DE10150677A1

DE10150677A1 - Neue Targets für Fungizide

Info

Publication number: DE10150677A1
Application number: DE10150677A
Authority: DE
Inventors: Annette Freund; Wilhelm Schaefer; Frank Maier; Anke Loesch; Sascha Malz; Nicole Jenczmionka; Katrin Quester; Meike Andermann
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 2001-10-17
Filing date: 2001-10-17
Publication date: 2003-04-30

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Isolation der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO:1 oder SEQ ID NO:2, funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen sowie Nukleinsäuresequenzen, enthaltend die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder funktionelle Äquivalente dieser Nukleinsäuresequenzen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung, basierend auf der Verwendung der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Identifizierung und Isolation der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID No: 1 oder SEQ ID NO: 2, funktionelle Äquivalente der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen sowie Nukleinsäuresequenzen enthaltend die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder funktionelle Äquivalente dieser Nukleinsäuresequenzen. Des weiteren betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung basierend auf der Verwendung der vorstehend genannten Nukleinsäuresequenzen.
Das grundlegende Prinzip, Fungizide über Inhibierung eines definierten Targets zu identifizieren ist bekannt (siehe z. B. EP-A 1081232; US 5,187071; WO 98/33925). Nicht nur aufgrund von in der Praxis häufig auftretenden Resistenzproblematiken, sondern auch aufgrund des ständigen Bemühens neue fungizide Wirkstoffe zu identifizieren, die sich durch einen möglichst breiten Wirkungsbereich, ökologische und toxikologische Unbedenklichkeit sowie geringe Aufwandmengen auszeichnen, besteht ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, welche neue Targets für Fungizide darstellen könnten. Dies ist in der Praxis mit großen Schwierigkeiten verbunden, da die Hemmung eines Enzyms, das Bestandteil eines Stoffwechselweges ist, häufig das Wachstum des Pilzes nicht weiter beeinflusst. Dies kann daran liegen, dass der Pilz auf alternative Stoffwechselwege ausweicht, deren Existenz nicht bekannt ist, oder dass das inhibierte Enzym nicht limitierend für den Stoffwechselweg ist. Die Targeteignung eines Genproduktes lässt sich daher auch mit Kenntnis der Genfunktion nicht vorhersagen. Ein weiteres Problem besteht darin, so genannte "druggable" Wirkorte zu identifizieren, d. h. Wirkorte, die gegenüber Wirkstoffen z. B. aus sterischen Gesichtspunkten überhaupt zugänglich sind. Diese Eigenschaft kann aus der Kentnis eines Wirkorts per se nicht abgeleitet werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht daher darin, fungizide Targets zu identifizieren sowie Verfahren bereitzustellen, welche zur Identifizierung von Verbindungen mit fungizider Wirkung geeignet sind.
Die erfindungsgemäße Aufgabe wurde gelöst durch

1. die Isolation der SEQ ID NO 1 und 2 aus dem phytopathogenen Pilz Fusarium graminearum,
2. die Validierung der in 1. erwähnten Nukleinsäuresequenzen als Targets für Fungizide insbesondere gegen Fusarium durch molekularbiologische Methoden;
3. die Bereitstellung eines Verfahrens zur Identifizierung von Inhibitoren von mitogen aktivierten Protein Kinasen (MAP-Kinasen) enthaltend die in 1. beschriebenen Sequenzen oder funktioneller Äquivalente dieser Sequenzen; sowie
4. die Verwendung der über das Verfahren identifizierten Inhibitoren als Fungizide.

An dieser Stelle werden nun einige der in der Beschreibung verwendeten Begriffe definiert.
"Affinitäts-Tag": Bezeichnet ein Peptid oder Polypeptid, dessen kodierende Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz direkt oder mittels eines Linkers über gängige Klonierungstechniken fusioniert werden kann. Das Affinitäts-Tag dient zur Isolierung, Anreicherung und/oder gezielten Aufreinigung des rekombinanten Zielproteins mittels Affinitäts-Chromatographie aus Gesamtzellextrakten. Der oben erwähnte Linker kann optional eine Protease-Schnittstelle (z. B. für Thrombin oder Faktor Xa) enthalten, wodurch das Affinitäts-Tag bei Bedarf vom Zielprotein abgespalten werden kann. Beispiele für gängige Affinitäts-Tags sind das "His-Tag" z. B. von Quiagen, Hilden, "Strep- Tag", das Myc-Tag" (Invitrogen, Carlsberg), das aus einer Chitin bindenden Domäne und einem Intein bestehende Tag von New England Biolabs, das Maltose-bindende Protein (pMal) von New England Biolabs und das sogenannte CBD-Tag von Novagen. Der Affinitäts-Tag kann dabei am 5'- oder 3'-Ende der kodierenden Nukleinsäuresequenz mit der für das Zielprotein kodierenden Sequenz angebracht sein.
"Aktivität": Die hier zu verwendende Bedeutung des Begriffs Aktivität ist darin zu sehen, daß Organismen wie hier Hefen und Pilze auf geeigneten Nährmedien durch die Aktivität eines Proteins wachstums- und überlebensfähig sind. Wir die Aktivität eines Proteins wie einer MAP-Kinase gehemmt, so kann es zu einem Wachstumsstillstand oder einem Absterben des Organismus führen.
"Expression" beschreibt Transkription und anschließende Translation eines Gens in einer Zelle enthaltend die gewünschte Expressionskassettte.
"Expressionskassette oder Nukleinsäuresequenz": Unter einer Expressionskassette enthaltend eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz versteht man beispielsweise eine genomische oder eine komplementäre DNA-Sequenz oder eine RNA-Sequenz sowie halb- oder vollsynthetische Analoga davon. Diese Sequenzen können in linearer oder zirkulärer Form, extra-chromosomal oder integriert im Genom vorliegen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen werden oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen enthalten, sowie aus verschiedenen heterologen Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen.
Auch artifizielle Nukleinsäuresequenzen sind hierbei geeignet, solange sie die Expression des Zielproteins in einer Zelle oder einem Organismus ermöglichen. Beispielsweise können synthetische Nukleotid-Sequenzen erzeugt werden, die bezüglich der Kodon-Nutzung des von den zu transformierenden Organismen optimiert wurden.
Alle vorstehend erwähnten Nukleotid-Sequenzen sind in an sich bekannter Weise durch chemische Synthese aus den Nukleotidbausteinen wie beispielsweise durch Fragment-Kondensation einzelner überlappender, komplementärer Nukleotidbausteine der Doppelhelix herstellbar. Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, Seite 896-897) erfolgen. Bei der Präparation einer Expressionskassette können verschiedene DNA-Fragmente so manipuliert werden, dass eine Nukleotid-Sequenz mit korrekter Leserichtung und korrektem Leseraster erhalten wird. Die Verbindung der Nukleinsäure-Fragmente untereinander erfolgt über allgemeine Klonierungstechniken wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enquist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind.
"Funktionelle Äquivalente" beschreiben hier Nukleinsäuresequenzen, die

1. unter Standardbedingungen mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz oder Teilen einer der beiden Nukleinsäuresequenzen hybridisieren und
2. befähigt sind die Expression einer enzymatisch aktiven MAP- Kinase in einer Zelle oder einem Organismus zu bewirken.

