EP1409499A1 - Fluorure de maltosyle fonctionnalise comme donneur de glycosyle dans la preparation chimio-enzymatique d'oligo- ou polysaccharides - Google Patents

Fluorure de maltosyle fonctionnalise comme donneur de glycosyle dans la preparation chimio-enzymatique d'oligo- ou polysaccharides

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Publication number
EP1409499A1
EP1409499A1 EP20020772464 EP02772464A EP1409499A1 EP 1409499 A1 EP1409499 A1 EP 1409499A1 EP 20020772464 EP20020772464 EP 20020772464 EP 02772464 A EP02772464 A EP 02772464A EP 1409499 A1 EP1409499 A1 EP 1409499A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
group
disaccharide
formula
glucopyranosyl
atom
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP20020772464
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Lionel Greffe
Hugues Driguez
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1409499A1 publication Critical patent/EP1409499A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H5/00—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium
    • C07H5/02—Compounds containing saccharide radicals in which the hetero bonds to oxygen have been replaced by the same number of hetero bonds to halogen, nitrogen, sulfur, selenium, or tellurium to halogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins

Definitions

  • the invention relates to a family of disaccharides derived from ⁇ -maltosyl fluoride which can be used as glycosyl donors in the chirnioenzymatic synthesis of oligo- and polysaccharides catalyzed by enzymes of the glycoside hydrolase and transglycosylase type.
  • the method of the invention allows in particular the sequential and linear elongation of an oligosaccharide and / or polysaccharide recognized as a glycosyl acceptor by enzymes of the glycoside hydrolase or transglycosylase type.
  • Glycosyl fluorides have long been known to be good glycosyl donors and are commonly used in transglycosylation reactions catalyzed by glycoside hydrolases or transglycosylases. Hehre's work, published in Arch. Biochem. Biophys. 135 (1969), 75
  • Bornaghi et al. describe the synthesis of hemi-thiomaltodextrins and hemi-C-maltooligosaccharides from 4-thio- ⁇ -maltosyl fluoride (3) and ⁇ -C-maltosyl fluoride (4) and in the presence of cGTase: Carbohydr.Res . 305, 1997, 561-568.
  • reaction products are in fact in each case mixtures.
  • Fluoride 3 in the presence of cGTase allows the authors, after acetylation, to obtain acetylated 4-thiomaltose (42%) (hydrolysis product), acetylated hemithiomaltohexaose (4%), cyclo- ⁇ - (l -4) -acetylated thiomaltotetraoside (13%), acetylated cyclo- ⁇ - (1-4) -acetylated thiomaltopentaoside (16%), cyclo- ⁇ - (1-4) -4- acetylated thiomaltohexaoside (7%).
  • modified maltosyl fluorides of the invention function as glycosyl donors for enzymes of the glycoside hydrolase type or of the transglycosylase type.
  • the modifications made at positions 4 ⁇ or positions 4 ⁇ and 6 ⁇ of maltosyl fluoride allow the simple transformation of these glycosyl donors into glycosyl acceptors so that a step-by-step synthesis of oligosaccharides and polysaccharides is made possible without risk of disorderly growth of the polysaccharide chains.
  • the process of the invention therefore allows ideal control of the synthesis of oligo- or polysaccharides.
  • the invention relates to a disaccharide of formula I:
  • R 1 and R 2 identical or different, represent an organic functional group, optionally protected, attached to the glycosidic unit by a nitrogen atom, an oxygen atom, a sulfur atom or a halogen atom, or well
  • R 1 and R 2 together form an organic functional group, optionally protected, attached to the glycosidic unit by two atoms chosen from oxygen, sulfur and nitrogen atoms, it being understood that R 1 does not represent a hydroxyl group .
  • the configuration of the endocyclic asymmetric carbons of the compounds of formula I is that of the corresponding ⁇ -maltosyl carbons.
  • the nature of the organic functional group representing R 1 and / or R 2 is arbitrary as long as it does not interfere with the subsequent condensation reaction involving the disaccharide of formula I corresponding as starting reactant and as soon as R 1 is convertible into a group allowing the resulting disaccharide to be a glycosyl acceptor.
  • a glycosyl acceptor is understood here as a molecule positioning itself in the acceptor sub-sites of the enzyme. Examples of groups allowing the resulting disaccharide to be a glycosyl acceptor are the OH, NH 2 and SH radicals.
  • R 1 is generally the precursor of an OH, SH or NH 2 group .
  • R 1 does not represent a hydroxyl group.
  • R 1 can represent a hydroxyl group protected by any protective group used in organic chemistry such as one of those described in
  • R 2 may represent a free hydroxyl group or else a hydroxyl group protected by a protective group such as those described in the two works cited above.
  • a preferred group of disaccharides of formula I consists of the disaccharides in which R 2 represents -OH.
  • Protective groups of hydroxyl function are in particular the groups ethers, esters, sulfonates, carbamates, acetals, hemiacetals and carbonates.
  • R 1 and / or R 2 By way of example of meanings of R 1 and / or R 2 , mention may be made of optionally substituted alkoxy groups; optionally substituted alkenyloxy; optionally substituted aryloxy; optionally substituted diarylalkoxy; or optionally substituted triarylalkoxy; optionally substituted heteroaryloxy; optionally substituted arylalkoxy; optionally heteroarylalkoxy substituted; optionally substituted alkylcarbonyloxy; optionally substituted arylcarbonyloxy; optionally substituted heteroarylcarbonyloxy; optionally substituted arylalkylcarbonyloxy; optionally substituted heteroarylalkylcarbonyloxy; optionally substituted alkylsulfonyloxy; optionally substituted arylsulfonyloxy; optionally substituted heteroarylsulf onyloxy; optionally substituted arylalkylsulfonyloxy; optionally substituted heteroarylalkylsulf
  • R a and R b are independently chosen from optionally substituted alkyl, optionally substituted aryl, optionally substituted arylalkyl, optionally substituted heteroarylalkyl, and a hydrogen atom;
  • R d - o - C ⁇ YR e where R c and R d are as defined above for R a and R b or else R c and R d together form an optionally substituted alkylene chain and R e is as defined below above for R a , or alternatively R d and R e together form an optionally substituted alkylene chain, R c being as defined above for R a ; and Y represents O or S.
  • R 1 and / or R 2 may represent a halogen atom such that for R 1 a bromine, chlorine or iodine atom and for R 2 a chlorine, bromine, iodine atom or fluorine.
  • R 1 and / or R 2 may represent an amine or thiol function optionally substituted or protected by one or two of the protective groups described in Protective Groups in Organic Synthesis Greene TW and Wutz PGM, ed. John Wiley & Sons, 1991 or in Protecting Groups Kocienski PJ 1994,
  • Such protective groups are in particular the carbamate, amide, azide, urea, thioacetate, disulfide, thiourea, arylthio, alkylthio, acylthio, arylcarbonylthio, acetamido or benzamido groups.
  • R 1 and R 2 there may be mentioned amino groups; alkylamino; dialkylamino; -NH-CO-R a where R a is as defined above; azide; -NR a -CO-NR b R f where R a and R b are as defined above and R f takes any of the meanings given above for R a ; -O-CO- NH-R a , R a being as defined above; -SR a , R a being as defined above;
  • R a and R e being as defined above.
  • the groups R 1 and R 2 can together form an optionally protected organic functional group.
  • Such a functional group is, for example, a diol functional protecting group such as an optionally substituted alkylidenedioxy group and, for example, substituted with aryl.
  • R 1 and R 2 can together form an O-isopropylidene or O-benzylidene group.
  • a particularly preferred disaccharide is the disaccharide of formula I in which R 1 represents a 2-tetrahydropyranyl group, and preferably R 2 represents a hydroxyl group.
  • disaccharide is the disaccharide of formula I, in which R 1 represents a 2-tetrahydropyranyl group and R 2 represents a halogen atom, such as bromine.
  • R 1 represents a 2-tetrahydropyranyl group
  • R 2 represents a halogen atom, such as bromine.
  • R 1 represents optionally substituted azido or amino
  • R 2 represents optionally substituted azido or amino.
  • Another preferred disaccharide is that of formula I in which R 1 represents azido or optionally substituted amino and R 2 represents -OH. More particularly, the disaccharides for which in formula I are preferred
  • R 1 NH 2 or azido;
  • R 2 OH; or
  • R 1 NH 2 or azido
  • R 2 NH2 or azido
  • alkyl means a linear or branched hydrocarbon chain comprising from 1 to 14 carbon atoms, preferably from 1 to 10, better still from 1 to 6 carbon atoms, for example from 1 to
  • alkyl radicals are methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, isobutyl, t-butyl, pentyl, isopentyl, neopentyl, 2-methylbutyl, 1- ethylpropyl, hexyl, isohexyl, neohexyl, 1-methylpentyl, 3-methylpentyl,
  • aryl is understood to mean, according to the invention, a mono- or polycyclic (for example mono- or bicyclic) hydrocarbon group, preferably aromatic.
  • heteroaryl groups are monocyclic or polycyclic heterocyclic aromatic groups comprising heteroatoms generally chosen from O, S and N, optionally in the oxidized state (case of S and N).
  • the heteroaryl is mono-, bi- or tricyclic.
  • At least one of the monocycles constituting the heterocycle comprises from 1 to 4 endocy clique heteroatoms, better still from 1 to 3 heteroatoms.
  • the heterocycle consists of one or more unicycles, each having from 5 to 7 vertices.
  • Examples of monocyclic heteroaryls of 5 to 7 vertices are in particular pyridine, furan, thiophene, pyrrole, pyrrazole, imidazole, thiazole, isoxazole, furazane, pyridazine, pyrimidine, pyrazine , thiazines, oxazole, pyrazole, oxadiazole, triazole and thiadiazole.
  • bicyclic heteroaryls in which each unicycle comprises from 5 to 7 vertices are chosen from indolizine, indole, isoindole, benzofuran, benzothiophene, indazole, benzimidazole, benzothiazole, benzofurazane, benzothiofurazane, purine, quinoline, isoquinoline, cinnoline, phthalazine, quinazoline, quinoxaline, naphthridines, pyrazolotriazine (such as pyrazolo-l, 3,4-triazine), pyrazolopyrimidine and pteridine.
  • tricyclic heteroaryls in which each monocycle comprises from 5 to 7 vertices are, for example, chosen from acridine, phenazine or carbazole.
  • Alkylene defines an optionally substituted linear or branched divalent hydrocarbon group, preferably Ci-Cu, derived from an alkyl group by stripping off a hydrogen atom.
  • alkylene denotes a group in Ci-Cio, better still in O-C ⁇ , for example in Ci-.
  • Alkylidenedioxy represents an organic divalent group of general formula: -O-A-O- where A denotes optionally substituted alkylene, as defined above.
  • An example of a particularly preferred arylalkyl group is benzyl.
  • An example of a triarylalkyl group is trityl.
  • the substituents of the aryl and heteroaryl groups are generally chosen from halogen atoms; nitro groups; (C ⁇ -Ci4) optionally halogenated alkoxy (and preferably trifluoromethoxy); (Ci-Ci4) optionally halogenated thioalkoxy, preferably (C ⁇ -Oo) thioalkoxy; (O-C14) optionally halogenated alkyl, preferably perhalogenated (and in particular methyl or trifluoromethyl); (C ⁇ -C) alkylcarbonyl in which the alkyl part is optionally halogenated; (C 6 -Ci8) arylcarbonyl in which the aryl part is optionally substituted one or more times with halogen, (C1-Q.4) optionally halogenated alkyl and / or (C ⁇ -Ci4) optionally halogenated alkoxy; (C1-C4) alkylcarbonylamino in which the alkyl part is optionally halogenated
  • aryl and heteroaryl groups may be substituted with one or more of the substituents listed above, preferably one to three times, for example one to two times.
  • alkyl groups and the alkyl parts of the above-mentioned radicals as well as the alkylene radicals or the alkylene parts of the above-mentioned radicals can be substituted one or more times by one or more radicals independently chosen from halogen such as bromine, (C ⁇ -C 14 ) alkoxy, (Ci-C 14) thioalkoxy, preferably by one to three radicals of this type.
  • halogen such as bromine, (C ⁇ -C 14 ) alkoxy, (Ci-C 14) thioalkoxy
  • the substituents can be an optionally substituted alkyl group, an optionally substituted aryl group, an optionally substituted heteroaryl group, an optionally substituted arylalkyl group, or an optionally substituted heteroarylalkyl group .
  • IR 1 and / or R 2 represent a protected hydroxyl group
  • the latter is chosen from optionally substituted benzyloxy; allyloxy; trityloxy; tetrahydropyranyloxy; 3-bromo-tetrahydropyranyloxy; tetrahydrothiopyranyloxy; 1-methoxycyclohexyloxy; 4- methoxytetrahydro-pyranyloxy; 4-methoxytetrahydrothiopyranyloxy; acetoxy; 2-haloacetoxy; a group -O-SiR ⁇ sR 11 where R f , Rs and R h are either all three identical or different alkyl, or all three identical or different aryl; tosyloxy; and mesyloxy.
  • the compounds of formula I can be prepared in several stages.
  • the synthesis process firstly comprises the reaction of hydrogen fluoride on a compound of formula II: in which :
  • P 2 , P 3 , P 4 , P 5 and P 6 are protecting groups for hydroxyl functions
  • R ' 1 , R' 2 respectively denote R 1 and R 2 or are precursor groups of the substituents R 1 and R 2 ;
  • G represents an acetylated group, the groups P 2 , P 3 , P 4 , P 5 and
  • P 6 can be identical.
  • R ' 1 , R' 2 , P 2 , P 3 , P 4 , P 5 and P 6 are as defined above for formula II and
  • W represents -SG, SeG or TeG, G being as defined above, it being understood that
  • G and P 2 can together form an alkylene chain where alkylene is as defined above.
  • This reaction can be carried out in the absence of solvent and in the presence of a large excess of hydrogen fluoride, the latter taking the place of solvent.
  • the reaction is carried out in a solvent such as pyridine. More preferably, the operation is also carried out in the presence of a large excess of hydrogen fluoride.
  • the compound of formula II above is dissolved in a 10/1 to 1/1 mixture of hydrogen fluoride / pyridine.
  • This reaction is usually carried out at room temperature and more generally at a temperature between -10 and 50 ° C, for example between 15 and 30 ° C.
  • P 2 , P 3 , P 4 , P 5 and P 6 represent alkylcarbonyl groups such as acetylated groups
  • R ′ 1 represents a hydroxyl group
  • R ′ 2 is chosen from an atom halogen (such as a bromine atom) or an alkylcarbonyl group such as an acetyl group.
  • the compound obtained at the end of this first step has the formula:
  • the transformation of compound III into compound of formula I includes for example: - a first step of transforming the hydroxyl group into position
  • the invention relates to the use of a disaccharide as defined above in the transglycosylation reactions catalyzed by glycoside hydrolases or in the transfer reactions catalyzed by transglycosylases.
  • the disaccharides of the invention substrates of enzymes of the glycoside hydrolase and / or transglycolase type, function as glycosyl donors.
  • the disaccharides of the invention are used as substrates for enzymes belonging to the family 13 of glycoside hydrolases.
