EP1402013A2 - Homoaconitase als target für fungizide - Google Patents

Homoaconitase als target für fungizide

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Publication number
EP1402013A2
EP1402013A2 EP02743184A EP02743184A EP1402013A2 EP 1402013 A2 EP1402013 A2 EP 1402013A2 EP 02743184 A EP02743184 A EP 02743184A EP 02743184 A EP02743184 A EP 02743184A EP 1402013 A2 EP1402013 A2 EP 1402013A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
seq
homoaconitase
activity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02743184A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Annette Freund
Wilhelm Schäfer
Karen Sonnenberger
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
BASF SE
Original Assignee
BASF SE
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by BASF SE filed Critical BASF SE
Publication of EP1402013A2 publication Critical patent/EP1402013A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/88—Lyases (4.)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)

Definitions

  • Homoaconitase as a target for fungicides
  • the present invention relates to the use of homoaconitase as a new target for fungicides.
  • the present invention further relates to the identification and isolation of the nucleic acid sequence SEQ ID No: 1 coding for the protein homoaconitase and its functional equivalents, and to a method for
  • the present invention further relates to a transgenic organism containing SEQ ID NO: 1 or a functional equivalent of SEQ ID N0: 1, which is characterized by increased lysine production compared to a non-transgenic fungus.
  • the object of the present invention was therefore to identify a new fungicidal target.
  • the object of the present invention is therefore to identify new targets for fungicides and to provide methods which are suitable for identifying fungicidal active ingredients.
  • homoaconitase encoded by the sequence SEQ ID N0: 1 or a functional equivalent of SEQ ID N0: 1 is suitable as a fungicide of the target. Furthermore, it was found that an increase in lysine biosynthesis was achieved in a transgenic fungus which contains SEQ ID NO: 1 by increased expression of homoaconitase.
  • transgenic fungi containing the nucleic acid sequences according to the invention are characterized by an increased lysine content compared to a non-transgenic fungus.
  • affinity tag denotes a peptide or polypeptide whose coding nucleic acid sequence can be fused with the sequence coding for the target protein directly or by means of a linker using common cloning techniques.
  • the affinity tag is used to isolate the recombinant target protein using affinity chromatography.
  • the above-mentioned linker can optionally contain a protease cut part (e.g. for thrombin or factor Xa), whereby the affinity tag can be cleaved from the target protein if necessary.
  • common affinity tags are the "His tag” e.g. by Quiagen, Hilden, "Strep-Tag", the Myc-Tag "(Invitrogen, Carlsberg), the chitin-binding domain and an intein from New England Biolab and the so-called CBD-Tag from Novagen.
  • Enzymatic activity / activity test The term enzymatic activity describes the ability of an enzyme to convert a substrate into a product. Both the natural substrate of the enzyme and a synthetic modified ana- logon of the natural substrate can be used. The enzymatic activity can be carried out in a so-called activity test
  • both the starting material and the product can be used as a substrate in the corresponding activity test.
  • “Expression” describes transcription and subsequent translation of a gene in a cell containing the desired nucleic acid sequence.
  • “Expression cassette or nucleic acid sequence” An expression cassette containing a nucleic acid sequence according to the invention means, for example, a genomic or a complementary DNA sequence or an RNA sequence and semisynthetic or fully synthetic analogues thereof. These sequences can be in linear or circular form, extra-chromoso al or integrated into the genome.
  • the nucleic acid sequences according to the invention can be produced synthetically or can be obtained naturally or contain a mixture of synthetic and natural DNA components, and can consist of different heterologous gene segments from different organisms.
  • Artificial nucleic acid sequences are also suitable here as long as they enable expression of the target protein in a cell or an organism.
  • synthetic nucleotide sequences can be generated with respect to the codon-usage-of optimized from the organisms to be transformed wur- 'the.
  • nucleotide sequences mentioned above can be produced in a manner known per se by synthesis from the nucleotide building blocks, for example by fragment condensation of individual overlapping, complementary nucleotide building blocks of the double helix.
  • the chemical synthesis of oligonucleotides can be carried out, for example, in a known manner using the phosphoamidite method (Voet, Voet, 2nd edition, Wiley Press New York, pages 896-897).
  • various DNA fragments can be manipulated in such a way that a nucleotide sequence with the correct reading direction and correct reading frame is obtained.
  • the nucleic acid fragments are connected to one another using general cloning techniques, as described, for example, in T.
  • Gene describes a nucleic acid sequence coding for a protein, which can be transcribed into RNA (mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, senseRNA or anti-senseRNA) and can optionally be associated with regulatory sequences. Examples of regulatory sequences are promoter sequences. Other optional elements are, for example, introns.
  • Genetic control sequence The term “genetic control sequences” (to be seen equivalent to the term “regulatory sequence”) describes the sequences which have an influence on the formation or the function of the expression cassette according to the invention and, for example, the transcription and possibly translation in ensure prokaryotic or eukaryotic organisms. Examples are promoters or so-called “enhancer” sequences. In addition to these control sequences or instead of these sequences, the natural regulation of these sequences may still be present before the actual structural genes and may have been genetically modified in such a way that the natural regulation was switched off and the expression of the target gene was increased. The control sequence is selected depending on the host organism or parent organism.
  • Genetic control sequences also include the 5 'untranslated region, introns or the non-coding 3' region of genes. Control sequences are further to be understood as those which enable homologous recombination or insertion into the genome of a host organism or which allow removal from the genome.
  • “Functional equivalents” here describe nucleic acid sequences that • 1) hybridize under standard conditions with the nucleic acid sequence coding for the target protein (according to the present invention with SEQ ID NO: 1) or parts of the nucleic acid sequence coding for the target protein and
  • an enzymatically active target protein in the case of the present invention, homoaconitase
  • short oligonucleotides with a length of about 10-50 bp; preferably 15-40 bp, for example of the conserved or other regions which can be determined by comparison with other related genes in a manner known to the person skilled in the art. But it can also be longer
  • fragments of the nucleic acids according to the invention or the complete sequences can be used for the hybridization. Varies depending on the nucleic acid used: oligonucleotide, longer fragment or complete sequence or depending on the type of nucleic acid DNA or RNA used for the hybridization
  • the melting temperatures for DNA: DNA hybrids are approx. 10 ° C lower than those of ⁇ DNA: RNA hybrids of the same length.
  • hybridization conditions for DNA DNA hybrids at 0.1 x SSC and temperatures between about 20 ° C to 45 ° C, preferably between about 30 ° C to 45 ° C.
  • DNA RNA hybrids the hybridization conditions are advantageously 0.1 ⁇ x SSC and temperatures between about 30 ° C to 55 ° C, preferably between about 45 ° C to 55 ° C.
  • the temperatures indicated for the hybridization are, for example, calculated melting temperature values for a nucleic acid with a length of approx. 100 nucleotides and a G + C content of 50% in the absence of formamide.
  • the experimental conditions for DNA hybridization are in relevant textbooks
  • a “functional equivalent” is meant further particular also contain natural or artificial mutations of the relevant nucleic acid sequences of the target protein and their homologs from other organisms which make possible the expression of the enzymatically active target protein in a 'cell or organism.
  • the present invention also includes those nucleotide sequences which are obtained by modifying the nucleic acid sequence of the target protein described by SEQ ID NO 1.
  • the aim of such a modification can e.g. the insertion of further restriction enzyme interfaces, the removal of superfluous DNA or the addition of further sequences.
  • Proteins which are encoded via said nucleic acid sequences should, however, still have the desired functions despite a different nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent can also refer to the protein encoded by the corresponding nucleic acid sequence.
  • the term functional equivalent describes a protein whose amino acid sequence is identical to SEQ ID NO: 2 to a certain percentage.
  • Functional equivalents thus include naturally occurring variants of the sequences described herein as well as artificial, e.g. nucleic acid sequences obtained by chemical synthesis and adapted to codon use or the amino acid sequences derived therefrom.
  • “Appropriate response time” means the time it takes to perform an activity test and depends not only on the method used, but also on the sensitivity of the equipment used. The determination of the reaction times is known to the person skilled in the art. When using photometric methods test systems, the reaction times are generally between> 0 to 40 minutes.
  • Homoaconitase is defined here as an enzyme that reverses. sibel is able to catalyze the conversion of homoaconitate to homoisocitrate.
  • Homoaconitase activity refers to the ability of an enzyme to catalyze the conversion of homoaconitate to homoisocitrate. This term is equivalent to the term "biological activity of a homoaconitase”.
  • Identity or “homology” between two nucleic acid sequences or polypeptide sequences is defined by the identity of the nucleic acid sequence / polypeptide sequence over the respective total sequence length, which is determined by comparison with the aid of the GAP program algorithm. (Wisconsin, - Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) is calculated using the following parameters:
  • Gap Weight 50 Length Weight: 3
  • Knock-out transformants denotes individual cultures of a transgenic organism, in the case of P. teres homokaryotic individual cultures, in which a specific gene was specifically inactivated via transformation.
  • Natural genetic environment means the natural chromosal locus in the organism of origin or the presence in a genomic library.
  • the natural genetic environment of the nucleic acid sequence is preferably at least partially preserved.
  • the surrounding area flanks the nucleic acid sequence at least on the 5 'or 3' side and has a sequence length of at least 50 bp, preferably at least 100 bp, particularly preferably at least 500 bp, very particularly preferably at least 1000 bp, most preferably at least 5000 bp.
  • Operative or functional linkage is understood to mean the sequential arrangement of promoter, coding sequence, terminator and possibly other regulatory elements in such a way that each of the regulatory elements can fulfill its function as intended when expressing the coding sequence.
  • Recombinant DNA describes a combination of DNA sequences in a non-natural arrangement that can be produced by recombinant DNA technology, but also DNA containing cell-own and foreign or synthetic DNA, also homologous and heterologous DNA based on the relatives of the organisms
  • Recombinant DNA technology generally known techniques for fusing DNA sequences (e.g., described in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
  • Replication origins ensure the multiplication of the expression cassettes or vectors according to the invention in microorganisms, e.g. pBR322 ori or P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
  • a growth, fluorescence, chemo-, bioluminescence or resistance assay or a photometric measurement (intrinsic color) or enzyme activity can be used to evaluate the transformation efficiency or the expression location or time using these genes.
  • Reporter proteins Schott al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechni-
  • selection markers confer resistance to antibiotics. Examples include the npt gene, which is resistant to the aminoglyciside antibiotics neomycin (G 418), kanamycin, and paromycin (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737) conferred the hygro gene (Marsh JL et al., Gene. 1984; 32 (3): 481-485), the sul gene ( Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15 (1): 127-136), the hygromycin gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the she-ble gene, which is resistant to bleomycin Gives antibiotic Zeocin.
  • selection ark genes are genes which confer resistance to 2-deoxyglucose-6-phosphate (WO 98/45456) or phosphinotricin etc. or those which confer antimetabolite resistance, for example the dhfr -Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149). Also suitable are genes such as trpB or hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei US A. 85 (1988) 8047-8051).
  • Mannose-phosphate isomerase WO 94/20627
  • ODC ornithine decarboxylase
  • McConlogue 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, ed.
  • deaminase from Aspergillus terreus (Tamura K et al., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
  • Signal decrease based on the enzymatic activity, a decrease in the enzymatic activity of the enzyme incubated with a test compound in comparison to the activity of the ⁇ nyzms not incubated with the test compound is meant, which lies outside of a measurement error.
  • substrate is the compound which is recognized by the enzyme in its original function and which is converted into a product by means of a reaction catalyzed by the enzyme.
  • Test compound denotes the substances that were tested and identified in accordance with the method according to the invention. These substances can e.g. B. from expression libraries, for example cDNA expression libraries or peptides, proteins, nucleic acids, antibodies, small organic substances, hormones, • PNAs or the like (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 and references cited therein). The substances can be chemically synthesized or microbiologically produced substances and can occur, for example, in cell extracts from, for example, plants, animals or microorganisms.
  • Transformation describes a process for the introduction of heterologous DNA into a pro- or eukaryotic cell.
  • a transformed cell describes not only the product of the transformation process itself, but also all transgenic ones Descendants of the transgenic organism produced by the transformation.
  • Transgene Relating to a nucleic acid sequence, an expression cassette or a ' vector containing said nucleic acid sequence or an organism transformed with said nucleic acid sequence, expression cassette or vector, transger describes all such constructions produced by genetic engineering methods, in which either
  • nucleic acid sequences are not in their natural genetic environment or have been modified by genetic engineering methods.
  • the modification can be achieved here, for example, by mutating one or more nucleotide residues of the corresponding nucleic acid sequence.
  • Active ingredient here is synonymous with the term “compound with a fungicidal action”.
  • Homoaconitase reversibly catalyzes the conversion of in an ⁇ -aminoadipate pathway that is only found in archaebacteria and fungi for the synthesis of the amino acid lysine (Nishida, H. et al., Journal of Molecular Evolution 51 (2000) 299-302) Homoaconitate to homoisocitrate
  • homoaconitase is a new target for fungicides for controlling pathogenic fungi, preferably phytopathogenic fungi.
  • homoaconitase was clearly identified as a suitable target protein (target) for fungicidal active ingredients.
  • the present invention therefore relates to the use of the gene product of a nucleic acid sequence from a phytopathogenic fungus coding for a protein with the biological activity of a homoaconitase as a target for fungicides, the nucleic acid sequence
  • nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID N0.-1; or b) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or
  • SEQ ID N0: 1 The functional equivalents according to the invention of SEQ ID N0: 1 claimed here have an identity with SEQ ID No: 2 of P. teres homoaconitase of at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67 %, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% preferably at least 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% , 99% on.
  • Said functional equivalents. are characterized by essentially the same functionality, i.e. they are still able to reversibly catalyze the conversion of homoaconitate to homoisocitrate.
  • Pathogenic fungi are to be understood as those fungi that colonize a host and thereby cause a disease of the host.
  • Examples of fungi affecting plants, so-called phytopathogenic fungi are, in addition to P. teres, which affects barley, the following species: Alternaria species, Podosphaera species, Sclerotinia species, Physalospora canker on vegetables and fruit, Botrytis cinerea (gray mold) Strawberries, vegetables, ornamental plants and vines, Corynespora melonis on cucumbers, strawberries; Colletotrichum species on cucumbers; Diplocarpon rosae on roses; Elsinoe fawcetti and Diaporthe citri on citrus fruits; Sphaerotheca species on cucumbers, squash, strawberries and roses; Cinula neccata on cucumbers, Cercospora species on peanuts, sugar beets, egg plants and date plums; Erysiphe cichoracearum
  • Fusarium species should preferably be understood to mean the following species: F. graminearum, F. di erium, F. merismoides, F. lateritium, F. decem-cellulare, F. poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. chlamydosporum, F. rnoniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum, F. subglutinans, F. nygamai, F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. sambucinum, F. crookwellense, F. avenaceum ssp.
  • avenaceum F. avenaceum ssp. ayhong, F. avenaceum .ssp.- nurragi, F. hetrosporum, F. acuminatum ssp. acuminatum, F. acuminatum ssp. armenia-cum, F. longipes, F. compactum, F. equiseti, F. scripi, F. polyphialidicum, F. semitectum and F. beomiforme.
  • P.renophora species or “Pyrenophora species” should preferably be understood to mean the following species: P. graminea, P. hordei, P. japonica, P. teres, P. teres f. aculata, P. teres f. teres, P. tritici-repentis.
  • the present invention furthermore relates to the following nucleic acids:
  • nucleic acid sequence which, on the basis of the degenerate genetic code, can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by back-translation;
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by back-translating a functional equivalent;
  • SEQ ID NO: encode 2 amino acid sequence shown; or e) functional analogs of the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, which codes for functional analogs of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; or
  • the present invention further relates to nucleic acid sequences encoding a polypeptide with the biological activity of a homoaconitase, comprising
  • the nucleic acid sequences preferably originate from a phytopathogenic fungus.
  • the term “phytopathogenic fungus” here means the species mentioned at the beginning.
  • the nucleic acid sequence preferably originates from the Pyrenophora or Fusarium species mentioned at the outset, very particularly preferably P. teres and F. graminearum.
  • the use of the gene product of one of the abovementioned nucleic acid sequences coding for a protein with the biological activity of a homoaconitase as a target for fungicides is also an object of the present invention.
  • SEQ ID NO: 2 has an identity with SEQ ID No: 2 of P. teres homoaconitase of at least 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% and 70%. preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86% , 88%, 88%, 89%, 90% particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • Said functional equivalents are characterized by essentially the same functionality, i.e. they are still able to reversibly catalyze the conversion of homoaconitate to homoisocitrate.
  • SEQ ID NO: 2 The functional equivalents of SEQ ID NO: 2 according to the invention have an identity with SEQ ID No: 1 of homoaconitase from P. teres of at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78 %, 79%, 80% preferably at least 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94% 95%, 96%, 97%, 98%, 99%.
  • Said functional equivalents are characterized by essentially the same functionality, ie they are still able to reversibly catalyze the conversion from homoaconitate to homoisocitrate.
  • the invention further relates to sections of SEQ ID NO: 1 and functional equivalents of SEQ ID NO: 1, the range of the section extending from amino acid position 2 to 783.
  • the range from the amino acid position 200 to 600 is preferred here.
  • the range from the amino acid position 250 to 550 is particularly preferred, and very particularly preferably from amino acid position 300 to 500.
  • nucleic acid sequences can be used for the production of hybridization probes, by means of which the corresponding full-length genes can be isolated.
  • manufacture of these probes and the conduct of the experiments are known. This can be done, for example, by the targeted production of radioactive or non-radioactive probes by means of PCR and the use of appropriately labeled oligonucleotides with subsequent hybridization experiments.
  • the technologies required for this are described, for example, in T. Maniatis, E.F. Fritsch and J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual," Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989).
  • the corresponding probes can also be modified using standard technologies (Lit. SDM or random mutagenesis) so that they can be used for other purposes, e.g. as a probe that hybridizes specifically to mRNA and the corresponding coding sequences for the purpose of analyzing the corresponding sequences in other organisms.
  • parts of the nucleic acids according to the invention can be used as probes for the detection and isolation of functional analogs of SEQ ID NO: 1 from other fungal species due to sequence identities.
  • Part or all of the sequence of the corresponding SEQ ID NO: 1 is used here as a probe for screening in a genomic or cDNA bank of the corresponding fungus or in a computer search for analogous sequences in electronic databases.
  • probes described above are the analysis of possibly changed expression profiles of the nucleic acids according to the invention in various fungi, preferably from the Pyrenophora or Fusarium species mentioned at the beginning, particularly preferably P. teres or F. graminearum especially in connection with certain factors such as increased resistance to fungicides , the detec- tion of the fungus in plant material and detection of emerging resistance.
