologs of the SA protein can be generated by mutagenesis, e.g. by certain point mutation or shortening of the SA protein.
  • the term "homologon” as used herein refers to a variant form of the SA protein that acts as an agonist or antagonist of the SA protein activity.
  • An agonist of the SA protein can maintain substantially the same or part of the biological activities of the SA protein.
  • An antagonist of the SA protein can inhibit one or more activities of the naturally occurring form of the SA protein, for example, by competitive binding to a downstream or upstream element of the stress response cascade that contains the SA protein.
  • homologs of the SA protein can be identified by screening combinatorial banks of mutants, for example shortening mutants, of the SA protein for SA protein agonist or antagonist activity.
  • a varied bank of SA variants is generated by combinatorial mutagenesis at the nucleic acid level and encoded by the varied gene bank.
  • a varied bank of SA variants can be produced, for example, by enzymatically ligating a mixture of synthetic oligonucleotides in gene sequences, so that a degenerate set of potential SA sequences can be used as individual polypeptides or alternatively as a set of larger fusion proteins (for example for phage display) Contain set of SA sequences, expresses.
  • a library of coding sequence fragments can be obtained by treating a double-stranded PCR fragment of a coding SA sequence with a nuclease under conditions under which nicking occurs only about once per molecule, denaturing the double-stranded DNA, renaturing the DNA to form double stranded DNA, which may include sense / antisense pairs from various nodded products, removing single-stranded sections from newly formed duplexes by treatment with S1 nuclease and ligating the resulting fragment library into an expression vector.
  • This method can be used to derive an expression bank which encodes N-terminal, C-terminal and internal fragments with different sizes of the SA protein.
  • REM Recursive ensemble mutagenesis
  • cell-based tests can be used to analyze a varied SA bank using methods known in the art.
  • the nucleic acid and protein molecules according to the invention can serve as markers for specific regions of the genome. This is useful not only when mapping the genome, but also for functional studies of A. gossypii proteins.
  • the A. gossypii genome can be cleaved and the fragments incubated with the DNA-binding protein.
  • Those that bind the protein can additionally be probed with the nucleic acid molecules according to the invention, preferably with easily detectable labels; the binding of such a nucleic acid molecule to the genome fragment enables the fragment to be located on the genomic map of A.
  • nucleic acid molecules according to the invention can moreover be sufficiently homologous to the sequences of related species so that these nucleic acid molecules can serve as markers for the construction of a genomic map in related fungi.
  • the SA nucleic acid molecules according to the invention are also suitable for evolution and protein structure studies.
  • the stress response, DNA repair and detoxification processes in which the molecules according to the invention are involved are used by a large number of prokaryotic and eukaryotic cells; by comparing the sequences of the nucleic acid molecules according to the invention with those which encode similar enzymes from other organisms, the degree of evolutionary kinship of the organisms can be determined. Accordingly, such a comparison enables the determination of which sequence regions are conserved and which are not, which can be helpful in determining those regions of the protein which are essential for the enzyme function. This type of determination is valuable for protein engineering studies and may give an indication of how much mutagenesis the protein can tolerate without the function ⁇ lose.
  • the manipulation of the SA nucleic acid molecules according to the invention can bring about the production of SA proteins with functional differences from the wild-type SA proteins. These proteins may be improved in efficiency or activity, may be present in the cell in greater numbers than usual, or may be weakened in efficiency or activity. There are a number of mechanisms by which the modification of an SA protein according to the invention can indirectly influence the yield, production and / or efficiency of the production of a fine chemical from an A. goss pii strain which contains such a modified protein.
  • the mutagenesis of one or more SA proteins according to the invention can also lead to SA proteins with changed activities which indirectly influence the production of one or more desired fine chemicals from A. gossypii.
  • an increased stress response can intercept efficient radicals and thus enable the essential cellular processes to run smoothly.
  • These processes include the construction of the cell walls, the transcription, translation and the biosynthesis of compounds that are necessary for the growth and division of cells (e.g. nucleotides, amino acids, vitamins, lipids etc.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Prokaryontes, Thieme Published by Stuttgart, pp. 88-109; 913-918; 875-899).
  • the nucleic acid and protein molecules of the invention can be used to generate A. gossypii or related bacterial strains expressing mutant SA nucleic acid and protein molecules so that yield, production and / or efficiency of production of a desired compound is improved.
  • the desired compound can be any product made by A.
  • gossypii including the end products of biosynthetic pathways and intermediates of naturally occurring metabolic pathways, as well as molecules involved in the metabolism of A. gossypii do not occur naturally, but are produced by an A. gossypii-Staia ⁇ a according to the invention.
  • Another object of this invention is the use of the nucleic acids according to the invention for the generation of stress resistance in microorganisms.
  • Double-stranded cDNA was synthesized from 5 ⁇ g poly (A) RNA using the "Time Saver cDNA Synthesis Kit” from Pharmacia according to the manufacturer's instructions.
  • the double-stranded cDNA was purified by column chromatography on a Sephacryl S400 column (Pharmacia).
  • a cDNA library carrying 2X10 10 recombinant DNA fragments was cloned into a derivative of the yeast expression vector pYEUra3 (clone-tech) according to the manufacturer's instructions and used for sequencing.
  • a genomic library from Ashbya gossypii An A. gossypii genomic library was generated by ligation of size-selected Sau3A fragments of a partial digestion of the genomic DNA into a dephosphorilized BamHI cut Bluescript SK + vector (Stratagene) (Sambrook, J, Fritsch, EF and Maniatis, T., 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, In Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York). A total of 60,000 transformants were obtained after transforming this library into E. coli. The plasmid DNA was isolated from individual clones and used for sequencing. Contained 95% of the transforms an insert from Ashbya gossypii with an average length of 3 to 6 kb. Plasmids.
  • DNA band shift assays also known as gel retardation assays
  • reporter gene assays as described in Kolmar, H. et al., (1995) EMBO J. 14: 3895-3904 and the references cited therein. Reporter gene test systems are well known and established for applications in pro- and eukaryotic cells using enzymes such as beta-galactosidase, green fluorescent protein and several others.
  • membrane transport proteins The determination of the activity of membrane transport proteins can be carried out according to techniques as described in Gennis, RB (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, pp. 85-137; 199-234; and 270-322.
  • the effect of the genetic modification in A. gossypii on the production of a desired compound can be determined by growing the modified microorganisms under suitable conditions (such as those described above) and the medium and / or the cellular components with respect to the increased production of the desired product (ie an amino acid) is investigated.
  • suitable conditions such as those described above
  • Such analysis techniques are well known to the person skilled in the art and include spectroscopy, thin-layer chromatography, staining methods of various types, enzymatic and microbiological methods and analytical chromatography, such as high-performance liquid chromatography (see, for example, Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A2, p. 89- 90 and pp.
  • the analytical methods include measurements of the amount of nutrients in the medium (e.g. sugar, hydrocarbons, nitrogen sources, phosphate and other ions), measurements of the biomass composition and growth, analysis of the production of common metabolites of biosynthetic pathways and measurements of gases that are produced during fermentation. Standard procedures for these measurements are in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, PM Rhodes and PF Stanbury, ed. IRL Press, pp. 103-129; 131-163 and 165-192 (ISBN: 0199635773) and the literature references specified therein. Purification of the desired product from A. gossypii culture
  • the desired product can be obtained from A. gossypii cells or from the supernatant of the culture described above by various methods known in the art. If the desired product is not secreted by the cells, the cells can be harvested from the culture by slow centrifugation, the cells can be lysed by standard techniques such as mechanical force or ultrasound treatment. The cell debris is removed by centrifugation and the supernatant fraction containing the soluble proteins is obtained for further purification of the desired compound. If the product is secreted by the A. gossypii cells, the cells are removed from the culture by slow centrifugation and the supernatant fraction is kept for further purification.
  • the supernatant fraction from both purification processes is subjected to chromatography with a suitable resin, the desired molecule either being retained on the chromatography resin, but not many impurities in the sample, or the impurities remaining on the resin, but the sample not. If necessary, these chromatography steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • a suitable resin the desired molecule either being retained on the chromatography resin, but not many impurities in the sample, or the impurities remaining on the resin, but the sample not. If necessary, these chromatography steps can be repeated using the same or different chromatography resins.
  • the person skilled in the art is in the selection of the suitable chromatography resins and their most effective
  • the purified product can be concentrated by filtration or ultrafiltration and kept at a temperature at which the stability of the product is maximum.
  • Table 2 List of genera of microbial strains:
  • Bacillus Clostridium, Escherichia, Pichia, Candida, Cyanobacter, Corynebacterium, Brevibacterium, Saccharomyces, Eremothecium or Ashbya.

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Abstract

Die Erfindung betrifft Nukleinsäuremoleküle und davon codierte Polypeptide, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Ashbya gossypii oder verwandten Mikro-organismen arten verwenden lassen.

Description

An der Stressantwort beteiligte Proteine und dafür codierende Gene aus ASHBYA GOSSYPU
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neuartige Nukleinsauremolekule, die sich zur Identifizierung oder Klassifizierung von Ashbya gossypii oder verwandten Mikroorganismenarten verwenden lassen. A. gossypii ist ein filamentöser Pilz, der in der Industrie für die Produktion im Großmaßstab einer Reihe von Feinchemikalien verwendet werden kann. Die Nukleinsauremolekule können daher zum Identifizieren von Mikroorganismen eingesetzt werden, die sich zur Produktion von Feinchemikalien, bspw. durch Fermentationsverfahren, ver- wenden lassen.
Bestimmte Produkte und Nebenprodukte von natürlich-vorkommenden Stoffwechselprozessen in Zellen eignen sich für viele Industriezweige, einschließlich der Nahrungsmittel-, Futtermittel-, Kosmetik- und pharmazeutischen Industrie. Diese Moleküle, die man gemeinsam als "Feinchemikalien" bezeichnet, umfassen organische Säuren, sowohl proteinogene als auch nicht-proteinogene Aminosäuren, Nukleotide und Nukleoside, Lipide und Fettsäuren, Diole, Kohlehydrate, aromatische Verbindungen, Vitamine und Cofaktoren sowie Enzyme. Ihre Produktion erfolgt am besten mittels Anzucht von Mikroorgansimen im Großmaßstab, die entwickelt wurden, um große Mengen des jeweils gewünschten Moleküls zu produzieren und sezernieren. Ein für diesen Zweck geeigneter Organismus ist Ashbya gossypii , ein filamentöser Pilz. Über Stammselektion ist eine Reihe von Mutantenstämmen entwickelt worden, die ein Sortiment wünschenswerter Verbindungen produzieren. Die Auswahl von Stämmen, die hinsichtlich der Produktion eines bestimmten Moleküls verbessert sind, ist jedoch ein zeitaufwendiges und schwieriges Verfahren.
Die neuen Nukleinsauremolekule codieren Proteine, die hier als Proteine der Stressantwort, DNA-Reparatur und Entgiftung (SA-Proteine) bezeichnet werden. Diese SA-Proteine haben bspw. eine Funktion beim Schutz der Zelle vor schädlichen, äußeren Einflüssen (z.B. Radikalbildung, osmotischer Stress usw.) wie siein Fermentern zu finden sind, in A. gossypii . Aufgrund der Verfügbarkeit von in Ashbya gossypii verwendbaren Klonierungs- vektoren, wie bspw. offenbart in Wright und Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., und von Techniken zur genetischen Mani- pulation von A. gossypii und den verwandten iϊe-fe-Arten lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule zur genetischen Manipulation dieses Organismus verwenden, um ihn als Produzenten von einer oder mehreren Feinchemikalien besser und effizienter zu machen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie kann aufgrund einer direkten Auswirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder aufgrund einer indirekten Auswirkung einer solchen Manipulation erfolgen.
Es gibt eine .Reihe von Mechanismen, durch die die Veränderung eines erfindungsgemäßen SA-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem A. gossypH-Staxam, der dieses veränderte Protein enthält, direkt beeinflussen kann. So kann durch eine effizientere Stressantwort, die Zelle robuster gegen äußere Einflüsse gemacht werden, so daß die Lebensfähigkeit und damit die Produktivität der Fein- che ikalie im Fermenter erhöht wird.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen SA-Proteinen kann auch zu SA-Proteinen mit geänderten Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion einer oder mehrere gewünschten Feinchemikalien aus A. gossypii beeinflussen. Beispielsweise kann man durch den durch SA-Proteine verminderte Konzentration an Radikalen die Funktion von essentiellen Stoffwechselprozessen aufrecht erhalten, da Radikale allgemein Proteine angreifen und inaktivieren. Zu diesen Prozessen gehört neben der Biosynthese der Feinchemikalie auch der Aufbau der Zellwände, die Transkription, Translation, die Biosynthese von Verbindungen, die für das Wachstum und die Teilung von Zellen nötig sind (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Lipide usw.) (Lengeier et al. (1999)) . Durch Verbessern von Wachstum und Ver- mehrung dieser veränderten Zellen ist es möglich, die Lebensfähigkeit der Zellen in Kulturell im Großmaßstab zu steigern und auch ihre Teilungsrate zu verbessern, daß eine vergleichsweise größere Anzahl Zellen in der Fermenterkultur überleben kann. Die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion kann zumindest aufgrund der Anwesenheit einer größeren Anzahl lebensfähiger Zellen, die jeweils die gewünschte Feinchemikalie produzieren, erhöht werden. Auch viele der Abbauprodukte, die während des Zuckerstoffwechsels produziert werden, werden von der Zelle als Vorstufen oder Zwischenprodukte bei der Produktion anderer wünschenswerter Produkte, bspw. von Feinchemikalien, verwendet.
Diese Erfindung stellt neue Nukleinsauremolekule bereit, die die hier als SA-Proteine bezeichneten Proteine codieren, welche bspw. eine Funktion ausüben können, die an der Stressantwort und damit an zellulären Schutzmechanismen in Ashbya gossypii beteiligt sind. Nukleinsauremolekule, die ein SA-Protein codieren, werden hier als SA-Nukleinsäuremoleküle bezeichnet . Bei einer bevor- zugten Ausführungsform ist das SA-Protein an der DNA-Reparatur, Entgiftung und der allgemeinen Stressantwort verwendet wird. Beispiele für solche Proteine sind diejenigen, die von den in Tabelle 1 angegebenen Genen codiert werden.