  • enzymes there are in particular ⁇ -amylases, pullulanases, cyclomaltodextrin-glucanotransferases, cyclomaltodextrinases, oligo- ⁇ -glucosidases, maltogenic amylases, neopullulanases, ⁇ -glucosidases, ⁇ -amylases forming maltotetraose, isoamylases, glucodextranases, ⁇ -amylases forming maltohexaose, branching enzymes, 4- ⁇ -glucanotransferases, ⁇ -amylases forming maltopentaose and amylosucrases.
  • said enzymes are used for the preparation of oligo- or polysaccharides by sequential condensation of glycosyls.
  • a disaccharide of formula I in which R 2 represents a halogen atom, and more particularly bromine is used as enzyme substrate for the preparation of branched oligosaccharides.
  • oligosaccharides in which the monosaccharide units form sequences with ramifications.
  • linear oligosaccharides is understood to mean oligosaccharides in which the monosaccharide units form linear sequences.
  • oligo- and polysaccharides involves cyclodextrin glycosyltransferase (cGTase), as an enzyme of glycoside hydrolase type.
  • cGTase cyclodextrin glycosyltransferase
  • the invention relates to a process for the preparation of oligosaccharides or polysaccharides comprising the reaction of at least one disaccharide of formula I of the invention with a glycosyl acceptor, in the presence of an enzyme glycoside hydrolase type or transglycosylase type.
  • the synthesis of oligo- or polysaccharides from the disaccharides of the invention involves one or more condensation reactions between the maltosyl type unit of a disaccharide of formula I and l pyranosyl unit of a glycosyl acceptor.
  • the process of the invention comprises one or more coupling reactions between a disaccharide of the invention and a glycosyl acceptor having, at the non-reducing end, a pyranosyl unit carrying at least one function capable of reacting with said disaccharide of formula I, the glycosidic bond taking place between this pyranosyl unit and the anomeric carbon carrying the fluorine atom of the disaccharide of the invention, which disaccharide functions as a glycosyl donor.
  • the synthesis of the oligosaccharide or of the polysaccharide comprises a step of condensation between the maltosyl type unit of the disaccharide of the invention and the pyranosyl unit of the glycosyl acceptor, said condensation proceeding by the reaction d 'a single hydroxyl group of the pyranosyl unit of the glycosyl acceptor with the anomeric carbon of said maltosyl type unit.
  • One of the advantages of the invention lies in the possibility of controlling, step by step, the synthesis of the oligosaccharide, respectively of the final polysaccharide.
  • the anomeric carbon carrying the fluorine of the disaccharide of the invention reacts with a hydroxyl, thiol or amino function (and more particularly a hydroxyl function) preferably located in position 4 of the pyranosyl unit of the glycosyl acceptor. More generally, this function of the pyranosyl unit is located in position 2, 3, 4 or 6.
  • the glycosyl acceptor can be either a monosaccharide such as methyl ⁇ -D-glucopyranoside, an oligosaccharide or a polysaccharide such as pullulan.
  • the resulting polymer is particularly particularly interesting as a new vector in gene therapy.
  • the invention relates to a vector usable in gene therapy resulting from the condensation of a polysaccharide consisting of a linear or branched chain of glycopyranosyl units with one or more disaccharides of formula I as defined above, said condensation involving the reaction of one or more hydroxyl functions in position 4 of the glycopyranosyl units of said polysaccharide with an anomeric carbon carrying the fluorine atom of said disaccharides of formula I.
  • said polysaccharide is pullulan.
  • the disaccharide of formula I is a disaccharide of formula
  • the process of the invention is suitable for branching, in a controlled manner, the 4 positions of the monosaccharide units of pullulan.
  • polysaccharide examples include linear or branched dextrans, alternans, amylose, glycogen, amylopectin and more generally any polysaccharide capable of be a glycosyl acceptor when using a type I compound as defined in the invention.
  • the coupling of the disaccharide of the invention with the glycosyl acceptor is carried out in an aqueous medium, at a pH close to neutrality, for example at a pH between 6 and 8, preferably at pH 7.
  • buffers which can be used for this purpose are phosphate, sulfate, acetate, citrate, succinate and maleate buffers, phosphate buffers being preferred.
  • the condensation is carried out by bringing together 1 equivalent of the glycosyl acceptor and 1 to 5 molar equivalents, preferably 1.2 to 3.5 equivalents, of the maltosyl fluoride derivative of formula I.
  • the enzyme functioning as a catalyst is present in the reaction medium in a catalytic amount. Less than one equivalent of enzyme is thus used for one molar equivalent of glycosyl acceptor (in general an amount less than 10 ' 3 M, better still less than 10 ⁇ M and for example between 10 -4 and 10 " 6 M (such as an amount of the order of 10- 5 M) will usually suffice.
  • the reaction is generally carried out at a temperature below
  • the products obtained are free of residual organic solvents, which guarantees their total harmlessness.
  • EP denotes petroleum ether
  • PF the experimental melting point
  • PFiitt the melting point reported in the literature.
  • the reaction is carried out at 0 ° C in a plastic container.
  • the hepta-acetate obtained in the previous step (5 g, 7.86 mmol) is dissolved in a solution of hydrogen fluoride in pyridine (7: 3; v / v; 30 ml). After half an hour of stirring, the reaction mixture is diluted with dichloromethane and then poured onto an ice-cold aqueous solution of 3M ammonia. After decantation, the organic phase is washed twice with a saturated solution of ice-cold sodium hydrogencarbonate. The organic phase is then dried over anhydrous sodium sulfate and then evaporated using a rotary evaporator.
  • the per-acetylated compound obtained in the previous step (1.55 g; 2.28 mmol) is dissolved in methanol (50 ml). A solution of sodium methylate in methanol (1M; 2.5 ml) is added. After stirring for 30 minutes at room temperature, the reaction mixture is cooled to 0 ° C. and then neutralized with Amberlite IRN 120 H + resin. After filtration, the compound is concentrated, taken up in water and lyophilized (956 mg; 2.23 mmol). This compound is used without further purification. In lyophilized form, this fluoride is stable at -18 ° C. Note: the first degradation compound is maltosyl r ⁇ -fluoride.
  • the protein is filtered through cotton.
  • the filtrate is lyophilized and then acetylated in a pyridine / acetic anhydride mixture (1.5: 1, v / v, 25 ml) overnight at 70 ° C.
  • Methanol (10 ml) is added at 0 ° C to neutralize the excess acetic anhydride.
  • the reaction mixture is concentrated on a rotary evaporator, taken up in CH 2 C1, washed with water and then with a saturated NaHCO solution.
  • the aqueous phases are extracted with CH 2 C1 2 (3 times).
  • the organic phases are combined, dried over Na 2 SO 4 and then evaporated to dryness.
  • Example 2 The compound of Example 2 (100 mg; 0.546 mmol) is dissolved in MeOH (30 ml) and a solution of sodium methylate in methanol is added (1M, 300 ⁇ l). The reaction mixture is stirred overnight at room temperature. Thin layer chromatography (HO 1 / CH 3 CN 1.5) reveals the entire reaction. The solution is then neutralized with Amberlite IRN 120 resin (H * " ), evaporated, co-evaporated with water and then lyophilized to give the expected compound 61 mg (96%).
  • the reaction is carried out at 0 ° C in a plastic container.
  • the hexa-acetate obtained in the previous step (2.041 g; 3.11 mmol) is dissolved in a solution of hydrogen fluoride in pyridine (7: 3; v / v; 20 ml). After half an hour of stirring, the reaction mixture is diluted with dichloromethane and then poured onto an ice-cold solution of 3M ammonia.
  • the per-acetylated compound obtained in the previous step (1 g; 1.42 mmol) is dissolved in methanol (20 ml). A solution of sodium methylate in methanol (1M; 200 ⁇ l) is added. After stirring for 30 minutes at room temperature, the reaction mixture is cooled to 0 ° C. and then neutralized with Amberlite IRN 120 H + resin. After filtration, the compound is concentrated, taken up in water and lyophilized (683 mg; 98%). This compound is used without further purification. In lyophilized form, this fluoride is stable at -18 ° C.
  • Step b) The polymer obtained in the previous step (21 mg) is dissolved in a 10 "2 M hydrochloric acid solution (2 ml). The reaction mixture is stirred for 2 hours at room temperature. The mixture is then neutralized by addition of ammonia and then precipitated in ethanol After centrifugation, the polymer is dried under vacuum, 15 mg is thus isolated, the degree of substitution is determined by methylation according to the Hakomori method, and the methyl polymer thus obtained is hydrolyzed in an acid medium.
  • Non-glycosylated units Area of: 1,6-di-O-acetyl-2,3,6-tri-O-methylhexytol: 29163
  • a of compound A7 prepared in the preceding step (81 mg; 66.2 ⁇ mol) dissolved in dichloromethane (1.9 ml), are added triethylsilane (Et 3 SiH; 35.8 ⁇ l; 225 ⁇ mol) and l trifluoroacetic acid (1.2 ml). The mixture is stirred for 45 minutes at room temperature and then evaporated. The residue is taken up in anhydrous pyridine (2 ml) and acetic anhydride (1.5 ml) as well as a catalytic amount of DMAP are added. The reaction mixture is stirred for 12 hours at room temperature and then neutralized by adding methanol (1.2 ml) at 0 ° C and evaporated. The expected compound is purified by rapid chromatography (EP / EtOAc: 1-1.5) (45 mg; 69%).
  • EXAMPLE 8 a) Preparation of (2,3,4,6-Tetra-0-acetyl-aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) - (2,3,6-tri-0-acetyl-aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) - (2,3-di-0-acetyl-6-bromo-6-deoxy-aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) -l, 2,3, 6-tetra-O-acetyl-D- glucopyranose
  • the lyophilisate is dissolved in anhydrous pyridine (30 ml), acetic anhydride (20 ml) and DMAP ( ⁇ 1 mg) are added.
  • the reaction mixture is stirred at 70 ° C for 12 hours and then the excess anhydride is neutralized by addition to methanol (20 ml) at 0 ° C.
  • the reaction mixture is concentrated on a rotary evaporator, taken up in dichloromethane, washed with water and then with a saturated NaHCO 3 solution.
  • the aqueous phases are extracted with dichloromethane (3 times).
  • the organic phases are combined, dried over anhydrous potassium sulfate and evaporated.
  • the expected anomeric mixture is purified by rapid chromatography (EP / EtOAc: 3-4) (521 mg, 70%).
  • EXAMPLE 9 a) Preparation of aD-glucopyranosyl- (l ⁇ 4) -aD-glucopyranosyl- (l ⁇ 4) - [aD- glucopyranosyl- (l ⁇ 4) -aD-glucopyranosyl- (l ⁇ 4) -SaD-glucopyranosyl - (l ⁇ 6)] - 6- thio- -D-glucopyranosyl- (l ⁇ 4) -D-glucopyranose
  • the solution is then neutralized by adding a saturated sodium hydrogen carbonate solution and then lyophilized.
  • the mixture is purified on an HPLC column (NH 2 column; eluent: CH 3 CN 55 H 2 O 45) two fractions are recovered FI and F2.
  • the IF fraction is dissolved in water (10 ml) and acidic resin (DOWEX 50 W x 8) is added.
  • the mixture is stirred for 8 hours at room temperature and then filtered.
  • the aqueous phase is washed with ethyl acetate (3x) and combined with the F2 fraction. Lyophilization makes it possible to obtain the expected compound (51 mg; 66%).
  • High resolution MS (ES +): C 42 H 72 O 35 NaS [M + Na: Calculated: m / z 1191.3473
  • EXAMPLE 10 a) (2,3,4,6-Tetra-0-acetyl-aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) - (2,3,6-tri-0-acetyl- -D- glucopyranosyl) - ( l ⁇ 4) - (2,3-di-0 ⁇ acetyl-aD-glucopyranosyl-6-bromo-6-deoxy -) - (l ⁇ 4) - (2,3,6-tri-0-acetyl- - D-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) -2,3,6-tri-0-acetyl-aD-methyl glucopyranoside
  • the solution is then neutralized by adding ammonia and fluoride El, prepared in example le) (112 mg; 1.3 eq) in solution in the buffer (1 ml) as well as CGTase (129 ⁇ l) are added.
  • the mixture is incubated for 2 hours at room temperature and then heated for 5 minutes at 100 ° C.
  • the enzyme is filtered through cotton.
  • the filtrate is acidified by adding hydrochloric acid to pH ⁇ 2 and stirred for 20 minutes.
  • the solution is then neutralized by adding ammonia.
  • the lyophilisate is dissolved in anhydrous pyndine (20 ml), acetic anhydride (10 ml) and DMAP ( ⁇ 1 mg) are added.
  • reaction mixture is stirred at 70 ° C for 12 hours and then the excess anhydride is neutralized by addition to methanol (10 ml) at 0 ° C.
  • the reaction mixture is concentrated on a rotary evaporator, taken up in CH 2 C1 2 , washed with water and then with a saturated NaHCO 3 solution.
  • the aqueous phases are extracted with CH 2 C1 2 (3 times).
  • the organic phases are combined, dried over Na 2 SO 4 and evaporated.
  • a pu ⁇ fication by rapid chromatography (Et 2 O then Et 2 O 10 Acetone 1) makes it possible to obtain the compound A10 (161 mg; 52%).
  • the compound Ail, prepared in Example 11a) (110 mg; 0.17 mmol) is dissolved in anhydrous dichloromethane (4 ml) and pyridine (400 ⁇ l) is added. The reaction mixture is cooled to -15 ° C. and triflic ranhydride (70 ⁇ l) is added. The reaction mixture is stirred for 30 minutes at -15 ° C. and then 2 hours at room temperature. The mixture is then washed cold with: water, a saturated solution of sodium hydrogen carbonate and with an acid solution of potassium hydrogen sulphate. The organic phase is dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The residue is taken up in distilled dimethylformamide (0.9 ml) and sodium azide (64 mg) is added.
  • reaction mixture is stirred at room temperature for 12 hours then diluted with ethyl acetate, washed with water, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated.
  • the expected compound is purified by rapid chromatography (EtOAc / EP: 4-1) (102 mg; 91%).
  • the reaction is carried out at 0 ° C in a plastic container.
  • EXAMPLE 12 a) Preparation of (2,3,6-Tri-0-acetyl-4-azido-4-deoxy-aD-glucopyranosyl) - (1 ⁇ 4) - (2,3,6-tri-0-acetyl -aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) - (di-0-acetyl-6-bromo-6-deoxy- 5 aD-glucopyranosyl) - (l ⁇ 4) -l, 2,3, 6-tetra-O acetyl-D-glucopyranose
  • DMAP 4,4-dimethylaminopyridme
  • the reaction is stirred for 12 hours at 70 ° C. then the reaction medium is cooled and the excess anhydride is destroyed by slow addition of methanol at 0 ° C. (5 ml). The mixture is stirred for 20 minutes at room temperature and then concentrated. The residue is taken up in dichloromethane, washed with a solution of potassium hydrogen sulphate, a solution of sodium hydrogen carbonate and water. The organic phase is recovered, dried over anhydrous sodium sulfate and evaporated to dryness. The expected compound is purified by rapid chromatography (Et 2 O) (200 mg; 71%).
  • the mixture is incubated at room temperature for 2 hours then heated to 100 ° C for 5 minutes and filtered.
  • the mixture is concentrated and co-evaporated with water.
