EP1392819A2 - Keratinocytes obtenus a partir de cellules souches embryonnaires de mammiferes - Google Patents

Keratinocytes obtenus a partir de cellules souches embryonnaires de mammiferes

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EP1392819A2
EP1392819A2 EP02740676A EP02740676A EP1392819A2 EP 1392819 A2 EP1392819 A2 EP 1392819A2 EP 02740676 A EP02740676 A EP 02740676A EP 02740676 A EP02740676 A EP 02740676A EP 1392819 A2 EP1392819 A2 EP 1392819A2
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EP
European Patent Office
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stem cells
cells
embryonic stem
keratinocytes
culture
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Withdrawn
Application number
EP02740676A
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German (de)
English (en)
Inventor
Daniel Aberdam
Christelle Coraux
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
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Publication date
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Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
    • C12N5/0629—Keratinocytes; Whole skin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells

Definitions

  • the present invention relates to a process for obtaining keratinocytes from embryonic mammalian stem cells.
  • a possible therapeutic application of such a process is the reconstitution of tissues derived from keratinocytes, in particular, the manufacture of artificial skin.
  • extracellular matrix or “ECM” is the name generally given to the complex network of extracellular macromolecules with which most of the cells of multicellular organisms are in contact.
  • extracellular matrix and its shape vary depending on the tissue, so that we speak more readily of extracellular matrices, than of the extracellular matrix.
  • extracellular matrices have in common that they are made up of macromolecules which are essentially proteins and polysaccharides secreted locally and which organize themselves to form a three-dimensional network at the intercellular spaces of most tissues.
  • proteoglycans there are for example proteoglycans, fibrous proteins having an essentially structural function such as elastin and collagens, and fibrous proteins having an essentially adhesion function such as fibronectin and laminins.
  • the extracellular matrix is not only a biological "glue”, it also forms highly specialized structures such as cartilage, tendons, laminal basement membrane, skeleton and teeth.
  • extracellular matrices play a critical role in regulating the behavior of the cells with which they are in contact. They are thus involved in phenomena as different as cell development, proliferation, metabolism, shape and 'polarity of cells. Another phenomenon in which extracellular matrices are involved is the differentiation of cells.
  • Embryonic stem cells are derived from totipotent cells of the embryo. They are pluripotent cells capable of differentiating in vivo into any cell type (Bradley et al., Nature 309, 255-256 (1984); Nagy et al., Development 110, 815-821 (1990)) and in vitro in a more limited number of cell types (Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87, 27-45 (1985); shells et al., Biomed. Biochim. Acta 47, 965- 973 (1988) ); Robbins et al., J. Biol. Chem.
  • LIF is a secretion protein which can be supplied by maintaining embryonic stem cells on a feeder layer of cells producing this LIF (EJ Robertson, Tetracarcinomas and Embryonic stem cells: a practical approach, Washington DC, IRL Press (1987 )) or, in the absence of a feeder layer, by adding purified LIF to the culture medium (Pease et al., Exp. Cell. Res. 190, 209-211 (1990)).
  • This differentiation takes place under the effect of the aggregation of embryonic stem cells, leading to the formation of embryoid bodies (three-dimensional structures) from which the cells spontaneously differentiate into different cell types.
  • Rudnicki et al. have described a general method of inducing differentiation of embryonic stem cells known as the "hanging drop method" (Rudnicki et al., "Cell culture ethods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell unes", in Teratocarcinomas and embryonic stem cells: a practical approach, (EJ Robertson, op. cit.), 19-49 (1987), IRL Press, Oxford).
  • the embryonic stem cells in order for the embryonic stem cells to differentiate, it is necessary to form three-dimensional structures called “embryoid bodies" which have been mentioned above. The absence of LIF during this method is necessary to allow the embryonic stem cells to differentiate.
  • the embryoid bodies formed are transferred to bacteriological petri dishes and are kept in suspension for 2 days, in order to avoid their adhesion and promote their growth.
  • the embryoid bodies are then allowed to adhere to cell culture dishes. From the 2 nd day after adhesion, one can observe, within these bodies, different cell types, including beating cells (cardiomyocytes).
  • beating cells cardiomyocytes
  • skeletal and smooth muscle cells, nerve cells, glia cells and derivatives of the hematopoietic system are identified (Rathjen et al., "Properties and uses of embryonic stem cells: prospects for application to human biology and gene therapy ", Jeprod. Fertil. Dev. 10 (1), 31-
  • the present invention aims to provide a method and means for inducing the differentiation of embryonic stem cells into keratinocytes, which make it possible to obtain differentiated keratinocytes more quickly and in greater number, compared to methods of the state of technique.
  • the present invention also aims to provide a method and means for inducing the differentiation of embryonic mammalian stem cells into keratinocytes which are reproducible and reliable.
  • the present invention relates to obtaining keratinocytes from mammalian embryonic stem cells, in particular to a method for inducing the differentiation of mammalian embryonic stem cells into keratinocytes, comprising the following steps: an extracellular matrix secreted by at least one type of mammalian cells, embryonic stem cells of undifferentiated mammalian stem cells are cultured in parallel in an appropriate culture medium, said embryonic stem cells are then seeded in a monolayer on said extracellular matrix or on one or more of its fractions comprising particular constituents, in particular laminin-5, collagen type IV, collagen type I or fibronectins, said embryonic stem cells thus seeded are then cultured, in the absence of the above-mentioned LIF for a sufficient time to obtain the differentiation in keratinocytes, and the keratinocytes thus obtained are collected, isolated and amplified by known cloning techniques (dispase, trypsin, cell sorting).
