EP1421110A2

EP1421110A2 - Neue genprodukte aus ashbya gossypii, die mit dem aufbau der zellwand bzw. des cytoskeletts assoziiert sind

Info

Publication number: EP1421110A2
Application number: EP02762453A
Authority: EP
Inventors: Marvin Karos; Henning ALTHÖFER; Burkhard Kröger; Jose L. Revuelta Doval
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-08-22
Filing date: 2002-08-21
Publication date: 2004-05-26
Also published as: KR20040029000A; WO2003018626A3; CA2456828A1; US20050221460A1; JP2005522984A; WO2003018626A2; AU2002327839A1; CN1543475A

Abstract

Die Erfindung betrifft neuartige Polynukleotide aus Ashbya gossypii; damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten und Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; und die Anwendung der neuen Polypeptide und Polynukleotide als Targets zur Modulation des Zellwand-bzw. Cytoskelettaufbaus und insbesondere zur Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mikroorganismen der Gattung Ashbya.

Description

Beschreibung

Neue Genprodukte aus Ashbya gossypu, die mit dem Aufbau der Zellwand bzw. des Cytoske- letts assoziiert sind.

Die vorliegende Erfindung betrifft neuartige Polynukleotide aus Ashbya gossypu; damit hybridisierende Oligonukleotide; Expressionskassetten und Vektoren, welche diese Polynukleotide enthalten; damit transformierte Mikroorganismen; von diesen Polynukleotiden kodierte Polypeptide; und die Anwendung der neuen Polypeptide und Polynukleotide als Targets zur Modulation des Zellwand- bzw. Cytoskeletteigenschaften und insbesondere der Verbesserung der Vitamin B2-Produktion in Mikroorganismen der Gattung Ashbya.

Vitamin B2 (Riboflavin, Lactoflavin) ist ein alkali- und lichtempfindliches, in Lösung gelbgrün fluoreszierendes Vitamin. Vitamin B2-Mangel kann zu Ektodermschäden, insbesondere Linsentrü- bung, Keratitis, Komeavaskularisation, zu neurovegetativen und urogenitalen Störungen führen. Vitamin B2 ist Vorläufer für die neben NAD^* und NADP⁺ wichtigen biologischen Wasserstoff- überträger-Moleküle FAD und FMN. Diese werden aus Vitamin B2 durch Phosphorylierung (FMN) und anschließende Adenylierung (FAD) gebildet.

Vitamin B2 wird in Pflanzen, Hefen und vielen Mikroorganismen aus GTP und Ribulose-5- phosphat synthetisiert. Der Reaktionsweg beginnt mit dem Öffnen des Imidazolrings von GTP und Abspaltung eines Phosphatrestes. Durch Desaminierung, Reduktion und Abspaltung des verbleibenden Phosphats entsteht 5-Amino-6-ribitylamino-2,4-pyrimidinon. Die Reaktion dieser Verbindung mit 3,4-Dihydroxy-2-butanon-4-phosphat führt zum bicyclischen Molekül 6,7- Dimethyl-8-ribityllumazin. Diese Verbindung wird durch Dismutation, bei der eine 4-Kohlenstoff- Einheit übertragen wird, in die tricyclische Verbindung Riboflavin umgesetzt.

Vitamin B2 kommt in vielen Gemüsen und in Fleisch vor, weniger in Getreideprodukten. Der tägliche Vitamin B2-Bedarf eines Erwachsenen liegt bei etwa 1,4 bis 2 mg. Hauptabbauprodukt der Coenzyme FMN und FAD beim Menschen ist wiederum Riboflavin, welches als solches ausgeschieden wird.

Vitamin B2 stellt damit ein wichtiges Nahrungsergänzungsmittel für Mensch und Tier dar. Es besteht daher das Bestreben, Vitamin B2 in technischem Maßstab zugänglich zu machen. Es wurde daher vorgeschlagen, Vitamin B2 auf mikrobiologischem Weg zu synthetisieren. Brauchbare Mikroorganismen hierfür sind beispielsweise Bacillus subtilis, die Ascomyceten Eremothe- cium ashbyii, Ashbya gossypu sowie die Hefen Candida flareri und Saccharomyces cerevisiae. Die hierzu verwendeten Nährmedien umfassen Melasse oder Pflanzenöle als Kohlenstoffquelle, anorganische Salze, Aminosäuren, tierische oder pflanzliche Peptone und Proteine sowie Vitaminzusätze. In sterilen aeroben submersen Verfahren erhält man pro Liter Kulturbrühe Ausbeuten von mehr als 10 g Vitamin B2 innerhalb weniger Tage. Voraussetzung sind gute Belüftung der Kultur, sorgfältiges Rühren und Einstellung von Temperaturen unter etwa 30°C. Nach Abtrennen der Biomasse, Eindampfen und Trocknen des Konzentrates erhält man ein mit Vitamin B2 angereichertes Produkt.

Die mikrobiologische Produktion von Vitamin B2 ist beispielsweise beschrieben in der WO-A- 92/01060, der EP-A-0 405 370 und EP-A-0 531 708.

Eine Übersicht über Bedeutung, Vorkommen, Herstellung, Biosynthese und Verwendung von Vitamin B2 ist beispielsweise in Ullmann's Encyclopaedia of Industrial Chemistry, Band A27, Seiten 521 ff. zu finden.

Die Zellwand und das Cytoskelett dienen einer eukaryotischen Zelle vor allem zum äußeren und inneren Strukturerhalt. Die Funktionen dieser Komponenten sind mit denen einer Zeltplane und dem dazugehörigen Zeltgestänge zu vergleichen. Da lebende Zellen jedoch kein starres, sondern aufgrund von Wachstum und Umweltbedingungen benötigtes, flexibles und anpassungsfä- higes Zellgerüst besitzen, wird der Aufbau und die Zusammensetzung von äußeren Faktoren, wie z.B. Temperatur und pH-Wert, aber auch von inneren Faktoren, wie z.B dem ATP-Gehalt oder der lonenkonzentration der Zelle beeinflußt.

Die pilzliche Zellwand spielt eine entscheidende Rolle während des Wachstums, der Entwick- lung oder der Interaktion des Pilzes mit der Umwelt bzw. mit anderen Zellen. Primär nimmt sie eine protektive Funktion, d.h. Schutz der Zelle gegen osmotische, chemische oder biologische Schäden, ein. Weiterhin ist die Zellwand aber auch in morphologische Antworten, Antigen- Expression, Adhäsion und Zell-Zell-Interaktion involviert. Die pilzliche Zellwand ist aus einer Mischung unterschiedlicher Polymere aufgebaut. Dabei unterscheidet man in zwei Kategorien. Zum einen in die sogenannten strukturellen Polymere die für die Steifheit der Struktur verantwortlich sind, und zum anderen in die Matrix-Polymere, in die sie eingebettet sind, und die einen Druckwiderstand gewährleisten. Für die meisten Pilze sind Chitin, Glucane und Mannoproteine die wichtigsten Zellwand Komponenten. Dabei übernehmen Chitin und Glucane strukturelle Funktion. Die Zellwandsynthese erfolgt über eine Zusammensetzung der Einzelkomponenten in verschiedenen Stufen. Zunächst muß eine Synthese der individuellen Komponenten intrazellulär oder an der Plasmalemma/Wand-Grenzschicht erfolgen. Nachdem alle Polymere in die expandierende Wand sekretiert wurden, lagern sie sich über molekulare Interaktionen zunächst lose zusammen, bevor sie über kovalente Bindungen fest miteinander verknüpft werden.

Das Cytoskelett ist dagegen ein koordiniertes Netzwerk aus filamentösen Polymeren, welche durch verschiedene Moleküle mit anderen zellulären Strukturen verknüpft sind. Die Organisation und die Eigenschaften dieses Netzwerkes stehen unter einer präzisen entwicklungsabhängigen und funktioneilen Kontrolle. Die Hauptstrukturkomponenten des Cytoskeletts bilden die Actinfi- lamente (F-Actin), Mikrotubuli und die intermediären Filamente. Das Cytosol kann eher mit einem hochorganisierten Gel als mit einer homogenen Lösung verglichen werden, bei dem die Zusammensetzung in verschiedenen Regionen der Zelle deutliche Unterschiede aufweisen kann. Das Cytoskelett übernimmt wichtige Aufgaben bei dieser Strukturierung, aber auch bei der Zellteilung und beim Organelltransport. Hierbei nimmt es im übertragenen Sinne die Funktion von Eisenbahnschienen ein, auf denen sich die unterschiedlichsten Zellkomponenten mit Hilfe von Zellmotoren wie dem Dynein oder Kinesin entlang bewegen.

Der Aufbau des Cytoskeletts ist im Unterschied zur Zellwandstruktur nicht durch das Knüpfen kovalenter Bindungen charakterisiert. Da es eine wesentlich größere Flexibilität aufweisen muß ist es wie im Falle der Mikrotubuli durch eine "dynamische Instabilität" gekennzeichnet. Tubulin Untereinheiten werden mit Hilfe von GTP polymerisiert. Da das GTP allerdings die Eigenschaft besitzt, unter zellphysiologischen Bedingungen zu GDP + Pi zu zerfallen, wird auch die Struktur der Mikrotubuli geschwächt, so daß diese daher kontinuierlich synthetisiert werden müssen um anschließend wieder zu zerfallen. Durch Mikrotubuli assoziierte Proteine (MAP) ist es der Zelle möglich, eine stärkere beziehungsweise kontrollierbare Stabilisierung der Mikrotubuli zu erreichen. MAP's besitzen je nach Phosphorylierungsgrad eine hohe bzw. niedrige Affinität und somit eine regelbare stabilisierende Wirkung auf die Mikrotubuli.

Die Polymerisation von Mikrofilamenten aus Actin und die Regulation der Stabilität dieser Polymere läuft in der Zelle analog zu der des Tubulins ab. Der Vorgang der Polymerisation wird hingegen durch ATP beschleunigt. Actin-bindende Proteine beeinflussen den Auf- und Abbau der Mikrofilamente und können wie im Falle des Profilins sogar eine Polymerisation des Actins ver- hindern.

Während entwicklungsspezifischen, bzw. umweltbedingten Morphologieveränderung von Pilzen, beispielsweise beim Knospen, der Fruchtkörper- oder Pseudohyphenentwicklung kommt es sowohl bei der Zellwandsynthese, als auch beim Cytoskelettaufbau zu massiven Umstrukturierun- gen, die einer hochpräzisen zeitlichen, wie räumlichen Regulation unterliegen. Das strukturelle Grundgerüst der Zelle ist von essentieller Bedeutung für die Stabilität der Zelle, den Vesi- keltransport und bildet die Grundvoraussetzung zur Produktion von Biomasse. Für eine eingehendere Beschreibung des Zeilwandaufbaus und der Cytoskelett- Strukturierung siehe Wessels, J.G.H. (1990), Role of cell wall architecture in fungal tip growth generation. In: Heath I.B. (ed) Tip growth in plant and fungal cells. Academic Press, San Diego, pp 1 -29; Heath I.B. und Heath M.C. (1978), Microtubules and organeile movement in the rustfungus Uromyces phaseoli var. Vignae. Cytobiologie 16: 393-411 ; McConnel S.J., Yaffe M.P. (1993), Intermediate filament formation by a yeast protein essential for organelle inheritance. Science 260: 687-689; Esser K. und Lemke P.A. (ed) The Mycota - A comprehensive Treatise on fungi as experimental Systems for basic and applied research. Springer-Verlag, Berlin; Voet D. und VoetJ.G. (ed) Bio- Chemie. VCH, Weinheim, und die in jeder dieser Zitate enthaltenen Literaturstellen.