  • the increase in resistance to a fungicide targeting homoaconitase is often based on mutation, e.g. the exchange of amino acids caused by a mutation in the nucleic acid sequence, at locations essential for substrate specificity, e.g. in the area of the active center or at other points on the protein that affect the binding of the substrate. Due to the changes described above, the binding of the inhibitor acting as a fungicide to the Erf. - Protein are made more difficult or even prevented, so that a limited or no fungicidal action can be observed in the corresponding cultures.
  • the probes described above may be used based on the above-defined nucleic acid sequences for the detection of mutant according Homoaconitasenukleinklanzen in completely or partially resistant phytopathogenic fungi.
  • the invention furthermore relates to expression cassettes comprising a nucleic acid sequence coding for homoaconitase
  • nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID N0: 1; or b) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or
  • Another object of the invention is the use of expression cassettes, the nucleic acid sequence of which codes for one of the above-mentioned nucleic acid sequences or for functional equivalents of the nucleic acid sequence SEQ ID NO: 1 with an identity of at least 71% to SEQ ID N0: 1 for the production recom - Binary homoaconitase for the test systems listed below e.
  • the nucleic acid sequence can e.g. be a DNA or a cDNA sequence.
  • an expression cassette according to the invention comprises a promoter at the 5 'end of the coding sequence and a transcription termination signal at the 3' end and optionally further genetic control sequences which are operatively linked to the intermediate coding sequence for the homoaconitase gene.
  • Analogs of the expression cassettes described above are also according to the invention, which can come about, for example, through a combination of the individual nucleic acid sequences on one polynucleotide (multiple constructs), on several polynucleotides in one cell (co-transformation) or through sequential transformation.
  • Vectors according to the invention also contain at least one copy of the nucleic acid sequences used and / or of the nucleic acid construct according to the invention or the expression cassettes described above. These vectors contain nucleic acid sequences comprising:
  • the use of the aforementioned vectors or of vectors containing nucleic acid sequences comprising functional equivalents of the nucleic acid sequences SEQ ID N0: 1 with an identity of at least 65% to SEQ ID N0: 1 for the production of recombinant protein for the test systems is also possible.
  • vectors are also understood to mean all other vectors known to the person skilled in the art, such as phages, viruses such as SV40, CMV, baculovirus, adenovirus, transposons, IS elements, phasmids, phagemids, cosmids, linear or circular DNA. These vectors can be replicated autonomously in the host organism or replicated chro osomally. Chromosomal replication is preferred.
  • the nucleic acid construct according to the invention can also advantageously be introduced into the organisms in the form of a linear DNA and integrated into the genome of the host organism via heterologous or homologous recombination.
  • This linear DNA can consist of a linearized plasmid or only of the nucleic acid construct as a vector or the nucleic acid sequences used.
  • nucleic acid sequences used in the method according to the invention can also be introduced into an organism alone.
  • nucleic acid sequences are to be introduced into the organism, they can all be introduced into the organism together in a single vector or each individual gene in a vector, the different vectors being able to be introduced simultaneously or successively.
  • Advantageous control sequences for the expression cassettes or vectors according to the invention are, for example, in promoters such as cos, tac, trp, tet, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara -, SP6, 1-PR or in the 1-PL promoter, which can be used for the expression of homoaconitase in gram-negative bacterial strains.
  • promoters such as cos, tac, trp, tet, lpp, lac, laclq, T7, T5, T3, gal, trc, ara -, SP6, 1-PR or in the 1-PL promoter, which can be used for the expression of homoaconitase in gram-negative bacterial strains.
  • control sequences are, for example, in the amy and SP02 promoters, which can be used for the expression of homoaconitase in gram-positive bacterial strains, and in contain the yeast or fungal promoters ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, AOX1 and GAP, which can be used to express homoaconitase in yeast strains.
  • control elements for expression in insect cells are the polyhedrin promoter and the p10 promoter (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio / Techn. 6, 47-55).
  • advantageous control sequences for the expression of homoaconitase in cell culture are, for example, the following eukaryotic promoters of viral origin, e.g. Promoters of Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus or Simian Virus 40 contain.
  • the expression cassettes according to the invention and the vectors derived from them can also contain other functional elements in addition to the promoters mentioned above. Examples include, but are not limited to:
  • the expression cassette and vectors derived therefrom can be used for transformation of bacteria, cyanobacteria, yeasts, filamentous tosen fungi and algae and eukaryotic cells (such as insect cells) of homoaconitase be used with the objective of the recombinant production, wherein the production of a suitable expression cassette of the Organism in which the gene is to be expressed.
  • the present invention relates to the transgenic organisms produced by transformation with one of the above-described embodiments of an expression cassette or a vector, and the recombinant homoaconitase obtainable from the transgenic organism by expression.
  • microorganisms for recombinant expression are also eukaryotic cell lines.
  • bacteria of the genus Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes or Cyanobacteria, for example of the genus Synechocystis or Anabena are preferred.
  • Preferred yeasts are Candida, Saccharomyces, Hansenula or Pichia.
  • Preferred fungi are Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995).
  • transgenic animals are also suitable as host organisms, for example C. elega s. "
  • yeast vectors for use in yeast are pYep-Secl (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 ( Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES derivatives, pGAPZ derivatives, pPICZ derivatives and the vectors of the "Pichia Expression Kit” (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).
  • insect cell expression vectors can also be used advantageously, e.g. for expression in Sf 9 cells. These are e.g. the vectors of the pAc series (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) and the pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39).
  • plant cells or algal cells can advantageously be used for gene expression.
  • plant expression vectors can be found in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the ' left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 or in Bevan, MW (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
  • nucleic acid sequences according to the invention can be expressed in mammalian cells.
  • Examples of corresponding expression vectors are pCDM8 and pMT2PC mentioned in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 or Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195).
  • Promoters of viral origin that are preferably to be used are e.g. Promoters of polyoma, adenovirus 2, cytomegalovirus or simian virus 40.
  • prokaryotic and eukaryotic expression systems are mentioned in chapters 16 and 17 in Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
  • Another object of the invention relates to methods for identifying compounds having a fungicidal activity which inhibit homoaconitase or its functional analogs.
  • the method is based comprehensively on the use of nucleic acid sequences
  • nucleic acid sequence with the nucleic acid sequence shown in SEQ ID N0: 1; or b) a nucleic acid sequence which can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 on the basis of the degenerate genetic code by back-translation; or
  • homoaconitase of at least 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67 %, 68%, 69% and 70% preferably at least 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% preferably at least 81%, 82%, 83 %, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% particularly preferably at least 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99 % on.
  • the nucleic acid sequences mentioned above are referred to below as the nucleic acid sequences according to the invention.
  • a polypeptide encoded by one of the nucleic acid sequences according to the invention is hereinafter referred to as homoaconitase or protein / polypeptide according to the invention.
  • the present invention relates to the use of the gene product of a nucleic acid sequence according to the invention, as defined above, as a target for the determination of fungicidally active substances.
  • the methods according to the invention for identifying compounds having a fungicidal action are characterized in that the transcription, expression, translation or the activity of the gene product of the nucleic acid sequence according to the invention is influenced and those compounds are selected which reduce the transcription, expression, translation or the activity of the gene product or block, the nucleic acid sequence according to the invention being selected from the group of the following sequences:
  • nucleic acid sequence which can be derived on the basis of the degenerate genetic code from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2; or c) a nucleic acid sequence which, based on the degenerate genetic code, can be derived from the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 by back-translating a functional equivalent; or
  • SEQ ID NO: encode 2 amino acid sequence shown
  • the biological activity is reduced by at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably by at least 50% and more than the natural activity of the gene product especially preferred to understand at least 70%.
  • Blocking the activity of the gene product means 100% blocking of the activity or partial blocking of the activity, preferably at least 80%, particularly preferably at least 90%, very particularly preferably at least 95% blocking of the biological activity.
  • nucleic acid molecule i. Bringing a nucleic acid molecule according to the invention or a homoaconitase into contact with one or more test compounds under conditions which allow the binding of the test substance (s) to the nucleic acid molecule or to the homoaconitase which is encoded by the above-mentioned nucleic acid molecule;
  • the method according to the invention can be carried out in separate separate method approaches in vivo or in vitro and / or advantageously together or particularly advantageously in a high-throughput screening and can be used to identify compounds with a fungicidal action.
  • sample to be examined which contains a compound with a fungicidal activity identified by the method according to the invention, has been identified, then it is either possible to isolate this compound directly from the sample.
  • the sample can be divided into different groups, e.g. if it consists of a large number of different test compounds so as to reduce the number of different test compounds per sample and then to repeat the method according to the invention with such a "sub-sample".
  • the steps described above can be repeated several times, preferably until the sample examined according to the method according to the invention only comprises a small number of compounds or only one compound with a fungicidal action.
  • HTS enables a multitude of different connections to be tested in parallel.
  • the use of carriers which contain one or more of the nucleic acid molecules according to the invention, one or more vectors containing the nucleic acid sequence according to the invention, one or more transgenic organisms which contain at least one of the nucleic acid sequences according to the invention or one or more May contain (poly) peptides encoded via the nucleic acid sequences according to the invention.
  • the carrier used can be solid or liquid, is preferably solid, particularly preferably a microtiter plate.
  • the above-mentioned carriers are also the subject of the present invention.
  • microtiter plates are used, which as a rule can comprise volumes of 50 to 500 ⁇ l, preferably 200 ⁇ l.
  • the other components of a HTS system are commercially available to match the respective microtiter plates, such as many instruments, materials, automatic pipetting devices, robots, automated plate readers and plate washers.
  • a preferred embodiment of the in vitro method comprises the following steps, wherein
  • said polypeptide is either expressed in an enzymatically active form in a transgenic organism according to the invention or an organism containing the protein according to the invention is cultivated;
  • step b) the protein obtained in step a) is incubated with a test compound in the resting or growing organism directly, in the cell disruption of the transgenic organism, in partially purified form or in a form purified to homogeneity;
  • a test compound is selected by step b) which inhibits a polypeptide encoded by a nucleic acid sequence according to the invention.
  • homoaconitase is expressed in a transgenic organism or an organism which naturally contains homoaconitase encoded by a nucleic acid sequence according to the invention is cultivated;
  • step (c) compounds are selected in step (c) which result in a significant decrease in the enzymatic activity, a reduction of at least 10%, advantageously at least 20%, preferably at least 30%, particularly preferably around at least 50% and very particularly preferably by at least 70% or a 100% reduction (blocking) is achieved.
  • the compounds having a fungicidal action or active ingredients are identified by determining the enzymatic activity in the presence and absence of a compound to be investigated.
  • the homoaconitase required for the test can be isolated either by heterologous expression from a transgenic organism according to the invention or from an organism which contains homoaconitase, for example from a fungus, preferably from one of the pyrenophora or Fusarium species mentioned above, particularly preferably from P. teres or F. graminearum.
  • Examples of other organisms from which homoaconitase can preferably be isolated are Alternaria kikuchiana, Alternaria inali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beti- cola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpophilumumotumus, Cochlioboletumus, Cochlioboletus, Cochlioboletus, Cochliobolusus, Cochliobolusus, Cochliobolusus, Cochliobolusus, Cochliobolususus, Cochliobolususus, Cochliobolususus, Cochliobolususus, Cochliobolususus, Cochliobolusus, Cochliobolusus, Cochliobolus colus, Cochliobolus
  • fungal strains are Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Pyrenophora teres, Saccharomyces (e.g. Saccharomyces cerevisiae), Pichia (e.g. Pichia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria or others Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995). Archaebacteria can also be used.
  • the solution containing the polypeptide according to the invention can consist of the lysate of the original organism or of the transgenic organism. If necessary, the polypeptide according to the invention can be partially or completely purified using standard methods. A general overview of common techniques for protein purification can be found, for example, in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN -0-87969-309-6. In the case of recombinant representation, the protein fused to an affinity tag can be purified by affinity chromatography.
  • the enzymatic activity is determined by incubating the polypeptide according to the invention with a suitable substrate, the conversion of the substrate or the increase in the product formed being monitored.
  • suitable substrates are homoaconitate, homoisocitrate and derivatives of these compounds.
  • Preferred substrates are those whose increase or decrease can be monitored photometrically.
  • the conversion of the substrate is monitored photometrically, based on one of Strassman et al. described method (Strassman et al., J. Biol. Chem. 241 (1966) 5401-5407):
  • the reaction can be monitored photometrically via the decrease in absorption, that is to say decrease in homoaconitate, at 240 nm. The determination of the enzymatic activity takes place depending on the substrate decrease at the time. 2.
  • the reaction can increase the absorption at 240nm, ie. The increase in the homoaconitate formed can be monitored photometrically.
  • the determination of the enzymatic activity is carried out in a pH range from 7.0 to 9.0.
  • the homoaconitase is now incubated with a test compound to be investigated.
  • the enzymatic activity of the polypeptide according to the invention is determined by one of the methods mentioned above in comparison to the activity of the uninhibited homoaconitase.
  • the polypeptide according to the invention is inhibited, a significant decrease in the enzymatic activity in comparison to the enzymatic activity of the non-inhibited polypeptide according to the invention is observed.
  • the detection according to step ii of the above method can be carried out using techniques which show the interaction between protein and ligand.
  • Either the test compound or the enzyme may contain a detectable label, e.g. a fluorescent, radioisotope, chemiluminescent or enzymatic label.
  • enzymatic labels are Horseraddish peroxidase, alkaline phosphatase or lucifierase. The subsequent detection depends on the marking and is known to the person skilled in the art.
  • FCS Fluorescence correlation spectroscopy
  • the polypeptide according to the invention is now linked on a suitable carrier and incubated with the test compound to be examined. After one or more suitable washing steps, the molecules of the test compound additionally bound to the protein can be detected using the above-mentioned methodology and thus possible inhibitors can be selected.
  • the test compounds identified in this way, which bind to the polypeptide according to the invention, may be suitable as inhibitors.
  • Biacore is based on the change in the refractive index on a surface when a test compound is bound to a protein immobilized on said surface. Since the change in the refractive index for a defined change in the mass concentration at the surface is virtually identical for all proteins and polypeptides, this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). The test compound is injected into a reaction cell with a volume of 2-5 ⁇ l, on the walls of which the protein has been immobilized.
  • the binding of the corresponding test compound to the protein and thus the identification of possible inhibitors can be carried out by recording the laser light reflected from the surface via surface plasmon response (SPR).
  • SPR surface plasmon response
  • the test compounds thus identified which bind to the polypeptide according to the invention may be suitable as inhibitors.
  • Fluorescence Resonance Energy Transfer is based on the radiation-free energy transfer between two spatially adjacent fluorescence molecules under suitable conditions. A prerequisite is the overlap of the emission spectrum of the donor molecule with the excitation spectrum of the acceptor molecule.
  • Test compounds can be measured using FRET (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179).
  • FRET Fluorescence Resolved Fluorescence
  • a particularly suitable embodiment of the FRET technology is the "Homogeneous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), as sold by Packard BioScience.
  • HTRF Homogeneous Time Resolved Fluorescence
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the measurement of surface plasmon resonance is based on the change in the refractive index on a surface when a test compound is bound to a protein immobilized on said surface. Since the change in the refractive index for a defined change in the mass concentration at the surface is virtually identical for all proteins and polypeptides, this method can in principle be applied to any protein (Lindberg et al.
  • the measurement can be carried out, for example, with the aid of the automated analyzers based on surface plasmon resonance sold by Biacore (Freiburg) in a throughput of currently up to 384 samples per day.
  • a method according to the invention can be used directly to measure the binding of the test compound to the invented. - Build up protein.
  • the compounds identified in this way can be suitable as inhibitors.
  • the 5 methods mentioned above can be designed so that a correspondingly labeled chemical reference compound is replaced by further test compounds to be tested ("displacement assay").
  • transgenic organisms which, after transformation with a nucleic acid sequence according to the invention, are able to express @@@@ homoaconitase;
  • step b) applying a test compound to the organism from step a) and an analog, non-transformed organism;
  • test compounds which bring about a reduced growth rate, survivability and / or infectivity of the non-transgenic organism compared to the growth of the transgenic organism.
  • An analog, non-transformed organism is to be understood as the organism that was used as the starting organism in step a).
  • the transformation can be carried out with a expression cassette, a vector according to the invention or the nucleic acid according to the invention itself.
  • Suitable organisms which are transformed with the nucleic acid sequence or expression cassette or vector according to the invention are, preferably, fungi, particularly preferably the phytopathogenic fungi mentioned at the beginning, very particularly preferably the fungi of the Pyrenophora or Fusarium species mentioned above, particularly preferably from P. teres or F. graminearum., In which the sequence coding for a polypeptide according to the invention is incorporated via transformation.
  • All of the compounds with a fungicidal activity (also called active ingredients) identified by the abovementioned methods can then be checked for their fungicidal activity in an in vivo activity test.
  • the corresponding substance is incubated with a culture of a pathogenic fungus, preferably a culture of a phytopathogenic fungus, particularly preferably a culture of P. teres, the fungicidal activity e.g. about limited growth can be determined.
  • the active ingredients identified via the abovementioned methods can also be present in the form of their agriculturally useful salts.
  • Agriculturally useful salts include, in particular, the salts of those cations or the acid addition salts of those acids whose cations or anions do not adversely affect the fungicidal activity of the active compounds.
  • the cations include, in particular, the ions of the alkali metals, preferably sodium and potassium, the alkaline earth metals, preferably calcium, magnesium and barium, and the transition metals, preferably manganese, copper, zinc and iron, and also the ammonium ion, which, if desired, can carry one to four C 1 -C 4 -alkyl substituents and / or a phenyl or benzyl substituent, preferably diisopropylammonium, tetramethylammonium, tetrabutylammonium, trimethylbenzylammonium, and further phosphonium ions, Sulfonium ions,.
  • sulfonium and sulfoxonium ions preferably tri (C C-C 4 alkyl) sulfoxonium, into consideration.
  • Usable acid addition salts are primarily chloride, bromide, fluoride, hydrogen sulfate, sulfate, dihydrogen phosphate, hydrogen phosphate, phosphate, nitrate, hydrogen carbonate, carbonate, hexafluorosilicate, hexafluorophosphate, benzoate, and the anions of C 1 -C 4 formate alkanoic acids , Acetate, propionate and butyrate. They can be formed by reacting I with an acid of the corresponding anion, preferably hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid or nitric acid.
  • All of the active substances identified by means of the abovementioned processes are, if they contain asymmetrically substituted ⁇ -carbon atoms, either as racemates, mixtures of enantiomers or as pure enantiomers and, if they have chiral substituents, can also be present as mixtures of diastereomers. They are suitable for combating the phytopathogenic fungi mentioned at the beginning.
