EP1368492A2 - Herzchip - Google Patents

Herzchip

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Publication number
EP1368492A2
EP1368492A2 EP02702408A EP02702408A EP1368492A2 EP 1368492 A2 EP1368492 A2 EP 1368492A2 EP 02702408 A EP02702408 A EP 02702408A EP 02702408 A EP02702408 A EP 02702408A EP 1368492 A2 EP1368492 A2 EP 1368492A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleotide
sequences
risk
probes
arteriosclerosis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP02702408A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Paul Cullen
Udo Seedorf
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
OGHAM GmbH
Original Assignee
OGHAM GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by OGHAM GmbH filed Critical OGHAM GmbH
Publication of EP1368492A2 publication Critical patent/EP1368492A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Definitions

  • the invention relates to a gene chip and a method for determining the genetic predisposition for the development of arteriosclerotic diseases and claims the priority of the German patent application 101 11 925.9, to which reference is made in terms of content.
  • Cardiovascular diseases are one of the most common causes of death worldwide. In the majority of cases, such diseases are due to calcification of the large and medium-sized artery (arteriosclerosis). Arteriosclerosis of the coronary arteries and carotid artery is of particular importance, as this can lead to a heart attack or stroke. Around 250,000 people currently suffer a heart attack in Germany, which in half of the cases is fatal. The heart attack often leads to considerable consequential damage and disabilities in the surviving patients. The frequency of stroke in Germany is around half of heart attacks; about a quarter of all cases are fatal. The consequential damage is often more devastating than with a heart attack.
  • Atherosclerosis is a complex clinical picture that goes back to multifactorial causes. Chemical and mechanical damage to the vessels is primarily caused, for example, by persistent nicotine consumption, metabolic disorders such as diabetes melitus or psychological disorders leading to adrenaline or noradrenaline releases. Chosomatic influences discussed as major causes. In addition, persistent high blood pressure and high blood cholesterol play a key role.
  • the recording of risk factors for determining the risk of atherosclerosis is of great importance.
  • biochemical analyzes for example of the cholesterol or fat levels in the blood, are carried out and the patient is asked about lifestyle habits and diseases that occur frequently in the family. If the genetic risk factors are recorded at all, this is done by means of a complete sequencing of the corresponding nucleotide sequence of the relevant gene or by displaying the affected gene segments, for example by means of the allele-specific polymerase chain reaction, restriction length polymorphisms or the single strand conformation polymorphism method (SSCP).
  • SSCP single strand conformation polymorphism method
  • a disadvantage of these methods for recording the genetic disposition is that they generally only record individual sequence changes, at most individual genes. In addition, they are often very labor-intensive and require special knowledge in both implementation and interpretation. Therefore, they are not suitable for examining a large number of people who may be affected.
  • the invention is therefore based on the problem of providing a diagnostic option which allows a quick and meaningful diagnosis of the genetic predisposition to the disease of arteriosclerosis.
  • the invention is based on the idea of bringing a suitable selection of nucleotide sequences relevant to the genetic arteriosclerosis risk (or the sequences complementary thereto) as well as their functionally characterized mutations onto a carrier (hereinafter also referred to as a gene chip), these nucleotide sequences with a nucleotide sequence sample of a patient hybridize ducks and evaluate the hybridization multifactorial.
  • the nucleotide sequences represent probes for so-called reference sequences whose indirect or direct functional connection with arteriosclerosis is known or suspected. If a probe hybridizes on the carrier with oligonucleotides from the patient sample, the evidence for the presence of the corresponding reference sequence in the patient is provided.
  • the method according to the invention and the nucleotide carrier according to the invention thus permit a more precise diagnosis of the risk of arteriosclerosis, in particular when this method is combined with the detection of the conventional risk factors.
  • a more precise diagnosis is an important prerequisite for new treatment methods that will allow specific treatment of genetic defects in the near future, such as gene therapy.
  • Another advantage of the invention is that all relevant mutations of the selected reference sequences can be recorded in a single operation, the implementation of which requires no special knowledge.
  • This method is also suitable for automation and thus for the rapid processing of large series of samples.
  • the simultaneous detection of relevant gene changes is possible inexpensively, quickly and reliably.
