EP1402028A2 - Oligonucleotides pour la regulation du gene codant pour le tnf-alpha et/ou de genes sous son controle et leur application - Google Patents

Oligonucleotides pour la regulation du gene codant pour le tnf-alpha et/ou de genes sous son controle et leur application

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Publication number
EP1402028A2
EP1402028A2 EP02718264A EP02718264A EP1402028A2 EP 1402028 A2 EP1402028 A2 EP 1402028A2 EP 02718264 A EP02718264 A EP 02718264A EP 02718264 A EP02718264 A EP 02718264A EP 1402028 A2 EP1402028 A2 EP 1402028A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
oligonucleotides
tnfα
target
oligonucleotide
gene
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP02718264A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jacques Pourel
Jean-Yves Jouzeau
Isabelle Chary-Valckenaere
Amr Abid
Horea Porumb
Eliane Taillandier
Patrick Netter
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
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Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP1402028A2 publication Critical patent/EP1402028A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1136—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against growth factors, growth regulators, cytokines, lymphokines or hormones
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/15—Nucleic acids forming more than 2 strands, e.g. TFOs

Definitions

  • the subject of the invention is oligonucleotides capable of regulating the gene coding for the necrotizing factor for alpha tumors (TNF ⁇ for short) and / or of genes under its control, and their applications in diagnosis, in therapy and as research tools.
  • TNF ⁇ is a pro-inflammatory cytokine that modulates the growth, differentiation and function of a large number of cell types, hence a broad spectrum of biological activities. It is involved in the pathophysiology of many ailments, in particular chronic inflammatory diseases, such as rheumatoid arthritis. Indeed, TNF ⁇ plays a central role in synovial inflammation and osteocartilaginous destruction which characterizes this disease where the perpetuation of inflammation is linked to an excess production of pro-inflammatory cytokines such as interleukins l ⁇ (ILl ⁇ ) , 6 (IL6), and 8 (IL8).
  • ILl ⁇ interleukins l ⁇
  • 6 6
  • IL8 8
  • TNF ⁇ also plays a central role in immune and tumor pathologies and its action on the central nervous system is the cause of fever, anorexia and weight loss.
  • Another approach consists in inhibiting the expression of the TNF ⁇ gene using oligonucleotides for gene therapies.
  • antisense oligonucleotides capable of reducing the translation of TNF ⁇ has thus been reported.
  • various studies have shown the efficiency and selectivity of antisense oligonucleotides directed against the mRNAs of cytokines, growth factors, adhesion molecules, enzymes of biosynthesis of mediators of inflammation (3) and (4).
  • the use of triple helix oligonucleotides has also shown its in vitro efficacy in inhibiting the expression of genes, such as those coding for the human oncogenes c-myc, c-erbB, Ha-ras, HER- 2 / neu.
  • Anti-gene oligonucleotides making it possible to reduce the transcription of the gene coding for TNF ⁇ , have also been described (5). In other studies, oligonucleotides have been used to induce cleavage of the target nucleic acid
  • an oligonucleotide can also specifically recognize a protein by the aptamer effect.
  • the inventors' research in this field has focused on the development of oligonucleotides capable of inhibiting non only the gene coding for TNF ⁇ in mammals, including in humans, but also genes under its control.
  • the invention therefore relates to new oligonucleotides for inhibiting the transcription of the TNF gene and of genes under its control. It also aims at the applications of these oligonucleotides for such inhibitions, in diagnosis, research and therapy.
  • oligonucleotides of the invention are capable of directly or indirectly modulating the expression of the gene coding for the necrotizing factor for alpha tumors (TNF ⁇ ) in different species and / or of genes under its control. These oligonucleotides are characterized in that they comprise:
  • oligonucleotides located on either side of the constant part, giving the oligonucleotides a specificity of direct or indirect interaction with the target in the TNF ⁇ gene of the species considered,
  • oligonucleotides are more particularly characterized in that they comprise from 8 to 25 nucleotides, preferably of the order of 20 nucleotides.
  • the target of these oligonucleotides consists of a deoxyribonucleic, ribonucleic acid sequence, or a protein interacting directly or indirectly with this sequence.
  • the target sequence can be intronic, exonic or overlap the two types of DNA.
  • the target consists of a double helix of nucleic acid comprising at least the sequence:
  • the oligonucleotides and the duplex target can be of Watson-Crick type perfect or imperfect, of Hoogsteen type or reversed or others. They are optionally formed with one or both strands of the duplex.
  • This target in the case of the human gene coding for TNF ⁇ , is located in the promoter, upstream of the transcription initiation codon and of the TATA box, and in position 563-570 of the nucleotide sequence (number accession X02910 and X02159 from Gene Bank) published by Nedwin et al. (6).
  • the interaction of an oligonucleotide with this target can then lead to a reduction in transcription.
  • this interaction of oligonucleotides with the target can inhibit the binding of a regulatory protein essential for the expression of the target gene (transcription factor for example). This interaction can also introduce irreversible damage (cuts, cross-links) in the DNA molecule, making it incapable, locally, for gene expression.
  • this target is also found in the promoter upstream of the TATA box.
  • this target is in position 934-941 of the nucleotide sequence (accession number U68415 of the Gene Bank) published by Iraqi and Teale (7).
  • Bovidae for example in Bos taurus
  • the target is in position 1131-1138 of the sequence having the accession number AF011926 of the Gene Bank.
  • Hominidae for example in Pan troglodytes
  • the target is in position 344-351 of the sequence having the accession number U42626 of the
  • oligonucleotides of the present invention do not interact directly with the target constituted by the nucleic acid, but with one of the proteins involved in the recognition of this target and / or the regulation of transcription of the TNF ⁇ gene.
  • the constant part is complementary to the target sequence, that is to say that a guanine of the sequence of the oligonucleotide corresponds to a cytosine of the target sequence, and that a guanine of the reverse sequence of the oligonucleotide corresponds to a cytosine in the target sequence.
  • the cytosine, complementary to guanine is replaced in the sequence of the oligonucleotide by another pyrimidine base, thymine, or by a purine base, adenine or uracil. It will be noted that two orientations are possible.
  • the sequence of the two variable parts will be determined by the sequence of the gene whose expression is to be modulated.
  • the oligonucleotides comprise variable parts of sequences AAGAAA and AGGAGAG, located, respectively on the 5 'side and on the 3' side in direction 5! _> 3 ', or on the 3' side and on the 5 'side in the direction 3' ⁇ _5 '.
  • the oligonucleotides comprise variable parts of sequences TCGAAAA and AGAAGG, located, respectively on the 5 ′ side and on the 3 ′ side in the direction 5. ⁇ 3 ', or on the 3' side and on the 5 'side in the direction 3' ⁇ _. 5 '.
  • the variable parts correspond to the CGGAAA and AGAAGTG sequences, located, respectively, on the 5 'side and on the 3' side in the 5 Lj.3 'direction, or on the 3' side and on the 5 'side in the 3 direction. ' ⁇ _5'.
  • the oligonucleotides thus designed can also interact not with the TNF ⁇ gene but with transcription factors. Indeed, the sequence AAGAAAGGGNGGGGGAGAG is for example recognized by the transcription factors GKLF (Gut-enriched Krueppel Like-Factor), MZF1 (Myeloid Zinc Finger protein 1) or Spl (Stimulating protein 1).
  • the choice of the two complementary variable parts on at least 4 nucleotides will give oligonucleotides which will have a so-called "hairpin" structure.
  • the oligonucleotides comprise variable parts of sequences NIS ⁇ NNNNNCCCCAA and GGGGNNNNN located respectively on the 5 'side and on the 3' side in the direction 5 i-> 3 'or on the 3' side and on the 5 'side in the direction 3 lç_5 'of the constant part.
  • N can be T, A, C, G or U.
  • the oligonucleotides thus designed will interact with the target proteins by structural recognition.
  • the oligonucleotides of the invention comprise from 8 to 30 nucleotides, preferably of the order of 20 nucleotides, in particular 21 nucleotides.
  • the oligonucleotides of the invention may include modifications of their phosphodiester chains and / or of additional reactive groups located at their ends.