Ein Aspekt der Erfindung betrifft folglich isolierte Nukleinsauremolekule (bspw. cDNAs) , umfassend eine Nukleotidsequenz , die ein SA-Protein oder biologisch aktive Abschnitte davon codiert, sowie Nukleinsäurefragmente, die sich als Primer oder Hybridi- sierungssonden zum Nachweis oder zur A plifikation von SA- codierender Nukleinsäure (bspw. DNA oder iuRNA) eignen. Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotid- sequenzen oder den codierenden Bereich einer dieser Nukleotid- Sequenzen oder ein Komplement davon. In anderen besonders bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das erfindungsgemäße isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die an eine in Anhang A angegebene Nukleotidsequenz hybridisiert oder mindestens zu etwa 80 %, vorzugsweise mindestens zu etwa 85 %, stärker bevor- zugt mindestens etwa 90 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder noch identischer dazu ist, oder einen Abschnitt davon. In anderen bevorzugten Ausführungsformen codiert das isolierte Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang B aufgeführten Aminosäuresequenzen. Die bevorzugten erfindungsgemäßen SA-Proteine besitzen ebenfalls vorzugsweise mindestens eine der hier beschriebenen SA-Aktivitäten.
Bei einer weiteren Ausführungsform codiert das isolierte Nukleinsauremolekule ein Protein oder einen Abschnitt davon, wobei das Protein oder sein Abschnitt eine Aminosäuresequenz enthält, die zu einer Aminsosäuresequenz in Anhang B hinreichend homolog ist, bspw. zu einer Aminsosäuresequenz in Anhang B derart hinreichend identisch ist, daß das Protein oder sein Abschnitt eine SA- Aktivität behält . Vorzugsweise behält das von dem Nukleinsäure- molekül codierte Protein oder der Abschnitt davon die Fähigkeit, eine an der Stressantwort, Entgiftung oder DNA-Reparatur, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii auszuüben. Bei einer Ausführungsform ist das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein mindestens etwa 80 % , vorzugsweise mindestens etwa 85 % und stärker bevorzugt mindestens etwa 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % oder noch identischer zu einer Aminosäuresequenz in Anhang B (bspw. einer vollständigen Aminosäuresequenz, ausgewählt aus den in Anhang B genannten Sequenzen) . Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungs- form ist das Protein ein A. gossypii-Vollängenprotein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz in Anhang B (die von einem in Anhang A gezeigten offenen Leseraster codiert wird) im wesentlichen homolog ist .
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das isolierte Nukleinsäuremolekül aus A. gossypii und codiert ein Protein (z.B. ein SA-Fusionsprotein), das eine biologisch aktive Domäne umfaßt, die zu einer der Aminosäuresequenzen in Anhang B zumindest zu etwa 80 % oder stärker homolog ist und eine an der DANN-Reparatur, Entgiftung oder Stressantwort durch Prozesse wie, Abfangen von Radikalen beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben kann oder eine oder mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Aktivitäten aufweist, und enthält auch heterologe Nukleinsäure- sequenzen, die ein heterologes Polypeptid oder regulatorische Bereiche codieren.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das isolierte Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. Das isolierte Nuklein- säuremolekül entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Die isolierte Nukleinsäure codiert stärker bevorzugt ein natürlich vorkommendes A. gossypii-SA-Protein oder einen biologisch aktiven Abschnitt davon.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, bspw. rekombinante Expressionsvektoren, die die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule enthalten, und Wirtszellen, in die diese Vektoren eingebracht worden sind. Bei einer Ausführungsform wird diese Wirtszelle zur Herstellung eines SA-Proteins verwendet, indem die Wirtszelle in einem geeigneten Medium gezüchtet wird. Das SA-Protein kann dann aus dem Medium oder der Wirtszelle isoliert werden.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft einen genetisch ver- änderten Mikroorganismus, bei dem ein SA-Gen eingebracht oder verändert worden ist. Das Genom des Mikroorganismus ist bei einer Ausführungsform durch Einbringen eines erfindungsgemäßen Nuklein- säuremoleküls verändert worden, das die SA-Wildtyp- oder die mutierte SA-Sequenz als Transgen codiert . Bei einer anderen Ausführungsform ist ein endogenes SA-Gen im Genom des Mikroorganismus durch homologe Rekombination mit einem veränderten SA-Gen verändert, z.B. funktioneil disrumpiert, worden. Der Mikroorganismus gehört bei einer bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Eremothecium / Ashbya, wobei Ashbya gossypii besonders bevorzugt ist. Der Mikroorganismus wird in einer bevorzugten Ausführungsform auch zur Herstellung einer gewünschten Verbindung, wie eines Vitamins verwendet, wobei Riboflavin besonders bevorzugt ist.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein isoliertes SA-Protein oder einen Abschnitt, bspw. einen biologisch aktiven Abschnitt, davon. Das isolierte SA-Protein oder sein Abschnitt kann in einer bevorzugten Ausführungsform eine an der Entgiftung, DNA-Reparatur oder Stressantwort, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii beteiligte Funktion ausüben. Bei einer weiteren bevor- zugten Ausführungsform ist das isolierte SA-Protein oder ein Abschnitt davon hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B, so daß das Protein oder sein Abschnitt die Fähigkeit behält, eine an de Stressantwort durch Prozesse, wie Entfernung von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii auszuüben.
Die Erfindung betrifft zudem ein isoliertes SA-Proteinpräparat. Das SA-Protein umfaßt bei bevorzugten Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz aus Anhang B. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die Erfindung ein isoliertes Vollängen- protein, das zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B (welche von einem offenen Leseraster in Anhang A codiert wird) im wesentlichen homolog ist. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Protein mindestens zu etwa 50 %, vorzugsweise mindestens zu etwa 60 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 %, 80 % oder 90 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, oder 99 % oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B. Das isolierte SA-Protein umfaßt bei anderen Ausführungsformen eine Aminosäuresequenz, die zu min- destens etwa 50 % oder stärker zu einer der Aminosäuresequenzen aus Anhang B homolog ist und eine an der Stressantwort, DNA- Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben kann oder eine oder mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Aktivitäten hat.
Das SA-Polypeptid oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon kann mit einem Nicht-SA-Polypeptid funktionsfähig verbunden werden, damit ein Fusionsprotein entsteht. Dieses Fusionsprotein hat bei bevorzugten Ausführungsformen eine andere Aktivität als das SA-Protein allein. Bei anderen bevorzugten Ausführungsformen übt dieses Fusionsprotein eine an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii aus. Die Integration dieses Fusionsproteins in eine Wirtszelle moduliert bei besonders bevorzugten Ausführungsformen die Produktion einer gewünschten Verbindung von der Zelle. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie. Das Verfahren sieht die Anzucht einer Zelle vor, die einen Vektor enthält, der die Expression eines erfindungsgemäßen SA-Nukleinsäuremoleküls bewirkt, so daß eine Feinchemikalie produziert wird. Dieses Verfahren umfaßt bei einer bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt der Gewinnung einer Zelle, die einen solchen Vektor enthält, wobei die Zelle mit einem Vektor transfiziert ist, der die Expression einer SA-Nukleinsäure bewirkt. Dieses Verfahren umfaßt bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zudem den Schritt, bei dem die Feinchemikalie aus der Kultur gewonnen wird. Die Zelle gehört bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform zur Gattung Eremothecium/ Ashbya oder ist aus den in Tabelle 2 angegebenen Stämmen ausgewählt .
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Produktion eines Moleküls von einem Mikroorganismus . Diese Verfahren umfassen das Zusammenbringen der Zelle mit einer Substanz, die die SA-Proteinaktivität oder die SA-Nukleinsäure-Expression moduliert, so daß eine zellassoziierte Aktivität verglichen mit der gleichen Aktivität bei Fehlen der Substanz verändert wird. Die Zelle wird bei einer bevorzugten Ausführungsform hinsichtlich eines oder mehrerer an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung beteiligten Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, moduliert, so daß die Ausbeute oder die Geschwindigkeit der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Mikroorganismus verbessert wird. Die Substanz, die die SA-Proteinaktivität moduliert, kann eine Substanz sein, die die SA-Proteinaktivität oder die SA-Nukleinsäure-Expression stimuliert. Beispiele für Substanzen, die die SA-Proteinaktivität oder SA-Nukleinsäureexpression stimulieren, umfassen kleine Moleküle, aktive SA-Proteine und Nukleinsäuren, die SA-Proteine codieren und in die Zelle eingebracht worden sind. Beispiele für Substanzen, die die SA-Aktivität oder -Expression hemmen, umfassen kleine Moleküle und SA-Antisense-Nukleinsäuremoleküle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verfahren zur Modulation der Ausbeuten einer gewünschten Verbindung aus einer Zelle, umfassend das Einbringen eines SA-Wildtyp- oder -Mutantengens in eine Zelle, das entweder auf einem gesonderten Plasmid bleibt oder in das Genom der Wirtszelle integriert wird. Die Integration in das Genom kann zufallsgemäß oder durch homologe Rekombination erfolgen, so daß das native Gen durch die integrierte Kopie ersetzt wird, was die Produktion der gewünschten Verbindung von der zu modulierenden Zelle hervorruft. Diese Ausbeuten sind bei einer bevorzugten Ausführungsform erhöht. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Chemikalie eine Feinchemikalie, die in einer besonders bevorzugten Ausführungsform ein Vitamin ist. Dieses Vitamin ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform Riboflavin.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt SA-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle bereit, die an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, in Ashbya gossypii beteiligt sind. Die erfindungsgemäßen Moleküle lassen sich bei der Modulation der Produktion von Feinchemikalien von Mikroorganismen, wie A. gossypii, entweder direkt (z.B. wenn z.B die verlängerte Lebensfähigkeit der Zelle eine direkte Auswirkung auf Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von z.B. Pyruvat aus modifizierten A. gossypii hat) oder durch indirekte Auswirkung verwenden, was dennoch zu einem Anstieg der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion der gewünschten Verbindung führt (z.B. wenn die Modulation von an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung beteiligten Proteinen zu Änderungen in der Menge der Energie führt, die • zur Durchführung notwendiger Stoffwechselprozesse und anderer Zeilfunktionen, wie Nukleinsäure- und Proteinbiosynthese und Transkription/ ranslation, verfügbar ist) . Die erfindungsgemäßen Aspekte sind nachstehend weiter erläutert.
Feinchemikalien
Der Begriff "Feinchemikalie" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Moleküle, die von einem Organismus produziert werden und in verschiedenen Industriezweigen Anwendungen finden, wie bspw. , jedoch nicht beschränkt auf die pharmazeutische Industrie, die Landwirtschafts- und Kosmetikindustrie. Diese Verbindungen umfassen organische Säuren, wie Weinsäure, Itaconsäure und Diaminopimelinsäure, sowohl proteinogene als auch nicht-proteino- gene Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleoside und
Nukleotide (wie bspw. beschrieben in Kuninaka, A. (1996) Nucleo- tides and related compounds, S. 561-612, in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten) , Lipide, gesättigte und ungesättigte Fettsäuren (bspw. Arachidonsäure) , Diole (bspw. Propandiol und Butandiol) , Kohlehydrate (bspw. Hyaluronsäure und Trehalose) , aromatische Verbindungen (bspw. aromatische Amine, Vanillin und Indigo) , Vitamine und Cofaktoren (wie beschrieben in Ull ann's Ency- clopedia of Industrial Chemistry, Bd. A27, "Vitamins", S. 443-613 (1996) VCH: Weinheim und den darin enthaltenen Zitaten; und Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for Free Radical Research - Asien, abgehalten am 1. bis 3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press (1995)), Enzyme und sämtliche anderen von Gutcho (1983) in Chemicals by Fermentation, Noyes Data Corporation, ISBN: 0818805086 und den darin angegebenen Literaturstellen beschriebenen Chemikalien. Der Metabolismus und die Verwendungen bestimmter Feinchemikalien sind nachstehend weiter erläutert .
A. Metabolismus und Verwendungen von Vi taminen, Cofaktoren und Nutra∑eutika
Vitamine, Cofaktoren und Nutrazeutika umfassen eine Gruppe von Molekülen. Höhere Tiere haben die Fähigkeit verloren, diese zu synthetisieren und müssen sie somit aufnehmen, obwohl sie leicht durch andere Organismen, wie Bakterien, synthetisiert werden. Diese Moleküle sind entweder biologisch aktive Moleküle an sich oder Vorstufen von biologisch aktiven Substanzen, die als Elektronenüberträger oder Zwischenprodukte bei einer Reihe von Stoffwechselwegen dienen. Diese Verbindungen haben neben ihrem Nährwert auch einen signifikanten industriellen Wert als Farbstoffe, Antioxidantien und Katalysatoren oder andere Ver- arbeitungs-Hilfsstoffe. (Für einen Überblick über die Struktur, Aktivität und die industriellen Anwendungen dieser Verbindungen siehe bspw. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996). Der Begriff "Vitamin" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt Nährstoffe, die von einem Organismus für eine normale Funktion benötigt werden, jedoch nicht von diesem Organismus selbst synthetisiert werden können. Die Gruppe der Vitamine kann
Cofaktoren und nutrazeutische Verbindungen umfassen. Der Begriff "Cofaktor" umfaßt nicht-proteinartige Verbindungen, die für das Auftreten einer normalen Enzymaktivität nötig sind. Diese Verbindungen können organisch oder anorganisch sein; die erfindungs- gemäßen Cofaktor-Moleküle sind vorzugsweise organisch. Der Begriff "Nutrazeutikum" umfaßt Nahrungsmittelzusätze, die bei Pflanzen und Tieren, insbesondere dem Menschen, gesundheitsfördernd sind. Beispiele solcher Moleküle sind Vitamine, Antioxidantien und ebenfalls bestimmte Lipide (z.B. mehrfach unge- sättigte Fettsäuren) .
Die Biosynthese dieser Moleküle in Organismen, die zu ihrer Produktion befähigt sind, wie Bakterien, ist umfassend charakterisiert worden (Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, "Vitamins", Bd. A27, S. 443-613, VCH: Weinheim, 1996, Michal, G. (1999) Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley & Sons; Ong, A.S., Niki, E. und Packer, L. (1995) "Nutrition, Lipids, Health and Disease" Proceedings of the UNESCO/Confederation of Scientific and Technological Associations in Malaysia and the Society for free Radical Research - Asien, abgehalten am 1. bis 3. Sept. 1994 in Penang, Malaysia, AOCS Press, Champaign, IL X, 374 S) .