Die Nutzung von Genen, die mit der Synthese der Zellwand und/oder des Cytoskeletts assoziiert sind, zur Generierung von Mikroorganismen, vorzugsweise der Gattung Ashbya, insbesondere von Ashbya gossypii Stämmen, mit modifiziertem Cytoskelett oder modifizierter Zellwand und z.B. damit verbundener modifizierter (höherer) Resistenz gegen äußere Einwirkungen ist noch nicht beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist daher die Bereitstellung neuer Targets zur Beeinflussung derZellwand- und Cytoskeletteigenschaften in Mikroorganismen der Gattung Ashbya, ins- besondere in Ashbya gossypii. Insbesondere besteht die Aufgabe, die Stabilität der Zellen in derartigen Mikroorganismen zu verbessern. Eine weitere Aufgabe ist die Verbesserung der Vitamin B2-Produktion durch derartige Mikroorganismen.

Gelöst wird obige Aufgabe durch Bereitstellung kodierender Nukleinsäuresequenzen, welche in Ashbya gossypii während der Vitamin B2-Produktion hoch- bzw. reguliert (basierend auf Ergebnissen, ermittelt mit Hilfe der im experimentellen Teil näher beschriebenen MPSS- Analysenmethode) sind, und zwar insbesondere:

a) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mitderFunk- tion eines Zellwand-Vorläufer-Proteins kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 8" trägt. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 8v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu kom- plementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 8" und „Oligo 8v" besitzen mit dem MIPS Tag „Cwp1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 4. Die vom komplementären Strang (Gegenstrang) zu SEQ ID NO:1 bzw. vom kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO:4 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit dem Zellwand-Vorläufer-Protein Cwp1 aus S. cerevisiae, beschrieben von Shimoni H., et al., in J. Biochem. 118: 302-311 (1995)

b) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche fürein Protein mit der Funktion einer Serin-Threonin-Kinase kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welcher für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 25/39" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 25/39v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii. isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen. Die Inserts von „Oligo 25/39" und „Oligo 25/39v" besitzen mit dem MIPS Tag „ARK1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 bzw. SEQ ID NO: 10. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zur SEQ ID NO: 8 bzw. vom kodierenden Strang der SEQ ID NO: 10 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Serin-Threonin-Proteinkinase aus S. cerevisiae.

c) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines GTPase-aktivierenden Proteins kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 46" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 46v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des geneti- sehen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 46" und „Oligo 46v" besitzen mit dem MIPS Tag „BUD2/CLA2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12 bzw. SEQ ID NO: 15. Die vom korrespondierenden Gegenstrang von SEQ ID NO: 12 bzw. von kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO: 15 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem GTPase-aktivierenden Protein aus S. cerevisiae, insbesondere Homologie zu dem von BUD2 kodierten GTPase- aktivierenden Protein für BUD2/Rsr1 beschrieben von Park H.-O., etal., in Nature 365: 269-274, (1993).

d) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion einer Resistenz gegen eine Aktin-Überexpression kodiert. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 103" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 103v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenzgemäß SEQ ID NO: 17. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu kom- plementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 103" und „Oligo 103v" besitzen mit dem MIPS Tag „Aor1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 17 bzw. SEQ ID NO: 19. Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:17 bzw. vom kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO: 19 abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae, welches eine Resistenz gegen eine Aktin-Überexpression besitzt bzw. zu dieser Resistenz beiträgt.

e) eine, vorzugsweise niederregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines zu Nuflp ähnlichen Proteins kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 128" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Be- Zeichnung „Oligo 128v" trägt. Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 23 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 128" und „Oligo 128v" besitzen mit dem MIPS Tag „Ykl179c" aus S. cere- visiae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21 bzw. SEQ ID NO: 23. Die vom kodierenden Strang abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. Aminosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem zu Nuflp ähnlichen Protein aus S. cerevisiae (vgl. Wiemann S., et al., Yeast 9: 1343-1348 (1993)).

f) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der

Funktion von Calponin oder eines zu Calponin homologen Proteins kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 150" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 150v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 26. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 150" und „Oligo 150v" besitzen mit dem MIPS Tag „Scp1" aus S. cerevisi- ae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO:

26 bzw. SEQ ID NO: 28. Die jeweils vom kodierenden Strang abgeleiteten Aminosäuresequen- zen besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Calponin oder zu Calponin homologen Protein aus S. cerevisiae.

g) eine, vorzugsweise hochregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein, welches für die Pseudohyphen-Entwicklung in Candida maitose essentiell ist, kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welcher für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 177" trägt.

Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 177v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 30. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 34. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar . Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Poly- nukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo 177" und „Oligo 177v" besitzen mit dem MIPS Tag „EPD1" aus Candida maltosa signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 30 bzw. SEQ ID NO: 34. Vom korrespondierenden Gegenstrang von SEQ ID NO:30 bzw. vom kodierenden Strang gemäß SEQ ID NO: 34 ableitbare Aminosäuresequenzen besitzen signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus Candida maltosa, insbesondere zu einem Protein, welches für die Pseudohyphen-Entwicklung in C. maltosa essentiell ist, (vgl. Na- kazawa T., et al., J. Bacteriol., 180(8), 2079-2086, (1998)). Ebenfalls konnte Homologie zu ei- nem entsprechenden Protein aus S. cerevisiae festgestellt werden.

h) eine, vorzugsweise niederregulierte, Nukleinsäuresequenz, welche für ein Protein mit der Funktion eines mit Aktin wechselwirkenden Proteins kodiert.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wurde ein DNA-Klon isoliert, welche für eine charakteristische Teilsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 145" trägt. Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform wurde erfindungsgemäß ein DNA-Klon isoliert, der für die Vollsequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kodiert und die interne Bezeichnung „Oligo 145v" trägt.

Ein erster Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 36. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Polynukleotid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 38 oder ein Fragment davon. Vorzugsweise sind die Polynukleotide aus einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya, insbesondere A. gossypii isolierbar. Außerdem sind Gegenstand der Erfindung die dazu komplementären Polynukleotide; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

Die Inserts von „Oligo145 " und „Oligo 145v" besitzen mit dem MIPS Tag „Aip2" aus S. cerevisi- ae signifikante Homologien. Die Inserts besitzen eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 36 bzw. SEQ ID NO: 38. Die vom kodierenden Strang abgeleitete Aminosäuresequenz bzw. A- minosäureteilsequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae, welches mit Aktin wechselwirkt (vgl. Chelstowska A., et al., Yeast 15 (13), 1377-1391 (1999)).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Oligonukleotide, welche mit einem der obigen Polynukleotide, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisieren.

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Polynukleotide, welche mit einem der erfindungsge- mäßen Oligonukleotide hybridisieren und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses Genproduktes kodieren.

Die Erfindung betrifft weiterhin Polypeptide bzw. Proteine, welche von den oben beschriebenen Polynukleotiden kodiert werden; sowie Peptidfragmente davon, welche eine Aminosäuresequenz aufweisen, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11 , 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 25, 27, 29, 31 , 32, 33, 35, 37, oder SEQ ID NO: 39 um- fasst; sowie funktionale Äquivalente der erfindungsgemäßen Polypeptide bzw. Proteine.

Funktionale Äquivalente unterscheiden sich dabei von den erfindungsgemäß konkret offenbar- ten Produkten in ihrer Aminosäuresequenz durch Addition, Insertion, Substitution, Deletion oder

Inversion an wenigstens einer, wie z.B. 1 bis 30 oder 1 bis 20 oder 1 bis 10, Sequenzpositionen ohne die ursprünglich beobachtete und durch Sequenzvergleich mit anderen Proteinen ableitba- re Proteinfunktion zu verlieren. Damit können Äquivalente im wesentlichen identische, höhere oder niedrigere Aktivitäten im Vergleich zum nativen Protein besitzen.

Weitere Gegenstände der Erfindung betreffen Expressionskassetten zurrekombinanten Produk- tion erfindungsgemäßer Proteine, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine der oben definierten Nukleinsäuresequenzen; sowie re- kombinante Vektoren, umfassend wenigstens eine solche erfindungsgemäße Expressionskassette.

Erfindungsgemäß bereitgestellt werden außerdem prokaryotische oder eukaryotische Wirte, welche mit wenigstens einem Vektor obigen Typs transformiert sind. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform werden solche prokaryotischen oder eukaryotischen Wirte bereitgestellt, in welchen die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert (z.B. Inhibition oder Überexpression) ist, das für ein erfindungsgemäßes Polypeptid nach obiger Definition kodiert; oder in welchen die biologische Aktivität eines Polypeptids nach obiger Definition emiedrigt oder erhöht ist. Bevorzugte Wirte sind ausgewählt unter Ascomyceten (Schlauchpilzen), insbesondere solchen der Gattung Ashbya und vorzugsweise Stämmen von A. gossypii.

Eine Modulation der Genexpression im obigen Sinn umfasst sowohl deren Inhibition, z.B. durch Blockade einer Expressionsstufe (insbesondere Transkription oder Translation) oder eine gezielte Überexpression eines Gens (z.B. durch Modifikation regulativer Sequenzen oder Erhöhung der Kopienzahl der kodierenden Sequenz).

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Ex- pressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette, eines erfindungsgemäßen Vektors oder eines erfindungsgemäßen Wirts zur rekombinanten Herstellung eines erfindungsgemäßen Polypeptids nach obiger Definition.

Erfindungsgemäß wird weiterhin ein Verfahren zur Nachweis bzw. zur Validierung eines Effektortargets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon bereitgestellt. Dabei behandelt man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäurese- quenz, wechselwirkt ( wie z.B. an diese nicht-kovalent bindet), den Einfluß des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2 und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert. Die Validierung erfolgt dabei bevorzugt durch direkten Vergleich mit der mikrobiologischen Vitamin B2-Produktion in Abwe- senheit des Effektors unter ansonsten gleichen Bedingungen.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Modulation (in Bezug auf Menge und/oder Geschwindigkeit) der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologi- sehen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem erfindungsgemäßen Polypeptid nach obiger Definition oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt.

Als bevorzugte Beispiele für oben genannte Effektoren sind zu nennen: a) Antikörper oder antigenbindene Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid wechselwirken; c) niedermolekulare Effektoren, welche die biologische Aktivität eines erfindungsgemäßen Polypeptids modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen, welche mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz wechselwirken.

Oben genannte Effektoren mit Spezifität für wenigstens eines der oben definierten erfindungs- gemäßen Targets sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt gemäß obiger Definition unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkt(e) aus dem Kulturansatz isoliert. Bevorzugt ist dabei, dass man den Wirt vor und/oder während der Kultivierung mit einem Effektor nach obiger Definition behandelt. Ein bevorzugter Wirt ist dabei ausgewählt unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya; insbesondere transformiert, wie oben beschrieben. Ein letzter Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung eines erfindungsgemäßen Poly- nukleotids oder Polypeptids als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya.