  • modifications introduced into the oligonucleotides are to increase the resistance of these molecules to nucleolytic degradation, and / or to promote their interactions with their targets, and / or to allow specific degradation / modification reactions of the DNA targets, and / or to increase their intracellular penetration, and / or to improve the crossing of biological membranes.
  • modifications or substitutions are given by way of illustration and do not constitute a limitation to the present invention. Modifications or substitutions include N-alkylphosphoramidates, phosphorothioates, phosphotriesters, methylphosphonates, short alkyl chains, heteroatoms, ⁇ ycloalkyl or heterocyclic inter-sugar bridges.
  • the phosphodiester bonds of the oligonucleotide backbone can be replaced by 3' ⁇ 5 'phosphoramidate bonds or by bonds, polyamides, nucleic bases are then linked directly or indirectly to the aza nitrogen of the polyamide.
  • the modifications or substitutions can also take place at the 2 ′ position of the carbohydrate parts of the oligonucleotides, comprising one of the following substitutions: OH, SH, SCH 3 , F, OCN, OCH 3 OCH 3 , OCH 3 0 (CH 2 ) n CH 3 , 0 (CH 2 ) n NH 2 , 0 (CH 2 ) n CH 3 , Cl, Br, CN, CF 3 , 0CF 3 , O-alkyl, S-alkyl, N-alkyl, O-alkenyl, S- alkenyl, N-alkenyl, SOCH 3 , S0 2 CH 3 ON0 2 , N0 2 , N 3 , NH 2
  • the modifications also include those of type 2 '-methoxyethoxy (2' -0- CH 2 CH 2 OCH 3 ), 2 '-methoxy (2' -0-CH 3 ) or 2'propoxy (2 '-0-CH 2 CH 2 CH 3 ). All the modifications in position 2 ′ of the nucleic sugars mentioned above can take place in position 3 ′ of the sugars, in position 3 ′ of the terminal nucleotide or 5 ′ of the terminal nucleotide.
  • the oligonucleotides can also have mimic sugars, such as cyclobutyls in place of pentofuranosyls, sugars derived from xylose, sugars in blocked conformation, isomers of D- or L- form. Substitution or modification of the nucleic bases by universal bases (such as hypoxanthine) can also take place.
  • the nucleotides can be of anomerism ⁇ instead of ⁇ as in natural nucleic acids.
  • the lipophilic parts can be grafted to the oligonucleotides of the present invention.
  • the purpose of these substitutions is to modify the charge and / or hydrophilicity of the oligonucleotides in order to increase the passage of the biological membranes.
  • lipophilic parts include, for example, cholesterol, a cholesteryl group, cholic acid, thioethers (hexyl-S-tritylthiol, for example), thiocholesterol, aliphatic chains (for example, dodecandiol or undecyl residues), phospholipids (di-hexadecyl-racglycero-3-H-phosphonate, for example), polyamine or polyethylene glycol chains, adamantane acetic acid, a palmityl group, an octadecylamine or hexylamino-carbonyl-oxycholesterol group.
  • Groups can be substituted to facilitate the detection of oligonucleotides.
  • Peptides can be covalently linked to the oligonucleotides of the present invention to aid in the recognition of organs, tissues or cell types. All these modifications or substitutions can obviously be combined with one another.
  • oligonucleotides of the present invention may be part of a circular or circularizable DNA or RNA.
  • oligonucleotides of the invention has made it possible to demonstrate their effectiveness and their specificity for modulating the expression of the genes coding for products exerting pathogenic effects in humans and animals, more particularly the gene coding for TNF ⁇ , or genes under his control.
  • the invention therefore relates to pharmaceutical compositions characterized in that they contain a therapeutically effective amount of at least one oligonucleotide as defined above in association with a pharmaceutically acceptable vehicle.
  • compositions can be used for curative or prophylactic purposes.
  • the treatment of a patient in need of this type of therapy is based on the administration of a pharmaceutical form of the oligonucleotide at doses between 0.01 ⁇ g and 100 g per kg of weight of the ( of the) patient.
  • the choice of dose will depend on the age of the patient, the severity of the disease and the nature of the condition.
  • the frequency of administration can be once or several times a day, once every twenty years.
  • the patient is followed up to assess the improvements in their medical condition and symptoms. Given these observations, the doses may then be increased in the event that the patient does not respond significantly to treatment, or decreased in the opposite case.
  • the patient it is preferable to treat the patient with the oligonucleotides of the present invention in combination with conventional therapies already existing, in order to increase the effectiveness of the treatment.
  • the doses administered will be between 0.01 ⁇ g and 100 g per kg of patient's weight at frequencies that can range from one to several times a day, up to once every 20 years.
  • the routes of administration of the pharmaceutical preparation (or formula) of the oligonucleotides of the present invention will vary depending on whether local or systemic treatment is desired. Administrations will then be transmucous
  • Parenteral administration can be epidural, intravenous (direct or infusion), subcutaneous, intraperitoneal, intrathecal, intracardiac, intramuscular or intra-articular.
  • the dosage form and the conditioning which the oligonucleotides will have to undergo in order to constitute medicaments will depend on the routes of administration.
  • the oligonucleotides can be administered in the form of lotions, creams, ointment, drops, suppositories, liquids, powders, aerosol.
  • the oligonucleotides can also be administered using active (mechanical or electrical) or passive devices.
  • the excipients will be components without pharmacological action but necessary for the manufacture, administration or conservation of the oligonucleotides of the present invention.
  • the oligonucleotides of the present invention can be administered for example in the form of powder, granule, capsule, cachet, tablet, capsule, tablet or suspension in aqueous or non-aqueous solution.
  • Parenteral administration can be in the form of a sterile aqueous solution which may contain buffers or other additives.
  • Active devices mechanical or electrical
  • the dosage of pharmaceutical preparations will depend on the severity and the response to treatment for the condition to be treated.
  • the optimal doses to be administered to patients will depend on the pharmacological activity of the oligonucleotides. This activity is generally determined in vitro or in vivo in experimental animal models by the effective doses 50 (ED 50 ).
  • the inflammatory model of experimental arthritis in rats using Freund's complete adjuvant (ACF) is a model widely used for the evaluation of the pharmacological activity of anti-rheumatic drugs.
  • the pharmacological activity of the oligonucleotides of the present invention can thus be evaluated in this model.
  • the parameters that will be taken into account to determine this pharmacological activity will be: - Fever;
  • the invention also relates to the use of the oligonucleotides defined above as tools for research and for diagnosis. It thus uses a diagnostic method where the oligonucleotides of the present invention, whether or not included in a kit, are used to account for the accumulation associated with a pathological process of an active transcriptional factor.
  • Physiological processes are intimately linked to the transcriptional activity of a large number of genes. This so-called physiological transcription of genes is dependent on the balance between the active or inactive state of a limited number of transcriptional factors.
  • a pathological process is often associated with an increase or decrease in the number of active transcriptional protein factors.
  • oligonucleotides of the present invention in solution or on a fixed support, single strand or double strand, coupled or not with a tracer such as a fluorophore, a chromophore or an enzyme, can be used to quantify an active transcriptional factor. It has thus been reported that an oligonucleotide in solution coupled to a fluorophore called "Molecular Beacons" by interacting with a protein produced fluorescence easily quantifiable by current spectrofluorometry methods (16). It has also been reported that a double stranded oligonucleotide attached to a solid support could be used to quantify the protein-nucleic acid interaction during high throughput screening (17).
  • the oligonucleotides of the present invention are used to study physiopathological mechanisms at the cellular and / or molecular level. They can thus be used to evaluate the impact of a certain number of molecules on these same pathophysiological mechanisms.
  • kits containing the defined oligonucleotides above and the reagents necessary for carrying out research and diagnostics are also falling within the protective field of the invention.
  • the oligonucleotides are in solution or on a support, single strand or double strand, coupled or not with a tracer, such as a fluorophore, a chromophore, or an enzyme.
  • a tracer such as a fluorophore, a chromophore, or an enzyme.
  • FIGS. 1 to 5 respectively represent: FIG. 1: the effect of the inter-eron-gamma (IFN) and of the lipopolysaccharide (LPS) on the production of TNF ⁇ in THP-1 cells.