Zur Hybrisierung werden vorteilhaft kurze Oligonukleotide mit einer Länge von etwa 15-35 bp beispielsweise der konservierten oder sonstigen Bereiche, die über Vergleiche mit anderen verwandten Genen in dem Fachmann bekannter Weise ermittelt werden können, verwendet. Es können aber auch längere Fragmente der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren mit einer Länge von 25-50 bp oder die vollständigen Sequenzen für die Hybridisierung verwendet werden. Je nach der verwendeten Nukleinsäure: Oligonukleotid, längeres Fragment oder vollständige Sequenz oder je nachdem welche Nukleinsäureart DNA oder RNA für die Hybridisierung verwendet werden, variieren diese Standardbedingungen. So liegen beispielsweise die Schmelztemperaturen für DNA:DNA-Hybride ca 10°C niedriger als die von DNA:RNA-Hybriden gleicher Länge. Die Länge der Oligonukleotide beträgt etwa 10-50 bp, vorzugsweise 15-40 bp.
Unter Standardhybridisierungsbbedingungen sind beispielsweise je nach Nukleinsäure Temperaturen zwischen 42 und 58°C in einer wäßrigen Pufferlösung mit einer Konzentration zwischen 0,1 bis 5 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat, pH 7,2) oder zusätzlich in Gegenwart von 50% Formamid wie beispielsweise 42°C in 5 × SSC, 50% Formamid zu verstehen. Vorteilhafterweise liegen die Hybridisierungsbedingungen für DNA:DNA-Hybride bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 20°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 30°C bis 45°C. Für DNA:RNA-Hybride liegen die Hybridisierungsbedingungen vorteilhaft bei 0,1 × SSC und Temperaturen zwischen etwa 30°C bis 65°C, bevorzugt zwischen etwa 45°C bis 55°C. Diese angegebenen Temperaturen für die Hybridisierung sind beispielhaft kalkulierte Schmelztemperaturwerte für eine Nukleinsäure mit einer Länge von ca. 100 Nukleotiden und einem G + C-Gehalt von 50% in Abwesenheit von Formamid. Die experimentellen Bedingungen für die DNA-Hybridisierung sind in einschlägigen Lehrbüchern der Genetik wie beispielsweise Sambrook et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, 1989, beschrieben und lassen sich nach dem Fachmann bekannten Formeln beispielsweise abhängig von der Länge der Nukleinsäuren, der Art der Hybride oder dem G + C-Gehalt berechnen. Weitere Informationen zur Hybridisierung kann der Fachmann folgenden Lehrbüchern entnehmen: Ausubel et al. (eds), 1985, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York; Hames and Higgins (eds), 1985, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford; Brown (ed), 1991, Essential Molecular Biology: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press, Oxford.
Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man ferner insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 sowie Nukleinsäuresequenzen, die bis zu einem bestimmten Grad mit den Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 homolog sind, und die Expression einer aktiven MAP-Kinase zu bewirken. Der Homologiegrad kann mittels üblicher Programmalgorithmen berechnet werden.
Beispielhaft können solche Modifikationen durch dem Fachmann geläufige Techniken, wie "Site Directed Mutagenesis", "Error Prone PCR", "DNA-shuffling" (Nature 370, 1994, pp. 389-391) oder "Staggered Extension Process" (Nature Biotechnol. 16, 1998, pp. 258-261) erzeugt werdne. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die Einfügung weiterer Restriktionsenzymschnittstellen, die Entfernung unerwünschter DNA oder das Hinzufügen weiterer Sequenzen sein. Proteine, die über besagte Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, sollten jedoch trotz abweichender Nukleinsäuresequenz noch die gewünschten Aktivität besitzen.
Der Begriff des funktionellen Äquivalents kann sich auch auf das durch die entsprechende Nukleinsäuresequenz codierte Protein beziehen. In diesem Fall beschreibt der Begriff funktionelles Äquivalent ein Protein, dessen Aminosäuresequenz mit der des Referenzproteins bis zu einem bestimmten Prozentsatz homolog ist.
Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch chemische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch adaptierte Nukleinsäuresequenzen bzw. die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen.
Generell gilt, dass funktionelle Äquivalente unabhängig von der jeweiligen Aminosäuresequenz (kodiert durch eine entsprechende Nukleinsäuresequenz) jeweils die gleiche physiologische Funktion haben, die das Protein, dass durch die ursprüngliche Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder Teile dieser Sequenzen kodiert wird.
"Gen" beschreibt eine für ein Protein kodierende Nukleinsäuresequenz, die in RNA transkribiert werden kann und optional mit regulatorischen Sequenzen assoziiert sein kann. Beispiele für regulatorische Sequenzen sind Promotorsequenzen, Terminatorsequenzen, Translationsinitiationssequenzen ("Kozac-Sequenzen") und Sequenzen, die die Stabilität der RNA beeinflussen (Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2(4), 2001, 237-246; Trends in Biochemical Sciences, 1995, 20(11): 465-470; Molecular & Cellular Biochemistry, 1990, 96(1): 15-23). Weitere optional vorhandene Elemente sind beispielsweise Introns.
"Genetische Kontrollsequenz": Der Begriff der genetischen Kontrollsequenzen äquivalent zu sehen mit dem Begriff "regulatorische Sequenz") beschreibt die Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expressionskassette haben und zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryontischen Organismen gewährleisten. Beispiele sind hierfür sind Promotoren oder sogenannte "enhancer" Sequenzen. Zusätzlich zu diesen Kontrollsequenzen oder anstelle dieser Sequenzen kann die natürliche Regulation dieser Sequenzen vor den eigentlichen Strukturgenen noch vorhanden sein und gegebenenfalls genetisch so modifiziert worden sein, dass die natürliche Regulation ausgeschaltet und die Expression des Zielgens modifiziert, also erhöht oder erniedrigt wurde. Die Auswahl der Kontrollsequenz erfolgt abhängig vom Wirtsorganismus oder Ausgangsorganismus. Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untranslatierte Region, Introns oder die nichtkodierende 3'-Region von Genen. Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben.
"Homologie" zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptidsequenzen wird durch die Identität der Nukleinsäuresequenz/Polypeptidsequenz über die jeweils gesamte Sequenzlänge definiert, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird:
Gap Weight: 12; Length Weight: 4;
Average Match: 2,912; Average Mismatch: -2,003.
"MAP-Kinase-Aktivität" bezeichnet die Fähigkeit eines Polypeptides Substratumwandlungen vorzunehmen, wie es eine MAP-Kinase vermag. Verbindungen, welche die Aktivität einer MAP-Kinase beeinflussen, werden im Sinne der vorliegenden Erfindung als "MAP-Kinase inhibierende Verbindungen" bezeichnet.
"Mutationen" umfassen Substitutionen (= Ersetzungen), Additionen (Hinzufügung), Deletionen (Löschung), Inversion (Veränderungen) oder Insertionen (Einfügungen) eines oder mehrerer Nukleotidreste, wodurch sich auch die entsprechende Aminosäuresequenz des Zielproteins mittels Substitution, Insertion oder Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren verändern kann.
"Knock-Out-Transformanden" bezeichnet Einzelkulturen eines transgenen Organismus, in denen gezielt über Transformation ein spezifisches Gen inaktiviert wurde.
"Natürliche genetische Umgebung" meint den natürlichen chromosomalen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Bibliothek ist die natürliche genetische Umgebung der Nukleinsäuresequenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an 5'- oder 3'-Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 100 bp, besonders bevorzugt mindestens 500 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, am meisten bevorzugt mindestens 5000 bp.
"Operative Verknüpfung": Unter einer operativen oder auch funktionellen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Sequenz bestimmungsgemäß erfüllen kann.
"Rekombinante DNA" beschreibt eine Kombination von DNA-Sequenzen herstellbar durch rekombinante DNA-Technologie.
"Rekombinate DNA-Technologie": allgemein bekannte Techniken zur Fusionierung von DNA-Sequenzen (z. B. beschrieben in Sambrook et al., 1989, Cold Spring Habour, NY, Cold Spring Habour Laboratory Press).
"Replikationsursprünge" gewährleisten die Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren in Mikroorganismen und Hefen wie z. B. der pBR322 ori oder der P15A ori in E. coli (Sambrook et al.: Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und der ARS1 ori in Hefe (Nucleic Acids Research, 2000, 28(10): 2060-2068).
"Reportergene" kodieren für leicht quantifizierbare Proteine. Über Wachstums-, Fluoreszenz-, Chemo-, Biolumineszenz- oder Resistenzassay oder über eine photometrische Messung (Eigenfarbe) oder Enzymaktivität kann mittels dieser Gene eine Bewertung der Transformationseffizienz oder des Expressionsortes oder -zeitpunktes vorgenommen werden. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Reporter-Proteine (Schenborn E, Groskreutz D. Mol Biotechnol. 1999; 13(1): 29-44) wie das "green fluorescence protein" (GFP) (Gerdes HH and Kaether C, FEBS Lett. 1996; 389(1): 44-47; Chui WL et al., Curr Biol 1996, 6: 325-330; Leffel SM et al., Biotechniques. 23(5): 912-8, 1997), die Chloramphenicolacetyltransferase, eine Luziferase (Giacomin, Plant Sci 1996, 116: 59-72; Scikantha, J Bact 1996, 178: 121; Millar et al., Plant Mol Biol Rep 1992 10: 324-414), sowie Luziferasegene im allgemeinen die β-Galactosidase, oder die β-Glucuronidase (Jefferson et al., EMBO J. 1987, 6, 3901-3907), das das Ura3-Gen, das Ilv2-Gen, das 2-Desoxyglucose-6-phosphat-Phosphatasegen, β-Lactamasegen, das Neomycinphosphotransferasegen, das Hygromycinphosphotransferasegen oder das BASTA(= Gluphosinatresistenz)-Gen.
"Selektionsmarker" verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika, Antimetaboliten oder andere toxische Verbindungen. Beispielhaft zu nennen seien hier das npt Gen, das eine Resistenz gegen die Aminoglycisid-Antibiotika Neomycin (G 418), Kanamycin, und Paromycin verleiht (Deshayes A et al., EMBO J. 4 (1985) 2731-2737), das hygro Gen (Marsh JL et al., Gene. 1984; 32(3): 481-485), das sul Gen (Guerineau F et al., Plant Mol Biol. 1990; 15(1): 127-136), das Hygromycin-Gen (Gen Bank Accession NO: K 01193) und das she-ble Gen, das eine Resistenz gegen das Bleomycin Antibiotikum Zeocin verleiht. Weitere Beispiele für Selektionsmarker-Gene sind Gene, die eine Resistenz gegen 2-Desoxyglucose-6-phosphat (WO 98/45456) oder Phosphinotricin etc. verleihen oder solche, die eine Antimetaboliten-Resistenz verleihen, zum Beispiel das dhfr-Gen (Reiss, Plant Physiol. (Life Sci. Adv.) 13 (1994) 142-149). Geeignet sind ferner Gene wie trpB oder hisD (Hartman SC and Mulligan RC, Proc Natl Acad Sci USA. 85 (1988) 8047-8051). Geeignet ist auch das Gen der Mannose-Phosphat Isomerase (WO 94/20627), das ODC (Ornithin-Decarboxylase) Gen (McConlogue, 1987 in: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Hrsg.) oder die Deaminase aus Aspergillus terreus (Tamura K etal., Biosci Biotechnol Biochem. 59 (1995) 2336-2338).
"Substrat": Substrat ist die chemische Verbindung, die von dem zu untersuchenden Targetprotein in seiner ursprünglichen Funktion erkannt wird und mittels einer durch das Target Protein katalysierten Reaktion in ein Produkt umgewandelt wird.
"Target/Target Protein": Ein Target Protein ist ein essenzielles oder zu untersuchendes Protein (dies kann ein Enzym im klassischen Sinne sein oder z. B. ein Strukturprotein, Entwicklungsprotein, Regulationsproteine wie Transkriptionsfaktoren, Kinasen, Phosphatasen, Rezeptoren, Untereinheiten von Kanälen, Transportproteine, regulatorische Untereinheiten die einem Enzymkomplex eine substrat- oder aAktivitätsregulation verleihen). Allen Targets oder Wirkorten gemein ist dabei, dass deren funktionale Anwesenheit essentiell für das Überleben oder die normale Entwicklung und das Wachstum sowie Pathogenität und Infekionsverhalten sind.
"Testverbindung" bezeichnet die zu testende Verbindung, die in den Testverfahren zur Ermittlung fungizid wirkender Substanzen eingesetzt wird.
"Transformation" beschreibt einen Prozess zur Einführung von DNA in eine pro- oder eukaryontische Zelle. Mit einer transformierten Zelle ist nicht nur das Produkt das Transformationsprozesses an sich beschrieben, sondern auch alle transgenen Nachkommen des durch die Transformation hergestellten transgenen Organismus'.
"Transgen": Bezogen auf eine Nukleinsäuresequenz, eine Expressionskassette oder einen Vektor enthaltend besagte Nukleinsäuresequenz oder einen Organismus transformiert mit besagter Nukleinsäuresequenz, Expressionskassette oder Vektor beschreibt der Ausdruck "transgen" alle solche durch gentechnische Methoden hergestellten Konstruktionen, in denen sich entweder die Nukleinsäuresequenz des Zielproteins oder eine mit der Nukleinsäuresequenz des Zielproteins funktionell verknüpfte genetische Kontrollsequenz oder eine Kombination der vorstehend genannten Möglichkeiten sich nicht in ihrer natürlichen genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden. Die Modifikation kann hier beispielsweise über Mutation eines oder mehrerer Nukleotidreste der entsprechenden Nukleinsäuresequenz erreicht werden.
Pilze der Gattung Fusarium verursachen als Schadpilze gewaltige wirtschaftliche Schäden.
So infiziert Fusarium graminearum als Erreger der partiellen Taubährigkeit von Weizen und Gerste die Ähren und führt somit zu einer starken Ertragseinbußung bei der Getreideernte und zum Qualitätsverlust der Getreide. Durch Vermehrung und Überdauerung im Korn ist es dem Pilz möglich, beim Getreideanbau großflächig Schaden anzurichten. Zudem ist bekannt, daß Fusarium graminearum Mykotoxine bildet. Von besonderer Bedeutung sind Deoxynivalenol (DON)und Zearalenon (ZEA), die sowohl bei Tieren als auch beim Mensch schwere gesundheitliche Schäden verursachen können. Sowohl DON als auch ZEA gehören weltweit zu den am häufigsten in Getreide vorkommenden Mykotoxinen. Bislang wird der Befall durch Fusarium graminearum hauptsächlich durch Anbau weniger empfindlicher Getreidesorten und durch Fungizidspritzungen vermieden. Im Zuge zunehmender Resistenzproblematiken besteht jedoch ein großer Bedarf, Enzyme zu detektieren, die insbesondere diesen Pilz die pathogene Lebensweise ermöglichen, um diese für die Bekämpfung des Krankheitserregers nutzen zu können.
Überraschender Weise anhand der Herstellung von Knock-Out Transformanden von F. graminearum konnte gezeigt werden, dass zwei MAP-Kinasen für das Infektionsverhalten und Überleben des phytopathogenen Pilzes F. graminearum auf Getreide essentiell sind. Die oben beschriebenen Knock-out Transformanden waren nicht in der Lage, Getreide zu infizieren.
Mitogen aktivierte Proteinkinasen (MAP-Kinasen) sind eine Gruppe von Proteinkinasen, die vielfältige Aufgaben bei der zellulären Signaltransduktion übernehmen, wie z. B. bei der Osmoregulation, der Zellwandbiosynthese, dem Wachstum und der Differenzierung. In vielen pilzlichen Pathogenen wird die Ausbildung von Penetrationsstrukturen und die Wirterkennung durch physikalisch oder chemnische Signale ausgelöst. Demzufolge spielen die Signaltransduktionswege in filamentösen Pilzzellen eine wichtige Rolle bei der Ausbildung vieler Krankheiten. Die hierzu durchgeführten Untersuchungen basieren jedoch auf Pilzen, die ein vollständig anderes Infektionsverhalten als Fusarium graminearum aufweisen. Somit war bislan über die Rolle von MAP-Kinasen im phytopathogenen Pilz Fusarium graminearum oder Pilzen mit einem Ähnlichen Infektionsverhalten nichts bekannt.
Erfindungsgemäß stellen MAP-Kinasen geeignete Targets für Fungizide dar, insbesondere gegen Fusarium Spezies sowie Spezies mit einem analogen oder ähnlichen Infektionsverhalten.
Unter Fusarium Spezies sind zu nennen: Fusarium dimerium, Fusarium merismoides, Fusarium lateritium, Fusarium decemcellulare, Fusarium poae, Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium chlamydosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium anthophilum, Fusarium subglutinans, Fusarium nygamai, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium culmorum, Fusarium sambucinum, Fusarium crookwellense, Fusarium avenaceum ssp. avenaceum, Fusarium avenaceum ssp. aywerte, Fusarium avenaceum ssp. nurragi, Fusarium hetrosporum, Fusarium acuminatum ssp. acuminatum, Fusarium acuminatum ssp. armeniacum, Fusarium longipes, Fusarium compactum, Fusarium equiseti, Fusarium scripi, Fusarium polyphialidicum, Fusarium semitectum und Fusarium beomiforme.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind folgende Nukleinsäuren umfassend:

a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder
b) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2; oder
c) Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.
d) Nukleinsäuresequenzen enthaltend Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.