  • the invention therefore furthermore relates to processes for producing an agrochemical composition having a fungicidal action, characterized in that
  • an active ingredient is identified using one of the abovementioned methods according to the invention.
  • the active ingredient identified via (a) or an agriculturally useful salt of the active ingredient identified via (a) is formulated with appropriate auxiliaries.
  • compositions which have a fungicidal action and can be prepared by the abovementioned process are also an object of the present invention.
  • the active compounds from step a) can be formulated, for example, in the form of directly sprayable aqueous solutions, powders, suspensions, also high-strength aqueous, oily or other suspensions or suspoemulsions or dispersions, emulsions, oil dispersions, pastes, dusts, sprinkling agents or granules, and by spraying , Atomizing, dusting, scattering or pouring can be used.
  • the application forms are directed according to the uses and the nature of the active ingredient used; in any case, they should ensure the finest possible distribution of the active compounds according to the invention.
  • the so-called active ingredients as such or in an oil or solvent can be dissolved or dispersed, it being possible to add further formulation auxiliaries for homogenization.
  • liquid or solid concentrates which are suitable for dilution with water can also be prepared from active ingredient and, if appropriate, solvent or oil and optionally further auxiliaries.
  • Emulsion concentrates EC, EW
  • suspensions SC
  • soluble concentrates SL
  • pastes pastilles
  • wettable powders or granules are mentioned here, whereby the solid formulations can either be water-soluble (soluble) or dispersible (wettable) , Corresponding powder or granules or tablets can also be provided with a solid coating which prevents abrasion or premature release of the active ingredient ("coating").
  • auxiliary means the following substance classes: anti-foaming agents, thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants or emulsifiers, bactericides and thixotropic agents.
  • anti-foaming agents thickeners, wetting agents, adhesives, dispersants or emulsifiers, bactericides and thixotropic agents.
  • the meaning of the above-mentioned agents is known to the person skilled in the art.
  • SLs, EWs and ECs can be produced by simply mixing the corresponding ingredients, powder by mixing or grinding in special mill types (e.g. hammer mills).
  • SCs and SEs are usually produced by wet milling, it being possible to produce an SE from a SC by adding an organic phase containing further auxiliaries or active ingredients.
  • the manufacture is known.
  • Granules for example coated granules, impregnated granules and homogeneous granules, can be prepared by binding the active ingredients to solid carriers.
  • Solid carriers are, for example, mineral soils such as silicas, silica gels, silicates, talc, kaolin, limestone, lime, chalk, bolus, loess, clay, dolomite, diatomaceous earth, calcium and magnesium sulfate, magnesium oxide, ground plastics, fertilizers such as ammonium sulfate, ammonium phosphate , Ammonium nitrate, ureas and vegetable products such as cereal flour, tree bark, wood and nutshell flour or cellulose powder. Details of the production are known to the person skilled in the art, and e.g. listed in the following documents: US 3,060,084, EP-A 707445 (for liquid concentrates), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec.
  • inert liquid and / or solid carriers suitable for the agrochemical compositions according to the invention are known to the person skilled in the art, such as, for example, liquid additives such as mineral oil fractions from medium to high boiling point such as kerosene or diesel oil, also coal tar oils as well as oils of vegetable or animal origin, aliphatic, cyclic and aromatic see hydrocarbons, e.g.
  • surfactants suitable for the formulations according to the invention are known to the person skilled in the art, such as, for example. Alkali, alkaline earth, ammonium salts of aromatic ' sulfonic acids, e.g.
  • Powders, materials for broadcasting and dusts can advantageously be produced as solid carriers by mixing or grinding the active ingredients together with a solid carrier.
  • the fungicidal compositions or the active compounds can be applied curatively, eradicatively or protectively.
  • the application rates of active ingredient are 0.001 to 3.0, preferably 0.01 to 1.0 kg / ha of active substance, depending on the control target, season, target plants and growth stage.
  • Another object of the present invention is a method for controlling harmful fungi, characterized in that the fungi or the materials, plants, soil or seeds to be protected against fungal attack are treated with an effective amount of an active ingredient or an agrochemical composition with a fungicidal action. Harmful fungi are to be understood as the phytopathogenic fungi mentioned at the beginning.
  • Another object of the invention relates to the production of a transgenic organism, the transgenic organism being characterized by an increased lysine production compared to a non-transgenic organism.
  • Archaebacteria and fungi are preferred as transgenic organisms.
  • the transgenic organism is a fungus, preferably the Pyrenophora or Fusarium species mentioned above, particularly preferably P. teres or F. graminearum.
  • further organisms are Alternaria kiku- chiana, Alternaria mali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beticola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpophilum, Cochliob ⁇ lus heterostrophus, Colletotethrumumortumariumumototrophum lorosolarium, Cototrichum lorotumaronostructus, Collototrichum lortariumumostarium, Collototrichum lorotumarostolarototrophum lorumumostarium, Colletotrichum lorotumaronostium, Collototrichum lorotumarost
  • fungal strains are Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Pyreno- phora teres, Saccharomyces (e.g. Saccharomyces cerevisiae), Pichia (e.g. Pichia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995). Arma bacteria can also be used.
  • Saccharomyces e.g. Saccharomyces cerevisiae
  • Pichia e.g. Pichia pastoris, Pichia methanolica
  • Magnaporthe Pyrialeria or others in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995). Arma bacteria can also be used.
  • An increase in lysine production compared to the starting organism means an increase in the lysine content by at least 10%, preferably by at least 20%, particularly preferably by at least 10 40%, very particularly preferably by at least 80%.
  • the transgenic fungus can be produced in the following ways:
  • the corresponding fungus is transformed with one of the above-described 15 embodiments of an expression cassette or vector according to the invention containing SEQ ID N0: 1 or a functional equivalent of said sequence, with here naturally the control sequences mentioned above for the construction of the expression cassette / vectors 20 according to the invention are used which enable the heterologous expression of the target sequence in a fungus.
  • the additional expression of a polypeptide according to the invention can take place either via targeted induction or continuously. This results in an increased production of the metabolic end product lysine compared to a non-transgenic fungus.
  • Cloning methods such as Restriction cleavage, DNA isolation, agarose gel electrophoresis, purification of DNA fragments, transfer of nucleic acids to nitrocellulose and nylon membranes, linking of DNA fragments, transformation of E. coli cells, cultivation of bacteria, sequence analysis of recombinant DNA as well as Southern and Western blots were carried out as in Sambrook et al. , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) and Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6.
  • the bacterial strains used below (E. coli DH5 ⁇ , DHB10) were obtained from BRL Gibco, or Invitrogen ,. Carlsberg, CA related.
  • the vector pAN7-l (Punt et al., Gene 56 (1987) 117-124)
  • the vector pCR ® 2.1-T0P0-TA Invitrogen the vector pUC18 Pharmacia
  • the vector pGEM by the company were Promega used, used.
  • the isolation of the P. teres wild type strain 15A is described in J. Wiland et al. (Phytopathology 89 (1999), 176-181).
  • the DSM.-4527 can be used as F. Graminearum wild type strain 8/1.
  • the sequencing of recombinant DNA molecules was carried out with a laser fluorescence DNA sequencer from ABI according to the method of Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463-5467 (1977)). Fragments resulting from a polymerase chain reaction were sequenced and checked to avoid polymerase errors in constructs to be expressed.
  • the primers DEG Homacl and DEGHomacII were constructed for the detection of the homoaconitase in P. teres and F. graminearum, with conserved amino acid blocks from the protein sequences of the Homoacononces stored in the gene bank from Saoacaronces cerevisiae (Accession No. U46154) and Aspergillus nidulans (Accession No. X99624) were used for the construction:
  • a fragment of 1630 bases was amplified in the case of P. teres and a fragment of 1757 bp in the case of F. graminearum, cloned into the pCR 2.1-TOPO-TA vector using standard cloning techniques and then transformed into E. coli DH10B.
  • the sequencing of the construct produced showed that the fragment had a 65% identity with the homoaconitase from S. cerevisiae and a 70% identity with the DNA sequence of the homoaconitase from Aspergillus nidulans.
  • the sequencing of the construct produced showed that the fragment had a 61.73% identity with the homoaconitase from S. cerevisiae, a 68.73% identity with the DNA sequence of the homoaconitase from Aspergillus nidulans and a 67.46% identity with the DNA sequence of the homoaconitase from Aspergillus fumiga- tus.
  • the phage bank was equipped with the "Lambda FIX ® II Xh ⁇ l Partial Fill-In
  • the phages were transferred to Sambrook el al. (Molecular Cloning. 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press) on Hybond N + nylon membrane from Amersham.
  • the DNA was fixed on the filter using UV radiation (1200 ⁇ J / cm 2 ).
  • the DIG system was used in accordance with the manufacturer's instructions (Röche company).
  • the standard hybridization buffer contained no formamide.
  • the probe was made from the following two primers labeled with digoxygenin in a PCR: HOM / Hyg forw. : 5 '-ctggccaaagctagggtcgta-3'
  • HOM / Hyg rev. 2 5 '-acagtcattccaacatgtacggtg-3'
  • the signals were visualized using an autoradiography film (Hyperfilm TM ECL TM).
  • DNA was isolated from the positive clone according to Lösch (dissertation (2015) Hamburg: 2000). A large lysate was produced for this. The DNA isolated from this was cut with various restriction enzymes and analyzed in a Southern blot. From the bands that showed a signal with the homoaconitase probe already used in phage screening, a DNA band of approximately 6 kb cut with Sall was selected and cloned into the Sall interface of the pUC18 vector. The subsequent sequencing showed that the entire gene sequence of the homoaconitase from P. teres is located on this fragment.
  • a 2314 bp fragment of the sequence SEQ ID N0: 1 comprising 2352 was amplified from the Lambda bank fragment (see example). This fragment was then cloned into the pGEM-T vector. The construct produced was given the name pGEM-T / HOM. A 1084 bp fragment of the homoaconitase gene, which also contains the putative active center, was cut out by a restriction enzyme digestion of the construct produced with the restriction enzymes BsrGI and Nhel. Im so mo therefore, the modified vector construct remains at the end 227 bp or 1003 bp of the homoaconitase gene.
  • a hygromycin cassette containing the restriction enzyme interfaces BsrGI and Nhel was then cloned into the position of the removed homoaconite fragment in the linearized vector.
  • the hygromycin cassette was made up of the glucoamyase promoter region (Gen Bank Accession No: Z 30918), the hygromycin gene (Gen Bank Accession NO: K 01193) and the trpC terminator sequence (Gen Bank Accession) No: E 05643) using common cloning techniques.
  • the resulting construct was also in the vector pGEM-T and was called pGEM-T / hph. This construct was then amplified with primers containing the attached restriction sites BsrGI and Nhel and those with BsrGI and Nhel cut
  • the KO cassette was then amplified by PCR with the Expand Polymerase® from Röche. In this way, 15 ⁇ g of the KO cassette were amplified and purified for the subsequent transformation via gel elution.
  • HOM start 5 ⁇ GGCGCCGCTACTGGTCAAACC 3 ⁇
  • HOM end 5 "GGCGCCTTGTTGACGGGGA 3 ⁇
  • mycelium was grown in liquid culture over 2 days at 28 ° C and 180rpm in CM ( according to Leach et al. (J. Gen. Microbiol. 128 ( 1982) 1719-1729.) Incubated, crushed and then incubated for a further day at 28 ° C., 180 rpm was then washed twice with distilled water. Ten grams of mycelium were mixed with 40 ml of 5% enzyme-osmotic solution (700 mM NaCl, -5% Driselase, sterile) and incubated for 3 hours at 28 ° C. and 10 ORp.
  • enzyme-osmotic solution 700 mM NaCl, -5% Driselase, sterile
  • the progressive protoplasting was followed microscopically via samples.
  • the protoplasts were separated from mycelium residues by filtration, pelleted (3000 rpm, 10 min, 4 ° C.), and after washing with 10 ml each of 700 mM NaCl and SORB-TC (1.2 M sorbitol, 50 mM CaCl 2 lOmM Tris / HCl, pH 7.0) in 1 ml SORB-TC.
  • the concentration of protoplasts was determined by counting under the microscope.
  • Protoplasts were immediately placed on ice, carefully mixed with 15 ⁇ g of the KO HOM cassette amplified by PCR from pHOM / hph and then incubated on ice for 10 min. After adding a volume of PEG-TC (60% (w / V) PEG4000, 50mM CaCl 2 , lOmM Tris / HCl pH 7.0) and subsequent incubation on ice for 15 minutes, 8 volumes - based on the original culture volume - SORB- TC medium added.
  • PEG-TC 50% (w / V) PEG4000, 50mM CaCl 2 , lOmM Tris / HCl pH 7.0
  • the KO plasmid pAN7-Hom-1 was isolated according to standard procedures, as described, for example, in T. Maniatis, EF Fritsch and J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) and in TJ Silhavy, ML Berman and LW Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) and in ' Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing A ⁇ oc. and Wiley-Interscience (1994), center linearized in 'connection with MamI (isoschizomer BsaBI) and adjusted to a concentration of 30g / 01.
  • the petri dishes were overlaid with water agar containing 10 ml of hygromycin (16 g / l agar, 300 mg / l hygromycin) and then incubated at 28 ° C. Mycelium colonies that grew through the selection agar were cut out and separated on CMHyg plates (CMkompl medium with 150 mg / 1 hygromycin).
  • DNA from the mycelium of these cultures was checked for vector integration using Southern ' blot.
  • genomic DNA was 3 5 ge ⁇ chnitten the P. teres transformants and the wild type with the enzyme BstXI and the gramninearum F. Tran ⁇ formanten with Nru I and fractionated in Agaro ⁇ egel. Homoaconitas gene-specific fragments of 2314 bp labeled with digoxygenin were used as the probe.
  • Czapek Medium is an amino acid deficient medium, ie. Transformants that do not grow on this medium are auxotrophic for at least one amino acid.
  • mycelium from the P. teres wild type strain 15A or F. graminearum wild type strain 8/1 was incubated in an analogous manner.
  • the P. teres knockout transformants grew in comparison to the. Wild type 15 A not on the Czapek medium.
  • the F. graminearum mutants grew with a 2 day delay compared to the wild type 8/1.
  • RNA isolation was grown for RNA isolation as for DNA isolation (see Example 1B). The medium was centrifuged off and the mycelium was washed twice with ice-cold water. The RNA isolation was carried out with the peqGOLD RNAPure TM from Promega according to the manufacturer's instructions. The amount was quantified photometrically and the quality of the RNA was checked by gel electrophoresis.
  • HOM start TCAATGAGACGCCCAAAGTACC
  • HOM end ACGATGGAGGACTGCCAATCT
  • the PCR was carried out with 1 / 20th of the cDNA approach according to the manufacturer's instructions from Gibco for the single strand synthesis with SUPERSCRIPT TM II. Only the wild type P. teres 15A cDNA gave a product of the expected size. The five lysine axotrophic transformants no longer produce mRNA for homoaconitase synthesis.
  • the control PCR with the microliter, which was removed before the Superscript addition yielded no product, which shows that the RNA was free of DNA a product which, compared to that from genomic DNA, is smaller by the spliced intron. This also confirms that the RNA was free of DNA and also intact.
  • the virulence of the transformants vis-à-vis the host is determined via visual assessment.
  • the test can be carried out both on the whole plant and with cut leaf segments (Detached Leaf).
  • the filter paper with the leaf segments is placed in a petri dish filled with 10 ml sterile tap water. Each leaf section is inoculated drop-wise with a set conidia suspension (50 conidia / 20 ⁇ l) with 0.01% Tween20 and then cultured in a phyto chamber for up to 7 days. The intensity and size of the necrosis is compared to the wild-type infection.
  • Mycelium was freshly grown in CM medium (2 days incubation at 28 ° C and 180rpm), separated by centrifuging the medium, washed once with distilled water and carefully dried using filter paper.
  • the mycelium was then milled with liquid nitrogen and 100 mg mixed with 1000 ⁇ l of extraction buffer (40% glycerol, 2mM DTT, 1 tablet Complete ® Mini EDTA-free (Fa.Röche) to 10 ml, 200mM potassium phosphate pH 6.5). After an incubation of 5 min on ice and subsequent centrifugation (15300 rpm, 4 ° C., 30 min), the supernatant was transferred to a new reaction vessel and the protein content was determined using the Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate according to the manufacturer's instructions.
  • B) Activity test 50% glycerol, 2mM DTT, 1 tablet Complete ® Mini EDTA-free (Fa.Röche) to 10 ml, 200mM potassium phosphate pH 6.5. After an incubation of 5 min on ice and subsequent centrifugation (15300 rpm, 4 ° C., 30 min), the supernatant was transferred to a new reaction vessel and the protein content
  • the homoaconitase activity in the wild-type strain and in the lysine autotrophic transformants was determined. As can be seen from Figure 1, the homoaconitase activity of the lysine auxotrophic transformants is negligibly low.
  • SEQ ID 1 Nucleic acid sequence of the homoaconitase from P. teres
  • SEQ ID 2 amino acid sequence of the homoaconitase from P. teres
  • Figure 1 Measurement of homoaconitase activity in the wild-type strain and in two knockout mutants (labeled ⁇ lys4 P. eres in the figure)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Homoaconitase als neues Target für Fungizide. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Identifizierung und Isolation der Nukleinsäuresequenz SEQ ID No: 1 kodierend für das Protein Homoaconitase sowie deren funktionelle Äquivalente sowie ein Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung basierend auf den vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen oder den durch diese Sequenzen kodierten Proteinen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen transgenen Organismus enthaltend die SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID NO:l, der verglichen mit einem nicht transgenen Pilz durch eine erhöte Lysinproduktion gekennzeichnet ist.

Description

Homoaconitase als Target für Fungizide
Beschreibung
Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung der Homoaconitase als neues Target für Fungizide. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin die Identifizierung und Isolation der Nukleinsauresequenz SEQ ID No: 1 kodierend für das Protein Homoaconitase sowie deren funktioneile Äquivalente sowie ein Verfahren zur
Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung basierend auf den vorstehend genannten Nukleinsäuresequenze oder den durch diese Sequenzen kodierten Proteinen. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin einen transgenen Organismus enthaltend die SEQ ID NO: 1 oder ein funktionelles Äquivalent der SEQ ID N0:1, der verglichen mit einem nicht transgenen Pilz durch eine erhöte Ly- sinproduktion gekennzeichnet ist.
Das grundlegende Prinzip, Fungizide über Inhibierung eines defi- nierten Enzymes (Target) zu identifizieren ist bekannt
(WO 00/3657) . Im Zuge zunehmender Resistenzproblematiken bei Fun- giziden besteht jedoch ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Fungizide darstellen könnten.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, ein neues fungi- zides Target zu identifizieren.