  • the embryonic stem cells are maintained beforehand in the undifferentiated state in the presence of LIF, preferably at a
  • the induction of differentiation of embryonic stem cells on an extracellular matrix is initiated from 8 days and widely initiated at 15 days. This time factor is in no way limiting and can be accelerated by various methods adaptable by those skilled in the art.
  • MHC major histocompatibility complex
  • the embryonic stem cells seeded on the extracellular matrix are cultured in the presence of BMP-4 and ascorbic acid.
  • Another aspect of the present invention relates to the manufacture of an artificial skin, in particular an epidermal tissue comprising said keratinocytes thus obtained, as well as their use for treating patients victims of thermal wounds (in particular severe burn victims), vascular wounds
  • LJF Leukemia Inhibiting Factor
  • the epithelial lines produce, inter alia, significant amounts of laminin-5, and form in vi tro numerous anchoring structures of the hemidesmosome type (Langhofer M. et al., J. Cell Science 105, 753-764 (1993) ).
  • Embryonic stem cells were also seeded on slides coated only with major constituents of the basal slides (purified laminin-5; purified type IV collagen; purified type I collagen; purified fibronectins).
  • keratinocytes The presence of keratinocytes was evaluated by munofluorescent labeling i with mouse monoclonal antibodies directed against cytokeratins 14 (K14; Sigma) and 5 (Dr. B. Lane, University of Dundee, UK). Cytokeratins 14 and 5 are among the specific intermediate filaments of basal keratinocytes. Embryonic stem cells were cultured on sterile glass slides with or without matrix deposition extracellular. After washing with PBS, the cells were fixed with cold methanol for 10 minutes at -20 ° C.
  • the cells were then washed with PBS before being incubated for one hour with the primary anti-K14 antibody (diluted to l / l00 e in a PBS buffer containing 3 mg / ml of BSA, in a humid chamber) or with l 'primary anti-K5 antibody (diluted 1/5 in the same buffer, in a humid chamber).
  • the slides were incubated for one hour in the dark with a relevant secondary antibody coupled to a label.
  • the coverslips were incubated with a nuclear marker (Hoechst or propidium iodide) diluted to l / l000 e in PBS for 10 minutes protected from light, then mounted on slides after washing with distilled water. All the manipulations were carried out at room temperature. The slides were observed under a "Zeiss Axiophot" microscope.
  • results obtained showed that on an amorphous support, despite spontaneous and anarchic differentiation, the cells do not differentiate into keratinocytes, even after 15 days of culture without LIF.
  • the results gelatin showed that only a tiny proportion of CGR8 embryonic stem cell has differentiated keratinocytes: a sporadic presence of keratinocytes can be seen at 8 bear culture, and this proportion is increased on day 15, the observed keratinocyte remaining mostly isolated, not forming a cluster.
  • the results obtained on coated slides with a total or partial fraction of the extracellular matrix of the cell types have proved to be dramatically different from the results obtained on amorphous support. Results obtained on the extracellular matrix from the different cell types used
  • Keratinocyte differentiation was obtained on the different extracellular matrices studied. However, the variations in induction efficiency between these different matrices require that they be divided into two distinct categories: (A) matrices with high induction capacity; (B) matrices with average induction capacity (see also table I). (A) Matrices with a high capacity for inducing keratinocyte differentiation a) - Extracellular matrix produced by FHN cells: FHN (normal human fibroblasts) were obtained from prepuce biopsies and maintained in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles') s Medium - GIBCO BRL) supplemented with 10% of SVF (Hyclone).
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles'
  • SVF Hyclone
  • the cells were kept in a humid atmosphere at 37 ° C. and under 5% CO 2 in an incubator. At confluence, the FHN cells were unhooked and the CGR8 embryonic stem cells were seeded on the extracellular matrix deposited by the FHN cells.
  • patches forming a kind of epidermal sheet. Many isolated keratinocytes are also detectable.
  • the presence of matrix secreted by FHN cells causes a significant effect on the differentiation of embryonic stem cells into keratinocytes. Indeed, while no differentiation is observed in direct culture on an amorphous substrate even after 15 days of culture, a large amount of Keratinocytes is obtained by direct culture on the extracellular matrix produced by the FHN cells. In addition, this differentiation is earlier than that obtained via the embryoid bodies since from the eighth day of culture in a monolayer without LIF, a large proportion of keratinocytes is observed.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles' Medium - GIBCO BRL
  • SVF Hyclone
  • (B) Matrices with medium capacity for inducing keratinocyte differentiation a) - Extracellular matrix produced by the 804G line The 804G line, derived from rat bladder epithelial cells (Riddelle KS et al., J. (1991) J Cell Biol. 112, 159-168), was previously cultivated in DMEM (Dulbecco's Modified Eagles' s Medium - GIBCO BRL) supplemented with 10% of SVF (Hyclone). The cells were kept in a humid atmosphere at 37 ° C. and under 5% CO 2 in an incubator.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles' s Medium - GIBCO BRL
  • the 804G cells were unhooked and the CGR8 embryonic stem cells were seeded on the extracellular matrix deposited by the 804G cells.
  • isolated keratinocytes can be identified by immunofluorescence.
  • more numerous keratinocytes are also detectable.
  • the presence of matrix secreted by 804G cells causes a significant effect on the differentiation of embryonic stem cells into keratinocytes. Indeed, while no differentiation is observed in direct culture on an amorphous substrate even after 15 days of culture, a large quantity of keratinocytes is obtained in direct culture on the extracellular matrix produced by the 804G cells.