Der Begriff des funktionellen Äquivalentes bzw. des funktionellen Analogons ist bereits weiter oben definiert.
Unter Teilen der Nukleinsäuresequenzen f) sind für die SEQ ID NO: 1 der Abschnitt 281-556 bp zu verstehen und für die SEQ ID NO: 2 der Abschnitt 218 bp bis 419 bp.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 1 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No: 1 von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Besagte funktionelle Äquivalente zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d. h. sie haben die physiologische Funktion einer MAP-Kinase.
Die erfindungsgemäßen funktionellen Äquivalente der SEQ ID NO: 2 weisen eine Homologie mit der SEQ ID No: 2 von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%,48%,49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%,69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf. Besagte funktionelle Äquivalente zeichnen sich durch eine im wesentlichen gleiche Funktionalität aus, d. h. sie haben die physiologische Funktion einer MAP-Kinase.
Die Bereitstellung von Nukleinsäuresequenzen enthaltend die SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 kann über die Herstellung von Hybridisierungssonden (T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989)) basierend auf den Sequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 bzw. deren funktioneller Äquivalente erfolgen. Das hierzu notwendige Vorgehen ist dem Fachmann bekannt und beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben.
Die hier beanspruchten Nukleinsäuresequenzen stammen bevorzugt aus einem Pilz, bevorgzugt phytopathogenen Pilz, besonders bevorzugt einem Pilz der Gattung Fusarium, ganz besonders bevorzugt aus Fusarium graminearum.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Expressionskassetten, deren Nukleinsäuresequenz für eine der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen kodiert für die rekombinante Expression von MAP-Kinasen. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z. B. eine DNA- oder eine cDNA-Sequenz sein. Die rekombinante Expression ist für die später erwähnten Testsysteme vornöten. Diese Expressionskasetten werden im folgenden als erfindungsgemäße Expressionskassetten bezeichnet.
Erfindungsgemäße Expressionskassetten beinhalten vorteilhaft außerdem genetische Kontrollsequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine erfindungsgemäße Expressionskassette am 5'-Ende der kodierenden Sequenz einen Promotor und am 3'-Ende Transkriptions-Terminations-Signal und gegebenenfalls weitere genetische Kontrollsequenzen, welche mit der dazwischenliegenden für eine MAP-Kinase kodierenden Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft sind.
Erfindungsgemäß sind auch Analoga der oben beschriebenen Expressionskassetten die zum Beispiel durch eine Kombination der einzelnen Nukleinsäuresequenzen auf einem Polynukleotid (Mehrfachkonstrukte), auf mehreren Polynukleotiden in einer Zelle (Kotransformation) oder durch sequenzielle Transformation zustande kommen können.
Erfindungsgemäß sind ferner Vektoren, die mindestens eine Kopie der oben erwähnten Nukleinsäuresequenzen und/oder des erfindungsgemäßen Nukleinsäurekonstrukts der oben beschriebene Expressionskassetten enthalten.
Unter Vektoren sind außer Plasmiden auch alle anderen dem Fachmann bekannten Vektoren wie beispielsweise Phagen, Viren wie SV40, CMV, Baculovirus, Adenovirus, Transposons, IS-Elemente, Phasmide, Phagemide, Cosmide, lineare oder zirkuläre DNA zu verstehen. Diese Vektoren können autonom im Wirtsorganismus repliziert oder chromosomal repliziert werden bevorzugt ist eine chromosomale Replikation.
In einer weiteren Ausgestaltungsform des Vektors kann die erfindungsgemäße Nukleinsäurekonstrukt auch vorteilhafterweise in Form einer linearen DNA in die Organismen eingeführt werden und über heterologe oder homologe Rekombination in das Genom des Wirtsorganismus integriert werden. Diese lineare DNA kann aus einem linearisierten Plasmid oder nur aus dem Nukleinsäurekonstrukt als Vektor oder den verwendeten Nukleinsäuresequenzen bestehen.
In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform können die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Nukleinsäuresequenzen auch alleine in einen Organismus eingebracht werden.
Sollen neben den Nukleinsäuresequenzen weitere Gene in den Organismus eingeführt werden, so können alle zusammen in einem einzigen Vektor oder jedes einzelne Gen in je einem Vektor in den Organismus eingebracht werden, wobei die verschiedenen Vektoren gleichzeitig oder sukzessive eingebracht werden können.
Vorteilhafte Kontrollsequenzen für die erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Vektoren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR- oder im 1-PL-Promotor, die zur Expression der MAP-Kinasen in gram-negativen Bakterienstämmen verwendet werden können.
Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den Promotoren amy und SPO2, die zur Expression der MAP-Kinasen in gram-positiven Bakterienstämmen verwendet werden können, sowie in den Hefe- oder Pilzpromotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28, ADH, AOX1 und GAP enthalten, die zur Expression der MAP-Kinasen in Hefestämmen verwendet werden können. Insbesondere für filamentöser Pilze sind vorteilhaft der GPD-Promotor (Mönke und Schäfer, Mol. Gen. Genet. 1993, 241, S. 73-80) oder dem pg1-Promotor (Di Pietro, A., M. D. Huertas-González, J. F. Gutierrez-Corona, G. Martinez-Cadena, E. Méglecz and M. I. G. Roncero (2001); Mol. Plant-Microbe Interact. 14 (5), 653-62).
Di Pietro, A. and M. I. G. Roncero (1998) Cloning, Expression, and role in pathogenicity if pg1 encoding the major extracellular endopolygalacturonase of the vascular wilt pathogen fusarium oxysporum, Mol. Plant-Microbe Interact. 11 (2), 91-8. als Kontrollsequenzen zu verwenden.
Als zur Expression in Insektenzellen geeignete Kontrollelemente sind exemplarisch der Polyhedrin-Promotor sowie der p10-Promotor (Luckow, V. A. and Summers, M. D. (1988) Bio/Techn. 6, 47-55) zu nennen.
Vorteilhafte Kontrollsequenzen zur Expression der MAP-Kinasen in Zellkultur sind neben Polyadenylierungssequenzen zum Beispiel die folgenden eukaryontischen Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40.
Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Expressionskassetten und die von ihnen abgeleiteten Vektoren können neben den oben erwähnten Promotoren auch weitere Funktionselemente enthalten. Beispielhaft aber nicht einschränkend seien hier Reportergene, Replikationsursprünge, Selektionsmarker und sogenannte Affinitäts-Tags, fusioniert mit der MAP-Kinase direkt oder mittels eines Linkers optional enthaltend eine Protease-Schnittstelle.
Die Expressionskassette sowie davon abgeleitete Vektoren können zur Transformation von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen und eukaryontischen Zellen (z. B. en) mit dem Ziel der rekombinanten Herstellung der MAP-Kinase eingesetzt werden, wobei sich die Herstellung einer geeigneten Expressionskassette nach dem Organismus, in welchen das Gen exprimiert werden soll, richtet.
Hierbei kann das Einbringen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuren, der Expressionskassette oder des Vektors in die entsprechenden Organismen (Transformation) prinzipiell nach allen dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen.
Für Mikroorganismen kann der Fachmann entsprechende Methoden den Lehrbüchern von Sambrook, J. et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, von F. M. Ausubel et al. (1994) Current protocols in molecular biology, John Wiley and Sons, von D. M. Glover et al., DNA Cloning Vol. 1, (1995), IRL Press (ISBN 019-963476-9), von Kaiser et al. (1994) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Habor Laboratory Press oder Guthrie et al. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, 1994, Academic Press entnehmen. Insbesondere für die Transformation filamentöser Pilze sind die in den Beispielen der vorliegenden Anmeldung beschriebenen Verfahren oder Abwandlungen davon vorteilhaft.
Die durch Transformation mit einer der oben beschriebenen Ausführungsformen einer Expressionskassette oder eines Vektor hergestellten transgenen Organismen sowie die mittels Expression aus dem transgenen Organismus erhältliche rekombinante MAP-Kinasen sind Gegenstand der vorliegenden Erfindung.
Bevorzugte Mikroorganismen für die rekombinante Expression sind neben Bakterien, Hefen, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien (z. Bsp. Insektenzelllinien).
Innerhalb der Bakterien sind Bakterien der Gattung Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt.
Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula oder Pichia.
Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neurospora, Fusarium, Beauveria, Mortierella, Saprolegnia, Pythium, oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
Prinzipiell sind als Wirtsorganismen auch transgene Tiere geeignet beispielsweise C. elegans.
Bevorzugt ist auch die Verwendung von Expressionsystemen und Vektoren, die öffentlich zugänglich oder kommerziell erhältlich sind.
Zu nennen sind hierbei die typischen vorteilhaften, kommerziell erhältlichen Fusions- und Expressionsvektoren pGEX [Pharmacia Biotech Inc. Smith, D. B. and Johnson, K. S. (1988) Gene 67: 31-40], pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) and pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) welches Glutathion S-transferase beinhaltet (GST), Maltose Bindeprotein, oder Protein A, die pTrc-Vektoren (Amann et al., (1988) Gene 69: 301-315) der "pKK233-2" von CLONTECH, Palo Alto, CA und die "pET"-, und die "pBAD"-Vektor-Serien von Stratagene, La Jolla.
Weitere vorteilhafte Vektoren zur Verwendung in Hefe sind pYep- Sec1 (Baldari, et al., (1987) Embo J. 6: 229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, (1982) Cell 30: 933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54: 113-123), and pYES-Derivate, pGAPZ-Derivate, pPICZ-Derivate sowie die Vektoren des "Pichia Expression Kit" (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren für die Nutzung in filamentösen Pilzen sind beschrieben in: von den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ können auch vorteilhaft Insektenzellexpressionsvektoren genutzt werden z. B. für die Expression in Sf9 oder Sf21 Zellen. Dies sind z. B. die Vektoren der pAc Serie (Smith et al. (1983) Mol. Cell Biol. 3: 2156-2165) und der pVL series (Lucklow and Summers (1989) Virology 170: 31-39). Weiterhin genannt seien die Baculovirus Expressionssysteme "MaxBac 2.0 Kit" von Invitrogen, Calsbald oder "BacPAK Baculovirus Expressionssystem" von CLONTECH, Palo Alto, CA.
Des weiteren können zur Genexpression vorteilhaft Pflanzenzellen oder Algenzellen genutzt werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren finden sich in Becker, D., et al. (1992) "New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border", Plant Mol. Biol. 20: 1195-1197 oder in Bevan, M. W. (1984) "Binary Agrobacterium vectors for plant transformation", Nucl. Acid. Res. 12: 8711-8721.
Weiterhin können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen in Säugerzellen exprimiert werden. Beispiel für entsprechende Expressionsvektoren sind pCDM8 und pMT2PC genannt in: Seed, B. (1987) Nature 329: 840 oder Kaufman et al. (1987) EMBO J. 6: 187-195). Dabei sind vorzugsweise zu nutzende Promotoren viralen Ursprungs wie z. B. Promotoren des Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus oder Simian Virus 40. Weitere prokaryotische und eukaryotische Expressionssysteme sind genannt in Kapitel 16 und 17 in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Weitere vorteilhafte Vektoren werden in Hellens et al. (Trends in plant science, 5, 2000) beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung sind dadurch gekennzeichnet, dass man in einem geeigneten Testsystem die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes einer Nukleinsäuresequenzen durch Zugabe einer Testverbindung beeinflußt und solche Substanzen auswählt, die die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genprodukt reduzieren, inhibieren oder blockieren, wobei die Nukleinsäuresequenz folgende Sequenzen umfasst:

a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellten Sequenz; oder
b) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2; oder
c) Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.
d) Nukleinsäuresequenzen enthaltend Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.