Thiamin (Vitamin Bi) wird durch chemisches Kuppeln von Pyrimidin und Thiazol-Einheiten gebildet. Riboflavin (Vitamin B ) wird aus Guanosin-5 ' -triphosphat (GTP) und Ribose-5 ' -phosphat synthetisiert. Riboflavin wiederum wird zur Synthese von Flavin- mononukleotid (FMN) und Flavinadenindinukleotid (FAD) eingesetzt. Die Familie von Verbindungen, die gemeinsam als "Vitamin Bg" bezeichnet werden (bspw. Pyridoxin, Pyridoxamin, Pyridoxal-5 ' - phosphat und das kommerziell verwendete Pyridoxinhydrochlorid) , sind alle Derivate der gemeinsamen Struktureinheit 5-Hydroxy-6- methylpyridin. Panthothenat (Pantothensäure, R- (+) -N- (2 , 4-Di- hydroxy-3 , 3-dimethyl-l-oxobutyl) -ß-alanin) kann entweder durch chemische Synthese oder durch Fermentation hergestellt werden. Die letzten Schritte bei der Pantothenat-Biosynthese bestehen aus der ATP-getriebenen Kondensation von ß-Alanin und Pantoinsäure . Die für die Biosyntheseschritte für die Umwandlung in Pantoinsäure, in ß-Alanin und zur Kondensation in Pantothensäure verantwortlichen Enzyme sind bekannt. Die metabolisch aktive Form von Pantothenat ist Coenzym A, dessen Biosynthese über 5 enzymatische Schritte verläuft. Pantothenat, Pyridoxal-5' -phosphat, Cystein und ATP sind die Vorstufen von Coenzym A. Diese Enzyme katalysieren nicht nur die Bildung von Pantothenat, sondern auch die Produktion von (R) -Pantoinsäure, (R) -Pantolacton, (R) -Panthenol (Provitamin B5) , Pantethein (und seinen Derivaten) und Coenzym A.
Die Biosynthese von Biotin aus dem Vorstufenmolekül Pimeloyl-CoA in Mikroorganismen ist ausführlich untersucht worden, und man hat mehrere der beteiligten Gene identifiziert. Es hat sich herausgestellt, daß viele der entsprechenden Proteine an der Fe-Cluster-Synthese beteiligt sind und zu der Klasse der nifS- Proteine gehören. Die Liponsäure wird von der Octanonsäure abgeleitet und dient als Coenzym beim Energie-Metabolismus, wo sie Bestandteil des Pyruvatdehydrogenasekomplexes und des α-Keto- glutaratdehydrogenasekomplexes wird. Die Folate sind eine Gruppe von Substanzen, die alle von der Folsäure abgeleitet werden, die wiederum von L-Glutaminsäure, p-Aminobenzoesäure und 6-Methyl- pterin hergeleitet ist . Die Biosynthese der Folsäure und ihrer Derivate, ausgehend von den StoffWechselzwischenprodukten Guano- sin-5' -triphosphat (GTP), L-Glutaminsäure und p-Aminobenzoesäure ist in bestimmten Mikroorganismen eingehend untersucht worden. Corrinoide (wie die Cobalamine und insbesondere Vitamin Bι2) und die Porphyrine gehören zu einer Gruppe von Chemikalien, die sich durch ein Tetrapyrrol-Ringsystem auszeichnen. Die Biosynthese von Vitamin B]_2 ist hinreichend komplex, daß sie noch nicht voll- ständig charakterisiert worden ist, jedoch ist inzwischen ein Großteil der beteiligten Enzyme und Substrate bekannt. Nikotinsäure (Nikotinat) und Nikotinamid sind Pyridin-Derivate, die auch als "Niacin" bezeichnet werden. Niacin ist die Vorstufe der wichtigen Coenzyme NAD (Nikotinamidadenindinukleotid) und NADP (Nikotinamidadenindinukleotidphosphat) und ihrer reduzierten Forme .
Die Produktion dieser Verbindungen im Großmaßstab beruht größtenteils auf zellfreien chemischen Synthesen, obwohl einige dieser Chemikalien, wie Riboflavin, Vitamin Bg, Pantothenat und Biotin, auch durch großangelegte Anzucht von Mikroorganismen produziert worden sind. Nur Vitamin Bχ wird aufgrund der Komplexität seiner Synthese lediglich durch Fermentation produziert. In-vitro-Ver- fahren erfordern einen erheblichen Aufwand an Materialien und Zeit und häufig an hohen Kosten.
B. Meta.boIisii.us und Verwendungen von Aminosäuren
Die Aminosäuren umfassen die grundlegenden Struktureinheiten sämtlicher Proteine und sind somit für die normalen Zell- funktionen in allen Organismen essentiell. Der Begriff "Aminosäure" ist im Fachgebiet bekannt. Die proteinogenen Aminosäuren, von denen es 20 Arten gibt, dienen als Struktureinheiten für Proteine, in denen sie über Peptidbindungen miteinander verknüpft sind, wohingegen die nicht-proteinogenen Aminosäuren (von denen Hunderte bekannt sind) gewöhnlich nicht in Proteinen vorkommen (siehe Ulimann' s Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 57-97 VCH: Weinheim (1985)). Die Aminosäuren können in der optischen D- oder L-Konfiguration vorliegen, obwohl L-Aminosäuren gewöhnlich der einzige Typ sind, den man in natürlich vorkommenden Proteinen vorfindet. Biosynthese- und Abbauwege von jeder der 20 proteinogenen Aminosäuren sind sowohl bei prokaryontisehen als auch eukaryotisehen Zellen gut charakterisiert (siehe bspw. Stryer, L., Biochemistry, 3. Auflage, S. 578-590 (1988)). Die "essentiellen" Aminosäuren (Histidin, Isoleucin, Leucin, Lysin, Methionin, Phenylalanin, Threonin, Tryptophan und Valin) , so bezeichnet, weil sie aufgrund der Komplexität ihrer Biosynthese gewöhnlich mit der Ernährung aufgenommen werden müssen, werden durch einfache Biosynthesewege in die übrigen 11 "nichtessen- tiellen" Aminosäuren (Alanin, Arginin, Asparagin, Aspartat,
Cystein, Glutamat, Glutamin, Glycin, Prolin, Serin und Tyrosin) umgewandelt. Höhere Tiere besitzen die Fähigkeit, einige dieser Aminosäuren zu synthetisieren, jedoch müssen die essentiellen Aminosäuren mit der Nahrung aufgenommen werden, damit eine normale Proteinsynthese stattfindet.
Abgesehen von ihrer Funktion bei der Proteinbiosynthese sind diese Aminosäuren interessante Chemikalien an sich, und man hat entdeckt, daß viele bei verschiedenen Anwendungen in der Nahrungsmittel-, Futter-, Chemie-, Kosmetik-, Landwirtschaftsund pharmazeutischen Industrie zum Einsatz kommen. Lysin ist nicht nur für die Ernährung des Menschen eine wichtige Aminosäure, sondern auch für monogastrische Tiere, wie Geflügel und Schweine. Glutamat wird am häufigsten als Geschmacksadditiv (Mononatriumglutamat, MSG) sowie weithin in der Nahrungsmittelindustrie verwendet, wie auch Aspartat, Phenylalanin, Glycin und Cystein. Glycin, L-Methionin und Tryptophan werden sämtlich in der pharmazeutischen Industrie verwendet. Glutamin, Valin, Leucin, Isoleucin, Histidin, Arginin, Prolin, Serin und Alanin werden in der pharmazeutischen Industrie und der Kosmetikindustrie verwendet. Threonin, Tryptophan und D-/L-Methionin sind weitverbreitete Futtermittelzusätze (Leuchtenberger, W. (1996) Amino acids - technical production and use, S. 466-502 in Rehm et al., (Hrsg.) Biotechnology Bd. 6, Kapitel 14a, VCH: Weinheim). Man hat entdeckt, daß sich diese Aminosäuren außerdem als Vorstufen für die Synthese von synthetischen Aminosäuren und Proteinen, wie N-Acetylcystein, S-Carboxymethyl-L-cystein,
(S) -5-Hydroxytryptophan und anderen in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2 , S. 57-97, VCH, Weinheim, 1985 beschriebenen Substanzen eignen.
Die Biosynthese dieser natürlichen Aminosäuren in Organismen, die sie produzieren können, bspw. Bakterien, ist gut charakterisiert worden (für einen Überblick der bakteriellen Aminosäure-Biosynthese und ihrer Regulation s. Umbarger, H.E. (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:533-606). Glutamat wird durch reduktive Aminierung von -Ketoglutarat, einem Zwischenprodukt im Citronensäure- Zyklus, synthetisiert. Glutamin, Prolin und Arginin werden jeweils nacheinander aus Glutamat erzeugt. Die Biosynthese von Serin erfolgt in einem Dreischritt-Verfahren, beginnt mit 3-Phosphoglycerat (einem Zwischenprodukt der Glykolyse) und er- gibt nach Oxidations-, Transaminierungs- und Hydrolyseschritten diese Aminosäure. Cystein und Glycin werden jeweils aus Serin produziert, und zwar die erstere durch Kondensation von Homo- cystein mit Serin, und die letztere durch Übertragung des Seiten- ketten-ß-Kohlenstoffatoms auf Tetrahydrofolat in einer durch Serin-Transhydroxymethylase katalysierten Reaktion. Phenylalanin und Tyrosin werden aus den Vorstufen des Glykolyse- und Pentose- phosphatweges, Erythrose-4-phosphat und Phosphoenolpyruvat, in einem 9-Schritt-Biosyntheseweg synthetisiert, der sich nur in den letzten beiden Schritten nach der Synthese von Präphenat unterscheidet. Tryptophan wird ebenfalls aus diesen beiden Ausgangsmolekülen produziert, jedoch erfolgt dessen Synthese in einem 11-Schritt-Weg. Tyrosin läßt sich in einer durch Phenylalanin- hydroxylase katalysierten Reaktion auch aus Phenylalanin herstellen. Alanin, Valin und Leucin sind jeweils Biosyntheseprodukte aus Pyruvat, dem Endprodukt der Glykolyse. Aspartat wird aus Oxalacetat, einem Zwischenprodukt des Citratzyklus, gebildet. Asparagin, Methionin, Threonin und Lysin werden jeweils durch Umwandlung von Aspartat produziert. Isoleucin wird aus Threonin gebildet. In einem komplexen 9-Schritt-Weg erfolgt die Bildung von Histidin aus 5-Phosphoribosyl-l-pyrophosphat , einem aktivierten Zucker.
Aminosäuren, deren Menge den Proteinbiosynthesebedarf übersteigt, können nicht gespeichert werden, und werden statt dessen abgebaut, so daß Zwischenprodukte für die Haupt-Stoffwechselwege der Zelle bereitgestellt werden (für einen Überblick siehe Stryer, L. , Biochemistry, 3. Aufl. Kap. 21 "Amino Acid Degradation and the Urea Cycle"; S 495-516 (1988)). Die Zelle ist zwar in der Lage, ungewünschte Aminosäuren in nützliche Stoffwechsel- Zwischenprodukte umzuwandeln, jedoch ist die Aminosäureproduktion hinsichtlich der Energie, der Vorstufenmoleküle und der für ihre Synthese nötigen Enzyme aufwendig. Es überrascht daher nicht, daß die Aminosäure-Biosynthese durch Feedback-Hemmung reguliert wird, wobei das Vorliegen einer bestimmten Aminosäure ihre eigene Produktion verlangsamt oder ganz beendet (für einen Überblick über Rückkopplungs-Mechanismen bei Aminosäure-Biosynthesewegen, siehe Stryer, L., Biochemistry, 3. Aufl., Kap. 24, "Biosynthesis of Amino Acids and Heme", S. 575-600 (1988)). Der Ausstoß einer bestimmten Aminosäure wird daher durch die Menge dieser Aminosäure in der Zelle eingeschränkt .
C. Pur in- , Pyrimidin-, Nukleosid- und Nukleotid-Metabolismus und Verwendungen
Gene für den Purin- und Pyrimidin-Stoffwechsel und ihre entsprechenden Proteine sind wichtige Ziele für die Therapie von Tumorerkrankungen und Virusinfektionen. Der Begriff "Purin" oder "Pyrimidin" umfaßt stickstoffhaltige Basen, die Bestandteile der Nukleinsäuren, Coenzyme und Nukleotide sind. Der Begriff "Nukleotid" beinhaltet die grundlegenden Struktureinheiten der Nukleinsauremolekule, die eine stickstoffhaltige Base, einen Pentose-Zucker (bei RNA ist der Zucker Ribose, bei DNA ist der Zucker D-Desoxyribose) und Phosphorsäure umfassen. Der Begriff "Nukleosid" umfaßt Moleküle, die als Vorstufen von Nukleotiden dienen, die aber im Gegensatz zu den Nukleotiden keine Phosphorsäureeinheit aufweisen. Durch Hemmen der Biosynthese dieser Moleküle oder ihrer Mobilisierung zur Bildung von Nukleinsäure- molekülen ist es möglich, die RNA- und DNA-Synthese zu hemmen; wird diese Aktivität zielgerichtet bei Krebszellen gehemmt, läßt sich die Teilungs- und Replikationsfähigkeit von Tumorzellen hemmen. Es gibt zudem Nukleotide, die keine Nukleinsauremolekule bilden, jedoch als Energiespeicher (d.h. AMP) oder als Coenzyme (d.h. FAD und NAD) dienen.
Mehrere Veröffentlichungen haben die Verwendung dieser Chemikalien für diese medizinischen Indikationen beschrieben, wobei der Purin- und/oder Pyrimidin-Metabolismus beeinflußt wird (bspw. Christopherson, R.I. und Lyons, S.D. (1990) "Potent inhibitors of de novo pyrimidine and purine biosynthesis as chemotherapeutic agents", Med. Res. Reviews 10:505-548). Untersuchungen an Enzymen, die am Purin- und Pyrimidin-Metabolismus beteiligt sind, haben sich auf die Entwicklung neuer Medikamente konzentriert, die bspw. als Immunsuppressiva oder Antiproliferan- tien verwendet werden können (Smith, J.L. (1995) "Enzymes in
Nucleotide Synthesis" Curr. Opin. Struct. Biol . 5:752-757; (1995) Biochem. Soc. Transact. 23:877-902). Die Purin- und Pyrimidin- basen, Nukleoside und Nukleotide haben jedoch auch andere Einsatzmöglichkeiten: als Zwischenprodukte bei der Biosysnthese ver- schiedener Feihchemikalien (z.B. Thiamin, S-Adenosyl-methionin, Folate oder Riboflavin) , als Energieträger für die Zelle (bspw. ATP oder GTP) und für Chemikalien selbst, die gewöhnlich als Geschmacksverstärker (bspw. IMP oder GMP) oder für viele medizinische Anwendungen verwendet werden (siehe bspw. Kuninaka, A. , (1996) "Nucleotides and Related Compounds in Biotechnology Bd. 6, Rehm et al., Hrsg. VCH: Weinheim, S. 561-612). Enzyme, die am Purin-, Pyrimidin-, Nukleosid- oder Nukleotid-Metabolismus beteiligt sind, dienen auch immer stärker als Ziele, gegen die Chemikalien für den Pflanzenschutz, einschließlich Fungiziden, Herbiziden und Insektiziden, entwickelt werden.
