EP1404879A2 - Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung durch vergleichende analyse der einzelstränge von amplifikaten - Google Patents

Verfahren zum nachweis von cytosin-methylierung durch vergleichende analyse der einzelstränge von amplifikaten

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Publication number
EP1404879A2
EP1404879A2 EP02754310A EP02754310A EP1404879A2 EP 1404879 A2 EP1404879 A2 EP 1404879A2 EP 02754310 A EP02754310 A EP 02754310A EP 02754310 A EP02754310 A EP 02754310A EP 1404879 A2 EP1404879 A2 EP 1404879A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
bisulfite
methylation
strands
malfunction
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02754310A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Jürgen Distler
Erik Leu
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Epigenomics AG
Original Assignee
Epigenomics AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Epigenomics AG filed Critical Epigenomics AG
Publication of EP1404879A2 publication Critical patent/EP1404879A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6858—Allele-specific amplification

Definitions

  • the present invention relates to a method for the detection of cytosine methylation in DNA samples.
  • 5-Methylcytosine is the most common covalently modified base in the DNA of eukaryotic cells. For example, it plays a role in the regulation of transcription, in genetic imprinting and in tumorigenesis. The identification of 5-methylcytosine as a component of genetic information is therefore of considerable interest. However, 5-methylcytosine positions cannot be identified by sequencing since 5-methylcytosine has the same base pairing behavior as cytosine. In addition, in the case of PCR amplification, the epigenetic information which the 5-methylcytosins carry is completely lost.
  • Hybridization behavior from cytosine can not be distinguished, now by "normal" molecular biological techniques as the only remaining cytosine can be detected, for example by amplification and hybridization or sequencing. All of these techniques are based on base pairing, which is now being fully exploited
  • Sensitivity is defined by a process that includes the DNA to be examined in an agarose matrix, thereby preventing the diffusion and renaturation of the DNA (bisulfite only reacts on single-stranded DNA) and replacing all precipitation and purification steps with rapid dialysis (Olek A , Oswald J, Walter J. A modified and i - proved method for bisulphite based cytosine methylation analysis.
  • Urea improves the efficiency of bisulfite treatment before the sequencing of 5-methylcytosine in genomic DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate-ediated sequencing of 5'-methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21): 5009-10).
  • methylation-sensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sei US A. Sep 3; 93 (18): 9821-6).
  • Primers are used for this process, which either which only hybridize to a sequence which arises from the bisulfite treatment of a DNA which is unmethylated at the position in question, or vice versa primer which only binds to a nucleic acid which is treated by the bisulfite treatment of one at the position in question unethylated DNA is formed. With these primers, amplicons can accordingly be generated, the detection of which in turn provides evidence of the presence of a methylated or unmethylated position in the sample to which the primers bind.
  • a newer method is also the detection of cytosine methylation by means of a Taqman PCR, which has become known as MethylLight (WO00 / 70090). With this method, it is possible to detect the methylation status of individual or fewer positions directly in the course of the PCR, so that a subsequent analysis of the products is unnecessary.
  • the state of the art is again a method developed by Epigenomics, which amplifies the DNA to be examined and background DNA after bisulfite treatment in the same way and then examines the former CpG positions contained in the fragment by hybridization techniques, alternatively by means of mini-sequencing or other common methods.
  • This has the advantage that one obtains a quantitative picture with regard to the examined methylation positions, i. H. the degree of methylation of a large number of positions is determined.
  • B. allows a very precise classification for solid tumors.
  • Primer oligonucleotides labeled with fluorescence have been used in many cases for the labeling of amplificates.
  • the simple application of Cy3 and Cy5 dyes to the 5 '- is particularly suitable for fluorescent labels. End of each primer.
  • the dyes Cy3 and Cy5, among many others, are commercially available.
  • Matrix-assisted laser desorption / ionization mass spectrometry is a very powerful development for the analysis of biomolecules (Karas M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of proteins with olecular masses exceeding 10,000 daltons. ANAL Chem. 1988 Oct. 15; 60 (20): 2299-301).
  • An analyte is embedded in a light-absorbing matrix. The matrix is evaporated by a short laser pulse and the analyte molecule is thus transported unfragmented into the gas phase. The ionization of the analyte is achieved by collisions with matrix molecules.
  • An applied voltage accelerates the ions into a field-free flight tube. Due to their different masses, ions are accelerated to different extents. Smaller ions reach the detector earlier than larger ones.
  • MALDI-TOF spectroscopy is excellently suited for the analysis of peptides and proteins.
  • the analysis of nucleic acids is somewhat more difficult (Gut, IG and Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry. Molecular Biology: Current Innovations and Future Trends 1: 147-157.)
  • the sensitivity is about 100 times worse than for peptides and decreases disproportionately with increasing fragment size.
  • nucleic acids that have a backbone that is often negatively charged the ionization process through the matrix is much more inefficient.
  • MALDI-TOF spectroscopy the choice of the matrix plays an eminently important role.
  • Genomic DNA is obtained by standard methods from DNA from cell, tissue or other test samples. This standard methodology can be found in references such as
  • nested PCR which is used, among other things, to detect particularly small amounts of DNA.
  • This type of PCR consists of two successive amplifications, the primers of the second amplification being within the first amplification and not with the primers of the first amplification. cation are identical. This achieves a special specificity, since the primers of the second amplification only work if the intended fragment was generated in the first amplification. In contrast, the multiplication of possible by-products of the first amplification in the second is almost impossible.
  • the present invention is intended to provide a method which, after the bisulfite treatment and amplification with intrusion used in molecular biological laboratories, such as capillary gel electrophoresis or HPLC, allows a direct methylation analysis to be carried out in the entire fragment without further steps.
  • the method dispenses with the analysis of certain individual positions, but analyzes the extent of methylation in the fragments examined.
  • the present invention is based on the knowledge that the base composition of the DNA changes in the bisulfite treatment and in the subsequent amplification in a characteristic manner and that an analysis method for the detection of cytosine methylation can be derived from this alone. Becomes a genomic DNA
  • Strands differ the more the lower the degree of methylation in the amplified section of the genomic DNA sample.
  • a conversion of the cytosine in one strand into ultimately thymidine leads to an increase in the mass by 15 Da each, while on the complementary strand, by replacing guanine with adenine, the molecular mass is reduced by 16 Da. It follows that the conversion of each additional cytosine into ultimately thymine results in an additional mass difference of 31 Da between the two complementary strands of the amplificate.
  • the present invention now uses several methods in order to show this mass difference and to derive information directly therefrom about the methylation state of the examined section of the genomic DNA sample.
  • Denaturing gel electrophoresis preferably capillary gel electrophoresis
  • Denaturing gel electrophoresis is particularly suitable for separating the single strands (see Example 1). Normally, in gel electrophoresis, if it is not denatured, the DNA is separated essentially depending on its length. DNA fragments of known length serve as the standard. Denaturing gel electrophoresis, on the other hand, often separates depending on the sequence if these require different conformations and secondary structures of the DNA single strand.
  • One of the best known techniques in this context is the SSCP.
  • the SSCP can also be used for methylation analysis in this sense.
  • the particular advantage of this invention with regard to gel electrophoresis is that the base composition in the bisulfite-treated and amplified DNA differs significantly from the genomic, and the more so the lower the degree of methylation thereof. These differences are extreme enough that, as shown in Example 1, they can also be used directly for methylation analysis, since the behavior in capillary gel electrophoresis can be measured depending on the Sequence changes. It is also particularly useful and preferred to use the spacing of the bands for the two respective single strands of the PCR product as a measure of the degree of methylation in the genomic sample.
  • the two peaks of a denaturing HPLC can be evaluated analogously.
  • the two single strands can also be separated on suitable reversed-phase columns, preferably eluted in conjunction with triethylammonium acetate / acetonitrile gradients.
  • the retention time is directly dependent on the base composition and thus ultimately on the degree of methylation of the genomic DNA sample in the fragment in question.
  • the HPLC it is also possible and preferred to carry out the HPLC at a temperature at which the DNA is still at least partially double-stranded.
  • the duplexes and heteroduplexes formed can also be separated by HPLC depending on the number of mismatches. This allows an image to be drawn of the homogeneity of the methylation between two samples. It is also possible and preferred to measure methylation directly in this way if a known reference amplificate is added, which was obtained from a sample well characterized in the methylation pattern and treated with bisulfite. In this case, the peaks allow conclusions to be drawn about the similarity of the methylation pattern to that of the reference DNA.