  • the method according to the invention is not only suitable for clinical diagnostics but in particular also as an aid for scientific research. In this way, for example, population studies aiming to clarify the connection between genetic modification and the risk of heart attack or stroke can be facilitated, since a much higher number of study participants can be recorded compared to conventional studies.
  • nucleotide carrier allows the identification of interactions between mutations or mutation combinations and between mutations and conventional risk factors, for example from the family history, the metabolism or the blood cholesterol level, it can contribute to a better understanding of the development of arteriosclerotic phenomena. It is therefore particularly suitable as a research reagent.
  • nucleotide carrier is based on the hybridization of the nucleotide sequences applied to the carrier with complementary nucleotide sequences from the patient's sample material. Since the selected nucleotide sequences represent probes for reference genes which are functionally relevant for the formation of arteriosclerosis, individual genes or parts thereof can be detected in a preparation of genomic DNA or the transcription product of a gene (mRNA) by means of hybridization.
  • mRNA messenger mRNA
  • one strand of nucleic acid can be marked, for example, by dyes, radioactivity or chemiluminescent or fluorescent molecules, while the second is bound to a solid support, for example made of plastic or glass.
  • the nucleotide sequence is preferably marked during the synthesis of the sequence from the patient sample.
  • oligonucleotides can be applied to the carrier as probes.
  • the subsequent hybridization on the carrier can advantageously be evaluated using a scanner, so that the evaluation can be largely automated.
  • hybridization includes any form of pairing or juxtaposition of nucleotide sequences. The hybridization can take place both under stringent and under relaxed conditions.
  • nucleotide sequence refers to any oligomeric or polymeric sequence of ribonucleotides or deoxyribonucleotides or a combination thereof. Ribonucleotides or deoxyribonucleotides with base analogs are also included. Nucleotide sequences can be of synthetic or natural origin and can be traced back to recombinant processes.
  • arteriosclerosis risk refers to any increase (or decrease) in the likelihood of developing atherosclerosis. The probability is measured by the average probability in the entire population. If the arteriosclerosis risk is due to genetic causes, the term genetic arteriosclerosis risk or genetic predisposition or just disposition is used. “Mutations” are understood to mean all forms of change in the genetic information of a nucleotide sequence in comparison with the wild-type sequence - including a native sequence. These can be substitutions, insertions or deletions, for example. More complex mutations such as inversions and indels are also possible.
  • reference sequence refers to certain nucleotide sequences of selected genes, where a gene can include a large number of reference sequences.
  • the reference sequences can be native, i.e. in wild type formation, or be mutated. A connection between the mutations and the risk of arteriosclerosis is known or is suspected, i.e. the mutation is functionally characterized or relevant.
  • probe refers to specific oligonucleotide sections of a reference sequence or sequences complementary thereto. The hybridization of an oligonucleotide sample with a probe thus allows the detection of the reference sequence in the original tissue of the sample. The probes are applied to the nucleotide carrier.
  • probes for reference sequences of the genes listed in Table 1 below are applied to the carrier, the mutations of which directly or indirectly contribute to an increase in the genetic risk of arteriosclerosis.
  • probes of sequences complementary to the reference sequences can also be used (hereinafter also complementary sequences).
  • the genes are specified both by their code number from the GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and by the symbol used for them.
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the table also contains information on the frequency of genetic changes in these genes and the number of known mutations. Table 1
  • Lipolipoprotein genes A-I APOA1 Less than 28 reduction in high-density lipoprotein cholesterol.
  • Apolipoprotein B 3500 APOB 1 600 Like LDL receptor, somewhat milder.
  • Apolipoprotein B APOB 1 2 13 Possible protection factor against heart attack and stroke.
  • Apolipoprotein E APOE ApoE2 10% of 26 At homozygosity for ApoE2: hyperlipidemia, carrier of a
  • ApoE4- Alleis have an increased risk not only for A ⁇ oE4 heart attack: 20% of but also for Alzheimer's disease.
  • Apolipoprotein H APOH 1 4 2 High triglycerides in women. Possible importance for blood clotting
  • Adenosine triphosphate- ABCA1 Less than 14 Severe decrease in high-density lipoprotein cholesterol binding cassettes 1: 10,000 level. Possibly increased risk of heart attack. transporter 1
  • Hepatic Lipase LIPC Less than 1: 5 hypertriglyceridemia; possible increased risk of arterial 10,000 riosclerosis of the coronary arteries.