  • the expected compound is purified on Sep-pack Cl 8 ® (15 mg; 65%).
  • Hydrogen sulfide is bubbled for 30 minutes in a pyridine / water mixture (1: 1; 3 ml) containing the compound A13 (15 mg; 17.6 ⁇ mol). The flask is then hermetically closed and the reaction medium is stirred for 12 hours at room temperature then filtered, concentrated and co-evaporated with water. The expected compound is purified on Sep-pak Cl 8 ® and lyophilized (14 mg; 96%).

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Abstract

La présente invention concerne des disaccharides de formule (I) dérivés de fluorure de α-maltosyle, dans lesquels R1 et R2 sont tels que définis à la revendication 1. Ces disaccharides sont utilisables comme donneurs de glycosyle dans les réactions de transglycosylations catalysées par des glycoside-hydrolases ou dans les réactions de transfert catalysées par des transglycosylases lors de la préparation d'oligosaccharides ou de polysaccharides.

Description

Fluorure de maltosyle fonctionnalisé comme donneur de glycosyle dans la préparation chimio-enzymatique d'oligo- ou polysaccharides
L'invention concerne une famille de disaccharides dérivés du fluorure de α-maltosyle utilisables comme donneurs de glycosyle dans la synthèse chirnioenzymatique d'oligo- et polysaccharides catalysée par les enzymes de type glycoside-hydrolase et transglycosylase.
Le procédé de l'invention permet notamment l'allongement séquentiel et linéaire d'un oligosaccharide et/ ou polysaccharide reconnu comme accepteur de glycosyle par les enzymes de type glycoside-hydrolase ou transglycosylase.
Les fluorures de glycosyle sont depuis longtemps connus pour être de bons donneurs de glycosyle et sont communément utilisés dans les réactions de transglycosylation catalysées par des glycoside-hydrolases ou des transglycosylases. Les travaux de Hehre, publiés dans Arch. Biochem. Biophys. 135 (1969), 75
; Arch. Biochem. Biophys. 142 (1971), 382 ; et Carbohydr. Res. 26(1973), 240, ont montré notamment que les amylases sont capables d'utiliser des fluorures de glycosyle pour former des produits de condensation. En 1978, l'équipe de Hehre publie dans Carbohydr. Res. 61, 1978, 291-299, une étude utilisant le fluorure d'α- maltosyle comme substrat de β-amylases. Par la suite, Hehre utilise différentes souches d'α-amylase, dont l'α-amylase issue d'Aspergillus or zae, pour la synthèse de malto-oligosaccharides à partir d'α-maltosyle et constate que ces enzymes présentent une activité non-hydrolytique préférentielle puisque très peu du produit d'hydrolyse, le maltose, est finalement isolé (cf. Carbohydr. Res. 71, 1979, 287-298).
De la même façon, Okada et coll. démontre que la production de 6-0- maltosyl-cyclodextrines est possible en utilisant le transfert du fluorure d'α- maltosyle sur une cyclodextrine à l'aide d'une pullulanase (protéine appartenant à la famille des α-amylases). L'un des principaux inconvénients de cette méthode est l'isolement de mélanges complexes de 6-O-maltosyl-cyclodextrines résultant de la pluri- substitution des cyclodextrines et de l'allongement incontrôlé des chaînes polymères. L'utilisation de fluorure d'α-maltosyle modifié a également été décrite dans la technique. Driguez et coll. ont publié notamment la synthèse de la 6A, 6e, 6E-tri-0-méthyl-cyclomaltohexaose par condensation et cyclisation du fluorure de ό'-O-méthyl-α-maltosyle par la cyclodextrine glucosyltransférase (cGTase). Les auteurs mettent en évidence la possibilité de préparer des mélanges de cyclodextrines (α, β, γ) substituées en présence de cGTase et de l'un des fluorures de maltosyle (1)(2) suivants éventuellement modifié en position 6: J. Chem. Soc,
16, 1989, 1088-1089.
Ces fluorures de maltosyle modifiés sont reconnus à la fois comme donneurs et accepteurs de glycosyle par la cGTase.
Bornaghi et al. décrivent la synthèse des hémi-thiomaltodextrines et des hémi-C-maltooligosaccharides à partir du fluorure de 4-thio-α-maltosyle (3) et du fluorure de α-C-maltosyle (4) et en présence de cGTase: Carbohydr.Res. 305, 1997, 561-568.
Cependant, les produits de réactions sont en fait dans chaque cas des mélanges.
Le fluorure 3 en présence de cGTase permet aux auteurs, après acétylation, d'obtenir du 4-thiomaltose (42%) acétylé (produit d'hydrolyse), de l'hémithiomaltohexaose acétylé (4%), de cyclo-α-(l-4)-thiomaltotétraoside acétylé (13%), cyclo-α-(l-4)-thiomaltopentaoside acétylé (16%), cyclo-α-(l-4)-4- thiomaltohexaoside acétylé (7%). En utilisant 3 équivalents de 4-thiomaltose comme accepteur de glycosyle, les auteurs ont isolé de l'hémithiomaltotétraose (18%) et de l'hémithiomaltohexaose (14%). Le fluorure 4 en solution tamponné et en présence de cGTase ne permit pas aux auteurs d'obtenir de produits de transglycosylation mais seulement le produit d'hydrolyse. En utilisant un milieu hydro-organique les auteurs sont parvenus à limiter la réaction d'hydrolyse du substrat. Ils ont ainsi obtenu après acétylation, de l'hémi-C-maltotétraose acétylé (18%), de l'hémi-C-maltohexaose acétylé (11%), de l'hémi-C-matooctaose acétylé (5%). Il est à noter ici que la quantité de substrat hydrolyse est élevée (respectivement 42 et 66%). On peut signaler en outre la synthèse du fluorure de 4'-désoxymaltosyle et du fluorure de 4"-désoxymaltotriosyle par Withers et coll. (Carbohydr. Res. 268,
1995, 93-106), ces deux composés n'ayant cependant jamais été utilisés à des fins synthétiques en vue de la préparation d'oligo- ou polysaccharides. Les fluorures de maltosyle modifiés de l'invention fonctionnent comme donneurs de glycosyle pour les enzymes de type glycoside-hydrolases ou de type transglycosylases. Les modifications effectuées au niveau des positions 4π ou des positions 4π et 6π du fluorure de maltosyle permettent la transformation simple de ces donneurs de glycosyle en accepteurs de glycosyle de telle sorte qu'une synthèse pas à pas d'oligosaccharides et de polysaccharides est rendue possible sans risque de croissance désordonnée des chaînes polysaccharidiques.
Le procédé de l'invention permet donc un contrôle idéal de la synthèse d'oligo- ou de polysaccharides.
Plus précisément, l'invention concerne un disaccharide de formule I :
dérivé du fluorure de α-maltosyle, dans lequel :
R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par un atome d'azote, un atome d'oxygène, un atome de soufre ou un atome d'halogène, ou bien
R1 et R2 forment ensemble un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par deux atomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre et d'azote, étant entendu que R1 ne représente pas un groupe hydroxyle. La configuration des carbones asymétriques endocycliques des composés de formule I est celle des carbones correspondants de l'α-maltosyle.
La nature du groupement fonctionnel organique représentant R1 et/ ou R2 est quelconque dès lors que celui-ci n'interfère pas avec la réaction de condensation ultérieure mettant en jeu le disaccharide de formule I correspondant comme réactif de départ et dès lors que R1 est transformable en groupe permettant au disaccharide résultant d'être un accepteur de glycosyle. Un accepteur de glycosyle est entendu ici comme une molécule se positionnant dans les sous-sites accepteurs de l'enzyme. Des exemples de groupes permettant au disaccharide résultant d'être un accepteur de glycosyle sont les radicaux OH, NH2 et SH. Ainsi, R1 est généralement le précurseur d'un groupe OH, SH ou NH2.
Selon l'invention, R1 ne représente pas un groupe hydroxyle. Par contre, R1 peut représenter un groupe hydroxyle protégé par un groupe protecteur quelconque utilisé en chimie organique tel que l'un de ceux décrits dans
Protective Groups in Organic Synthesis Greene T.W. et Wutz P.G.M., éd. John
Wiley & Sons, 1991 ou dans Protecting Groups Kocienski P.J. 1994, Georg Thieme
Verlag.
A l'inverse, R2 peut représenter un groupe hydroxyle libre ou bien un groupe hydroxyle protégé par un groupe protecteur tels que ceux décrits dans les deux ouvrages cités ci-dessus.
Un groupe préféré de disaccharides de formule I est constitué des disaccharides dans lesquels R2 représente -OH.
Des groupes protecteurs de fonction hydroxyle sont notamment les groupes éthers, esters, sulfonates, carbamates, acétals, hémiacétals et carbonates.
A titre d'exemple de significations de R1 et/ ou R2, on peut mentionner les groupes alkoxy éventuellement substitué ; alcényloxy éventuellement substitué ; aryloxy éventuellement substitué ; diarylalcoxy éventuellement substitué ; ou triarylalcoxy éventuellement substitué ; hétéroaryloxy éventuellement substitué ; arylalkoxy éventuellement substitué ; hétéroarylalkoxy éventuellement substitué ; alkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; arylcarbonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylcarbonyloxy éventuellement substitué ; arylalkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylalkylcarbonyloxy éventuellement substitué ; alkylsulfonyloxy éventuellement substitué ; arylsulfonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylsulf onyloxy éventuellement substitué ; arylalkylsulfonyloxy éventuellement substitué ; hétéroarylalkylsulfonyloxy éventuellement substitué ; -O-SiRfRsR11 où Rf, Rε et Rh sont choisis indépendamment parmi alkyle et aryle éventuellement substitué ;
-0-CO-NRaR où Ra et Rb sont indépendamment choisis parmi alkyle éventuellement substitué, aryle éventuellement substitué, arylalkyle éventuellement substitué, hétéroarylalkyle éventuellement substitué, et un atome d'hydrogène ; et
R d — o— C~YRe où Rc et Rd sont tels que définis ci-dessus pour Ra et Rb ou bien Rc et Rd forment ensemble une chaîne alkylène éventuellement substituée et Re est tel que défini ci-dessus pour Ra, ou bien encore Rd et Re forment ensemble une chaîne alkylène éventuellement substituée, Rc étant tel que défini ci-dessus pour Ra ; et Y représente O ou S.
Selon l'invention, R1 et/ ou R2 peuvent représenter un atome d'halogène tel que pour R1 un atome de brome, de chlore ou d'iode et pour R2 un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor.
En variante, R1 et/ ou R2 peuvent représenter une fonction aminé ou thiol éventuellement substituée ou protégée par un ou deux des groupes protecteurs décrits dans Protective Groups in Organic Synthesis Greene T.W. et Wutz P.G.M., éd. John Wiley & Sons, 1991 ou dans Protecting Groups Kocienski P.J. 1994,
Georg Thieme Verlag.
De tels groupes protecteurs sont notamment les groupes carbamates, amides, azide, urée, thioacétate, disulfure, thiourée, arylthio, alkylthio, acylthio, arylcarbonylthio, acétamido ou benzamido. A titre d'exemples de significations de R1 et R2, on peut mentionner les groupes amino ; alkylamino ; dialkylamino ; -NH-CO-Ra où Ra est tel que défini ci-dessus ; azide ; -NRa-CO-NRbRf où Ra et Rb sont tels que définis ci-dessus et Rf prend l'une quelconque des significations données ci-dessus pour Ra ; -O-CO- NH-Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus ; -S-Ra, Ra étant tel que défini ci-dessus ;
-NRa-CO-Re, Ra et Re étant tels que définis ci-dessus.
En variante, les groupes R1 et R2 peuvent former ensemble un groupe fonctionnel organique éventuellement protégé.
Un tel groupe fonctionnel est, par exemple, un groupe protecteur de fonction diol tel qu'un groupe alkylidènedioxy éventuellement substitué et, par exemple, substitué par aryle.
Ainsi, R1 et R2 peuvent former ensemble un groupe O-isopropylidène ou O-benzylidène.
Un disaccharide particulièrement préféré est le disaccharide de formule I dans lequel R1 représente un groupe 2-tétrahydropyranyle, et de préférence R2 représente un groupe hydroxyle.
Un disaccharide également préféré est le disaccharide de formule I, dans lequel R1 représente un groupe 2-tétrahydropyranyle et R2 représente un atome d'halogène, tel que le brome. Comme autre saccharide préféré, on peut citer le disaccharide de formule I dans lequel R1 représente azido ou amino éventuellement substitué et R2 représente azido ou amino éventuellement substitué.
Un autre disaccharide préféré est celui de formule I dans lequel R1 représente azido ou amino éventuellement substitué et R2 représente -OH. Plus particulièrement on préfère les disaccharides pour lesquels dans la formule I
- R1 = NH2 ou azido; R2 = OH ; ou
- R1 =NH2 ou azido; R2 = NH2 ou azido.
Des substituants préférés du groupe amino sont les groupes alkyle, aryle et arylalkyle dans lesquels aryle est éventuellement substitué. Dans le cadre de l'invention, on entend par alkyle une chaîne hydrocarbonée linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 14 atomes de carbone, de préférence de 1 à 10, mieux encore de 1 à 6 atomes de carbone, par exemple de 1 à
4 atomes de carbone. Des exemples de radicaux alkyle sont méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, butyle, isobutyle, t-butyle, pentyle, isopentyle, néopentyle, 2-méthylbutyle, 1- éthylpropyle, hexyle, isohexyle, néohexyle, 1-méthylpentyle, 3-méthylpentyle,
1,1-diméthylbutyle, 1,3-dirnéthylbutyle, 2-éthylbutyle, 1-méthyl-l-éthylpropyle, heptyle, 1-méthylhexyle, 1-propylbutyle, 4,4-diméthylpentyle, octyle, 1- méthylheptyle, 2-méthylhexyle, 5,5-diméthylhexyle, nonyle, décyle, 1- méthylnonyle, 3,7-diméthyloctyle et 7,7-diméthyloctyle.
Par aryle on entend selon l'invention, un groupe hydrocarboné mono- ou polycyclique (par exemple mono- ou bicyclique) aromatique préférablement en
C6-G.8, tel que phényle, naphtyle, anthryle, ou phénanthryle. Les groupes hétéroaryle sont des groupes aromatiques hétérocy cliques monocycliques ou polycycliques comprenant des hétéroatomes généralement choisis parmi O, S et N, éventuellement à l'état oxydé (cas de S et de N).
De préférence, l'hétéroaryle est mono-, bi- ou tricyclique.
De préférence, au moins l'une des monocycles constituant l'hétérocycle comprend de 1 à 4 hétéroatomes endocy cliques, mieux encore de 1 à 3 hétéroatomes.
De façon préférée, l'hétérocycle est constitué d'un ou plusieurs monocycles présentant chacun de 5 à 7 sommets.
Des exemples d'hétéroaryles monocycliques de 5 à 7 sommets sont notamment la pyridine, le furane, le thiophène, le pyrrole, le pyrrazole, l'imidazole, le thiazole, l'isoxazole, le furazane, la pyridazine, la pyrimidine, la pyrazine, les thiazines, l'oxazole, le pyrazole, l'oxadiazole, le triazole et le thiadiazole.