  • SCC25 ATCC CRL 1628. These cells were maintained in DMEM (Dulbecco 's Modified Eagles' s Medium - GIBCO BRL ) containing 50% of Ham F12 medium (GIBCO BRL) and supplemented with 10% of FCS (Hyclone) and 0.4 ⁇ g / ml of hydrocortisone. The cells were kept in a humid atmosphere at 37 ° C. and under 5% CO 2 in an incubator. ii) MCF-10A: ATCC CRL 10317.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles' s Medium - GIBCO BRL
  • GIBCO BRL Ham F12 medium
  • SVF Hyclone
  • 1.5 ng / ml of triiodo- L -thyronine 5 ⁇ g / ml of insulin, 0.5 ⁇ g / ml of hydrocortisone, 20 ⁇ g / ml of adenine, 5 ⁇ g / ml of apo-transferrin and 2 ng / ml of Epide al Growth Factor.
  • SVF Hyclone
  • HaCaT Bouka p P. et al. (1988). J. Cell Biol. 106: 761-771.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagles' Medium - GIBCO BRL
  • SVF Hyclone
  • results similar to those obtained with the matrix of 804G cells are obtained. Indeed, the deposition of embryonic stem cells on the slides coated with extracellular matrix produced by these cell lines leads to the appearance of K14-positive keratinocytes from the eighth day of monolayer culture. The qualitative and quantitative differences are shown in Table I.
  • the D3 line (Doets ' chman et al., J. Embryol. Exp. Morphol. _8_7, 27-45 (1985)) was previously cultivated on a feeder layer of murine embryonic fibroblasts.
  • Results similar to those obtained with the CGR8 embryonic stem cell line were obtained. Results similar to those obtained with the matrices were observed using the conditioned medium of the same cell lines.
  • the method according to the present invention therefore has the advantage, compared to the method of hanging drops as applied by Bagutti et al. (op. ci t.) to induce the differentiation of mouse embryonic stem cells into keratinocytes, to allow more efficient and faster obtaining of keratinocytes.
  • This is particularly important in cases where it is necessary to mass produce such keratinocytes, as for example in the case of the production of artificial skin.
  • the skin is in fact an organ made up of three tissues of different embryological origins: the ectoderm for the epidermis, the mesoderm for the dermis and the hypodermis. Keratinocytes represent 95% of the epidermal population and they are constantly renewed starting from a basal germinal base following a differentiation program which results in the formation of a stratum corneum made up of corneocytes.
  • the constitution of artificial skin is a technology intended to treat patients victims of thermal wounds, in particular severe burns, vascular wounds such as ulcers, or even patients with pathologies linked to scarring defects .
  • ES cells were deposited on matrices secreted by cells of different origins. The presence of newly formed keratinocytes was detected at 8 (D8) and 15 days (D15) by anti-keratinel4 immunostaining.
  • the presence of positive K14 cells is quantitatively represented by: (-): absence of keratinocyte; (+) small amount of keratinocytes; medium (++), strong (+++) and very strong quantities
  • ES cells embryonic stem cells
  • BMP-4 embryonic stem cells
  • BMP-4 is a morphogenic protein belonging to the TGF- ⁇ superfamily. It is known that neuroectodermal cells, during early embryonic development, become either epidermal or neuronal, depending on the local concentration of BMP-4, BMP-4 at high concentrations promoting the formation of the epidermis (Wilson P. and al. (1997) Development 124, 3177-3184; Chang C. et al. (1997) Development 124, 827-837).
  • a 0.5nM BMP-4 solution diluted in 0.1% PBS-BSA was added to the culture medium with which the embryonic stem cells are cultivated in monolayer, and this treatment was repeated every 2 days. Then it has been observed by immunostaining with anti-cytokeratin-14, the occurrence of a significant proportion of keratinocytes in the 15th day of treatment. It has also been observed that if, instead of adding a BMP-4 solution to the culture medium, a solution containing 50 ⁇ g / ml of ascorbic acid is added under the same conditions, a significant proportion of keratinocytes 15 th day of treatment appeared.

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Abstract

La présente invention se rapporte à une méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en kératinocytes, comprenant les étapes suivantes :- isolement d'une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères,- culture en parallèle des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié en présence de LIF,- ensemencement des cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire,- culture des cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées en absence de LIF pendant un délai suffisant pour leur différenciation en kératinocytes, et - recueillement des kératinocytes ainsi obtenus.

Description

KERATINOCYTES OBTENUS A PARTIR DE CELLULES SOUCHES EMBRYONNAIRES DE MAMMIFERES
Objet de 1 ' invention [0001] la présente invention se rapporte à un procédé d'obtention de keratinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères.
[0002] Une application thérapeutique possible d'un tel procédé est la reconstitution de tissus dérivés des keratinocytes, en particulier, la fabrication de peau artificielle.
Etat de la technique [0003] Le nom de « matrice extracellulaire » ou « MEC » est le nom généralement donné au réseau complexe de macromolécules extracellulaires avec lequel sont en contact la plupart des cellules des organismes pluricellulaires .
[0004] La composition de la matrice extracellulaire et sa forme varient en fonction du tissu, de sorte que l'on parle plus volontiers des matrices extracellulaires, que de la matrice extracellulaire. Néanmoins, les matrices extracellulaires ont en commun d'être constituées de macromolécules qui sont essentiellement des protéines et des polysaccharides sécrétés localement et qui s'organisent pour former un réseau en trois dimensions au niveau des espaces intercellulaires de la plupart des tissus.
[0005] Parmi ces macromolécules, on trouve par exemple des protéoglycannes, des protéines fibreuses ayant une fonction essentiellement structurale telles que l'élastine et les collagênes, et des protéines fibreuses ayant une fonction essentiellement d'adhésion telles que la fibronectine et les laminines.
[0006] La matrice extracellulaire n'est pas seulement une « glue » biologique, elle forme aussi des structures hautement spécialisées telles que le cartilage, les tendons, la membrane basale laminale, le squelette et les dents.