  • IFN inter-eron-gamma
  • LPS lipopolysaccharide
  • the results represent the average of three independent tests ⁇ standard deviation. ND, not detectable; *, significantly different from cells without treatment (p ⁇ 0.01);
  • FIG. 2 the effect of 1 gamma interferon (IFN) and lipopolysaccharide (LPS) on the synthesis of TNF ⁇ mRNA in THP-1 cells.
  • IFN 1 gamma interferon
  • LPS lipopolysaccharide
  • FIG. 3 the kinetics of TNF ⁇ production in stimulated THP-1 cells.
  • the cells were treated with IFN (10 ng / ml) + LPS (10 ⁇ g / ml).
  • the results represent the average of three independent tests ⁇ standard deviation. ND, not detectable; *, significantly different from 2 h cells (p ⁇ 0.01);
  • FIG. 4 the effect of an oligonucleotide according to the invention on the production of TNF ⁇ in THP-1 cells stimulated with the LPS-IFN association (10 ⁇ g / ml - 10 ng / ml).
  • the results represent the average of three independent tests ⁇ standard deviation; *, significantly different from the control cells (p ⁇ 0.0001); **, significantly different from LPS-IFN cells (p ⁇ 0.005); ND, not detectable;
  • FIG. 5 the effect of a 21T oligonucleotide on the synthesis of TNF ⁇ mRNA in THP-1 cells stimulated with the LPS-IFN association (10 ⁇ g / ml - 10 ng / ml). 1, cells treated with 0.1% (v / v) DMSO; 2, cells stimulated by LPS-IFN; 3, stimulated cells treated with 1 nM; 4, stimulated cells treated with 10 nM; 5, stimulated cells treated with 100 nM.
  • Oligonucleotides are synthesized chemically according to conventional methods and using existing equipment and devices on the market. Treatment of human cells The results reported in the examples were obtained with a monocytic human cell line since monocytes constitute the major source of TNF ⁇ in the inflammatory reaction. It is the THP-1 cell line from a 1 year old child with acute monocytic leukemia. This line has a monocytic morphology and differs in macrophage (8). Lipopolysaccharide and gamma interferon, which constitute powerful cytokine inducers, have been used as inducing molecules.
  • the THP-1 human monocytic line (ECACC, Cerdic, France) is cultured in RPMI 1640 medium, supplemented with 2 mM L-glutamine, 100 IU / ml penicillin, 100 ⁇ g / ml streptomycin, 0.25 ⁇ g / ml fungizone, 10% (v / v) of fetal calf serum decomplemented at 56 ° C for 30 minutes (all products from Life Technologies, France).
  • the cultures are kept in an incubator at 37 ° C. in a humid atmosphere containing 5% of CO 2 .
  • the cells are cultured in 24-well plates (Costar, France) at the density of
  • TNF ⁇ production is induced by treating THP-1 cells with a mixture of lipopolysaccharide (LPS) from Escherichia coli 055: B5 (Sigma, France) and human gamma interferon (IFN; Tebu, France).
  • LPS lipopolysaccharide
  • IFN human gamma interferon
  • the cells are deposited in a volume of 0.5 ml / well of complete culture medium, incubated for 18 hours at 37 ° C., then 0.5 ml of complete medium containing:
  • TNF ⁇ concentrations are determined by an ELISA method (Enzyme Immuno Sorbent Assay; Biotrak,
  • RNAs are separated from the cell pellets according to the method of Chomczynski et al. (10) using the Trizol® solution (Life Technologies, France). The synthesis of TNF ⁇ mRNAs is analyzed by the reverse transcription method, followed by chain amplification by polymerase.
  • the primer sequence used for reverse transcription is as follows:
  • the amplification reaction takes place in the following reaction mixture:
  • the amplification reaction comprises three steps (11).
  • TNF-F 5 'GGCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3'
  • TNF-R 5'TAGACCTGCCCAGACTCGGCAA-3 '
  • HG3PDH-F 5 '-TATTGGGCGCCTGGTCACCAGG-3'
  • HG3PDH-R 5 '-CTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'
  • the amplification gives products having a size of 933 bp for G3PDH, and 462 bp for TNF ⁇ .
  • the specificity of the amplification was verified by the size of the products obtained and by sequencing of the cDNAs.
  • the amplification products are separated on a 1% (w / v) agarose gel under a constant voltage.
  • the gel contains ethidium bromide (0.2 ⁇ g / ml) (Life Technologies, France).
  • the gel is photographed under UV light (in transillumination) using a CCD camera.
  • Figure 1 gives the results of stimulation of TNF ⁇ production.
  • the different concentrations of LPS have no effect on the production of TNF ⁇ in THP-1 cells.
  • the addition of 10 ng / ml of IFN to the three concentrations of LPS leads to a dose-dependent increase in the production of TNF ⁇ .
  • IFN alone also causes an increase in TNF ⁇ production.
  • this increase remains significantly lower than that produced by the IFN-LPS association.
  • the effect of the various concentrations of LPS associated or not with 1 IFN on the expression of the TNF ⁇ gene has also been studied by implementing a semi-quantitative method, reverse transcription followed by chain amplification.
  • G3PDH Gene encoding G3PDH was used as the standard to which increases in TNF ⁇ expression have been reported.
  • the expression of the gene coding for G3PDH is very insensitive to treatment with LPS or with cytokines (14).
  • THP-1 cells causes a slight increase in expression of the TNF ⁇ gene.
  • Treatment with IFN alone also causes an increase in TNF ⁇ mRNAs.
  • the combination of IFN and LPS leads to a dose-dependent increase in mRNA. In addition, this increase is greater than that caused by treatment with LPS or IFN alone.
  • FIG. 3 shows that the treatment of THP-1 cells by the association IFN-LPS (10 ng / ml IFN and 10 ⁇ g / ml LPS) on the production of TNF ⁇ causes a significant time-dependent increase. Inhibition of TNF ⁇ production
  • THP-1 cells The transfection of THP-1 cells is carried out using the ExGen 500 (Euromedex, France) which is a vector constituted by an association of ethyleneimine polymers (PEI) (15). As described above, one million cells are deposited per well under a volume of 0.5 ml of complete culture medium, incubated for 18 hours at 37 ° C. and under 5% of CO 2 , then 0.1 ml of solution of transfection is added to the cells, then the cells are incubated for 4 hours at 37 ° C. under 5% CO 2 .
  • ExGen 500 Euromedex, France
  • PEI ethyleneimine polymers
  • 0.4 ml of stimulation solution (10 ng / ml of IFN + 10 ⁇ g / ml of LPS per well in complete culture medium) is added to the cells, then these are incubated for 18 hours at 37 ° C under 5% C0 2 . After 18 hours of incubation, the samples are taken and centrifuged at 12,000 g for 3 minutes. The supernatants as well as the pellets are stored separately at -80 ° C. until their respective uses for the determination of the TNF ⁇ contents and the preparation of the RNAs.
  • the transfection solution consists of the oligonucleotides diluted to the desired concentrations in 0.05 ml of a 0.9% NaCl solution (w / v).
  • 0.01 ml of ExGen 500 is diluted in 0.05 ml of the same NaCl solution.
  • the 0.05 ml of vector solution is added to the 0.05 ml of the oligonucleotide solution.
  • the mixture is vortexed, centrifuged briefly, then incubated for 15 minutes at room temperature (time required for the formation of the oligonucleotide-vector complex).
  • the penetration of the oligonucleotide into the THP-1 cells is checked, using a 21T oligonucleotide coupled to a fluorescent label (denoted 21T *).
  • the results show that the transfection leads to accumulation in the cells of the oligonucleotide.
  • the treatment of THP-1 cells by the LPS-IFN association causes an increase in TNF ⁇ mRNAs, without affecting the expression of the gene coding for G3PDH.
  • the increase in expression of the TNF ⁇ gene induced by LPS-IFN is reduced in a dose-dependent manner by the oligonucleotide 21T at concentrations of 1 nM, 10 nM and 100 nM. Oligonucleotide 21T has no effect on the expression of the gene encoding G3PDH.