Figurenbeschreibung:

Figur 1 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 1092 bis 595 in SEQ ID NO: 1) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags „Cwp1" aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Se- quenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 2 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 1067 bis 84 in SEQ ID NO:8) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags ARK1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 3A zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (ent- sprechend dem Gegenstrang zu Position 475 bis 353 in SEQ ID NO: 12) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags BUD2/CLA2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Figur 3B zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 351 bis 1 in SEQ ID NO:12) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags BUD2/CLA2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpo- sitionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 4 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 933 bis 157 in SEQ ID NO: 17) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Aor1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 5 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (ent- sprechend dem Strang zu Position 117 bis 794 in SEQ ID NO:21) (obere Sequenz) und einer

Teilsequenz des MIPS-Tags Ykl179c aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenz- Positionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 6 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (ent- sprechend dem Strang zu Position 438 bis 767 in SEQ ID NO:26) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Scp1 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 7A zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 983 bis 651 in SEQ ID NO:30) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags EPD1 aus C. maltosa (untere Sequenz). Figur 7B zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 661 bis 596 in SEQ ID NO:30) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags EPD1 aus C. maltosa (untere Sequenz). Figur 7C zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Gegenstrang zu Position 591 bis 1 in SEQ ID NO:30) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags EPD1 aus C. maltosa (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind jeweils zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Figur 8 zeigt ein Alignment zwischen einer erfindungsgemäßen Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend dem Strang zu Position 2 bis 148 in SEQ ID NO:36) (obere Sequenz) und einer Teilsequenz des MIPS-Tags Aip2 aus S. cerevisiae (untere Sequenz). Identische Sequenzpositionen sind zwischen den beiden Sequenzen angegeben. Ähnliche Sequenzpositionen sind mit „+" gekennzeichnet.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung:

Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle kodieren Proteine bzw. Proteine, die hier als Proteine des Zellwand- bzw. Cytoskelettaufbaus (z.B. mit Aktivität bezüglich der Zellwandsynthese oder des Cytoskelettaufbaus) oder kurz als „ZC-Proteine" bezeichnet werden. Diese ZC- Proteine haben z.B. eine Funktion bei der Synthese oder Umstrukturierung von Zellwand oder Cytoskelett z.B. bei entwicklungsspezifischen oder umweltbedingten Morphologieveränderungen der Zelle. Aufgrund der Verfügbarkeit von in Ashbya gossypii verwendbaren Klonierungsvekto- ren, wie z.B. offenbart in Wright und Philipsen (1991) Gene, 109, 99-105., und von Techniken zur genetischen Manipulation von A. gossypii und den verwandten Hefe-Arten lassen sich die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle zur genetischen Manipulation dieser Organismen, insbesondere von A. gossypii verwenden, um sie als Produzenten von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivate davon besser und effizienter zu machen. Diese verbesserte Produktion oder Effizienz kann aufgrund einer direkten Wirkung der Manipulation eines erfindungsgemäßen Gens oder aufgrund einer indirekten Wirkung einer solchen Manipulation erfolgen.

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Bereitstellung neuer Molekülen, die hier als ZC- Nukleinsäuren und ZC-Proteine bezeichnet werden und am Aufbau von Zellwand und Cytoskelett, insbesondere in Ashbya gossypii, (z.B. bei der Synthese oder Umstrukturierung von Zellwand und Cytoskelett ) beteiligt sind. Die Aktivität der erfindungsgemäßen ZC-Moleküle in A. gossypii beeinflußt die Vitamin B2-Produktion durch diesen Organismus. Vorzugsweise wird die Aktivität der erfindungsgemäßen ZC-Moleküle so moduliert, dass die Stoffwechsel- und/oder Energiewege von A. gossypii, an denen die erfindungsgemäßen ZC-Proteine teilnehmen, hinsichtlich der Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion moduliert werden, was entweder direkt oder indirekt die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Vitamin B2-Produktion in A. gossypii moduliert.

Die erfindungsgemäß bereitgestellten Nukleinsäuresequenzen sind beispielsweise aus dem Genom eines Ashbya gossyp//-Stammes isolierbar, der von der American Type Culture Collecti- on unter der Bezeichnung ATCC 10895 frei erhältlich ist.

Verbesserung der Vitamin B2-Produktion:

Es gibt eine Reihe von möglichen Mechanismen, über welche man durch Veränderung von Menge und/oder Aktivität eines erfindungsgemäßen ZC-Proteins die Ausbeute, Produktion und/oder Effizienz der Produktion von Vitamin B2 durch einem A. gossypii-Stamm direkt beeinflussen kann.

So kann durch eine effizientere Synthese von Zellwand und Cytoskelett, die Zelle robuster gegen äußere Einflüsse gemacht werden, so dass die Lebensfähigkeit und damit die Produktivität im Fermenter erhöht wird.

Die Mutagenese von einem oder mehreren erfindungsgemäßen ZC-Proteinen kann auch zu ZC- Proteinen mit geänderten (erhöhten oder verminderten) Aktivitäten führen, die indirekt die Produktion des gewünschten Produkts aus A. gossypii beeinflussen. Beispielsweise kann man mit Hilfe der ZC-Proteine die Stabilität der Zellen und der Vesikeltransport in den Zellen an die jeweiligen Umwelt- bzw. Kulturbedingungen anpassen und so die Funktion von essentiellen Stoffwechselprozessen aufrecht erhalten. Zu diesen Prozessen gehört neben der Biosynthese des Produkts auch der Aufbau der Zellwände, die Transkription, Translation, die Biosynthese von Verbindungen, die für das Wachstum und die Teilung von Zellen nötig sind (z.B. Nukleotide, Aminosäuren, Vitamine, Lipide usw.) (Lengeieretal. (1999)). Durch Verbesserung von Wachstum und Vermehrung dieser veränderten Zellen ist es möglich, die Lebensfähigkeit der Zellen in Kulturen im Großmaßstab zu steigern und auch ihre Teilungsrate so zu verbessern, dass eine vergleichsweise größere Anzahl von produzierenden Zellen in der Fermenterkultur überleben kann. Die Ausbeute, Produktion oder Effizienz der Produktion kann zumindest aufgrund der Anwesenheit einer größeren Anzahl lebensfähiger Zellen, die jeweils das gewünschte Produkt produzieren, erhöht werden.

Polypeptide

Gegenstand der Erfindung sind Polypeptide, welche die oben genannten Aminosäuresequenzen oder charakteristische Teilsequenzen davon umfassen und/oder von den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen kodiert werden.

Erfindungsgemäß mit umfasst sind ebenfalls „funktionale Äquivalente" der konkret offenbarten neuen Polypeptide.

„Funktionale Äquivalente" oder Analoga der konkret offenbarten Polypeptide sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung davon verschiedene Polypeptide, welche weiterhin die gewünschte biologische Aktivität, (wie z.B. Substratspezifität) besitzen.

Unter "funktionalen Äquivalenten" versteht man erfindungsgemäß insbesondere Mutanten, wel- ehe in wenigstens einer der oben genannten Sequenzpositionen eine andere als die konkret genannte Aminosäure aufweisen aber trotzdem eine der oben genannten biologischen Aktivitäten besitzen. "Funktionale Äquivalente" umfassen somit die durch eine oder mehrere Aminosäure-Additionen, -Substitutionen, -Deletionen und/ oder -Inversionen erhältlichen Mutanten, wobei die genannten Veränderungen in jeglicher Sequenzposition auftreten können, solange sie zu einer Mutante mit dem erfindungsgemäßen Eigenschaftsprofil führen. Funktionale Äquivalenz ist insbesondere auch dann gegeben, wenn die Reaktivitätsmuster zwischen Mutante und unverändertem Polypeptid qualitativ übereinstimmen, d.h. beispielsweise gleiche Substrate mit unterschiedlicher Geschwindigkeit umgesetzt werden.

„Funktionale Äquivalente" im obigen Sinne sind auch Präkursoren der beschriebenen Polypeptide sowie funktionale Derivate und Salze der Polypeptide. Unter dem Ausdruck „Salze" versteht man sowohl Salze von Carboxylgruppen als auch Säureadditionssalze von Ami- nogruppen der erfindungsgemäßen Proteinmoleküle. Salze von Carboxylgruppen können in an sich bekannter Weise hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, wie zum Beispiel Natrium-, Calcium-, Ammonium-, Eisen- und Zinksalze, sowie Salze mit organischen Basen, wie zum Beispiel Aminen, wie Triethanolamin, Arginin, Lysin, Piperidin und derglei- chen. Säureadditionssalze, wie zum Beispiel Salze mit Mineralsäuren, wie Salzsäure oder Schwefelsäure und Salze mit organischen Säuren, wie Essigsäure und Oxalsäure sind ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

„Funktionale Derivate" erfindungsgemäßer Polypeptide können an funktioneilen Aminosäure- Seitengruppen oder an deren N- oder C-terminalen Ende mit Hilfe bekannter Techniken ebenfalls hergestellt werden. Derartige Derivate umfassen beispielsweise aliphatische Ester von Carbonsäuregruppen, Amide von Carbonsäuregruppen, erhältlich durch Umsetzung mit Ammoniak oder mit einem primären oder sekundären Amin; N-Acylderivate freier Aminogruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen; oder O-Acylderivate freier Hydroxylgruppen, hergestellt durch Umsetzung mit Acylgruppen.

"Funktionale Äquivalente" umfassen natürlich auch Polypeptide welche aus anderen Organismen, zugänglich sind, sowie natürlich vorkommende Varianten. Beispielsweise lassen sich durch Sequenzvergleich Bereiche homologer Sequenzregionen festlegen und in Anlehnung an die konkreten Vorgaben der Erfindung äquivalente Enzyme ermitteln.

„Funktionale Äquivalente" umfassen ebenfalls Fragmente, vorzugsweise einzelne Domänen o- der Sequenzmotive, der erfindungsgemäßen Polypeptide, welche z.B. die gewünschte biologische Funktion aufweisen.

„Funktionale Äquivalente" sind außerdem Fusionsproteine, welche ein der oben genannten Po- lypeptidsequenzen oder davon abgeleitete funktionale Äquivalente und wenigstens eine weitere, davon funktionell verschiedene, heterologe Sequenz in funktioneller N- oder C-terminaler Verknüpfung (d.h. ohne gegenseitigen wesentliche funktioneile Beeinträchtigung der Fusionsprote- inteile) aufweisen. Nicht-Iimitiernde Beispiele für derartige heterologe Sequenzen sind z.B. Sig- nalpeptide, Enzyme, Immunoglobuline, Oberflächenantigene, Rezeptoren oder Rezeptorliganden.

Erfindungsgemäß mit umfasste „funktionale Äquivalente" sind Homologe zu den konkret offen- harten Proteinen. Diese besitzen wenigstens 60 %, vorzugsweise wenigstens 75% ins besondere wenigsten 85 %, wie z.B. 90%, 95% oder 99%, Homologie zu einer der konkret offenbarten Sequenzen, berechnet nach dem Algorithmus von Pearson und Lipman, Proc. Natl. Acad, Sei. (USA) 85(8), 1988, 2444-2448.