[0007] En outre, il apparaît que les matrices extracellulaires jouent un rôle critique dans la régulation du comportement des cellules avec lesquelles elles sont en contact. Elles sont ainsi impliquées dans des phénomènes aussi différents que le développement cellulaire, la prolifération, le métabolisme, la forme et la' polarité des cellules. Un autre phénomène dans lequel les matrices extracellulaires interviennent est la différenciation des cellules .
[0008] Les cellules souches embryonnaires dérivent de cellules totipotentes de l'embryon. Ce sont des cellules pluripotentes capables de se différencier in vivo en n'importe quel type cellulaire (Bradley et al . , Nature 309, 255-256 (1984) ; Nagy et al., Development 110, 815-821 (1990)) et in vitro en un nombre plus restreint de types cellulaires (Doetschman et al . , J. Embryol . Exp . Morph . 87, 27-45 (1985); obus et al . , Biomed . Biochim . Acta 47, 965- 973 (1988) ; Robbins et al . , J. Biol . Chem. 265 , 11905- 11909 (1990) ; Schmitt et al . , Gènes and Development 5, 728-740 (1991) ) . [0009] Cependant, les cellules souches embryonnaires sont difficiles à cultiver en laboratoire et leur culture nécessite l'ajout, dans le milieu de culture, d'un facteur inhibant la différenciation, communément appelé le « LIF »
(Leukemia Inhibitory Factor) , afin d'éviter tout phénomène de différenciation spontanée (Williams et al . , Nature 336 , 684-687 (1988) ; Smith et al . , Nature 336, 688-690 (1988) ; Gearing et al . , Biotechnology 7, 1157-1161 (1989)). [0010] Le LIF est une protéine de sécrétion qui peut être fournie en maintenant des cellules souches embryonnaires sur une couche nourricière de cellules produisant ce LIF (E.J. Robertson, Tetracarcinomas and Embryonic stem cells : a practical approach, Washington DC, IRL Press (1987) ) ou, en absence de couche nourricière, en ajoutant au milieu de culture du LIF purifié (Pease et al . , Exp. Cell . Res . 190, 209-211 (1990)).
[0011] Il a été démontré que la différenciation spontanée de cellules souches embryonnaires se produit dès l'instant où l'on supprime le LIF du milieu de culture où ces cellules se trouvent, et qu'elle peut être également induite par manipulation dans certaines conditions (Gutierrez-Ramos et al . , Proc . Nat . Acad . Sci . 8_9, 9111- 9175 (1992) ) .
[0012] Cette différenciation a lieu sous l'effet de l'agrégation des cellules souches embryonnaires, conduisant à la formation de corps embryoïdes (structures tridimensionnelles) à partir desquels les cellules se différencient spontanément en différents types cellulaires.
[0013] Rudnicki et al . ont décrit une méthode générale d' induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires dite « méthode des gouttes pendantes » (Rudnicki et al . , « Cell culture ethods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell unes », in Teratocarcinomas and embryonic stem cells : a practical approach, (E.J. Robertson, op. cit.), 19-49 (1987) , IRL Press, Oxford) . Dans cette méthode, pour que les cellules souches embryonnaires se différencient, il est nécessaire de former des structures tridimensionnelles appelées « corps embryoïdes » dont il a été fait mention ci-dessus . [0014] L'absence de LIF au cours de cette méthode est nécessaire pour permettre aux cellules souches embryonnaires de se différencier. Après 3 jours, les corps embryoïdes formés sont transférés sur des boîtes de Pétri bactériologiques et sont maintenus en suspension pendant 2 jours, afin d'éviter leur adhésion et de favoriser leur croissance. Les corps embryoïdes sont ensuite mis à adhérer sur des boîtes de culture cellulaire. Dès le 2eme jour après adhésion, on peut observer, au sein de ces corps, différents types cellulaires, dont des cellules battantes (cardiomyocytes) . Selon les conditions de culture utilisées, on identifie des cellules musculaires squelettiques et lisses, des cellules nerveuses, des cellules de la glie et des dérivés du système hématopoïétique (Rathjen et al . , « Properties and uses of embryonic stem cells : prospects for application to human biology and gène therapy », Jeprod. Fertil . Dev. 10 (1) , 31-
47 (1998) , Review) .
[0015] Depuis peu, des conditions de culture permettant d'induire majoritairement et de manière reproductible la différenciation des cellules souches embryonnaires vers un lignage particulier ont été mises au point (Rathjen et al . , op . ci t . ) .
[0016] Il est désormais clairement établi que le LIF maintient les cellules souches embryonnaires pluripotentes sous forme indifférenciée, et que son retrait du milieu cellulaire • permet à ces cellules d'initier, sous forme de corps embryoïdes, un programme de différenciation. [0017] Le document de Bagutti et al . (Bagutti et al . , Developmental Biology 179, 184-196 (1996)) décrit plus particulièrement la différenciation spontanée de cellules souches embryonnaires de souris en keratinocytes en utilisant la méthode des gouttes pendantes, avec apparition de keratinocytes à partir du 21ême jour. [0018] Néanmoins, il n'existe pas encore actuellement de méthode d'induction de la différenciation des cellules souches embryonnaires en keratinocytes qui constituerait une réelle alternative, en terme de rapidité et de rendement, à la méthode des gouttes pendantes.
Buts de 1 ' invention
[0019] La présente invention vise à fournir une méthode et des moyens d' induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires en keratinocytes, qui permettent d'obtenir plus rapidement et en nombre plus grand des keratinocytes différenciés, comparativement aux méthodes de 1 ' état de la technique .
[0020] La présente invention vise également à fournir une méthode et des moyens d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifère en keratinocytes qui soient reproductibles et fiables .