  • a control oligonucleotide (21 mer of identical composition to 21T, but of different sequence) was used at the same concentrations as 21T without any significant effect on the stimulated production of TNF ⁇ in THP-1 cells.
  • the oligonucleotides 21T and the control at the concentrations used have no significant cellular toxicity as has been determined using the method of release into the cell supernatant of lactate dehydrogenase.
  • Nedwin GE Naylor SL, Sakaguchi AY, Smith D, Jarrett- Nedwin J, Pennica D, Goeddel DV, Gray PW.
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Abstract

L'invention vise des oligonucléotides capables de moduler directement ou indirectement l'expression du gène codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha (TNFα) dans différentes espèces et ou de gènes sous son contrôle. Ces oligonucléotides sont caractérisés en ce qu'ils comportent: une partie constante - GGGGNGGG -, oú N = T,A ou U, orientée de 5' vers 3' ou de 3' vers 5', complémentaire d'une séquence cible; deux parties variables, situées de part et d'autre de la partie constante, conférant aux oligonucléotides une spécifité d'interaction directe ou indirecte avec la cible dans le gène TNFα de l'espèce considérée, dont la base à chacune des extrémités, adjacente à la partie constante, est une purine. Applications en diagnostic et en thérapeutique, et comme outils de recherches.

Description

OLIGONUCLEOTIDES POUR LA REGULATION DU GENE CODANT POUR LE TNFα ET/OU DE GENES SOUS SON CONTROLE ET LEURS APPLICATIONS
L'invention a pour objet des oligonucléotides capables de réguler le gène codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha (TNFα en abrégé) et/ou de gènes sous son contrôle, et leurs applications en diagnostic, et en thérapeutique et comme outils de recherche.
Le TNFα est une cytokine pro-inflammatoire qui module la croissance, la différenciation et la fonction d'un grand nombre de types cellulaires, d'où un large spectre d'activités biologiques. Il est impliqué dans la physiopathologie de nombreuses affections, en particulier les maladies inflammatoires chroniques, comme la polyarthrite rhumatoide. En effet, le TNFα joue un rôle central dans l'inflammation synoviale et la destruction ostéo-cartilagineuse qui caractérise cette maladie où la pérennisation de l'inflammation est liée à un excès de production de cytokines pro-inflammatoires comme les interleukines lβ (ILlβ) , 6 (IL6) , et 8 (IL8) .
Le TNFα joue également un rôle central dans les pathologies immunitaires et tumorales et son action sur le système nerveux central est à l'origine de fièvre, d'anorexie et d'amaigrissement.
Son inhibition spécifique constitue donc l'un des objectifs majeurs dans une perspective thérapeutique et pour la compréhension de la physiopathologie de ces affections. Une démonstration en a été fournie par les effets cliniques bénéfiques obtenus par l'administration d'anticorps monoclonaux chimériques anti-TNFα (1) ou de récepteurs solubles du TNFα chez des sujets atteints de polyarthrite rhumatoide . Il a été également montré par des études expérimentales chez le rat que la neutralisation on l'inhibition de la production de TNFα conduisait à la diminution de la production de 1 ' ILlβ et par conséquent à celles de 1 ' IL6 et de 1 ' IL8 (2) . Cependant, l'intérêt pratique de l'utilisation d'anticorps anti-TNFα ou de récepteurs solubles semble être limité dans le traitement au long cours de la polyarthrite rhumatoide.
Une autre approche consiste à inhiber l'expression du gène du TNFα à l'aide d' oligonucléotides en vue de thérapies géniques .
On a ainsi rapporté l'élaboration d ' oligonucléotides antisens capables de réduire la traduction du TNFa. A cet égard, divers travaux ont montré l'efficacité et la sélectivité d' oligonucléotides antisens dirigés contre les ARNm des cytokines, des facteurs de croissance, des molécules d'adhésion, des enzymes de biosynthèse des médiateurs de l'inflammation (3) et (4). L'utilisation d' oligonucléotides formant des triples hélices a également montré son efficacité in vi tro dans l'inhibition de l'expression des gènes, comme ceux codant pour les oncogènes humains c-myc, c-erbB, Ha-ras, HER-2/neu.
Des oligonucléotides anti-gènes, permettant de réduire la transcription du gène codant pour TNFα, ont également été décrits (5) . Dans d'autres travaux, les oligonucléotides ont été utilisés pour induire la coupure de l'acide nucléique cible
(stratégie ribozyme) , ou pour agir comme ligand compétitif d'une protéine vis-à-vis de sa cible naturelle d'acide nucléique (stratégie leurre). En s ' autostructurant , un oligonucleotide peut également reconnaître spécifiquement une protéine par effet aptamère.
Les recherches des inventeurs dans ce domaine ont porté sur l'élaboration d' oligonucléotides capables d'inhiber non seulement le gène codant pour le TNFα chez les Mammifères, y compris chez l'Homme, mais également de gènes sous son contrôle .
Leurs travaux ont ainsi montré qu'en concevant des oligonucléotides de séquence déterminée, il était possible d'atteindre de tels résultats à très faible dose. Ainsi, sur des cellules en culture, des doses efficaces de tels oligonucléotides se situent dans une gamme de concentration de l'ordre du nanomolaire, alors que les doses rapportées dans l'art antérieur pour bloquer la production de TNFα sont de l'ordre du micromolaire.
L'invention vise donc de nouveaux oligonucléotides pour inhiber la transcription du gène TNF et de gènes sous son contrôle . Elle a également pour but les applications de ces oligonucléotides pour de telles inhibitions, en diagnostic, recherche et thérapeutique.
Les oligonucléotides de l'invention sont capables de moduler directement ou indirectement l'expression du gène codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha (TNFα) dans différentes espèces et/ou de gènes sous son contrôle. Ces oligonucléotides sont caractérisés en ce qu'ils comportent :
- une partie constante - GGGGNGGG-, où N = T,A ou U,
• orientée de 5 'vers 3' ou de 3 ' vers 5', • complémentaire d'une séquence cible,
- deux parties variables,
. situées de part et d'autre de la partie constante, conférant aux oligonucléotides une spécificité d'interaction directe ou indirecte avec la cible dans le gène TNFα de l'espèce considérée,
. dont la base à chacune des extrémités, adjacente à la partie constante, est une purine. Ces oligonucléotides sont plus particulièrement caractérisés en ce qu'ils comprennent de 8 à 25 nuclêotides, de préférence de l'ordre de 20 nuclêotides.
La cible de ces oligonucléotides est constituée par une séquence d'acide deoxyribonucléique, ribonucléique, ou une protéine interagissant directement ou indirectement avec cette séquence.
Il s'agit par exemple d'une cible située sur le brin codant ou non codant de l 'ADN ou de l'ARN des organismes vivants, eucaryotes, procaryotes et des virus.
Dans le cas de l'ADN des eucaryotes, nucléaire ou extranucléaire, la séquence cible peut être intronique, exonique ou chevaucher les deux types d'ADN.
En variante, la cible est constituée par une double hélice d'acide nucléique comportant au minimum la séquence :
5' -CCCCGCCC-3 ' , ou
3 '-GGGGCGGG-5' .
Si les interactions entre les oligonucléotides et la cible duplex font intervenir des liaisons hydrogène, ces dernières peuvent être de type Watson-Crick parfaites ou imparfaites, de type Hoogsteen ou inversées ou autres. Elles sont formées éventuellement avec l'un des brins ou les deux brins du duplex.
Cette cible, dans le cas du gène humain codant pour le TNFα, est située dans le promoteur, en amont du codon d'initiation de la transcription et de la boîte TATA, et en position 563-570 de la séquence nucléotidique (numéro d'accession X02910 et X02159 de la Gène Bank) publiée par Nedwin et col. (6) . Compte tenu du rôle de la boîte TATA dans le mécanisme transcriptionnel et de la distance entre la cible et cette boîte, l'interaction d'un oligonucleotide avec cette cible peut alors conduire à une réduction de la transcription. En effet, cette interaction des oligonucléotides avec la cible peut inhiber la fixation d'une protéine de régulation indispensable à l'expression du gène cible (facteur de transcription par exemple) . Cette interaction peut également introduire des dommages irréversibles (coupures, cross-links) dans la molécule d'ADN, la rendant inapte, localement, pour l'expression génétique.