Die Detektion neuer Targets ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines StoffWechselweges ist, häufig das Wachstum oder die Infek- tiösistät des pathogenen Pilzes nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass der pathogene Pilz auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechsel- weg ist. Die Targeteignung eines Genproduktes lässt sich daher auch mit Kenntnis der Genfunktion nicht vorhersagen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, neue Targets für Fungizide zu identifizieren sowie Verfahren bereitzu- stellen, welche zur Identifizierung von fungiziden Wirkstoffe geeignet sind.
Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Homoaconitase kodiert durch die Sequenz SEQ ID N0:1 oder ein funktionelles Äqui- valent der SEQ ID N0:1 als fungiz des Target geeignet ist. Weiterhin wurde gefunden, daß in einem transgenen Pilz , der die SEQ ID NO : l enthält , durch vermehrte Expression der Homoaconitase eine Erhöhung der Lysinbiosynthese erreicht wurde .
Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde somit gelöst durch
1 ) die Isolation der für die Homoaconitase, insbesondere der aus dem phytopathogenen Pilz Pyrenophora (P . ) teres stammenden Homoaconitase, codierenden Nukleinsauresequenz SEQ ID NO : l ;
2) die Validierung der Homoaconitase als Fungizid-Target durch molekularbiologische Methoden in Pyrenophora teres und Fusa- rium graminearum;
3) die Bereitstellung eines Aktivitätstests zur Identifizierung von Inhibitoren der Homoaconitase; sowie
4) die Verwendung der über den Aktivitätstest identifizierten Inhibitoren als Fungizide.
Ferner konnte überraschend gefunden werden, dass transgene Pilze enthaltend die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen gekennzeichnet sind durch einen erhöhten Lysingehalt verglichen mit einem nicht transgenen Pilz.
An dieser Stelle werden nun einige der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"Affinitäts-Tag" : Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen codierende Nukleinsauresequenz mit der für das Zielprotein codierenden Sequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolation des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromatographie . Der oben erwähnte Linker kann optional eine Protease-Schnittsteile (z.B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespalten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts-Tags sind das "His-Tag" z.B. von Quiagen, Hilden, "Strep-Tag", das Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg) , das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolab und das sogenannte CBD-Tag von Novagen.
"Enzymatische Aktivität / Aktivitätstest" : Der Begriff enzymati- sche Aktivität beschreibt die Fähigkeit eines Enzyms ein Substrat in ein Produkt umzuwandeln. Hierbei kann sowohl das natürliche Substrat des Enzyms als auch ein synthetisches modifiziertes Ana- logon des natürlichen Substrates verwendet werden. Die enzymati- sche Aktivität kann in einem sogenannten Aktivitätstest über
1) die Zunahme des Produktes; oder
2) die Abnahme des Eduktes; oder
3) die Abnahme eines spezifischen Cofaktors; oder
4) einer Kombination aus mindestens zwei der unter 1) bis 3) erwähnten Parameter
in Abhängigkeit einer definierten Zeitspanne bestimmt werden. Falls das Enzym eine reversible Reaktion katalysiert, kann sowohl das Edukt als auch das Produkt als Substrat in den entsprechenden Aktivitätstest eingesetzt werden.
"Expression" beschreibt Transkription und anschließende Translation eines Gens in einer Zelle, enthaltend die gewünschte Nu- kleinsäuresequenz .
"Expressionskassette oder Nukleinsäuesequenz" : Unter einer Ex- presεionskassette, enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz, versteht man beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra-chromoso al oder integriert in das Genom vorliegen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression des Zielproteins in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nut- zung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wur- ' den.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch die Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstell- bar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander er- folgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. En- quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labora- tory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F.M. et al . , Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc . and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
"Gen" beschreibt eine für ein Protein codierende Nukleinsäurese- quenz, die in RNA (mRNA, rRNA, tRNA, snRNA, senseRNA oder anti- senseRNA) transkribiert werden kann und optional mit regulatorischen Sequenzen assoziiert sein kann. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind Promotorsequenzen. Weitere optional vorhandene Elemente sind beispielsweise Introns.
"Genetische Kontrollsequenz" : Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen (äquivalent zu sehen mit dem Begriff "regulatorische Sequenz") beschreibt die Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Ex- pressionskassette haben und zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryonti- schen Organismen gewährleisten. Beispiele sind hierfür sind Promotoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die na- türliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens erhöht wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Aus- gangsOrganismus . Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5 '-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodie- rende 3 '-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Inser- tion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Ent- fernung aus dem Genom erlauben.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die • 1) unter Standardbedingungen mit der für das Zielprotein kodierenden Nukleinsauresequenz (nach der vorliegenden Erfindung mit der SEQ ID NO:l) oder Teilen der für das Zielprotein kodierenden Nukleinsauresequenz hybridisieren und
5
2) befähigt sind die Expression eines enzymatisch aktiven Zielproteins (im Falle der vorliegenden Erfindung der Homoaconitase) in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.
10 Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 10-50 bp; vorzugsweise 15-40 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere
15 Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren
20 diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10 °C niedriger als die von ■ DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge.
Unter Standardbedingungen sind beispielsweise je nach Nuklein-
25 säure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 x SSC (1 X SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumeitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50 % Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 x SSC, 50 % Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die
30 Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 45°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungs- ■ bedingungen vorteilhaft bei 0,1 x SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 55°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese
35 angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50 % in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der
•Q Genetik wie beispielsweise Sambrook et al . , "Molecular Clbning" ,
Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-
Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann m5r. der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al .
(eds) , 1985, Current Protocols m Molecular Biology, John Wiley &
Sons, New York; Harnes and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids
Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford Uni- versity Press, Oxford; Brown (ed) , 1991, Essential Molecular Bio- logy: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem "funktionellen Äquivalent" versteht man ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der entsprechenden Nukleinsäuresequenzen des Zielsproteins sowie deren Homologe aus anderen Organismen, welche die Expression des enzyma- tisch aktiven Zielproteins in einer 'Zelle oder einem Organismus ermöglichen.
Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfasst, welche man durch Modifikation der Nukleinsauresequenz des Zielproteins beschrieben durch SEQ ID NO 1 erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z.B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung überflüssiger DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über besagte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, sollten jedoch trotz abweichender Nukleinsauresequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents kann sich auch auf das durch die entsprechende Nukleinsauresequenz codierte Protein beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äqui- valent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der SEQ ID NO: 2 bis zu einem bestimmten Prozentsatz identisch ist.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z.B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Amino- säuresequenzen.
Generell gilt , dass funktionelle Äquivalente unabhängig von der jeweiligen Aminosäuresequenz (codiert durch eine entsprechende Nukleinsauresequenz) jeweils die gleiche enzy atische Aktivität wie das Protein haben, dass durch die Nukleinsauresequenz SEQ ID NO: 1 codiert wird. Die "funktionellen Äquivalente" weisen somit die biologische Aktivität einer Homoaconitase auf.
"Geeignete Reaktionszeit" bezeichnet die Zeit, die man für die Durchführung eines Aktivitätstests benötigt und hängt nicht nur von der verwendeten Methode, sondern auch von der Empfindlichkeit der verwendeten Geräte ab. Dem Fachmann ist die Ermittlung der Reaktionszeiten bekannt. Bei auf photometrischen Methoden basie- renden Testsystemen liegen die Reaktionszeiten im allgemeinen zwischen > 0 bis 40 Minuten.
"Homoaconitase" ist hier als ein Enzym definiert, welches rever- . sibel die Umwandlung von Homoaconitat zu Homoisocitrat zu katalysieren vermag.
"Homoaconitase-Aktivität" bezeichnet die Fähigkeit eines Enzyms, die Umwandlung von Homoaconitat zu Homoisocitrat zu katalysieren. Dieser Begriff ist äquivalent mit dem Begriff "biologische Aktivität einer Homoaconitase" .
"Identität" oder auch "Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nu- kleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Program- malgorithmus GAP. (Wisconsin,- Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG) , Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 50 Length Weight: 3
Average Match: 10 Average Mismatch:-9
"Mutationen" umfassen Substitutionen (=Ersetzungen) , Additionen (Hinzufügung) , Deletionen (Löschung) , Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidre- ste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann.
"Knock-Out-Transformanten" bezeichnet Einzelkulturen eines transgenen Organismus, im Fall von P. teres homokaryotische Einzelkulturen, in denen gezielt über Transformation ein spezifisches Gen inaktiviert wurde.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromoso- alen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsauresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsauresequenz zumindest an 5'- oder 3 '-Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders be- vorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp. "Operative Verknüpfung" : Unter einer operativen oder auch funktionellen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine 5 Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen in nicht natürlicher Anordnung herstellbar durch rekombinante 10 DNA-Technologie, aber auch DNA enthaltend zelleigene und zellfremde oder synthetische DNA, auch homologe und heterologe DNA bezogen auf Verwandschaft der Organismen
"Rekombinate DNA-Technologie" : allgemein bekannte Techniken zur 15 Fusionierung von DNA-Sequenzen (z.B. beschrieben in Sambrook et al . , 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press) .
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfin- 20 dungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen z.B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al . : Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) .
25 "Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine.
Über Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resi- stenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeit-
30 punktes vorgenommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(l):29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389 (1) : 44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6:325-330; Leffel SM et al . , Biotechni-
35 ques. 23(5):912-8, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sei 1996, 116:59-72; Scikantha', J Bact 1996, 178:121; Millar et al . , Plant Mol Biol Rep 1992 10:324-414), sowie Luziferasegene im allgemeinen die ß-Galactosi- dase, oder die ß-Glucuronidase (Jefferson et al . , EMBO J. 1987, 6,
40 3901-3907) , das das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das 2-Desoxyglu- cose-6-phosphat-Phosphatasegen, ß-Lactamasegen, das Neo ycinphosp- hotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA (= Gluphosinatresistenz) -Gen.
45 "Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika. Beispielhaft zu nennen seien hier das npt Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycisid-Antibiotika Neomycin (G 418) , Kanamycin, und Paromycin verleiht (Deshayes A et al . , EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das hygro Gen (Marsh JL et al . , Gene. 1984; 32 (3) :481-485) , das sul Gen (Guerineau F et al . , Plant Mol Biol. 1990; 15 (1) :127-136) , das Hygromycin-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das she-ble Gen, das eine Resistenz gegen das Bleo- mycin Antibiotikum Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für Selek- tions arker-Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglu- cose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten-Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sei. Adv.) 13 (1994) 142-149) . Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sei U S A. 85 (1988) 8047-8051) . Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isome- rase (WO 94/20627) , das ODC (Ornithin-Decarboxylase) Gen (McCon- logue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergil- lus terreus (Tamura K etal . , Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338) .
"Signifikante Abnahme" : bezogen auf die enzymatische Aktivität ist hier eine Abnahme der enzymatischen Aktivität des mit einer Testverbindung inkubierten Enzyms im Vergleich zur Aktivität des nicht mit der Testverbindung inkubierten Ξnyzms gemeint, die außerhalb eines Meßfehlers liegt.
"Substrat": Substrat ist die Verbindung, die von dem Enzym in seiner ursprünglichen Funktion erkannt wird und mittels einer durch das Enzym katalysierten Reaktion in ein Produkt umgewandelt wird.
"Testverbindung" bezeichnet die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und identifiziert wurden. Diese Stoffe können z. B. aus Expressionsbibliotheken, z.B. cDNA-Expressionsbibliotheken stammen oder Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Anti- körper, kleine organische Stoffe, Hormone,• PNAs oder ähnliches sein (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs , Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen) . Die Stoffe können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z.B. in Zell- extrakten von z.B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten.
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung hetero- loger DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus ' .
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsauresequenz, eine Expres- sionskassette oder einen' Vektor enthaltend besagte Nukleinsauresequenz oder einen Organismus transformiert mit besagter Nukleins uresequenz, Expressionskassette oder Vektor beschreibt transger alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder
1) die Nukleinsauresequenz des Zielproteins; oder
2) eine mit der Nukleinsauresequenz des Zielproteins funktionel. verknüpfte genetische Kontrollsequenz; oder
3) eine Kombination aus (1) und (2)
sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifi- kation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsauresequenz erreicht werden.
"Wirkstoff" ist hier gleichbedeutend mit dem Begriff "Verbindung mit fungizider Wirkung" .
Die Homoaconitase katalysiert in einem, nur in Archaebakterien und Pilzen vorkommenden α-Aminoadipat-Weg für die Synthese der Aminosäure Lysin (Nishida, H. et al . , Journal of Molecular Evolu- tion 51 (2000) 299-302) reversibel die Umwandlung von Homoaconitat zu Homoisocitrat.
Obgleich neben anderen Genen des Lysinbiosyntheseweges die Homoa- conitasen aus nicht-pathogenen Pilzen wie Aspergillus nidulans (Weidner et al . , Molecular and General Genetics 255 (1997)
237-247, Identität bez. der SEQ ID No: 1 = 70,0%, bez. der SEQ ID No: 2 = 63,2%), Saccharomyces cerevisiae (Gen bank Acc. Nr. X93502; Identität bez. der SEQ ID No : 1 = 65%, bez. der SEQ ID No: 2 = 56,8%) und Candida albicans (Genbezeichnung lys4, Candida Datenbank: Contig 6-2495 (69967bp-72022bp) ; Identität bez. der SEQ ID No: 2 = 56,7%) bekannt sind und bezüglich ihrer Relevanz für den Lysinstoffwechsel charakterisiert wurden (Wang et al., Curr. Gen-. 16 (1989) 7-12; Weidner et al . , Mol. Gen. Ge- net. 255 (1997) 237-247), fehlte bislang jegliche Charakterisie- rung von Enzymen, die in pathogenen bzw. phytopathogenen Pilzen Schritte in diesem Stoffwechselweg katalysieren ebenso wie Stu- dien, welche die Relevanz der Homoaconitase für das Wachstum von phytopathogenen Pilzen belegen.
Eine Gensequenz, die vermutlich für eine Homoaconitase codiert, ist weiterhin von Schizosaccharomyces pombe (Gen bank Acc. Nr. CAB52279; Identität bez. der SEQ ID No: 2 = 51,6%) bekannt.
Durch Herstellung von Knock-Out Transformanten des P. teres WildtypStammes 15A bezüglich des Homoaconitase-Gens konnte überra- sehender Weise gezeigt werden, daß Homoaconitase für nicht nur für die Lysin-Biosynthese, sondern auch für das Wachstum und Überleben des phytopathogenen Pilzes P. teres essentiell ist. Die oben beschriebenen Knock-out Transformanten waren weder in der Lage, auf Minimalmedium zu wachsen, noch auf Gerste trotz des in Gerste vorhandenen Lysins zu überleben.
Diese Ergebnisse konnten durch einen weiteren Knock-out in einem zweiten phytopathogenen Pilz, Fusarium (F.) graminearum, bestätigt werden. Die F. graminearum Knock-out Transformanten zeigten ein verzögertes Wachstum auf Minimalmedium und waren nicht mehr in der Lage Weizen in dem Maße wie der Wildtyp zu befallen. Die Sequenzierung des aus Fusarium stammenden Homoaconitasefragmentes (SEQ ID NO: 3) zeigte, daß das Fragment eine 61,73%ige Identität mit der Homoaconitase aus S. cerevisiae, eine 68,73%ige Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus Aspergillus nidulans eine 67,46%ige Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus Aspergillus fumigatus und eine 68,25%ige Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus P. teres aufwies.
Auf Basis der vorliegenden Erfindung stellt die Homoaconitase ein neues Target für Fungizide zur Bekämpfung pathogener Pilze, bevorzugt phytopathogener Pilze dar.
Die Homoaconitase konnte erstmals eindeutig als geeignetes Ziel- protein (Target) für fungizide Wirkstoffe identifiziert werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher die Verwendung des Genproduktes einer Nukleinsauresequenz aus einem phytopathogenen Pilz codierend für ein Protein mit der biologischen Aktivi- tat einer Homoaconitase als Target für Fungizide, wobei die Nukleinsauresequenz
a) eine Nukleins uresequenz mit der in SEQ ID N0.- 1 dargestellten Nukleinsauresequenz ; oder b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID
NO:lmit einer Identität von mindestens 61% zu der SEQ ID NO:l umfasst .
Die hier beanspruchten, erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID N0:1 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:2 der Homoaconitase aus P. teres von mindestens 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% vorzugsweise mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% besonders bevorzugt minde- stens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Besagte funktionelle Äquivalente . zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d.h. sie vermögen weiterhin die Umsetzung von Homoaconitat zu Homoisocitrat reversibel zu katalysieren.
Unter pathogenen Pilzen sind die Pilze zu verstehen, die einen Wirt besiedeln und dadurch eine Krankheit des Wirtes hervorrufen. Beispiele für Pflanzen befallende Pilze, sogenannte phytopatho- gene Pilze, sind neben P. teres, der Gerste befällt, folgende Spezies: Alternaria-Arten, Podosphaera-Arten, Sclerotinia-Arten, Physalospora canker an Gemüse und Obst, Botrytis cinerea (Grauschimmel) an Erdbeeren, Gemüse, Zierpflanzen und Reben, Corynes- pora melonis an Gurken, Erdbeeren; Colletotrichum-Arten an Gurken; Diplocarpon rosae an Rosen; Elsinoe fawcetti und Diaporthe citri an Citrus-Früchten; Sphaerotheca-Arten an Gurken, Kürbisgewächsen, Erdbeeren und Rosen; Cinula neccata an Gurken, Cercos- pora-Arten an Erdnüssen, Zuckerrüben, Eierpflanzen und Dattelpflaumen; Erysiphe cichoracearum und Sphaerotheca fuliginea an Kürbisgewächsen, Leveillula taurica an Piment; Mycosphaerella-Ar- ten an Äpfeln und Japanischer Aprikose; Phyllactinia kakicola, Gloesporium kaki, an Japanischer Aprikose; Gymnosporangium yama- dae, Leptotthrydium pomi, Podosphaera leucotricha und Gloedes po- migena an Äpfeln; Cladosporium carpophilum an Birnen und Japanischer Aprikose; Phomopsis-Arten an Birnen; Phytopora-Arten an Ci- trus Früchten, Kartoffeln, Zwiebeln; Phytophthora infestans an Kartoffeln und Tomaten, Erysiphe graminis (echter Mehltau) an Getreide, Fusarium- und Verticillium-Arten an verschiedenen Pflanzen, Glomerella cingulata an Tee; Drechslera bzw. Bipolaris-Arten an Getreide, Mycosphaerella-Arten an Bananen und Erdnüssen, Plas- mopara viticola an Reben und Grapefruits, Personospora-Arten an Zwiebeln, Spinat und Chrysantemen; Phaeoisariopsis vitis und Spa- celo a ampelina an Grapefruits; Pseudocercosporella herpotrichoi- des an Weizen und Gerste, Pseudoperonospora-Arten an Hopfen und Gurken, Puccinia-Arten und Typhula-Arten an Getreide, Pyricularia oryzae an Reis, Rhizoctonia-Arten an Baumwolle, Reis und Rasen, Stachosporium nodorum an Weizen, Uncinula necator an Reben, Usti- lago-Arten an Getreide und Zuckerrohr, Gaeumannomyces graminis an Hafer und Rüben sowie Venturia-Arten (Schorf) an Äpfeln und. Birnen. Beispiele für humane pathogene Pilze sind Spezies wie Candida albicans und Aspergillus fumigatus .