Des exemples d'hétéroaryles bicycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets sont choisis parmi indolizine, indole, isoindole, benzofuranne, benzothiophène, indazole, benzimidazole, benzothiazole, benzofurazane, benzothiofurazane, purine, quinoléine, isoquinoléine, cinnoline, phtalazine, quinazoline, quinoxaline, naphtyridines, pyrazolotriazine (tel que pyrazolo-l,3,4-triazine), pyrazolopyrimidine et ptéridine.
Les hétéroaryle tricycliques dans lesquels chaque monocycle comprend de 5 à 7 sommets sont, par exemple, choisis parmi l'acridine, la phénazine ou le carbazole.
Alkylène définit un groupe divalent hydrocarboné linéaire ou ramifié éventuellement substitué, de préférence en Ci-Cu, dérivé d'un groupe alkyle par arrachement d'un atome d'hydrogène. De manière avantageuse, alkylène désigne un groupe en Ci-Cio, mieux encore en O-CÔ, par exemple en Ci- .
Alkylidènedioxy représente un groupe divalent organique de formule générale : -O-A-O- où A désigne alkylène éventuellement substitué, tel que défini ci-dessus.
Un exemple de groupe arylalkyle particulièrement préféré est benzyle. Un exemple de groupe triarylalkyle est trityle.
Les substituants des groupes aryle et hétéroaryle sont généralement choisis parmi les atomes d'halogène ; les groupes nitro ; (Cι-Ci4)alcoxy éventuellement halogène (et préférablement trifluorométhoxy) ; (Ci- Ci4)thioalcoxy éventuellement halogène, de préférence (Cι-Oo)thioalcoxy ; (O- Ci4)alkyle éventuellement halogène, de préférence perhalogéné (et notamment méthyle ou trifluorométhyle) ; (Cι-C )alkylcarbonyle dans lequel la partie alkyle est éventuellement halogénée ; (C6-Ci8)arylcarbonyle dans lequel la partie aryle est éventuellement substituée une ou plusieurs fois par halogène, (C1-Q.4) alkyle éventuellement halogène et/ ou (Cι-Ci4)alcoxy éventuellement halogène ; (Ci- Ci4)alkylcarbonylamino dans lequel la partie alkyle est éventuellement halogénée ; (C6-Ci8)arylcarbonylamino dans lequel aryle est éventuellement substitué une ou plusieurs fois par halogène, (Cι-Ci4)alkyle éventuellement halogène et (O- Ci4)alcoxy éventuellement halogène ; et (C6-Ci8)aryle éventuellement substitué une ou plusieurs fois par halogène, (Cι-Ci4)alkyle éventuellement halogène tel que trifluorométhyle, et (Cι-Ci4)alcoxy éventuellement halogène tel que trifluorométhoxy. Par atome d'halogène, on entend un atome de chlore, de brome, d'iode ou de fluor.
Les groupes aryle et hétéroaryle peuvent être substitués par un ou plusieurs des substituants énumérés ci-dessus, de préférence une à trois fois, par exemple une à deux fois.
Les groupes alkyle et les parties alkyle des radicaux sus-mentionnés ainsi que les radicaux alkylène ou les parties alkylène des radicaux sus-mentionnés peuvent être substitués une ou plusieurs fois par un ou plusieurs radicaux indépendamment choisis parmi halogène tel que brome, (Cι-C14)alcoxy, (Ci- Ci4)thioalcoxy, de préférence par un à trois radicaux de ce type.
Lorsque l'un de R1 et/ ou R2 représente amino substitué, les substituants peuvent être un groupe alkyle éventuellement substitué, un groupe aryle éventuellement substitué, un groupe hétéroaryle éventuellement substitué, un groupe arylalkyle éventuellement substitué, ou un groupe hétéroarylalkyle éventuellement substitué.
Lorsque dans les disaccharides de formule I R1 et/ ou R2 représentent un groupe hydroxyle protégé, on préfère que celui-ci soit choisi parmi benzyloxy éventuellement substitué ; allyloxy ; trityloxy ; tétrahydropyranyloxy ; 3-bromo- tétrahydropyranyloxy ; tétrahydrothiopyranyloxy ; 1-méthoxycyclohexyloxy ; 4- méthoxytétrahydro-pyranyloxy ; 4-méthoxytétrahydrothiopyranyloxy ; acétoxy ; 2-halogénoacétoxy ; un groupe -O-SiR^sR11 où Rf, Rs et Rh sont soit tous les trois alkyle identiques ou différents, soit tous les trois aryle identiques ou différents ; tosyloxy ; et mésyloxy.
Les composés de formule I peuvent être préparés en plusieurs étapes. Le procédé de synthèse comprend tout d'abord la réaction de fluorure d'hydrogène sur un composé de formule II : dans laquelle :
P2, P3, P4, P5 et P6 sont des groupes protecteurs de fonctions hydroxyle ;
R'1, R'2 désignent respectivement R1 et R2 ou bien sont des groupes précurseurs des substituants R1 et R2 ; et
G représente un groupe pouvant être déplacé par un ion fluorure tel qu'un groupe alkylcarbonyle où alkyle est tel que défini ci-dessus, un groupe allylé ; un groupe epoxyde (1, 2) ou un groupe -C(=NH)-CC13 ; ou bien G et P2 forment ensemble un groupe alkylidènedioxy tel que défini ci-dessus. De préférence, G représente un groupe acétylé, les groupes P2, P3, P4, P5 et
P6 pouvant être identiques.
En variante, on peut envisager la réaction de fluorure d'hydrogène sur un composé de formule II' :
dans laquelle
R'1, R'2, P2, P3, P4,P5 et P6 sont tels que définis ci-dessus pour la formule II et
W représente -SG, SeG ou TeG, G étant tel que défini ci-dessus étant entendu que
G et P2 peuvent former ensemble une chaîne alkylène où alkylène est tel que défini ci-dessus. Cette réaction peut être mise en œuvre en l'absence de solvant et en présence d'un large excès de fluorure d'hydrogène, celui-ci tenant lieu de solvant. De manière avantageuse cependant, la réaction est conduite dans un solvant tel que la pyridine. Plus préférablement, on opère en outre en présence d'un large excès de fluorure d'hydrogène.
Ainsi, selon un mode de réalisation préféré de l'invention, le composé de formule II ci-dessus est dissous dans un mélange 10/1 à 1/1 de fluorure d'hydrogène/ pyridine. Cette réaction est habituellement conduite à température ambiante et plus généralement à une température comprise entre -10 et 50° C, par exemple comprise entre 15 et 30° C.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, P2, P3, P4, P5 et P6 représentent des groupes alkylcarbonyle tels des groupes acétylé, R'1 représente un groupe hydroxyle et R'2 est choisi parmi un atome d'halogène (tel qu'un atome de brome) ou un groupe alkylcarbonyle tel qu'un groupe acétylé.
Le composé obtenu à l'issue de cette première étape a pour formule :
dans laquelle P2, P3, P4, P5, P6 et R'1, R'2 sont tels que définis ci-dessus pour la formule III.
Les étapes suivantes aboutissant à l'isolement du composé de formule I seront facilement mises au point par l'homme du métier en fonction de la nature des groupes R1 et R2 dans le composé de formule I visé. Ces étapes comprennent, dans un ordre quelconque, (i) la déprotection des fonctions hydroxyle protégées respectivement par P2, P3, P4, P5 et P6, et, le cas échéant, (ii) la transformation des groupes R'1 et R'2 en groupes R1 et R2.
Lorsque dans les composés de formule II R'1 représente un groupe hydroxyle et R'2 est identique aux groupes P2, P3, P4, P5 et P6 (identiques entre eux), la transformation du composé III en composé de formule I comprend par exemple : - une première étape de transformation du groupe hydroxyle en position
4π en groupe R1 ;
- la déprotection ultérieure simultanée des groupes hydroxyle en position 2i, &, &, 2H, 311 et 6H ; - et, le cas échéant, la transformation du groupe hydroxyle en position 6π en groupe R2.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne l'utilisation d'un disaccharide tel que défini ci-dessus dans les réactions de transglycosylations catalysées par des glycoside-hydrolases ou dans les réactions de transfert catalysées par des transglycosylases. Dans ces réactions, les disaccharides de l'invention, substrats des enzymes de type glycoside-hydrolases et/ ou transglycolases, fonctionnent comme donneurs de glycosyle.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, les disaccharides de l'invention sont utilisés comme substrats d'enzymes appartenant à la famille 13 des glycoside-hydrolases. Parmi ces enzymes, on compte notamment les α-amylases, les pullulanases, les cyclomaltodextrin- glucanotransférases, les cyclomaltodextrinases, les oligo-α-glucosidases, les maltogenic amylases, les néopullulanases, les α-glucosidases, les α-amylases formant maltotetraose, les isoamylases, les glucodextranases, les α-amylases formant maltohexaose, les enzymes de ramification, les 4-α-glucanotransférases, les α-amylases formant maltopentaose et les amylosucrases.
Dans le cadre de l'invention, lesdites enzymes sont utilisées pour la préparation d'oligo- ou polysaccharides par condensation séquentielle de glycosyles. Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, on utilise comme substrat d'enzymes un disaccharide de formule I dans laquelle R2 représente un atome d'halogène, et plus particulièrement le brome, en vue de la préparation d'oligosaccharides ramifiés, c'est-à-dire d'oligosaccharides dans lesquels les unités monosaccharidiques forment des enchaînements avec ramifications. Il doit être entendu qu'à l'inverse on entend selon l'invention par oligosaccharides linéaires des oligosaccharides dans lesquels les unités monosaccharidiques forment des enchaînements linéaires.
De manière plus particulièrement préférée, la préparation d'oligo- et polysaccharides met en jeu la cyclodextrine glycosyltransférase (cGTase), comme enzyme de type glycoside hydrolase.
Selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un procédé pour la préparation d'oligosaccharides ou de polysaccharides comprenant la réaction d'au moins un disaccharide de formule I de l'invention avec un accepteur de glycosyle, en présence d'une enzyme de type glycoside-hydrolase ou de type transglycosylase.
Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, la synthèse d'oligo- ou polysaccharides à partir des disaccharides de l'invention implique une ou plusieurs réactions de condensation entre l'unité de type maltosyle d'un disaccharide de formule I et l'unité pyranosyle d'un accepteur de glycosyle.
De fait, de façon particulièrement avantageuse, le procédé de l'invention comprend une ou plusieurs réactions de couplage entre un disaccharide de l'invention et un accepteur de glycosyle présentant, en extrémité non réductrice, une unité pyranosyle portant au moins une fonction susceptible de réagir avec ledit disaccharide de formule I, la liaison glycosidique ayant lieu entre cette unité pyranosyle et le carbone anomère portant l'atome de fluor du disaccharide de l'invention, lequel disaccharide fonctionne comme donneur de glycosyle.
Des exemples d'unités préférées pyranosyle sont les unités allose, altrose, glucose, gulose, mannose, idose, galactose ou talose. De manière préférée, la synthèse de l'oligosaccharide ou du polysaccharide comprend une étape de condensation entre l'unité de type maltosyle du disaccharide de l'invention et l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle, ladite condensation procédant par la réaction d'un seul groupe hydroxyle de l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle avec le carbone anomère de ladite unité de type maltosyle. L'un des avantages de l'invention réside dans la possibilité de contrôler, étape par étape, la synthèse de l'oligosaccharide, respectivement du polysaccharide final.
Il suffit, à l'issue de chaque étape de condensation avec un dissacharide de l'invention, de procéder à une nouvelle réaction de condensation, après déprotection éventuelle d'une fonction hydroxyle de l'oligosaccharide obtenu, lequel devient pour ladite nouvelle réaction de condensation l'accepteur de glycosyle.
De préférence, le carbone anomère portant le fluor du disaccharide de l'invention réagit avec une fonction hydroxyle, thiol ou aminé (et plus particulièrement une fonction hydroxyle) préférablement située en position 4 de l'unité pyranosyle de l'accepteur de glycosyle. Plus généralement, cette fonction de l'unité pyranosyle est située en position 2, 3, 4 ou 6.
L'accepteur de glycosyle peut être indifféremment un monosaccharide tel que l'α-D-glucopyranoside de méthyle, un oligosaccharide ou un polysaccharide tel que le pullulane.
On préfère tout particulièrement que l'accepteur de glycosyle soit le pullulane et que le disaccharide de l'invention soit un disaccharide de formule I dans laquelle R1 = NH2 ou azido et R2 = OH ou bien encore R1, R2 représentent indépendamment NH2 ou azido.
Le polymère résultant est notamment particulièrement intéressant comme nouveau vecteur en thérapie génique.
Ainsi, selon un autre de ses aspects, l'invention concerne un vecteur utilisable en thérapie génique résultant de la condensation d'un polysaccharide constitué d'un enchaînement linéaire ou ramifié d'unités glycopyranosyle avec un ou plusieurs disaccharides de formule I tel que défini ci-dessus, ladite condensation impliquant la réaction d'une ou plusieurs fonctions hydroxyle en position 4 des unités glycopyranosyle dudit polysaccharide avec un carbone anomère portant l'atome de fluor desdit disaccharides de formule I. De manière préférée, ledit polysaccharide est le pullulane. De préférence, le disaccharide de formule I est un disaccharide de formule
I dans laquelle R1, R2 représentent indépendamment NH2 ou azido; ou bien encore R1 = NH2 ou azido; R2 = OH.
Plus généralement, le procédé de l'invention est approprié pour ramifier, de façon contrôlée, les positions 4 des unités monosaccharidiques du pullulane.
D'autres exemples de polysaccharide, accepteur de glycosyle, utilisables dans le cadre de l'invention sont notamment des dextranes linéaires ou ramifiés, des alternanes, de l'amylose, du glycogène, de l'amylopectine et plus généralement tout polysaccharide suceptible d'être accepteur de glycosyle lors de l'utilisation de composé de type I tel que le défini l'invention.
Selon l'invention, le couplage du disaccharide de l'invention avec l'accepteur de glycosyle est mis en œuvre en milieu aqueux, à un pH voisin de la neutralité, par exemple à un pH compris entre 6 et 8, de préférence à pH 7.
On opère le plus souvent en solution aqueuse tamponnée. En variante, on peut également opérer par ajout d'une base minérale telle que la soude, l'addition étant réalisée à l'aide d'une burette automatisée contrôlée par un pH-mètre.
Des exemples de tampons utilisables à cet effet sont les tampons phosphate, sulfate, acétate, citrate, succinate et maléate, les tampons phosphate étant préférés.
Habituellement, la condensation est mise en œuvre en mettant en présence 1 équivalent de l'accepteur de glycosyle et 1 à 5 équivalents molaires, de préférence 1,2 à 3,5 équivalents, du dérivé fluorure de maltosyle de formule I.
L'enzyme fonctionnant en tant que catalyseur est présente dans le milieu réactionnel en quantité catalytique. On utilise ainsi moins d'un équivalent d'enzyme pour un équivalent molaire d'accepteur de glycosyle (en général une quantité inférieure à 10'3M, mieux encore inférieure à ÎO^M et par exemple comprise entre 10-4 et 10"6 M (telle qu'une quantité de l'ordre de 10-5M) suffit habituellement. La réaction est généralement mise en œuvre à une température inférieure à
100° C. Les avantages de ce type de synthèse d'oligo- et polysaccharides utilisant les enzymes de type glycoside hydrolase au transglycosylase sont multiples :
- les coûts de production sont réduits ;
- les synthèses étant effectuées en milieu aqueux, les produits obtenus sont exempts de solvants organiques résiduels, ce qui garantit leur totale innocuité.