  • the fragments are in terms of the base composition of each of the two complementary strands of
  • the amplified product was examined, the difference in the molecular weight of the two strands being used to infer the methylation status in the amplified section of the genomic DNA sample.
  • the difference or differences in the molecular weight of the two strands are measured by denaturing gel electrophoresis. Analogous to the molecular weight, the gross composition of the DNA can be viewed in relation to the nucleobases A, C, T and G. For the sake of simplicity, however, only the molecular weight is referred to below. In another particularly preferred variant of the method, the difference in the molecular weight of the two strands is determined by capillary gel electrophoresis.
  • the difference in the molecular weight of the two strands is measured by chromatographic methods.
  • This chromatographic method is particularly preferably denaturing high-pressure liquid chromatography (HPLC).
  • reference DNA of known composition and of the same or similar length is used in the analysis as an external or internal standard.
  • this reference DNA is particularly preferably bisulfite-treated DNA from a reference sample with a known methylation status, or else the genomic DNA amplified without prior chemical treatment with the same or similar fragment length as the fragment analyzed in each case.
  • This method variant is preferably carried out with small sample volumes and, moreover, is preferably suitable for mass throughput.
  • the quality and completeness of the bisulfite reaction are checked simultaneously with the analysis of the methylation status.
  • the bisulfite reaction does not take place especially when the DNA to be treated is not single-stranded. If denaturation is incomplete, a fraction of the DNA can remain virtually completely unconverted.
  • a fraction of the DNA can remain virtually completely unconverted.
  • These genomic amplificates can be detected simultaneously with the analysis of the methylation status, since fragments with an approximately average base composition and thus approximately the expected mass are also observed (example 4). It is also particularly preferred to use primers which amplify bisulfite-converted as well as genomic DNA in order to be able to detect even small amounts of unconverted DNA in this way.
  • a method is particularly preferred in which the quality of the bisulfite reaction and the degree of methylation are simultaneously eaten, by also detecting unconverted fractions. This is preferably achieved by the primers used likewise amplifying bisulfite-converted and genomic DNA.
  • the DNA samples are obtained from serum or other body fluids of an individual, from cell lines, blood, sputum, stool, urine, serum, brain-spinal cord fluid, tissue embedded in paraffin, for example tissue from eyes , Intestine, kidney, brain, heart, prostate, lung, breast or liver, histological slides and all possible combinations thereof.
  • the chemical treatment is particularly preferably carried out after embedding the DNA in agarose. It is likewise preferred that a reagent denaturing the DNA duplex and / or a radical scavenger is present during the chemical treatment.
  • the amplification of several fragments is carried out in a reaction vessel in the form of a multiplex PCR.
  • the primers used in the amplifications particularly preferably do not amplify fragments of genomic DNA not treated with bisulfite (or only to a negligible extent), so that they are specific for the DNA converted with bisulfite. This protects against erroneous results in the event of an incomplete conversion reaction with, for example, sodium bisulfite, but then does not permit the detection of the quality of the bisulfite reaction.
  • the amplificates for detection are provided with at least one detectable label, which is preferably introduced by labeling the primers during the amplification.
  • the labels are particularly preferred fluorescent labels or radionuclides.
  • the two strands of the amplificates are particularly preferably separated and detected overall in the mass spectrometer and thus clearly characterized by their respective mass.
  • a method variant is also particularly preferred in which, based on the degree of methylation at the various CpG positions examined, it is concluded that there is a disease or another medical condition of the patient.
  • the present invention also relates to the use of one of the described method variants for diagnosing and / or predicting adverse events for patients or individuals, these adverse events being indicated in at least one of the following categories. hear: adverse drug effects; Cancers; CNS malfunction, damage or illness; Symptoms of aggression or behavioral disorders; clinical, psychological and social consequences of brain damage; psychotic disorders and personality disorders; Dementia and / or associated syndromes; cardiovascular disease, malfunction and damage; Malfunction, damage or disease of the gastrointestinal tract; Malfunction, damage or disease of the respiratory system; Injury, inflammation, infection, immunity and / or convalescence; Malfunction, damage or illness of the body as a deviation in the development process; Malfunction, damage or disease of the skin, muscles, connective tissue or bones; endocrine and metabolic dysfunction, injury or illness; Headache or sexual malfunction.
  • the present invention also relates to the use of one of the described method variants for differentiating cell types or tissues or for examining cell differentiation.
  • the present invention also relates to a kit consisting of a reagent containing bisulfite, primers for the preparation of the amplificates, and optionally instructions for carrying out an assay in accordance with one of the process methods described.
  • the amplification was carried out in a PCR thermal cycler (Ependorf) using the following program:
  • Step5 GOTO Step 2 (39 x)
  • the MdrI-PCR product thus produced has a length of 633 bp and the sequence:
  • methylated human DNA For the production of methylated human DNA, which is to serve as the standard for further investigations, 700ng of DNA were converted with the CpG-specific methylase Sssl (BioLabs Ine) according to the manufacturer's instructions. This methylated DNA and unmodified human DNA were treated with bisulfite as described (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulfite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24): 5064-6). A DNA sample was also treated with bisulfite, which was accordingly not methylated.
  • a bisulfite fragment corresponding to the genomic fragment was amplified by PCR using the primers TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG (SEQ-ID: 4) and TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC (SEQ-ID: 5).
  • the PCR reaction conditions were as follows:
  • Step5 GOTO Step 2 (39 x)
  • the MdrI-PCR product thus produced has a length of 633 bp and the methylated variant has the following sequence:
  • the DNA was separated using the ABI Pris 310 capillary electrophoresis system, equipped with the GS STR POP4 module (Applied Biosystems, Rothstadt) under denaturing conditions in a capillary (length 47 cm, diameter 50 ⁇ m). Sample preparation and running conditions were as recommended by the device manufacturer. The fragment size was determined using the internal length standard ROX-1000 (Applied Biosystems). ⁇ The selected running conditions were: injection time 2s injection voltage 3.5 kV running voltage 15 kV temperature 60 ° C
  • the amplified genomic DNA as well as the methylated and the non-methylated and subsequently bisulfite-treated DNA samples were measured. It was to be expected that a value would be measured for the statistically composed respective single strands of the amplificate of the genomic DNA which essentially corresponds to the actual length of the fragment. This was confirmed; a value of 630.45 bases or 632.56 bases was measured for the amplicon for the two single strands, the theoretical value is 633 bases (FIG. 1c).
  • This measurable difference of 1.46 can be directly used for the diagnosis of the methylation state in an unknown sample can be used.
  • a fragment of the NME3 gene is suitable as a standard quality control for the bisulfite reaction. 0 However, in practice you will always select the gene whose methylation status you want to investigate. Non-specific primers were used for the amplification, which are able to amplify bisulfite-treated and genomic DNA. The 5 fragment was amplified as in Example 1.
  • the NME3 PCR product thus produced has a length of 686 bp and the sequence:
  • the following non-specific primers were used for the amplification: 5 AAG GGA ATA AAG AGA AAA GAA GTA (SEQ-ID: 8) and TCC CCT TCC CCC CAC A (SEQ-ID: 9).
  • the bisulfite treatment was carried out as in the literature reference (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24): 5064-6) carried out.
  • the subsequent amplification was carried out analogously to Example 2.
  • the bisulfite-treated fragment obtained has the sequence:
  • Figures 2-4 left column: fragment analysis; middle column: gel image; right column: method
  • Fig. 2 Method A: reaction temperature: 50 ° C; Response time: 5h; Thermo spikes: none; Splitting: 37 (671-708); Residual genomic fractions detectable (C); No complete conversion
  • reaction temperature 50 ° C
  • Response time 2.5h
  • Thermo spikes 10
  • Splitting 37 (671-708); No residual genomic components detectable; Complete conversion
  • reaction temperature 50 ° C
  • Response time 5h
  • Thermo spikes none
  • Splitting 17 (672-689); Residual genomic portion detectable (C); No complete conversion

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Abstract

Beschrieben wird ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben. Eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit), derart behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt. Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polymerasekettenreaktion, amplifiziert. Zuletzt werden die Fragmente hinsichtlich der Basenzusammensetzung jeweils der beiden komplementären Stränge des Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylierungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.