Im Falle einermöglichen Proteinglykosylierung umfassen erfindungsgemäße Äquivalente Prote- ine des oben bezeichneten Typs in deglykosylierter bzw. glykosylierter Form sowie durch Veränderung des Glykosylierungsmusters erhältliche abgewandelte Formen.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine oder Polypeptide können durch Mutagenese erzeugt werden, z.B. durch Punktmutation oder Verkürzung des Proteins. Der Begriff "Homolog", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Variante Form des Proteins, die als Agonist o- der Antagonist der Protein-Aktivität wirkt.

Homologe der erfindungsgemäßen Proteine können durch Screening kombinatorischer Banken von Mutanten, wie z.B. Verkürzungsmutanten, identifiziert werden. Beispielsweise kann eine variegierte Bank von Protein-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäure- ebene erzeugt werden, wie z.B. durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide. Es gibt eine Vielzahl von Verfahren, die zur Herstellung von Banken potentieller Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten durchgeführt werden, und das synthetische Gen kann dann in einen geeigneten Expressionsvektor ligiert werden. Die Verwendung eines degenerierten Gensatzes ermöglicht die Bereitstellung sämtlicher Sequenzen in einem Gemisch, die den gewünschten Satz an potentiellen Proteinsequenzen codieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt (Z.B. Narang, S.A. (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., (1984) Science 198:1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acids Res. 11 :477).

Zusätzlich können Banken von Fragmenten des Protein-Codons verwendet werden, um eine variegierte Population von Protein-Fragmenten zum Screening und zur anschließenden Selekti- on von Homologen eines erfindungsgemäßen Proteins zu erzeugen. Bei einer Ausführungsform kann eine Bank von kodierenden Sequenzfragmenten durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, unter denen ein Nicking nur etwa einmal pro Molekül erfolgt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA, die Sense-/Antisense-Paare von verschiedenen genickten Produkten umfassen kann, Entfernen einzelsträngiger Abschnitte aus neu gebildeten Duplices durch Behandlung mit S1-Nuclease und Ligieren der resultierenden Fragmentbank in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbank hergeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne Fragmente mit verschiedenen Größen des erfindungsgemäßen Proteins kodiert.

Im Stand der Technik sind mehrere Techniken zum Screening von Genprodukten kombinatori- scher Banken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellt worden sind, und zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft bekannt. Diese Techniken lassen sich an das schnelle Screening der Genbanken anpassen, die durch kombinatorische Mutagenese von erfindungsgemäßer Homologen erzeugt worden sind. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken, die einer Analyse mit hohem Durchsatz unterliegen, umfassen das Klonieren der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren der geeigneten Zellen mit der resultierenden Vektorenbank und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen der Nachweis der gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Recursive-Ensemble-Mutagenese (REM), eine Technik, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Banken vergrößert, kann in Kombination mit den Screeningtests verwendet werden, um Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan (1992) PNAS 89:7811- 7815; Delgrave et al. (1993) Protein Engineering 6(3):327-331 ).

Die erfindungsgemäßen Polypeptide können rekombinant hergestellt werden (vgl. folgende Ab- schnitte) oder können in nativer Form unter Anwendung klassischer biochemischer Arbeitsweisen (vgl. Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin) aus Mikroorganismen, insbesondere solchen der Gattung Ashbya, isoliert werden.

Nukleinsäureseguenzen:

Gegenstand der Erfindung sind auch Nukleinsäuresequenzen (einzel- und doppelsträngige DNA- und RNA-Sequenzen, wie z.B. cDNA und mRNA), kodierend für eines der obigen Polypeptide und deren funktionalen Äquivalenten, welche z.B. unter Verwendung künstlicher Nukleotidanaloga zugänglich sind.

Die Erfindung betrifft sowohl isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche für erfindungsgemäße Polypeptide bzw. Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon kodieren, sowie Nukleinsäure- fragmente, die z.B. zur Verwendung als Hybridisierungssonden oder Primer zur Identifizierung oder Amplifizierung von erfindungsgemäßen kodierenden Nukleinsäuren verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können zudem untranslatierte Sequenzen vom 3'- und/oder 5'-Ende des kodierenden Genbereichs enthalten.

Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül wird von anderen Nukleinsäuremolekülen abgetrennt, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure zugegen sind und kann überdies im wesentlichen frei von anderem zellulären Material oder Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.

Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels molekularbiologischer Standard- Techniken und der erfindungsgemäß bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Beispielsweise kann cDNA aus einer geeigneten cDNA-Bank isoliert werden, indem eine der konkret offenbarten vollständigen Sequenzen oder ein Abschnitt davon als Hybridisierungssonde und Standard-Hybridisierungstechniken (wie z.B. beschrieben in Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) verwendet werden. Überdies läßt sich ein Nukleinsäuremolekül, umfassend eine der offenbarten Sequenzen oder einen Abschnitt davon, durch Polymerasekettenreaktion isolieren, wobei die Oligonukleotidprimer, die auf der Basis dieser Sequenz erstellt wurden, verwendet werden. Die so amplifizierte Nuklein- säure kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide, die einer SA-Nukleotidsequenz entsprechen, können ferner durch Standard-Syntheseverfahren, z.B. mit einem automatischen DNA-Synthesegerät, hergestellt werden.

Die Erfindung umfasst weiterhin die zu den konkret beschriebenen Nukleotidsequenzen komplementären Nukleinsäuremoleküle oder einen Abschnitt davon.

Die erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Identifizierung und/oder Klonierung homologer Sequenzen in anderen Zelltypen und Organismen verwendbar sind. Solche Sonden bzw. Primer umfassen gewöhnlich einen Nukleotidsequenzbereich, der unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, vorzugsweise mindestens etwa 25, wie z.B. etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Stranges einer erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenz oder eines entsprechenden Antisense-Stranges hybridisiert.

Weitere erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenzen sind abgeleitet von SEQ ID NO: 1 , 4, 8, 10, 12, 15, 17, 19, 21 , 23, 26, 28, 30, 34, 36 oder SEQ ID NO: 38 und unterscheiden sich davon durch Addition, Substitution, Insertion oderDeletion einzelner oder mehrerer Nukleotide, kodieren aber weiterhin für Polypeptide mit dem gewünschten Eigenschaftsprofil.

Erfindungsgemäß umfasst sind auch solche Nukleinsäuresequenzen, die sogenannte stumme Mutationen umfassen oder entsprechend der Codon-Nutzung eines speziellen Ursprungs- oder Wirtsorganismus, im Vergleich zu einer konkret genannten Sequenz verändert sind, ebenso wie natürlich vorkommende Varianten, wie z.B. Spleißvarianten oder Allelvarianten, davon. Gegenstand sind ebenso durch konservative Nukleotidsubstutionen (d.h. die betreffende Aminosäure wird durch eine Aminosäure gleicher Ladung, Größe, Polarität und/oder Löslichkeit ersetzt) er- hältliche Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung sind auch die durch Sequenzpolymorphismen von den konkret offenbarten Nukleinsäuren abgeleiteten Moleküle. Diese genetischen Polymorphismen können zwischen Individuen innerhalb einer Population aufgrund der natürlichen Variation existieren. Diese natürlichen Variationen bewirken üblicherweise eine Varianz von 1 bis 5 % in der Nukleotidse- quenz eines Gens.

Weiterhin umfasst die Erfindung auch Nukleinsäuresequenzen, welchen mit oben genannten kodierenden Sequenzen hybridisieren oder dazu komplementär sind. Diese Polynukleotide las- sen sich bei Durchmusterung von genomischen oder cDNA-Banken auffinden und gegebenenfalls daraus mit geeigneten Primern mittels PCR vermehren und anschließend beispielsweise mit geeigneten Sonden isolieren. Eine weitere Möglichkeit bietet die Transformation geeigneter Mikroorganismen mit erfindungsgemäßen Polynukleotiden oder Vektoren, die Vermehrung der Mikroorganismen und damit der Polynukleotide und deren anschließende Isolierung. Darüber hinaus können erfindungsgemäße Polynukleotide auch auf chemischem Wege synthetisiert werden.

Unter der Eigenschaft, an Polynukleotide „hybridisieren" zu können, versteht man die Fähigkeit eines Poly- oderOligonukleotids unter stringenten Bedingungen an eine nahezu komplementäre Sequenz zu binden, während unter diesen Bedingungen unspezifische Bindungen zwischen nicht-komplementären Partnern unterbleiben. Dazu sollten die Sequenzen zu 70-100%, vorzugsweise zu 90-100%, komplementär sein. Die Eigenschaft komplementärer Sequenzen, spezifisch aneinander binden zu können, macht man sich beispielsweise in der Northern- oder Sou- thern-Blot-Technik oder bei der Primerbindung in PCR oder RT-PCR zunutze. Üblicherweise werden dazu Oligonukleotide ab einer Länge von 30 Basenpaaren eingesetzt. Unter stringenten Bedingungen versteht man beispielsweise in der Northem-Blot-Technik die Verwendung einer 50 - 70 °C, vorzugsweise 60 - 65 °C warmen Waschlösung, beispielsweise 0,1x SSC-Puffer mit 0,1% SDS (20x SSC: 3M NaCI, 0,3M Na-Citrat, pH 7,0) zur Elution unspezifisch hybridisierter cDNA-Sonden oder Oligonukleotide. Dabei bleiben, wie oben erwähnt, nur in hohem Maße komplementäre Nukleinsäuren aneinander gebunden. Die Einstellung stringenter Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und ist z.B. in Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. beschrieben.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft "Antisense-'Nukleinsäuren. Diese umfaßt eine Nukleo- tidsequenz, die zu einer kodierenden "Sense-"Nukleinsäure, komplementär ist. Die Antisense- Nukleinsäure kann zum gesamten kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon kom- plementär sein. Bei einerweiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül an- tisense zu einem nicht-kodierenden Bereich des kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz. Der Begriff "nicht-kodierender Bereich" betrifft die als 5'- und 3'-untranslatierte Bereiche bezeichneten Sequenzabschnitte.

Ein Antisense-Oligonukleotid kann bspw. etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleoti- de lang sein. Eine erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäure kann durch chemische Synthese und enzymatische Ligationsreaktionen mittels im Fachgebiet bekannter Verfahren konstruiert werden. Eine Antisense-Nukleinsäure kann chemisch synthetisiert werden, wobei natürlich vorkommende Nukleotide oder verschieden modifizierte Nukleotide verwendet werden, die so ges- taltet sind, daß sie die biologische Stabilität der Moleküle erhöhen, oder die physikalische Stabilität des Duplexes erhöhen, der zwischen der Antisense- und Sense-Nukleinsäure entstanden ist. Beispielsweise können Phosphorthioat-Derivate und acridinsubstituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleoside, die zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, sind u.a. 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-loduracil, Hypo- xanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-

Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Be- ta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-lsopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2- Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D- Mannosylqueosin, δ'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6- isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2- Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5- oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2- carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Die Antisense-Nukleinsäure kann auch biologisch hergestellt werden, indem ein Expressionsvektor verwendet wird, in den eine Nukleinsäure in Antisense-Richtung subkloniert worden ist. Die erfindungsgemäßen Antisense-Nukleinsäuremoleküle werden üblicherweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit der zellulären mRNA und/oder einer kodierenden DNA hybridisieren oder daran binden, so daß die Expression des Proteins, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird.