  • Lecithinxholesterin LCAT Less than 31 reduction in high-density lipoprotein cholesterol.
  • Acyltransferase 1 10,000 corneal opacity and kidney dysfunction may occur.
  • Low-density Lipopro LDLR 1 500 36 increase in blood cholesterol. Severe arteriosclerosis tein receptor before the age of 40 in men, before the age of 50 in women.
  • Lysosomal acid lipase LIPA 1 750 25 Liver function disorders, high blood cholesterol, high triglycerides, low HDL cholesterol. Possibly increased risk of heart attack.
  • Lipoprotein Lipase LPL Less than 81 increase in blood triglyceride level. Probably a slight 1: 10,000 increase in myocardial infarction risk. Very high blood triglyceride levels can lead to severe, sometimes life-threatening, inflammation of the pancreas.
  • Alpha-adducin ADD1 1:10 1 hypertension Alpha-adducin ADD1 1:10 1 hypertension.
  • Beta2 adrenergic recep- ADRB2 1 5 4 hypertension.
  • Angiotensinogen AGT 1 3 8 hypertension.
  • Angiotensin receptor 1 AGTR1 1 3 1 connection with high blood pressure.
  • bleak of Differentiation CD36 1 300 3 high blood pressure, fat metabolism disorder, arteriosclerosis.
  • Cytochrome P450 / 11 beta CYP11B1 Unknown, 1:50 in 25 hypertension.
  • Angiotensin-Converting DCP1 1 4 1 hypertension. Possibly increased risk of heart attack
  • Guanine nucleotide GNB3 1 2 1 hypertension. ending protein, beta 3
  • Neurofibromatose-Fak- NF1 1 3500 22 Neurofibromatosis type 1, high blood pressure. gate 1
  • E-selectin SELE 1 5 3 Possibly increased risk of heart attack.
  • P-selectin SELP 1 5 1 Possibly protective factor against the development of arteriosclerosis.
  • Methyl tetrahydrofolate- MTHFR variable, some 12 high homocysteine levels, increased risk of arteriosclerosis homocysteine methyl polymorphisms of the coronary arteries.
  • transferase reductase very common methionine synthase MTR 1: 7 1 Like MTHFR.
  • Methyl tetrahydrofolate- MTRR 1 3 20 Like MTHFR. reductase
  • Antithrombin 3 AT3 1 500 116 Increased coagulation.
  • Coagulation factor II F2 1 20 17 Increased coagulation. Relation to atherosclerosis still unclear.
  • Coagulation factor VIII F8 1 10,000 480 haemophilia A.
  • Coagulation factor IX F9 1 30,000 667 hemophilia B.
  • Coagulation factor X F 10 Less than 29 Slight bleeding tendency.
  • Coagulation factor XI F 11 Unknown: 1:10 in 20 Slight bleeding tendency.
  • Coagulation factor XII F12 Up to 50% 10 Symptom-free when occurring on its own, combination effect unknown.
  • Coagulation factor XIIIA F13A Unknown, true38 Slight bleeding tendency. apparently less than 1: 10,000
  • Coagulation factor XIIIB F13B 1 5 3 Slight bleeding tendency.
  • Fibrinogen alpha FGA Less than 1 in 9 Statistical relationship between polymorphism and Herzin5,000 farkt.
  • Fibrinogen beta FGB 1:10 8 Possibly increased risk of heart attack.
  • Fibrinogen gamma FGG Less than 1 in 13 Asymptomatic on its own, combination effect 5,000 unknown.
  • Plasminogen PLG 1 3 14 tendency to clot.
  • Protein C PROC 1 30 190 Partially severe tendency to clot.
  • Thrombomodulin THBD 1 100 7 connection with heart attack described.
  • von Willebrand factor VWF 1 50 117 Most common cause of a clinically important bleeding tendency.
  • Leptin receptor LEPR 1 3 1 Not related to obesity.
  • Glucokinase GCK 1 100 56 Some mutations lead to diabetes.
  • Peroxisome prolifera- PPARG 1 5 diabetes mellitus, lipid disorders. tion activating
  • Peroxisome prolifera- PPARA unknown hypertriglyceridemia Lowering HDL cholesterol. tion activating
  • Stromelysin MMP3 1 2 1 Possible association with atherosclerosis of the coronary arteries.