Hierbei sind unter dem Begriff "Fusarium Arten" oder Fusarium Spezies vorzugsweise die folgenden Spezies zu verstehen: F. graminearum, F. di erium, F. merismoides, F. lateritium, F. decem- cellulare, F. poae, F. tricinctum, F. sporotrichioides, F. chla- mydosporum, F. rnoniliforme, F. proliferatum, F. anthophilum, F. subglutinans , F. nygamai, F. oxysporum, F. solani, F. culmorum, F. sambucinum, F. crookwellense, F. avenaceum ssp. avenaceum, F. avenaceum ssp. aywerte, F. avenaceum .ssp.- nurragi, F. hetrospo- rum, F. acuminatum ssp. acuminatum, F. acuminatum ssp. armenia- cum, F. longipes, F. compactum, F. equiseti, F. scripi, F. poly- phialidicum, F. semitectum und F. beomiforme.
Hierbei sind unter dem Begriff "Pyrenophora Arten" oder "Pyrenophora Spezies" folgende Spezies bevorzugt folgende Arten zu verstehen: P. graminea, P. hordei, P. japonica, P. teres, P. teres f. aculata, P. teres f. teres, P. tritici-repentis .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin folgende Nukleinsäuren:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Amiriosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) eine Nukleinsauresequenz, 'die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung eines funktionellen Äquivalentes der in SEQ ID NO : 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
d) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid mit den in
SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren; oder e) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert; oder
f) Teile- der Nukleinsäuresequenzen a) , b) , c) oder d) .
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind weiterhin Nukleinsäuresequenzen beansprucht kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Homoaconitase, umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:l dargestellten Nukleinsauresequenz ; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID
NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:lmit einer Identität von mindestens 71% zu der SEQ ID NO:l.
Die Nukleinsäuresequenzen stammen vorzugsweise aus einem phytopathogenen Pilz. Hierbei sind unter dem Begriff des phytopathogenen Pilzes die eingangs erwähnten Spezies zu verstehen. Vorzugsweise stammt die Nukleinsauresequenz aus den eingangs erwähnten Pyrenophora oder Fusarium-Arten, ganz besonders bevorzugt P. teres und F. graminearum. Die Verwendung des Genproduktes einer der vorstehend genannten Nukleinsauresequenz codierend für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Homoaconitase als Target für Fungizide ist ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 2 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:2 der Homoaconitase aus P. teres von mindestens 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% vor- zugsweise mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Besagte funktionelle Äquivalente zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d.h. sie vermögen weiterhin die Umsetzung von Homoaconitat zu Homoisocitrat reversibel zu katalysieren.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 2 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:l der Homoaconitase aus P. teres von mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Besagte funktionelle Äquivalente zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d.h. sie vermögen weiterhin die Umsetzung von Homoaconitat zu Homoisocitrat reversibel zu katalysieren.
Weiter Gegenstand der Erfindung sind Abschnitte der SEQ ID NO:l sowie funktioneller Äquivalente der SEQ ID N0:lwobei der Bereich des Abschnites von Aminosäureposition 2 bis 783 reicht. Bevorzugt ist hier der Bereich von der Anminoεäureposition 200 bis 600. Be- sonders bevorzugt ist hier der Bereich von der Anminosäureposi- tion 250 bis 550, und ganz besonders bevorzugt von Aminosäureposition 300 bis 500.
Die oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen können für die Herstel- lung von Hybridisierungssonden verwendet werden, über welche die entsprechenden Vollängengene isoliert werden können. Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mittels PCR und der Ver- wendung von entsprechend markierten Oligonukleotiden mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten erfolgen. Die hierfür erforderlichen Technologien sind beispielsweise in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt. Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mutagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z.B. als Sonde, die spezifisch zu mRNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen.
Des weiteren können Teile der erfindungemäßen Nukleinsäuren als Sonden für die Detektion und Isolation von funktionellen Analoga der SEQ ID NO:l aus anderen Pilzspezies aufgrund von Sequenziden- titäten verwendet werden. Hierbei wird ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO:l als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank des entsprechenden Pilzes oder in einer Computer-Recherche nach analogen Sequenzen in elektronischen Datenbanken verwendet.
Weitere Anwendungen der oben beschriebenen Sonden sind die Analyse eventuell veränderter Expressionsprofile der erfindungemäßen Nukleinsäuren in diversen Pilzen, bevorzugt aus den eingangs erwähnten Pyrenophora- oder Fusarium Arten, besonders bevorzugt P. teres oder F. graminearum speziell in Verbindung mit bestimmten Faktoren wie erhöhter Resistenz gegenüber Fungizide, der Detek- tion des Pilzes in Pflanzenmaterial sowie Detektion von entstehenden Resistenzen.
Die Erhöhung der Resistenz gegen ein Fungizid, welches Homoaconi- tase als Target hat, basiert häufig auf Mutation, z.B. dem Austausch von Aminosäuren verursacht durch eine Mutation in der Nukleinsauresequenz, an für die Substratspezifität essentiellen Stellen wie z.B. im Bereich des aktiven Zentrum oder an anderen Stellen des Proteins, welche die Bindung des Substrates beein- flussen. Aufgrund der vorstehend beschriebenen Veränderungen kann die Bindung des als Fungizid wirkenden Inhibitors an das Erf . - Protein erschwert oder gar verhindert werden, so dass eine eingeschränkte oder keine fungizide Wirkung in den entsprechenden Kulturen zu beobachten ist.
Da di'e hierbei auftretenden Veränderungen oft nur wenige Basenpaare umfassen, können die oben beschriebenen Sonden basierend auf den oben definierten Nukleinsäuresequenzen zur Detektion von entsprechend mutierten Homoaconitasenukleinsäuresequenzen in vollständig oder partiell resistenter phytopathogener Pilze verwendet werden.
Nach Isolation des enstprechenden Homoaconitase-Gens oder Genabschnitt aus dem entsprechenden resistenten Pilz mittels der oben erwähnten Sonden gefolgt von Sequenzierung und Vergleich mit der entsprechenden Wildtyp-Nukleinsäuresequenz stehen für die Analytik prinzipiell zwei Methoden zur Verfügung:
1) Herstellung von auf einer der vorstehend gennanten Nuklein- säuresequenzen basierenden Oligonukleotiden enthaltend die
Mutation mit anschließender PCR; oder
2) Herstellung von Oligonukleotiden basierend auf einer der vorstehend gennanten Nukleinsäuresequenzen, wobei der die Muta- tion flankierende Bereich mittels PCR amplifiziert wird, gefolgt von einem Restriktionsverdau und/oder einer Sequenzierung.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind Expressionskassetten ent- haltend eine für Homoaconitase codierende Nukleinsauresequenz umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ' ID NO:lmit einer Identität von mindestens 71% zu der SEQ ID NO:l.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Ex- pressionskassetten, deren Nukleinsauresequenz für eine der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen kodiert oder für funktionelle Äquivalente der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestens 71% zu der SEQ ID N0:1 zur Herstellung rekom- binanter Homoaconitase für die weiter unten aufgeführten Testsy- ste e. Die Nukleinsauresequenz kann dabei z.B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein.
Die Expressionskassetten beinhalten vorteilhaft außerdem genetische Kontrollsequenzen, welche die Expression der kodierenden Se- quenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5 '-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3 '-Ende Transkriptions-Ter inations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische KontrollSequenzen, welche mit der dazwischenliegenden kodierenden Sequenz für das Homoaconitase Gen operativ verknüpft sind.
Erfindungsgemäß sind auch Analoga der oben beschriebenen Expressionskassetten die zum Beispiel durch eine Kombination der ein- zelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfach- konstrukte) , auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Ko- transformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der verwendeten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts oder die oben beschriebene Expressionskassetten enthalten. Diese Vektoren enthalten Nukleinsäuresequenzen umfassend:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID
NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestens 71% zu der SEQ ID N0:1
Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung der vorstehend genannten Vektoren oder von Vektoren enthaltend Nukleinsäuresequenzen umfassend funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID N0:1 mit einer Identität von mindestens 65% zu der SEQ ID N0:1 zur Herstellung rekombinanten Proteins für die Testsysteme.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom .im Wirtsorganismus repliziert oder chro osomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäure- konstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Vorteilhafte Kontrollsequenzen für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, laclq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor, die zur Expression der Homoaconitase in gram-negativen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Weitere vorteilhafte KontrollSequenzen sind beispielsweise in den Promotoren amy und SP02, die zur Expression der Homoaconitase in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa , AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, AOX1 und GAP enthalten, die zur Expression der Homoaconitase in Hefestämmen verwendet werden können, enthalten.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete Kontrollelemente sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der plO-Promotor (Luckow, V.A. and Summers, M.D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55) zu nennen.
Vorteilhafte KontrollSequenzen zur Expression der Homoaconitase in Zellkultur sind sind neben Polyadenylierungssequenzen zum Beispiel die folgenden eukaryontisehen Promotoren viralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40 enthalten.
Weitere prokaryotische und eukaryotische ExpressionsSysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al . , Molecular Clo- ning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al . (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können neben den ohen erwähnten Promotoren auch weitere Funktionsele ente enthalten. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien hier zu nennen:
1) Reportergene;
2) Replikationsursprünge;
3) ' Selektionsmarker;
4) sogenannte Affinitäts-Tags, fusioniert mit der Homoaconitase direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine
Protease-Schnittstelle .
' Die Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamen- tosen Pilzen und Algen und eukaryontisehen Zellen (z.B. Insektenzellen) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung der Homoaconitase eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet. Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette oder eines Vektor hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante Homoaconitase sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Mikroorganismen für die rekombinante Expression sind sind neben Bakterien, Hefen, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien.
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pi- chia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neuros- pora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elega s . "
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsysteme und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältich sind.
Zu nennen sind hierbei die typischen vorteilhaften, kommerziell erhätliehen Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Ine; Smith, D.B. and Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Pi- scataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST) , Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69:301-315) der "pKK233-2" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die "pBAD"-Vektor-Serien von Strata- gene, La Jolla.
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Secl (Baldari, et al . , (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ-Deri- vate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) . Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: van den Hon- del, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) "Gene transfer Systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al . , eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressions- Vektoren genutzt werden z.B. für die Expression in Sf 9 Zellen. Dies sind z.B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170:31-39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus ExpressionsSysteme "MaxBac 2.0 Kit" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLON- TECH, Palo Alto, CA.
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzen- expressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al . (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the' left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M.W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation" , Nucl . Acid. Res . 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329:840 oder Kaufman et al . (1987) EMBO J. 6:187-195) . Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren vi- ralen Ursprungs wie z.B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed. , Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al . (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung, welche die Homoaconitase bzw. deren funktionelle Analoga inhibieren.
Das Verfahren basiert auf der Verwendung von Nukleinsäuresequen- zen umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID N0:1 mit einer Identität von mindestens 61% zu der SEQ ID NO:l
oder auf der Verwendung der durch die vorstehend genannten Nu- kleinsäuresequenzen kodierten Aminosäuresequenzen der Homoaconitase aus einem phytopathogenen Pilz. Die hier beanspruchten, erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID N0:1 weisen eine Identität mit der SEQ ID No:2 der Homoaconitase aus P. teres von mindestens 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% vorzugsweise mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Die vorstehdend genannten Nukleinsäuresequenzen werden im folgenden als erfindungsgemäße Nuklein- säuresequenzen bezeichnet. Ein durch eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodiertes Polypeptid wird im folgernden als Homoaconitase oder erfindungsgemäßes Protein/Polypeptid bezeichnet.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung des Genproduktes einer erfindungsgemäßen, wie obenstehend, definierten Nukleinsauresequenz als Target zur Ermittlung fungizid wirkender Substanzen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung sind dadurch gekennzeichnet, dass man die Tanskription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes der erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz, beeinflußt und solche Verbindungen auswählt, die die Tanskription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt reduzieren oder blockieren, wobei die erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz aus der Gruppe folgender Sequenzen auszuwählen ist:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder c) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung eines funktionellen Äquivalentes der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
d) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für ein Polypeptid mit den in
SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren; oder
e) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert.
Unter Reduktion der Tanskription, Expression, Translation oder der Aktivität des Genprodukts ist eine Verringerung der biologi- sehen Aktivität im Vergleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% zu verstehen. Blockie- rung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die 100%ige Blockierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80%ige, besonders bevorzugt mindestens 90%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%ige Blockierung der biologischen Aktivität.
Eine weitere Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung umfasst die folgenden Schritte:
i. Inkontaktbringen eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls oder einer Homoaconitase mit einer oder mehreren TestVerbin- dungen unter Bedingungen, die die Bindung der Testsubstanz (en) an das Nukleinsäuremolekül oder an die Homoaconitase, das durch das vorstehend genannte Nukleinsäuremolekül kodiert wird, erlauben; und
i) Nachweis, ob die Tes'tverbindung an die Homoaconitase aus i) bindet;
ii) Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität der Homoaconitase aus i) reduziert oder blockiert; oder
iii) Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription, Translation oder Expression der Nukleinsäure aus i) reduziert oder blockiert. Sämtliche der oben genannten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden im folgenden als erfindungsgemäßes Verfahren bezeichnet.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung verwendet werden.
Wenn ein zu untersuchende Probe, die eine nach dem erfindungsgemäßen Verfahren identifizierte Verbindung mit fungizider Wirkung beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, diese Verbindung direkt aus der Probe zu isolieren. Alternativ kann man die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z.B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Testverbindungen besteht, um so die Zahl der verschiedenen Testverbindungen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode untersuchte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Verbindungen oder nur noch eine Verbindung mit fungizider Wirkung umfaßt.
HTS ermöglicht das parallele Testen einer Vielzahl verschiedener Verbindungen. In HTS bietet sich für die praktische Durchführung die Verwendung von Trägern an, die eines oder mehrere der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle, einen oder mehrere die erfin- gungsgemäße Nukleinsauresequenz enthaltenden Vektoren, einen oder mehrere transgene Organismen, welche mindestens eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten oder eines oder mehrere (Poly)peptide codiert über die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen enthalten können. Der verwendete Träger kann fest oder flüssig sein, ist bevorzugt fest, besonders bevorzugt eine Mikrotiterplatte. Die vorstehend genannten Träger -sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Gemäß der am weit verbreitesten Technik werden 96-well, 384-well oder 1536-well Mikroti- terplatten verwendet, die in der Regel Volumina von 50 bis 500μl, vorzugsweise 200μl umfassen können. Neben den Mikrotiterplatten sind die weiteren Bestandteile eines HTS-Systems passend zu den jeweiligen Mikrotiterplatten wie viele Instrumente, Materialien, automatische Pipettiervorichtungen, Robotoren, automatisierte Plattenleser sowie Plattenwascher kommerziell erhältlich.
Neben den auf Mikrotiterplatten basierenden HTS-Verfahren können auch sogenannte "free format assays" oder Testsysteme, die zwischen den Proben keine physischen Barrieren aufweisen, verwendet werden wie z.B. in Jayaickreme et al . , Proc. Natl . Acad. Sei U.S.A. 19 (1994) 161418; Chelsky, "Strategies for Screening Co - binatorial Libaries, First Annual Conference of The Society for Biomolecular Screening in Philadelphia, Pa. (Nov. 710, 1995); Salmon et al . , Molecular Diversity 2 (1996), 5763 und US 5,976,813.
Die nun folgenden bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens basieren auf den Schritten i) und iii) .
Eine bevorzugte Ausführungsform des in vitro Verfahrens umfasst die folgenden Schritte, wobei
a) besagtes Polypeptid entweder in einem erfindungsgemäßen transgenen Organismus in enzymatisch aktiver Form exprimiert wird oder ein das erfindungsgemäße Protein enthaltender Organismus kultiviert wird;
b) das im Schritt a) erhaltene Protein in dem ruhenden oder wachsenden Organismus direkt, im Zellaufschluss des transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung inkubiert wird;
c) eine Testverbindung durch Schritt b) selektiert wird, welche ein Polypeptides codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz inhibiert.
Der Begriff "inhibiert" ist mit dem Bergriff "signifikante Ab- nähme der enzymatischen Aktivität" gleichzusetzen, der im folgenden definiert wird.
Eine analoge Form des oben stehenden Verfahrens ist dadurch gekennzeichnet, dass
a) entweder Homoaconitase in einem transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus der naturgemäß Homoaconitase codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsauresequenz enthält, kultiviert wird;
b) Homoaconitase aus dem Organismus aus Schritt a) im Zellauf- schluss des Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und c) eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Homoaconitase reduziert oder blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten Homoaconitase mit der Aktitivtät einer nicht mit einer TestVerbindung inkubierten' Homoaconitase ermittelt wird.
Hierbei werden in beiden der oben stehenden Verfahrensvarianten in Schritt (c) Verbindungen selektiert, die eine signifikante Abnahme der enzymatischen Aktivität zur Folge haben, wobei eine Re- duktion von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% oder eine 100% Reduktion (Blockierung) erzielt wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Verbindungen mit fungizider Wirkung oder Wirkstoffe durch die Bestimmung der enzymatischen Aktivität in Gegenwart und Abwesenheit einer zu untersuchenden Verbindung identifiziert.