Das Antisense-Molekül kann so modifiziert werden, daß es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen bindet, das auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert wird, z.B. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, das/der an einen Zelloberflächenrezeptor oder Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren an Zellen verabreicht werden. Zur Erzielung hinreichender intrazellulärer Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektorkon- strukte, in denen sich das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken bakteriellen, viralen oder eukaryotischen Promotors befindet, bevorzugt.

In einer weiteren Ausführungsform ist das erfindungsgemäße Antisense-Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu gewöhnlichen alpha-Einheiten parallel zueinander verlaufen. (Gaultier et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6625-6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zudem ein 2'-0- Methylribonukleotid (Inoue et al., (1987) Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al. (1987) FEBS Lett. 215:327-330) umfassen.

Gegenstand der Erfindung sind auch Ribozyme. Dies sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribo- nukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie einen kom- plementären Bereich haben, spalten können. Somit können Ribozyme (z.B. Hammerhead- Ribozyme (beschrieben in Haselhoff und Gerlach (1988) Nature 334:585-591 )) zur katalytischen Spaltung von erfindungsgemäßen Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation der entsprechenden Nukleinsäure zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine erfindungsgemäße kodierende Nukleinsäure kann z.B. auf der Basis einer hierin konkret offenbarten cDNA gebildet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena-L-19-IVS-RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementärzurNukleotidsequenzist, die in einer erfindungsgemäßen kodierenden mRNA gespalten werden soll. (vgl. z.B. US-A-4 987 071 und US-A-5 116742). Alternativ kann mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit spezifischer Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden (siehe z.B. Bartel, D., und Szostak, J.W. (1993) Science 261 :1411-1418). Die Genexpression erfindungsgemäßer Sequenzen läßt sich alternativ hemmen, indem Nukleotidsequenzen, die komplementär zum regulatorischen Bereich einer erfindungsgemäßen Nukleo- tidsequenz sind (z.B. zu einem Promotor und/oder Enhancer einer kodierenden Sequenz) so dirigiert werden, daß Triple-Helixstrukturen gebildet werden, die die Transkription des entsprechenden Gens in Ziel-Zellen verhindern (Helene, C. (1991 ) Anticancer Drug Res. 6(6) 569-584; Helene, C. et al., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660:27-36; und Mäher. L.J. (1992) Bioassays 14(12):807-815).

Expressionskonstrukte und Vektoren:

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Expressionskonstrukte, enthaltend unter der genetischen Kontrolle regulativer Nukleinsäuresequenzen eine für ein erfindungsgemäßes Polypeptid kodierende Nukleinsäuresequenz; sowie Vektoren, umfassend wenigstens eines dieser Expressionskonstrukte. Vorzugsweise umfassen solche erfindungsgemäßen Konstrukte 5'-strom- aufwärts von der jeweiligen kodierenden Sequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Terminatorsequenz sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar jeweils operativ verknüpft mit der kodierenden Sequenz. Unter einer „operativen Verknüpfung" versteht man die sequentielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und gegebenenfalls weiterer regulativer Elemente derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funkti- on bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Beispiele für operativ verknüpfbare Sequenzen sind Targeting-Sequenzen sowie Enhancer, Polyadenylie- rungssignale und dergleichen. Weitere regulative Elemente umfassen selektierbare Marker, Amplifikationssignale, Replikationsursprünge und dergleichen. Geeignete regulatorische Sequenzen sind z.B. beschrieben in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymo- logy 185, Academic Press, San Diego, CA (1990).

Zusätzlich zu den artifiziellen Regulationssequenzen kann die natürliche Regulationssequenz vor dem eigentlichen Strukturgen noch vorhanden sein. Durch genetische Veränderung kann diese natürliche Regulation gegebenenfalls ausgeschaltet und die Expression der Gene erhöht oder erniedrigt werden. Das Genkonstrukt kann aber auch einfacher aufgebaut sein, das heißt es werden keine zusätzlichen Regulationssignale vor das Strukturgen insertiert und der natürliche Promotor mit seiner Regulation wird nicht entfernt. Statt dessen wird die natürliche Regulationssequenz so mutiert, dass keine Regulation mehr erfolgt und die Genexpression gesteigert oder verringert wird. Die Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein. Beispiele für brauchbare Promotoren sind: cos-, tac-, trp-, tet-, trp-tet-, Ipp-, lac-, Ipp-lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, λ-PR- oder im λ-PL-Promotor, die vorteilhafterweise in gramnegativen Bakterien Anwendung finden; sowie die gram-positiven Promotoren amy und SP02, die Hefepromotoren ADC1, MFα , AC, P-60, CYC1 , GAPDH oder die Pflanzenpromotoren CaMV/35S, SSU, OCS, Iib4, usp, STLS1 , B33, not oder der Ubiquitin- oder Phaseolin-Promotor. Besonders bevorzugt ist die Verwendung induzierbarer Promotoren, wie z.B. licht- und insbesondere temperaturinduzierbarer Promotoren, wie der P_rP_rPromotor. Prinzipiell können alle natürlichen Promotoren mit ihren Regulationssequenzen verwendet werden. Darüber hinaus können auch synthetische Promotoren vorteilhaft verwendet werden.

Die genannten regulatorischen Sequenzen sollen die gezielte Expression der Nukleinsäuresequenzen ermöglichen. Dies kann beispielsweise je nach Wirtsorganismus bedeuten, dass das Gen erst nach Induktion exprimiert oder überexprimiert wird, oder dass es sofort exprimiert und/oder überexprimiert wird.

Die regulatorischen Sequenzen bzw. Faktoren können dabei vorzugsweise die Expression positiv beeinflussen und dadurch erhöhen oder erniedrigen. So kann eine Verstärkung der regulatorischen Elemente vorteilhafterweise auf der Transkriptionsebene erfolgen, indem starke Transkriptionssignale wie Promotoren und/oder "Enhancer" verwendet werden. Daneben ist aber auch eine Verstärkung der Translation möglich, indem beispielsweise die Stabilität der mRNA verbessert wird.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten erfindungsgemäßen Nukleotidsequenz sowie einem Terminator- oder Polya- denylierungssignal. Dazu verwendet man gängige Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Sil- havy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Mole- cular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Das rekombinante Nukleinsäurekonstrukt bzw. Genkonstrukt wird zur Expression in einem geeigneten Wirtsorganismus vorteilhafterweise in einen wirtsspezifischen Vektor insertiert, dereine optimale Expression der Gene im Wirt ermöglicht. Vektoren sind dem Fachmann wohl bekannt und können beispielsweise aus "Cloning Vectors" (Pouwels P. H. et al., Hrsg, Elsevier, Amster- dam-New York-Oxford, 1985) entnommen werden. Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren, wie beispielsweise Phagen, Viren, wie SV40, CMV, Baculovirus und Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Cosmide, und lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden.

Als Beispiele für geeignete Expressionsvektoren können genannt werden:

Übliche Fusionsexpressionsvektoren, wie pGEX (Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. und Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT 5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), bei denen Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E-bindendes Prote- in bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusioniert wird.

Nicht-Fusionsprotein-Expressionsvektoren wie pTrc (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al. Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Aca- demic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60-89).

Hefe-Expressionsvektor zur Expression in der Hefe S. cerevisiae , wie pYepSed (Baldari et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan und Herskowitz (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al. (1987) Gene 54:113-123) sowie pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich zur Verwendung in anderen Pilzen, wie filamentösen Pilzen, eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector develop- mentforfilamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.

Baeulovirus-Vektoren, die zur Expression von Proteinen in gezüchteten Insektenzellen (bspw. Sf9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., (1983) Mol. Cell BioL 3:2156- 2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers (1989) Virology 170:31-39).

Pflanzen-Expressionsvektoren, wie solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R. (1992) "New plant binary vectors with seleetable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acids Res. 12:8711-8721.

Säugetier-Expressionsvektoren, wie pCDM8 (Seed, B. (1987) Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6:187-195). Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryotische Zellen sind in Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsch, E.F. und Maniatis, T., Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Rekombinante Mikroorganismen:

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vektoren sind rekombinante Mikroorganismen herstellbar, welche beispielsweise mit wenigstens einem erfindungsgemäßen Vektor transformiert sind und zur Produktion der erfindungsgemäßen Polypeptide eingesetzt werden können. Vorteilhafterweise werden die oben beschriebenen erfindungsgemäßen rekombinanten Konstrukte in ein geeignetes Wirtssystem eingebracht und exprimiert. Dabei werden vorzugsweise dem Fachmann bekannte geläufige Klonierungs- und Transfektionsmethoden, wie beispielsweise Co-Präzipitation, Protoplastenfusion, Elektroporation, retrovirale Transfektion und dergleichen, verwendet, um die genannten Nukleinsäuren im jeweiligen Expressionssystem zur Expression zu bringen. Geeignete Systeme werden beispielsweise in Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel et al., Hrsg., Wiley Interscience, New York 1997, oder Sambrook et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 beschrieben.

Erfindungsgemäß sind auch homolog rekombinierten Mikroorganismen herstellbar. Dazu wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines erfindungsgemäßen Gens oder einer kodierenden Sequenz enthält, worin gegebenenfalls wenigstens eine Aminosäure-Deletion, - Addition oder -Substitution eingebracht worden ist, um die erfindungsgemäße Sequenz zu ver- ändern, z.B. funktioneil zu disrumpieren ("Knockouf'-Vektor). Die eingebrachte Sequenz kann z.B. auch ein Homologes aus einem verwandten Mikroorganismus sein oder aus einer Säugetier-, Hefe- oder Insektenquelle abgeleitet sein. Der zur homologen Rekombination verwendete Vektor kann alternativ derart ausgestaltet sein, daß das endogene Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert ist, jedoch noch das funktionelle Protein codiert (z.B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich derart verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen Proteins verändert wird). Der veränderte Abschnitt des ZC-Gens ist im homologen Rekombinationsvektor. Die Konstruktion geeigneter Vektoren zur homologen Rekombination ist z.B. beschrieben in Thomas, K.R. und Capecchi, M.R. (1987) Cell 51 :503.

Als Wirtsorganismen sind prinzipiell alle Organismen geeignet, die eine Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, ihrer Allelvarianten, ihrer funktioneilen Äquivalente oder Derivate ermöglichen. Unter Wirtsorganismen sind beispielsweise Bakterien, Pilze, Hefen, pflanzliche oder tierische Zellen zu verstehen. Bevorzugte Organismen sind Bakterien, wie solche der Gattungen Escherichia, wie z. B. Escherichia coli, Streptomyces, Bacillus oder Pseudomonas, eukaryotische Mikroorganismen, wie Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus, höhere eukaryotische Zellen aus Tieren oder Pflanzen, beispielsweise Sf9 oder CHO-Zellen. Bevorzugte Organismen sind aus der Gattung Ashbya, insbesondere aus A. gossyp//^'-Stämmen ausgewählt.