Résumé de 1 ' invention
[0021] La présente invention se rapporte à l'obtention de keratinocytes à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères, en particulier à une méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en keratinocytes, comprenant les étapes suivantes: on isole une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères, on cultive parallèlement des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié, on ensemence ensuite lesdites cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire ou sur une ou plusieurs de ses fractions comprenant des constituants particuliers, notamment la laminine-5, le collagène de type IV, le collagène de type I ou des fibronectines, on cultive ensuite lesdites cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées, en absence du LIF susmentionné pendant un délai suffisant pour obtenir la differentiation en keratinocytes, et on recueille les keratinocytes ainsi obtenus, isolés et amplifiés par des techniques connues de clonage (dispase, trypsine, tri cellulaire) .
[0022] De manière avantageuse, les cellules souches embryonnaires sont maintenues préalablement à l'état indifférencié en présence de LIF, de préférence à une
3 concentration de l'ordre de 10 unités/ml de culture. [0023] Selon l'invention, l'induction de la différenciation des cellules souches embryonnaires sur une matrice extracellulaire est initiée dès 8 jours et largement engagée à 15 jours. Ce facteur de temps n'est nullement limitatif et peut être accéléré par différents procédés adaptables par l'homme du métier.
[0024] En outre, il est également possible de traiter les souches embryonnaires avant la différenciation en keratinocytes par différentes modifications génétiques, en particulier par des modifications génétiques sur des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC) , de manière à créer des lignées pluripotentes universelles immunotolérantes .
[0025] De façon particulièrement avantageuse, les cellules souches embryonnaires ensemencées sur la matrice extracellulaire sont cultivées en présence de BMP-4 et d'acide ascorbique. [0026] Un autre aspect de la présente invention concerne la fabrication d'une peau artificielle, en particulier un tissu épidermique comprenant lesdits keratinocytes ainsi obtenus, ainsi que leur utilisation pour soigner des patients victimes de plaies thermiques (en particulier des grands brûlés) , des plaies vasculaires
(tels que des ulcères) ou des patients atteints de pathologies liées à des défauts de cicatrisation.
[0027] La présente invention sera détaillée à l'aide de la description d'une forme d'exécution préférée de l'invention présentée à titre d'illustration non limitative de l'objet de l'invention.
Description détaillée de l'invention [0028] Les exemples présentés ci-dessous illustrent la méthode selon la présente invention. Dans ces exemples, une lignée de cellules souches embryonnaires murines CGR8
(Mountford et al., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 91, 4303-4307
(1994)) , au stade blastocyste, a été cultivée à l'état indifférencié en présence de LJF (Leukemia Inhibiting Factor) (103 unités/ml) sur des boîtes de culture préalablement gélatinisées (0,1% dans du PBS) en atmosphère humide à 37 °C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. [0029] Le milieu de culture se composait de GMEM/BH 21 (Glasgow' s Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal (SVF; Hyclone) , 0,23% de bicarbonate de sodium, 1% d'acides aminés non essentiels, 2 mM de glutamine, 1 mM de pyruvate de sodium,
0,1 mM de β-mercaptoéthanol . [0030] Ces cellules souches embryonnaires à l'état indifférencié ont ensuite été ensemencées, en absence de LIF, soit sur un substrat amorphe (verre ou plastique, contrôle négatif) , soit sur de la gélatine, soit sur des lames coatées de matrice extracellulaire provenant de différents types de cellules (voir ci-dessous) . On a ainsi testé des cellules d'origine épithéliale (lignée 804G; lignée Rac-llP; lignée SCC25; lignée MCF-10 A; lignée KHSV; lignée NBTn; lignée HaCaT) et des cellules fibroblastiques (lignée J2 ; lignée NIH-3T3, fibroblastes dermiques humains en culture primaire) . Les lignées épithéliales produisent, entre autre, des quantités importantes de laminine-5, et forment in vi tro de nombreuses structures d'ancrage de type hémidesmosome (Langhofer M. et al . , J. Cell Science 105, 753-764 (1993) ) .
[0031] Les cellules souches embryonnaires ont également été ensemencées sur des lames coatées uniquement avec des constituants majeurs des lames basales (laminine-5 purifiée; collagène de type IV purifié; collagène de type I purifié; fibronectines purifiées) .
[0032] Afin de récolter leur matrice' extracellulaire, les lignées mentionnées ci-dessus ont été cultivées à confluence sur lamelles. Une fois arrivées à confluence, ces cellules ont été décollées grâce à une solution constituée de PBS contenant 20mM d'hydroxyde d'ammonium ou à une solution d'HBSS (Hanks balanced sait solution, GIBCO-BRL) contenant 20 mM d'EDTA, 20 mM d'Hepes et 1 mM d'EGTA) de manière à ne garder que la matrice extracellulaire sécrétée, intacte sur les lamelles. Les lamelles ainsi "coatées" ont été conservées à 4°C.
[0033] La présence de keratinocytes a été évaluée par marquage i munofluorescent avec des anticorps monoclonaux de souris dirigés contre les cytokêratines 14 (K14; Sigma) et 5 (Dr. B. Lane, Université de Dundee, UK) . Les cytokêratines 14 et 5 font partie des filaments intermédiaires spécifiques des keratinocytes basaux. Les cellules souches embryonnaires ont été cultivées sur des lamelles de verre stériles avec ou sans dépôt de matrice extracellulaire. Après lavage au PBS, les cellules ont été fixées avec du méthanol froid 10 minutes à -20°C. Les cellules ont ensuite été lavées au PBS avant d'être incubées pour une heure avec l'anticorps primaire anti-K14 (dilué au l/l00e dans un tampon PBS contenant 3 mg/ml de BSA, en chambre humide) ou avec l'anticorps primaire anti- K5 (dilué au l/5e dans le même tampon, en chambre humide) . Après un nouveau lavage au PBS de 5 minutes, les lamelles ont été incubées pour une heure à l'obscurité avec un anticorps secondaire relevant couplé à un marqueur. Après un dernier rinçage, les lamelles ont été incubées avec un marqueur nucléaire (Hoechst ou iodure de propidium) dilués au l/l000e dans du PBS pendant 10 minutes à l'abri de la lumière, puis montées sur lames après lavage à l'eau distillée. Toutes les manipulations ont été effectuées à température ambiante. Les lames ont été observées sous un microscope "Zeiss Axiophot".