L'invention est illustrée dans la suite par les exemples de synthèse 1 à 6 suivants.
Dans les exemples, EP désigne l'éther de pétrole, PF le point de fusion expérimental et PFiitt le point de fusion rapporté dans la littérature.
EXEMPLE 1 a) Préparation du 2,3-di-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(l- )-l,2,3,6-tétra-0-acétyl- β-D-glucopyranose
A une solution de 4',6'-O-benzylidène maltose per-acétylé (15g, 22 mmol) en solution dans acétonitrile (420 ml), est additionné une solution d'acide tétrafluoroborique (HBF4/H O; 35% v/v; 6,1 ml). Le mélange est agité 10 minutes à température ambiante, neutralisé par de la triéthylamine (6,8 ml) puis évaporé. Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 3 / EP 1), le composé attendu est cristallisé dans un mélange dichlorométhane/éther (12 g; 92%)
PF = 204-205 °C
PFiit =205-206° C : K. Takeo et K. Shinmitsu, Carbohydr. Res., 133, 1984, 135-145.
RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,08-168,8 (COCH3); 95,82 (Clπ); 91,29 (Cl1); 75,21 - 73,10 - 72,78 - 72,05 - 71,92 - 70,92 - 70,28 - 69,42 (C21, C3 C41, C5 C2π, C3π, C4π, C5π); 62,63 (C61); 61,87 (C6π); 20,78-20,46 (COCH3) I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Al ci- dessus. b) Préparation du 2,3,6-tri-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(l—>4)-l,2,3,6-tétra-0-acétyl- β-D-glucopyranose
Le composé obtenu à l'étape précédente (6,075 g, M=594 g/mol, 10,2 mmol), de l'acétate de N-hydroxy-benzotriazole (2,004 g, 1,2 éq) sont solubilisés dans du dichlorométhane (60 ml). De la triéthylamine (2,112 ml) est additionné. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 20h. Le solvant est évaporé. Le composé attendu est obtenu par cristallisation dans l'éther éthylique (5,164 g, 80 %).
RMN ]H (300 MHz, CDC13): 5,64 (Hl1; d; Jlj2 = 8,4 Hz); 5,22 (Hlπ; d; J1;2 = 3,66 Hz); 5.17 (H31; t; J2,3 = J3;4 = 8,4 Hz); 5,1 (H3π; t; J2,3 = 10,2 Hz; J3;4 = 9,8 Hz); 4,84 (H21; t; Jlj2 = J2j3 = 8,4 Hz Hz); 4,66 (H2π; dd; Jlj2 ≈ 3,66 Hz; J2)3 = 10,23 Hz); 4,37 (Hόa1; dd; J5;6a # 2 Hz; J6a;6b # 12 Hz); 4,34 (Hόa11; dd; J5)6a = 4,02 Hz; J6a,6b = 12,06 Hz); 4,14 (H6bπ); 4,10 (Hόb1); 3,9 (H41; t; J4>5 = J3>4 = 8,4 Hz); 3,73 (H51); 3,69 (H511); 3,45 (H4π; t; J4;5 = J3,4 ≈ 9,8 Hz); 2,01-2,0-1,98-1,93-1,89 (CH3CO; s; 21 H);
RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,06 - 170,62 - 170,52 - 170,37 - 169,88 - 169,41 - 168,65 (COCH3); 95,75 (Clπ); 91,09 (Cl1); 74,94 - 72,88 - 72,31 - 71,46 - 70,84 - 70,77 - 70,03 - 68,47 (C21, C31, C41, C51, C2π, C311, C4π, C5π); 62,37 (C61, C6π); 20,53-20,26 (COCH3)
I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Bl.
Analyse élémentaire C26H36O18 : Calculée C = 49,06 %; H = 5,7 %; Trouvée C = 48,97 %; H = 5,85 % c) Préparation du fluorure de 2,3,6-tή-0-acétyl-a-J)-glucopyranosyl-(l->4)-2,3,6-tri-0- acétyl-ct-D-glucopyranosyle
La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.
L'hepta-acétate obtenu à l'étape précédente (5 g, 7,86 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7:3; v/v; 30 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution aqueuse glacée d'ammoniaque 3M. Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogénocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Une chromatographie rapide (EtOAc 2 / EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (4,45 g; 95%).
RMN H1 (300 MHz, CDC13) : 5,6 (Hl; dd; JH1;2 = 2,56 Hz; JHJF = 54 Hz ); 5,48 (H31; dd#t; J3>4 # 9,5 Hz); 5,33 (Hlπ; d; JHlj2 = 4,0 Hz); 5,17 (H3π; dd#t; J3;4 = 10.1 Hz ); 4,79 (H21; ddd; ,ι = 2,56; J2;3 = 10.05 Hz; JH;F = 22,5 Hz); 4,75 (H2π; dd; Jlj2 = 4,0 Hz; J2,3 = 10,6 Hz); 4,5 (Hόa1; dd; J5>6a = 2 Hz; J6a,6 =12,4); 4,41 (H6aπ; dd; J5;6a =3,6 Hz; J6a,6b =12,4 Hz); 4,18 (Hôb1; H6bπ); 4,11 (H51; m); 3,99 (H41; t; J4,5 = 9,3 Hz); 3,75 (H5π; m); 3,5 (H4π; dt; JH4,5# 10,1 Hz; JH)OH=5,6 HZ); 3,21 (OH non lié, JOH,H=5,6 HZ); 2,1-2,08- 2,04-2,02-1,97 (21 H COCH3).
RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,33-169,69 (COCH3); 103,56 (Cl1; d; JC,F=229,3 HZ); 95,84 (Cl11); 71,78 - 71,66 - 71,58 - 71,21 - 70,72 - 70,30 - 69,99 - 68,69 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5π); 62,36 - 62,12 (C61, C6π); 20,71-20,41 (COCH3).
S.M. (FAB): m/z = 659 Da [M+Na]"1 Analyse élémentaire C24H33FO16 : Calculée : C 48,32; H 5,58; F 3,18;
Trouvée : C 48,34; H 5,82; F 2.98;
I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Cl ci- dessus.
d) Préparation du fluorure de 2,3,6-tri-0-acétyl-4-0-tétrahydropyranyl-a-D- glucopyranosyl-(l —>4)-2,3, 6-tri-O-acétyl- -D-glucopyranosyle
Du composé obtenu à l'étape précédente (3g; 5 mmol) est dissous dans du dichlorométhane (120 ml) distillé. Du dihydropyrane (2.3 ml) est ajouté ainsi que de l'acide camphorsulfonique (86 mg). Après 3h d'agitation à température ambiante, le mélange réactionnel est lavé avec une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 1 / EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine, le composé attendu est obtenu sous forme de mélange de diastéréoisomères (3,420 g; 98 %).
RMN 1H (300 MHz, CDC13) : pas d'interprétation, mélange de diastéréoisomères.
RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 170,54-169,31 (COCH3); 103,56 (Cl1; d; JC)F=229,3 Hz); 102,05 - 101,62 (C acétalique du tétrahydropyrane R et S) 95,72 (Cl11); 75,28 - 73,59 - 71,75 - 71,68 - 71,48 - 70,77 - 70,43 - 70,38 - 70,26 - 69,99 - 69,84 - 69,74 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5π); 64,03 - 63,34 - 62,61 - 62,14 - 62,1 - 62,02 (C61, C6D R et S , C tétrahydropyranyle R et S); 31,07 - 24,99 (tétrahydropyranyle); 20,76-20,41 (COCH3); 20,09 - 19,67 (1 C tétrahydropyranyle R et S ). Analyse élémentaire : Calculée : C 51,18; H 6,07; F 2,79;
Trouvée : C 51,19; H 6,15;
S.M. (DCI) : m/z=698 Da [M+NH4]+
I et II se réfèrent respectivement aux unités glycosidiques représentées à la formule Dl ci- dessus.
e) Préparation du fluorure de 4-0-tétrahydropyranyl-a-D-glucopyranosyl-(l—>4)-a-D- glucopyranosyle
Le composé per-acétylé obtenu à l'étape précédente (1,55 g; 2,28 mmol) est dissous dans du méthanol (50 ml). Une solution de méthylate de sodium dans le méthanol (1M; 2,5 ml) est ajoutée. Après agitation 30 minutes à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 H+. Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (956 mg; 2,23 mmol). Ce composé est utilisé sans autre purification. Sous forme lyophilisé, ce fluorure est stable à -18°C. Note : le premier composé de dégradation est rα-fluorure de maltosyle.
S.M. (FAB): m/z = 429 Da [M+H]+
EXEMPLE 2 Préparation du 2,3,4, 6-tétra-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(l —>4)-2,3, 6-tri-O-acétyl-a- D-glucopyranosyl-(l —>4)-[2,3,4, 6-tétra-0-acétyl- -D-glucopyranosyl-(l —>4)-2,3, 6-tri- 0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(l—>4)-2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranosyl-(l—>6)]- 2,3-di-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl-(l—>4)-l,2,3,6-tétra-0-acétyl-D-glucopyranose
Du panose [(a-D-glucopyranosyl-(l —>6)J- -D-glucopyranosyl-(l —>4)-D-glucopyranose) (80 mg; 0,158 mmol) et du fluorure de maltosyle modifié obtenu à l'exemple le) (171 g; 0,4 mmol; 2,5 éq) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (8 ml; 0,1 M; pH=7). De la cGTase (en quantité catalytique) est additionnée. Le mélange est agité pendant deux heures à température ambiante. Une chromatograhie sur couche mince (éluant H2O 1 / CH3CN 2) montre la complète conversion du fluorure. Le mélange réactionnel est porté à 100°C pendant 5 minutes. La protéine est filtrée sur coton. Le filtrat est lyophilisé puis acétylé dans un mélange pyridine / anhydride acétique (1,5:1, v/v, 25 ml) pendant une nuit à 70°C. Du méthanol (10 ml) est additionné à 0°C pour neutraliser l'excès d'anhydride acétique. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CH2C1 , lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2C12 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2SO4 puis évaporées à sec. Le résidu est repris au CH2C12 (10 ml) et de l'acide trifluoroacétique (10 ml) est additionné. Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à température ambiante, évaporé à sec puis acétylé 14 heures dans un mélange pyridine / anhydride acétique (1,5:1, v/v, 3,5 ml) à température ambiante. Le mélange est alors refroidi à 0°C et du méthanol (1ml) est additionné. Après évaporation sur évaporateur rotatif, le résidu est purifié par chromatographie rapide (CH2C12 100/ MeOH 1), m = 230 mg (0,125 mmol, 80 %).
S. M. (électrospray) m/z = 2141 (M+Na)+
EXEMPLE 3 Préparation du a-D-glucopyranosyl-(l ->4)-a-D-glucopyranosyl-(l - )-[ -D- glucopyranosyl-(l —>4)~ a-D-glucopyranosyl-(l ->4)-a-D-glucopyranosyl-(l —>6)]-a-D- glucopyranosyl-(l—>4)-D-glucopyranose
Le composé de l'exemple 2 (100 mg; 0,546 mmol) est dissous dans du MeOH (30 ml) et une solution de méthylate de sodium dans le méthanol est ajouté (1M, 300 μl). Le mélange réactionnel est agité une nuit à température ambiante. Une chromatographie sur couche mince (H O 1 / CH3CN 1,5) révèle la totalité de la réaction. La solution est ensuite neutralisée avec de la résine Amberlite IRN 120 (H*"), évaporée, co-évaporée à l'eau puis lyophilisée pour donner le composé attendu 61 mg (96 %).
S.M. Haute résolution : m/z = 1191.3441 Da [M+K]+ Correspondant à C42H72O36K m/z = 1175.3701 Da [M+Na]+ Correspondant à C42H72O36Na
Abréviation DP utilisée pour: degrés de polymérisation (nombre d'unité glucosyle) Couplage spectrométrie de masse/spectrométrie de masse :
Ions fils de (M+Na)+ : - 1012,8 Da (DP6+Na)+
850,6 Da pP5+Na)+
688,9 Da (DP4+Na)+ - 526,9 Da (DP3+Na)+
347.1 Da (DP2+Na)+
203.2 Da (DPl+Na)+
RMN 1H : (400 MHz, D2O (4,65 ppm), 298 K) -Hi αl4 (trois massifs) : 5,23 ppm,
5,19 ppm,
5,149 ppm; d; J12 = 4 Hz; -Hlα : 5,073 ppm; J12 = 3,6 Hz et 5,028 ppm; J12 = 4 Hz;
- Hι αl6 : 4,808 ppm; d; J12= 3,2 Hz;
-HιP : 4,491 ppm, d; J12 = 8 Hz;
3,9 - 3,4 ppm; massif; tout proton non cité
- H des unités non-réductrices : 3,249 ppm ; t ; J32 = 9,6 Hz - H2β : 3,114 pm ; t; J32 ≈ J12
RMN 13C : (400 MHz, D2O, 298 K)
100,38; 100,09 ppm : Cl de liaisons αl4; - 98,92 ppm : Cl de liaison αl6;
96,09 ppm : Clβ;
92,21 ppm : Cl ;
79,139; 78,25 ;78,06; 77,85; 77,73; 77,14; 77,00; 76,42; 74,98; 74,25; 73,70; 73,48; 73,30; 73,19; 73,05; 72,07; 71,98; 71,76; 71,62; 71,52; 70,65; 70,51; 70,38; 69,64 ppm : tout carbone non cité (soit 28 carbones).
- 67,83-67,67 : C6 appartenant à la liaison glycosidique αl6. Dédoublement dû: - à la forme α et à la forme β
- ou à l'équilibre conformationnel. 61,14; 60,90; 60,80; 60,67 ppm : C6 ne participant pas à une liaison glycosidique (6 carbones).
EXEMPLE 4 a) Préparation du 2,3-di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy-a,-D-glucopyranosyl-(l—>4)- 1,2,3, 6-tétra-O-acétyl-β-D-glucopyranose
A une solution du composé de l'exemple la) (5g; 7,86 mmol) dans la pyridine (54 ml) de la triphénylphosphine (PPh3; 4 g; 2 éq) et du tétrabromure de carbone (CBr4; 2,57 g, 1,02 éq) sont additionnés à 0°C. Le mélange réactionnel est agité 15 minutes à 0°C puis 3 heures à 50°C. Une chromatographie sur couche mince (EtOAc 1 / EP 1) montre la disparition du produit de départ. Du méthanol (5 ml) est alors ajouté. Le milieu réactionnel est évaporé puis co-évaporé avec du toluène. Le composé attendu est obtenu par purification par chromatographie rapide (4.2 g, 84 %).