Die Selektion erfolgreich transformierter Organismen kann durch Markergene erfolgen, die ebenfalls im Vektor oder in der Expressionskassette enthalten sind. Beispiele für solche Markergene sind Gene für Antibiotikaresistenz und für Enzyme, die eine farbgebende Reaktion katalysieren, die ein Anfärben der transformierten Zelle bewirkt. Diese können dann mittels automatischer Zellsortierung selektiert werden. Erfolgreich mit einem Vektor transformierte Mikroorganismen, die ein entsprechendes Antibiotikaresistenzgen (z.B. G418 oder Hygromycin) tragen, lassen sich durch entsprechende Antibiotika-enthaltende Medien oder Nährböden selektieren. Markerproteine, die an der Zelloberfläche präsentiert werden, können zur Selektion mittels Affinitäts- Chromatographie genutzt werden.

Die Kombination aus den Wirtsorganismen und den zu den Organismen passenden Vektoren, wie Plasmide, Viren oder Phagen, wie beispielsweise Plasmide mit dem RNA- Polymerase/Promoter-System, die Phagen λ oder μ oder andere temperente Phagen oder Transposons und/oder weiteren vorteilhaften regulatorischen Sequenzen bildet ein Expressionssystem. Beispielsweise ist unter dem Begriff "Expressionssystem" die Kombination aus Säugetierzellen, wie CHO-Zellen, und Vektoren, wie pcDNA3neo-Vektor, die für Säugetierzellen geeignet sind, zu verstehen.

Gewünsehtenfalls kann das Genprodukt auch in transgenen Organismen wie transgenen Tieren, wie insbesondere Mäusen, Schafen oder transgenen Pflanzen zur Expression gebracht werden.

Rekombinante Herstellung der Polypeptide:

Gegenstand der Erfindung sind weiterhin Verfahren zur rekombinanten Herstellung einer erfindungsgemäßen Polypeptide oder funktioneller, biologisch aktiver Fragmente davon, wobei man einen Polypeptide-produzierenden Mikroorganismus kultiviert, gegebenenfalls die Expression der Polypeptide induziert und diese aus der Kultur isoliert. Die Polypeptide können so auch in großtechnischem Maßstab produziert werden, falls dies erwünscht ist.

Der rekombinante Mikroorganismus kann nach bekannten Verfahren kultiviert und fermentiert werden. Bakterien können beispielsweise in TB- oder LB-Medium und bei einer Temperatur von 20 bis 40°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 vermehrt werden. Im Einzelnen werden geeignete Kultivierungsbedingungen beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1982) beschrieben.

Die Zellen werden dann, falls die Polypeptide nicht in das Kulturmedium sezerniert werden, aufgeschlossen und das Produkt nach bekannten Proteinisolierungsverfahren aus dem Lysat gewonnen. Die Zellen können wahlweise durch hochfrequenten Ultraschall, durch hohen Druck, wie z.B. in einer French-Druckzelle, durch Osmolyse, durch Einwirkung von Detergenzien, lyti- sehen Enzymen oder organischen Lösungsmitteln, durch Homogenisatoren oder durch Kombination mehrerer der aufgeführten Verfahren aufgeschlossen werden.

Eine Aufreinigung der Polypeptide kann mit bekannten, chromatographischen Verfahren erzielt werden, wie Molekularsieb-Chromatographie (Gelfiltration), wie Q-Sepharose-Chromatographie, lonenaustausch-Chromatographie und hydrophobe Chromatographie, sowie mit anderen üblichen Verfahren wie Ultrafiltration, Kristallisation, Aussalzen, Dialyse und nativer Gelelektrophorese. Geeignete Verfahren werden beispielsweise in Cooper, T. G., Biochemische Arbeitsmethoden, Verlag Walter de Gruyter, Berlin, New York oder in Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, New York, Heidelberg, Berlin beschrieben.

Besonders vorteilhaft ist es, zur Isolierung des rekombinanten Proteins Vektorsysteme oder Oligonukleotide zu verwenden, die die cDNA um bestimmte Nucleotidsequenzen verlängern und damit für veränderte Polypeptide oder Fusionsproteine kodieren, die z.B. einer einfacheren Reinigung dienen. Derartige geeignete Modifikationen sind beispielsweise als Anker fungierende sogenannte "Tags", wie z.B. die als Hexa-Histidin-Anker bekannte Modifikation oder Epitope, die als Antigene von Antikörpern erkannt werden können (beschrieben zum Beispiel in Harlow, E. and Lane, D., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor (N.Y.) Press). Diese Anker können zur Anheftung der Proteine an einen festen Träger, wie z.B. einer Polymermatrix, dienen, die beispielsweise in einer Chromatographiesäule eingefüllt sein kann, oder an einer Mikrotiterplatte oder an einem sonstigen Träger verwendet werden kann.

Gleichzeitig können diese Anker auch zur Erkennung der Proteine verwendet werden. Zur Erkennung der Proteine können außerdem übliche Marker, wie Fluoreszenzfarbstoffe, Enzymmar- ker, die nach Reaktion mit einem Substrat ein detektierbares Reaktionsprodukt bilden, oderra- dioaktive Marker, allein oder in Kombination mit den Ankern zur Derivatisierung der Proteine verwendet werden. Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.

Wird die Umsetzung mit einem rekombinanten Mikroorganismus durchgeführt, so erfolgt vor- zugsweise zunächst die Kultivierung der Mikroorganismen in Gegenwart von Sauerstoff und in einem Komplexmedium, wie z.B. bei einer Kultivierungstemperatur von etwa 20 °C oder mehr, und einem pH-Wert von etwa 6 bis 9, bis eine ausreichende Zelldichte erreicht ist. Um die Reaktion besser steuern zu können, bevorzugt man die Verwendung eines induzierbaren Promotors. Die Kultivierung wird nach Induktion der Vitamin B2-Produktion in Gegenwart von Sauerstoff 12 Stunden bis 3 Tage fortgesetzt.

Folgende nichtlimitierende Beispiele beschreiben spezielle Ausführungsformen der Erfindung.

Allgemeine experimentelle Angaben

a) Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungsschrittewie z.B. Restriktionsspaltungen, Agarose Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) a.a.O. beschrieben durchgeführt.

b) Polymerasekettenreaktion (PCR)

PCR wurde nach Standardprotokoll mit folgendem Standardansatz durchgeführt:

8 μl dNTP-Mix (200μM), 10 μl Taq-Polymerase-Puffer (10 x) ohne MgCI₂, 8μl MgCI₂ (25mM), je 1 μl Primer (0,1 μM), Iμl zu amplifizierende DNA, 2,5 U Taq-Polymerase (MBI Fermentas, Vilnius, Litauen), ad 100 μl demineralisiertes Wasser.

c) Kultivierung von E.coli

Die Kultivierung von rekombinanten E. coli-Stämme DH5α wurde in LB-Amp Medium (Trypton 10,0g, NaCI 5,0 g, Hefeextrakt 5,0 g, Ampicillin 100 g/ml H₂0 ad 1000 ml) bei 37 °C kultiviert. Dazu wurde jeweils eine Kolonie mittels Impföse von einer Agarplatte in 5 ml LB-Amp überführt. Nach ca. 18 h Stunden Kultivierung bei einer Schüttelfrequenz von 220 Upm wurden 400 ml Medium in einem 2-l-Kolben mit 4 ml Kultur inokuliert. Die Induktion der P450-Expression in E. coli erfolgte nach Erreichen eines OD578-Wertes zwischen 0,8 und 1 ,0 durch eine drei- bis vierstündige Hitzeschockinduktion bei 42 °C.

d) Reinigung des gewünschten Produktes aus der Kultur

Die Gewinnung des gewünschten Produktes aus dem Mikroorganismus oder aus dem Kulturüberstand kann durch verschiedene, im Fachgebiet bekannte Verfahren erfolgen. Wird das ge- wünschte Produkt von den Zellen nicht sezerniert, können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden, die Zellen können durch Standard-Techniken, wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung, lysiert werden.

Die Zelltrümmer werden durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die lösli- chen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung erhalten. Wird das Produkt von den Zellen sezerniert, werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung behalten.

Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterworfen, wobei das gewünschte Molekül mit höherer Selektivität als die Verunreinigungen entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird oder dieses passiert. Diese Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei die gleichen oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur aufbewahrt werden, bei der die Stabilität des Produktes maximal ist.

Im Stand der Technik sind viele Reinigungsverfahren bekannt. Diese Reinigungstechniken sind z.B. beschrieben in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw- Hill: New York (1986).

Die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen kann durch Techniken des Standes der Technik bestimmt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschiehtchromatographie, NIRS, Enzymtest oder mikrobiologische Tests. Diese Analyseverfahren sind zusammengefaßt in: Patek et al. (1994) Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova etal. (1996) Biotekhnologiya 11 27-32; und Schmidt et al. (1998) Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89-90, S. 521-540, S. 540-547, S.559-566, 575- 581 und S. 581-587; Michal, G (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistryand Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochem- istry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.

e) Allgemeine Beschreibung der MPSS-Methode, Klonidentifizierung und Homologiesuche

Die MPSS Technologie (Massive Parallele Signatur Sequenzierung, wie von Brenner et al, Nat. Biotechnol.(2000) 18, 630-634 beschrieben; worauf hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird) wurde an dem filamentösen, Vitamin B2 produzierenden Pilz Ashbya gossypii angewendet. Mit Hilfe dieser Technologie ist es möglich, mit hoher Genauigkeit quantitative Aussagen über die Expressionsstärke einer Vielzahl von Genen in einem eukaryotischen Organismus zu erhalten. Dabei wird die mRNA des Organismus zu einem bestimmten Zeitpunkt X isoliert, mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase in cDNA umgeschrieben und anschließend in spezielle Vektoren kloniert, die eine spezifische Tag-Sequenz besitzen. Die Anzahl von Vektoren mit unterschiedlicher Tagsequenz wird dabei so hoch gewählt (etwa 1000-fach höher), dass statistisch gesehen, jedes DNA-Molekül in einen, durch seine Tag-Sequenz einzigartigen, Vektor kloniert wird.

Anschließend werden die Vektorinserts zusammen mit dem Tag herausgeschnitten. Die so erhaltenen DNA-Moleküle werden dann mit Mikrokügelchen inkubiert, die die molekularen Gegenstücke zu den erwähnten Tags besitzen. Nach Inkubation kann davon ausgegangen werden, daß jedes Mikrokügelchen über die spezifischen Tags bzw. Gegenstücke mit nur einer Sorte von DNA Molekülen beladen ist. Die Kügelchen werden in eine spezielle Flußzelle überführt und dort fixiert, so dass es möglich ist, mit Hilfe eines adaptierten Sequenzierverfahrens, auf Basis von Fluoreszensfarbstoffen und mit Hilfe einer digitalen Farbkamera, eine Massensequenzierung aller Kügelchen vorzunehmen. Mit dieser Methode ist zwar eine zahlenmäßig hohe Auswertung möglich, die allerdings durch eine Leseweite von etwa 16 bis 20 Basenpaaren limitiert ist. Die Sequenzlänge reicht dennoch aus, um bei den meisten Organismen eine eindeutige Zuordnung zwischen Sequenz und Gen zu ermöglichen (20bp besitzen eine Sequenzhäufigkeit von -1x10¹², das menschliche Genom besitzt im Vergleich dazu "nur" eine Größe von -3x10⁹ bp).