Description

Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung durch vergleichende Analyse der Einzelstränge von Amplifikaten
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben.
Die nach den methodischen Entwicklungen der letzten Jahre in der Molekularbiologie gut studierten Beobachtungsebe- nen sind die Gene selbst, die Übersetzung dieser Gene in RNA und die daraus entstehenden Proteine. Wann im Laufe der Entwicklung eines Individuums welches Gen angeschaltet wird und wie Aktivieren und Inhibieren bestimmter Gene in bestimmten Zellen und Geweben gesteuert wird, ist mit Ausmaß und Charakter der Methylierung der Gene bzw. des Genoms korrelierbar . Insofern äußern sich pathogene Zustände in einem veränderten Methylierungsmuster einzelner Gene oder des Genoms.
5-Methylcytosin ist die häufigste kovalent modifizierte Base in der DNA eukaryotischer Zellen. Sie spielt beispielsweise eine Rolle in der Regulation der Transkription, beim genetischen Imprinting und in der Tumorgenese. Die Identifizierung von 5-Methylcytosin als Bestandteil genetischer Information ist daher von erheblichem Interesse. 5-Methylcytosin-Positionen können jedoch nicht durch Sequenzierung identifiziert werden, da 5-Methyl- cytosin das gleiche Basenpaarungsverhalten aufweist wie Cytosin. Darüber hinaus geht bei einer PCR-Amplifikation die epigenetische Information, welche die 5-Methylcyto- sine tragen, vollständig verloren.
Eine relativ neue und die mittlerweile am häufigsten angewandte Methode zur Untersuchung von DNA auf 5-Methyl- cytosin beruht auf der spezifischen Reaktion von Bisulfit mit Cytosin, das nach anschließender alkalischer Hydroly- se in Uracil umgewandelt wird, welches in seinem Basenpaarungsverhalten dem Thymidin entspricht. 5-Methylcyto- sin wird dagegen unter diesen Bedingungen nicht modifiziert. Damit wird die ursprüngliche DNA so umgewandelt, dass Methylcytosin, welches ursprünglich durch sein
Hybridisierungsverhalten vom Cytosin nicht unterschieden werden kann, jetzt durch „normale" molekularbiologische Techniken als einzig verbliebenes Cytosin beispielsweise durch Amplifikation und Hybridisierung oder Sequenzierung nachgewiesen werden kann. Alle diese Techniken beruhen auf Basenpaarung, welche jetzt voll ausgenutzt wird. Der Stand der Technik, was die Empfindlichkeit betrifft, wird durch ein Verfahren definiert, welches die zu untersuchende DNA in einer Agarose-Matrix einschließt, dadurch die Diffusion und Renaturierung der DNA (Bisulfit reagiert nur an einzelsträngiger DNA) verhindert und alle Fällung- und Reinigungsschritte durch schnelle Dialyse ersetzt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and i - proved method for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24 ): 5064-6) . Mit dieser Methode können einzelne Zellen untersucht werden, was das Potential der Methode veranschaulicht. Allerdings werden bisher nur einzelne Regionen bis etwa 3000 Basenpaare Länge untersucht, eine globale Untersu- chung von Zellen auf Tausenden von möglichen Methylie- rungsanalysen ist nicht möglich. Allerdings kann auch dieses Verfahren keine sehr kleinen Fragmente aus geringen Probenmengen zuverlässig analysieren. Diese gehen trotz Diffusionsschutz durch die Matrix verloren.
Eine Übersicht über die weiteren bekannten Möglichkeiten, 5-Methylcytosine nachzuweisen, kann aus dem folgenden Ü- bersichtsartikel entnommen werden: Rein T, DePamphilis ML, Zorbas H. Identifying 5-methylcytosine and related modi- fications in DNA genomes . Nucleic Acids Res. 1998 May 15;26(10) :2255-64. Die Bisulfit-Technik wird bisher bis auf wenige Ausnahmen (z. B. Zeschnigk M, Lieh C, Buiting K, Dörfler W, Hor- sthemke B. A single-tube PCR test for the diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome based on allelic methylation differences at the SNRPN locus . Eur J Hum Ge- net. 1997 Mar-Apr; 5 (2) : 94-8 ) nur in der Forschung angewendet. Immer aber werden kurze, spezifische Stücke eines bekannten Gens nach einer Bisulfit-Behandlung amplifi- ziert und entweder komplett sequenziert (Olek A, Walter J. The pre-implantation ontogeny of the H19 methylation imprint . Nat Genet . 1997 Nov. ; 17 (3) : 275-6) oder einzelne Cytosin-Positionen durch eine „Primer-Extension-Reaktion" (Gonzalgo ML, Jones PA. Rapid quantitation of methylation differences at speeifie sites using methylation-sensitive Single nucleotide primer extension (Ms-SNuPE) . Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15;25 (12) : 2529-31, WO-Patent 9500669) oder einen Enzymschnitt (Xiong Z, Laird PW. COBRA: a sensitive and quantitative DNA methylation as- say. Nucleic Acids Res. 1997 Jun. 15; 25 (12) : 2532-4) nachgewiesen. Zudem ist auch der Nachweis durch Hybridisierung beschrieben worden (Olek et al., WO 99 28498) .
Ein Problem der Bisulfitreaktion ist es, dass sie häufig nicht vollständig abläuft. Das heißt, dass nicht umgewandelte Cytosine nicht nur auf deren Methylierung hindeuten können, sondern auch auf eine unvollständig abgelaufene Bisulfitreaktion. Daher ist es von grossen Interesse, die Bisulfitreaktion quantitativ verfolgen zu können und ih- ren Erfolg vor der Ermittlung des methylierungsgrades bestimmen zu können. Ansätze hierzu mittels Bisulfit- sequenzierung sind publiziert (Grünau, C, Rosenthal, A. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters . Nucleic Acids Res. 2001 Jul. 1;29 (13) :E65-5) . Diese Methode ist jedoch langwierig und aufwendig und werden sehr große Probenmengen benö- tigt, so dass sie sich für Routineanwendung weniger eignet .
Harnstoff verbessert die Effizienz der Bisulfit- Behandlung vor der Sequenzierung von 5-Methylcytosin in genomischer DNA (Paulin R, Grigg GW, Davey MW, Piper AA. Urea improves efficiency of bisulphate- ediated sequencing of 5 ' -methylcytosine in genomic DNA. Nucleic Acids Res. 1998 Nov. 1; 26 (21) : 5009-10) .
Weitere Publikationen, die sich mit der Anwendung der Bisulfit-Technik zum Methylierungsnachweis bei einzelnen Genen befassen, sind: Grigg G, Clark S. sequencing 5-methylcytosine residues in genomic DNA. Bioassays. 1994 Jun. ; 16 ( 6) : 431-6, 431;
Zeschnigk M, Schmitz B, Dittrich B, Buiting K, Horsthemke B, Dörfler W. Imprinted Segments in the human genome : different DNA methylation patterns in the Prader- Willi/Angelman syndrome region as determined by the ge- nomic sequencing method. Hu Mol Genet . 1997
Mar;6 (3) : 387-95; Feil R, Charlton J, Bird AP, Walter J, Reik W. Methylation analysis on individual chromosomes: improved protocol fort bisulphate genomic sequencing. Nucleic Acids Res. 1994 Feb. 25 ; 22 ( ): 695-6; Martin V, Ribieras S, Song-Wang X, Rio MC, Dante R. Genomic sequencing indicates a correlation between DNA hypomethyla- tion in the 5' region of the pS2 gene andin its expres- sion in human breast cancer cell lines. Gene. 1995 May 19;157(l-2) :261-4; WO 97 46705, WO 95 15373 und WO 45560.
Ein weiteres bekanntes Verfahren ist die sogenannte me- thylierungssensitive PCR (Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. (1996), Methylation-specific PCR: a novel PCR assay for methylation status of CpG is- lands. Proc Natl Acad Sei U S A. Sep 3; 93 (18) : 9821-6) .