Der Metabolismus dieser Verbindungen in Bakterien ist charakterisiert worden (für Übersichten siehe bspw. Zalkin, H. und Dixon, J.E. (1992) "De novo purin nucleotide biosynthesis" in Progress in Nucleic Acids Research and Molecular Biology, Bd. 42, Academic Press, S. 259-287; und Michal, G. (1999) "Nucleotides and Nucleo- sides"; Kap. 8 in: Biochemical Pathways : An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, Wiley, New York) . Der Purin-Metabolismus, das Objekt intensiver Forschung, ist für das normale Funktio- nieren der Zelle essentiell. Ein gestörter Purin-Metabolismus in höheren Tieren kann schwere Erkrankungen verursachen, bspw. Gicht. Die Purinnukleotide werden aus Ribose-5-phosphat über eine Reihe von Schritten über die Zwischenverbindung Inosin-5 ' - phosphat (IMP) synthetisiert, was zur Produktion von Guanosin-5'- monophosphat (GMP) oder Adenosin-5 ' -monophosphat (AMP) führt, aus denen sich die als Nukleotide verwendeten Triphosphatformen leicht herstellen lassen. Diese Verbindungen werden auch als Energiespeicher verwendet, so daß ihr Abbau Energie für viele verschiedene biochemische Prozesse in der Zelle liefert. Die Pyrimidinbiosynthese erfolgt über die Bildung von Uridin-5 ' - monophosphat (UMP) aus Ribose-5-phosphat . UMP wiederum wird in Cytidin-5 ' -triphosphat (CTP) umgewandelt. Die Desoxyformen sämtlicher Nukleotide werden in einer Einschritt-Reduktionsreaktion aus der Diphosphat-Riboseform des Nukleotides zur Diphosphat- Desoxyriboseform des Nukleotides hergestellt. Nach der Phosphory- lierung können diese Moleküle an der DNA-Synthese teilnehmen.
D. Trehalose-Metabolismus und Verwendungen
Trehalose besteht aus zwei Glucosemolekülen, die über eine α,α-l, 1-Bindung miteinander verknüpft sind. Sie wird gewöhnlich in der Nahrungsmittelindustrie als Süßstoff, als Additiv für getrocknete oder gefrorene Nahrungsmittel sowie in Getränken verwendet. Sie wird jedoch auch in der pharmazeutischen Industrie, der Kosmetik- und Biotechnologie-Industrie angewendet (s. bspw. Nishimoto et al . , (1998) US-Patent Nr. 5 759 610; Singer, M.A. und Lindquist, S. (1998) Trends Biotech. 16:460-467; Paiva,
C.L.A. und Panek, A.D. (1996) Biotech Ann. Rev. 2:293-314; und Shiosaka, M. (1997) J. Japan 172:97-102). Trehalose wird durch Enzyme von vielen Mikroorganismen produziert und auf natürliche Weise in das umgebende Medium abgegeben, aus dem sie durch im Fachgebiet bekannte Verfahren gewonnen werden kann.
Bedeutung von Stressantwort, DNA-Reparatur in der Zelle
Organismus sind einer Reihe von Stressfaktoren ausgesetzt. Diese Faktoren lassen sich nach Ihrer Wirkung wie folgt nach Stresstypen einteilen:
- Nicht optimale Temperatur
- Oxidativer Stress Hyperosmolarität - Hypoosmolarität
- Mechanischer Stress
- Nicht optimales Nährstoffangebot
- Kontakt mit Stoffen, die Giftcharakter aufweisen
Alle diese Stresstypen sind in der Lage die Zelle zu schädigen oder sogar abzutöten. Um einen Schutz gegen diese Gefährdung aufzubauen, besitzen die Zellen Systeme der Stressantwort, die in der Lage sind die Zelle an den Stress zu adaptieren, oder die Ursache des Stress zu beseitigen.
Die Antwort der Zelle auf Stress beinhaltet Prozesse der Wachs- 5 tumskontrolle, der Signaltransduktion, der Transkription und der postranslationalen Kontrolle.
Die Nutzung von Mikroorganismen in Fermentern führt ebenfalls zu einer Reihe von Stresstypen (Attfield, PV, Nature Biotechnology, 10 1997, 15, 1351-1357) .
So ist hier mit oxidativem Stress, einer nicht optimalen Osmolarität, mechanischen Stress (Scherrstress hervorgerufen durch Rühren) , einem nicht optimalen Nährstoffangebot und 15 Kontakt mit giftigen Produkten des Stoffwechsel zu rechnen. Aerob lebende Organismen haben eine reduziertes, zelluläres Redox-Umgebung aufrecht zu erhalten, parallel zu den prooxi- dativen Verhältnissen die ein aerobes Leben mit sich bringt .
20 Die unvollständige Reduktion von Sauerstoff zu Wasser führt zu der Bildung von Redox-aktiven Sauerstoffintermediaten (ROI) , wie Superoxidanionen Radikale, Hydrogenperoxid und Hydroxylradikale. ROI werden ebenfalls bei der ß-Oxidation der Fettsäuren, bei Einfluß von UV oder radioaktiver Strahlung, durch Metalle und
25 Redox-aktiven Substanzen gebildet. Oxidativer Stress resultiert aus abnormal hohen Mengen an ROIs, die den zellulären Redox- Status stören und zur Schädigung von Lipiden, Proteinen, DNA und RNA führen (Godon, C. et al. The Journal of Biological Chemistry, 1998, 273, 22480-22489).
30
Aus diesem Grund prüfen Organismen ununterbrochen ihren Redox- status und Adaptieren auf Änderungen durch die Induktion von Genen oder Aktivierung von Genprodukten, die in der Lage sind den zellulären Redox-Zustand in der Zelle wieder auf einen für
35 die Zelle ungefährlichen Wert einzustellen. Gleichzeitig werden aber auch Gene oder Genprodukte aktiviert, die durch ROIs oder Strahlung geschädigte DNA erkennen und wieder reparieren können.
Gleiches gilt für die Adaption an veränderte Osmolarität. Auch 40 hier prüft die Zelle den Osmostatus und reagiert auf Änderung durch Aktivierung von Genen und Genprodukten, die ungefährliche osmolarische Bedingungen einstellen (Blomberg, A, Electro- phoresis, 1997, 18, 1429-1440). Entsprechendes gilt für mechanischen Stress und Stress durch Närstofflimitierung. 45 Werden Organismen mit Giften konfrontiert, dann werden Gene oder Genprodukte aktiviert, die entweder das Gift durch Modifizierung unschädlich machen, oder TransportSysteme aktivieren, die in der Lage sind, die Gifte aus der Zelle zu schaffen (Baumeister, W, Critical Reviews in Microbiology, 1997, 23, 1-46).
Die Nutzung von Genen der Stressantwort zur Generierung von Ashbya gossypii Stämmen, mit einer folglich höheren Resistenz gegen Stress ist ein wertvoller Aspekt der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäße Elemente und Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung von neuen Molekülen, die hier als SA-Nukleinsäure- und -Protein-Moleküle bezeichnet werden und an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, teilnehmen können. Bei einer Ausführungsform nehmen die SA-Moleküle an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, in Ashbya gossypii teil. Die Aktivität der erfindungsgemäßen SA-Moleküle, in der Stressantwort, DNA-Reparatur und Entgiftung in A. gossypii beizutragen, hat bei einer bevorzugten Ausführungsform eine Auswirkung auf die Produktion einer gewünschten Feinchemikalie durch diesen Organismus. Bei einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Aktivität der erfindungsgemäßen SA-Moleküle moduliert, so daß die Stoffwechsel- und Energiewege von A. gossypii , an denen die erfindungsgemäßen SA-Proteine teilnehmen, hinsichtlich der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion moduliert werden, die entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Feinchemikalie aus A. gossypii modulieren.
Der Begriff "SA-Protein" oder "SA-Polypeptid" umfaßt Proteine, die eine an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben können. Beispiele für SA-Proteine um- fassen solche, die von den in Tabelle 1 und Anhang A aufgeführten SA-Genen codiert werden. Die Ausdrücke "SA-Gen" oder "SA-Nuklein- säuresequenz" umfassen Nukleinsäuresequenzen, die ein SA-Protein codieren, das aus einem codierenden Bereich und entsprechenden untranslatierten 5'- und 3 ' -Sequenzbereichen besteht. Beispiele für SA-Gene sind die in Tabelle 1 aufgelisteten. Die Begriffe
"Produktion" oder "Produktivität" sind im Fachgebiet bekannt und beinhalten die Konzentration des Fermentationsproduktes (bspw. der gewünschten Feinchemikalie) , das innerhalb einer festgelegten Zeitspanne und eines festgelegten Fermentationsvolumens gebildet wird (bspw. kg Produkt pro Std. pro 1) . Der Begriff "Effizienz der Produktion" umfaßt die Zeit, die zur Erzielung einer bestimmten Produktionsmenge nötig ist (bspw. wie lange die Zelle zur Aufrichtung einer bestimmten Ausstoßrate einer Feinchemikalie benötigt) . Der Begriff "Ausbeute" oder "Produkt/ Kohlenstoff-Ausbeute" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Effizienz der Umwandlung der Kohlenstoffquelle in das Produkt (d.h. die Feinchemikalie) . Dies wird bspw. gewöhnlich ausgedrückt als kg Produkt pro kg Kohlenstoffquelle. Durch Vergrößern der Ausbeute oder Produktion der Verbindung wird die Menge der gewonnenen Moleküle oder der geeigneten gewonnenen Moleküle dieser Verbindung in einer bestimmten Kulturmenge über einen festgelegten Zeitraum erhöht. Die Begriffe "Biosynthese" oder "Biosyntheseweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Synthese einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle aus Zwischenverbindungen, bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Die Begriffe "Abbau" oder "Abbauweg" sind im Fachgebiet bekannt und umfassen die Spaltung einer Verbindung, vorzugsweise einer organischen Verbindung, durch eine Zelle in Abbauprodukte (allgemeiner gesagt, kleinere oder weniger komplexe Moleküle) , bspw. in einem Mehrschritt- oder stark regulierten Prozeß. Der Ausdruck "Abbau- produkt" ist im Fachgebiet bekannt und beinhaltet Abbauprodukte einer Verbindung. Diese Produkte können selbst als Vorstufen (Ausgangspunkt) oder Zwischenmoleküle geeignet sein, die für die Biosynthese anderer Verbindungen durch die Zelle notwendig sind. Der Begriff "Metabolismus" ist im Fachgebiet bekannt und umfaßt die Gesamtheit der biochemischen Reaktionen, die in einem Organismus stattfinden. Der Metabolismus einer bestimmten Verbindung (z.B. der Metabolismus einer Aminosäure, wie Glycin) umfaßt dann sämtliche Biosynthese-, Modifikations- und Abbauwege in der Zelle, die diese Verbindung betreffen.
Die erfindungsgemäßen SA-Moleküle sind in einer anderen Ausführungsform befähigt, die Produktion eines gewünschten Moleküls, wie einer Feinchemikalie, in einem Mikroorganismus, wie A. gossypii, zu modulieren. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Änderung eines erfindungsgemäßen SA-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem A. gossypii-Stamm, der ein solches verändertes Protein enthält, direkt beeinflussen kann.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen
SA-Proteinen kann auch zu SA-Proteinen mit geänderten Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion einer oder mehrerer gewünschten Feinchemikalien aus A. gossypii beeinflussen. Beispielsweise kann man durch Verbesserung des Entfernens von Radikalen in der Zelle der reibungslose Ablauf von essentiellen StoffWechselprozessen sichergestellt werden. Zu diesen Prozessen gehört der Aufbau der Zellwände, die Transkription, Translation, die Biosynthese von Verbindungen, die für das Wachstum und die Teilung von Zellen nötig sind (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Lipide usw.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Prokaryontes, Thieme Verlag: Stuttgart, S. 88-109; 913-918; 875-899) . Durch Verbessern von Wachstum und Vermehrung dieser veränderten Zellen ist es möglich, die Lebensfähigkeit der Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern und auch ihre Teilungsrate zu verbessern, so daß eine vergleichsweise größere Anzahl Zellen in der Fermenterkultur überleben kann. Die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion kann zumindest aufgrund der Anwesenheit einer größeren Anzahl lebensfähiger Zellen, die jeweils die gewünschte Feinchemikalie produzieren, erhöht werden.
Die isolierten erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen befinden sich im Genom eines Ashbya gossypii-Staicαxies , der von der American Type Culture Collection unter der Bezeichnung ATCC 10895 erhältlich ist. Die Nukleotidsequenz der isolierten A. gossypii-SA- cDNAs/genomische Klone und die vorhergesagten Aminosäuresequenzen der A. gossypii-SA-Proteine sind im Anhang A bzw. B gezeigt. Es wurden Computeranalysen durchgeführt, die diese Nukleotid- sequenzen als Sequenzen klassifizierten und/oder identifizierten, die Proteine codieren, die eine an der Stressantwort, DNA- Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Proteine, deren Aminosäuresequenz zu einer Aminosäuresequenz in Anhang B im wesentlichen homolog ist. Wie hier verwendet, ist ein Protein, dessen Aminosäuresequenz im wesentlichen homolog zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz ist, zumindest zu etwa 50 % homolog zu der ausgewählten Aminosäuresequenz, bspw. zur gesamten ausgewählten Aminosäuresequenz. Ein Protein, dessen Aminosäuresequenz zu einer ausgewählten Aminosäuresequenz im wesentlichen homolog ist, kann auch mindestens zu etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens zu etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens zu etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 % oder 90 bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens zu etwa 96%, 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zur ausgewählten Aminosäuresequenz sein.