Die auf diese Weise erhaltenen Daten werden ausgewertet, indem die Anzahl dergleichen Sequenzen gezählt und ihre Häufigkeiten miteinander verglichen werden. Häufig auftretende Se- quenzen spiegeln eine hohe Expressionsstärke, vereinzelt auftretende Sequenzen eine niedrige Expressionsstärke wider. Erfolgte die mRNA-lsolation zu zwei Unterschiedlichen Zeitpunkten (X und Y), so ist es möglich ein zeitliches Expressionsmuster einzelner Gene aufzustellen. Beispiel 1:

Isolation von mRNA aus Ashbya gossypii

Ashbya gossypii wurde in an sich bekannter Weise kultiviert (Nährmedium: 27,5 g/l Hefeextrakt; 0,5 g/l Magnesiumsulfat; 50ml/l Sojaöl; pH 7). Myzelproben von Ashbya gossypii werden zu unterschiedlichen Zeitpunkten der Fermentation (24h, 48h und 72h) entnommen und die entsprechende RNA bzw. mRNA wird nach dem Protokoll von Sambrook et al. (1989) daraus isoliert.

Beispiel 2:

Anwendung der MPSS

Isolierte mRNA von A. gossypii wird dann einer MPSS-Analyse, wie oben erläutert, unterzogen.

Die ermittelten Datensätze werden einer statistischen Auswertung unterzogen und nach Signifikanz der Expressionsunterschiede gegliedert. Dabei wurde sowohl hinsichtlich Erhöhung bzw. Erniedrigung der Expressionsstärke untersucht. Eine Einteilung erfolgt über eine Einstufung der Expressionsveränderung in a) monotone Veränderung, b) Veränderung nach 24h, und c) Veränderung nach 48h.

Die eine Expressionsveränderung repräsentierenden durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp- Sequenzen werden dann als Sonden verwendet und gegen eine Genbank von Ashbya gossypii, mit einer durchschnittlichen Insertgröße von etwa 1kb, hybridisiert. Die Hydridisierungstempera- tur lag dabei im Bereich von etwa 30 bis 57°C.

Beispiel 3:

Erstellung einer genomischen Genbank aus Ashbya gossypii

Zur Erstellung einer genomischen DNA-Bank wird zunächst chromosomale DNA nach der Me- thode von Wright und Philippsen (Gene (1991 ) 109: 99-105) und Mohr (1995, PhD Thesis, Biozentrum Universität Basel, Schweiz) isoliert.

Die DNA wird partiell mit Sau3A verdaut. Dazu werden 6μg genomische DNA einem Sau3A Verdau mit unterschiedlichen Enzymmengen (0,1 bis 1 U) unterzogen. Die Fragmente werden in einem Saccharose-Dichtegradienten fraktioniert. Die 1 kb Region wird isoliert und einer QiaEx- Extraktion unterzogen. Die größten Fragmente werden mit dem Ba HI geschnittenen Vektor pRS416 (Sikorski und Hieter, Genetics (1988) 122; 19-27) ligiert (90 ng BamHI geschnittener, dephosphorylierter Vektor; 198 ng Insert DNA; 5ml Wasser; 2 μl 10xLigationspuffer; 1 U Ligase). Mit diesem Ligationsansatzwird £ co// Laborstamm XL-1 blue transformiert und die resultierenden Klone werden zur Identifizierung des Inserts eingesetzt.

Beispiel 4:

Herstellung einer geordneten Genbank (CHIP-Technologie)

Etwa 25,000 Kolonien der Ashbya gossypii Genbank (dies entspricht einer etwa 3-fachen Genomabdeckung) wurden geordnet auf eine Nylonmembran transferiert und anschließend nach der Methode der Koloniehybridisierung wie in Sambrook et al. (1989) beschrieben, behandelt. Von den durch MPSS-Analyse ermittelten 20bp-Sequenzen wurden Oligonukleotide synthetisiert und mit Hilfe von ³²P radioaktiv markiert. Jeweils 10 markierte Oligonukleotide mit ähnlichem Schmelzpunkt werden vereinigt und gemeinsam gegen die Nylonmembranen hybridisiert. Nach Hybridisierungs- und Waschschritten werden positive Klone durch Autoradiographie identifiziert, und mit Hilfe von PCR-Sequenzierung direkt analysiert.

Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 8" trägt und mit dem MIPS Tag „Cwp1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 1.

Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 25/39" trägt und mit dem MIPS Tag „ARK1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8.

Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 46" trägt und mit dem MIPS Tag „BUD2/CLA2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 12.

Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeich- nung „Oligo 103" trägt und mit dem MIPS Tag „Aor1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 17.

Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 128" trägt und mit dem MIPS Tag „Ykl179c" aus S. cerevisiae signifikante Homolo- gien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 21. Auf diese Weise wurde weiterhin ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 150" trägt und mit dem MIPS Tag „Scp1" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 26.

Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 177" trägt und mit dem MIPS Tag „EPD1" aus C. maltosa signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 30.

Auf diese Weise wurde ein Klon identifiziert, der ein Insert mit der internen Bezeichnung „Oligo 145" trägt und mit dem MIPS Tag „Aip2" aus S. cerevisiae signifikante Homologien besitzt. Das Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 36.

Beispiel 5:

Auswertung der Sequenzdaten mit Hilfe einer BLASTX Suche

Eine Auswertung der erhaltenen Nukleinsäure-Sequenzen, d.h. deren funktionale Zuordnung zu einer funktionalen Aminosäuresequenz, erfolgte mittels einer BLASTX-Suche in Sequenz- Datenbanken. Fast alle der aufgefundenen Aminosäuresequenz-Homologien betrafen Saccha- romyces cerevisiae (Bäckerhefe). Da dieser Organismus bereits vollständig sequenziert worden ist, konnten genauere Informationen bezüglich dieser Gene unter: http://www.mips.gsf.de/proi/yeast/search/code search.htm nachgeschlagen werden.

So wurde folgende Homologien mit einem Aminosäurefragment aus S. cerevisiae ermittelt. Die entsprechenden Alignments sind in den beiliegenden Figuren 1 bis 8 gezeigt.

a) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:1 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Zellwand-Vorläufer-Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 1092 bis 595 aus SEQ ID NO:1 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 1 dargestellt. SEQ ID NO: 2 und SEQ ID NO: 3 zeigen jeweils eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines Zellwand- Vorläufer-Proteins zugeordnet werden.

b) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:8 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einer Serin-Threonin-Kinase aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 1067 bis 84 aus SEQ ID NO:8 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Enzyms ist in Figur 2 dargestellt. SEQ ID NO: 9 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion einer Serin-Threonin- Kinase zugeordnet werden.

c) Die vom Gegenstrang zu SEQ ID NO:12 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem GTPase-aktivierenden Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 475 bis 353 aus SEQ ID NO: 12 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 3A dargestellt. Eine weitere davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 351 bis 1 aus SEQ ID NO:12) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 3B dargestellt. SEQ ID NO: 13 und SEQ ID NO: 14 zeigen jeweils eine N-terminal verlängerte Aminosäure- Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines GTPase- aktivierenden Proteins zugeordnet werden.

d) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO: 17 abgeleitete Aminosäure- sequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae, welches mit eineδr Resistenz gegen eine Aktin-Überexpression assoziiert ist. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 933 bis 157 aus SEQ ID NO:17 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 4 dargestellt. SEQ ID NO: 18 zeigt eine N- terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines Proteins, welches eine Resistenz gegen eine Aktin-Überexpression besitzt, zugeordnet werden.

e) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:21 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomplogie mit einem zu Nuflp ähnlichen Protein aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 117 bis 794 aus SEQ ID NO:21 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 5 dargestellt. SEQ ID NO: 22 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines zu Nuf 1 p ähnlichen Proteins zugeordnet werden. f) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:26 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem zu Calponin homologen Proteins aus S. cerevisiae. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 438 bis 767 aus SEQ ID NO:26 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 6 dargestellt. SEQ ID NO: 27 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines zu Calponin homologen Proteins zugeordnet werden.

g) Die vom korrespondierenden Gegenstrang zu SEQ ID NO:30 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus C. maltosa, welches für die Pseudohyphen-Entwicklung in maltosa essentiell ist. Eine davon abgeleiteten Aminosäure- Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 983 bis 651 aus SEQ ID NO:30 ) mit einer Teilsequenz des C. maltosa Proteins ist in Figur 7A dargestellt. Eine weitere davon abgeleiteten Ami- nosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 661 bis 596 aus SEQ ID NO:30 ) mit einer Teilsequenz des C. maltosa Proteins ist in Figur 7B dargestellt. Eine dritte davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 591 bis 1 aus SEQ ID NO:30 ) mit einer Teilsequenz des C. maltosa Proteins ist in Figur 7C dargestellt. SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32 und SEQ ID NO: 33 zeigen jeweils eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines Proteins, welches für die Pseudohyphen-Entwicklung in C. maltosa essentiell ist, zugeordnet werden.

h) Die vom kodierenden Strang zu SEQ ID NO:36 abgeleitete Aminosäuresequenz besitzt signifikante Sequenzhomologie mit einem Protein aus S. cerevisiae, welches mit Aktin wechselwirkt. Eine davon abgeleiteten Aminosäure-Teilsequenz (entsprechend den Nucleotiden 2 bis 148 aus SEQ ID NO:36 ) mit einer Teilsequenz des S. cerevisiae Proteins ist in Figur 8 dargestellt. SEQ ID NO: 37 zeigt eine N-terminal verlängerte Aminosäure-Teilsequenz .

Die ermittelte A. gossypii Nukleinsäuresequenz konnte damit der Funktion eines Proteins, welches mit Aktin wechselwirkt, zugeordnet werden.

Beispiel 6: Isolierung der Full-Length-DNA

a) Konstruktion einer A. gossyp/7-Genbank Hochmolekulare zelluläre Gesamt-DNA von A. gossypii wurde aus einer 2 Tage alten, in einem flüssigen MA2-Medium (10g Glucose, 10g Pepton, 1g Hefeextrakt, 0,3g Myo-Inositad 1000 ml) gewachsenen 100 ml Kultur hergestellt. Das Myzel wurde abfiltriert, zweimal mit H₂0 dest. ge- waschen, in 10 ml 1M Sorbitol, 20 mM EDTA, enthaltend 20 mg Zymolyase-20T, suspendiert und 30 bis 60 min unter leichtem Schütteln bei 27 °C inkubiert. Die Protoplasten-Suspension wurde auf 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 150 mM NaCI, 100 mM EDTA und 0,5-%igem Natriumdode- cylsulfat (SDS) eingestellt und 20 min bei 65 °C inkubiert. Nach zwei Extraktionen mit Phenol- Chloroform (1 :1 vol/vol) wurde die DNA mit Isopropanol gefällt, in TE-Puffer suspendiert, mit RNase behandelt, erneut mit Isopropanol gefällt und in TE resuspendiert.