[0034] Les résultats obtenus ont montré que sur support amorphe, malgré une différenciation spontanée et anarchique, les cellules ne se différencient pas en keratinocytes, même après 15 jours de culture sans LIF. Les résultats sur gélatine ont montré que seulement une proportion infime de cellules souches embryonnaires CGR8 s'est différenciée en keratinocytes: une présence sporadique de keratinocytes peut être observée à 8 ours de culture, et cette proportion est augmentée au 15e jour, les keratinocytes observés restant en majorité isolés, ne formant pas d ' amas . [0035] Les résultats obtenus sur des lames coatées avec une fraction totale ou partielle de la matrice extracellulaire des types cellulaires se sont révélés dramatiquement différents des résultats obtenus sur support amorphe . Résultats obtenus sur la matrice extracellulaire provenant des différents types cellulaires utilisés
[0036] Une différenciation kératinocytaire a été obtenue sur les différentes matrices extracellulaires étudiées. Cependant, les variations d'efficacité d'induction entre ces différentes matrices nécessitent de les répartir en deux catégories distinctes: (A) matrices à haute capacité d'induction; (B) matrices à capacité moyenne d'induction (voir aussi tableau I) . (A) Matrices à haute capacité d'induction de la différenciation kératinocytaire a) - Matrice extracellulaire produite par les cellules FHN: Les FHN (fibroblastes humains normaux) ont été obtenus à partir de biopsies de prépuce et entretenus en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. A confluence, les cellules FHN ont été décrochées et les cellules souches embryonnaires CGR8 ont été ensemencées sur la matrice extracellulaire déposée par les cellules FHN.
[0037] Au huitième jour de culture des cellules souches embryonnaires CGR8 sur la matrice produite par les FHN, de nombreux keratinocytes isolés sont identifiables par immunofluorescence . Au quinzième jour de culture, les keratinocytes plus nombreux sont observés en larges amas
("patches") formant une sorte de feuillet épidermi ue. De nombreux keratinocytes isolés sont également détectables.
[0038] Ainsi, la présence de matrice sécrétée par les cellules FHN provoque un effet significatif sur la différenciation des cellules souches embryonnaires en keratinocytes. En effet, alors qu'aucune différenciation n'est observée en culture directe sur un substrat amorphe même après 15 jours de culture, une quantité importante de keratinocytes est obtenue en culture directe sur la matrice extracellulaire produite par les cellules FHN. De plus, cette différenciation est plus précoce que celle obtenue via les corps embryoïdes puisque dès le huitième jour de culture en monocouche sans LIF, une proportion importante de keratinocytes est observée. b) - Matrice extracellulaire produite par les lignées cellulaires NIH-3T3, Rac-llP, KHSV et NBTn : [0039] L'expérience susmentionnée (cellules FHN) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i ) NIH-3T3: ATCC, CRL 1658. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles ' Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. ii ) Rac-llP: Sonnenberg A. et al. (1996) J. Cell Science 106: 1083. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco 's Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. iii ) KHSV: Miquel C. et al. (1996). Exp. Cell Res . 224: 279-290. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco1 s Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ha F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 0,4 μg/ l d' hydrocortisone, 0,1 ng/ l de toxine cholérique et 10 ng/ml d'Epidermal Growth facto . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. iiii ) BTii-. ATCC CRL 1655. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur.
[0040] Dans ces quatre autres exemples, on obtient des résultats similaires à ceux obtenus avec la matrice des cellules FHN. En effet, le dépôt de cellules souches embryonnaires sur les lames coatées avec de la matrice extracellulaire produite par ces lignées cellulaires conduit à l'apparition de keratinocytes K14-positifs dès le huitième jour de culture en monocouche. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I .
(B) Matrices à capacité moyenne d'induction de la différenciation kératinocytaire a) - Matrice extracellulaire produite par la lignée 804G: La lignée 804G, dérivée de cellules epitheliales de vessie de rat (Riddelle KS et al . , J. (1991) J. Cell Biol . 112, 159-168), a été préalablement cultivée en DMEM (Dulbecco's Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. A confluence, les cellules 804G ont été décrochées et les cellules souches embryonnaires CGR8 ont été ensemencées sur la matrice extracellulaire déposée par les cellules 804G. [0041] Au huitième jour de culture des cellules souches embryonnaires CGR8 sur la matrice produite par les 804G, des keratinocytes isolés sont identifiables par immunofluorescence. Au quinzième jour de culture, des keratinocytes plus nombreux sont également détectables. [0042] Ainsi, la présence de matrice sécrétée par les cellules 804G provoque un effet significatif sur la différenciation des cellules souches embryonnaires en keratinocytes. En effet, alors qu'aucune différenciation n'est observée en culture directe sur un substrat amorphe même après 15 jours de culture, une quantité importante de keratinocytes est obtenue en culture directe sur la matrice extracellulaire produite par les cellules 804G. De plus, cette différenciation est plus précoce que celle obtenue via les corps embryoïdes puisque dès le huitième jour de culture en monocouche sans LIF, une proportion importante de keratinocytes est observée. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I. b) - Matrice extracellulaire produite par les lignées cellulaires SCC25, MCF-10A et HaCaT:
[0043] L'expérience susmentionnée (cellules 804G) a été reproduite sur la matrice produite par les lignées cellulaires : i ) SCC25: ATCC CRL 1628. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) contenant 50% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) et 0,4 μg/ml d 'hydrocortisone . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur. ii ) MCF-10A: ATCC CRL 10317. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco ' s Modified Eagles 's Médium - GIBCO BRL) contenant 25% de milieu Ham F12 (GIBCO BRL) et supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone), 1,5 ng/ml de triiodo-L-thyronine, 5μg/ml d'insuline, 0,5 μg/ml d' hydrocortisone, 20 μg/ml d'adénine, 5 μg/ml d'apo- transferrine et 2 ng/ml d'Epide al Growth Factor . Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur, iii ) HaCaT: Bouka p P. et al. (1988). J. Cell Biol . 106: 761-771. Ces cellules ont été entretenues en DMEM (Dulbecco 's Modified Eagles ' s Médium - GIBCO BRL) supplémenté avec 10% de SVF (Hyclone) et 1% de solution d'acides aminés non essentiels. Les cellules ont été maintenues en atmosphère humide à 37°C et sous 5% de CO2 dans un incubateur.