Für dieses Verfahren werden Primer verwendet, die entwe- der nur an eine Sequenz hybridisieren, die durch die Bisulfit-Be andlung einer an der betreffenden Position un- methylierten DNA entsteht, oder aber umgekehrt Primer, welche nur an eine Nukleinsäure bindet, die durch die Bi- sulfit-Behandlung einer an der betreffenden Position un- ethylierten DNA entsteht. Mit diesen Primer können demnach Amplifikate erzeugt werden, deren Detektion wiederum Hinweise auf das Vorliegen einer methylierten oder un- methylierten Position in der Probe liefern, an welche die Primer binden.
Ein neueres Verfahren ist auch der Nachweis von Cytosin- Methylierung mittels einer Taqman PCR, das als Methyl- Light bekannt geworden ist (WO00/70090) . Mit diesem Ver- fahren ist es möglich, den Methylierungsstatus einzelner oder weniger Positionen direkt im Verlauf der PCR nachzuweisen, so dass sich eine nachfolgende Analyse der Produkte erübrigt.
Stand der Technik ist wiederum ein von Epigenomics entwickeltes Verfahren, welches zu untersuchende DNA und Hintergrund-DNA nach Bisulfit-Behandlung gleichermaßen amplifiziert und dann die im Fragment enthaltenen ehemaligen CpG Positionen durch Hybridisierungstechniken un- tersucht, alternativ mittels MiniSequenzierung oder anderen gängigen Verfahren. Dies hat den Vorteil, dass man ein quantitatives Bild bezüglich der untersuchten Methy- lierungspositionen erhält, d. h. es erfolgt die Bestimmung des Methylierungsgrades einer Vielzahl von Positio- nen, was z. B. bei soliden Tumoren eine sehr genau Klassifizierung ermöglicht.
Für die Markierung von Amplifikaten sind vielfach fluoresziert markierte Primeroligonukleotid e verwendet wor- den. Besonders geeignet für Fluoreszenzmarkierungen ist das einfache Anbringen von Cy3 und Cy5 Farbstoffen am 5 ' - Ende des jeweiligen Primers. Die Farbstoffe Cy3 und Cy5 sind, neben vielen anderen, kommerziell erhältlich.
Matrix-assistierte Laser Desorptions/Ionisations- Massenspektrometrie (MALDI-TOF) ist eine sehr leistungsfähige Entwicklung für die Analyse von Biomolekülen (Ka- ras M, Hillenkamp F. Laser desorption ionization of pro- teins with olecular masses exceeding 10,000 daltons . A- nal Chem. 1988 Oct . 15; 60 (20) : 2299-301) . Ein Analyt wird in eine lichtabsorbierende Matrix eingebettet. Durch einen kurzen Laserpuls wird die Matrix verdampft und das Analytmolekül so unfragmentiert in die Gasphase befördert. Durch Stöße mit Matrixmolekülen wird die Ionisation des Analyten erreicht. Eine angelegte Spannung beschleu- nigt die Ionen in ein feldfreies Flugrohr. Auf Grund ihrer verschiedenen Massen werden Ionen unterschiedlich stark beschleunigt. Kleinere Ionen erreichen den Detektor früher als größere.
MALDI-TOF Spektroskopie eignet sich ausgezeichnet zur A- nalyse von Peptiden und Proteinen. Die Analyse von Nukleinsäuren ist etwas schwieriger (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), DNA and Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Mass Spectrometry . Molecular Biology: Current Inno- vations and Future Trends 1: 147-157.) Für Nukleinsäuren ist die Empfindlichkeit etwa 100 mal schlechter als für Peptide und nimmt mit zunehmender Fragmentgröße überproportional ab. Für Nukleinsäuren, die ein vielfach negativ geladenes Rückgrat haben, ist der Ionisationsprozeß durch die Matrix wesentlich ineffizienter. In der MALDI-TOF Spektroskopie spielt die Wahl der Matrix eine eminent wichtige Rolle. Für die Desorption von Peptiden sind einige sehr leistungsfähige Matrices gefunden worden, die eine sehr feine Kristallisation ergeben. Für DNA gibt es zwar mittlerweile einige ansprechende Matrices, jedoch wurde dadurch der Empfindlichkeitsunterschied nicht ver- ringert . Der Empfindlichkeitsunterschied kann verringert werden, indem die DNA chemisch so modifiziert wird, dass sie einem Peptid ähnlicher wird. Phosphorothioatnuklein- säuren, bei denen die gewöhnlichen Phosphate des Rück- grats durch Thiophosphate substituiert sind, lassen sich durch einfache Alkylierungschemie in eine ladungsneutrale DNA umwandeln (Gut, I. G. und Beck, S. (1995), A procedu- re for selective DNA alkylation and detection by mass spectrometry. Nucleic Acids Res. 23: 1367-1373). Die Kopplung eines „Charge tags" an diese modifizierte DNA resultiert in der Steigerung der Empfindlichkeit um den gleichen Betrag, wie er für Peptide gefunden wird. Ein weiterer Vorteil von „Charge tagging" ist die erhöhte Stabilität der Analyse gegen Verunreinigungen, die den Nachweis unmodifizierter Substrate stark erschweren.
Genomische DNA wird durch Standardmethoden aus DNA von Zeil-, Gewebe- oder sonstigen Versuchsproben gewonnen. Diese Standardmethodik findet sich in Referenzen wie
Fritsch und Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 1989.
Nach der Erfindung der PCR sind in den folgenden Jahren zahlreiche Varianten bekannt geworden, die diese Technik zur Amplifikation der DNA verfeinern. Insbesondere ist hier die Multiplexierung der PCR (Multiplex-PCR) zu erwähnen, wobei man mehr als 2 spezifische Primer einsetzt und dabei in einem Reaktionsgefäß eine Vielzahl von ver- schiedenen, spezifische n Amplifikation erzeugen kann.
Besonders interessant ist auch die sogenannte Nested PCR, welche unter anderem zum Nachweis besonders geringer DNA Mengen verwendet wird. Diese Art der PCR besteht aus zwei aufeinanderfolgenden Amplifikationen, wobei die Primer der zweiten Amplifikation innerhalb des ersten Amplifika- tes liegen und nicht mit den Primern der ersten Amplifi- kation identisch sind. Dadurch wird eine besondere Spezi- fität erreicht, da die Primer der zweiten Amplifikation nur dann funktionieren, wenn in der ersten Amplifikation das beabsichtigte Fragment erzeugt wurde. Dagegen ist die die Vermehrung etwaiger Nebenprodukte der ersten Amplifikation in der zweiten so gut wie ausgeschlossen.
Es sind demnach bislang vielerlei Verfahren zur Methylie- rungsanalyse Stand der Technik. Die meisten dieser Ver- fahren erlauben die Analyse von einzelnen Positionen im Genom, einige, wie zum Beipiel Hybridisierungstechniken an Oligomer Arrays, erlauben die Analyse einer Vielzahl von Positionen gleichzeitig. Der experimentelle Aufwand dieser Verfahren ist jedoch vergleichsweise hoch. Die vorliegende Erfindung soll ein Verfahren bereitstellen, das es nach den Bisulfit Behandlung und Amplifikation mit in molekularbiologischen Laboratorien verbreiteter Intru- mentierung wie Kapillargelelektrophorese oder HPLC erlaubt, eine direkte Methylierungsanalyse in dem gesamten Fragment ohne weitere Schritte durchzuführen. Die Methode verzichtet dabei auf die Analyse bestimmter Einzelpositionen, sondern analysiert das Ausmaß der Methylierung in dem untersuchten Fragmen .
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass sich die Basenzusammensetzung der DNA in der Bisulfit- Behandlung und in der nachfolgenden Amplifikation auf charakteristische Weise ändert und dass sich allein daraus ein Analyseverfahren zum Nachweis von Cytosin- Methylierung ableiten lässt. Wird eine genomische DNA
Probe mit Bisulfit behandelt, so werden alle nicht methylierten Cytosinbasen in Uracil umgewandelt und in der nachfolgenden Amplifikation in Thymin. Demzufolge nimmt die Anzahl der Cytosinbasen grundsätzlich ab, und zwar umso mehr, je geringer der Methylierungsgrad des betreffenden amplifizierten Abschnittes der DNA-Probe ist. Ent- sprechend nimmt die Anzahl der Thyminbasen zu, je geringer der Methylierungsgrad ist. In dem in der Amplifikation gebildeten komplementären Gegenstrang ist es umgekehrt so, dass je geringer der Methylierungsgrad in der DNA Probe war, umso mehr Adenin eingebaut wurde. Umgekehrt enthält der Gegenstrang umso mehr Guanin, je höher der Methylierungsgrad der DNA-Probe war.