RMN 1H (300 MHz, CDC13): 5,68 (Hl1; d; Jι,2 = 8,22 Hz); 5,31 (Hlπ; d; J1;2 = 3,83 Hz); 5,24 (H31; t; J3;4 = 8,7 Hz); 5,15 (H3π; t; J2j3 « J3>4 «10,2 Hz); 4,84 (H21; t; J2)3 = 9,14 Hz); 4,66 (H2π; dd; J2,3 = 10,3 Hz); 4,46 (Hόa1; dd; J5;6a = 2,4 Hz; J6a,6b = 12,2 Hz); 4,17 (H6b!; dd; J5)6a = 4,7 Hz; J6a,6b = 12,2 Hz); 3,96 (H41; t; J4(5= 9.6 Hz); 3,79-3,75 (H51; H5π); 3,68- 3,53 (H4π; Hόa11; H6bπ; m); 2,06-2,03-2,02-1,99-1,96-1.95 (CH3CO; s; 18 H);
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 171,13-168,78 (COCH3); 95,67 (Cl1); 91,18 (Clπ); 74,96 - 7 733,,1122 -- 7722,,4444 -- 7711,,7733 -- 7711,,2288 -- 7700,,8822 -- 7700,,7722 -- 7700,,1144 i (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5U); 62,61 (C61); 32,66 (C6π); 20,75-20,38 (COCH3).
s +
S.M. (DCI) : m/z = 674 Da (M+NE tJ
I et II se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule A4.
b) Préparation du fluorure de 2,3-di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy-a-D-glucopyranosyl- (1 —>4)-2,3, 6-tri-O-acétyl- -D-glucopyranosyle
La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.
L'hexa-acétate obtenu à l'étape précédente (2,041 g; 3,11 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7:3; v/v; 20 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution glacée d'ammoniaque 3M.
Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif. Une chromatographie rapide (EtOAc 2 / EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (1,71 g; 90 %).
RMN H1 (300 MHz, CDC13) : 5,59 (Hl; dd; JHl!2 = 2,93 Hz; JH,F = 53,3 Hz ); 5,47 (H31; dd; J3j4= 8,8 Hz); 5,34 (Hlπ; d; JH = 3,6 Hz); 5,15 (H3π; dd; J3)4= 9,14 Hz ); 4,76 (H21; ddd; J2,3 = 10,23 Hz; JH)F * 23 Hz); 4,73 (H2π; dd; J2,3 = 10,6 Hz); 4,51 (Hόa1; dd; J5;6a = 2,2 Hz; J6a,6b=12,4); 4,17 (Hόb1; dd; J5)6b =4,02 Hz); 4,10 (H51; m); 3,99 (H41; t; J4>5 ≈ 9,8 Hz); 3,75 (H5π; m); 3,6-3,48 (H4π; H6aπ; H6bπ; m); 2,07-2,02-2,01-2,0-1,97-1,96 (18 H COCH3).
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 171,33-169,76 (COCH3); 103,54 (Cl1; d; JC,F=227,8 HZ); 95,70 (Clπ); 71,80 - 71,31 - 70,7 - 70,35 - 70,06 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5π); 62,17 (C61); 32,71 (C6π) 20,9-20,36 (COCH3).
I et II se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule B4.
c) Préparation du fluorure de 2,3-di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy-4-0- tétrahydropyranyl-a-D-glucopyranosyl-(l—>4)-2,3,6-tri-0-acétyl-a-Ω-glucopyranosyle
Le composé obtenu à l'étape précédente (1,725 g; 2,79 mmol) est dissous dans du dichlorométhane distillé (95 ml). Du dihydropyrane (1,4 ml) est ajouté ainsi que de l'acide camphorsulfonique (50 mg). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à température ambiante puis lavé avec une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée. Après purification par chromatographie rapide (EtOAc 1 / EP 1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine. Le composé attendu est obtenu sous forme de mélange de diastéréoisomères (1,8 g; 95 %).
RMN : pas d'interprétation, mélange de diastéréoisomères. S.M. (DCI) : m/z = 718 Da (M+NH4)+
d) Préparation du fluorure de 6-bromo-6-désoxy-4-0-tétrahydropyranyl-a-D- glucopyranosyl-(l —>4)~ a-D-glucopyranosyle
Le composé per-acétylé obtenu à l'étape précédente (1 g; 1,42 mmol) est dissous dans du méthanol (20 ml). Une solution de méthylate de sodium dans le méthanol (1M; 200 μl) est ajoutée. Après agitation 30 minutes à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 H+. Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (683 mg; 98%). Ce composé est utilisé sans autre purification. Sous forme lyophilisé, ce fluorure est stable à -18°C.
S.M. (FAB) : m z = 513 Da (M+Na)+
EXEMPLE 5 Préparation du 2,3,4-tri-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy- -D-glucopyranosyl-(l —>4)-2,3,6- tri-0-acétyl- -D-glucopyranosyl-(l —>4) 2,3, 6-tri-O-acétyl— -D-glucopyranoside de méthyle
Du fluorure obtenu à l'exemple 4d) (80 mg; 0,163 mmol) et de l'α-D-glucopyranoside de méthyle (94,8 mg; 3 éq) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (7 ml; 0,1 M; pH=7,0). De la cGTase en quantité catalytique est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé à 40 °C pendant 14 heures puis chauffé à 100°C pendant 5 minutes. La protéine est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide acétique à 50% jusqu'à pH ≈ 4 et agité pendant 1 heure. Le mélange est ensuite neutralisé par ajout d'une solution ammoniaque à 10 % puis évaporé. Le résidu est co-évaporé 3 fois à l'eau, lyophilisé puis acétylé une nuit à 70°C dans un mélange pyridine / anhydride acétique (1,5:1, v/v, 16 ml). Du méthanol (7 ml) est additionné à 0°C pour neutraliser l'excès d'anhydride acétique. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CH2C12, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2C12 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2SO4. Le composé attendu est obtenu par chromatographie rapide (éluant : éther éthylique) (118 mg, 75 %).
RMN H1 (300 MHz, CDC13) : 5,48 (H31; dd; J2)3 = 10.1 Hz; J3)4= 8,17 Hz ); 5,38 (Hlιπ; d; J1)2 = 3,9 Hz); 5,37 (H3π; dd#t *; J3>4 = 8.32 Hz); 5,32 (H3m; dd; J3;4 = 9,61 Hz ); 5,25 (Hlu; d, J = 4,08 Hz); 4,98 (H4m; dd#t *, J3>4 = 9,04 ); 4,79 (Hl1; d, J ≈ 3,5 Hz); 4,79 (H2 ; dd; J2)3 = 10,4 Hz;); 4,72 (H21; dd; J2>3 = 10,1 Hz); 4,70 (H2π; dd; J2,3 = 10,5 Hz); 4,45; 4.41 (Hόa1; Hόa11; dd; J5j6a = 2,5 Hz; J6a,6b=12,24); 4,28; 4,19 (Hόb1; H6bπ; dd; J5;6b =3,5 et 3.2 Hz); 3,9 massif (H41; H4π; H51; H5π; H5m; 5H); 3,38 (CH3; s); 3,38 +/- 0,05 ppm massif (H6affl; H6bra); 2,13-1,94 (27 H, COCH3). (* dd ≠ t : doublet de doublet pratiquement triplé). RMN 13C (300 MHz, CDC13) : 171,2-168,7 (COCH3); 96,58 (Cl1); 95,57 - 95,42 (Clπ,
Clffl); 73,72 - 72,86 (C41, C4π); 72,56 (C31); 71,58 (C3π); 71,23 (C21); 70,53 (C4111);
70,34 - 70,12 (C2π, C2m); 69,09 - 69,04 - 68,98 - 67,52 (C51, C5π, C3ffl, C5m); 62,96 -
62,53 (C61, C6π); 55,27 (CH3); 31,15 (C6m); 21-20,38 (COCH3).
I, H et m se réfèrent aux unités glycosidiques représentées ci-dessus à la formule A5.
M.S. (FAB): m/z = 983 (M+Na)+
EXEMPLE 6
Préparation d'un pullulane modifié par condensation d'unités maltosyle au niveau des positions 4 des unités glycosidiques Etape a)
Du pullulane (50 mg) et du fluorure obtenu à l'exemple le) (63,4 mg : 1,5 éq.) sont mis en solution dans du tampon phosphate (5 ml; 0,1 M; pH = 7,0). De la cGTase (en quantité catalytique) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 2 heures à température ambiante. Une chromatographie sur couche mince (CH3CN 4 / H2O 1) révèle la conversion totale du fluorure. Le mélange réactionnel est précipité dans 200 ml d'éthanol (95%). Le précipité est récupéré par centrifugation et séché une nuit sous vide. On obtient ainsi 65 mg soit un taux de substitution d'environ 37 %. Etape b) Le polymère obtenu à l'étape précédente (21 mg) est dissous dans une solution d'acide chlorhydrique 10"2 M (2 ml). Le mélange réactionnel est agité 2 heures à température ambiante. Le mélange est ensuite neutralisé par ajout d'ammoniaque puis précipité dans l'éthanol. Après centrifugation le polymère est séché sous vide. On isole ainsi 15 mg. Le degré de substitution est déterminé par méthylation suivant la méthode Hakomori. Le polymère méthyle ainsi obtenu est hydrolyse en milieu acide. Les monosaccharides obtenus sont réduits puis acétylés. Le mélange obtenu est analysé en couplage chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse. Unités glycosylées: Aire de l-O-acétyl-2,3,4,6-tetra-O-méthylhexytol : 17190
Unités non-glycosylées: Aire de : l,6-di-O-acétyl-2,3,6-tri-O-méthylhexytol : 29163
Degré de substitution: 37% Les spectres RMN 1H des polymères des exemples 6a) et 6b) sont comparés avec celui du pullulan.
Spectre du pullulan : - HÎ αl4 (2 pics) : 5,27; 5,23 ppm; int* = 2;
Hι. αl6 : 4,83 ppm ; int = 1; - 3,9 - 3,4 ppm; massif; tout proton non cité: intégrale théorique : 18 intégrale mesurée : 18,5
Polymère de l'exemple 5a) : HÎ αl4 (2 pics) : 5,26; 5,24 ppm; int = 2,56; H\ αl6 (massif) : 4,83 ppm ; int = 1; 3,9 - 3,4 ppm; massif; tout proton non cité; 1,71-1,42 ppm; 2 pics, int = 1,66, groupe tétrahydropyranyle
Polymère de l'exemple 5b) : H1 l4 (2 pics) : 5,26; 5,24 ppm; int = 2,56; Hi. αl 6 (massif) : 4,83 ppm ; int = 1; 3,9 - 3,4 ppm; massif; tout proton non cité: 1, 71-1,42 ppm; 2 pics, int * = 1.66 résultat de l'intégration
EXEMPLE 7 a) Préparation du (2,3,6-tri-0-acétyl-4~0-tétrahydropyranyl-cc-D-glucopyranosyl)-
(l→ 4)-S-(2,3, 6-tri-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-2,3, 6-tri-O-acétyl-thio-a-D- glucopyranoside de triphénylméthyle
A une solution du fluorure El préparé à l'exemple le) (50 mg; 0,12 mmol) et du thio-α- D-glucopyranoside de triphénylméthyle (62 mg; 1,2 éq.) dans du tampon phosphate (3 ml; 0,1 M; pH=7,0), de la CGTase (207 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé à 40 °C pendant 2 heures, lyophilisé, repris dans un mélange pyridine / anhydride acétique (10 ml; 1/1; v/v) et une quantité catalytique de DMAP est ajouté. Le mélange est agité à 70°C pendant 12 heures, neutralisé à froid par ajout de méthanol à 0°C (5 ml) et évaporé. Le résidu est repris dans le dichlorométhane lavé à l'eau puis avec une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium. La phase organique est récupérée, séchée sur sulfate de sodium anhydre, évaporée et co-évaporée au toluène. Le mélange de diastéréoisomères est purifié par chromatographie rapide ( EP 1 / EtOAc 1) (127 mg;
86%).
S.M. haute résolution (ES+) : C60H72θ25NaS [M+Na Calculé : m/z = 1247,3981
Trouvé : m z = 1247,3989
RMN 13C (75 MHz, CDC13) : 170,69 - 170,59 - 170,32 - 169,78 - 169,49 - 169,39 - 169,32 - 169,20 (ÇOCH3); 144,35 (Cw aromatiques ); 129,79 - 127,80 - 126,94 (CH aromatiques) 101,14 - 100,67 (C acétalique du tétrahydropyrane R et S); 95,77 - 95,65 (Cl11, Cl111); 81,66 (Cl1); 76,58 - 75,28 - 73,93 - 73,57 - 72,59 - 72,42 - 71,78 - 71,56 - 70,36 - 70,26 - 69,79 - 69,60 - 69,25 - 68,76 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5 π, C2m, C3πι, C4m, C5πι, ÇPh3); 63,91 - 63,20 - 63,00 - 62,54 - 62,24 - 62,00 (C61, C6π, C6ffl, R et S , C tétrahydropyranyle R et S); 31,05 - 30,92 - 25,04 - 24,92 (2 C tétrahydropyranyle R et S); 20,85 - 20,75 - 20,66 - 20,51 - 20,46 (COÇH3); 20,16 - 19,53 (1 C tétrahydropyranyle R et S ).
b) Préparation du (2,3,4,6-Tétra-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-(2,3,6-tri- 0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-2,3,6-tri-0-acétyl-l-S-acétyl-l-thio-a-D- glucopyranose
A du composé A7 préparé à l'étape précédente (81 mg; 66,2 μmol) dissous dans du dichlorométhane (1,9 ml), sont additionnés du triéthylsilane (Et3SiH; 35,8 μl; 225 μmol) et de l'acide trifluoroacétique (1,2 ml). Le mélange est agité 45 minutes à température ambiante puis évaporé. Le résidu est repris dans de la pyridine anhydre (2 ml) et de ranhydride acétique (1,5 ml) ainsi qu'une quantité catalytique de DMAP sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité 12 heures à température ambiante puis neutralisé par ajout de méthanol (1,2 ml) à 0°C et évaporé. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (EP / EtOAc : 1-1,5) (45 mg; 69 %).
[ ]D : +183 (c = 0,27; Chloroforme)
S.M. haute résolution (ES+) : C40H54O26SNa [M+Na]+ Calculé : m/z = 1005,2522 Trouvé : m/z = 1005,2519
RMN 1H (400 MHz, CDC13) :
Déplacements chimiques Constantes de couplage
SCOÇH3 : 2,40
COÇH3 : 2,14 - 2,12 - 2,11 - 2,06 - 2,02 - 2,00 - 1,99 - 1,97 - 1,96
RMN 1 "3C (100 MHz, CDC13)
Déplacements chimiques
SÇOCH3 : 191,51 SCOÇH3 : 31,24 ÇOCH3 : 170,3-169,2 COÇ_H3 : 20,41
EXEMPLE 8 a) Préparation du (2,3,4,6-Tétra-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-(2,3,6-tri- 0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-(2,3-di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy-a-D- glucopyranosyl)-(l→ 4)-l,2,3, 6-tétra-O-acétyl-D-glucopyranose
Du fluorure El préparé à l'exemple le) (250 mg; 0,58 mmol) et du 6-bromo-6-déoxy-α- D-glucopyranosyl-D-glucopyranose (235 mg; 1 éq.) sont dissous dans du tampon phosphate (25 ml; 0,1 M; pH=7,0). De la CGTase (750 μl) est ajoutée et mélange réactionnel est incubé 1 heure à 40 °C puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH ≈ 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque puis lyophilisée. Le lyophilisât est dissous dans la pyridine anhydre (30 ml), de anhydride acétique (20 ml) et du DMAP (< lmg) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à 70°C pendant 12 heures puis ranhydride en excès est neutralisée par ajout à de méthanol (20 ml) à 0°C. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au dichlorométhane, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au dichlorométhane (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur sulfate de potassium anhydre et évaporées. Le mélange anomère attendu est purifié par chromatographie rapide (EP / EtOAc : 3-4) (521 mg, 70%).