Die für den Test benötigte Homoaconitase kann entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der Homoaconitase enthält, isoliert werden, beispielsweise aus einem Pilz, bevorzugt aus einem der eingans erwähnten Pyrenophora oder Fusarium Arten, beson- ders bevorzugt aus P. teres oder F. graminearum. Beispiele für weitere Organismen, aus denen bevorzugt Homoaconitase isoliert werden kann, sind Alternaria kikuchiana, Alternaria inali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beti- cola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpo- philum, Cochliobolus heterostrophus, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum heterostrophus, Colletotrichum lagenarium, Cory- nespora melonis, Diaporthe citri, Diplocarpon rosae, Elsinoe fawcetti, Erisyphe graminis, Leveillula taurica, Fusarium cul o- rum Fusarium nivale, Fusarium graminearum, Gloedes pomigena, Gloesporium kaki, Glomerella cingulata, Gymnosporangium yamadae, Leptothyrium pomi, Magnaporthe grise, Mycosphaerella pomi, My- cosphaerella nawae, Neurospora crassa, Peronospora destructor, Peronospora spinaciae, Phaeoisariopsis vitis, Phyllactinia kaki- cola, Physalospora canker, Phytophthora citrophithora, Phytoph- thora investans, Phytophthora porri, Plasmopora viticola, Podosp- haera leucotricha, Podosphaera tridactyla, Pomophis sp., Pseudo- cercorsporella herpotrichoides, Pseudoperonospora cubensis, Puc- cinia allii, Puccinia recondita, Puccinia horiana, Pyricularia oryzae, Uncinula necator, Sclerotinia cinerea, Sclerotinia mali, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria tritici, Sphaerotheca fuligi- nea, Sphaerotheca humuli, Sphaerotheca pannosa, Spaceloma ampe- lina, Stagnospora nodorum, Typhula ishikariensis, Typhula in- carnata, Ustilago maydis, Venturia inaequalis, Venturia nashi- cola. Weitere bevorzugte Pilzstämme sind Aspergillus, Tricho- derma, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Pyrenophora teres, Saccharomyces (z. Bsp. Saccharomyces cerevisiae) , Pichia (z.Bεp. Pi- chia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze. Des weiteren können auch Archaebakterien verwendet werden.
Die das erfindungsgemäße Polypeptid enthaltende Lösung kann aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen Organismus bestehen. Falls erforderlich kann das erfindungsgemäße Polypeptid partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigt werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen ist beispielsweise in Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN -0-87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über Affinität- schromoatographie erfolgen.
Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität erfolgt durch Inkubation des erfindungsgemäßen Polypeptides mit einem geeigneten Substrat, wobei der Umsatz des Substrates oder der Anstieg des ent- stehenden Produktes verfolgt wird.
Beispiele für geeignete Substrate sind Homoaconitat, Homoisocitrat sowie Derivate dieser Verbindungen.
Bevorzugt sind hierbei Substrate, deren Ab- bzw. Zunahme photometrisch verfolgt werden kann.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird der Umsatz des Substrates photometrisch verfolgt, angelehnt an ein von Strassman et al. beschriebenes Verfahren (Strassman et al., J. Biol. Chem. 241 (1966) 5401-5407):
1. Bei der Verwendung von Homoaconitat als Substrat kann die Reaktion über die Abnahme der Absorption, sprich Abnahme des Homoaconitats bei 240nm photometrisch verfolgt werden. Die Bestimmung der enzymatischen Aktivität erfolgt in Abhängigkeit der Substratabnahme zur Zeit. 2. Bei der Verwendung von Homoisocitrat als Substrat kann die Reaktion über die Zunahme der Absorption bei 240nm, dh. Zunahme des gebildeten Homoaconitats photometrisch verfolgt werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungform wird die Bestimmung der enzymatischen Aktivität in einem pH-Bereich von 7,0 bis 9,0 durchgeführt .
Zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung wird nun die Homoaconitase mit einer zu untersuchenden TestVerbindung inkubiert. Nach einer geeigneten Reaktionszeit wird die enzymati- sche Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptides nach einer der oben genannte Methoden im Vergleich zur Aktivität der nicht ge- hemmten Homoaconitase ermittelt. Bei Inhibition des erfindungsgemäßen Polypeptides beobachtet man eine signifikante Abnahme der enzymatischen Aktivität im Vergleich zur enzymatischen Aktivität des nicht inhibierten erfindungsgemäßen Polypeptides.
Der Nachweis gemäß Schritt ii des oben stehenden Verfahrens kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, detektieren, erfolgen. Hierbei kann entweder die Testverbindung oder das Enzym eine detektierbare Markierung enthalten, wie z.B. eine fluoreszierende, radioisotope, che- milumineszierende oder enzymatische Markierung. Beispiele für en- zymatische Markierungen sind Horseraddish Peroxidase, alkalische Phosphatase oder Luzifierase. Die anschließende Detektion richtet sich nach der Markierung und ist dem Fachmann bekannt.
Hierbei sind insbesondere fünf bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls auch für Hochdurchsatzmethoden geeignet sind:
1) Über Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1994) 11753-11575) läßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an das erfindungsgemäße Polypeptid läßt sich FCS zur Bestimmung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen einsetzten. Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Testverbindungen sind möglicherweise als Inhibitoren geeignet. 2) Surface Enhanced-Laser Desorption/Ionisation (SELDI) in Kombination mit einem Time of Flight Massenspektrometer (MALDI- TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-Ligand Wechselwirkun- gen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70:750-756) . In einer bevorzugten Ausführungsform verknüpft man nun das erfindungsgemäße Polypeptid auf einem geeigneten Träger und inkubiert diesen mit der zu untersuchenden Testverbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschrit- ten kann man die an das Protein zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektieren und somit mögliche Inhibitoren selektieren. Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Testverbindungen sind möglicherweise als Inhibitoren geeignet.
3) Biacore basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al . Sensor Ac- tuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187) . Hierbei wird die Test erbindung in eine Reaktionszelle mit einem Volumen von 2-5μl injeziert, an deren Wänden das Protein immobilisiert wurde. Die Bindung der entsprechenden TestVerbindung an das Protein und somit die Identifizierung möglicher Inhibitoren kann durch Aufnahme des von der Oberfläche reflektierten Laser Licht über Surface Plasmon Re- sonance (SPR) vorgenommen werden. Die so identifizierten an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Testverbindungen sind möglicherweise als Inhibitoren geeignet.
4) Fluoreszenz-Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormole- küls. Durch Fluoreszenzmarkierung von erf .-Protein und den
Testverbindungen kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179) . Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homoge- nous Time Resolved Fluorescence" (HTRF) , wie sie von Packard BioScience vertrieben wird. Die so identifizierten Verbindu- gnen können als Inhibitoren geeignet sein. 5) Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des BrechnungsIndexes an einer Oberfläche beim Binden einer Testverbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisierten Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al . Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187) . Die Messung kann bei- pielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflächen-Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein erfindungsgemäßes Verfahren kann direkt zur Messung der Bindung der Testverbindung an das erf . - Protein aufgebaut werden. Die so identifizierten Verbindugnen können als Inhibitoren geeignet sein.
Alternativ können die 5 vorsthend genannten Verfahren so konzipiert sein, dass eine entsprechend markierte chemische Referenz- Verbindung durch zu testende weitere Testverbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay") .
Eine weitere Möglichkeit zur Identifizierung von Inhibitoren des erfindungsgemäßen Polypeptides besteht in sogenannten in vivo Verfahren, das auf den folgenden Schritten basieren:
a) der Herstellung von transgenen Organismen, die nach Transformation mit einer erfindungsgemäßen Nukleinsauresequenz in der Lage sind, @@@@Homoaconitase zu exprimieren;
b) das Aufbringen einer Testverbindung auf den Organismus aus Schritt a) und einen analogen, nicht transformierten Organismus;
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und eines nicht-transformierten Organismus nach dem Aufbringen der Testverbindung aus Schritt b) ; und
d) Selektion von Testverbindungen, die ein vermindertes Wachs- turn, Überlebensfähigkeit und/oder Infektiösität des nicht- transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum des transgenen Organismus bewirken.
Unter einem analogen, nicht transformierten Organismus- ist der Organismus zu verstehen, der als Ausgangsorganismus in Schritt a) verwendet wurde. Die Transformation kann mit einer erfindungsge- mäßen Expressionskassette, einem erfindungsgemäßen Vektor oder der erfindungsgemäßen Nukleinsäure selbst erfolgen.
Als Organismen, die mit der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequnez bzw. Expressionskassette bzw. Vektor transformiert werden, eignen sich bevorzugt Pilze, besonders bevorzugt die eingangs erwähnten phytopathogene Pilze, ganz besonders bevorzugt der Pilze der eingangs erwähnten Pyrenophora oder Fusarium Arten, besonders bevorzugt aus P. teres oder F. graminearum., in welche die für ein er- findungsgemäße Polypeptid codierende Sequenz über Transformation inkorporiert wird.
Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen Polypeptides mittels Röntgen- Strukturanalyse weitere potentielle fungizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Rön genstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen besagter Messungen sowie die Methodik des "Molecular Modelling" sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Wirkstoffe möglich.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Ver- bindungen mit fungizider Wirkung (auch Wirkstoffe genannt) können anschließend in einem in vivo Aktivitätstest auf ihre fungizide Wirkung überprüft werden. Hierbei wird die entsprechende Substanz mit einer Kultur eines pathogenen Pilzes, bevorzugt einer Kultur eines phytopathogenen Pilzes, besonders bevorzugt einer Kultur von P. teres inkubiert, wobei die fungizide Wirkung z.B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen mit fungizider Wirkung (Wirkstoffe) sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die über die oben genannten Verfahren identifizierten Wirkstoffe können auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen.
Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die fungizide Wirkung der Wirkstoffe nicht negativ beeinträchtigen. So kommen als Kationen insbesondere die Ionen der Alkalimetalle, vorzugsweise Natrium und Kalium, der Erdalkalimetalle, vorzugsweise Calcium, Magnesium und Barium, und der Übergangsmetalle, vorzugsweise Mangan, Kupfer, Zink und Eisen, sowie das Ammoniumion, das gewünschtenfalls ein bis vier Cι-C4-Alkylsubstituenten und/oder einen Phenyl- oder Benzylsubstituenten tragen kann, vorzugsweise Diisopropylammonium, Tetramethylammonium, Tetrabutyl- ammonium, Trimethylbenzylammonium, des weiteren Phosphoniumionen, Sulfoniumionen, . vorzugsweise Tri (Cχ-C4-alkyl) sulfonium und Sulfo- xoniumionen, vorzugsweise Tri (Cι-C4-alkyl) sulfoxonium, in Betracht. Anionen. von brauchbaren Säureadditionssalzen sind in erster Linie Chlorid, Bromid, Fluorid, Hydrogensulfat, Sulfat, Dihydrogenphosphat, Hydrogenphosphat, Phosphat, Nitrat, Hydrogen- carbonat, Carbonat, Hexafluorosilikat, Hexafluorophosphat, Benzoat, sowie die Anionen von Cι-C4-Alkansäuren, vorzugsweise Formiat, Acetat, Propionat und Butyrat. Sie können durch Reaktion von I mit einer Säure des entsprechenden Anions, vorzugsweise der Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure- oder Salpetersäure, gebildet werden.
Sämtliche, über die oben genannten verfahren identifizierten Wirstoffe liegen sofern sie asymmetrisch substituierte α-Kohlenstof- fato e enthalten, entweder als Racemate, Enantiomerengemische, oder als reine Enantiomere vor und können, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereomerengemische vorliegen. Sie sind geeignet zur Bekämpfung der Eingangs erwähnten phytopathogenen Pilze.
Weiterer Gegenstand der Erfindung sind daher Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammensetzung mit fungizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet dass man
a) einen Wirkstoff über eines der oben genannten erfindungsgemäßen Verfahren identifiziert und
b) den über (a) identifizierten Wirkstoff oder ein landwirtschaftlich brauchbares Salz des über (a) identifizierten Wirkstoffes mit entsprechenden Hilfsmitteln formuliert.
Die über das vorstehend genannte Verfahren herstellbaren agrochemischen Zusammensetzungen mit fungizider Wirkung sind ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Die Wirkstoffe aus Schritt a) können z.B. in Form von direkt versprühbaren wäßrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formuliert werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur des verwendeten Wirstoffes; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wäßrigen oder ölhaltigen Dispersionen können die sog. Wirkstoffe als solche oder in einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffen zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus Wirkstoff sowie und even- tuell Lösungsmittel oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind Emulsionskonzentrate (EC, EW) , Suspensionen (SC) , lösliche Konzentrate (SL) , Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granula- ten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (solüble) oder dispergierbar (wettable) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver- bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffrei- setzung verhindernden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff Hilfsmittel folgende Substanzklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel, Bakterizide sowie thixo- trope Agentien verstehen. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder vermählen in speziellen Mühlentypen (z.Bsp. Hammermühlen). SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase enthaltend weitere Hilfsmittel oder Wirkstoffe hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Granulate, z.B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Dünge- ittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl oder Cellulosepulver . Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z.Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al . , Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H. , Grubemann, A. , Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Fed- eral Republic of Germany) , 2001.
Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die er- findungsgemäßen agrochemischen Zusammensetzungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kero- sin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromati- sehe Kohlenwasserstoffe, z.B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, al- kylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol,- Propanol, Buta- nol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z.B. A ine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.
Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z.Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen ' Sulfonsäuren, z.B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaph- thalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsul- fonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fet- talkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether-, ethoxyliertes Isooc- tyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyg- lykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fet- talkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Poly- oxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalko- holpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose .
Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermählen der Wirkstoffe mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.
Die Applikation der fungiziden Zusammensetzungen bzw. der Wirkstoffe kann curativ, eradikativ oder protektiv erfolgen. Die Aufwandmengen an Wirkstoff betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und WachstumsStadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha aktive Substanz.
Weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Pflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge eines Wirkstoffes oder einer agrochemischen Zusammensetzung mit fungi- zider Wirkung behandelt. Unter Schadpilzen sind die eingangs erwähnten phytopathogenen Pilze zu verstehen.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Herstellung eines transgenen Organismus, wobei der transgene Organismus durch eine erhöhte Lysinproduktion gekennzeichet ist im Vergleich zu einem nicht transgenen Organismus .
Als transgene Organismen eignen sich bevorzugt Archaebakterien und Pilze.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der transgene Organismus ein Pilz, bevorzugt die eingans erwähnten Pyrenophora oder Fusarium Arten, besonders bevorzugt P. teres oder F. graminearum. Beispiele für weitere Organismen sind Alternaria kiku- chiana, Alternaria mali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beticola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpophilum, Cochliobσlus heterostrophus, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum heterostrophus, Colletotrichum lagenarium, Corynespora melonis, Diaporthe citri, Diplocarpon rosae, Elsinoe fawcetti, Erisyphe graminis, Leveil- lula taurica, Fusarium culmorum # Fusarium nivale, Fusarium graminearum, Gloedes pomigena, Gloesporium kaki, Glomerella cingulata, Gymnosporangium yamadae, Leptothyrium pomi, Magnaporthe grise, Mycosphaerella pomi, Mycosphaerella nawae, Neurospora crassa, Pe- ronospora destructor, Peronospora spinaciae, Phaeoisariopsis vi- tis, Phyllactinia kakicola, Physalospora canker, Phytophthora citrophithora, Phytophthora ihvestans, Phytophthora porri, Plasmopora viticola, Podosphaera leucotricha, Podosphaera tridactyla, Pomophis sp., Pseudocercorsporella herpotrichoides, Pseudopero- nospora cubensis, Puccinia allii, Puccinia recondita, Puccinia horiana, Pyricularia oryzae, Uncinula necator, Sclerotinia cinerea, Sclerotinia mali, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria tri- tici, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerotheca humuli, Sphaerotheca pannosa, Spaceloma ampelina, Stagnospora nodorum, Typhula ishi- kariensis, Typhula incarnata, Ustilago maydis, Venturia inaequa- lis, Venturia nashicola. Weitere bevorzugte Pilzstämme sind Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Pyreno- phora teres, Saccharomyces (z. Bsp. Saccharomyces cerevisiae) , Pichia (z.Bsp. Pichia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze. Des weiteren können auch Ar- 5 chaebakterien verwendet werden.
Unter einer gegenüber dem Ausgangsorganismus erhöhten Lysinpro- duktion ist eine Erhöhung des Lysingehaltes um mindestens 10 % , bevorzugt um mindestens 20 %, besonders bevorzugt um mindestens 10 40 %, ganze besonders bevorzugt um mindestens 80 % zu verstehen.
Der transgene Pilz kann auf folgenden Wegen hergestellt werden:
1. Der entsprechende Pilz wird mit einer der oben beschriebenen 15 Ausführungsformen einer erfindungsgemäßen Expressionskassette oder Vektors enthaltend die SEQ ID N0:1 oder ein funktionelles Äquivalent besagter Sequenz transformiert, wobei hier naturgemäß die der oben genannten Kontrollsequenzen zur Konstruktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette/Vektoren 20 zu verwenden sind, welche die heterologe Expression der Zielsequenz in einem Pilz ermöglichen. Die zusätzliche Expression eines erfindungsgemäßen Polypeptides kann entweder über gezielte Induktion oder kontinuierich erfolgen. Hierdurch wird eine erhöhte Produktion des Stoffwechselendproduktes Lysin im 25 Vergleich zu einem nicht transgenen Pilz erreicht.
2. In einer zweiten Ausführungsform wird durch gezielte Modifikation des natürlichen für ein erfindungsgemäßes Polypeptid codierendes Gens eine erhöhten biologischen Aktivität des in
30 dem Pilz natürlich vorkommenden erfindungsgemäße Polypeptides erreicht. Hierdurch wird eine erhöhte Produktion des Stoffwechselendproduktes Lysin im Vergleich zu einem nicht transgenen Pilz erreicht. Diese Modifikation kann zum einen durch gezielte Mutation des für ein erfindungsgemäßes Polypeptid 5 codierendes Gens erzielt werden oder durch die Transformation eines Pilzes mit einer Nukleinsauresequenz, welche für ein Genprodukte kodiert, die eine erhöhte biologische Aktivität aufweisen. Hierbei wurde die biologische Aktivität so verändert, daß eine gegenüber dem Ausgangsorganismus um mindestens 0 10 % , bevorzugt um mindestens 30 %, besonders bevorzugt um mindestens 50 %, ganze besonders bevorzugt um mindestens 100 % erhöhte Aktivität erzielt wurde.
3. Durch gezielte Modifikation des Promotors des natürlichen Ho- 5 moaconitsese uenz wird eine erhöhte Transkription und Translation der Gensequenz erzielt. Dadurch wird eine erhöhte Pro- duktion des Stoffwechselendproduktes Lysin im Vergleich zu einem nicht transgenen Pilz erreicht.
Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Im Folgenden werden kurz die gentechnische Verfahren, die den folgenden Ausführungsbeispielen zugrunde liegen, beschrieben:
A: Allgemeine Verfahren
Klonierungsverfahren wie z.B. Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membra- nen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA sowie Southern und Western Blots wurden wie in Sambrook et al . , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt .
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DH5α, DHB10) wurden von BRL Gibco, oder Invitrogen,. Carlsberg, CA bezogen. Zur Klonierung wurden der Vektor pAN7-l (Punt et al., Gene 56 (1987) 117-124), der Vektor pCR® 2.1-T0P0-TA der Firma Invitrogen, der Vektor pUC18 der Firma Pharmacia sowie der Vektor pGEM von der Firma Promega verwendet, verwendet. Die Isolation des P. teres Wildtypstamm 15A ist in J. Wiland et al. (Phytopathology 89 (1999), 176-181) beschrieben. Als F. Graminearum Wildtypstamm 8/1 kann z.B. der DSM.-4527 verwendet werden.
B: Sequenzanalyse rekombinanter DNA
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al . , Proc. Natl . Acad. Sei. USA, 74, 5463-5467(1977)). Fragmente resultierend aus einer Polymerase Kettenreaktion wurden zur Vermeidung von Polymerasefehlern in zu exprimierenden Konstrukten sequenziert und überprüft.
C: Verwendete Materialien
Alle, im Folgenden verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht anders erwähnt, in p.A. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt) , Roth (Karlsruhe) , Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H20 bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg) , Amersham (Braunschweig) , Biometra (Göttingen) , Röche (Mannheim) , Genomed (Bad Oeynnhausen) , New. England Biolabs (Schwalbach/Taunus) , Novagen (Madison, Wisconsin, USA) , Perkin- Elmer (Weiterstadt) , Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.
Alle für die gentechnischen Experimente verwendeten Medien und Puffer wurden entweder über Sterilfiltration oder Erhitzen im Autoklaven sterilisiert.
Beispiel 1
Identifizierung der genomischen Nukleinsauresequenz der Homoaconitase aus P. teres und F. graminearum
A) Identifizierung der genomischen Nukleinsauresequenz der Homoaconitase aus P. teres und F. graminearum
Mit Hilfe der Sequenzinformation von den Genen der Homoaconitase von Saccharomyces cerevisiae und Aspergillus nidulans wurden zur Detektion der Homoaconitase in P. teres und F. graminearum die Primer DEG Homacl und DEGHomacII konstruiert, wobei konservierte Aminosäureblöcke aus den in der Genbank abgelegten Proteinsequenzen der Homoaconitasen aus Saccaromyces cerevisiae (Accession No. U46154) und Aspergillus nidulans (Accession No. X99624) für die Konstruktion verwendet wurden:
DEGHo acl : 5 ' -CGGCCACCAGATCatgathgarga-3 '
DEGHomacII: 5 ' -GATGGAGTTCCGGGAGAAGatrttnccraa-3 '
Im Anschluss wurde mit diesen eine PCR nach dem in Tabelle 1 dargestellten Programm mit 1,5 mM MgCl2 (BRL Gibco) , 0 , 2mM dNTP Mix (MBI Fermentas) , je 150 p ol der beiden Primer, 0,8 U Taq Polyme- rase sowie 100 ng genomische DNA aus dem Wildtypstamm P. teres 15 A und F. graminearum 8/1 durchgeführt. Hierbei wurde die verwendete Templat-DNA aus dem Wildtypstamm P. teres 15 A und F. graminearum 8/1 gemäß der Vorschrift des DNA Isolation Kits (Firma Gentra Systems, Minneapolis, USA) hergestellt.
Tabelle 1
Hierbei wurde im Falle von P. teres ein Fragment von 1630 Basen und bei F. graminearum ein Fragment von 1757 bp amplifiziert, mittels gängiger Klonierungstechniken in den pCR 2.1-TOPO-TA Vektor kloniert und im Anschluß in E. coli DH10B transformiert.
Die Sequenzierung des hergestellten Konstruktes zeigte, daß das Fragment eine 65%ige Identität mit der Homoaconitase aus S. cerevisiae sowie eine 70% Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus Aspergillus nidulans aufwies .
Die Sequenzierung des hergestellten Konstruktes zeigte, daß das Fragment eine 61,73%ige Identität mit der Homoaconitase aus S. cerevisiae sowie eine 68,73%ige Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus Aspergillus nidulans und eine 67,46%ige Identität mit der DNA-Sequenz der Homoaconitase aus Aspergillus fumiga- tus aufwies .
B) Herstellung und Screening einer genomischen Lambda Bibliothek aus P. teres 15A sowie Isolation eines für die Homoaconitase codierenden Klons
Die Phagenbank wurde mit dem "Lambda FIX® II Xhόl Partial Fill-In
Vektor Kit" und dem "Gigapack® III Gold Packaging Extract" (von Stratagene) nach den Angaben des Herstellers hergestellt.
Der Transfer der Phagen erfolgte nach Sambrook el al . (Molecular Cloning. 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press) auf Hy- bond N+ Nylonmembran der Firma Amersham. Die DNA wurde mittels UV-Strahlung (1200μJ/cm2) auf dem Filter fixiert. Zur Detektion positiver Klone wurde das DIG-System entsprechend den Angaben des Herstellers (Firma Röche) verwendet. Der Standardhybridisierungs- puffer enthielt kein Formamid. Die Sonde wurde aus den beiden folgenden, in einer PCR mit Digoxygenin markierten Primern hergestellt: HOM/Hyg forw. : 5 ' -ctggccaaagctagggtcgta-3 '
HOM/Hyg rev. 2 : 5 '-acagtcattccaacatgtacggtg-3 '
Diese amplifizieren ein 1418 bp großes Fragment aus dem ursprünglich mit degenerierten Primern amplifiziertem Fragment der Homoaconitase.
Die Signale wurden mittels eines Autoradiographiefilms (Hyperfil- m™ECL™) viεualisiert.
Die Isolierung von DNA aus dem positiven Klon erfolgte nach Lösch (Dissertation Universität Hamburg: 2000) . Hierfür wurde ein Groß- lyεat hergestellt. Die daraus isolierte DNA wurde mit verschiede- nen Restriktionsenzymen geschnitten und im Southern Blot analysiert. Aus den Banden, die ein Signal mit der bereits im Phagen- Screening verwendeten Homoaconitase-Sonde zeigten, wurde eine mit Sall geεchnittene DNA-Bande von ca. 6 kb ausgewählt und in die Sall Schnittstelle des pUC18 Vektors kloniert. Die anschließende Sequenzierung zeigte, daß auf diesem Fragment die gesamte Gensequenz der Homoaconitase aus P. teres liegt.
Beispiel 2
Herstellung der Knock-Out-Transformanten
A) Herstellung der Knock-out-Konstrukte (KO-Konstrukte)
P. teres
Zur Herstellung des Knock-out-Konstruktes wurden die beiden folgenden Primer konstruiert:
HOM-Anfang: 5' TCAATGAGACGCCCAAAGTACC 3l
HOM-Ende: 5X ACGATGGAGGACTGCCAATCT 3*
Mittels dieser Primer wurde ein 2314 bp Fragment der 2352 umfassenden Sequenz SEQ ID N0:1 aus dem Lambdabank Fragment (s. Bei- spiel) amplifiziert. Dieses Fragment wurde anschließend in den pGEM-T Vektor kloniert. Das hergestellte Konstrukt erhielt den Namen pGEM-T/HOM. Durch einem Reεtriktionεenzymverdau des hergestellten Konstrukteε mit den Reεtriktionsenzymen BsrGI und Nhel wurde ein 1084 bp Fragment des Homoaconitase-Gens herausgeschnit- ten, welches auch das putative aktive Zentrum enthält. Im so mo- difizierten Vektorkonεtrukt verbleiben endständig daher 227 bp bzw. 1003 bp des Homoaconitase-Gens .
Im Anschluß wurde in den linearisierten Vektor eine Hygromycin- kaεεette endständig enthaltend die Restriktionsenzymschnittstellen BsrGI und Nhel an die Stelle des entfernten Homoaconitasef- ragment kloniert. Die Hygromycinkassette wurde auε der Glucoamy- laεe-Promotor-Region (Gen Bank Accession No: Z 30918), dem Hygro- mycin-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) sowie der trpC-Termi- nator-Sequenz (Gen Bank Accesεion No: E 05643) mittels gängiger Klonierungstechniken konstruiert. Das hierbei entstandende Kon- εtrukt befand sich ebenfalls im Vektor pGEM-T und wurde mit pGEM- T/hph bezeichnet. Im Anschluß wurde dieses Konstrukt mit Primern enthaltend die anhängenden Restriktionsschnittstellen BsrGI und Nhel amplifiziert und in den mit BsrGI und Nhel geschnittenen
Vektor pGEM-T/HOM kloniert..Das so hergestellte Konstrukt erhielt den Namen pHOM/hph.
Anschließend wurde die KO-Kassette über PCR mit der Expand Poly- merase® der Fa. Röche amplifiziert. Auf diesem Wege wurden 15 μg der KO-Kassette amplifiziert und für die anschließende Transformation über Gelelution gereinigt.
F . graminearum
Zur Herstellung des Knock-out-Konstruktes wurden die beiden folgenden Primer konstruiert:
HOM-Anfang: 5λ GGCGCCGCTACTGGTCAAACC 3λ
HOM-Ende: 5 " GGCGCCTTGTTGACGGGGA 3Λ
Das 500 bp lange Fragment (SQ ID NO: 3) wurde über ein l%iges TAE- Agarosegel aufgetrennt, ausgeschnitten, mit dem BioRad-Geleluti- onskit isoliert und in pGEM-T kloniert (E. coli DH5a) . Nach einer Plasmidpräparation wurde mit PvuII ein 950 bp langes Fragment in die Ehel-site von pAN7-lM (PUNT et äl . , 1987, M = Punktmutation in der Ncol-site des pAN7-l, stattdessen BsrDI-site) kloniert. Dadurch entstand der KO Vektor pAN7-Hom-l.
B) Herstellung von Protoplasten
Für die Protoplastierung des P. teres Wildtypstammes 15 A und des F. graminearum WildtypStammes 8/1 wurde Mycel in Flüssigkultur über 2 Tage bei 28°C und 180rpm in CMkompl (nach Leach et al . (J. Gen. Microbiol. 128 (1982) 1719-1729.) inkubiert, zerkleinert und im Anschluß noch einen Tag bei 28°C, 180rpm inkubiert. Dieses wurde dann zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Zehn Gramm Mycel wurden mit 40 ml 5% Enzym-Osmotikum-Lösung (700 mM NaCl, -5% Driselase, steril) versetzt und 3h bei 28°C und lOOrp inkubiert. Die fortschreitende Protoplastierung wurde über Proben mikrosko- pisch verfolgt. Mittels Filtration wurden die Protoplasten von Mycelrückständen getrennt, pelletiert (3000rpm, 10 min, 4°C) , und nach Waschen mit je 10 ml 700 mM NaCl und SORB-TC (1,2 M Sorbit, 50mM CaCl2 lOmM Tris/HCl, pH 7,0) in 1ml SORB-TC aufgenommen. Die Konzentration an Protoplasten wurde durch Auszählen unter dem Mi- kroskop ermittelt.
C) Transformation
Für die Transformation von P. teres wurden 107 Protoplasten eingesetzt. Nach einem Hitzeschock (5min, 48°C) wurden die
Protoplasten sofort auf Eis gestellt, mit 15μg der mittels PCR aus pHOM/hph amplifizierten KO HOM Kassette vorsichtig vermischt und anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von einem Volumen PEG-TC (60% (w/V) PEG4000, 50mM CaCl2, lOmM Tris/HCl pH 7,0) und anschließender 15minütiger Inkubation auf Eis wurden wurden 8 Volumen -bezogen auf das ursprüngliche Kulturvolumen- SORB-TC Medium hinzugefügt.
Für die nachfolgende Transformation von F. graminearum Protoplasten wurden das KO-Plasmid pAN7-Hom-l nach Standardprozeduren iεoliert, wie εie beiεpielεweiεe in T. Maniatis, E.F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T.J. Silhavy, M.L. Berman und L.W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in'Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Aεεoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind, im' Anschluß mit MamI (Isochizomer BsaBI) mittig linearisiert und auf eine Konzentration von 30g/ 01 eingestellt.
Für die Transformation wurden 107 Protoplasten auf Eis gestellt, mit 30μg des wie oben beschrieben hergestellten KO-Vekto'rs vorsichtig vermischt und anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von einem Volumen PEG-TC (60% (w/V) PEG4000, 50mM CaCl2, lOmM Tris/HCl pH 7,0) und anschließender 15minütiger Inkubation auf Eis wurden 8 Volumen -bezogen auf daε ursprüngliche Kulturvolumen- SORB-TC Medium hinzugefügt.
D) Selektion der hergestellten Knock Out Transformanten Der Transormationεansatz wurde mit 400ml 45°C warmen CMReg.-Medium (lg/1 Hefeextrakt, lg/1 Caseinhydrolysat, 342g/l Saccharose, 16g/l Agar) vermischt und in 20ml Aliquots auf 20 Petrischalen mit einem Durchmesser von 90mm ausgebracht. 5
Bei den P. teres Transformationsansätze wurde nach 2-3 Tagen Inkubation bei 24°C die Petrischalen mit je 10ml Hygromycin enthaltendem Wasseragar (12g/l Agar, 225μg/ml Hygromycin) überεchicht'et und im Anschlusε bei 24°C inkubiert. Mycelkolonien •1-0 die durch den Selektionsagar wuchsen, wurden ausgeschnitten, und auf CMHyg. -Platten (bestehend aus CM-Medium supplementiert mit 75μg/ml Hygromycin B) vereinzelt.
Nach 1 Tag Inkubation bei 28°C wurden die Petrischalen mit je 10ml Hygromycin enthaltenden Wasseragar (16g/l Agar, 300mg/l Hygromycin) überschichtet und anschließend bei 28°C inkubiert. Mycelkolonien, die durch den Selektionsagar wuchsen, wurden auεgeschnitten und auf CMHyg-Platten (CMkompl-Medium mit 150mg/1 Hygromycin) vereinzelt.
20
E) Nachweis der Knock out Transformation
Die Transformanten von P. teres wurde auf POA-Medium (hergestellt nach Speakman, J.B. &Pommer, E.-H. Bulletin of the British Mycological Society 20 (1986) 129-130) ) und die von F.
25 graminearum auf SNA-Medium (nach Nirenberg 1981 Can. J. Bot. 59:1599-1609) unter UV-Licht zur Konidiation angeregt. Jeweils eine einzelne Konidie wurde auf eine CMHyg-Platte überführt, wodurch homokaryotische Kulturen erhalten wurden. Im Anschluß wurden von dieser Platte Agarblöckchen mit Mycel ausgeschnitten 30 und in CMjompi-Medium überführt und bei 28°C, 180rpm für 48h inkubiert .
DNA aus dem Mycel dieser Kulturen wurde mittels Southern' Blot auf die Vektorintegration hin überprüft. Hierfür wurde die genomische 35 DNA der P. teres Transformanten und des Wildtyps mit dem Enzym BstXI und die der F. gramninearum Tranεformanten mit Nrul geεchnitten und im Agaroεegel aufgetrennt. Alε Sonde wurden Homoaconitasegen spezifische mit Digoxygenin markierte Fragmente von 2314 bp verwendet.
40
Bei fünf Transformanten von P. teres und bei 9 Transformanten von
F. graminearum wurde anstelle der Bande des Homoaconitase-Genε eine Bande mit erhöhter Masse beobachtet. Die Massendifferenz zwischen der Bande des Homoaconitase-Gen und der Masεe der oben £c erwähnten Bande entεpricht der Maεse des KO-Konstruktes, was auf eine Integration der KO-HOM Kassette in das für die Homoaconitase codierende Gen hinweist.
Beispiel 3
A) Untersuchung und Charakterisierung der Knock-Out Transforman- ten
Mit einem Skalpell wurden kleine, mit Mycel der Knock-Out
Transformanten bewachsene Agarblöcke aus ei.ner CMκ0pi.-Medi.um
Agar-Platte ausgeschnitten und auf Czapek Medium-Platten nach Raper et al. (A Manual of the Penicillia. Waverly Press Inc., The Williams & Wilkins Company, Baltimore (1949) 64-65) inkubiert. Czapek Medium ist ein Aminosäuremangelmedium, dh. Transformanten die auf diesem Medium nicht wachsen sind für mindestens eine Aminosäure auxotroph. Als Kontrolle wurde Mycel vom P. teres Wildtypstamm 15A bzw. F. graminearum Wildtypstamm 8/1 in analoger Weise inkubiert.
Die Knockout Transformanten vom P. teres wuchsen im Vergleich zum. Wildtyp 15 A nicht auf dem Czapek Medium. Die F. graminearum Mutanten wuchsen im Vergleich zum Wildtyp 8/1 mit 2 Tagen Verzögerung.
zur Kontrolle wurde das oben beschriebene Experiment mit Czapek Medium -Platten, die mit Lysin supplementiert wurden, durchgeführt. Hierbei konnten keine Unterschiede zwischen Knock out Transformanten und Wildtyp festgestellt werden: Durch das gezielte Ausschalten des Homoaconitase-Gens waren die Transfor an- ten somit nicht mehr in der Lage, Lysin herzustellen.
B) Überprüfung von P. teres Transformanten mit RT-PCR
Für die RNA Isolierung wurde Mycel wie für die DNA Isolierung an- gezogen (s. Beispiel 1B) . Das Medium wurde abzentrifugiert und das Mycel zweimal mit eiskaltem Wasser gewaschen. Die RNA Isolierung wurde mit dem peqGOLD RNAPure™ der Firma Promega nach Herstellerangaben durchgeführt. Die Menge wurde photometrisch quantifiziert und die RNA durch Geleelektrophorese auf ihre Qualität hin überprüft.
Vor der RT-PCR wurde nach Herstellerangaben ein DNase Verdau mit Desoxyribonuclease I, Amplification Grade der Firma Gibco durchgeführt. Es folgt die Einzelstrangsynthese der cDNA mit SUPER- SCRIPT™ II der Firma Gibco. Es wurde nach Herstellerangaben verfahren. Für die sich anschließende PCR Reaktion wurden die Primer HOM Anfang und HOM Ende verwendet, die jeweils am Anfang und am Ende der kodierenden Gensequenz der Homoaconitase greifen.
HOM Anfang: TCAATGAGACGCCCAAAGTACC
HOM Ende: ACGATGGAGGACTGCCAATCT
Die PCR wurde mit l/20stel des cDNA Ansatzeε nach Herεtelleranga- ben der Firma Gibco für die Einzelεtrangεynthese mit- SUPERSCRIPT™ II durchgeführt. Nur die cDNA aus dem Wildtyp P. teres 15A ergab ein Produkt in der erwarteten Größe. Bei den fünf Lysin-au- xotrophen Transformanten wird keine mRNA mehr für die Homoaconitase Synthese hergestellt.