Dies führt nun zu dem Effekt, dass sich die Molmasse der beiden in der Amplifikation gebildeten komplementären
Stränge umso mehr unterscheidet, je geringer der Methylierungsgrad in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe ist. Eine Umwandlung des Cytosins in dem einen Strang in letztlich Thymidin führt zu einer Erhö- hung der Masse um jeweils 15 Da, während auf dem komplementären Strang sich dadurch, dass entsprechend Guanin durch Adenin ersetzt wird, eine Verringerung der Molekülmasse um 16 Da ergibt. Daraus folgt, dass sich aus der Umwandlung jedes zusätzlichen Cytosins in letzlich Thymin eine zusätzliche Massendifferenz von 31 Da zwischen den beiden komplementären Strängen des Amplifikates ergibt.
Die vorliegende Erfindung nutzt nun mehrere Verfahren, um diese Massendifferenz aufzuzeigen und daraus unmittelbar Information über den Methylierungszustand des untersuchten Abschnittes der genomischen DNA Probe abzuleiten.
Zusätzlich zu der sich mit abnehmender Methylierung verändernden Molekülmasse der Einzelstränge gibt es noch weitere Effekte, der hier ausgenutzt werden können. Jede Umwandlung von Cytosinbasen in Thymidin führt beispielsweise zu dem Verlust einer Aminofunktion in dem jeweiligen Einzelstrang, während in dem anderen Strang Guanin gegen Adenin auszutauschen ist und dabei jedoch die A i- nofunktion erhalten bleibt. Auch dadurch verändern sich je nach . gewähltem Analyseverfahren die Eigenschaften der jeweiligen Einzelstränge zueinander erheblich. In jedem Fall lässt sich aber eine unmittelbare Abhängigkeit dieser Eigenschaften vom Methylierungsgrad herstellen.
Zur Analyse der Einzelstränge lassen sich mehrere Verfahren nutzen, die hier beschrieben werden sollen. Insbesondere ist denaturierende Gelelektrophorese, bevorzugt die Kapillargelelektrophorese, zur Auftrennung der Einzelstränge geeignet (siehe Beispiel 1). Normalerweise wird in der Gelelektrophorese, wenn sie nicht denaturierend durchgeführt wird, die DNA im wesentlichen in Abhängigkeit von ihrer Länge aufgetrennt. Dabei dienen DNA Fragmente bekannte Länge als Standard. Bei denaturierender Gelelektrophorese hingegen erfolgt oft auch eine Auftren- nung in Abhängigkeit von der Sequenz, wenn diese unterschiedliche Konformationen und Sekundärstrukturen des DNA-Einzelstranges bedingen. Eine der bekanntesten Techniken in diesem Zusammenhang ist die SSCP.
Da jedoch hier ein Methylierungsgrad innerhalb eines
Fragmentes festzustellen ist, dem eine Vielzahl möglicher unterschiedlicher Sequenzen nach der Bisulfit-Behandlung gegenüberstehen, eignen sich derartige Methoden nicht so gut, da man sehr viele verschiedene Fälle unterscheiden muss. Jedoch ist eine Anwendung der SSCP auch für Methy- lierungsanalyse in diesem Sinne denkbar.
Der besondere Vorteil dieser Erfindung im Hinblick auf die Gelelektrophorese ist jedoch, dass sich die Basenzu- sammensetzung in der Bisulfit-behandelten und amplifi- zierten DNA wesentlich von der genomischen unterscheidet, und zwar umso mehr, je geringer ihr Methylierungsgrad ist. Diese Unterschiede sind extrem genug, dass man sie, wie in Beispiel 1 gezeigt, auch unmittelbar zur Methylie- rungsanalyse verwenden kann, da sich das Verhalten in der Kapillargelelektrophorese messbar in Abhängigkeit von der Sequenz ändert. Besonders sinnvoll und bevorzugt ist es auch, den Abstand der Banden für die beiden jeweiligen Einzelstränge des PCR-Produktes als Mass für den Methylierungsgrad in der genomischen Probe zu verwenden.
Ähnliches gilt auch für die zwei Peaks einer denaturierenden HPLC, die analog ausgewertet werden kann. Auf geeigneten Reversed-Phase Säulen, bevorzugt in Verbindung mit Triethylammoniumacetat/Acetonitril Gradienten elu- iert, lassen sich die beiden Einzelstränge ebenfalls auftrennen. Auch hier ist die Retentionszeit wiederum unmittelbar abhängig von der Basenzusammensetzung und damit letztlich von dem Methylierungsgrad der genomischen DNA- Probe in dem betreffenden Fragment.
Es ist auch möglich und bevorzugt, die HPLC bei einer Temperatur durchzuführen, in der die DNA zumindest partiell noch doppelsträngig vorliegt. Die dabei gebildeten Duplexes und Heteroduplexes können ebenfalls in Abhängig- keit von der Anzahl der Fehlpaarungen von der HPLC aufgetrennt werden. Dies erlaubt es, ein Bild von der Homogenität der Methylierung zwischen zwei Proben zu erzeugen. Es ist auch möglich und bevorzugt, Methylierung auf diese Art unmittelbar zu messen, wenn ein bekanntes Referen- zamplifikat zugesetzt wird, das aus einer im Methylie- rungsmuster gut charakterisierten und mit Bisulfit behandelten Probe gewonnen wurde. Die Peaks erlauben in diesem Falle einen Rückschluss auf die Ähnlichkeit des Methylie- rungsmusters mit dem der Referenz-DNA.
Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird dadurch gelöst, dass ein Verfahren zum Nachweis von Cytosin- Methylierung in DNA-Proben geschaffen wird bei dem man die folgenden Schritte ausführt: a) eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) , derart behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5- Methylcytosin unverändert bleibt, b) Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Polyme- rasekettenreaktion, amplifiziert und
c) die Fragmente werden hinsichtlich der Basenzusammen- setzung jeweils der beiden komplementären Stränge des
Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylie- rungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens werden der oder die Unterschiede im Molekulargewicht der beiden Stränge durch denaturierende Gelelektrophorese gemessen. Analog dem Molekulargewicht kann die Bruttozusam- mensetzung der DNA in Bezug auf die Nukleobasen A, C, T und G betrachtet werden. Im folgenden wird jedoch der Einfachheit halber immer nur auf das Molekulargewicht Bezug genommen. In einer wiederum besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Unterschied im Molekular- gewicht der beiden Stränge durch Kapillargelelektrophorese bestimmt.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird der Unterschied im Molekulargewicht der bei- den Stränge durch chomatographische Verfahren gemessen. Besonders bevorzugt handelt es sich bei diesem chromatographischen Verfahren um denaturierende Hochdruckflüs- sigkeits-chromatographie (HPLC) .
Besonders bevorzugt tragen zusätzlich zum Molekulargewicht auch noch weitere Faktoren wie z. B. der unter- schiedliche Gesamtgehalt an Guanin, an Aminofunktionen oder Ketofunktionen der beiden komplementären Stränge zu ihrem unterschiedlichen Verhalten in einer der oben erwähnten analytischen Methoden bei.
Ebenfalls ist es besonders bevorzugt, den Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Massenspektro- metrie zu bestimmen. Da ausschliesslich die Massendifferenz der beiden Stränge bestimmt wird, erübrigt sich hier eine Kalibrierung. Es ist jedoch offensichtlich, dass es ebenfalls möglich ist, die Massen der beiden Stränge getrennt zu bestimmen und nur eine Masse für die Methylie- rungsanalyse heranzuziehen.
Besonders bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante, bei der Referenz-DNA bekannter Zusammensetzung und gleicher oder ähnlicher Länge bei der Analyse als externer oder interner Standard verwendet wird. Wiederum besonders bevorzugt handelt es sich bei dieser Referenz-DNA um Bisul- fit-behandelte DNA aus einer Referenzprobe mit bekanntem Methylierungsstatus handelt oder aber um die ohne vorherige chemische Behandlung amplifizierte genomische DNA mit gleicher oder ähnlicher Fragmentlänge wie das jeweils analysierte Fragment. Diese Verfahrensvariante wird vor- zugsweise mit kleinen Probenvolumina durchgeführt und eignet sich darüber hinaus bevorzugt für den Massendurchsatz .