Die hier beanspruchten, erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO: 1 weisen eine Homologie mit der SEQ ID NO: 1 von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.
Die hier beanspruchten, erfindungsgemäße funktionelle Äquivalente der SEQ ID NO: 2 weisen eine Homologie mit der SEQ ID NO: 2 von mindestens 30%, 31%, 32%, 33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59% vorzugsweise mindestens 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% und 70% bevorzugt mindestens 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80% besonders bevorzugt mindestens 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 88%, 88%, 89%, 90% ganz besonders bevorzugt mindestens 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% auf.
Die hier beanspruchten Nukleinsäuresequenzen stammen bevorzugt aus einem Pilz, bevorgzugt phytopathogenen Pilz, besonders bevorzugt einem Pilz der Gattung Fusarium, ganz besonders bevorzugt Fusarium graminearum.
Unter Reduktion der Aktivität des Genprodukts ist eine Verringerung der biologischen Aktivität im Vergleich zur natürlichen Aktivität des Genprodukts von mindestens 10%, vorteilhaft mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt um mindestens 50% und ganz besonders bevorzugt um mindestens 70% zu verstehen. Blockierung der Aktivität des Genprodukts bedeutet die gänzliche, das heißt 100%ige Blockierung der Aktivität oder die teilweise Blockierung der Aktivität, bevorzugt eine mindestens 80%ige, besonders bevorzugt mindestens 90%ige, ganz besonders bevorzugt mindestens 95%ige Blockierung der biologischen Aktivität. Im Sinne der vorliegenden Erfindung wird "Reduktion" oder "Blockierung" unter dem Begriff "Inhibierung" zusammengefaßt.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in einzelnen getrennten Verfahrensansätzen in vivo oder in vitro und/oder vorteilhaft gemeinsam oder besonders vorteilhaft in einem High-Throughput- Screening durchgeführt werden und zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung oder von Antagonisten verwendet werden.
Eine bevorzugte Ausführungsform des in vitro Verfahrens umfasst die folgenden Schritte, wobei

a) eine Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer MAP-Kinase, codiert durch eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz, entweder in einem erfindungsgemäßen transgenen Organismus exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktvität einer MAP-Kinase enthält, kultiviert wird;
b) das im Schritt a) erhaltene Polypeptid in dem ruhenden oder wachsenden Organismus direkt, im Zellaufschluss des transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung inkubiert wird;
c) eine Verbindung selektiert wird, welche das Polypeptid inhibiert.

Unter dem in b) beschriebenen Organismus sind beispielsweise folgende Pilze zu verstehen: Bevorzugt sind hierbei Pilze, die über einen ähnlichen Infektionszyklus wie Fusarium Spezies verfügen
Die für das Verfahren benötigte Enzymlösung kann - wie in Schritt b) erwähnt- aus dem Lysat des ursprünglichen Organismus oder des transgenen Organismus bestehen. Falls erforderlich kann das erfindungsgemäße Polypeptid partiell oder vollständig über gängige Methoden aufgereinigen werden. Eine allgemeine Übersicht über gängige Techniken zur Reinigung von Proteinen sind beispielsweise in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben. Bei rekombinanter Darstellung kann eine Reinigung des mit einem Affinitäts-Tag fusionierten Proteins über Affinitätschromoatographie erfolgen.
Das für in vitro Verfahren benötigte erfindungsgemäße Polypeptid genannt kann somit entweder mittels heterologer Expression aus einem erfindungsgemäßen, transgenen Organismus oder aus einem Organismus, der MAP-Kinase enthält, isoliert werden, beispielsweise aus einem Pilz, hierbei bevorzugt phytopathogenen Pilz, hierbei besonders bevorzugt Fusarium-Spezies wie Fusarium dimerium, Fusarium merismoides, Fusarium lateritium, Fusarium decemcellulare, Fusarium poae, Fusarium tricinctum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium chlamydosporum, Fusarium moniliforme, Fusarium proliferatum, Fusarium anthophilum, Fusarium subglutinans, Fusarium nygamai, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Fusarium culmorum, Fusarium sambucinum, Fusarium crookwellense, Fusarium avenaceum ssp. avenaceum, Fusarium avenaceum ssp. aywerte, Fusarium avenaceum ssp. nurragi, Fusarium hetrosporum, Fusarium acuminatum ssp. acuminatum, Fusarium acuminatum ssp. armeniacum, Fusarium longipes, Fusarium compactum, Fusarium equiseti, Fusarium scripi, Fusarium polyphialidicum, Fusarium semitectum, Fusarium beomiforme, ganz besonders bevorzugt Fusarium graminearum oder Spezies mit einem ähnlichen oder anlaogen Infektionsmechanismus. Beispiele für weitere Organismen, aus denen bevorzugt Polypeptide mit MAP- Kinase-Aktivität isoliert werde kann, sind:
Alternaria kikuchiana, Alternaria mali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beticola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpophilum, Cochliobolus heterostrophus, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum heterostrophus, Colletotrichum lagenarium, Corynespora melonis, Diaporthe citri, Diplocarpon rosae, Elsinoe fawcetti, Erisyphe graminis, Leveillila taurica, Fusalium nivale, Gloedes pomigena, Gloesporium kaki, Glomerella cingulata, Gymnosporangium yamadae, Leptothyrium pomi, Magnaporthe grise, Mycoshpaerella pomi, Mycoshpaerella nawae, Neurospora crassa, Peronospora destructor, Peronospora spinaciae, Phaeoisariopsis vitis, Phyllactinia kakicola, Physalospora canker, Phytophthora citrophithora, Phytophthora investans, Phytophthora porri, Plasmopora viticola, Podosphaera leucotricha, Podosphaera tridactyla, Pomophis sp., Pseudocercorsporella herpotrichoides, Pseudoperonospora cubensis, Puccinia allii, Puccinia recondita, Puccinia horiana, Pyricularia oryzae, Uncinula necator, Sclerotinia cinerea, Sclerotinia mali, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria tritici, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerotheca humuli, Sphaerotheca pannosa, Spaceloma ampelina, Stagnospora nodorum, Typhula ishikariensis, Typhula incarnata, Ustilago maydis, Venturia inaequalis, Venturia nashicola. Weitere bevorzugte Pilzstämme sind Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Beauveria, Pyrenophora teres, Saccharomyces (z. Bsp. Saccharomyces cerevisiae), Pichia (z. Bsp. Pichia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria oder weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) beschriebene Pilze.
Die in Schritt c) beschriebene Detektion von Inhibitoren des Polypeptides kann anhand von Techniken, welche die Wechselwirkung zwischen Protein und Ligand aufzeigen, erfolgen. Das durch die weiter oben beschriebenen erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodierte Polypeptid wird hier im folgenden als erfindungsgemäßes Polypeptid bezeichnet. Hierbei sind insbesondere drei bevorzugte Ausführungsformen zu nennen, die in Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung ebenfalls auch für Hochdurchsatzmethoden (High Througput Screening oder HTS) geeignet sind:

1. Über Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 11753-11575) läßt sich die durchschnittliche Diffusionsrate eines Fluoreszenzmoleküls in Abhängigkeit zur Masse in einem kleinen Probenvolumen bestimmen. Durch Messen der Massenänderung bzw. der daraus resultierenden veränderten Diffunsionsrate einer Testverbindung beim Binden an das erfindungsgemäße Polypeptid läßt sich FCS zur Bestimmung von Protein-Ligand-Wechselwirkungen einsetzten. Ein Assay kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten chemischen Verbindung aufgebaut werden. Alternativ kann der Assay so konzipiert sein, dass die durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch zu testende weitere chemische Verbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay"). Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Verbindungen sind prinzipiell als Inhibitoren geeignet.
2. Die Fluoreszenzpolarisation nutzt die Eigenschaft eines mit polarisiertem Licht angeregten ruhenden Fluorophors ebenfalls wieder polarisiertes Licht zu emittieren. Kann der Fluorophor allerdings während des angeregten Zustands rotieren, so geht die Polarisation des emittierten Fluoreszenzlichts mehr oder weniger verloren. Bei sonst gleichen Bedingungen (z. B. Temperatur, Viskosität, Lösungsmittel) ist die Rotation eine Funktion der Molekülgröße, womit man über das Meßsignal eine Aussage über die Größe des am Fluorophor gedundenen Rests treffen kann (Methods in Enzymology 246 (1995), pp. 283-300). Ein Assay kann direkt zur Messung der Bindung einer durch ein Fluoreszenzmolekül markierten chemischen Verbindung aufgebaut werden. Alternativ kann der Assay so konzipiert sein, dass die durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch zu testende weitere chemische Verbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay"). Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden chemischen Verbindungen sind prinzipiell als Inhibitoren geeignet.
3. Fluoreszenz-Resonanz Energie Tranfer" (FRET) basiert auf der strahlungslosen Energieübertragung zwischen zwei räumlich benachbarten Fluoreszenzmolekülen unter geeigneten Bedingungen. Eine Voraussetzung ist die Überlappung des Emissionsspektrums des Donormoleküls mit dem Anregungsspektrum des Akzeptormoleküls. Durch Fluoreszenzmarkierung von Targetprotein und den auf Bindung zu testenden chemischen Verbindungen kann mittels FRET die Bindung gemessen werden (Cytometry 34, 1998, pp. 159-179). Alternativ kann der Assay so konzipiert sein, dass die durch ein Fluoreszenzmolekül markierte chemische Referenzverbindung durch zu testende weitere chemische Verbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay"). Eine besonders geeignete Ausführungsform der FRET Technologie ist die "Homogenous Time Resolved Fluorescence" (HTRF), wie sie von Packard BioScience vertrieben wird. Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden chemischen Verbindungen sind möglicherweise als Inhibitoren geeignet.
4. Surface Enhanced-Laser Desorption/Ionisation (SELDI) in Kombination mit einem Time of Flight Massenspektrometer (MALDI- TOF) ermöglicht die schnelle Analyse von Molekülen auf einem Träger und kann zur Analyse von Protein-Ligand Wechselwirkungen verwendet werden (Worral et al., (1998) Anal. Biochem. 70: 750-756). In einer bevorzugten Ausführungsform verknüpft man nun das erfindungsgemäße Polypeptid auf einem geeigneten Träger immobilisiert und inkubiert diesen mit der Testerbindung. Nach einem oder mehreren geeigneten Waschschritten kann die an das Protein zusätzlich gebundenen Moleküle der Testverbindung mittels der oben erwähnten Methodik detektieren und somit mögliche Inhibitoren selektieren. Die so identifizierten, an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Verbindungen sind prinzipiell als Inhibitoren geeignet.
5. Die Messung von Oberflächen Plasmonenresonanz basiert auf der Änderung des Brechnungsindexes an einer Oberfläche beim Binden einer chemischen Verbindung an ein auf besagter Oberfläche immobilisiertesn Protein. Da die Änderung des Brechungsindex für eine definierte Änderung der Massenkonzentration an der Oberfläche quasi für alle Proteine und Polypeptide identisch ist, kann diese Methode prinzipiell auf jedes Protein angewendet werden (Lindberg et al. Sensor Actuators 4 (1983) 299-304; Malmquist Nature 361 (1993) 186-187). Die Messung kann beipielsweise mit Hilfe der von Biacore (Freiburg) vertriebenen auf Oberflächen-Plasmonenresonanz basierenden Analyseautomaten in einem Durchsatz von derzeit bis zu 384 Proben pro Tag durchgeführt werden. Ein Assay kann direkt zur Messung der Bindung einer chemischen Verbindung an das Protein aufgebaut werden. Alternativ kann der Assay so konzipiert sein, dass eine chemische Referenzverbindung durch zu testende weitere chemische Verbindungen verdrängt wird ("Verdrändungsassay"). Die so identifizierten an das erfindungsgemäße Polypeptid bindenden Verbindungen sind prizipiell als Inhibitoren geeignet.