Chez les autres mammifères et toujours dans le cas du gène codant pour le TNFα, cette cible est également retrouvée dans le promoteur en amont de la boîte TATA. Ainsi, chez les Muridae (par exemple chez Mus musculus BALB/c) , cette cible est en position 934-941 de la séquence nucleotidique (numéro d'accession U68415 de la Gène Bank) publiée par Iraqi et Teale (7) . Chez les Bovidae (par exemple chez Bos taurus) , la cible est en position 1131-1138 de la séquence ayant pour numéro d'accession AF011926 de la Gène Bank. Chez les Hominidae (par exemple chez Pan troglodytes) , la cible est en position 344- 351 de la séquence ayant pour numéro d'accession U42626 de la
Il est possible que les oligonucléotides de la présente invention n' interagissent pas directement avec la cible constituée par l'acide nucléique, mais avec une des protéines impliquées dans la reconnaissance de cette cible et/ou la régulation de la transcription du gêne TNFa.
La partie constante est complémentaire de la séquence cible, c'est-à-dire qu'une guanine de la séquence de l 'oligonucleotide correspond à une cytosine de la séquence cible, et qu'une guanine de la séquence inversée de 1 'oligonucleotide correspond à une cytosine dans la séquence de la cible. Mais la cytosine, complémentaire de la guanine, est remplacée dans la séquence de 1 ' oligonucleotide par une autre base pyrimidique, la thymine, ou par une base purique, l'adénine ou l'uracile. On notera que deux orientations sont possibles .
La séquence des deux parties variables sera déterminée par la séquence du gène dont on souhaite moduler l'expression. Pour moduler l'expression du gène codant pour le TNFα chez les Hominidae, par exemple chez l'Homme ou le Chimpanzé, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences AAGAAA et AGGAGAG, situées, respectivement du côté 5' et du côté 3' dans le sens 5 !_>3 ' , ou du côté 3' et du côté 5' dans le sens 3 '^_5 ' .
Pour moduler l'expression du gène codant pour le TNFα chez les Muridae, par exemple chez le rat ou la souris, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences TCGAAAA et AGAAGG, situées, respectivement du côté 5' et du côté 3 ' dans le sens 5 .^3 ' , ou du côté 3 ' et du côté 5 ' dans le sens 3 '<_.5 ' . Chez les Bovidae, les parties variables répondent aux séquences CGGAAA et AGAAGTG, situées, respectivement, du côté 5' et du côté 3' dans le sens 5 L-j.3 ' , ou du côté 3' et du côté 5' dans le sens 3 '<_5 ' .
Les oligonucléotides ainsi conçus peuvent également interagir non pas ave'c le gène TNFa mais avec des facteurs de transcription. En effet, la séquence AAGAAAGGGNGGGGGAGAG est par exemple reconnue par les facteurs de transcription GKLF (Gut-enriched Krueppel Like-Factor) , le MZF1 (Myeloid Zinc Finger protein 1) ou le Spl (Stimulating protein 1) .
Le choix des deux parties variables complémentaires sur au moins 4 nuclêotides donnera des oligonucléotides qui présenteront une structure dite "en épingle à cheveux" . Dans ce cas, les oligonucléotides comportent des parties variables de séquences NISΓNNNNNCCCCAA et GGGGNNNNN situées respectivement du côté 5' et du côté 3' dans le sens 5 i->3 ' ou du côté 3' et du côté 5' dans le sens 3 lç_5 ' de la partie constante. N peut être T, A, C, G ou U. Les oligonucléotides ainsi conçus interagiront avec les protéines cibles par reconnaissance structurale . De manière avantageuse, les oligonucléotides de l'invention comprennent de 8 à 30 nuclêotides, de préférence de l'ordre de 20 nuclêotides, notamment 21 nuclêotides.
Les oligonucléotides de 1 ' invention peuvent comporter des modifications de leurs chaînes phosphodiester ou/et de groupements réactifs additionnels localisés à leurs extrémités .
Ces modifications introduites dans les oligonucléotides ont pour but d'augmenter la résistance de ces molécules à la dégradation nucléolytique, et/ou de favoriser leurs interactions avec leurs cibles, et/ou de permettre des réactions de dégradation/modification spécifiques des cibles ADN, et/ou d'accroître leur pénétration intracellulaire, et/ou d'améliorer la traversée des membranes biologiques. Les exemples suivants de modifications ou de substitutions sont donnés à titre illustratif et ne constituent pas une limitation à la présente invention. Les modifications ou substitutions incluent les N-alkylphosphoramidates, les phosphorothioates, les phosphotriesters, les méthylphosphonates, les courtes chaînes alkyl, les hétéroatomes, les ponts inter-sucres σycloalkyls ou hêtérocycliques . Les liaisons phosphodiesters du squelette oligonucléotidique peuvent être remplacées par des liaisons 3'γ5' phosphoramidates ou par des liaisons, les polyamides, les bases nucléiques sont alors liées directement ou indirectement à l'azote aza du polyamide. Les modifications ou substitutions peuvent également intervenir en position 2 ' des parties glucidiques des oligonucléotides, comprenant l'une des substitutions suivantes : OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3OCH3, OCH30(CH2)nCH3, 0(CH2)nNH2, 0(CH2)nCH3, Cl, Br, CN, CF3 , 0CF3, O-alkyl, S-alkyl, N-alkyl, O-alkényl, S-alkényl, N-alkényl, SOCH3, S02CH3 ON02, N02, N3, NH2 , hétérocycloalkyl , hétérocycloalkaryl, aminoalkylamino, polyalkylamino, silyl substitué, un groupe ARN clivable, un groupe reporter, un groupe améliorant les propriétés pharmacocinétiques des oligonucléotides, un groupe améliorant les propriétés pharmacodynamiques des oligonucléotides ou d'autres substitutions ayant les même propriétés. Les modifications incluent également celles de type 2 ' -méthoxyéthoxy (2 ' -0- CH2CH2OCH3) , 2 ' -méthoxy (2 ' -0-CH3) ou 2'propoxy (2 ' -0-CH2CH2CH3) . Toutes les modifications en position 2 ' des sucres nucléiques énoncés précédemment peuvent avoir lieu en position 3 ' des sucres, en position 3' du nucléotide terminal ou 5' du nucléotide terminal. Les oligonucléotides peuvent également avoir des sucres mimiques, comme des cyclobutyls à la place des pentofuranosyls, des sucres dérivés du xylose, des sucres en conformation bloquée, des isomères de forme D- ou L- . La substitution ou la modification des bases nucléiques par des bases universelles (comme 1 ' hypoxanthine) peut également avoir lieu. Les nuclêotides peuvent être d'anomérie α au lieu de β comme dans les acides nucléiques naturels.
Les parties lipophiles peuvent être greffées aux oligonucléotides de la présente invention. Ces substitutions ont pour but de modifier la charge et/ou 1 ' hydrophilie des oligonucléotides afin d'augmenter le passage des membranes biologiques. Ces parties lipophiles incluent par exemple le cholestérol, un groupement cholestéryl, l'acide cholique, les thioéthers (hexyl-S-tritylthiol, par exemple), le thiocholesterol, les chaînes aliphatiques (dodécandiol ou des résidus undécyls, par exemple) , des phospholipides (di- hexadécyl-racglycéro-3-H-phosphonate, par exemple) , des chaînes polyamines ou polyéthylène glycol , l'acide adamantane acétique, un groupement palmityl, un groupement octadécylamine ou hexylamino-carbonyl-oxycholestérol .
Des groupements peuvent être substitués pour faciliter la détection des oligonucléotides. Des peptides peuvent être liés de façon covalente aux oligonucléotides de la présente invention pour aider à la reconnaissance d'organes, de tissus ou de types cellulaires. Toutes ces modifications ou substitutions peuvent évidemment être combinées entre elles.
Elles peuvent concerner tous les nuclêotides ou seulement certains d'entre eux. Les oligonucléotides de la présente invention peuvent être une partie d'un ADN ou d'un ARN circulaire ou circularisable .