S.M. (Fab+) : m/z = 1299 [M+Naf
Analyses élémentaires pour C24H33BrO16 : Calculée : C 47,07 ; H 5,29 ; Br 6,26
Trouvée : C 47,25 ; H 5,52 ; Br 6,34
RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K) : 6,62 (HlIα; d, Jlj2= 3,7 Hz); 5,69 (HlIβ; d, J1>2= 8,0 Hz); 6,01-3,70 (H sucre); 2,15-1,93 (39 H COCH3). RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,56 - 170,45 - 170,34 - 169,88 (ÇOCH3); 96,01 -95,64 (Clπ, Clm, Cl^); 91,21 (ClIβ); 88,81 (ClIα); 75,1 - 74,56 - 73,63 - 73,51 - 72,89 - 72,40 - 72,15 - 71,73 - 70,99 - 70,40 - 70,15 - 69,97 - 69,71 - 69,39 - 69,18 - 68,96 - 68,47 - 68,01 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5 π, C2ιπ, C3m, C4m, C5 m, C2IV, 03 , C4W, 05 ); 62,72 - 61,38 33,38 (C6π); 20,77 - 20,48 (COÇH3).
EXEMPLE 9 a) Préparation du a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-[a-D- glucopyranosyl-(l→4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-S-a-D-glucopyranosyl-(l→ 6)]-6- thio- -D-glucopyranosyl-(l→ 4)-D-glucopyranose
Du S-α-D-glucopyranosyl-(l→ 6)-6-thio-α-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-D-glucopyranose (34,2 mg; 65,7 μmol) et du fluorure El préparé à l'exemple le) (94 mg; 4 éq.) sont dissous dans du tampon phosphate (4,6 ml; 0,1 M; pH=7,0). De la CGTase (141 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 2 heures à température ambiante puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH ≈ 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'une solution d'hydrogenocarbonate de sodium saturée puis lyophilisée. Le mélange est purifié sur colonne C.L.H.P. (colonne NH2; éluant : CH3CN 55 H2O 45) deux fractions sont récupérées FI et F2. La fraction FI est dissoute dans l'eau (10 ml) et de la résine acide (DOWEX 50 W x 8) est ajouté. Le mélange est agité 8 heures à température ambiante puis filtré. La phase aqueuse est lavée avec de l'acétate d'éthyle (3x) et réunie avec la fraction F2. Une lyophilisation permet d'obtenir le composé attendu (51 mg; 66%). S.M. haute résolution (ES+) : C42H72O35NaS [M+Na : Calculé : m/z = 1191,3473
Trouvé : m/z = 1191,3473
RMN 13C (100 MHz, D2O) : 100-99,65 (Clπ, Clm, Cl™, C1VI, Clvπ); 96,21 (ClIβ); 92,27 (ClIα); 85,69 (CVα'β); 80,44 - 77,72 - 77,53 - 77,40 - 77,19 - 77,04 - 76,59 - 74,99 - 74,41 - 74,26 - 73,67 - 73,40 - 73,24 - 73,08 - 72,12 - 71,89 - 71,74 - 71,58 - 71,26 - 71,17 - 70,47 - 69,68 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5 π, C2m, C3m, C4ffl, C5 m, C2™, C3™, C4™, C5™, C2V, C3V, C4V, C5V, C2VI, C3VI, C4VI, C5VI, C2vπ, C3vπ, C4vπ, C5vπ); 61,42-61 (C61, C6m, C6™, C6V, Cό^, C6vπ); 31,05 (C6π).
EXEMPLE 10 a) (2,3,4,6-Tétra-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-(2,3,6-tri-0-acétyl- -D- glucopyranosyl)-(l→ 4)-(2,3-di-0~acétyl-a-D-glucopyranosyl-6-bromo-6-désoxy-)- (l→ 4)-(2,3,6-tri-0-acétyl- -D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-2,3,6-tri-0-acétyl-a-D- glucopyranoside de méthyle
Du composé D4 préparé à l'exemple 4d) (100 mg; 0,20 mmol) et de α-D- glucopyrannoside de méthyle (43,5 mg; 1,1 éq.) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (3,7 ml; 0,1 M; pH=7,0). De la CGTase (130 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 15 heures à 40 °C puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH ≈ 2 et agité pendant 20 minutes à température de la pièce. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque et du fluorure El, préparé à l'exemple le) (112 mg; 1,3 éq) en solution dans le tampon (1 ml) ainsi que de la CGTase (129 μl) sont ajoutés. Le mélange est incubé 2 heures à température ambiante puis chauffé 5 minutes à 100°C. L'enzyme est filtrée sur coton. Le filtrat est acidifié par ajout d'acide chlorhydrique jusqu'à pH ≈ 2 et agité pendant 20 minutes. La solution est alors neutralisée par ajout d'ammoniaque. Le lyophilisât est dissous dans la pyndine anhydre (20 ml), de anhydride acétique (10 ml) et du DMAP (< lmg) sont ajoutés. Le mélange réactionnel est agité à 70°C pendant 12 heures puis l'anhydride en excès est neutralisée par ajout à de méthanol (10 ml) à 0°C. Le mélange réactionnel est concentré sur évaporateur rotatif, repris au CH2C12, lavé à l'eau puis avec une solution de NaHCO3 saturée. Les phases aqueuses sont extraites au CH2C12 (3 fois). Les phases organiques sont réunies, séchées sur Na2SO4 et évaporées. Une puπfication par chromatographie rapide (Et2O puis Et2O 10 Acétone 1) permet d'obtenir le composé A10 (161 mg; 52%).
[α]D : +105 (c = 0,25, Chloroforme)
S.M. haute résolution (ES+) : C61H83BrO40Na [M+Na]+ Calculé : m/z = 1557,3542 Trouvé : m/z ≈ 1557,3542
RMN 1H (400 MHz, CDC13) : Déplacements chimiques Constantes de couplage
a : Protons dégénérés; *: Indétermination entre les deux unités sucre OCH3 : 3,41 COCH3 : 2,17 - 2,16 - 2,14 - 2,07 - 2,07 - 2,04 - 2,02 - 2,01 - 2,00 - 1,98 - 1,97 - 1,96
RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 170,45-169,56 (ÇOCH3); 96,58 - 95,87 - 95,65 - 95,53 (Cl1, Cl11, Clm, Cl™, Clv); 74,18 - 76,79 - 73,67 - 72,64 - 72,34 - 71,73 - 71,26 - 70,36 - 69,97 - 69,40 - 69,11 - 68,94 - 68,77 - 68,45 - 67,98 - 67,54 (C21, C31, C41, C51,
C2π, C3π, C4π, C5π, C2m, C3m, C4m, C5 m, C2™, C3™, C4™, C5™, C2V, C3V, C4V, C5V);
63,00 - 62,71 - 62,56 - 61,36 (C61, C6π, C6™, C6V); 55,33 (OÇH3); 33,45 (C6m); 20,83 -
20,51 (COÇH3).
EXEMPLE 11 a) Préparation du 2,3,6-Tri-0-acétyl-a-D-galactopyranosyl-(l→ 4)- 1,2,3, 6-tétra-β- D-glucopyranose
Du composé Bl, préparé à l'exemple lb) (202 g; 0,32 mmol) est dissous dans du dichlorométhane anhydre (8,6 ml) et de la pyridine (860 μl) est ajoutée. La réaction est refroidis à 0°C et de anhydride triflique (143 μl) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité pendant 30 minutes et lavé à froid avec : de l'eau, une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium et avec une solution acide d'hydrogénosulfate de potassium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le résidu est repris dans du diméthylformamide distillé (12 ml) et du nitrite de tétrabutylammonium est jouté (922 mg). Le mélange réactionnel est agité pendant 12 heures à température ambiante, dilué avec de l'acétate d'éthyle puis lavé successivement avec une solution de chlorure de sodium saturée et à l'eau. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (1. EtOAc 1 EPI; 2. EtOAc 1,5 EP 1) (192 mg; 95%).
[α]D : +73,3 (c = 1; Chloroforme)
S.M. haute résolution (ES+) : C26H36O18Na [M+Na] η + Calculé : m/z = 659,1799
Trouvé : m/z = 659,1813 S.M. haute résolution (ES+) : C26H36O18K [M+K]+ Calculé : m/z = 675,1539 Trouvé : m/z = 675, 1542 RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K): 5,70 (Hl1; d; J1>2 = 8,2 Hz); 5,38 (Hlπ; d; J = 3,6
Hz); 5,38 (Hlπ; J1;2 = 3,7 Hz); 5,24 (H31; dd ≈ t; J2;3 ≈ J3>4 ≈ 9,3 Hz); 5,18 (H3π; H2π; dq);
4,94 (H21; dd * t; J2)3 ≈ 9,3 Hz); 4,45 (Hόa1; dd; J5;6a = 2,4 Hz; J6a,6b ≈ 12,2 Hz); 4,31
(Hδa11; dd; J5,6a = 6,76 Hz; J6a,6b ≈ 11,3 Hz); 4,15 (Hόb1; dd; J5;6b = 5,11 Hz); 4,11 (H6bπ; dd; J5;6b = 3,66 Hz); 4,07 (H4π; m); 3,99 (H41; dd; J4>5 = 8,59 Hz); 3,96 (H5π; m); 3,78
(H51; m); 2,08 - 2,07 - 2,06 - 2,02 - 1,98 - 1,97 (CHsCO; s; fritg = 21 H).
RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K):128 170,84 - 170,69 - 170,39 - 170,03 - 169,78 - 169,54 - 168,75 (ÇOCH3); 96,26 (Cl11); 91,26 (Cl1); 75,26 - 73,25 - 72,20 - 70,97 - 69,13 - 68,64 - 67,34 - 67,17 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C511); 62,71 - 62,29 (C61, C6π); 20,75 - 20,71 - 20,65 - 20,61 - 20,44 (COÇH3).
b) Préparation du 4-Azido-4-désoxy-2,3,6-tri-0-acétyl-cc-D-glucopyranosyl-(l→ 4)- 1,2,3,6-tétra-O-acétyl-β-D-glucopyranose
Le composé Ail, préparé à l'exemple lia) (110 mg; 0,17 mmol) est dissous dans du dichlorométhane anhydre (4 ml) et de la pyridine (400 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est refroidi à — 15°C est de ranhydride triflique (70 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est agité 30 minutes à — 15°C puis 2 heures à température ambiante. Le mélange est alors lavé à froid avec : de l'eau, une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium et avec une solution acide d'hydrogénosulfate de potassium. La phase organique est séchée sur sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le résidus est repris dans du diméthylformamide distillé (0,9 ml) et de l'azoture de sodium (64 mg) est ajouté. Le mélange réactionnel est agité à température ambiante pendant 12 heures puis dilué avec de l'acétate d'éthyle, lavé à l'eau, séché sur sulfate de sodium anhydre et évaporé. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (EtOAc / EP : 4-1) (102 mg; 91%).
[α]D : +181 (c = 1; Chloroforme) S.M. haute résolution (ES+) : C26H35N3O17Na [M+Na]+ Calculé : m/z = 684,1864
Trouvé : m/z = 684,1863 S.M. haute résolution (ES+) : C26H35N3O17K [M+K]+ : Calculé : m/z = 700,1604 Trouvé : m/z = 700,1591
RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K): 5,70 (Hl1; d; J1;2 = 7,8 Hz); 5,32 (H3π; dd ≈ t; J3ι4 = 9,7 Hz); 5,31 (Hlπ; d) ; 5,25 (H31; dd * t; J2)3 = 8,2 Hz) ; 4,93 (EE1; dd « t; J2;3 = 9,5 Hz); 4,77 (H2π; dd; J = 3,8 Hz; J2)3 = 10,4 Hz); 4,40 (H6a*; dd; J5;6a = 3 Hz; J6a,6b = 12,2 Hz); 4,30 (H6a*; dd; J5>6a = 2,1 Hz; J6a,6b = 12,2 Hz) ; 4,19 (H6b*; dd; J5,6b = 3,66 Hz); 4,15 (H6b*; dd; J5)6b = 4,38 Hz); 3,95 (H41; dd; J4;5 = 10,1 Hz); 3,79 (H51; m) ; 3,70 (H5π, m); 3,56 (H4π; dd ≈ t; J4;5 = 10,4 Hz); 2,08 - 2,07 - 2,06 - 2,02 - 1,98 - 1,97 (CH3CO; s; intg = 18 H). * : indétermination entre l'unité I et H.
RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,67 - 170,32 - 169,91 - 169,56 - 169,41 - 168,70 (ÇOCH3); 95,97 (Cl11); 91,26 (Cl1); 75,16 - 73,05 - 72,71 - 70,92 - 70,16 - 69,94 - 68,98 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C5π); 62,46 - 62,32 (C61, C6π); 60,04 (C4π); 20,73 - 20,58 - 20,48 (COÇH3).
c) Préparation du Fluorure de 4-Azido-4-désoxy-2,3,6-tri-0-acétyl-a-D- glucopyranosyl-(l→ 4)-2,3, 6-tri-O-acétyl-a-D-glucopyranosyle
La réaction s'effectue à 0°C dans un récipient en plastique.
Du composé Bll préparé à l'exemple 11b) (100 mg, 0,15 mmol) est dissous dans une solution de fluorure d'hydrogène dans la pyridine (7:3; v/v; 3 ml). Après une demi-heure d'agitation, le mélange réactionnel est dilué au dichlorométhane puis versé sur une solution glacée d'ammoniaque 3M. Après décantation la phase organique est lavée deux fois avec une solution saturée d'hydrogenocarbonate de sodium glacée. La phase organique est ensuite séchée sur sulfate de sodium anhydre puis évaporée à l'aide d'un évaporateur rotatif.
Une chromatographie rapide (EtOAc / EP : 1-1) utilisant un gel de silice préalablement neutralisé par de la triéthylamine permet d'obtenir le fluorure attendu (71 mg; 75%).
[α]D : +112 (c = 0,3; Chloroforme)
S.M. haute résolution (ES+) : C24H32FN3O15Na [M+Na] + Calculé : m/z = 644,1715
Trouvé : m/z = 644,1720
S.M. haute résolution (ES+) : C2 H32FN3O15K [M+K]+ : Calculé : m/z = 660,1455 Trouvé : m/z = 660,1470
RMN 1H (300 MHz, CDC13, 303°K): 5,61 (Hl1; dd; J1;2 = 2,7 Hz; J1;F = 53,2 Hz); 5,50 (H31; dd; J2j3 = 10,1 Hz; J3)4 = 9,0 Hz); 5,35 (Hlπ; d); 5,33 (H3π; dd ≈ t; J3,4 = 9,9 Hz); 4,80 (H21; ddd; J2;F = 26,7 Hz); 4,78 (H2π; dd; J1)2 = 4,0 Hz; J2>3 = 10,4 Hz); 4,40 (Hόa1; dd; J5>6a = 2,2 Hz; J6a,6b = 12,4 Hz); 4,31 (H6aπ; dd; J5;6a = 2,2 Hz; J6a,6b = 12,4 Hz); 4,21 (H6bπ, J5,6b = 3,5 Hz); 4,16 (Hόb1; J5)6b = 3,8 Hz); 4,13 (H51; m); 3,95 (H41; dd ≈ t; J4>5 = 9,7 Hz); 3,70 (H5π; m); 3,58 (H4π; dd ≈ t; J4>5 = 10,4 Hz); 2,12 - 2,10 - 2,07 - 2,04 - 1,99 (CH3CO; S; intg = 18 H).