Ein erfindungsgemäßes SA-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt oder Fragment davon kann an der Stressantwort, DNA- Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, in Ashbya gossypii beteiligt sein oder kann eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Aktivitäten aufweisen. In den nachstehenden Unterabschnitten sind verschiedene Aspekte der Erfindung ausführlicher beschrieben:
A. Isolierte Nukleinsauremolekule
Ein Aspekt der Erfindung betrifft isolierte Nukleinsauremolekule, die SA-Moleküle oder biologisch aktive Abschnitte davon codieren, sowie Nukleinsäurefrag ente, die zur Verwendung als Hybridisie- rungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von SA-codierenden Nukleinsäuren (z.B. SA-DNA) hinreichen. Der Begriff "Nukleinsäuremolekül", wie hier verwendet, soll DNA- Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) sowie DNA- oder RNA-Analoga, die mittels Nukleotidanaloga erzeugt werden, umfassen. Dieser Begriff umfaßt zudem die am 3'- und am 5 ' -Ende des codierenden Genbereichs gelegene untrans- latierte Sequenz: mindestens etwa 100 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5 ' -Endes des codierenden Bereichs und mindestens etwa 20 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3 '-Endes des codierenden Bereichs des Gens . Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist aber vorzugsweise doppelsträngige DNA. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind. Eine "isolierte" Nukleinsäure hat vorzugsweise keine Sequenzen, die die Nuklein- säure in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure stammt, natürlicherweise flankieren (bspw. Sequenzen, die sich am 5'- bzw. 3 '-Ende der Nukleinsäure befinden) . In verschiedenen Ausführungsformen kann bspw. das isolierte SA-Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb der Nukleotidsequenzen, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure stammt (bspw. eine A. gossypii-Zelle) flankieren. Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül , kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, bspw. eine Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon, kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der hier bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Bspw. kann eine A. gossypii-SA-cDNA aus einer A. gossypü-Baήk isoliert werden, indem eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie bspw. beschrieben in Sambrook, J. , Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäure- molekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden (z.B. kann ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine vollständige Sequenz aus Anhang A oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isoliert werden, indem Oligonukleotidprimer verwendet werden, die auf der Basis dieser gleichen Sequenz aus Anhang A erstellt worden sind) . Bspw. läßt sich mRNA aus normalen Endothelzellen isolieren (bspw. durch das Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al. (1979) Biochemistry 18: 5294-5299), und die cDNA kann mittels reverser Transkriptase (bspw. Moloney-MLV-Reverse- Transkriptase, erhältlich bei Gibco/BRL, Bethesda, MD, oder AMV-Reverse-Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL) hergestellt werden. Synthetische Oligonukleotidprimer für die Amplifizierung via Polymerasekettenreaktion lassen sich auf der Basis einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen erstellen. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure kann mittels cDNA oder alternativ genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß PCR- Standard-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Die so amplifizierte Nukleinsäure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Oligonukleotide, die einer SA-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, bspw. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine der in Anhang A aufgeführten Nukleotidsequenzen. Die Sequenzen von Anhang A entsprechen den erfindungsgemäßen SA-cDNAs aus Ashbya gossypii . Diese cDNAs umfassen Sequenzen, die SA-Proteine (d.h. den "codierenden Bereich", der in jeder Sequenz in Anhang A angegeben ist), sowie die 5'- und 3 ' -untranslatierten Sequenzen, die ebenfalls in Anhang A angegeben sind. Das Nukleinsäuremolekül kann alternativ nur den codierenden Bereich einer der Sequenzen in Anhang A umfassen.
Für die Zwecke dieser Anmeldung hat selbstverständlich jede der in Anhang A angegebenen Sequenzen eine RXA-Identifizierungs- nummer, wobei hinter der Bezeichnung "RXA" 5 Ziffern aufgeführt sind (bspw. RXA00013). Jede dieser Sequenzen umfaßt bis zu drei Abschnitte: einen stromaufwärts gelegenen 5 '-Bereich, einen codierenden Bereich, und einen stromabwärts gelegenen Bereich. Jeder dieser drei Bereiche ist durch die gleiche RXA-BeZeichnung gekennzeichnet, um Ver- 5 wirrung zu vermeiden. Die Bezeichnung "eine der Sequenzen in
Anhang A" steht dann für eine der Sequenzen in Anhang A, die sich durch ihre unterschiedlichen RXA-Nummern unterscheiden lassen. Der codierende Bereich jeder Sequenz wird in die entsprechende Aminosäuresequenz translatiert, die in Anhang B angegeben ist. 0 Die Sequenzen in Anhang B werden durch die gleichen RXA-Nummern wie in Anhang A identifiziert, so daß sie sich leicht zuordnen lassen. Bspw. ist die mit RXA00013 bezeichnete Aminosäuresequenz in Anhang B eine Translation des codierenden Bereichs der Nukleotidsequenz des Nukleinsäuremoleküls RXA00013 in Anhang A. 5
Bei einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül ein zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen komplementäres Nukleinsäuremolekül oder einen Abschnitt davon, wobei es sich um ein " Nukleinsäuremolekül handelt, das zu einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen hinreichend komplementär ist, daß es mit einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen hybridisieren kann, wodurch ein stabiler Duplex entsteht.
5 Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann überdies nur einen Abschnitt des codierenden Bereichs von einer der Sequenzen in Anhang A umfassen, bspw. ein Fragment, das als Sonde oder Primer oder Fragment verwendet werden kann, welches einen biologisch aktiven Abschnitt eines SA-Proteins codiert. Die aus der 0 Klonierung der SA-Gene aus A. gossypii ermittelten Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung von SA-Homologa in anderen Zelltypen und Organismen und SA-Homologa von anderen Ermothecien oder verwandten Arten ausgelegt sind. Die Sonde bzw. 5 der Primer umfaßt gewöhnlich im wesentlichen gereinigtes Oligo- nukleotid. Das Oligonukleotid umfaßt gewöhnlich einen Nukleotid- sequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges von einer ^ der in Anhang A angegebenen Sequenzen, eines Antisense-Stranges von einer der in Anhang A angegebenen Sequenzen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Basis einer Nukleotidsequenz aus Anhang A können in PCR-Reaktionen zur Klonierung von SA-Homologa verwendet werden. Sonden auf der Basis der SA-Nukleotidsequenzen können zum Nachweisen von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die das gleiche oder homologe Proteine codieren, verwendet werden. In bevorzugten Ausführungs- formen umfaßt die Sonde zudem eine daran gebundene Markierungsgruppe, bspw. ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzym-Cofaktor. Diese Sonden können als Teil eines diagnostischen Test-Kits zur Identifizierung von Zellen 5 verwendet werden, die ein SA-Protein mißexprimieren, bspw. durch Messen einer Menge einer SA-codierenden Nukleinsäure in einer Zellenprobe, bspw. durch Nachweisen der SA-mRNA-Spiegel oder durch Bestimmen, ob ein genomisches SA-Gen mutiert oder deletiert ist.
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Bei einer Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon, der eine Aminosäuresequenz umfaßt, die hinreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B ist, daß das Protein oder ein Abschnitt
15 davon die Fähigkeit behält, eine an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii auszuüben. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "hinreichend homolog" Proteine oder Abschnitte davon, deren Aminosäuresequenzen eine minimale Anzahl
20 identischer oder äquivalenter (bspw. einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette wie ein Aminosäurerest in einer der Sequenzen von Anhang B) Aminosäurereste zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweisen, so daß das Protein oder ein Abschnitt davon eine an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder
25 Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben kann. Somit trägt die "Funktion eines SA-Proteins" indirekt zur Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer oder mehrerer Feinchemikalien bei. In Tabelle 1 sind Beispiele der SA-Protein-
30 aktivitäten angegeben.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Protein mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 35 90 bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäuresequenz in Anhang B.
Abschnitte von Proteinen, die von den erfindungsgemäßen SA- 40 Nukleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der SA-Proteine. Der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt eines SA-Proteins", wie er hier verwendet wird, soll einen Abschnitt, bspw. eine Domäne/ein Motiv eines SA-Proteins, umfassen, die/das an der Stressantwort, DNA- 45 Reparatur oder Entgiftung durch Prozessen, wie Abfangen von Radikalen, in A . gossypii beteiligt ist oder eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist. Zur Bestimmung, ob ein SA-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon am Transport am Stoffwechsel von Kohlenstoffverbindungen oder an der Erzeugung von energiereicher Moleküle in A. gossypii beteiligt sein kann, kann ein Test der enzymatischen Aktivität durchgeführt werden. Diese Testverfahren, wie eingehend beschrieben in Beispiel 8 des Beispielteils, sind dem Fachmann geläufig.
Zusätzliche Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte eines SA-Proteins codieren, lassen sich durch Isolieren eines Abschnitts von einer der Sequenzen in Anhang B, Exprimieren des codierten Abschnitt des SA-Proteins oder -Peptides (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmen der Aktivität des codierten Abschnittes des SA-Proteins oder -Peptides herstellen.
Die Erfindung umfaßt zudem Nukleinsauremolekule, die sich von einer der in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen (und Abschnitten davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und somit das gleiche SA-Protein codieren wie dasjenige, das von den in Anhang A gezeigten Nukleotidsequenzen codiert wird. In einer anderen Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein mit einer in Anhang B gezeigten Aminosäuresequenz codiert. In einer weiteren Ausführungsform codiert das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ein A. gossypii- Vollängenprotein, das zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B (codiert von einem in Anhang A gezeigten offenen Leseraster) im wesentlichen homolog ist.
Zusätzlich zu den in Anhang A gezeigten A. gossypii-SA-Nukleotid- sequenzen, ist dem Fachmann bekannt, daß DNA-Sequenzpoly- morphis en, die zu Änderungen in den Aminosäuresequenzen von SA-Proteinen führen, innerhalb einer Population (bspw. der A. gossypii-Population) existieren können. Diese genetischen Polymorphismen im SA-Gen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Wie hier verwendet, bedeuten die Begriffe "Gen" und "rekombi- nantes Gen" Nukleinsauremolekule mit einem offenen Leseraster, das ein SA-Protein, vorzugsweise ein A. ossypii-SA-Protein, codiert. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidsequenz des SA-Gens. Sämtliche Nukleotidvariationen und daraus resultierenden Amino- säurepolymorphismen in SA, die das Ergebnis natürlicher Variation sind und die funktioneile Aktivität von SA-Proteinen nicht ver- ändern, sollen im Umfang der Erfindung liegen. Nukleinsauremolekule, die natürlichen Varianten entsprechen, und Nicht-Ä. gossypii-Eomologa der erfindungsgemäßen A . gossypii- SA-cDNA können aufgrund ihrer Homologie zur hier offenbarten A. ossypii-SA-Nukleinsäure mit der A. gossypii-cDNA oder einem Abschnitt davon als Hybridisierungssonde gemäß Standard- Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungbedingungen isoliert werden. In einer anderen Ausführungsform ist folglich ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz aus Anhang A umfaßt. In anderen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 Nukleotide lang oder länger. Der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen", wie er hier verwendet wird, soll Hybridisierungs- und Wasch- bedingungen beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60 % homolog zueinander sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Die Bedingungen sind vorzugsweise derart, daß Sequenzen, die mindestens etwa 65 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 75 % oder stärker zueinander homolog sind, gewöhnlich aneinander hybridisiert bleiben. Diese stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und lassen sich in Ausubel et al . , Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. finden. Ein bevorzugtes, nicht-einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen ist eine
Hybridisierung in 6x Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Waschschritten in 0,2 x SSC, 0,1 % SDS bei 50 bis 65°C. Ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz aus Anhang A hybridisiert, entspricht vorzugsweise einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hier verwendet betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (bspw. ein natürliches Protein codiert) . Bei einer Ausführungsform codiert die Nukleinsäure ein natürlich vorkommendes A. gossypii-SA-Protein.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten der SA-Sequenz, die in der Population existieren können, ist der Fachmann sich ebenfalls bewußt darüber, daß Änderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von Anhang A eingebracht werden können, was zur Änderung der Aminosäuresequenz des codierten SA-Proteins führt, ohne daß die Funktionsfähigkeit des SA-Proteins beeinträchtigt wird. Bspw. lassen sich Nukleotidsusbtitutionen, die an "nicht- essentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in einer Sequenz von Anhang A herstellen. Ein "nichtessentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der sich in der Wild- typsequenz von einem der SA-Proteine (Anhang B) verändern läßt, ohne daß die Aktivität des SA-Proteins verändert wird, wohingegen ein "essentieller" Aminosäurerest für die SA-Proteinaktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste jedoch (bspw. nicht- konservierte oder lediglich semikonservierte Aminosäurereste in der Domäne mit SA-Aktivität) können für die Aktivität nicht essentiell sein und lassen sich somit wahrscheinlich verändern, ohne daß die SA-Aktivität verändert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Nukleinsauremolekule, die SA-Proteine codieren, die veränderte Aminosäurereste enthalten, die für die SA-Aktivität nicht-essentiell sind. Diese SA-Proteine unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz in Anhang B, behalten aber dennoch mindestens eine der hier beschriebenen SA-Aktivitäten. Das isolierte Nukleinsäuremolekül umfaßt bei einer Ausführungsform eine Nukleotidsequenz, die ein Protein codiert, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die mindestens etwa 50 % Homologie zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B aufweist und an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, in Ashbya gossypii beteiligt sein kann oder eine oder mehrere der in Tabelle 1 aufgeführten Aktivitäten besitzt. Das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein weist vorzugsweise mindestens etwa 50 bis 60 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 60 bis 70 %, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 90 bis 95 %, und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 % oder 99 % Homologie zu einer der Sequenzen in Anhang B auf.
Zur Bestimmung der prozentualen Identität von zwei -Aminosäuresequenzen (bspw. einer der Sequenzen aus Anhang B und einer mutierten Form davon) oder von zwei Nukleinsäuren werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke untereinander geschrieben (bspw. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingefügt werden, damit ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure erzeugt wird) . Die Aminosäurereste oder die Nukleotide werden dann an den entsprechenden Aminosäure- oder Nukleotidpositionen miteinander verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (bspw. einer der Sequenzen von Anhang B) vom gleichen Aminosäurerest oder Nukleo- tid belegt wird, wie an der entsprechenden Stelle in der anderen Sequenz (bspw. einer mutanten Form der aus Anhang B ausgewählten Sequenz) , dann sind die Moleküle an dieser Position identisch. Die prozentuale Identität zwischen den beiden Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl der identischen Positionen in allen Sequenzen (d.h. % Identität = Anzahl der identischen Positionen/Gesamtanzahl der Positionen x 100) . Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein SA-Protein codiert, das zu einer Proteinsequenz aus Anhang B homolog ist, kann durch Einbringen von einer oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus Anhang A erzeugt werden, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingebracht werden. Die Mutationen können in eine der Sequenzen aus Anhang A durch Standard-Techniken, wie stellengerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese, eingebracht werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren der vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäurereste eingeführt. Bei einer "konservativen Aminosäuresubstitution" wird der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ausgetauscht . Im Fachgebiet sind Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin) , sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein) , nicht-polaren Seitenketten, (bspw. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methio- nin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) . Ein vorhergesagter nicht- essentieller Aminosäurerest in einem SA-Protein wird somit vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest der gleichen Seiten- kettenfamilie ausgetauscht. In einer weiteren Ausführungsform können die Mutationen alternativ zufallsgemäß über die gesamte oder einen Teil der SA-codierenden Sequenz eingebracht werden, bspw. durch Sättigungsmutagenese, und die resultierenden Mutanten können auf eine hier beschriebene SA-Aktivität untersucht werden, um Mutanten zu identifizieren, die eine SA-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese von einer der Sequenzen aus Anhang A kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann bspw. mit den hier beschriebenen Tests (siehe Beispiel 8 des Beispielteils) bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, die die vorstehend beschriebenen SA-Proteine codieren, betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsauremolekule, die antisense dazu sind. Eine "Antisense-"Nukleinsäure umfaßt eine Nukleotidsequenz, die zu einer "Sense-"Nukleinsäure, welche ein Protein codiert, komplementär ist, bspw. komplementär zum codierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer KNA- Sequenz . Eine Antisense-Nukleinsäure kann folglich über Wasserstoffbrückehbindungen an eine Sense-Nukleinsäure binden. Die Antisense-Nukleinsäure kann zum gesamten SA-codierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. Bei einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einem "codierenden Bereich" des codierenden Stranges einer Nukleotidsequenz, die ein SA-Protein codiert. Der Begriff "codierender Bereich" betrifft den Bereich der Nukleotidsequenz, der Codons umfaßt, die in Aminosäurereste translatiert werden. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einem "nicht-codierenden Bereich" des codierenden Stranges einer Nukleotidsequenz, die SA codiert. Der Begriff "nicht-codierender Bereich" betrifft 5 ' - und
3 '-Sequenzen, die den codierenden Bereich flankieren und nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. die auch als 5'- und 3 '-untranslatierte Bereiche bezeichnet werden).