In einer weiteren, besonders bevorzugten Variante des Verfahrens wird zugleich mit der Analyse des Methylierungsstatus eine Kontrolle der Qualität und Vollständigkeit der Bisulfitreaktion durchgeführt. Die Bisulfitreaktion läuft vor allem dann nicht ab, wenn die zu behandelte DNA nicht einzelsträngig vorliegt. Bei unvollständiger Denaturierung kann eine Fraktion der DNA praktisch vollständig unumgewandelt verbleiben. Je nach Spezifität der Primer kann es dann zur Amplifikation von umgewandelter DNA und Resten praktisch genomischer DNA kommen. Diese genomischen Amplifikate lassen sich gleichzeitig mit der Analyse des Methylierungsstatus nachweisen, da auch Frag- mente mit in etwa durchschnittlicher Basenzusammensetzung und damit etwa der erwarteten Masse beobachtet werden (Beispiel 4) . Besonders bevorzugt ist es auch, Primer zu verwenden, die gleichermassen Bisulfit-umgewandelte wie auch genomische DNA amplifizieren, um auf diese Art auch geringe Mengen nicht umgewandelter DNA nachweisen zu können.
Besonders bevorzugt ist also ein Verfahren, bei dem man zugleich die Qualität der Bisulfitreaktion und den Methy- lierungsgrad isst, indem auch nicht umgewandelte Fraktionen nachgewiesen werden. Die wird bevorzugt dadurch er- zeit, dass die verwendeten Primer gleichermassen Bisul- fit-umgewandelte sowie genomische DNA amplifizieren.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens gewinnt man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums, aus Zellinien, Blut, Sputum, Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks- Flüssigkeit, in Paraffin einbettetem Gewebe, beispiels- weise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon.
In einer weiteren besonders bevorzugten Variante des Ver- fahrens führt man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durch. Besonders bevorzugt erfolgt die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose. Ebenfalls bevorzugt ist es, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturie- rendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist. In einer besonders bevorzugten Verfahrensvariante wird die Amplifikation mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR durchgeführt.
Die in den Amplifikationen verwendeten Primer amplifizie- ren besonders bevorzugt keine Fragmente aus nicht mit Bisulfit behandelter genomischer DNA (oder nur in vernachlässigbarem Ausmaß) , so dass sie für die mit Bisulfit umgewandelte DNA spezifisch sind. Dies schützt vor fehler- haften Ergebnissen im Falle einer unvollständigen Umwandlungsreaktion mit beispielsweise Natriumbisulfit, erlaubt dann aber nicht den Nachweis auch der Qualität der Bisulfitreaktion.
In einer besonders bevorzugten Variante des Verfahrens sind die Amplifikate für die Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen, die bevorzugt durch Markierung der Primer während der Amplifikation eingebracht wird. Besonders bevorzugt sind die Markierun- gen Fluoreszenzmarkierungen oder Radionuklide. Besonders bevorzugt werden die beiden Stränge der Amplifikate getrennt und insgesamt im Massenspektrometer nachgewiesen und somit durch ihre jeweilige Masse eindeutig charakterisiert .
Besonders bevorzugt ist auch eine Verfahrensvariante bei der man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Er- kankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen Verfahrensvarianten zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien ange- hören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS-Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädi- gungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastrointestinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssys- tems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungspro- zess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabolische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung eines der beschriebenen Verfahrensvarianten zur Unterscheidung von Zelltypen oder Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Reagenz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines Assays entsprechend einer der beschriebenen Verfahrens arianten.
Die nachfolgenden Beipiele erläutern die Erfindung.
Beipiel 1:
Amplifikation von Fragmenten des MdrI Gens durch PCR (genomische DNA)
Für die Experimente wurde humane DNA (Promega) verwendet, Das MdrI-Fragment wurde mit den PCR-Primern CAAGCATGCTGAAGAAAGACCACTGCAG (SEQ-ID: 1) und TGGGAACTGTCCCATAGTAGCTCCCAGC (SEQ-ID: 2) unter folgenden Reaktionsbedingungen amplifiziert :
1 μl Promega_DNA (2ng/μl)
0,2 μl Taq Polymerase (5U/μl)
0,2 μl dNTP's (Endkonzentration je 200μM)
1 μl dATP Fluorescein-markiert (0,5 μM Endkonzentration) 2,5 μl lOxPCR Puffer (Qiagen)
2 μl Primer (SEQ-ID 1 und 2) je 25pmol/μl 18,1 μl Wasser
Die Amplifikation erfolgte in einem PCR-Thermocycler (Ep- pendorf) unter Verwendung des folgenden Programms:
Stepl 15min 95°C
Step2 1min 95°C
Step3 45sec 61°C
Step4 lminl5sec 72°C
Step5 GOTO Step 2 (39 x)
Step6 10min 72°C
Step7 HOLD 4°C
Das so hergestellte MdrI-PCR-Produkt hat eine Länge von 633 bp und die Sequenz:
CAAGCATGCTGAAGAAAGACCACTGCAGAAAAATTTCTCCTAGCCTTTTCAAAGGTG TTAGGAAGCAGAAAGGTGATACAGAATTGGAGAGGTCGGAGTTTTTGTATTAACTGT ATTAAATGCGAATCCCGAGAAAATTTCCCTTAACTACGTCCTGTAGTTATATGGATA TGAAGACTTATGTGAACTTTGΆAΆGACGTGTCTACATAAGTTGAAATGTCCCCAATG ATTCAGCTGATGCGCGTTTCTCTACTTGCCCTTTCTAGAGAGGTGCAACGGAAGCCA GAACATTCCTCCTGGAAATTCAACCTGTTTCGCAGTTTCTCGΆGGAATCAGCATTCA GTCAΆTCCGGGCCGGGAGCAGTCATCTGTGGTGAGGCTGATTGGCTGGGCAGGAACA GCGCCGGGGCGTGGGCTGAGCACAGCCGCTTCGCTCTCTTTGCCACAGGAAGCCTGA GCTCATTCGAGTAGCGGCTCTTCCÄAGCTCAAAGAAGCAGAGGCCGCTGTTCGTTTC CTTTAGGTCTTTCCACTAΆAGTCGGAGTATCTTCTTCCAAAATTTCACGTCTTGGTG GCCGTTCCAAGGAGCGCGAGGTAGGGGCACGCAAAGCTGGGAGCTACTATGGGACAG TTCCCA (SEQ-ID: 3) . Beipiel 2 :
Amplifikation von bisulfit-behandelten Fragmenten des MdrI Gens durch PCR zur Analyse des Methylierungszustan- des
Für die Herstellung von aufmethylierter humaner DNA, welche als Standard für die weiteren Untersuchungen dienen soll, wurden 700ng DNA mit der CpG-spezifischen Methylase Sssl (BioLabs Ine) nach Herstellerangaben umgesetzt. Diese methylierte DNA und nicht modifizierte humane DNA wurde, wie beschrieben mit Bisulfit behandelt (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved method for bi- sulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Ac- ids Res. 1996 DEC 15; 24 (24) : 5064-6) . Ebenso wurde eine DNA-Probe mit Bisulfit behandelt, welche entsprechend nicht aufmethyliert wurde. Von diesen beiden Bisulfit- behandelten DNA-Proben wurde mit den Primern TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG (SEQ-ID: 4) und TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC (SEQ-ID: 5) ein, dem genomischen Fragment entsprechendes Bisulfit-Fragment, durch PCR amplifiziert . Die PCR-Reaktionsbedingungen waren wie folgt :
1 1 μμll Bisulfit-behandelte DNA (lOng/μl) o, 2 μl Taq Polymerase (5U/μl) o, 2 μl dNTP's (Endkonzentration je 200μM)
1 μl dATP Fluorescein-markiert (0,5 μM Endkonzentration) 2 2,, .55 μμll lOxPCR Puffer (Qiagen)
2 μl Primer je 5pmol/μl 18,1 μl Wasser Die Amplifikation erfolgte in einem PCR-Thermocycler (Ep- pendorf) unter Verwendung des folgenden Programms:
Stepl 15min 95°C
Step2 1min 95°C
Step3 45sec 55°C
Step4 lminl5sec 72°C
Step5 GOTO Step 2 (39 x)
Step6 10min 72°C
Step7 HOLD 4°C
Das so hergestellte MdrI-PCR-Produkt hat eine Länge von 633 bp und die methylierte Variante hat die folgende Sequenz :
TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAGAAAAATTTTTTTTAGTTTTTTTAAAGGTG TTAGGAAGTAGAAAGGTGATATAGAATTGGAGAGGTCGGAGTTTTTGTATTAATTGT ATTAAATGCGAATTTCGAGAAAATTTTTTTTAATTACGTTTTGTAGTTATATGGATA TGAAGATTTATGTGAATTTTGAAAGACGTGTTTATATAAGTTGAAATGTTTTTAATG ATTTAGTTGATGCGCGTTTTTTTATTTGTTTTTTTTAGAGAGGTGTAACGGAAGTTA GAATATTTTTTTTGGAAATTTAATTTGTTTCGTAGTTTTTCGAGGAATTAGTATTTA GTTAATTCGGGTCGGGAGTAGTTATTTGTGGTGAGGTTGATTGGTTGGGTAGGAATA GCGTCGGGGCGTGGGTTGAGTATAGTCGTTTCGTTTTTTTTGTTATAGGAAGTTTGA GTTTATTCGAGTAGCGGTTTTTTTAAGTTTAAΆGAΆGTAGAGGTCGTTGTTCGTTTT TTTTAGGTTTTTTTATTAΆAGTCGGAGTATTTTTTTTTAAΆATTTTACGTTTTGGTG GTCGTTTTAAGGAGCGCGAGGTAGGGGTACGTAAAGTTGGGAGTTATTATGGGATAG TTTTTA (SEQ-ID: 6) .