L'étude des oligonucléotides de l'invention a permis de mettre en évidence leur efficacité et leur spécificité pour moduler l'expression des gènes codant pour des produits exerçant des effets pathogènes chez les humains et les animaux, plus particulièrement du gène codant pour TNFα, ou de gènes sous son contrôle.
L'invention vise donc des compositions pharmaceutiques caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un oligonucleotide tel que défini ci-dessus en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Ces compositions sont utilisables à titre curatif ou prophylactique . Le traitement d'un(e) patient (e) ayant besoin de ce type de thérapie repose sur l'administration d'une forme pharmaceutique de 1 ' oligonucleotide à des doses comprises entre 0,01μg et 100 g par kg de poids du (de la) patient (e) . Le choix de la dose dépendra de l'âge du (de la) patiente, de la sévérité des atteintes et de la nature de la pathologie. La fréquence d'administration peut être de une ou plusieurs fois par jour, à une fois tous les vingt ans. Après le traitement, le (la) patient (e) est suivi (e) pour évaluer les améliorations intervenues dans son état pathologique et les symptômes . Compte tenu de ces observations, les doses pourront alors être augmentées dans le cas où le (la) patient (e) ne répond pas significative ent au traitement, ou diminuées dans le cas inverse . Dans certains cas, il est préférable de traiter le (la) patient (e) avec les oligonucléotides de la présente invention en association avec les thérapies conventionnelles déjà existantes, afin d'augmenter l'efficacité du traitement. Après le succès du traitement, il est parfois nécessaire d'administrer au (à la) patient (e) des doses d'entretien, afin d'éviter la réapparition des symptômes et une rechute. Dans ce cas, les doses administrées seront comprises entre 0,01 μg et 100 g par kg de poids du (de la) patient (e) à des fréquences pouvant aller d'une à plusieurs fois par jour, jusqu'à une fois tous les 20 ans.
Les voies d'administration de la préparation (ou formule) pharmaceutique des oligonucléotides de la présente invention varieront selon qu'un traitement local ou systémique est souhaité. Les administrations seront alors transmuqueuses
(voie ophtalmique, voie vaginale, voie rectale, voie intranasale, voie pulmonaire, voie sublinguale) orales, cutanées ou parentérales . Les administrations parentérales peuvent être en épidurales, en intraveineuses (directe ou perfusion) , en sous-cutanées, en intrapéritonéales, en intrathécales, en intracardiaques , en intramusculaires ou en intra-articulaires .
La mise en forme galénique et le conditionnement que devront subir les oligonucléotides afin de constituer des médicaments dépendront des voies d'administration. Dans le cas des administrations transmuqueuses et cutanées par exemple, les oligonucléotides peuvent être administrés sous forme de lotions, de crèmes, de pommade, de gouttes, de suppositoires, de liquides, de poudres, en aérosol. Les oligonucléotides peuvent également être administrés à l'aide de dispositifs actifs (mécanique ou électrique) ou passifs. Les excipients seront des composants sans action phar acologique mais nécessaires à la fabrication, à l'administration ou à la conservation des oligonucléotides de la présente invention. Dans le cas d'une administration orale, les oligonucléotides de la présente invention peuvent être administrés par exemple sous forme de poudre, de granule, de capsule, de cachet, de comprimé, gélule, de tablette ou de suspension en solution aqueuse ou non. Les administrations parentérales peuvent se faire sous forme de solution aqueuse stérile qui pourra contenir des tampons ou d'autres additifs. Des dispositifs actifs (mécaniques ou électrique) peuvent également être utilisés. Le dosage des préparations pharmaceutiques dépendra de la sévérité et de la réponse au traitement de la pathologie a traiter. Les doses optimales à administrer aux patient (e) s dépendront de l'activité pharmacologique des oligonucléotides. Cette activité est en général déterminée in vi tro ou in vivo sur des modèles expérimentaux d'animaux par les doses efficaces 50 (DE50) .
Le modèle inflammatoire de polyarthrite expérimentale chez le rat par adjuvant complet de Freund (ACF) est un modèle largement utilisé pour l'évaluation de l'activité pharmacologique des médicaments anti-rhumastismaux. L'activité pharmacologique des oligonucléotides de la présente invention peut être ainsi évaluée dans ce modèle. Les paramètres qui seront pris en compte pour déterminer cette activité pharmacologique seront : - La fièvre ;
- L'œdème des pattes postérieures ;
- La fonction locomotrice ;
- L'intégrité du cartilage, en analysant la biosynthèse des protéoglycannes et la dégradation de ces derniers dans le cartilage patellaire ;
- La production de TNFα au niveau systémique et local. L'invention vise également l'utilisation des oligonucléotides définis ci-dessus comme outils pour la recherche et pour le diagnostic. Elle utilise ainsi une méthode de diagnostic où les oligonucléotides de la présente invention, inclus ou non dans un kit, sont utilisés pour rendre compte de l'accumulation associée à un processus pathologique d'un facteur transcriptionnel actif. Les processus physiologiques sont intimement liés à l'activité transcriptionnelle d'un grand nombre de gènes. Cette transcription dite physiologique des gènes est quant à elle dépendante de l'équilibre entre l'état actif ou inactif d'un nombre restreint de facteurs transcriptionnels . Un processus pathologique est souvent associé à une augmentation ou une diminution du nombre de facteurs protéiques transcriptionnels actifs. Les oligonucléotides de la présente invention en solution ou sur un support fixe, simple brin ou double brin, couplés ou non à un traceur comme un fluorophore, un chromophore ou une enzyme, peuvent être utilisés pour quantifier un facteur transcriptionnel actif. On a ainsi rapporté qu'un oligonucleotide en solution couplé à un fluorophore nommé "Molecular Beacons" en interagissant avec une protéine produisait une fluorescence aisément quantifiable par les méthodes courantes de spectrofluorométrie (16) . Il a également été rapporté qu'un oligonucleotide double brin fixé sur un support solide pouvait être utilisé pour quantifier l'interaction protéine-acide nucléique lors d'un criblage à haut débit (17) .
En recherche et en développement, les oligonucléotides de la présente invention, inclus ou non dans un kit, sont utilisés pour étudier des mécanismes physio-pathologiques au niveau cellulaire et/ou moléculaire. Ils peuvent être ainsi utilisés pour évaluer l'impact d'un certain nombre de molécules sur ces mêmes mécanismes physio-pathologiques.
Entrent également dans le champ de protection de l'invention, les kits renfermant les oligonucléotides définis ci-dessus et les réactifs nécessaires pour la réalisation de recherches et de diagnostics.
Dans ces kits, les oligonucléotides sont en solution ou sur un support, simple brin ou double brin, couplés ou non à un traceur, comme un fluorophore, un chromophore, ou une enzyme .
D'autres caractéristiques et avantages de l'invention sont donnés dans les exemples qui suivent avec référence aux figures 1 à 5, qui représentent, respectivement : - la figure 1 : l'effet de 1 ' inter éron-gamma (IFN) et du lipopolysaccharide (LPS) sur la production de TNFα dans les cellules THP-1. Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants ± l'écart type. ND, non détectable ; *, significativement différent des cellules sans traitement (p < 0, 01) ;
- la figure 2 : l'effet de 1 ' interféron gamma (IFN) et du lipopolysaccharide (LPS) sur la synthèse des ARNm du TNFα dans les cellules THP-1. 1, traitées avec 0,1% (v/v) de DMSO ; 2, LPS 0,1 μg/ml ; 3, LPS 1 μg/ml ; 4, LPS 10 μg/ml ; 5, IFN, 10 ng/ml ; 6, IFN (10 ng/ml) + LPS (0,1 μg/ml) ; 7, IFN (lOng/ml) + LPS (lμg/ml) ; 8, IFN (10 ng/ml) + LPS (10 μg/ml) ;
- la figure 3 : la cinétique de production de TNFα dans les cellules THP-1 stimulées. Les cellules ont été traitées avec l'IFN (10 ng/ml) + LPS (10 μg/ml). Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants ± l'écart type. ND, non détectable ; *, significativement différent des cellules 2 h (p < 0,01) ; la figure 4 : l'effet d'un oligonucleotide selon l'invention sur la production du TNFα dans les cellules THP-1 stimulées avec l'association LPS-IFN (10 μg/ml - 10 ng/ml). Il s'agit de 1 'oligonucleotide 21T, qui comporte une partie constante orientée de 5 ' vers 3 ' , contenant N = T ; et deux parties variables AAGAAA et AGGAGAG, situées respectivement du côté 5' et du côté 3' dans le sens 5'γ3' Les résultats représentent la moyenne de trois essais indépendants ± l'écart type ; *, significativement différent des cellules contrôles (p < 0,0001) ; **, significativement différent des cellules LPS-IFN (p < 0,005) ; ND, non détectable ;
- la figure 5 : l'effet d'un oligonucleotide 21T sur la synthèse des ARNm du TNFa dans les cellules THP-1 stimulées avec l'association LPS-IFN (10 μg/ml - 10 ng/ml) . 1, cellules traitées avec 0,1% (v/v) DMSO ; 2, cellules stimulées par LPS- IFN ; 3, cellules stimulées traitées par 1 nM ; 4, cellules stimulées traitées par 10 nM ; 5, cellules stimulées traitées par 100 nM.