Bei den hier offenbarten Sequenzen des codierenden Stranges, die das SA codieren (bspw. die Sequenzen aus Anhang A) , können die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuren gemäß der Regeln der Watson-Crick-Basenpaarung ausgestaltet werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zum gesamten codierenden Bereich von SA-ir-RNA komplementär sein, ist aber stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, das zu lediglich einem Abschnitt des codierenden oder nicht-codierenden Bereichs der SA-mRNA antisense ist. Das Antisense-Oligonukleotid kann bspw. zum Bereich, der die Translationsstartstelle von SA-mRNA umgibt, komplementär sein. Ein Antisense-Oligonukleotid kann bspw. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzy- matische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure (bspw. ein Antisense-Oligonukleotid) kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so gestaltet sind, daß sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabilität des Duplexes erhöhen, der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Bspw. können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Iod- uracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxy- hydroxyl ethyl )uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D- Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2 , 2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methyl- guanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methyl- guanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thio- uracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5 ' -Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5- oxyessigsäure (v) , Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thio- cytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5- oxyessigsäure (v) , 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2, 6-Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann ersatzweise biologisch hergestellt werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist (d.h. RNA, die von der eingebrachten Nukleinsäure transkribiert wird, ist zu einer Zielnukleinsäure von Interesse in Antisense- Richtung orientiert, was im nachstehenden Unterabschnitt weiter beschrieben ist) .
Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäure oleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit der zellulären mRNA und/oder der genomischen DNA, die ein SA-Protein codiert, hybridisieren oder daran binden, so daß die Expression des Proteins, bspw. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotid-Komplementarität unter Bildung eines stabilen Duplexes oder bspw. im Fall eines Anti- sense-Nukleinsäuremoleküls, das DNA-Duplices bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert werden, daß es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen bindet, das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, bspw. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das/der an einen Zelloberflächen- rezeptor oder Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Zur Erzielung hinreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektor- konstrukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken bakteriellen, viralen oder eukaryotischen Promotors befindet, bevorzugt.
In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungεgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül . Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen ß-Einheiten parallel zueinander verlaufen. (Gaultier et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Das Antisense- Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2 ' -O-Methylribonukleotid (Inoue et al . , (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett . 215:327-330) umfassen.
In einer weiteren Ausführungsform ist eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie einen komplementären Bereich haben, spalten können. Somit können Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591)) zur katalytischen Spaltung von SA-mRNA-
Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation der SA- mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine SA-codierende Nukleinsäure kann auf der Basis der Nukleotidsequenz einer hier offenbarten SA-cDNA (d.h. RXA00001 in Anhang A) gestaltet werden. Bspw. kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zur Nukleotidsequenz ist, die in einer SA-codierenden mRNA gespalten werden soll. S. bspw. Cech et al., US-Patent Nr. 4 987 071 und Cech et al., US-Patent Nr. 5 116 742. Alternativ kann SA-mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe bspw. Bartel, D., und Szostak, J.W. (1993) Science 261:1411-1418.
Die SA-Genexpression läßt sich alternativ hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer SA-Nukleotidsequenz sind (bspw. zu einem SA-Promotor und/oder -Enhancer) so dirigiert werden, daß Triple-Helixstrukturen gebildet werden, die die Transkription eines SA-Gens in Ziel- Zellen verhindern. Siehe allgemein Helene, C. (1991) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-584; Helene, C. et al . , (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660:27-36; und Mäher. L.J. (1992) Bioassays 14(12) :807-815.
B. Rekombinante Expressionsvektoren und Wirtszellen
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Vektoren, vorzugsweise Expressionsvektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein SA-Protein (oder einen Abschnitt davon) codieren. Wie hier verwendet, betrifft der Begriff "Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure transportieren kann, an welche es gebunden ist. Ein Vektortyp ist ein "Plasmid", was für eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife steht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Ein weiterer Vektor- typ ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren können in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, autonom replizieren (bspw. Bakterienvektoren, mit bakteriellem Repli- kationsursprung und episomale Säugetiervektoren) . Andere Vektoren (z.B. nicht-episo ale Säugetiervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle beim Einbringen in die Wirtszelle integriert und dadurch zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert . Zudem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie funktionsfähig verbunden sind, steuern. Diese Vektoren werden hier als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Gewöhnlich haben die Expressionsvektoren, die bei DNA-Rekombinationstechniken ver- wendet werden können, die Form von Plasmiden. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch diese anderen Expressionsvektorformen, wie virale Vektoren (bspw. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren) , die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, d.h. daß die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen, ausgewählt auf der Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, umfassen, die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz funktionsfähig verbunden sind. In einem rekombinanten Expressionsvektor bedeutet "funktionsfähig verbunden", daß die Nukleotidsequenz von Interesse derart an die regulatorische(n) Sequenz (en) gebunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (bspw. in einem in-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht ist) . Der Begriff "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (bspw. Poly- adenylierungssignale) umfassen. Diese regulatorischen Sequenzen sind bspw beschrieben in Goeddel: Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Regulatorisehe Sequenzen umfassen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Wirtszelltypen steuern, und solche, die die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen steuern. Der Fachmann ist sich dessen bewußt, daß die Gestaltung eines Expressionsvektors von Faktoren abhängen kann, wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, dem gewünschten Ausmaß der Proteinexpression usw. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszellen eingebracht werden, so daß dadurch Proteine oder Peptide, einschließlich der Fusionsproteine oder -peptide, die von den Nukleinsäuren, wie hier beschrieben, codiert werden, hergestellt werden (bspw. SA- Proteine, mutierte Formen von SA-Proteinen, Fusionsproteine, usw. ) .
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von SA-Proteinen in prokaryontischen oder eukaryotischen Zellen ausgestaltet sein. Bspw. können SA-Gene in bakteriellen Zellen, wie A. gossypii , Insektenzellen (mit Baculovirus-Expressionsvektoren) , Hefe- und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al. (1992) "Foreign gene expression in yeast: a review" , Yeast 8: 423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al. (1991) "Heterologous gene expression in filamentous fungi" in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, Hrsg., S. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi. in: Applied Molecular Geneties of Fungi, Peberdy, J.F. et al., Hrsg, S. 1-28, Cambridge Uni- versity Press: Cambridge), Algenzellen und Zellen vielzelliger Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L. (1988) "High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants" Plant Cell
Rep. : 583-586) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiter erörtert in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) . Der rekombinante Expressionsvektor kann alternativ, bspw. mit regulatorischen Sequenzen des T7-Promotors und
T7-Polymerase, in vitro transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren ent- halten, die die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren steuern eine Reihe von Aminosäuren zu einem darin codierten Protein bei, gewöhnlich am Aminoterminus des rekombinanten Proteins, aber auch am C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Bereiche der Proteine. Diese Fusionsvektoren haben gewöhnlich drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit des rekombinanten Proteins; und 3) die Unterstützung der Reinigung des rekombinanten Proteins durch Wirkung als Ligand bei der Affinitätsreinigung. Bei Fusions- Expressionsvektoren wird oft eine proteolytisehe Spaltstelle an der Verbindungsstelle der Fusionseinheit und des rekombinanten Proteins eingebracht, so daß die Trennung des rekombinanten Proteins von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins möglich ist. Diese Enzyme und ihre entsprechenden Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase . Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) , bei denen Glutathion-S-Transferase (GST) , Maltose E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird. Bei einer Ausführungsform ist die codierende Sequenz des SA-Proteins in einen pGEX-Expressions- vektor kloniert, so daß ein Vektor erzeugt wird, der ein Fusionsprotein codiert, umfassend vom N-Terminus zum C-Terminus: GST - Thrombin-Spaltstelle - X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie mittels Glutathion-Agarose-Harz gereinigt werden. Das rekombinante SA-Protein, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer Nicht~Fusions-.E. -coli- Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET lld (Studier et al . Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89) . Die Zielgenexpression aus dem pTrc- Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem Hybrid-trp-lac-Fusionspromotor . Die Zielgenexpression aus dem pET lld-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7-gnl0-lac-Fusions-Promotor, die von einer coexprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird von den Wirtsstämmen BL 21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen geliefert, der ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors birgt .
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist die Expression des Proteins in einem Wirtsbakterium, dessen Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins gestört ist (Gottesman, S. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119-128) . Eine weitere Strategie ist die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu inserierenden Nukleinsäure, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in einem zur Expression aus- gewählten Bakterium, wie A. gossypii , verwendet werden (Wada et al. (1992) Nucleic Acids Res. 20:2111-2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann durch Standard- DNA-Synthesetechniken erfolgen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist der SA-Protein- Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae umfassen pYepSecl (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al . (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Geneties of Fungi, J.F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können die erfindungsgemäßen SA-Proteine in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol.. 3:2156-2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen SA-Proteine in Zellen einzelliger Pflanzen (wie Algen) oder in Pflanzenzellen höherer Pflanzen (bspw. Spermatophyten, wie Feldfrüchte) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzen-Expressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einem Säugetier-Expressionsvektor exprimiert. Beispiele für Säugetier-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al . (1987) EMBO J. 6:187-195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft von viralen regulatorischen Elementen bereitgestellt . Gemeinhin verwendete Promotoren stammen bspw. aus Polyoma, Adeno- virus 2, Cytomegalievirus und Simian Virus 40. Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontisehe und eukaryotisehe Zellen siehe in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Bei einer weiteren Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektor die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp bewirken (bspw. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nuklein- säure verwendet) . Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele für geeignete gewebespezifische Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al . (1987) Genes Dev. 1:268-277) , lymphoid-spezifische Promotoren (Calame und Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zellrezeptoren (Winoto und Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) und I munglobulinen (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen und Baltimore (1983) Cell 33:741-748), neuronenspezifische Promotoren (bspw. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle (1989) PNAS 86:5473-5477), pankreasspezifische Promotoren (Edlund et al., (1985) Science 230:912-916) und milchdrüsenspezifische Promotoren (bspw. Milchserum-Promotor; US-Patent Nr. 4 873 316 und europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264 166) . Entwicklungsregulierte Promotoren sind ebenfalls umfaßt, bspw. die Maus-hox-Promotoren (Kessel und Gruss (1990) Science
249:374-379) und der α-Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).
Die Erfindung stellt zudem einen rekombinanten Expressions- vektor bereit, umfassend ein erfindungsgemäßes DNA Molekül, das in Antisense-Richtung in den Expressionsvektor kloniert ist. D.h. daß das DNA-Molekül derart mit einer regulatorischen Sequenz funktionsfähig verbunden ist, daß die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das zur SA-mRNA antisense ist, möglich wird. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig an eine in Antisense-Richtung klonierte Nukleinsäure gebunden sind und die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen steuern, bspw. können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltyp- spezifische Expression von Antisense-RNA steuern. Der Antisense- Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder attenuierten Virus vorliegen, in dem Antisense- Nukleinsäuren unter der Kontrolle eines hochwirksamen regulatorischen Bereichs produziert werden, dessen Aktivität durch den Zelltyp bestimmt wird, in den der Vektor eingebracht wird. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression mittels Anti- sense-Genen siehe Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a mole- cular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Geneties, Bd. 1(1) 1986. Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden hier untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, daß diese Begriffe nicht nur eine bestimmte Zielzelle, sondern auch die Nachkommen oder potentiellen Nachkommen dieser Zelle betreffen. Da in aufeinanderfolgenden Generationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, sind diese Nachkommen nicht unbedingt mit der Parentalzelle identisch, sind jedoch im Umfang des Begriffs, wie er hier verwendet wird, noch umfaßt.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryontisehe oder eukaryotisehe Zelle sein. Bspw. kann ein SA-Protein in Bakterienzellen, wie A. gossypii , Insektenzellen, Hefe- oder Säugetierzellen (wie Ovarzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen) exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann geläufig. Mikroorganismen, die mit Ashbya gossypii verwandt sind und sich geeignet als Wirtszellen für die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle verwenden lassen, sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Durch herkömmliche Transformations- oder Transfektionsverfahren läßt sich Vektor-DNA in prokaryontisehe oder eukaryotisehe Zellen einbringen. Die Begriffe "Transformation" und "Transfektion", "Konjugation" und " ransduktio " , wie sie hier verwendet werden, sollen eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen fremder Nukleinsäure (bspw. DNA) in eine Wirtszelle umfassen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calcium- chlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelter Transfektion, Lipofektion, natürlicher Kompetenz, chemisch vermittelter Übertragung oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen lassen sich nachlesen in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Handbücher .
Es ist bekannt, daß für die stabile Transfektion von Säugetier- zellen je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die fremde DNA in ihr Genom integrieren kann. Zur Identifizierung und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die die Resistenz gegen Medikamente, wie G418, Hygromycin und Methotrexat, verleihen. Eine Nukleinsäure, die einen selektierbaren Marker codiert, kann in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor eingebracht werden, wie derjenige, der ein SA-Protein codiert, oder kann auf einem gesonderten Vektor eingebracht werden. Zellen, die mit der eingebrachten Nukleinsäure stabil transfiziert worden sind, können bspw. durch Medikamentenselektion identifiziert werden (z.B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, wohingegen die anderen Zellen sterben) .
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines SA-Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um das SA-Gen zu verändern, bspw. funktionell zu disrumpieren. Dieses SA-Gen ist vorzugsweise ein Ashbya gossypii-SA-Geτi, jedoch kann ein Ho ologon von einem verwandten Bakterium oder sogar aus einer Säugetier-, Hefeoder Insektenquelle verwendet werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor derart ausgestaltet, daß das endogene SA-Gen bei homologer Rekombination funktionell disrumpiert ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein codiert; auch als "Knockout"-Vektor bezeichnet) . Der Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene SA-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen SA-Proteins verändert wird. ) . Der veränderte Abschnitt des SA-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor an seinem 5'- und 3 '-Ende von zusätzlicher Nukleinsäure des SA-Gens flankiert, die eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen SA-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen SA-Gen in einem Mikroorganismus ermöglicht. Die zusätzliche flankierende SA-Nukleinsäure ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen hinreichend lang. Gewöhnlich enthält der Vektor mehrere Kilobasen flankierende DNA (sowohl am 5 ' - als auch am 3 '-Ende) (siehe z.B. Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51:503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren) . Der Vektor wird in einen- Mikroorganismus (z.B. durch Elektroporation) ein- gebracht, und Zellen, in denen das eingebrachte SA-Gen mit dem endogenen SA-Gen homolog rekombiniert ist, werden unter Verwendung im Fachgebiet bekannter Verfahren selektiert.