Beispiel 3: Analyse der PCR-Fragmente durch Kapillar- Elektrophorese
Die Auftrennung der DNA erfolgte mit dem Kapillar- Elektrophoresesystem ABI Pris 310, augestattet mit Modul GS STR POP4 (Applied Biosystems, Weiterstadt) unter denaturierenden Bedingungen in einer Kapillare (Länge 47cm, Durchmesser 50μm) . Probenvorbereitung und Laufbedingungen waren wie vom Gerätehersteller empfohlen. Die Fragmentgrößenbestimmung erfolgte über den internen Längenstan- dard ROX-1000 (Applied Biosystems) . < Die gewählten Laufbedingungen waren: Injektionszeit 2sec Injectionsspannung 3,5 kV Laufspannung 15 kV Temperatur 60 °C
Laufzeit 45min.
Es wurden unter diesen Bedingungen zum einen die amplifi- zierte genomische DNA sowie die aufmethylierte und die nicht aufmethylierte und anschliessend Bisulfit behandelten DNA-Proben gemessen. Es war zu erwarten, dass für die statistisch zusammmengesetzten jeweiligen Einzelstränge des Amplifikats der genomischen DNA ein Wert gemessen werden würde, der im wesentlichen der tatsächlichen Länge des Fragmentes entspricht. Dies bestätigte sich, für das Amplifikat wurde für die beiden Einzelstränge ein Wert von 630.45 Basen bzw. 632.56 Basen gemessen, der theoretische Wert liegt bei 633 Basen (Figur lc) .
Bei den Amplifikaten der Bisulfit-DNA war nun zu erwarten, dass die Werte stärker abweichen würden, da die Basenzusammensetzung der Stränge, insbesondere die der Gua- nine und Cytosine, nicht mehr gleich verteilt ist. Entsprechend obigen Überlegungen war auch damit zu rechnen, dass sich bei der aufmethylierten DNA-Proben ein geringerer Unterschied zwischen beiden Strängen ergibt als bei der nicht aufmethylierten Probe. Die bestätigt sich durch das Experiment. Für die nicht aufmethylierte Probe werden Werte von 620.87 Basen und 640.46 Basen für die jeweili- gen Einzelstränge gefunden (Figur la, bei statistischer
Verteilung der Basen wären 633 zu erwarten) , bei der aufmethylierten DNA-Probe ergeben sich Werte von 622.56 Basen und 640.69 Basen (Figur lb) . Der gemessene Unterschied entspricht also für aufmethylierte DNA 18.13 Ba- sen, hingegen für nicht aufmethylierte DNA 19.59 Basen.
Dieser messbare Unterschied von 1.46 kann unmittelbar für die Diagnose des Methylierungszustandes in einer unbekannten Probe herangezogen werden.
5 Beispiel 4: Qualitätskontrolle für die Bisulfitreaktion durch Fragmentanalyse
Als Standard-Qualitätskontrolle für die Bisulfitreaktion eignet sich ein beipielsweise ein Fragment des NME3-Gens. 0 Allerdings wird man in der Praxis immer das Gen auswählen, dessen Methylierungsstatus man jeweils untersuchen möchte. Für die Amplifikation wurden unspezifische Primer verwendet, die in der Lage sind, bisulfitbehandelte und genomische DNA zu amplifizieren. Die Amplifikation des 5 Fragments wurde wie in Beispiel 1 durchgeführt. Das so hergestellte NME3 PCR-Produkt hat eine Länge von 686 bp und die Sequenz:
AΆGGGΆATAAAGAGAAAΆGAAGTACCCAGGGTCGTGGTGTCTTTGCGCTCTGTCTTT o AGGACCGGGGAGAGAAGGGCTGACGCTGTGGTCGTGGCCCTGGCCGGGGGGGCGCGG GGGGGGCGGGGTTCGGGCGGTGCGGAGCAGGGCGCCGCGTGGGTGGAΆCCACCTGGG CGGGTTGTGGGGGATACAGTTAGTGTCCGAGCTGCTGGAGGAGACTTGGCCTCCGCA GCTGCCCTCCGGCCCCCCACGGCTGCCGGGTTCCGGGGTGCAAGTGAAGCAGCCTCC CCGCGGAGGCCGCAGCGCCCCGACCAGGCCTCTTTAAGCGCAGGCCCCGCCCCGGGC 5 GCCACCGCCCCGCCCCGCGGATCCCGCTCCCGCACCGCCATCATGATCTGCCTGGTG
CTGACCATCTTCGCTAACCTCTTCCCCGCGGGTGAGCCGCGCGGCGCGGGCCGGGGG CGGGTGGCCGGTGCTGGGCCGGCCTGACGGCCCGTCCCCGCCTGCCCCGCAGCCTGC ACCGGCGCACACGAACGCACCTTCCTGGCCGTGAAGCCGGACGGCGTGCAGCGGCGG CTGGTGGGCGAGATTGTGCGGCGCTTCGAGAGGAAGGGCTTCAAGTTGGTGGCGCTG o AAGCTGGTGCAGGTGGGGGCGCGGTGAGCGAGCGGGGGCGCGGTGTGGGGGGAAGGG
GA (SEQ-ID: 7) .
Für die Amplifikation wurden die folgenden unspezifischen Primer verwendet: 5 AAG GGA ATA AAG AGA AAA GAA GTA (SEQ-ID: 8) und TCC CCT TCC CCC CAC A (SEQ-ID: 9) . Die Bisulfit-Behandlung wurde wie in der Literaturstelle (Olek A, Oswald J, Walter J. A modified and improved me- thod for bisulphite based cytosine methylation analysis. Nucleic Acids Res. 1996 DEC 15; 24 (24) : 5064-6) durchgeführt. Die anschließende Amplifikation wurde analog Beispiel 2 durchgeführt.
Das erhaltene bisulfitbehandelte Fragment hat die Se- quenz:
AAGGGAATAAAGAGAAAAGAAGTATTTAGGGTCGTGGTGTTTTTGCGTTTTGTTTTT AGGATCGGGGAGAGAAGGGTTGACGTTGTGGTCGTGGTTTTGGTCGGGGGGGCGCGG GGGGGGCGGGGTTCGGGCGGTGCGGAGTAGGGCGTCGCGTGGGTGGAATTATTTGGG CGGGTTGTGGGGGATATAGTTAGTGTTCGAGTTGTTGGAGGAGATTTGGTTTTCGTA GTTGTTTTTCGGTTTTTTACGGTTGTCGGGTTTCGGGGTGTAAGTGAAGTAGTTTTT TCGCGGAGGTCGTAGCGTTTCGATTAGGTTTTTTTAAGCGTAGGTTTCGTTTCGGGC GTTATCGTTTCGTTTCGCGGATTTCGTTTTCGTATCGTTATTATGATTTGTTTGGTG TTGATTATTTTCGTTAATTTTTTTTTCGCGGGTGAGTCGCGCGGCGCGGGTCGGGGG CGGGTGGTCGGTGTTGGGTCGGTTTGACGGTTCGTTTTCGTTTGTTTCGTAGTTTGT ATCGGCGTATACGAACGTATTTTTTTGGTCGTGAAGTCGGACGGCGTGTAGCGGCGG TTGGTGGGCGAGATTGTGCGGCGTTTCGAGAGGAAGGGTTTTAAGTTGGTGGCGTTG AAGTTGGTGTAGGTGGGGGCGCGGTGAGCGAGCGGGGGCGCGGTGTGGGGGGAAGGG GA(SEQ-ID: 10) .