Eine A. gossyp//-Kosmid-Genbank wurde hergestellt, indem man nach der Größe ausgewählte, mit Sau3A teilverdaute genomische DNA an die dephosphorylierten Arme des Cosmidvektors Super-Cos1 (Stratagene) band. Der Super-Cos1 -Vektor wurde zwischen den beiden cos-Stellen durch Verdau mit Xbal und Dephosphorylierung mit alkalischer Kalbsdarm-Phosphatase (Boeh- ringer) geöffnet, gefolgt von einem öffnen der Klonierungsstelle mit BamHI. Die Ligationen wurden über Nacht bei 15 °C in 20 μl, enthaltend 2,5 μg teilverdauter chromosomaler DNA, 1 μg Super-Cos1 -Vektorenarme, 40 mM Tris-HCI, pH 7,5, 10 mM MgCI₂, 1mM Dithiothreitol, 0,5 mM ATP und 2 Weiss-Einheiten T4-DNA-Ligase (Boehringer) durchgeführt. Die Ligationsprodukte wurden unter Verwendung der Extrakte und des Protokolls von Stratagene (Gigapack II Packa- ging Extract) in vitro verpackt. Das verpackte Material wurde zur Infizierung von E. coli NM554 {recA13, araD139, Δ(ara,leu)7696, Δ(lac)17A, galil, galK, hsrR, rps(stt^r), mcrA, mcrB) verwendet und auf Ampicillin (50 μg/ml) enthaltende LB-Platten verteilt. Man erhielt Transformanten, welche ein A. gossyρ/7-lnsert einer durchschnittlichen Länge von 30-45 kb enthielten.

b) Lagerung und Screening der Cosmid-Genbank

Insgesamt 4 x 10⁴ frische Einzelkolonien wurden einzeln in Vertiefungen von 96-er Microtiterplatten (Falcon, Nr. 3072) in 100 μl LB-Medium, ergänzt mit dem Gefriermedium (36 mM K₂HPθ₄/13,2 mM KH₂P0₄, 1 ,7 mM Natriumeitrat, 0,4 mM MgS0₄, 6,8 mM (NH₄)₂S0₄, 4,4% (wt/vol) Glycerin) und Ampicillin (50 μg/ml), inokuliert, über Nacht bei 37 °C unter Schütteln wachsen gelassen und bei -70 °C eingefroren. Die Platten wurden rasch aufgetaut und danach unter Verwendung eines 96-er-Replikators, der in einem Ethanolbad unter anschließender Verdunstung des Ethanols auf einer heißen Platte sterilisiert worden war, in frisches Medium dupli- ziert. Vor dem Einfrieren und nach dem Auftauen (vor irgendwelchen anderen Maßnahmen) wurden die Platten kurz in einem Mikrotiterschüttler (Infors) geschüttelt, um eine homogene Zellsuspension zu gewährleisten. Mittels eines Robotersystems (Bio-Robotics), mit dem geringe Mengen an Flüssigkeit aus 96 Vertiefungen einer Mikrotiterplatte auf Nylonmembran (GeneSc- reen Plus, New England Nuclear) transferiert werden können, wurden einzelne Klone auf Nylonmembranen platziert. Nach dem Transfer der Kultur aus den 96-er Mikrotiterplatten (1920 Klone) wurden die Membranen auf die Oberfläche von LB-Agar mit Ampicillin (50 μg/ml) in 22 x 22 cm Kulturschalen (Nunc) platziert und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Vor Erreichen derZell- konfluenz wurden die Membranen, wie von Herrmann, B. G., Barlow, D. P. und Lehrach, H. (1987) in Cell 48, S. 813-825 beschrieben, prozessiert, wobei als zusätzliche Behandlung nach dem ersten Denaturierungsschritt ein 5-minütiges Bedampfen der Filter auf einem in Denaturie- rungslösung getränkten Pad über einem kochenden Wasserbad hinzukommt.

Hit Hilfe des Random-Hexamer-Primer-Verfahrens (Feinberg, A. P. und Vogelstein, B. (1983), Anal. Biochem. 132, S. 6-13) wurden doppelsträngige Sonden durch Aufnahme von [alpha- ³²P]dCTP mit hoher spezifischer Aktivität markiert. Die Membranen wurden prähybridisiert und 6 bis 12 h bei 42 °C in 50% (vol/vol) Formamid, 600 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 1 mM EDTA, 10% Dextransulfat, 1% SDS, und 10x Denhardt-Lösung, enthaltend Lachssperma-DNA (50 μg/ml) mit ³²P-markierten Sonden (0,5-1 x 10⁶cpm/ml) hybridisiert. Typischerweise wurden Waschschritte etwa 1 h bei 55 bis 65 °C in 13 bis 30 mM NaCI, 1,5 bis 3 mM Natriumeitrat, pH 6,3, 0,1 % SDS durchgeführt und die Filter wurden 12 bis 24 h bei -70 °C mit Kodak- Verstärkerplatten autoradiographiert. Bislang wurden einzelne Membrane mehr als 20 mal er- folgreich wiederverwendet. Zwischen den Autoradiographien wurden die Filter durch Inkubation bei 95 °C für 2 x 20 min in 2 mM Tris-HCI, pH 8,0, 0,2 mM EDTA, 0,1 % SDS gestrippt.

c) Zurückgewinnung positiver Kolonien aus der aufbewahrten Genbank

Gefrorene Bakterienkulturen in Microtiter-Wells wurden unter Verwendung steriler Einweg- Lanzetten abgekratzt und das Material wurde auf LB-Agar-Petrischalen enthaltend Ampicillin (50 μg/ml) ausgestrichen. Einzelne Kolonien wurden danach zur Inokulierung von Flüssigkulturen für Herstellung von DNA mittels Alkali-Lyse-Verfahren (Bimboim, H. C. und Doly, J. (1979), Nucleic Acids Res. 7, S. 1513-1523) verwendet.

d) Full-Length DNA

Auf die oben beschriebenen Weise konnten Klone identifiziert werden, derein Insert mit der entsprechenden Vollsequenz trägt. Diese Klone tragen die internen Bezeichnungen:

„Oligo 8v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 4. Das davon kodierte Protein umfasst vorzugsweise wenigstens eine der Amino- Säuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 5, 6 und 7.

„Oligo 25/39v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 10.

„Oligo 46v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 15.

„Oligo 103v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 19.

„Oligo 128v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 23. Das davon kodierte Protein umfasst vorzugsweise wenigstens eine der Aminosäuresequenzen gemäß SEQ ID NO: 24 und 25.

„Oligo 150v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 28.

„Oligo 177v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 34.

„Oligo 145v". Das die Vollsequenz umfassende Insert besitzt eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 38.

Tabelle 1: Sequenzübersicht

Claims

Patentansprüche

1. Polynukleotid, welches aus Ashbya gossypii isolierbar ist und für ein Protein kodiert, das mit dem Zellwand- und/oder Cytoskelettaufbau assoziiert ist.

2. Polynukleotid, nach Anspruch 1 , das mit dem Zellwand- und/oder Cytoskelettaufbau assoziiert ist und eine in Tabelle 1 angegebene strukturelle und/oder funktionale Eigenschaft besitzt.

3. Polynukleotid nach Anspruch 1 oder 2, umfassend eine Nukleinsäuresequenz gemäß

SEQ ID NO: 1 , 8, 12, 17, 21 , 26, 30 oder 36, welche vorzugsweise aus Ashbya gossypii isolierbar ist; das dazu komplementäre Polynukleotid; und die von diesen Polynukleotiden durch Entartung des genetischen Codes abgeleiteten Sequenzen.

4. Polynukleotid nach Anspruch 3, welches eine Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID

NO: 4, 10, 15, 19, 23, 28, 34 oder 38 oder ein Fragment davon umfasst.

5. Oligonukleotid, welches mit einem Polynukleotid nach einem der vorhergehenden Ansprüche, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert.

Polynukleotid, welches mit einem Oligonukleotid nach Anspruch 5, insbesondere unter stringenten Bedingungen, hybridisiert und für ein Genprodukt aus Mikroorganismen der Gattung Ashbya oder ein funktionales Äquivalent dieses Genproduktes kodiert.

7. Polypeptid, welches von einem Polynukleotid kodiert wird, das eine Nukleinsäuresequenz gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Fragment davon umfasst, oder von einem Polynukleotid nach Anspruch 6 kodiert wird; oder welches eine Aminosäuresequenz aufweist, die wenigstens 10 zusammenhängende Aminosäurereste gemäß SEQ ID NO: 2, 3, 5, 6, 7, 9, 11 , 13, 14, 16, 18, 20, 22, 24,

25, 27, 29, 31 , 32, 33, 35, 37, oder SEQ ID NO: 39 umfasst; sowie funktionale Äquivalente davon, insbesondere solche , welche eine der in Anspruch 2 definierten Eigenschaften besitzen.

8. Expressionskassette, umfassend in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer regulativen Nukleinsäuresequenz eine Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 6.

9. Rekombinanter Vektor, umfassend wenigstens eine Expressionskassette nach Anspruch 8.

10. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, transformiert mit wenigstens einem Vektor nach Anspruch 9.

11. Prokaryotischer oder eukaryotischer Wirt, in welchem die funktionale Expression wenigstens eines Gens moduliert ist, das für ein Polypeptid nach Anspruch 7 kodiert; oder in welchem die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 erniedrigt oder erhöht ist.

12. Wirt nach Anspruch 10 oder 11 aus der Gattung Ashbya.

13. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 9 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.

14. Verwendung einer Expressionskassette nach Anspruch 8, eines Vektors nach Anspruch 9 oder eines Wirts nach einem der Ansprüche 10 bis 12 zur rekombinanten

Herstellung eines Polypeptids nach Anspruch 7.

15. Verfahren zum Nachweis eines Effektortargets für die Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von

Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt, insbesondere bindet, den Einfluß des Effektors auf die Menge des mikrobiologisch produzierten Vitamins B2, und/oder des Präkursors und/oder eines Derivats davon validiert; und das Target gegebenenfalls isoliert.

16. Verfahren zur Modulation der mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Mikroorganismus, der zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder

Derivaten davon befähigt ist, mit einem Effektor behandelt, welcher mit einem Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wechselwirkt.

17. Effektor für ein Target, ausgewählt unter einem Polypeptid nach Anspruch 7 oder einer dafür kodierenden Nukleinsäuresequenz, wobei der Effektor ausgewählt ist unter: a) Antikörpern oder antigenbindenen Fragmenten davon; b) von a) verschiedenen Polypeptid-Liganden, welche mit dem Polypeptid gemäß Anspruch 7 wechselwirken; c) niedermolekularen Effektoren, welche die biologische Aktivität eines Polypeptids nach Anspruch 7 modulieren; d) Antisense-Nukleinsäuresequenzen.

18. Verfahren zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon, wobei man einen Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 unter die Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon begünstigenden Bedingungen kultiviert und das(die) gewünschte(n) Produkt(e) aus dem Kulturansatz isoliert.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei man vor und/oder während der Kultivierung des Wirts diesen mit einem Effektor nach Anspruch 17 behandelt.

20. Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, wobei der Wirt ausgewählt ist unter Mikroorganismen der Gattung Ashbya.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 20, wobei der Mikroorganismus ein Wirt nach einem der Ansprüche 10 bis 12 ist.

22. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation der Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya.

23. Verwendung eines Polynukleotids nach einem der Ansprüche 1 bis 4 und 6 oder eines Polypeptids nach Anspruch 7 als Target zur Modulation des Zellwand- und/oder Cytoskelettaufbaus in einem Mikroorganismus der Gattung Ashbya während der Kultivierung zur mikrobiologischen Produktion von Vitamin B2 und/oder Präkursoren und/oder Derivaten davon.

24. Wirt nach Anspruch 12 mit modifiziertem Zellwand -und Oder Cytoskelett aufbau.