[0044] Dans ces trois autres exemples, on obtient des résultats similaires à ceux obtenus avec la matrice des cellules 804G. En effet, le dépôt de cellules souches embryonnaires sur les lames coatées avec de la matrice extracellulaire produite par ces lignées cellulaires conduit à l'apparition de keratinocytes K14-positifs dès le huitième jour de culture en monocouche. Les différences qualitative et quantitative sont représentées sur le tableau I .
Résultats obtenus avec la lignée de cellules souches embryonnaires D3 sur la matrice extracellulaire produite par les lignées susmentionnées
[0045] La lignée D3 (Doets'chman et al . , J. Embryol . Exp . Morphol . _8_7, 27-45 (1985)) a été préalablement cultivée sur une couche nourricière de fibroblastes embryonnaires murins .
[0046] Des résultats similaires à ceux obtenus avec la lignée de cellules souches embryonnaires CGR8 ont été obtenus . [0047] Des résultats similaires à ceux obtenus avec les matrices ont été observés en utilisant le milieu conditionné des mêmes lignées cellulaires.
[0048] La méthode selon présente invention présente donc l'avantage, par rapport à la méthode des gouttes pendantes telle qu'appliquée par Bagutti et al. (op. ci t . ) pour induire la différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en keratinocytes, de permettre une obtention plus efficace et plus rapide de keratinocytes. [0049] Ceci est particulièrement important dans les cas où il est nécessaire de produire en masse de tels keratinocytes, comme par exemple dans le cas de la production de peau artificielle. La peau est en effet un organe constitué de trois tissus d'origines embryologiques différentes : 1 ' ectoderme pour l'épiderme, le mésoderme pour le derme et 1 ' hypoderme . Les keratinocytes représentent 95% de la population épidermique et ils se renouvellent en permanence à partir d'une assise germinale basale suivant un programme de différenciation qui aboutit à la formation d'une couche cornée constituée de cornéocytes.
[0050] La constitution de peau artificielle est une technologie ayant pour but de soigner des patients victimes de plaies thermiques, en particulier des grands brûlés, de plaies vasculaires telles que des ulcères, ou encore les patients atteints de pathologies liées à des défauts de cicatrisation.
[0051] Trois types principaux de modèles pour reconstituer de la peau humaine en laboratoire sont actuellement disponibles et réalisables : les dermes équivalents (Procacci et al . , J. Inv. Dermatol . 115, 518 (2000); Bell et al . , Proc . Natl . Acad . Sci . USA 7_6, 1274- 1278 (1979) ; Bell et al . , J. Invest . Dermatol . 8JL, 2s-10s (1983) ) , la peau composite dermo-épidermique allogénique (Burke et al . , A . Surg . 194, 413-428 (1981)) et l'épiderme en culture allogénique (Hansbrough et al . , J.
Am. Med . Ass . 262, 2125-2140) . Ces différents modèles sont préparés à partir de cultures primaires de keratinocytes et/ou fibroblastes.
[0052] Si ces modèles se prêtent bien à des études phar acologiques, leur utilisation à des fins théarpeutiques est néanmoins jugée insatisfaisante par un certain nombre d'équipes chirurgicales dans le monde, notamment parce qu'elle s'accompagne de rejet de greffes (Compron et al . , Lab . Invest . 60, 600-612 (1989)). [0053] L' autogreffe d'épiderme reconstitué à partir d'une biopsie cutanée sur le patient, suivie d'une culture des keratinocytes pendant environ trois semaines serait la meilleure solution, car elle éviterait tout risque de rejet immunologique. Néanmoins, cette solution présente l'inconvénient d'être longue à mettre en œuvre. [0054] A l'heure actuelle, pour le chirurgien, l'allogreffe expansée de peau de cadavre reste le meilleur substitut cutané. Cependant, cette solution n'est pas viable à long terme car, outre le problème du manque de donneurs, cette solution expose le patient à une contamination virale potentielle.