RMN 13C (75 MHz, CDC13, 303°K) : 170,23 - 170,03 - 169,59 - 169,42 (ÇOCH3); 103,56 (Cl1; d, JC;F = 229,3 Hz); 95,89 (Clπ); 71,88 - 71,71 - 70,70 - 70,38 - 70,28 - 70,23 - 70,16 - 69,89 - 69,01 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C5π); 62,22 - 61,98 (C61, C6π); 60,0 (C4π); 20,80 - 20,70 - 20,53 - 20,43 (COÇH3).
d) Préparation du Fluorure de 4-Azido-4-désoxy-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D- glucopyranosyle
Du composé Cil, préparé à l'étape précédente (34 mg; 51,5 μmol) est dissous dans du méthanol (10 ml). Une solution de méthanolate de sodium dans le méthanol (IM; 100 μl) est ajoutée. Après 4 heures d'agitation à température ambiante le mélange réactionnel est refroidi à 0°C puis neutralisé avec de la résine Amberlite IRN 120 HT1". Après filtration le composé est concentré, repris dans l'eau et lyophilisé (19 mg; 100 %). Ce composé est utilisé sans autre purification.
[α]D : +154 (c = 0,87; eau)
10
S.M. haute résolution (ES+) : C12H20FN3O9Na [M+Naf : Calculé : m/z = 392,1081 Trouvé : m/z = 392,1081
15 RMN 1H (400 MHz, D2O):
Déplacements chimiques Constantes de couplage
RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 107,46 (Cl1; d, JC)F = 229,4 Hz); 100,14 (Clπ); 76,02 - 73,19 - 72,94 - 72,30 - 71,97 - 71,55 - 71,33 - 71,09 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, 0 C5π); 61,90 - 60,97 (C61, C6π); 60,34 (C4π).
EXEMPLE 12 a) Préparation du (2,3,6-Tri-0-acétyl-4-azido-4-désoxy-a-D-glucopyranosyl)- (l→ 4)-(2,3,6-tri-0-acétyl-a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-(di-0-acétyl-6-bromo-6-désoxy- 5 a-D-glucopyranosyl)-(l→ 4)-l,2,3, 6-tétra-O-acétyl-D-glucopyranose
Du fluorure DU, préparé à l'exemple lld) (90,9 mg; 0,25 mmol) et du 6-bromo-6- désoxy-α-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-D-glucopyranose (90,9 mg; 0,22 mmol) sont dissous dans une solution de tampon phosphate (0,1 M; pH = 7; 9 ml) et de la CGTase (270 μl) est ajoutée. Le mélange réactionnel est incubé 3 heures à température ambiante puis lyophilisé. Le solide est repris dans de la pyridine distillée (10 ml) et de ranhydride acétique est ajouté (10 ml) ainsi qu'une quantité catalytique de 4,4-diméthylaminopyridme (DMAP; ≈ 1 mg). La réaction est agitée 12 heures à 70 °C puis le milieu réactionnel est refroidi et ranhydride en excès est détruit par addition lente de méthanol à 0°C (5 ml). Le mélange est agité 20 minutes à température ambiante puis concentré. Le résidu est repris au dichlorométhane, lavé avec une solution d'hydrogénosulfate de potassium, une solution d'hydrogéno-carbonate de sodium et de l'eau. La phase organique est récupérée, séchée sur du sulfate de sodium anhydre et évaporée à sec. Le composé attendu est purifié par chromatographie rapide (Et2O) (200 mg; 71 %).
S.M. haute résolution (ES+) : C48H64BrN3O31Na [M+Na Calculé : m/z = 1089,3234 Trouvé : m/z = 1089,3233
RMN 1H (400 MHz, CDC13):
Déplacements chimiques Constantes de couplage
CH3CO : 2,20 - 2,14 - 2,13 - 2,11 - 2,08 - 2,04 - 2,01 - 2,00 - 1,99 - 1,98 - 1,96.
RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 170,82 - 170,56 - 170,36 - 169,99 - 169,53 (ÇOCH3); 96,01 - 95,84 - 95,56 (Cl11, Cl , Cl ); 91,21 (ClIβ); 88,82 (ClIα); 75,17 - 74,42 - 73.54 - 73.34 - 72,93 - 72,40 - 72,17 - 71,69 - 71,10 - 70,97 - 70,33 - 70,14 - 70,00 - 69,73 - 69,17 - 68,87 (C21, C31, C41, C51, C2π, C3π, C4π, C5π, C2m, C3m, C4 , C5m, 02™, 03™, C5™); 62,57 - 62.21 (C61, C6ffl, C6™); 59,99 (C4™), 33,44 (C6π); 20,84 - 20,53 (COÇH3).
EXEMPLE 13 a) Préparation du 4-Azido-4-désoxy-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D- glucopyranosyl-(l→ 4)- -D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-D- glucopyranose
Du fluorure DU, préparé à l'exemple lld) (10 mg; 27,1 μmol) est dissous dans du tampon phosphate (50 mM; pH = 7; 95 μl) et du méthanol (156 μl) ainsi que de l'a- amylase d'Aspergillus oryzae en solution dans le tampon (54 U; 51 μl) sont ajoutés. Le mélange est incubé à température de la pièce pendant 2 heures puis chauffé à 100 °C pendant 5 minutes et filtré. Le mélange est concentré et co-évaporé à l'eau. Le composé attendu est purifié sur Sep-pack Cl 8® (15 mg; 65%).
S.M. haute résolution (ES+) : C30H5ιN3O25Na [M+Na Calculé : m/z = 876,2709 Trouvé : m/z = 876,2713 RMN 1H (300 MHz, D2O, 303°K): 5,30-5,25 (Hlπ, Hlffl, Hl™, Hlv; m); 5,10 (HlIα; d; 3,7 Hz); 4,35 (HlIβ; d; 8,0 Hz); 3,87-3,42 (H2Iα H2π, H2ra, H2™, H2V, H3ÏH3π, H3m, H3™, H3V, H4ÎH4π, H4m, H4™, H5ÎH5π, H5m, H5™, H5V, H6a^H6aπ, H6affl, Hόa™, H6av, H6b|H6bπ, H6bffl, H6b™, H6bv; m); 3,15 (H2Iβ.;dd; J2,3 = 9,1 Hz; 3,32 (H4V; dd ≈ t; J = 9,7 Hz).
b) Préparation du 4-Amino-4-désoxy-a-D~glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D- glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)-D- glucopyranose
Du sulfure d'hydrogène est mis à buller pendant 30 minutes dans un mélange pyridine / eau (1:1; 3 ml) contenant le composé A13 (15 mg; 17,6 μmol). Le ballon est ensuite fermé hermétiquement et le milieu réactionnel est agité pendant 12 heures à température ambiante puis filtré, concentré et co-évaporé à l'eau. Le composé attendu est purifié sur Sep-pak Cl 8® et lyophilisé (14 mg; 96 %).
S.M. haute résolution (ES+) : C30H5 NO25 [M+Hp Calculé : m/z = 828,2983 Trouvé : m/z = 828,2985
RMN 1H (300 MHz, D2O, 303°K): 5,32-5,26 (Hlπ, Hlm, Hl™, Hlv; m); 5,10 (HlIα; d; 3,56 Hz); 4,52 (HlIβ; d; 8,0 Hz); 3,86-3,41 (H2Iα H2π, H2ffl, H2™, H2V, H3!H3π, H3m, H3™, H3V, H4ÏH411, H4ffl, H4™, H51H5π, H5ffl, H5™, H5V, Hôa^Hόa11, H6am, Hόa™, H6av, H6bÏH6bπ, H6bm, H6b™, H6bv; m); 3,14 (H2Iβ ; dd; J2,3 = 9,4 Hz; 2,89 (H4V; dd ≈ t; J = 9,7 Hz). RMN 13C (100 MHz, CDC13) : 100,20 - 99,95 (Clπ, Clra, Cl™, Clv); 96,14 (ClIβ); 92,27
(ClIα); 77,32 - 77,18 - 77,05 - 76,55 (C41 ,C4π, C4m, C4™); 74,91 - 74,38 - 73,67 -
73,57 - 72,29 - 71,91 - 71,83 - 71,66 - 71,52 - 70,30 (C21, C31, C51, C2π, C3π, C5π,
C2m, C3 , C5m, C2™, C3™, C5™, C2V, C3V, C4V, C5V); 61,01 - 60,80 (C61, C6π, C6m,
C6™, C6V); 52,59 (C41).
c) Préparation du 4-Désoxy-4-(6-nitrovératryloxycarbonylamino)-a-D- glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D-glucopyranosyl-(l→ 4)- -D-glucopyranosyl-(l→ 4)-a-D- glucopyranosyl-(l→ 4)-D-glucopyranose
A du composé B13, préparé à l'exemple 13b) (10 mg; 12.1 μmol) dissous dans du DMF anhydre (300 μl) est ajouté de la pyridine (5 μl). Le mélange est refroidis à 0 °C et du chloroformate de 6-nitroveratryle (3,2 mg; 1 éq.) ainsi qu'une quantité catalytique de DMAP sont ajoutés. Le mélange est agité 4 heures à température ambiante et du chloroformate (3,2 mg) est ajouté. Le mélange réactionnel est chauffé à 70 °C pendant 12 heures et du chloroformate (3,2 mg) est ajouté. Le mélange est alors chauffé 4 heures à 100 °C et refroidis à 0 °C. De l'acétone (3 ml) est ajouté et le précipité formé est filtré, dissous dans l'eau, purifié sur Sep-pack Cl 8® et lyophilisé (9 mg; 70 %).
S.M. haute résolution (ES+) : C40H62N2O3ιNa [M+Na Calculé : m/z = 1089,3234 Trouvé : m/z = 1089,3233

Claims

REVENDICATIONS 1 - Disaccharide de formule I :
dérivé du fluorure de α-maltosyle, dans lequel :
R1 et R2, identiques ou différents, représentent un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par un atome d'azote, un atonie d'oxygène, un atome de soufre ou un atonie d'halogène, ou bien R1 et R2 forment ensemble un groupement fonctionnel organique, éventuellement protégé, rattaché à l'unité glycosidique par deux atomes choisis parmi les atomes d'oxygène, de soufre et d'azote, étant entendu que R1 ne représente pas un groupe hydroxyle.
2. Disaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R2 représente hydroxyle.
3. Disaccharide selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le groupement fonctionnel organique éventuellement protégé rattaché à l'unité glycosidique par un atome d'halogène, un atome d'oxygène, de soufre ou un atome d'azote est choisi parmi un atome de chlore, un atome de brome, un atome d'iode, un groupe acétal, un groupe hémiacétal, un groupe ester, un groupe éther, un groupe sulfonate, un groupe carbamate, un groupe carbonate, un groupe aminé, un groupe amide, un groupe azide, un groupe urée, un groupe thioacétate, un groupe disulfure, un groupe thiourée^ ou l'un quelconque de ces groupes sous forme protégée, étant entendu que R2 peut représenter en outre un atonie de fluor.
4. Disaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 et R2 forment ensemble un groupe protecteur de fonction diol tel qu'un groupe alkylidènedioxy éventuellement substitué par aryle.
5. Disaccharide selon la revendication 4, caractérisé en ce que R1 et R2 forment ensemble un groupe O-isopropylidène ou O-benzylidène.
6. Disaccharide selon la revendication 2, caractérisé en ce que R1 représente 2-tétrahydropyranyle et, de préférence R2 représente OH.
7. Disaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente 2-tétrahydropyranyle et R2 représente halogène tel que bromo.
8. Disaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 et R2 représentent indépendamment -N3 ou amino éventuellement substitué.
9. Disaccharide selon la revendication 1, caractérisé en ce que R1 représente azido ou amino éventuellement substitué et R2 représente OH.
10. Utilisation d'un disaccharide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9, comme donneur de glycosyle dans les réactions :
- de transglycosylations catalysées par des glycoside-hydrolases ;
- de transferts catalysés par des trans-glycosylases.
11. Utilisation selon la revendication 10, caractérisée en ce que la glycoside-hydrolase appartient à la famille 13 des glycoside-hydrolases.
12. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 ou 11, caractérisée en ce que la glycoside-hydrolase est une cyclodextrine glycosyltransférase.
13. Utilisation selon l'une quelconque des revendications 10 à 12, pour la préparation d'oligosaccharides ou de polysaccharides et impliquant une ou plusieurs réactions de condensation entre l'unité de type maltosyle d'un disaccharide selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 et l'unité pyranosyle d'un accepteur de glycosyle.
14. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que l'accepteur de glycosyle est le pullulane.
15. Utilisation selon la revendication 13, caractérisée en ce que chaque réaction de condensation résulte de la réaction d'un hydroxyle d'une unité pyranosyle non réductrice de l'accepteur de glycosyle avec l'unité de type maltosyle, de préférence avec le carbone anomère de l'unité maltosyle portant l'atome de fluor.
16. Procédé pour la préparation d'oligosaccharides ou de polysaccharides comprenant la réaction d'au moins un disaccharide de formule I selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 avec un accepteur de glycosyle, en présence d'une enzyme de type glycoside-hydrolase ou de type transglycosylase.
17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que la glycoside- hydrolase appartient à la famille 13 des glycoside-hydrolases.
18. Procédé selon la revendication 17, caractérisé en ce que la glycoside- hydrolase est une cyclodextrine glycosyl-transférase.
19. Procédé selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, caractérisé en ce que l'accepteur de glycosyle présente en extrémité non réductrice une unité pyranosyle présentant au moins une fonction susceptible de réagir avec ledit disaccharide de formule I.
20. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que l'accepteur de glycosyle est le pullulane.
21. Procédé selon la revendication 19, caractérisé en ce que la fonction réagissante de l'unité pyranosyle est une fonction hydroxyle en position 2, 3, 4 ou
6, de préférence en position 4.
22. Vecteur utilisable en thérapie génique résultant de la condensation d'un polysaccharide constitué d'un enchaînement linéaire ou ramifié d'unités glycopyranosyle avec un ou plusieurs disaccharides de formule I tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 à 9, ladite condensation impliquant la réaction d'une ou plusieurs fonctions hydroxyle en position 4 des unités glycopyranosyle dudit polysaccharide avec un carbone anomère portant l'atome de fluor desdit disaccharides de formule I.
23. Vecteur selon la revendication 22, caractérisé en ce que ledit polysaccharide est le pullulane.
24. Vecteur selon la revendication 22 ou 23, caractérisé en ce que le disaccharide de formule I est tel que R1 = NH2 ou azido et R2 = OH ; ou bien R1,
R2 représentent indépendamment NH2 ou azido.
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