Auch besteht die Möglichkeit, über Aufklärung der dreidimensionalen Struktur des erfindungsgemäßen Polypeptides mittels Röntgenstrukturanalyse oder Aussagen über die mögliche Tertiärstruktur mittels Strukturvorhersage weitere potentielle fungizide Wirkstoffe mittels "Molecular Modelling" zu detektieren. Die Herstellung von für die Röntgenstrukturanalyse benötigten Proteinkristallen sowie die entsprechenden Messungen und anschließenden Auswertungen besagter Messungen sowie die Methodik des "Molecular Modelling" sind dem Fachmann bekannt. Über "Molecular Modelling" ist prinzipiell auch eine Optimierung der über die oben genannten Verfahren identifizierten Wirkstoffe möglich.
Eine Ausführungsform eines in vitro Verfahrens zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung, welche die MAP-Kinase Aktivität in phytopathogenen Pilzen inhibieren, bestehet aus den folgenden Schritten:

a) der Herstellung von Organismen, die nach Transformation mit einer erfindungsgemäßen Expressionskassette eine zusätzliche Nukleinsäuresequenz enthalten und in der Lage sind, ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer MAP-Kinase überzuexprimieren;
b) das Aufbringen einer Testsubstanz auf den Organismus nach Anspruch a);
c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht-transformierten Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz, wobei solche Substanzen ausgewählt werden, die ein vermindertes Wachstum oder Infektiösistät des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum oder der Infektiösistät des transgenen Organmismus.