Synthèse des oligonucléotides Les oligonucléotides sont synthétisés par voie chimique selon les méthodes classiques et en utilisant des équipements et appareillages existant sur le marché. Traitement des cellules humaines Les résultats rapportés dans les exemples ont été obtenus avec une lignée cellulaire humaine monocytaire car les monocytes constituent la source majeure de TNFα dans la réaction inflammatoire. Il s'agit de la lignée cellulaire THP-1 provenant d'un enfant de 1 an atteint d'une leucémie monocytaire aiguë. Cette lignée présente une morphologie monocytaire et se différencie en macrophage (8) . Le lipopolysaccharide et 1 ' interféron gamma qui constituent de puissants inducteurs de cytokines, ont été utilisés comme molécules inductrices .
La lignée monocytaire humaine THP-1 (ECACC, Cerdic, France) est mise en culture dans du milieu RPMI 1640, supplémenté par 2 mM L-glutamine, 100 Ul/ml pénicilline, 100 μg/ml streptomycine, 0,25 μg/ml fungizone, 10% (v/v) de sérum de veau foetal décomplémenté à 56°C pendant 30 minutes (tous les produits proviennent de Life Technologies, France).
Les cultures sont maintenues dans un incubateur à 37°C en atmosphère humide contenant 5% de C02. Pour les différentes expériences, les cellules sont mises en culture dans des plaques de 24 puits (Costar, France) à la densité de
106 cellules/puits.
La production de TNFα est induite en traitant les cellules THP-1 avec un mélange de lipopolysaccharide (LPS) d' Escherichia coli 055 :B5 (Sigma, France) et d' interféron gamma humain (IFN ; Tebu, France) . L'action en synergie de ces deux facteurs induit une surexpression du gène TNFα dans les cellules THP-1 (9) .
Les cellules sont déposées sous un volume de 0,5 ml/puits de milieu de culture complet, incubées durant 18 heures à 37°C, puis on ajoute 0,5 ml de milieu complet contenant :
- soit différentes concentrations (0,1 - 10 μg/ml) de LPS (le LPS est dissous dans du DMSO ; concentration finale 0,1% v/v) ; - soit 10 ng/ml d'IFN (dissous dans le milieu) ; soit 10 ng/ml d'IFN en association avec différentes concentrations (0,1 - 10 μg/ml) de LPS.
Après 18 heures d'incubation, les échantillons sont prélevés et centrifugés à 12 000 g durant 3 minutes. Les surnageants ainsi que les culots sont conservés séparément à -
80 °C jusqu'à leurs utilisations respectives pour la détermination des teneurs en TNFα et pour la préparation des
ARN.
Les concentrations en TNFα sont déterminées par une méthode ELISA (Enzyme Immuno Sorbent Assay ; Biotrak,
Amersham, France) de type sandwich. Le dosage a été utilisé selon les instructions du fournisseur en utilisant comme standard du TNFα humain. Les ARN totaux sont séparés à partir des culots cellulaires selon la méthode de Chomczynski et al . (10) à l'aide de la solution Trizol® (Life Technologies, France). La synthèse des ARNm du TNFα est analysée par la méthode de transcription inverse, suivie d'une amplification en chaîne par polymérase.
La séquence de l'amorce utilisée pour la transcription inverse est la suivante :
RDTiv : 5 ' -GACTCGAGTCGACAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT-3 ' La procédure pour obtenir le brin d 'ADNc est la suivante (11) :
ARN total 1 μg
Amorce (20 μM) 1 μl
Eau ultra-pure stérile q.s.p. 20 μl Le mélange est chauffé durant 10 minutes à 70 °C, puis refroidi rapidement dans la glace pilée. A ce mélange sont ajoutées successivement les solutions suivantes (Life Technologies, France) :
Tampon de transcription inverse 10 μl dNTP (10 mM) 2,5 μl
DTT (100 mM) 5 μl
Inhibiteur de RNase 1 μl
SuperScript Rnase H- transcriptase inverse .... 1 μl
Eau ultra-pure stérile q.s.p. 50 μl La réaction de transcription inverse se déroule à 42 °C pendant 2 heures. La réaction terminée, le mélange est dilué au 1/10 dans de l'eau ultra-pure stérile, puis conservé à -80°C.
La réaction d'amplification a lieu dans le mélange réactionnel suivant :
Tampon de réaction 5 μl dNTP (10 mM) 1 μl Amorce en 3 ' (20 μM) 1 μl
Amorce en 5 ' (20 μM) 1 μl
MgCl2 (50 mM) 1,5 μl
Solution de RT (ADNc) 5 μl Taq ADN polymérase (5 U/μl) 0,5 μl
Eau ultra-pure stérile q.s.p. 50 μl
La réaction d'amplification comprend trois étapes (11) .
Synthèse du deuxième brin d'ADNc :
94 °C (dénaturation du double brin) 1 minute 60°C (hybridation des amorces) 1 minute
72 °C (élongation) 40 minutes
Amplification de 1 'ADNc double brin (30 cycles) :
94 °C 1 minute
60°C (hybridation de l'amorce) 1 minute 72 °C (élongation) 1 minute
Extension finale :
72°C 10 minutes
La conception des amorces pour le TNFα a été réalisée sur la base de la séquence de l 'ARNm publiée (12) . Les séquences des 2 amorces utilisées, sont les suivantes : TNF-F : 5 ' GGCCCAGGCAGTCAGATCATCT-3 ' TNF-R : 5'TAGACCTGCCCAGACTCGGCAA-3 '
La conception des amorces pour la glycéraïdéhyde 3- phosphodésydrogénase (G3PDH) , utilisée comme standard, a été déterminée sur la base de la séquence de l 'ARNm publiée (13) . Les séquences des amorces utilisées sont les suivantes : HG3PDH-F : 5 ' -TATTGGGCGCCTGGTCACCAGG-3 ' HG3PDH-R : 5 ' -CTGGAGGAGTGGGTGTCGCTGT-3 '
L'amplification donne des produits ayant une taille de 933 pb pour la G3PDH, et 462 pb pour le TNFα. La spécificité de l'amplification a été vérifiée par la taille des produits obtenus et par séquençage des ADNc . Les produits d'amplification sont séparés sur un gel d'agarose 1% (p/v) sous un voltage constant. Le gel contient du bromure d'éthidium (0,2 μg/ml) (Life Technologies, France).
La migration terminée, le gel est photographié sous U.V. (en transillumination) à l'aide d'une caméra CCD.
La figure 1 donne les résultats de la stimulation de la production de TNFα. Les différentes concentrations de LPS n'ont aucun effet sur la production de TNFα dans les cellules THP-1. Par contre, l'addition de 10 ng/ml d'IFN aux trois concentrations de LPS, conduit à une augmentation dépendante de la dose de la production de TNFα. L'IFN tout seul provoque également une augmentation de la production du TNFα. Par contre, cette augmentation reste significativement inférieure à celle produite par l'association IFN-LPS. L'effet des différentes concentrations de LPS associé ou non à 1 ' IFN sur l'expression du gène TNFα a également été étudié en mettant en œuvre une méthode semi-quantitative, la transcription inverse suivie d'une amplification en chaîne.