Die Analyse der PCR-Fragmente wurde mittels Kapillargelelektrophorese analog Beispiel 3 durchgeführt. Es war zu erwarten, daß die Abweichung von der theoretischen Fragmentlänge für das Fragment des Gens NME3 deutlich größer ist, da dieses Fragment überdurchschnittlich viele Cyto- sine enthält. Entsprechend wurden Werte für die beiden
Einzelstränge von 670 und 708 gemessen, der theoretische Wert beträgt 686. Die große Aufspaltung von 37 bp ermöglicht eine einfache Identifikation genomischer Restanteile, die über die unspezifischen Primer mitamplifiziert werden. Bei einer vollständigen Umwandlungen können zwi- sehen den bisulfitspezifischen Peaks (A und B) keine zusätzlichen genomischen Peaks (C) detektiert werden.
Hiermit konnte gezeigt werden, daß sich die Fragmentana- lyse zudem zur Qualitätskontrolle der Bisulfitreaktion eignet .
Legende zu den Figuren:
Figuren 2-4: linke Spalte: Fragmentanalyse; mittlere Spalte: Gelbild; rechte Spalte: Methode
Fig. 2: Methode A: Reaktionstemperatur: 50°C; Reaktionszeit: 5h; Thermo-Spikes : keine; Aufspaltung: 37 (671 - 708); Restgenomische Anteile detektierbar (C) ; Keine vollständige Umwandlung
Fig. 3: Reaktionstemperatur: 50°C; Reaktionszeit: 2.5h; Thermo-Spikes: 10; Splitting: 37 (671 - 708); Keine restgenomischen Anteile detektierbar; Vollständige Umwandlung
Fig. 4: Reaktionstemperatur: 50°C; Reaktionszeit: 5h; Thermo-Spikes: keine; Splitting: 17 (672 - 689); Restge- nomischer Anteil detektierbar (C) ; Keine vollständige Umwandlung

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Nachweis von Cytosin-Methylierung in DNA-Proben, dadurch gekennzeichnet, dass die folgenden Verfahrensschritte ausgeführt werden:
eine genomische DNA Probe wird chemisch, bevorzugt mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) , der- art behandelt, dass Cytosin in Uracil umgewandelt wird, während 5-Methylcytosin unverändert bleibt,
Abschnitte der Proben-DNA werden mit mindestens 2 Primern in einer Polymerasereaktion, bevorzugt einer Poly erasekettenreaktion, amplifiziert,
die Fragmente werden hinsichtlich der Basenzusammensetzung jeweils der beiden komplementären Stränge des Amplifikates untersucht, wobei aus dem Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge auf den Methylierungsstatus in dem amplifizierten Abschnitt der genomischen DNA-Probe geschlossen wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden
Stränge durch denaturierende Gelelektrophorese gemessen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden
Stränge durch Kapillargelelektrophorese bestimmt wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch chomatographische Verfahren gemessen wird.
5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass denaturierende Hochdruckflüssigkeits-chromato- graphie (HPLC) verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass zusätzlich zum Moleku- largewicht auch noch weitere Faktoren wie z. B. der unterschiedliche Gesamtgehalt an Guanin, an Amino- funktionen oder Ketofunktionen der beiden komplementären Stränge zu ihrem unterschiedlichen Verhalten in einer der analytischen Methoden der Ansprüche 2 bis 5 beitragen.
7. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Unterschied im Molekulargewicht der beiden Stränge durch Massenspektro- metrie gemessen wird.
8. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass Referenz-DNA bekannter Zusammensetzung und gleicher oder ähnlicher Länge bei der Analyse als externer oder interner Standard verwendet wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Referenz-DNA um Bisulfit- behandelte DNA aus einer Referenzprobe mit bekanntem Methylierungsstatus handelt oder aber um die ohne vorherige chemische Behandlung amplifizierte genomische DNA mit gleicher oder ähnlicher Fragmentlänge wie das jeweils analysierte Fragment.
10. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die Proben DNA aus Serum oder anderen Körperflüssigkeiten eines Individuums, aus Zellinien, Blut, Sputu , Stuhl, Urin, Serum, Gehirn-Rückenmarks-Flüssigkeit, in Paraffin ein- bettetem Gewebe, beispielsweise Gewebe von Augen, Darm, Niere, Hirn, Herz, Prostata, Lunge, Brust oder Leber, histologischen Objektträgern und allen möglichen Kombinationen hiervon gewinnt.
11. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man die chemische Behandlung mit einem Bisulfit (=Disulfit, Hydrogensulfit) durchführt.
12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die chemische Behandlung nach Einbetten der DNA in Agarose erfolgt.
13. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass bei der chemischen Behandlung ein die DNA-Duplex denaturierendes Reagenz und/oder ein Radikalfänger zugegen ist.
14. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikation mehrerer Fragmente in einem Reaktionsgefäß in Form einer Multiplex-PCR durchgeführt wird.
15. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die in der Amplifikation eingesetzten Primer die chemisch mit Bisulfit umgewandelte DNA amplifizieren, nicht aber die entsprechende nicht umgewandelte genomische Sequenz.
16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zugleich die Qualität der Bisulfitreaktion gemesen wird, indem auch nicht umgewandelte Fraktionen nachgewiesen werden.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die verwendeten Primer gleichermassen Bisulfit- umgewandelte sowie genomische DNA amplifizieren.
18. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Amplifikate für die Detektion mit mindestens einer nachweisbaren Markierung versehen sind, die bevorzugt durch Markierung der Primer während der Amplifikation eingebracht wird.
19. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Fluoreszenzmarkierungen sind.
20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die Markierungen Radionuklide sind.
21. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die beiden Stränge der Amplifi- kate getrennt werden und insgesamt im Massenspektro- meter nachgewiesen werden und somit durch ihre jeweilige Masse eindeutig charakterisiert sind.
22. Verfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass man aus dem Methylierungsgrad an den verschiedenen untersuchten CpG Positionen auf das Vorliegen einer Erkankung oder eines anderen medizinischen Zustandes des Patienten schließt .
23. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranstehenden Ansprüche zur Diagnose und/oder Prognose nachteiliger Ereignisse für Patienten oder Individuen, wobei diese nachteiligen Ereignisse mindestens einer der folgenden Kategorien angehören: unerwünschte Arzneimittelwirkungen; Krebserkrankungen; CNS- Fehlfunktionen, Schäden oder Krankheit; Aggressionssymptome oder Verhaltensstörungen; klinische, psychologische und soziale Konsequenzen von Gehirnschädi- gungen; psychotische Störungen und Persönlichkeitsstörungen; Demenz und/oder assoziierte Syndrome; kardiovaskuläre Krankheit, Fehlfunktion und Schädigung; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des gastroin- testinalen Traktes; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Atmungssystems; Verletzung, Entzündung, Infektion, Immunität und/oder Rekonvaleszenz; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit des Körpers als Abweichung im Entwicklungsprozess; Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit der Haut, der Muskeln, des Bindegewebes oder der Knochen; endokrine und metabo- lische Fehlfunktion, Schädigung oder Krankheit; Kopfschmerzen oder sexuelle Fehlfunktion.
24. Verwendung eines Verfahrens nach einem der voranste- henden Ansprüche zur Unterscheidung von Zelltypen o- der Geweben oder zur Untersuchung der Zelldifferenzierung.
25. Kit, bestehend aus einem Bisulfit enthaltenen Rea- genz, Primern zur Herstellung der Amplifikate, sowie optional einer Anleitung zur Durchführung eines As- says nach einem der Ansprüche 1-22.
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