[0055] C'est pourquoi, des efforts ont été entrepris afin de proposer une alternative à ces méthodes. [0056] La culture de cellules souches embryonnaires humaines étant désormais possible en laboratoire, les méthodes représentées permettent l'obtention illimitée d' épidémies reconstitués greffables sans risque de rejet, les cellules embryonnaires souches présentant le double avantage d'être « immortelles » sans être immortalisées et d'être aisément manipulables par transfection et recombinaison homologue. Pour que ces keratinocytes persistent chez le patient receveur, des modifications de certains loci, tels que celui des gènes du complexe majeur d'histocompatibilité qui jouent un rôle dans la reconnaissance des cellules étrangères par le système immunitaire, permettent de créer des lignées totipotentes universelles i unotolérantes . Effet de différentes matrices sur la différenciation kératinocytaire
Matrices J8 J15
Verre
Gélatine -/+ +
FHN +++ ++++
3T3 +++ ++++
804G ++ ++
Racll P ++ ++++
SCC25 ++ +
MCF10 +++ +
KHSV +++ +++
NBTII + +++
HaCaT + +
Les cellules ES ont été déposées sur des matrices sécrétées par des cellules d'origines différentes. La présence de keratinocytes néo-formés a été détectée à 8 (J8) et 15 jours (J15) par immunomarquage anti-kératinel4.
La présence de cellules K14 -positives est représentée quantitativement par: (-) : absence de keratinocyte; (+) faible quantité de keratinocytes; quantités moyennes (++) , fortes (+++) et très fortes
(++++) de keratinocytes.
Cette quantification représente les résultats de plusieurs expériences indépendantes, exécutées en triplicat.
Effets sur la différenciation d7 additifs dans le milieu de culture
[0057] On a observé expérimentalement que les cellules souches embryonnaires (cellules ES) pouvaient être induites à se différencier en keratinocytes par l'ajout de BMP-4 dans le milieu de culture, quelque soit le substrat sur lequel les cellules sont cultivées.
[0058] La BMP-4 est une protéine morphogène appartenant à la superfamille du TGF-β. Il est connu que les cellules neuroectodermiques, au cours du développement embryonnaire précoce, deviennent soit epider ales soit neuronales, selon la concentration locale de BMP-4, la BMP- 4 à hautes concentrations favorisant la formation de l'épiderme (Wilson P. et al. (1997) Development 124, 3177- 3184 ; Chang C. et al. (1997) Development 124, 827-837).
[0059] Selon le procédé de l'invention, on a, dès le retrait du facteur LIF, ajouté une solution de BMP-4 à 0.5nM diluée dans du PBS-BSA 0.1% au milieu de culture avec lequel les cellules embryonnaires souches sont cultivées en monocouche, et on a renouvelé ce traitement tous les 2 jours. On a pu alors observé, par immunomarquage avec un anticorps anti-cytokératine-14, l'apparition d'une proportion importante de keratinocytes au 15eme jour de traitement . [0060] Il a également été observé que si, au lieu d'ajouter au milieu de culture une solution de BMP-4, on ajoute dans les mêmes conditions une solution contenant 50 μg/ml d'acide ascorbique, une proportion importante de keratinocytes au 15eme jour de traitement apparaissait. [0061] En outre, le dépôt en absence de LIF de cellules souches indifférenciées, cultivées sur un derme équivalent ou dé-épidermisé, permet la formation d'une bicouche de cellules différenciées en keratinocytes dès le 8eme jour de culture en immersion. Par immunofluorescence, toutes les cellules qui adhèrent au substrat dermique se sont en effet révélées positives pour la cytokératine-1 . Au bout de 14 jours supplémentaires de culture des cellules en interface air-liquide selon la méthode décrite par Basset-Seguin N. et al. (Basset-Seguin N. et al. (1990) Differentiation 44, 232-238), il est possible d'obtenir un épider e stratifié présentant tous les marqueurs spécifiques des différentes couches cellulaires de l'épiderme murin, ainsi que le dépôt par la couche basale de laminine-5 au niveau de la lame basale.
[0062] Comparativement, l'ajout de BMP-4 dans le milieu de culture des cellules embryonnaires souches, dès le dépôt sur le derme équivalent, permet l'obtention d'une bicouche de cellules différenciées en keratinocytes dès le
4eme jour de culture en immersion.

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d'induction de la différenciation de cellules souches embryonnaires de mammifères en keratinocytes, comprenant les étapes suivantes : - isolement d'une matrice extracellulaire sécrétée par au moins un type de cellules de mammifères , culture en parallèle des cellules souches embryonnaires de mammifères à l'état indifférencié dans un milieu de culture approprié en présence de LIF, - ensemencement des cellules souches embryonnaires en monocouche sur ladite matrice extracellulaire, culture des cellules souches embryonnaires ainsi ensemencées en absence de LJF pendant un délai suffisant pour leur différenciation en keratinocytes, et - recueillement des keratinocytes ainsi obtenus .
2. Méthode selon la revendication 1, caractérisée en ce que les cellules souches embryonnaires sont maintenues préalablement à l'état indifférencié à l'aide du facteur LJF, à une concentration de l'ordre de
3 10 unités/ml de culture.
3. Méthode selon la revendication 1 ou 2 , caractérisée en ce que le délai de culture des cellules souches embryonnaires ensemencées sur la matrice extracellulaire est efficace dès le 8eme jour et inférieur a 21 jours.
4. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules souches embryonnaires ensemencées sur la matrice extracellulaire sont cultivées en présence de BMP-4 ou d'acide ascorbique.
5. Méthode selon l'une des revendications précédentes, caractérisée en ce que les cellules dont on récupère la matrice extracellulaire sont des cellules humaines, à l'exception des cellules germinales .
6. Procédé de fabrication d'une peau artificielle à partir de cellules souches embryonnaires de mammifères, comprenant les étapes suivantes : on induit la différenciation desdites cellules souches embryonnaires en keratinocytes à l'aide de la méthode selon l'une des revendications précédentes ; on poursuit la culture des cellules différenciées en interface air-liquide pendant un temps suffisant pour obtenir la formation d'un épiderme artificiel stratifié.
7. Peau artificielle obtenue à partir de la méthode selon l'une des revendications précédentes.
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