Hierbei beträgt der Wachstumsunterschied bzw. der Unterschied bezüglich der Infektiösität in Schritt c) zur Selektion eines Inhibitors mit fungizider Wirkung mindestens 10%, vorzugsweise mindestens 20%, bevorzugt mindestens 30%, besonders bevorzugt 40% und ganz besonders bevorzugt mindestens 50%.
Der transgene Organismus kann hierbei aus der Gruppe der Bakterien, Hefen, Algen, Pilze auch eukaryontische Zellinien ausgewählt sein, wobei innerhalb der Bakterien die Gattungen Escherichia, Erwinia, Flavobacterium, Alcaligenes oder Cyanobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis oder Anabena bevorzugt sind.
Bevorzugte Pilze sind die bereits oben genannten Spezies Alternaria kikuchiana, Alternaria mali, Alternaria solani, Ashbya gossypii, otrytis cinerea, Cercospora beticola, Cercospora fuligena, Cercospora kaki, Cladosporum carpophilum, Cochliobolus heterostrophus, Colletotrichum fragariae, Colletotrichum heterostrophus, Colletotrichum lagenarium, Corynespora melonis, Diaporthe citri, Diplocarpon rosae, Elsinoe fawcetti, Erisyphe graminis, Leveillila taurica, Fusalium nivale, Gloedes pomigena, Gloesporium kaki, Glomerella cingulata, Gymnosporangium yamadae, Leptothyrium pomi, Magnaporthe gnise, Mycoshpaerella pomi, Mycoshpaerella nawae, Neurospora crassa, Peronospora destructor, Peronospora spinaciae, Phaeoisariopsis vitis, Phyllactinia kakicola, Physalospora canker, Phytophthora citrophithora, Phytophthora investans, Phytophthora porri, Plasmopora viticola, Podosphaera leucotricha, Podosphaera tridactyla, Pomophis sp., Pseudocercorsporella herpotrichoides, Pseudoperonospora cubensis, Puccinia allii, Puccinia recondita, Puccinia horiana, Pyricularia oryzae, Uncinula necator, Sclerotinia cinerea, Sclerotinia mali, Sclerotinia sclerotiorum, Septoria tritici, Sphaerotheca fuliginea, Sphaerotheca humuli, Sphaerotheca pannosa, Spaceloma ampelina, Stagnospora nodorum, Typhula ishikariensis, Typhula incarnata, Ustilago maydis, Venturia inaequalis, Venturia nashicola. Weitere bevorzugte Pilzstämme sind Aspergillus, Trichoderma, Neurospora, Beauveria, Pyrenophora teres, Saccharomyces (z. Bsp. Saccharomyces cerevisiae), Pichia (z. Bsp. Pichia pastoris, Pichia methanolica), Magnaporthe, Pyrialeria, die eingangs erwähnten Pilze der Gattung Fusarium sowie weitere in Indian Chem Engr. Section B. Vol 37, No 1, 2 (1995) beschriebene Pilze, bevorzugt die eingangs erwähnten Pilze der Gattung Fusarium sowie Pilze mit einem ähnlichen oder analogen Infektionsverhalten.
Sämtliche, über die oben genannten Verfahren identifizierten Substanzen können anschließend in einem weiteren in vivo Aktivitätstest auf ihre fungizide Wirkung überprüft werden. Eine weitere Möglichkeit besteht darin, die entsprechende Substanz mit einer Kultur eines pathogenen Pilzes, bevorzugt einer Kultur eines phytopathogenen Pilzes, besonders bevorzugt einer Kultur einer Fusarium-Art zu inkubieren, wobei die fungizide Wirkung z. B. über eingeschränktes Wachstum festgestellt werden kann entweder visuell oder photometrisch.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung sind MAP-Kinase inhibierende Verbindungen mit fungizider Wirkung identifiziert nach den oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Verfahren, wobei die Substanzen einen IC₅₀-Wert kleiner 0,1 mM, bevorzugt < 0,01 mM besonders bevorzugt < 0,001 mM ganz besonders bevorzugt < 0,0001 mM, optimal < 0,00001 mM aufweisen.
Die über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen können ihre Wirkung z. B. als Substratanaloga, Antagonisten, Agonisten, Liganden, regulatorische Effektoren in kompetetiver, nicht-kompetetiver, unkompetetiver oder allosterischer Weise am Target Protein entfalten.
Die über die oben genannten Verfahren identifizierten Verbindungen können auch in Form ihrer landwirtschaft brauchbaren Salze vorliegen.
Unter landwirtschaftlich brauchbaren Salzen kommen vor allem die Salze derjenigen Kationen oder die Säureadditionssalze derjenigen Säuren in Betracht, deren Kationen beziehungsweise Anionen die fungizide Wirkung der über die erfindungsgemäßen Verfahren identifzierten Verbindungen mit fungizider Wirkung nicht negativ beeinträchtigen. So kommen als Kationen insbesondere die Ionen der Alkalimetalle, vorzugsweise Natrium und Kalium, der Erdalkalimetalle, vorzugsweise Calcium, Magnesium und Barium, und der Übergangsmetalle, vorzugsweise Mangan, Kupfer, Zink und Eisen, sowie das Ammoniumion, das gewünschtenfalls ein bis vier C₁-C₄-Alkyl- substituenten und/oder einen Phenyl- oder Benzylsubstituenten tragen kann, vorzugsweise Diisopropylammonium, Tetramethylammonium, Tetrabutylammonium, Trimethylbenzylammonium, des weiteren Phosphoniumionen, Sulfoniumionen, vorzugsweise Tri(C₁-C₄-alkyl)sulfonium und Sulfoxoniumionen, vorzugsweise Tri(C₁-C₄-alkyl)sulfoxonium, in Betracht. Anionen von brauchbaren Säureadditionssalzen sind in erster Linie Chlorid, Bromid, Fluorid, Hydrogensulfat, Sulfat, Dihydrogenphosphat, Hydrogenphosphat, Phosphat, Nitrat, Hydrogencarbonat, Carbonat, Hexafluorosilikat, Hexafluorophosphat, Benzoat, sowie die Anionen von C₁-C₄-Alkansäuren, vorzugsweise Formiat, Acetat, Propionat und Butyrat.
Sämtliche, über die oben genannten verfahren identifizierten Verbindungen liegen sofern sie asymmetrisch substituierte α-Kohlenstoffatome enthalten und über chemische Sythese hergestellt wurden, entweder als Racemate, Enantiomerengemische, oder als reine Enantiomere vor und könne, sofern sie chirale Substituenten aufweisen, auch als Diastereomerengemische vorliegen.
Die identifizierten Substanzen können chemisch synthetisierte oder mikrobiologisch produzierte Stoffe sein und z. B. in Zellextrakten von z. B. Pflanzen, Tieren oder Mikroorganismen auftreten. Das Reaktionsgemisch kann ein zellfreier Extrakt sein oder eine Zelle oder Zellkultur umfassen. Geeignete Methoden sind dem Fachmann bekannt und werden z. B. allgemein beschrieben in Alberts, Molecular Biology the cell, 3^rd Edition (1994), z. B. Kapitel 17. Die genannten Stoffe können z. B. zu dem Reaktionsgemisch oder dem Kulturmedium zugegeben werden oder den Zellen injiziert werden oder auf eine Pflanze gesprüht werden.
Wenn eine Probe, die ein nach der erfindungsgemäßen Methode aktive Substanz beinhaltet, identifiziert wurde, dann ist es entweder möglich, den Stoff direkt von der ursprünglichen Probe zu isolieren oder man kann die Probe in verschiedene Gruppen teilen, z. B. wenn sie aus einer Vielzahl von verschiedenen Komponenten besteht, um so die Zahl der verschiedenen Substanzen pro Probe zu reduzieren und dann das erfindungsgemäße Verfahren mit einer solchen "Unterprobe" der ursprünglichen Probe zu wiederholen. Abhängig von der Komplexität der Probe können die oben beschriebenen Schritte mehrmals wiederholt werden, vorzugsweise bis die gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Probe nur noch eine geringe Anzahl von Substanzen oder nur noch eine Substanz umfaßt. Vorzugsweise wird der gemäß der erfindungsgemäßen Methode identifizierte Stoff oder Derivate davon weiter formuliert, so, daß er für die Anwendung in der Pflanzenzüchtung oder Pflanzenzell- oder Gewebekultur geeignet ist.
Die Stoffe, die gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren getestet und als MAP-Kinase inhibierende Substanzen identifiziert wurden, können sein: Expressionsbibliotheken, z. B. cDNA-Expressionsbibliotheken, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Antikörper, kleine organische Stoffe, Hormone, PNAs oder ähnliches (Milner, Nature Medicin 1 (1995), 879-880; Hupp, Cell. 83 (1995), 237-245; Gibbs, Cell. 79 (1994), 193-198 und darin zitierte Referenzen). Diese Stoffe könne auch funktionelle Derivate oder Analogon der bekannten Inhibitoren oder Aktivatoren sein. Verfahren zur Herstellung von chemischen Derivaten oder Analogon sind dem Fachmann bekannt. Die genannten Derivate und Analogon können gemäß Verfahren nach dem Stand der Technik getestet werden. Weiterhin kann computergestütztes Design oder Peptidomimetics zur Herstellung geeigneter Derivate und Analogon verwendet werden. Die Zelle oder das Gewebe, die/das für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden kann, ist vorzugsweise eine erfindungsgemäße Wirtszelle, Pflanzenzelle oder ein Pflanzengewebe, wie in den oben genannten Ausführungsformen beschrieben.
Sämtliche, über die erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Verbindungen werden im folgenden der Einfachheit halber als fungizide Wirkstoffe bezeichnet.
Fungizide Mittel, welche die fungiziden Wirkstoffe enthalten, bekämpfen die phytopathogene Pilze sehr gut, insbesonders Pilze der eingangs erwähnten Gattung Fusarium sowie Pilze mit einem änlichen oder analogen Infektionsverhalten besonders bei hohen Aufwandmengen.
In Abhängigkeit von der jeweiligen Applikationsmethode können die im erfindungsgemäßen Verfahren identifizierten Substanzen bzw. sie enthaltende Zusammensetzungen vorteilhaft zur Beseitigung der eingangs bereits erwähnten phytopathogenen Pilze verwendet werden.
Weiter Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer fungiziden Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man einen fungiziden Wirkstoff oder ein landwirtschaftlich brauchbares Salz des fungiziden Wirkstoffes mit entsprechenden Hilfsmitteln formuliert.
Die erfindungsgemäßen fungiziden Wirkstoffe können z. B. in Form von direkt versprühbaren wässrigen Lösungen, Pulvern, Suspensionen, auch hochprozentigen wäßrigen, öligen oder sonstigen Suspensionen bzw. Suspoemulsionen oder Dispersionen, Emulsionen, Öldispersionen, Pasten, Stäubemitteln, Streumitteln oder Granulaten formulierut werden und durch Versprühen, Vernebeln, Verstäuben, Verstreuen oder Gießen angewendet werden. Die Anwendungsformen richten sich nach den Verwendungszwecken und der Natur des verwendeten Wirkstoffes; sie sollten in jedem Fall möglichst die feinste Verteilung der erfindungsgemäßen Wirkstoffe gewährleisten. Die fungiziden Zusammensetzung enthalten eine fungizid wirksame Menge mindestens eines fungiziden Wirkstoff oder eines landwirtschaftlich brauchbaren Salzes eines fungiziden Wirkstoff und für die Formulierung von Pflanzenschutzmitteln übliche Hilfsstoffe.
Zur Herstellung von Emulsionen, Pasten oder wässrigen oder ölhaltigen Dispersionen können die fungiziden Wirkstoffe in einem einem Öl oder Lösungsmittel gelöst oder dispergiert werden, wobei weitere Formulierungshilfsstoffen zur Homogenisierung zugesetzt werden können. Es können aber auch aus fungiziden Wirkstoff sowie und eventuell Lösungsmittel oder Öl sowie optional weiteren Hilfsmitteln bestehende flüssige oder feste Konzentrate hergestellt werden, die zur Verdünnung mit Wasser geeignet sind. Hier zu nennen sind Emulsionskonzentrate (EC, EW), Suspensionen (SC), lösliche Konzentrate (SL), Pasten, Pastillen netzbaren Pulvern oder Granulaten, wobei die festen Formulierungen entweder in Wasser löslich (soluble) oder dispergierbar (wettable) sein können. Desweiteren können entsprechende Pulver bzw. Granulate oder Tabletten noch mit einem festen, den Abrieb oder eine vorzeitige Wirkstofffreisetzung verhinderenden Überzug ("coating") versehen werden.
Prinzipiell sind unter dem Begriff Hilfsmittel folgende Substanzklassen zu verstehen: Antischäumungsmittel, Verdicker, Netz-, Haft-, Dispergier- oder Emulgiermittel, Bakterizide sowie thixotrophe Agentien verstehen. Die Bedeutung der oben genannten Mittel ist dem Fachmann bekannt, und beispielsweise in beschrieben.
SLs, EWs und ECs können durch einfaches Mischen der entsprechenden Inhaltsstoffe hergestellt werden, Pulver über Mischen oder vermahlen in speziellen Mühlentypen (z. Bsp. Hammermühlen). SCs und SEs werden üblicherweise über Naßvermahlung ("wet milling") hergestellt, wobei ein SE aus einem SC durch Zugabe einer organischen Phase enthaltend weitere Hilfsmittel oder Wirkstoffe hergestellt werden kann. Die Herstellung ist bekannt. Granulate, z. B. Umhüllungs-, Imprägnierungs- und Homogengranulate können durch Bindung der Wirkstoffe an feste Trägerstoffe hergestellt werden. Feste Trägerstoffe sind beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe. Details der Herstellung sind dem Fachmann bekannt, und z. Bsp. in folgenden Schriften aufgeführt: US 3,060,084, EP-A 707445 (für flüssige Konzentrate), Browning, "Agglomeration", Chemical Engineering, Dec. 4, 1967, 147-48, Perry's Chemical Engineer's Handbook, 4th Ed., McGraw-Hill, New York, 1963, pages 8-57 und ff. WO 91/13546, US 4,172,714, US 4,144,050, US 3,920,442, US 5,180,587, US 5,232,701, US 5,208,030, GB 2,095,558, US 3,299,566, Klingman, Weed Control as a Science, John Wiley and Sons, Inc., New York, 1961, Hance et al., Weed Control Handbook, 8th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1989 und Mollet, H., Grubemann, A., Formulation technology, Wiley VCH Verlag GmbH, Weinheim (Federal Republic of Germany), 2001.
Inerte flüssige und/oder feste Trägerstoffe geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z. Bsp. flüssige Zusatzstoffe wie Mineralölfraktionen von mittlerem bis hohem Siedepunkt, wie Kerosin oder Dieselöl, ferner Kohlenteeröle sowie Öle pflanzlichen oder tierischen Ursprungs, aliphatische, cyclische und aromatische Kohlenwasserstoffe, z. B. Paraffin, Tetrahydronaphthalin, alkylierte Naphthaline oder deren Derivate, alkylierte Benzole oder deren Derivate, Alkohole wie Methanol, Ethanol, Propanol, Butanol, Cyclohexanol, Ketone wie Cyclohexanon oder stark polare Lösungsmittel, z. B. Amine wie N-Methylpyrrolidon oder Wasser.
Oberflächenaktive Stoffe (Tenside) geeignet für die erfindungsgemäßen Formulierungen sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, wie z. Bsp. Alkali-, Erdalkali-, Ammoniumsalze von aromatischen Sulfonsäuren, z. B. Lignin-, Phenol-, Naphthalin- und Dibutylnaphthalinsulfonsäure, sowie von Fettsäuren, Alkyl- und Alkylarylsulfonaten, Alkyl-, Laurylether- und Fettalkoholsulfaten, sowie Salze sulfatierter Hexa-, Hepta- und Octadecanolen sowie von Fettalkoholglykolether, Kondensationsprodukte von sulfoniertem Naphthalin und seiner Derivate mit Formaldehyd, Kondensationsprodukte des Naphthalins bzw. der Naphthalinsulfonsäuren mit Phenol und Formaldehyd, Polyoxyethylenoctylphenolether, ethoxyliertes Isooctyl-, Octyl- oder Nonylphenol, Alkylphenyl-, Tributylphenylpolyglykolether, Alkylarylpolyetheralkohole, Isotridecylalkohol, Fettalkoholethylenoxid-Kondensate, ethoxyliertes Rizinusöl, Polyoxyethylenalkylether oder Polyoxypropylenalkylether, Laurylalkoholpolyglykoletheracetat, Sorbitester, Lignin-Sulfitablaugen oder Methylcellulose.
Pulver-, Streu- und Stäubemittel können als feste Trägerstoffe vorteilhaft durch Mischen oder gemeinsames Vermahlen der wirksamen Substanzen mit einem festen Trägerstoff hergestellt werden.
Feste Trägerstoffe geeignet für erfindungsgemäße Granulate sind dem Fachman in einer Vielzahl bekannt, beispielsweise Mineralerden wie Kieselsäuren, Kieselgele, Silikate, Talkum, Kaolin, Kalkstein, Kalk, Kreide, Bolus, Löß, Ton, Dolomit, Diatomeenerde, Calcium- und Magnesiumsulfat, Magnesiumoxid, gemahlene Kunststoffe, Düngemittel, wie Ammoniumsulfat, Ammoniumphosphat, Ammoniumnitrat, Harnstoffe und pflanzliche Produkte wie Getreidemehl, Baumrinden-, Holz- und Nußschalenmehl, Cellulosepulver oder andere feste Trägerstoffe.
Die Konzentrationen der fungiziden Wirkstoffe in den anwendungsfertigen Zubereitungen können in weiten Bereichen variiert werden und hängt von der Art der jeweiligen Formulierung ab (s. unten stehende Tablle). Die in der unten stehenden Tabelle aufgezählten Angaben ergänzen sich jeweils zu 100%.
Die Applikation der fungiziden Zusammensetzungen bzw. der Wirkstoffe kann im curativ, eradikativ oder protektiv erfolgen.
Die Aufwandmengen an fungiziden Wirkstoff (= Substanze und/oder Mittel) betragen je nach Bekämpfungsziel, Jahreszeit, Zielpflanzen und Wachstumsstadium 0.001 bis 3.0, vorzugsweise 0.01 bis 1.0 kg/ha.
Des weiteren können die oben genannten SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 als Ausgangsbasis für die Detektion und Isolation von funktionellen Analoga der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 aus anderen Pilzspezies aufgrund von Seguenzhomologien verwendet werden. Hierbei wird ein Teil oder die gesamte Sequenz der entsprechenden SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 als Sonde zum Screening in einer genomischen oder cDNA Bank des entsprechenden Pilzes oder in einer Computer-Recherche nach analogen Sequenzen in elektronischen Datenbanken verwendet.
Vorzugsweise werden bei Teilen der Sequenz konservierte Bereiche der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 verwendet, und zwar für die SEQ ID NO: 1 der Abschnitt 281-556 bp und für die SEQ ID NO: 2 der Abschnitt 218 bp bis 419 bp.
Die Herstellung dieser Sonden sowie die Durchführung der Experimente ist bekannt. Sie kann zum Beispiel über die gezielte Herstellung radioaktiver oder nicht radioaktiver Sonden mittels PCR und der Verwendung von entsprechend markierten Oligonukleotiden erfolgen mit anschließenden Hybridisierungsexperimenten. Die hierfür erforderlichen Technologien sind beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) aufgeführt.
Die entsprechenden Sonden können weiterhin mittels Standardtechnologien (Lit. SDM bzw. random Mutagenesis) so modifiziert werden, dass sie für weitere Zwecke eingesetzt werden können, z. Bsp. als Sonde, die spezifisch zu mRNA sowie den entsprechenden codierenden Sequenzen hybridisiert zwecks Analyse der entsprechenden Sequenzen in anderen Organismen. Anwendungen dieser Sonden sind die Analyse eventuell veränderter Expressionsprofile der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 in diversen Pilzen, bevorzugt phytopathogenen Pilzen, besonders phytopathogenen Pilzen der Gattung Fusarium, ganz besonders bevorzugt Fusarium graminearum in Verbindung mit bestimmten Faktoren wie erhöhter Resistenz gegenüber Fungizide, der Detektion des Pilzes in Pflanzenmaterial sowie Detektion von entstehenden Resistenzen.
Die Erhöhung der Resistenz gegen ein Fungizid, welches MAP-Kinasen als Target hat, basiert häufig auf Mutation, z. B. dem Austausch von Aminosäuren verursacht durch eine Mutation in der Nukleinsäuresequenz, an für die Substratspezifität essentiellen Stellen wie z. B. im Bereich des aktiven Zentrum oder an anderen Stellen des Proteins, welche die Bindung des Substrates beeinflussen. Aufgrund der vorstehend beschriebenen Veränderungen kann die Bindung des als Fungizid wirkenden Inhibitors an das Zielprotein, hier MAP-Kinasen erschwert oder gar verhindert werden, so dass eine eingeschränkte oder keine fungizide Wirkung in den entsprechenden Kulturen zu beobachten ist.
Da die hierbei auftretenden Veränderungen oft nur wenige Basenpaare umfassen, können die oben beschriebenen Sonden basierend auf den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 oder einen wie oben beschriebenen funktionellen Äquivalent wie oben beschrieben zur Detektion von entsprechend mutierten MAP-Kinase-Nukleinsäuresequenzen in vollständig oder partiell resistenter phytopathogener Pilze verwendet werden.
Nach Isolation des enstprechenden MAP-Kinase-Gens oder Genabschnitt aus dem entsprechenden resistenten Pilz mittels der oben erwähnten Sonden gefolgt von Sequenzierung und Vergleich mit der entsprechenden Wildtyp-Nukleinsäuresequenz stehen für die Analytik prinzipiell zwei Methoden zur Verfügung:

1. Mittels gängiger Methoden werden zwei Primerpaare konstruiert, wobei das erste komplementär zu der Wildtypsequenz ist, das zweite komplementär zu der entsprechend mutierten Sequenz. Über PCR kann nun die entsprechend mutierte Spezies quantitativ und qualitativ nachgewiesen werden.
2. Durch die Veränderung der Basenabfolge können Restriktionsenzymschnittstellen entstehen oder verschwinden. Der entsprechende Bereich wird mittels flankierender Primer amplifiziert und im Anschluß mit dem oder den entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut, wodurch das Vorhandensein der entsprechenden Mutation nachgewiesen werden kann.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt.
Im Folgenden werden kurz die gentechnische Verfahren, die den folgenden Ausführungsbeispielen zugrunde liegen, beschrieben:
Klonierungsverfahren wie z. B. Restriktionsspaltungen, DNA-Isolierung, Agarose-Gelelektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylon Membranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Sequenzanalyse rekombinanter DNA sowie Southern und Western Blots wurden wie in Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) und Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994); ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.
Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli DH5α) wurden von BRL Gibco, oder Invitrogen, Carlsberg, CA bezogen. Zur Klonierung wurden der Klonierungskit pGEMT-T (der Fa. Promega, Madison, Wisconsin, USA) und pAN7-1 M (entspricht dem Expressionsvektor pAN7-1 Punt et al., Gene 56 (1987) 117-124 bzw. z. Bsp. Medline Nukleotiddatenbank-Nummer: gi: 475166 mit einem Basenaustausch an der Position 2649 (C gegen A)) verwendet.
Des weiteren wurden alle, im Folgenden verwendeten Chemikalien, sofern nicht anders erwähnt, in p. A. Qualität von den Firmen Fluka (Neu-Ulm), Merck (Darmstadt), Roth (Karlsruhe), Serva (Heidelberg) sowie Sigma (Deisenhofen) bezogen. Lösungen wurden mit aufbereitetem, pyrogenfreiem Wasser, im weiteren Text als H₂O bezeichnet, aus einer Milli-Q Water System Wasseraufbereitungsanlage (Millipore, Eschborn) angesetzt. Restriktionsenzyme, DNA-modifizierende Enzyme und molekularbiologische Kits wurden von den Firmen AGS (Heidelberg), Amersham (Braunschweig), Biometra (Göttingen), Roche (Mannheim), Genomed (Bad Oeynnhausen), New England Biolabs (Schwalbach/Taunus), Novagen (Madison, Wisconsin, USA), Perkin-Elmer (Weiterstadt), Promega (Madison, Wisconsin, USA), Pharmacia (Freiburg) Qiagen (Hilden) und Stratagene (Heidelberg) bezogen. Sie wurden, soweit nicht anders erwähnt, nach Herstellerangaben verwendet.
Alle für die gentechnischen Experimente verwendeten Medien und Puffer wurden entweder über Sterilfiltration oder Erhitzen im Autoklaven sterilisiert.

Beispiel 1

Isolation von zwei MAPK-Fragmenten aus genomischer DNA von F. graminearum

Für die Isolation der MAP-Kinasen aus der genomischen DNA des F. graminearum Wildtyp (WT)-Stammes 8/1 wurden zwei degenerierte Primerpaare verwendet, die aus unterschiedlichen Aminosäureregionen konserviert innerhalb verschiedener MAPKs (Hanks und Quinn, 1991 Methods Enzymol. 200: 38-62) entwickelt wurden:
Primer 1 (5'-CCAICKIGTNGCIACRTAYTC-3') und
Primer 4 (5'-AYYTCIGGIGCICKRTAVYA-3') aus der konservierten Region der Domaine VIII der MAP-Kinasen sowie
Primer 2 (5'-GCITAYGGIRTNGTNTG-3') aus der konservierten Region der Domaine I der MAP-Kinasen und
Primer 3 (5'-GTIGCNATRAARAAPAT-3') aus der konservierten Region der Domaine II der MAP-Kinasen.
Hierfür wurde zunächst eine PCR mit Taq-Polymerase nach Herstellerangaben mit den Primern 2 und 4 (Konzentrationsbereich ca. 6-7 µM) mit genomischer WT-DNA durchgeführt (1. Schritt: 5 min bei 94°C; 2-41. Schritt: 1 min bei 94°C, 1 min bei 50°C, 1 min bei 72°C; 42. Schritt: 10 min bei 72°C). Das Produkt dieser PCR-Reaktion diente in einer zweiten nested PCR-Reaktion basierend auf dem gleichen Programm mit den Primern 1 und 3 (Konzentrationsbereich ca. 11-20 µM) als Template.
Die hierbei entstandenen 556 bp- und 490 bp-Fragmente wurden aus einem präparativen Agarosegel eluiert, in den Vektor pGEMT nach den Herstellerangaben ligiert und in den E. coli-Stamm DH5α transformiert, wobei die Konstrukte pGEMT-1 (enthaltend die SEQ ID NO: 1) und pGEMT-2 (enthaltend die SEQ ID NO: 2) erhalten wurden.
Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI mittels des Big- Dye-Mix (Fa. ABI) nach Herstellerangaben.

Beispiel 2

Konstruktion der Knockout-Vektoren

Bei beiden in den Vektoren pGEMT-1 und pGEMT-2 befindlichen SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 wurde mittels Inverse-PCR mittig eine Schnittstelle eingefügt (Programm für SEQ ID NO: 1: 1. Schritt: 3 min bei 94°C; 2-36. Schritt: 30 sec bei 94°C, 30 sec. bei 43°C, 2 min bei 72°C; 37. Schritt: 10 min bei 72°C; Programm für SEQ ID NO: 2 : 1. Schritt: 4 min bei 94°C; 2-31. Schritt: 1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C, 3 min bei 72°C; 32. Schritt: 10 min bei 72°C). In der SEQ ID NO: 1 wurde eine Pf123II-Schnittstelle mittels eines Austausches von 4 Basen über die Primern NJ 3 (5'-CGTACGGACCTATTTG- TAC-3') und NJ 4 (5'-AAGTTATCGGGTCG-3') an der Stelle 209-227 bp (Austausch gegen die Sequenz GTAC) eingeführt. In der SEQ ID NO: 2 wurde bei Basenpaar 212 eine Schnittstelle für Paul durch Punktmutation (Austausch gegen C) mit den Primern NJ 1 (5'-CAGCGCGC- TAACAAACACTGC-3') und NJ 2 (5'- ATCTTACTACAGCAAAACAG-3'). Die Amplifikation erfolgte aus dem pGEMT-1 und pGEMT-2 mit der Proofreading-Polymerase DeepVent von New England Biolabs nach Herstellerangaben.
Im Anschluß wurde eine bluntend-Ligation des bei der PCR erhaltenen gesamten, linearen Plasmids durchgeführt gefolgt von einer Transformation in den E. coli-Stamm DH5α.
pGEMT-1 und pGEMT-2 wurden mit PvuII verdaut, wobei die Fragmente SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2 aus dem jeweiligen Vektor entfernt wurden. Nach Isolation wurden beide Fragmente jeweils mittels bluntend-Ligation in den mit EheI linearisierten Vektor pAN7-1M eingefügt, wobei die Konstrukte pAN7-1M-1 (enthaltend die SEQ ID NO: 1) und pAN7-1M-2 (enthaltend die SEQ ID NO: 2) erhalten wurden. Der pAN7-1M-Vektor enthält das Hygromycinresistenzgen HPH als) Selektivmarker. Im Anschluß erfolgte die Transformation von pAN7-1M-1 bzw. pAN7-1M-2 in den E. coli DHSα.

Beispiel 3

A) Protoplastierung von F. graminaerum

Für die Protoplastierung des F. graminearum WT-Stammes 8/1 wurde Mycel in Flüssigkultur über 2 Tage bei 28°C und 180 rpm in CM_kompl (nach Leach et al. (J. Gen. Microbiol. 128 (1982) 1719-1729.) inkubiert, zerkleinert und im Anschluß noch einen Tag bei 28°C, 180 rpm inkubiert. Dieses wurde dann zweimal mit destilliertem Wasser gewaschen. 2 g Mycel wurden mit 20 ml 5% Enzym-Osmotikum- Lösung (700 mM NaCl, 5% Driselase, steril) versetzt und 3 h bei 28°C und 100 rpm inkubiert. Die fortschreitende Protoplastierung wurde über Proben mikroskopisch verfolgt. Mittels Filtration wurden die Protoplasten von Mycelrückständen getrennt, pelletiert (3000 rpm, 10 min, 4°C), und nach Waschen mit je 10 ml 700 mM NaCI und SORB-TC (1,2 M Sorbit, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCl, pH 7,0) in 1 ml SORB-TC aufgenommen. Die Konzentration an Protoplasten wurde durch Auszählen unter dem Mikroskop ermittelt.

B) Transformation

Für die nachfolgende Transformation von F. graminearum Protoplasten wurden die Plasmide pAN7-1M-1 bzw. pAN7-1M-2 nach Standardprozeduren isoliert, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. Enguist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1994) beschrieben sind, im Anschluß mit Pf123II bzw. mit Paul mittig linearisiert und auf eine Konzentration von 3 µg/µl eingestellt.
Für die Transformation wurden 10⁷ Protoplasten auf Eis gestellt, mit 30 µg der wie oben beschriebenen hergestellten pAN7-1M-1 bzw. pAN7-1M-2-DNA vorsichtig vermischt und anschließend 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von einem Volumen PEG-TC (60% (w/V) PEG4000, 50 mM CaCl₂, 10 mM Tris/HCl pH 7,0) und anschließender 15minütiger Inkubation auf Eis wurden wurden 8 Volumen - bezogen auf das ursprüngliche Kulturvolumen - SORB-TC Medium hinzugefügt.