Als Kontrollen wurden je ein Mikroliter aus dem Reaktionsansatz , der für die Einzelstrangεyntheεe eingesetzt wurde, vor SUPERSCRIPT™ II Zugabe entnommen. Mit. diesem Mikroliter und mit l/20stel der Einzelstrang cDNA wurden die Kontroll PCRs mit Pri- mern (ActF: tgggacgatatggaiaaiatctggca,ActR: tcitcgtattcttgctti- gaiatcacat (Voigt, K. et al. (2001) Gene 270: 113-120), die ein Fragment aus dem konstitutiv exprimierten Aktingen von P. teres amplifizieren, durchgeführt. Die Kontroll PCR mit dem Mikroliter, der vor Superscript Zugabe entnommen wurde, ergab kein Produkt. Dieses zeigt, daß die RNA frei von DNA war. Bei der Kontroll PCR mit der cDNA entstand ein Produkt welches, im Vergleich zu dem aus genomischer DNA, um das herausgeεpleißte Intron kleiner iεt. Auch dieses bestätig, daß die RNA frei von DNA und außerdem intakt war.
C) Virulenz und Fähigkeit zur Adhäsion der selektierten P. teres Transformanten
Die Virulenz der Transformanten gegenüber dem Wirt wird über vi- suelle Bonitur bestimmt. Hierbei kann der Test sowohl auf der ganzen Pflanze als auch mit abgeεchnittenen BlattSegmenten (Deta- ched Leaf) durchgeführt werden.
Für diesen Test werden die unvollständig resistente Gerstensorte Harbin (Steffenson, B.J., 1992), die suszeptible Gerεtensorte Ha- zera (Steffenson, B.J., 1992 ) verwendet, wobei keine Keimblätter eingesetzt werden. Zusätzlich werden Blätter vom Sommerweizen Nandu in den Test mit einbezogen, welcher als Nicht-Wirt zur Kontrolle der Testbedingung dient. In einen Rundfilter (0 90 mm, Schleicher & Schüll, Ref. No. 10311609) werden ca. 7 cm langen Blattabschnitte der oben beschriebenen Pflanzen in einem Abstand von ca. 6cm so fixiert, daß die Blattoberseite nach oben weiεt. Es werden jeweils fünf Blattsegmente einer Gerstensorte und ein Blattabschnitt vom Weizen verwendet. Das Filterpapier mit den Blattsegmenten wird in eine mit 10 ml sterilem Leitungswasser gefüllte Petrischale gelegt. Jeder Blattabschnitt wird mit einer eingestellten Konidiensuspension (50 Konidien/20μl) mit 0,01% Tween20 tropfenartig inokuliert und anschließend bis zu 7 Tagen in einer Phytokammer kultiviert. Die Intensität und die Größe der Nekrosen wird mit der Wildtyp-Infektion verglichen.
Parallel zum Pathogenitätεteεt wird die Fähigkeit von P. teres sich an eine Gersteblattoberfläche innerhalb eines bestimmten Zeitraumes anzuheften, indirekt über das Schadbild bestimmt.
Dieser sogenannte Adhäsionstest wird analog wie der oben be- schriebene Pathogenitätεteεt durchgeführt. Es werden allerdings nur suszeptible Gerstesorten verwendet (Kombar (Steffenson, B.J., 1992) , Hazera) .
Nach tropfenförmiger Benetzung der in dem Filterpapier befindli- chen Blattabschnitte mit Konidiensuspension wird die Konidiensuspension auf zwei Blättern sofort entfernt. Die benetzte Stelle wird im Anschluεε mit 2 x 50μl 0,01%+ Tween gewaschen, um alle nicht adhärierten Konidien zu entfernen. Die drei anderen Tropfen werden drei Stunden auf den Blättern belassen und dann ebenfalls entfernt und die Tropfstelle gewaschen. Im Anschluss erfolgt eine 7tägige Inkubation in der Phytokammer. Als Vergleich dient auch hier der Wildtyp.
Hierbei zeigte sich, dass die Lysin auxotrophen Transformanten avirulent sind und nicht fähig sind über den Infektionsort hinaus zu infizieren.
D) Virulenz der selektierten F. graminearum Transformanten
Um die Virulenz der Transformanten zu testen wurde Sommerweizen der Sorten Nandu und Munk infiziert. Beide Sorten werden in die Boniturklasse 6 des Bundessortenamtes eingeordnet und sind damit besonders anfällig für die Infektion von F. graminearum.
In jedem Infektionsexperiment wurde als Positivekontrolle eine Infektion mit dem F. geaminearum Wildtypstamm 8/1, aus dem die Transformanten hervorgingen, durchgeführt und als Negativkontrolle eine Inoculation mit reinem Wasser. Zudem wurde in jedem Infektionsexperiment neben den aus dem Southernblot identifizier- ten KO-Mutanten auch jeweils eine Transformante mit einem ekto- pisch integrierten pAN7-Hom-l auf Weizen inokuliert. Für die Infektion wurden Konidien von SNA-Platten (SNA-Medium nach Nirenberg 1981 Can. J. Bot. 59:1599-1609 enthaltend 22g Agar) mit Wasser abgewaschen und auf eine Konzentration von 5xl04 Konidien /ml eingestellt. In der Mitte der Ähre, direkt neben den Fruchtknoten, wurden lOμl dieser Konidiensuspension inokuliert. Anschließend wurden die Pflanzen mit Wasser besprüht und die einzelnen Ähren wurden in Plastikfolie gehüllt und bis zur sichtbaren Infektion in einer Phytokammer ( ag-/Nachtrhythmus : Tag: 18oC, 16h, 25000 Lux; Nacht: 16oC, 8h) gehalten. Nach 13 Tagen wurden die Infektionen ausgewertet.
Bei der Infektion mit F. geaminearum Wildtypstamm 8/1 wurde starkes Mycelwachstum um das infizierte Ährchen, beginnende Bräunung des Ährchens und Ausweitung der Infektion auf Nachbarährchen be- obachtet. Bei den KO-Mutanten war eine deutlich reduzierte Infektion im Vergleich zum Wildtypstamm 8/1 zu beobachten. Bei der ek- topis'chen Transformante wurde' eine Infektion analog der des Wild- typεtammeε beobachtet. Ein Vergleichsversuch mit Wasser zeigte keine Infektion.
Aus den oben beschriebenen Ergebnisεen folgt, daß Ho oaconitaεe für die Pathogenität von F. graminearum essentiell ist, da der Pilz beim Fehlen dieser Gene den Wirt nicht effektiv infizieren kann.
Beispiel 4
A) Proteinisolation bei P. teres
Alle Schritte wurden bei 4°C durchgeführt.
Mycel wurde frisch in CMk0mpι -Medium angezogen (2 Tage Inkubation bei 28°C und 180rpm) , durch Abzentrifugieren von Medium getennt einmal mit destilliertem Wasser gewaschen und sorgfältig mittels Filterpapier getrocknet.
Im Anschluß wurde das Mycel mit flüssigem Stickstoff gemörsert und 100 mg mit 1000 μl Extraktionεpuffer (40% Glycerin, 2mM DTT, 1 Tablette Complete® Mini EDTA-free (Fa.Röche) auf 10 ml, 200mM Kaliumphosphat pH 6.5) gemischt. Nach einer Inkubation von 5 min auf Eis und anschließender Zentrifugation (15300 rpm, 4°C, 30 min) wurde der Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und der Proteingehalt mit dem Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concen- trate nach Herstellerangaben ermittelt. B) Aktivitätsteεt
Für die photometrische Bestimmung der Homoaconitase Aktivität bei Raumtemperatur wurden 12 μg Protein mit 80 nmol Substrat (Sub- stratstammlösung: lOmM Homoiεocitrat3, 30mM Kaliumphosphat pH 8.5) in einem Endvolumen von 120 μl Reaktionspuffer (30mM Kaliumphosphat pH 8.5) gemischt und die Absorption bei 240 nm über 20 min aufgezeichnet.
C) Vergleich der Homoaconiatse Aktivität im Wildtypstamm und zwei auxotrophen Mutanten
Es wurde die Homoaconitase Aktivität im Wildtypstamm und in den Lysin autotrophen Transformanten bestimmt. Hierbei ist wie aus Abbildung 1 ersichtlich, die Homoaconitase-Aktivität der Lysin- auxotrophen Transformanten vernachlässigbar gering.
Beschreibung der Sequenzen:
SEQ ID 1: Nukleinsauresequenz der Homoaconitase aus P. teres
SEQ ID 2 : Aminosäuresäuresequenz der Homoaconitase aus P . teres
Beschreibung der Abbildung:
Abbildung 1 : Messung der Homoaconitase-Aktivität in dem Wildtyp Stamm sowie in zwei Knockout Mutanten (in der Abbildung mit Δlys4 P. eres bezeichnet)

Claims

Patentansprüche
1. Verwendung des Genproduktes einer Nukleinsauresequenz aus ei- nem phytopathogenen Pilz kodierend für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Homoaconitase als Target für Fungizide, wobei die Nukleinsauresequenz
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO:l darge- stellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten ' läßt ; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen
SEQ ID N0:1 mit einer Identität von mindestenε 61% zu der SEQ ID N0:1 umfasst.
2. Nukleinεäure-Sequenzen umfassend:
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID NO: 1; oder
b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) eine Nukleinsäureεequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes aus den durch Rückübersetzung eines funktionellen Äquivalentes der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäureεequenz ableiten läßt; oder
d) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsäureεequenz, die für ein Polypeptid mit den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codieren; oder
e) funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 1 dargestellten Nukleinsauresequenz, die für funktionelle Analoga der in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz codiert; oder
f) Teile der Nukleinsäuresequenzen a) , b) , c) oder d) .
3. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 2 kodierend für ein Polypeptid mit der biologischen Aktivität einer Homoaconitase, umfassend
a) eine Nukleinsäureεequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsauresequenz; oder
b) eine Nukleinsäureεequenz, die εich aufgrund deε degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO:2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt; oder
c) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestenε 71% zu der SEQ ID NO: 1.
4. Nukleinεäuresequenz nach den Ansprüchen 2 bis 3, die aus einem phytophathogenen Pilz stammt.
5. Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 2 bis 4 die auε dem phytophatogenen Pilz Pyrenophora teres stammt.
6. Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 2 bis 4 die aus dem phytophatogenen Pilz Fusarium graminearum stammt.
7. Verfahren zur Detektion funktioneller Analoga der SEQ ID N0:1 durch Herstellung einer Sonde gefolgt von anschließenden Durchsuchen einer genomischen oder cDNA Bank der entsprechenden Spezies oder einer Computer-Recherche nach analogen Se- quenzen in elektronischen Datenbanken.
8. Verfahren zur Identifizierung von Mutationen in einer für ein Protein mit der biologischen Aktivität einer Homoaconiase codierenden Nukleinεäureεe uenz gemäß den Anεprüchen 2 biε 6 stammend aus einem phytopathogenen Pilz bestehend aus
a) der Herstellung von auf einer Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 2 bis 6 basierenden Oligonukleotiden enthaltend die Mutation mit anschließender PCR; oder
b) der Herstellung von Oligonukleotiden basierend auf einer Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 2 bis 6, wobei der die Mutation flankierende Bereich mittels PCR amplifiziert wird, gefolgt von einem Restriktionsverdau und/ oder einer Sequenzierung.
9. Verwendung des Genproduktes einer Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 2, 3, 4, 5 oder 6 oder eines funktionellen Äquivalentes der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestenε 61% zu der SEQ ID NO:l als Target
5 zur Ermittlung fungizid wirkender Substanzen.
10. Expressionskassette enthaltend eine für Homoaconitase codierende Nukleinsauresequenz gemäß den Ansprüchen 2 bis 6.
10 11. Expressionskassette nach Anspruch 10, enthaltend
a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit der über Ansprüche 2 bis 6 definierten Nukleinsauresequenz ; oder
15 b) zusätzliche Funktionsele ente; oder
c) eine Kombination aus a) und b) .
20 12. Vektor enthaltend eine Expressionskassette nach Anspruch 10 oder 11.
13. Transgener Organismus, enthaltend mindestenε eine Nukleinεäü- reεequenz gemäß Anεpruch 2, 3, 4, 5 oder 6, eine Expressionε-
25 kassette gemäß einem der Ansprüchen 10 bis 11 oder einen Vektor gemäß Anspruch 12.
14. Transgener Organismus nach Anspruch 13, ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.
30
15. Verwendung von Nukleinsäuresequenzen umfassend
a) eine Nukleinsauresequenz mit der in SEQ ID N0:1 dargestellten Nukleinsäureεequenz; oder
35 b) eine Nukleinsauresequenz, die sich aufgrund des degenerierten genetischen Codes durch Rückübersetzung aus den in SEQ ID NO: 2 dargestellten Aminosäuresequenz ableiten läßt ; oder
40 c) funktionelle Äquivalente der Nukleinεäuresequenzen SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestens 61% zu der SEQ ID NO:l
5 oder durch die vorstehend genannten Nukleinsäureεequenzen kodierten Aminoεäuresquenzen der Homoaconitase aus einem phytopathogenen Pilz in einem Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung. 5
16. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung, dadurch .gekennzeichnet, dass man die Tanskription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes einer Nukleinsauresequenz nach den Ansprüchen 2 bis 6 kodier-
10 ten Aminosäuresequenz beeinflußt und solche Substanzen auswählt, die die Tanskription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes reduzieren oder blockieren..
17. Verfahren nach Anspruch 16 umfassend die folgenden Schritte: 15 i) Inkontaktbringen eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 6 oder eines funktionellen Äquivalentes der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestens 61% zu der SEQ ID NO:l oder der durch ei-
20 nes der vorεtehend genannten Nukleinεäuremoleküle kodierten Homoaconitase mit einer oder mehreren Testsubstanzen unter Bedingungen, die die Bindung der Testsubstanz (en) an das Nukleinsäuremolekül oder die Homoaconitase erlauben; und
25 ii) Nachweis, ob die Testverbindung an die Homoaconitase aus i) bindet;
iii) Nachweis, ob die Testverbindung die Aktivität der Ho oa- 30 conitase aus i) reduziert oder blockiert; oder
iv) Nachweis, ob die Testverbindung die Transkription,
Translation oder Expresεion der Nukleinsäure aus i) reduziert oder blockiert. 35
18. Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High- Throughput-Screening durchgeführt wird.
40 19. Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mittels eines Organismus durchgeführt wird.
20. Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das 45 Verfahren mittels eines Organismus nach Anspruch 13 oder 14 durchgeführt wird.
21. Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 20 dadurch gekennzeichnet, dass
a) entweder Homoaconitase in einem transgenen Organismus
5 enthaltend eine Nukleinsäureεequenz nach Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 6 oder ein funktionelles Äquivalent der Nukleinsauresequenz SEQ ID NO:l mit einer Identität von mindestenε 61% zu der SEQ ID N0:1 exprimiert wird oder ein Organiεmuε, der naturgemäß Homoaconitase enthält, 10 kultiviert wird;
b) die Homoaconitase aus dem Organismuε auε Schritt a) im Zellaufschluss des Organismus, in partiell gereinigter Form ,oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer
15 Testverbindung in Kontakt gebracht wird; und
c) eine Testverbindung selektiert wird, welche die Aktivität der Homoaconitase reduziert oder- blockiert, wobei die Aktivität der mit der Testverbindung inkubierten Homoaconi-
20 tase mit der Aktivität einer nicht mit einer Testverbindung inkubierten Homoaconitase ermittelt wird.
22. Verfahren nach den Anεprüchen 21, dadurch gekennzeichnet, dass Homoaconitase mit einer Testverbindung inkubiert wird
25 und nach einer geeigneten Reaktionszeit die enzymatische Aktivität des Enzyms im Vergleich zur Aktivität des nicht gehemmten Enzyms photometrisch ermittelt wird.
23. Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis '22, dadurch gekennzeich- 30 net, dass man Homoaconitat als Substrat zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einsetzt, und die enzymatische Aktivität der Homoaconitase über die Abnahme der Absorption bei 240nm beεtimmt wird.
35 24. Verfahren nach den Ansprüchen 21 bis 22, dadurch gekennzeichnet, dass man Homoisocitrat als Substrat zur Bestimmung der enzymatischen Aktivität einsetzt, und die enzymatische Aktivität der Homoaconitase über die Zunahme der Absorption bei 240nm bestimmt.
40
25. Verfahren nach einem der .Ansprüche 16 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass man die über das Verfahren selektierte Testverbindung zur Verifizierung der fungiziden Wirkung auf einen phytophathogenen Pilz appliziert.
45
26. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17 zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung bestehend aus den folgenden Schritten:
5 a) der Herstellung von Organismen, die nach Transformation mit einer Nukleinsäureεequenz nach Anspruch 2, 3, 4, 5 oder 6 oder eines funktionellen Äquivalentes der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID N0:1 mit einer Identität von mindestens 61% zu der SEQ ID NO:l in der Lage sind, ein Poly- 10 peptid mit der biologischen Aktivität einer Homoaconitase zu exprimieren;
b) das Aufbringen einer Testverbindung auf den Organismus aus Schritt a) und auf einen analogen, nicht' transfor-
15 mierten Organismus;
c) das Bestimmen des Wachstums oder' der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht-transformierten Organismus nach dem Aufbringen der Testverbindung aus Schritt b) ;
20 und
d) Selektion von Testεubεtanzen, die ein vermindertes Wachstum, Überlebensfähigkeit und/oder Infektiösität des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem
25 Wachstum des transgenen Organismus bewirken.
27. Transgener Organismuε nach Anεpruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß er eine erhöhte Lysinproduktion im Vergleich mit einem nicht-transgenen Organismuε aufweist.
30
28. Transgener Organismus nach Anspruch 27 dadurch gekennzeichnet, daß der Organismus aus der Gruppe der Pilze oder Archae- bakterien stammt.
35 29. Transgener Organismuε nach Anεpruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß der Organiεmuε aus der Gruppe der phytopathogenen Pilze stammt.
30. Wirkstoffe mit fungizider Wirkung identifizierbar über eins 40 der Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 26.
31. Verfahren zur Herstellung einer agrochemischen Zusammensetzung mit fungizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet dasε man
45 a) einen fungiziden Wirkεtoff über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 16 bis 26 identifiziert, und b) den über (a) identifizierten Wirkεtoff oder ein landwirtschaftlich brauchbares Salz des über (a) identifizierten Wirkstoffeε mit entsprechenden Hilfsmitteln formuliert.
32. Agrochemische Zuεammenεetzung mit fungizider Wirkung erhät- lich durch ein Verfahren gemäß Anεpruch 31.
33. Verfahren zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Pflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge einer fungiziden Verbindung nach Anspruch 19 oder einer agrochemischen Zuεammenεetzung gemäß Anεpruch 32 behandelt.
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