L'expression du gène codant pour la G3PDH a été utilisée comme standard auquel les augmentations en expression du TNFα ont été rapportées. L'expression du gène codant pour la G3PDH est très peu sensible aux traitements par le LPS ou par les cytokines (14) .
Comme le montre la figure 2, le traitement des cellules THP-1 par le LPS provoque une légère augmentation de l'expression du gène TNFα. Le traitement par 1 ' IFN tout seul provoque également une augmentation des ARNm du TNFα. L'association de 1 ' IFN et du LPS conduit à une augmentation dépendante de la dose des ARNm. De plus, cette augmentation est supérieure à celle provoquée par le traitement par le LPS ou 1 ' IFN seuls .
D'autres travaux ont porté sur l'étude de la cinétique de production du TNFα par les cellules THP-1 stimulées. La figure 3 montre que le traitement des cellules THP-1 par l'association IFN-LPS (10 ng/ml IFN et 10 μg/ml LPS) sur la production du TNFα provoque une augmentation dépendante du temps significative. Inhibition de la production de TNFα
La transfection des cellules THP-1 est réalisée à l'aide de 1 ' ExGen 500 (Euromedex, France) qui est un vecteur constitué par une association de polymères d' éthylèneimine (PEI) (15) . Comme décrit précédemment, un million de cellules sont déposées par puits sous un volume de 0,5 ml de milieu de culture complet, incubées pendant 18 heures à 37°C et sous 5% de C02, puis 0,1 ml de solution de transfection est ajouté aux cellules, puis les cellules sont incubées pendant 4 heures à 37°C sous 5% de C02. A la fin de cette période, 0,4 ml de solution de stimulation (10 ng/ml d'IFN + 10 μg/ml de LPS par puits dans du milieu de culture complet) est ajouté aux cellules, puis celles-ci sont incubées durant 18 heures à 37°C sous 5% de C02. Après 18 heures d'incubation, les échantillons sont prélevés et centrifugés à 12 000 g durant 3 minutes. Les surnageants ainsi que les culots sont conservés séparément à -80 °C jusqu'à leurs utilisations respectives pour la détermination des teneurs en TNFα et la préparation des ARN.
La solution de transfection est constituée par les oligonucléotides dilués aux concentrations désirées dans 0,05 ml d'une solution de NaCl 0,9% (p/v). D'autre part, 0,01 ml d' ExGen 500 est dilué dans 0,05 ml de la même solution de NaCl . Les 0,05 ml de solution de vecteur sont ajoutés aux 0,05 ml de la solution d ' oligonucleotide . Le mélange est agité au vortex, centrifugé brièvement, puis incubé 15 minutes à température ambiante (temps nécessaire pour la formation du complexe oligonucléotide-vecteur) .
Dans un premier temps, on vérifie la pénétration de 1 'oligonucleotide dans les cellules THP-1, à l'aide d'un oligonucleotide 21T couplé à un label fluorescent (noté 21T*) . Les résultats montrent que la transfection conduit à l'accumulation dans les cellules de 1 ' oligonucleotide .
L'étude de l'inhibition de la transcription du gène TNFα a été réalisée à l'aide de différentes concentrations de 1 'oligonucleotide 21T. Ces concentrations sont comprises entre 0,01 et 100 nM. La figure 4 montre l'effet de ces différentes concentrations sur la production du TNFα stimulée. Le PEI n'a aucun effet sur la production du TNFα. La stimulation des cellules THP-1 par l'association LPS-IFN provoque une augmentation significative de la production du TNFα. Cette augmentation est inhibée significativement par 1 ' oligonucleotide aux concentrations de 0,1 nM ; 1 nM ; 10 nM ; et 100 nM. L'expression des ARNm du TNFα a été étudiée par transcription inverse, puis amplification en chaîne par polymérase . Comme le montre la figure 5, le traitement des cellules THP-1 par l'association LPS-IFN provoque une augmentation des ARNm du TNFα, sans affecter l'expression du gène codant pour la G3PDH. Par contre, l'augmentation d'expression du gène TNFa induite par le LPS-IFN, est réduite de façon dépendante de la dose par 1 ' oligonucleotide 21T aux concentrations de 1 nM, 10 nM et 100 nM. L ' oligonucleotide 21T n'a aucun effet sur l'expression du gène codant pour la G3PDH. Afin de déterminer la spécificité de l'action de 1 ' oligonucleotide sur la production stimulée du TNFα dans les cellules THP-1, un oligonucleotide témoin (21 mer de composition identique à 21T, mais de séquence différente) a été utilisé aux mêmes concentrations que le 21T sans aucun effet significatif sur la production stimulée de TNFα dans les cellules THP-1. De plus, les oligonucléotides 21T et le témoin aux concentrations utilisées, n'ont pas de toxicité cellulaire significative comme cela a été déterminé à l'aide de la méthode de largage dans le surnageant cellulaire de la lactate déshydrogénase .
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Claims

R E V E N D I C A T I O N S
1 . Oligonucléotides capables de moduler directement ou indirectement l ' expression du gène codant pour le facteur nécrosant des tumeurs alpha (TNFα) dans différentes espèces et/ou de gènes sous son contrôle , caractérisés en ce qu ' ils comportent :
- une partie constante - GGGGNGGG- , où N = T, A ou U,
• orientée de 5 ' vers 3 ' ou de 3 ' vers 5 ' ,
• complémentaire d ' une séquence cible ,
- deux parties variables , . situées de part et d'autre de la partie constante, conférant aux oligonucléotides une spécificité d'interaction directe ou indirecte avec la cible dans le gène TNFα de l'espèce considérée,
. dont la base à chacune des extrémités, adjacente à la partie constante, est une purine.
2. Oligonucléotides selon la revendication 1, caractérisés en ce qu'ils comprennent de 8 à 25 nuclêotides, de préférence de l'ordre de 20 nuclêotides.
3. Oligonucléotides selon la revendication 1 ou 2, caractérisés en ce que la cible est constituée par une séquence d'acide déoxyribonuclêique, ribonucléique, ou une protéine interagissant directement ou indirectement avec cette séquence .
4. Oligonucléotides selon la revendication 3, caractérisés en ce que la cible est constituée par une double hélice.
5. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que la cible, est située en amont de la boîte TATA.
6. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce que chez les
Hominidae, les parties variables répondent aux séquences AAGAAA et AGGAGAG et sont situées respectivement du côté 5' et du côté 3 ' dans le sens 5 '→3 ' , ou du côté 3 ' et du côté 5 ' dans le sens 31^-5', chez les Muridae, les parties variables répondent aux séquences TCGAAAA et AGAAGG, situées, respectivement du côté 5' et du côté 3' dans le sens 51^3', ou du côté 3 ' et du côté 5 ' dans le sens 3 V_5 ' , et chez les Bovidae, les parties variables répondent aux séquences CGGAAA et AGAAGTG, situées, respectivement, du côté 5' et du côté 3' dans le sens 5 '→3 ' , ou du côté 3' et du côté 5' dans le sens
3 5 ' .
7. Oligonucléotides selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisés en ce qu'ils sont modifiés au niveau de leur structure, de leurs sucres et /ou de leurs bases, et/ou qu'ils portent des groupements réactifs notamment à leurs extrémités variables.
8. Compositions pharmaceutiques, caractérisées en ce qu'elles renferment une quantité thérapeutiquement efficace d'au moins un oligonucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
9. Compositions pharmaceutiques selon la revendication 8, pour le traitement des affections associées à une production augmentée de TNFα, comme par exemple, la polyarthrite rhumatoide, la maladie de Crohn, le choc septique, les rhumatismes inflammatoires, la sarcoïdose .
10. Kits comportant au moins un oligonucleotide selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, ainsi que les réactifs pour la réalisation de recherches ou de diagnostics.
11. Kits selon la revendication 10, caractérisés en ce que le (s) oligonucleotide (s) est (sont) en solution ou est (sont) fixé (s) sur un support, simple brin ou double brin, le cas échéant couplé (s) à un traceur.
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