C) Selektion der hergestellten Knock Out Transformanden

Diese Lösung wurde mit 400 ml 45°C warmen Regenerationsmedium (1g/l Hefeextrakt, 1 g/l Caseinhydrolysat, 342 g/l Saccharose, 16 g/l Agar) vermischt und in 20 ml Aliquots auf die entsprechende Anzahl Petrischalen mit einem Durchmesser von 90 mm ausgebracht.
Nach 1 Tag Inkubation bei 280C wurden die Petrischalen mit je 10 ml Hygromycin enthaltenden Wasseragar (16 g/l Agar, 300 mg/l Hygromycin) überschichtet und anschließend bei 28°C inkubiert. Mycelkolonien, die durch den Selektionsagar wuchsen, wurden ausgeschnitten und auf CM_Hyg-Platten (CM_kompl-Medium mit 150 mg/l Hygromycin) vereinzelt.

E) Nachweis der Knock out Transformation

Auf SNA-Medium (nach Nirenberg 1981 Can. J. Bot. 59: 1599-1609) unter UV-Licht bei 18°C wurde der Pilz zur Konidiation angeregt. Jeweils eine einzelne Konidie wurde auf eine CMHyg-Platte überführt, wodurch homokaryotische Kulturen erhalten wurden. Im Anschluß wurden von dieser Platte Agarblöckchen mit Mycel ausgeschnitten und in CM_kompl-Medium überführt und bei 28°C, 150 rpm für 48-72 h inkubiert.
Isoliert aus dem Mycel dieser Kulturen wurde je 3 µg DNA enthaltend die SEQ ID NO: 1 (zBsp. PUREGENE DNA Isolationskit von Biozym) mit KpnI (MBI Fermentas) sowie 3 µg DNA enthaltend die SEQ ID NO: 2 mit EcoRV verdaut und im Anschluß mittels Southern Blot unter hochstringenten Bedingungen (68°C) auf die Vektorintegration hin überprüft. Die Sonden wurden mittels PCR aus den Transformationsvektoren pAN7-1M-1 bzw. pAN7-1M-2 amplifiziert und mit DIG-dNTPs markiert. Die folgenden Primer wurden für die Sondenherstellung verwendet:
Im hergestellten Southernblot konnte aufgrund der Verschiebung der Wildtyp-Bande um 733B bp durch Integration des Konsruktes pAN7-1M-1 bzw. um 7272 bp durch Integration des Konstruktes pAN7-1M-2 man erkennen, bei welchen der erhaltenen Transformanden der Transformationsvektor durch homologe Rekombination in das entsprechende MAP-Kinase-Gen integriert wurde. Durch die Unterbrechung des Leserahmens kam es zur Zerstörung des aktiven Gentranskripts. Diese Transformanden werden als KO-Mutanten bezeichnet. Transformanden, die im Southern Blot neben einer wie oben erwähnt verschobenen Bande auch die Wildtyp-Bande aufweisen, haben den Vektor zufallsmäßig, d. h. ektopisch integriert. Bei diesen Transformenden sind die Gen für die MAPKinasen basierend auf den SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 1 noch intakt.

Beispiel 4

Infektionsversuche

Um die Virulenz der Transformanden zu testen wurde Sommerweizen der Sorten Nandu und Munk infiziert. Beide Sorten werden in die Boniturklasse 6 des Bundessortenamtes eingeordnet und sind damit besonders anfällig für die Infektion von F. graminearum.
In jedem Infektionsexperiment wurde als Positivekontrolle eine Infektion mit dem F. geaminearum Wildtypstamm 8/1, aus dem die Transformanden hervorgingen, durchgeführt und als Negativkontrolle eine Inoculation mit reinem Wasser. Zudem wurde in jedem Infektionsexperiment neben den aus dem Southernblot identifizierten KO-Mutanten auch jeweils eine Transformande mit einem ektopisch integrierten pAN7-1M-1- bzw. pAN7-1M-2-Vektor auf Weizen inokuliert.
Für die Infektion wurden Konidien von SNA-Platten (SNA-Medium nach Nirenberg 1981 Can. J. Bot. 59: 1599-1609 enthaltend 22 g Agar) mit Wasser abgewaschen und auf eine Konzentration von 5 × 104 Konidien/ml eingestellt. In der Mitte der Ähre, direkt neben den Fruchtknoten, wurden 10 µl dieser Konidiensuspension inokuliert. Anschließend wurden die Pflanzen mit Wasser besprüht und die einzelnen Ähren wurden in Plastikfolie gehüllt und bis zur sichtbaren Infektion in einer Phytokammer (Tag-/Nachtrhythmus: Tag: 18°C, 16 h, 25 000 Lux; Nacht: 16°C, 8 h) gehalten. Nach 13 Tagen wurden die Infektionen ausgewertet.
Bei der Infektion mit F. geaminearum Wildtypstamm 8/l wurde starkes Mycelwachstum um das infizierte Ährchen, beginnende Bräunung des Ährchens und Ausweitung der Infektion auf Nachbarährchen beobachtet. Die Ergebnisse sind in der unten stehenden Tabelle 1 zusammengefasst.
Aus den oben beschriebenen Ergebnissen folgt, daß die die SEQ ID NO: 1 und 2 enthaltenden MAP-Kinasen für die Pathogenität von F. graminearum essentiell sind, da der Pilz beim Fehlen dieser Gene den Wirt nicht erkennen kann. Er dringt nicht ins pflanzliche Gewebe ein und bildet keine Symptome aus. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nukleinsäure-Sequenzen umfassend:

a) eine Nukleinsäuresequenz mit der in SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 dargestellten Nukleinsäuresequenz; oder

b) funktionelle Äquivalente der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2; oder

c) Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.

d) Nukleinsäuresequenzen enthaltend Teile der Nukleinsäuresequenzen SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2.

2. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1, die aus einem phytopathogenen Pilz stammt.

3. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1 oder 2, die aus einem phytopathogenen Pilz der Gattung Fusarium stammt.

4. Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1, 2 oder 3 die aus dem phytopathogenen Pilz Fusarium graminearum stammt.

5. Expressionskassette enthaltend mindestens Nukleinsäuresequenz gemäß den Ansprüchen 1 bis 4.

6. Expressionskassette nach Anspruch 5, enthaltend

a) genetische Kontrollsequenzen in funktioneller Verknüpfung mit der über Ansprüche 1 bis 4 definierten Nukleinsäure- Sequenz; oder

b) zusätzliche Funktionselemente; oder

c) eine Kombination aus a) und b).

7. Vektor enthaltend eine Expressionskassette nach Anspruch 5 oder 6.

8. Transgener Organismus enthaltend mindestens eine Nukleinsäuresequenz gemäß Anspruch 1, 2, 3 oder 4, eine Expressionskassette gemäß einem der Ansprüchen 5 bis 6 oder einen Vektor gemäß Anspruch 7.

9. Transgener Organismus nach Anspruch 8 ausgewählt aus Bakterien, Hefen, Pilzen, tierischen oder pflanzlichen Zellen.

10. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider Wirkung, dadurch gekennzeichnet, dass man in einem geeigneten Testsystem die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 kodierten Aminosäuresequenz durch Zugabe einer Testsubstanz beeinflußt und solche Substanzen auswählt, die die Tanscription, Expression, Translation oder die Aktivität des Genproduktes reduzieren, inhibieren oder blockieren.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mittels eines Organismus durchgeführt wird.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren mittels eines Organismus nach Anspruch 8 oder 9 durchgeführt wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass

a) eine Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer MAP-Kinase, codiert durch eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 bis 4, entweder in einem transgenen Organismus gemäß Anspruch 8 oder 9 exprimiert wird oder ein Organismus, der naturgemäß ein Polypeptid mit der enzymatischen Aktivität einer MAP-Kinase enthält, kultiviert wird;

b) das im Schritt a) erhaltene Polypeptid in dem ruhenden oder wachsenden Organismus direkt, im Zellaufschluss des transgenen Organismus, in partiell gereinigter Form oder in zur Homogenität gereinigten Form mit einer Testverbindung inkubiert wird;

c) eine chemische Verbindung selektiert wird, welche das Polypeptides ganz oder teilweise inhibiert.

14. Verfahren zur Identifizierung von Substanzen mit fungizider- Wirkung, welche die enzymatische Aktivität einer MAP-Kinase in phytopathogenen Pilzen hemmen, bestehend aus den folgenden Schritten:

a) der Herstellung von Organismen, die nach Transformation mit einer Expressionskassette nach Anspruch 5 oder 6 eine zusätzliche DNA-Sequenz nach Anspruch 1 bis 4 enthalten;

b) das Aufbringen einer Testsubstanz auf den Organismus nach Anspruch a);

c) das Bestimmen des Wachstums oder der Überlebensfähigkeit des transgenen und des nicht-transformierten Organismus nach der Aufbringung der Testsubstanz, wobei solche Substanzen ausgewählt werden, die ein vermindertes Wachstum oder Infektiösität des nicht-transgenen Organismus bewirken verglichen mit dem Wachstum oder der Infektiösität des transgenen Organmismus.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die über das Verfahren identifizierte besagte chemische Verbindung zur Verifizierung der fungiziden Wirkung auf einen phytopathogenen Pilz appliziert wird.

16. Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Identifizierung der Substanzen in einem High- Throughput-Screening durchgeführt wird.

17. Eine chemische Verbindung mit fungizider Wirkung identifizierbar über eins der Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 16.

18. Verfahren zur Herstellung einer fungiziden Zusanunensetzung, dadurch gekennzeichnet dass man

a) einen fungiziden Wirkstoff über eines der Verfahren nach den Ansprüchen 10 bis 16 identifiziert, und

b) den über (a) identifizierten Wirkstoff oder ein landwirtschaftlich brauchbares Salz des über (a) identifizierten Wirkstoffes mit entsprechenden Hilfsmitteln formuliert.

19. Verfahren zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Pflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge einer fungiziden Verbindung nach Anspruch 17 oder einer fungiziden Zusammensetzung hergestellt über das Verfahren nach Anspruch 18 behandelt.

20. Verfahren zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Pflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge einer fungiziden Verbindung mit MAP-Kinase inhibierender Wirkung behandelt.

21. Verwendung einer fungiziden Verbindung nach Anspruch 17 oder einer fungiziden Zusammensetzung hergestellt über das Verfahren nach Anspruch 18 zur Bekämpfung von Schadpilzen, dadurch gekennzeichnet, dass man die Pilze oder die vor Pilzbefall zu schützenden Materialien, Rflanzen, Boden oder Saatgüter mit einer wirksamen Menge einer fungiziden Verbindung nach Anspruch 17 oder einer fungiziden Zusammensetzung hergestellt über das Verfahren nach Anspruch 18 behandelt.

22. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 für ein Verfahren zur Identifizierung von Mutationen in einer für eine MAP-Kinase kodierenden Sequenz bestehend aus

a) der Herstellung von auf einer Nukleinsäuresequenzen nach den Ansprüchen 1 bis 4 basierend Oligonukleotiden enthaltend die Mutation mit anschließender PCR; oder

b) der Herstellung von Oligonukleotiden baisierend auf einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei der die Mutation flankierende Bereich mittels PCR amplifiziert wird, gefolgt von einem Restriktionsverdau.

23. Verwendung des Genproduktes einer Nukleinsäuresequenz nach den Ansprüchen 1 bis 4 als Target zur Ermittlung fungizid wirkender Substanzen.