Bei einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikro- Organismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. Der Einschluß eines SA-Gens in einen Vektor, wodurch es unter die Kontrolle des Lac-Operons gebracht wird, ermöglicht z.B. die Expression des SA-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Diese regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet bekannt .
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryontisehe oder eukaryotisehe Wirtszelle in Kultur, kann zur Produktion (d.h. Expression) eines SA-Proteins verwendet werden. Die Erfindung stellt zudem Verfahren zur Produktion von SA-Proteinen unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. Bei einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Anzucht der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein SA-Protein codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das ein Wildtyp- oder verändertes SA-Protein codiert) in einem geeigneten Medium, bis das SA-Protein produziert worden ist. Das Verfahren umfaßt in einer weiteren Ausführungsform das Isolieren der SA-Proteine aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Isolierte SA-Proteine
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte SA-Proteine und biologisch aktive Abschnitte davon. Ein "isoliertes" oder "gereinigtes" Protein oder biologisch aktiver Abschnitt davon ist im wesentlichen frei von zellulärem Material, wenn es durch DNA- Rekombinationstechniken produziert wird, oder von chemischen Vorstufen oder andern Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Der Begriff "im wesentlichen frei von zellulärem Material" umfaßt SA-Proteinpräparationen, in denen das Protein von zellulären Komponenten der Zellen, in denen es natürlich oder rekombi- nant produziert wird, abgetrennt ist. Bei einer Ausführungsform umfaßt der Ausdruck "im wesentlichen frei von zellulärem Material" SA-Proteinpräparationen mit weniger als etwa 30 % (bezogen auf das Trockengewicht) Nicht-SA-Protein (auch als "kontaminierendes Protein" bezeichnet) , stärker bevorzugt weniger als etwa 20 %, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10 % und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % Nicht-SA-Protein. Das SA-Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon enthält nach rekombinanter Produktion im wesentlichen kein Kulturmedium, d.h. das Kulturmedium macht weniger als etwa 20 %, stärker bevor- zugt weniger als etwa 10 % und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % des Volumens der Proteinpräparation aus . Der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfaßt SA-Proteinpräparationen, in denen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien abgetrennt ist, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind. Bei einer Ausführungsform umfaßt der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" SA-Protein- präparationen mit weniger als etwa 30 % (bezogen auf das Trockengewicht), stärker bevorzugt weniger als etwa 20 %, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10 % und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5 % chemische Vorstufen oder Nicht- 5 SA-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen weisen die isolierten Proteine oder biologisch aktiven Abschnitte davon keine kontaminierenden Proteine aus dem gleichen Organismus auf, aus dem das SA-Protein stammt . Diese Proteine werden gewöhnlich durch rekombinante Expression, bspw. eines A. gossypii-SA- 10 Proteins, in einem Mikroorganismus, wie A. gossypii , hergestellt.
Ein erfindungsgemäßes isoliertes SA-Protein oder ein Abschnitt davon kann an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligt sein oder
15 hat eine oder mehrere der in Tabelle 1 angegebenen Aktivitäten. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt das Protein oder ein Abschnitt davon eine Aminosäuresequenz, die zu einer Aminosäuresequenz aus Anhang B hinreichend homolog ist, daß das Protein oder der Abschnitt davon die Fähigkeit, eine an der Stressant-
20 wort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii auszuüben, beibehält. Der -bschnitt des Proteins ist vorzugsweise ein biologisch aktiver Abschnitt, wie hier beschrieben. Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat ein erfindungsgemäßes
25 SA-Protein eine der in Anhang B gezeigten Aminosäuresequenzen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform hat das SA-Protein eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die, bspw. unter stringenten Bedingungen, an eine Nukleotidsequenz aus Anhang A hybridisiert. In noch einer weiteren
30 bevorzugten Ausführungsform hat das SA-Protein eine Aminosäuresequenz, die von einer Nukleotidsequenz codiert wird und die mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %, 80 bis 90 %, 90 bis 95 % und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 96 %,
35 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zu einer der Aminosäuresequenzen von Anhang B ist. Die bevorzugten erfindungsgemäßen SA-Proteine besitzen vorzugsweise ebenfalls mindestens eine der hier beschriebenen SA-Aktivitäten. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes SA-Protein umfaßt zum Beispiel eine Aminosäuresequenz ,
40 die von einer Nukleotidsequenz codiert wird, die, bspw. unter stringenten Bedingungen, mit einer Nukleotidsequenz von Anhang A hybridisiert, und eine an der Stressantwort, DNA-Reparatur oder Entgiftung durch Prozesse, wie Abfangen von Radikalen, beteiligte Funktion in Ashbya gossypii ausüben kann oder eine oder mehrere
45 der in Tabelle 1 angegebenen Aktivitäten aufweist. Bei weiteren Ausführungsformen ist das SA-Protein im wesentlichen homolog zu einer Aminosäuresequenz von Anhang B und behält die funktioneile Aktivität des Proteins mit einer der Sequenzen aus Anhang B und unterscheidet sich dennoch in der Aminosäuresequenz 5 aufgrund der natürlichen Variation oder Mutagenese, wie in Unterabschnitt I oben eingehend beschrieben. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das SA-Protein folglich eine Aminosäuresequenz, die mindestens etwa 50 bis 60 %, vorzugsweise mindestens etwa 60 bis 70 %, stärker bevorzugt mindestens etwa 70 bis 80 %,
10 80 bis 90 %, 90 bis 95 % und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96 %, 97 %, 98 %, 99 % oder noch homologer zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B ist und die zumindest eine der hier beschriebenen SA-Aktivitäten aufweist . Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein A. gossypii-
15 Vollängenprotein, das im wesentlichen homolog zu einer vollständigen Aminosäuresequenz aus Anhang B ist .
Biologisch aktive Abschnitte eines SA-Proteins umfassen Peptide mit Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz eines
20 SA-Proteins hergeleitet sind, bspw. eine in Anhang B gezeigte Aminosäuresequenz oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, das zu einem SA-Protein homolog ist, die weniger Aminosäuren als das Vollängen-SA-Protein oder das Vollängenprotein aufweisen, das zu einem SA-Protein homolog ist, und zumindest eine Aktivität eines
25 SA-Proteins aufweisen. Gewöhnlich umfassen biologisch aktive Abschnitte (Peptide, bspw. Peptide, die bspw 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines SA-Proteins. Überdies können andere biologisch aktive Abschnitte,
30 in denen andere Bereiche des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt werden und bezüglich einer oder mehrerer der hier beschriebenen Aktivitäten untersucht werden. Die biologisch aktiven Abschnitte eines SA-Proteins umfassen vorzugsweise ein oder mehrere ausgewählte Domänen/
35 Motive oder Abschnitte davon mit biologischer Aktivität.
SA-Proteine werden vorzugsweise durch DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. Bspw wird, ein Nukleinsäuremolekül, das das Protein codiert, in einen Expressionsvektor (wie vorstehend beschrieben)
40 kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie vorstehend beschrieben) eingebracht, und das SA-Protein wird in der Wirtszelle exprimiert. Das SA-Protein kann dann durch ein geeignetes ReinigungsSchema mittels Standard-Protein-Reinigungstechniken aus den Zellen isoliert werden. Alternativ zur rekombi-
45 nanten Expression kann ein SA-Protein, -Polypeptid, oder -Peptid mittels Standard-Peptidsynthesetechniken chemisch synthetisiert werden. Überdies kann natives SA-Protein aus Zellen (bspw. Endo- thelzellen) , z.B. mit einem Anti-SA-Antikörper, isoliert werden, der durch Standardtechniken produziert werden kann, wobei ein erfindungsgemäßes SA-Protein oder ein Fragment davon verwendet wird.
Die Erfindung stellt auch chimäre SA-Proteine oder SA-Fusions- proteine bereit. Wie hier verwendet, umfaßt ein "chimäres SA-Protein" oder "SA-Fusionsprotein" ein SA-Polypeptid, das funktionsfähig an ein Nicht-SA-Polypeptid gebunden ist. Ein "SA- Polypeptid" betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz , die einem SA-Protein entspricht, wohingegen ein "Nicht-SA-Polypeptid" ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, die einem Protein entspricht, das nicht im wesentlichen homolog zum SA-Protein ist, z.B. ein Protein, das sich vom SA-Protein unter- scheidet und vom gleichen oder einem anderen Organismus herrührt. Innerhalb des Fusionsproteins soll der Begriff "funktionsfähig verbunden" bedeuten, daß das SA-Polypeptid und das Nicht-SA-Polypeptid im Leseraster miteinander fusioniert sind. Das Nicht-SA- Polypeptid kann an den N- oder C-Terminus des SA-Polypeptides gebunden sein. Bei einer Ausführungsform ist das Fusionsprotein bspw. ein GST-SA-Fusionsprotein, bei dem die SA-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Seςruenzen gebunden sind. Diese Fusionsproteine können die Reinigung des rekombinanten SA-Proteins erleichtern. Bei einer weiteren Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein SA- Protein, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus aufweist. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines SA-Proteins durch Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Ein erfindungsgemäßes chimäres SA-Protein oder SA-Fusionsprotein wird durch Standard-DNA-Rekombinationstechniken produziert. DNA- Fragmente, die unterschiedliche Polypeptidsequenzen codieren, werden gemäß herkömmlicher Techniken im Leseraster aneinander ligiert, bspw. durch Einsatz glatter oder überhängender Enden zur Ligation, Restriktionsenzymspaltung zur Bereitstellung geeigneter Enden, Auffüllen kohäsiver Enden, falls erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase, um ungewollte Verknüpfungen zu vermeiden, und enzymatische Ligierung. Bei einer weiteren Aus- führungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Techniken, einschließlich DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden.
Alternativ kann eine PCR-Amplifizierung von Genfragmenten mittels Ankerprimern durchgeführt werden, die komplementäre Überhänge zwischen aufeinanderfolgenden Genfragmenten erzeugen. Diese können anschließend miteinander hybridisiert und reamplifiziert werden, so daß eine chimäre Gensequenz erzeugt wird (s. bspw. Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Hrsg., John Wiley & Sons: 1992) . Überdies sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die schon eine Fusionseinheit codieren (bspw. ein GST-Polypeptid) . Eine SA-codierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, so daß die Fusionseinheit mit dem SA-Protein im Leseraster verbunden ist.
Homologa des SA-Proteins können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch bestimmte Punktmutation oder Verkürzung des SA- Proteins. Der Begriff "Homologon", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante Form des SA-Proteins, die als Agonist oder Antagonist der SA-Protein-Aktivität wirkt. Ein Agonist des SA-Proteins kann im wesentlichen die gleiche oder einen Teil der biologischen Aktivitäten des SA-Proteins beibehalten. Ein Antagonist des SA-Proteins kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des SA-Proteins bspw. durch kompetitive Bindung an ein stromabwärts oder -aufwärts gelegenes Element der Stressantwortkaskade, der das SA-Protein enthält, hemmen.
Bei einer alternativen Ausführungsform können Homologa des SA- Proteins durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, bspw. Verkürzungsmutanten, des SA-Proteins bezüglich SA-Protein- Agonisten- oder -Antagonisten-Aktivität identifiziert werden. Bei einer Ausführungsform wird eine variegierte Bank von SA-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt und von der variegierten Genbank codiert. Eine variegierte Bank von SA-Varianten kann bspw durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen hergestellt werden, so daß sich ein degenerierter Satz potentieller SA-Sequenzen als individuelle Polypeptide oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine (z.B. Für Phagen-Display) , die diesen Satz von SA-Sequenzen enthalten, exprimieren läßt. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller SA-Homologa aus einer degenerierten Oligonukleotid- sequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen SA-Sequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet bekannt (s. bspw. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al . , (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11:477). Zusätzlich können Banken von Fragmenten der SA-Protein-Codierung verwendet werden, um eine variegierte Population von SA- Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selektion von Homologa eines SA-Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von codierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer codierenden SA- Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppel- strängiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit Sl-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des SA-Proteins codiert .
Im Fachgebiet sind mehrere Techniken zum Screening von Gen- Produkten kombinatorischer Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA- Banken hinsichtlich Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Muta- genese von SA-Homologa erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM) , eine neue Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um SA-Homologa zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al . (1993) Protein Engineering 6 (3) :327-331) .
Bei einer weiteren Ausführungsform können Tests auf Zellenbasis zur Analyse einer variegierten SA-Bank unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren verwendet werden. D. Erfindungsgemäße Verwendungen und Verfahren
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können als Marker für spezifische Bereiche des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms, sondern auch für funktionelle Studien von A. gossypii-Proteinen nützlich. Zur Identifikation des Genombereichs, an den ein bestimmtes A. gossypii-DNA-bindendes Protein bindet, kann das A. gossypii- Genom gespalten und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht nachweisbaren Markierungen, sondiert werden; die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisation des Fragmentes auf der genomischen Karte von A. gossypii , und wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz , an die das Protein bindet . Die erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule können zudem hinreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so daß diese Nukleinsauremolekule als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Pilzen dienen können.
Die erfindungsgemäßen SA-Nukleinsäuremoleküle eignen sich ebenfalls für Evolutions- und Proteinstruktur-Untersuchungen. Die Stressantwort, DNA-Reparatur und Entgiftungsprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer Vielzahl von prokaryontischen und eukaryotischen Zellen ausgenutzt; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsauremolekule mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen codieren, kann der Evolutions-Verwandschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Entsprechend ermöglicht ein solcher Vergleich die Bestimmung, welche Sequenzbereiche konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Dieser Typ der Bestimmung ist für Proteintechnologie-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein tolerieren kann ohne die Funktion zu ■ verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen SA-Nukleinsäuremoleküle kann die Produktion von SA-Proteinen mit funktionellen Unterschieden zu den Wildtyp-SA-Proteinen bewirken. Diese Proteine können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert werden, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle zugegen sein oder können hinsichtlich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein. Es gibt eine Reihe von Mechanismen, durch die die Änderung eines erfindungsgemäßen SA-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer Feinchemikalie aus einem A. goss pii-Stamm, der ein solches verändertes Protein enthält, indirekt beeinflussen kann.
Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen SA- Proteinen kann auch zu SA-Proteinen mit geänderten Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion einer oder mehrerer gewünschten Feinchemikalien aus A. gossypii beeinflussen. Beispielsweise kann man durch eine verstärkte Stressantwort effizienter Radikale abfangen und so den reibungslosen Ablauf essentieller zellulären Prozessen ermöglichen. Zu diesen Prozessen gehört der Aufbau der Zellwände, die Transkription, Translation und die Biosynthese von Verbindungen, die für das Wachstum und die Teilung von Zellen nötig sind (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Lipide usw.) (Lengeier et al. (1999) Biology of Prokaryontes, Thieme Verlag: Stuttgart, S. 88-109; 913-918; 875-899) . Durch Verbessern von Wachstum und Vermehrung dieser veränderten Zellen ist es möglich, die Lebensfähigkeit der Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern und auch ihre Teilungsrate zu verbessern, so daß eine vergleichsweise größere Anzahl Zellen in der Fermenterkultur überleben kann. Die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion kann zumindest aufgrund der Anwesenheit einer größeren Anzahl lebensfähiger Zellen, die jeweils die gewünschte Feinchemikalie produzieren, erhöht werden.
Diese vorstehend genannten Mutagenesestrategien für SA-Proteine, die erhöhte Ausbeuten einer Feinchemikalie aus A. gossypii bewirken sollen, sollen nicht einschränkend sein; Variationen dieser Mutagenesestrategien sind dem Fachmann leicht ersichtlich. Unter Verwendung dieser Strategien und einschließlich der hier offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nuklein- säure- und Proteinmoleküle verwendet werden, um A. gossypii- oder verwandte Bakterienstämme, die mutierte SA-Nukleinsäure- und Proteinmoleküle exprimieren, zu erzeugen, so daß die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion einer gewünschten Verbindung verbessert wird. Die gewünschte Verbindung kann jedes von A. gossypii hergestellte Produkt sein, einschließlich der Endprodukte von Biosynthesewegen und Zwischenprodukte natürlich vorkommender etabolischer Wege sowie Moleküle, die im Metabolismus von A . gossypii nicht natürlich vorkommen, die jedoch von einem erfindungsgemäßen A. gossypii-Staiaεa produziert werden. Ein weiterer Gegenstand dieser Erfindung ist die Anwendung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren für die Erzeugung von Stress- Resistenz bei Mikroorganismen.
Diese Erfindung wird durch die nachstehenden Beispiele weiter veranschaulicht, die nicht als einschränkend aufgefaßt werden sollen. Die Inhalte sämtlicher, in dieser Patentanmeldung zitierter Literaturstellen, Patentanmeldungen, Patente und veröffentlichter Patentanmeldungen sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
Beispiele
Konstruktion der Ashbya gossypii cDNA Bibliothek: Durch Zerreiben des gefrorenen Pilzmycels in ein Pulver in Gegenwart von fl. Stickstoff sind die Pilzzellen aufgebrochen worden. Das gefrorene Pulver ist dann in 4M Guanidinium Isothiocyanat Puffer suspendiert worden (Sambrook, J, Fritsch, E.F. und Maniatis, T., 1989, Molecular cloning: a laboratory anual, In Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York) . Hierbei wird 1ml Puffer pro g nasse Zellen eingesetzt. Die RNA wurde isoliert durch Zentrifugation durch eine Schicht von 5,7 M CsCl . Die poly(A) enthaltene RNA Fraktion ist durch den Pharmacia mRNA-Reinigungskit gemäß der Herstellerangaben aufgereinigt worden.
Doppelsträngige cDNA ist von 5 μg poly(A) RNA mit Hilfe des "Time Saver cDNA Synthesis Kit" von Pharmacia gemäß der Herstellerangaben synthetisiert worden. Die Aufreinigung der doppelsträngigen cDNA gelang durch Säulenchromatographie auf einer Sephacryl S400 Säule (Pharmacia) . Eine cDNA Bibliothek, die 2X1010 rekombinante DNA-Fragmente trägt wurde in einen Abkömmling des Hefeexpressionsvektors pYEUra3 (Clone- tech) nach den Herstellerangaben kloniert und zur Sequenzierung eingesetzt.
Konstruktion einer genomischen Bibliothek aus Ashbya gossypii Eine A. gossypii genomische Bibliothek ist durch Ligation von Größen-selektierten Sau3A Fragmenten eines partiellen Verdaus der genomischen DNA in einen dephosphorilierten BamHI geschnittenen Bluescript SK+ Vektor (Stratagene) generiert worden (Sambrook, J, Fritsch, E.F. und Maniatis, T. , 1989, Molecular cloning: a laboratory manual, In Cold Spring Habor Laboratory Press, Cold Spring Habor, New York) . Die Gesamtzahl von 60000 Transformanten sind nach Transformation dieser Bibliothek in E.coli erhalten worden. Aus einzelnen Klonen wurde die Plasmid-DNA isoliert und zur Sequenzierung eingesetzt. 95 % der Transformaten enthielten ein Insert aus Ashbya gossypii mit einer durchschnittlichen Länge von 3 bis 6 kb. Plasmide.
Zuordung der DNA-Sequenzen: Die Sequenzinformation wurde in das Bioinformatikprogramm "GCG- Wisconsin-Package" (Oxford Molecular Company) eingelesen und in Bezug auf Zuordnung von Sequenzen analysiert .
In-vitro-Analyse der Funktion mutanter Proteine
Die Bestimmung der Aktivitäten und kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachgebiet gut bekannt. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms müssen an die spezifische Aktivität des Wildtypenzyms angepaßt werden, was innerhalb der Fähigkeiten des Fachmann liegt. Überblicke über Enzyme im allgemeinen sowie spezifische Einzelheiten, die die Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können bspw. in den nachstehenden Literaturstellen gefunden werden: Dixon, M. , und Webb, E.C: (1979) Enzymes, Longmans, London; Fersht (1985) Enzyme Structure and Mechanism, Freeman, New York; Walsh (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman, San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D: Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Aufl., Academic Press, New York; Bisswanger, H. (1994) Enzymkinetik, 2. Aufl. VCH, Weinheim (ISBN 3527300325) ; Bergmeyer, H.U. , Bergmeyer, J., Graßl, M. Hrsg. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Aufl. Bd. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9 , "Enzymes", VCH, Weinheim, S. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann durch viele gut eingeführte Verfahren gemessen werden, wie DNA-Banden-Shift- Assays (die auch als Gelretardations-Assays bezeichnet werden) . Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann mit Reportergen-Assays (wie in Kolmar, H. et al . , (1995) EMBO J. 14:3895-3904 und den darin zitierten Literaturstellen beschrieben) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und für Anwendungen in pro- und eukaryotischen Zellen etabliert, wobei Enzyme, wie beta-Galactosidase, Grün- Fluoreszenz-Protein und mehrere andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membran-Transportproteinen kann gemäß Techniken, wie sie in Gennis, R.B. (1989) "Pores, Channels and Transporters", in Biomembranes, Molecular Structure and Function, Springer: Heidelberg, S. 85-137; 199-234; und 270-322 beschrieben sind, erfolgen.
Analyse des Einflusses von mutiertem Protein auf die Produktion des gewünschten Produktes
Die Wirkung der genetischen Modifikation in A. gossypii auf die Produktion einer gewünschten Verbindung (wie einer Aminosäure) kann bestimmt werden, indem die modifizierten Mikroorganismen unter geeigneten Bedingungen (wie den vorstehend beschriebenen) gezüchtet werden und das Medium und/oder die zellulären Komponenten bezüglich der erhöhten Produktion des gewünschten Produktes (d.h. einer Aminosäure) untersucht wird/werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann wohlbekannt und umfassen Spektro- skopie, Dünnschichtchromatographie, Färbeverfahren verschiedener Art, enzymatische und mikrobiologische Verfahren sowie analytische Chromatographie, wie Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (s. bspw. Ullman, Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. A2, S. 89-90 und S. 443-613, VCH: Weinheim (1985); Fallon, A., et al., (1987) "Applications of HPLC in Biochemistry" in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al. (1993) Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: "Product recovery and purification", S. 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al . (1988) Bioseparations: downstream processing for Biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. und Cabral, J.M.S. (1992) Recovery processes for biological Materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J.A. und Henry, J.D. (1988) Bio- chemical Separations, in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3 ; Kapitel 11, S. 1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications) .
Zusätzlich zur Messung des Fermentationsendproduktes ist es ebenfalls möglich, andere Komponenten der Stoffwechselwege zu analysieren, die zur Produktion der gewünschten Verbindung verwendet werden, wie Zwischen- und Nebenprodukte, um die Gesamt- Effizienz der Produktion der Verbindung zu bestimmen. Die Analyseverfahren umfassen Messungen der Nährstoffmengen im Medium (bspw. Zucker, Kohlenwasserstoffe, Stickstoffquellen, Phosphat und andere Ionen) , Messungen der Biomassezusammensetzung und des Wachstums, Analyse der Produktion gemeinsamer Metabolite von Biosynthesewegen und Messungen von Gasen, die während der Fermentation erzeugt werden. Standardverfahren für diese Messungen sind in Applied Microbial Physiology; A Practical Approach, P.M. Rhodes und P.F. Stanbury, Hrsg. IRL Press, S. 103-129; 131-163 und 165-192 (ISBN: 0199635773) und den darin angegebenen Literaturstellen beschrieben. Reinigung des gewünschten Produktes aus A. gossypii-Kultur
Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus A. gossypii-Zell&n oder aus dem Überstand der vorstehend beschriebenen Kultur kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das gewünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden. Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den A. gossypii-Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurück- gehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromato- graphieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten
Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert . Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, und das vorhergehende Reinigungsverfahren soll nicht einschränkend sein. Diese Reinigungstechniken sind bspw. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) .
Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) , spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtσhromato- graphie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengef ßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al . (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulimann' s Encyclopedia of Industrial
Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S. 559-566, 575-581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Äquivalente
Der Fachmann erkennt oder kann - indem er lediglich Routineverfahren verwendet - viele Äquivalente der erfindungsgemäßen spezifischen Ausführungsformen feststellen. Diese Äquivalente sollen von den nachstehenden Patentansprüchen umfaßt sein.
Tabellen
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Tabelle 2 : Liste von Gattungen mikrobieller Stämme :
Bacillus, Clostridium, Escherichia, Pichia, Candida, Cyanobacter, Corynebakterium, Brevibakterium, Saccharomyces, Eremothecium oder Ashbya.

Claims

Patentansprüche
1. Isoliertes Nukleinsäuremolekül aus Ashbya gossypii , aus- gewählt aus der Gruppe, bestehend aus den ungeradzahligen
SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING, oder einem Abschnitt davon.
2. Isoliertes Nukleinsäuremolekül , das eine Polypeptidsequenz codiert, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den gerad- zahligen SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING.
3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül , das eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptides codiert, ausgewählt aus der Gruppe von Aminosäuresequenzen, bestehend aus den geradzahligen SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING.
4. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die zu mindestens 80 % zu einer Nukleotidsequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den ungeradzahligen SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING, oder einem Abschnitt davon identisch ist.
5. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend ein Fragment mit mindestens 15 Nukleotiden einer Nukleinsäure, umfassend eine Nukleotidsequenz , ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den ungeradzahligen SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING.
6. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an ein Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 5 hybridisiert.
7. Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einen Abschnitt davon und eine Nukleotidsequenz, die ein heterologes Poly- peptid codiert.
8. Vektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach einem der Ansprüche 1 bis 7.
9. Vektor nach Anspruch 8, welcher ein Expressionsvektor ist.
10. Wirtszelle, die mit dem Expressionsvektor nach Anspruch 9 transfiziert ist.
11. Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Zelle ein Mikroorganismus ist.
12. Wirtszelle nach Anspruch 11, wobei die Zelle zur Gattung Ashbya gehört .
13. Wirtszelle nach Anspruch 12, wobei die Expression des Nukleinsäuremoleküls eine Modulation der Produktion einer Feinchemikalie von der Zelle bewirkt .
14. Wirtszelle nach Anspruch 13, wobei die Feinchemikalie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus organischen Säuren, proteinogenen und nichtproteinogenen Aminosäuren, Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, Diolen, Kohlehydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Cofaktoren und Enzymen.
15. Verfahren zur Herstellung eines Polypeptides , umfassend das Züchten der Wirtszelle nach Anspruch 10 in einem geeigneten
Kulturmedium, um so das Polypeptid zu produzieren.
16. Isoliertes SA-Polypeptid aus Ashbya gossypii oder ein Abschnitt davon.
17. Polypeptid nach Anspruch 16, wobei das Polypeptid an der Produktion einer Feinchemikalie beteiligt ist .
18. Isoliertes Polypeptid, umfassend eine Aminosäuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den geradzahligen
SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING.
19. Isoliertes Polypeptid, umfassend eine natürlich vorkommende allelische Variante eines Polypeptides, umfassend eine Amino- säuresequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den geradzahligen SEQ ID NOs des SEQUENCE LISTING, oder einen Abschnitt davon.
20. Isoliertes Polypeptid nach einem der Ansprüche 16 bis 19, das zudem heterologe Aminosäuresequenzen umfaßt.
21. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie, umfassend das Züchten einer Zelle, die einen Vektor nach Anspruch 8 enthält, so daß die Feinchemikalie produziert wird.
22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das Verfahren zudem den Schritt Gewinnen der Feinchemikalie aus der Kultur umfaßt .
23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei das Verfahren zudem den 5 Schritt Transfizieren der Zelle mit dem Vektor nach Anspruch 8 umfaßt, so daß eine Zelle erhalten wird, die den Vektor enthält.
24. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Expression des Nuklein- 10 säuremoleküls von dem Vektor die Modulation der Produktion der Feinchemikalie bewirkt .
25. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Feinchemikalie ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: organischen
15 Säuren, proteinogenen und nichtproteinogenen Aminosäuren,
Purin- und Pyrimidinbasen, Nukleosiden, Nukleotiden, Lipiden, gesättigten und ungesättigten Fettsäuren, Diolen, Kohlehydraten, aromatischen Verbindungen, Vitaminen, Cofaktoren und Enzymen.
20
26. Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Feinchemikalie eine Aminosäure ist.
27. Verfahren nach Anspruch 26, wobei die Aminosäure aus der 25 Gruppe stammt, bestehend aus: Lysin, Glutamat, Glutamin,
Alanin, Aspartat, Glycin, Serin, Threonin, Methionin, Cystein, Valin, Leucin, Isoleucin, Arginin, Prolin, Histidin, Tyrosin; Phenylalanin und Tryptophan.
30 28. Verfahren zur Herstellung einer Feinchemikalie, umfassend das Züchten einer Zelle, deren genomische DNA durch Einschluß eines Nukleinsäuremoleküls nach einem der Ansprüche 1 bis 7 verändert worden ist.
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