  • Tumor necrosis factor TNF Some are very 6 possible association with atherosclerosis. alpha common (1: 3)
  • the individual reference sequences of these genes are the subject of Table 2.
  • the reference sequences can in turn be identified by their code numbers from the GenBank of the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (hereinafter also GenBank).
  • Probes of the complementary sequences of the reference sequences listed in Table 3 below are applied as oligonucleotides using standard techniques (DE 19612356; US5837832) to a suitable support, for example glass coated with gold. 10 to 25-mer nucleotide sequences, preferably 15-mers, are used. The sequences are chosen so that they include the functional mutations and the mutated complementary sequence (i.e. complementary sequence to the mutated reference sequence) is approximately in the middle relative to the native complementary sequence (i.e. complementary sequence to the native reference sequence).
  • the oligonucleotide probes are applied to the support in such a way that there is only one variant of the oligonucleotide in each case on the fields of the support.
  • LPL gene lipoprotein lipase gene
  • Table 3 A) to H) contains information about the nucleic acid sequences, the complementary sequences of which are applied as probes to the gene chip (for the sake of clarity, only the central region of the 10- to 25-mers is shown, the position with reference to the native reference sequence is specified by specifying the codon number).
  • the complementary sequence of the native reference sequence shown in the third column is applied to each reference sequence at a precisely defined location on the support.
  • the codon numbers given relate to the native gene sequence with the GenBank number of NCBINM_000237.
  • the deleted nucleotides are underlined.
  • the deleted bases are in lower case.
  • the mutations are derived from the normal gene sequence with the GenBank numbers M29549, M94221, M15856, M76722, M94222.
  • the larger deletion consists in the deletion of 2,100 nucleotides including exon 9.
  • the mutation was described at the level of the genomic DNA of Benlian (Journal of Lipid Research 1995, 36, page 356).
  • the rearrangement consists in the insertion of approx. 2,000 nucleotides into the 6th exon or 6th intron.
  • the mutation was determined at the level of the genomic DNA by Devlin et al. (American Journal of Human Genetics 1990, 46, page 112 ff).
  • a gene chip with preferably 15 to 18-mer oligonucleotide probes is produced.
  • the probes are complementary to the known mutated or native reference sequences of the following genes listed in Table 4:
  • a total of 6,298 hybridization sites are used in this exemplary embodiment for determining the genetic predisposition for arteriosclerosis on a DNA chip.
  • the common presence of these oligonucleotide probes on a support allows the simultaneous detection of these sequence variations from a patient sample. Therefore, this DNA chip is particularly suitable for use in epidemiological studies that aim to research the relative importance of genetic factors for the risk of heart attack.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Ermittlung des genetischen Arterioskleroserisikos, mit den Schritten Auswahl von für das Arterioskleroserisiko relevanter Referenznukleotidsequenzen einschlieβlich ihrer funktionell charakterisierten Mutationen; Aufbringen von Sonden dieser Nukleotidsequenzen bzw. derer Komplementärsequenzen auf einen Träger, Hybridisieren der Sonden mit Nukleotidsequenzen aus einer Patienten-Probe bzw. mit aus einer Patienten-Probe synthetisierten Nukleotidsequenzen, Nachweis der Hybridisierung und Auswerten der hybridisierung.

Description

"Herzchip"
Die Erfindung betrifft einen Genchip und ein Verfahren zum Bestimmen der genetischen Prädisposition für das Ausbilden arteriosklerotischer Erkrankungen und nimmt die Priorität der deutschen Patentanmeldung 101 11 925.9 in Anspruch, auf die inhaltlich Bezug genommen wird.
Erkrankungen des Herzkreislaufsystems stellen weltweit eine der häufigsten Todesursachen dar. In der Mehrzahl der Fälle sind solche Erkrankungen auf eine Verkalkung der großen und mittelgroßen Schlagader (Arteriosklerose) zurückzuführen. Von besonderer Bedeutung ist eine Arteriosklerose der Herzkranzgefäße und der Halsschlagader, da diese zum Herzinfarkt oder Schlaganfall führen kann. In Deutschland erleiden jährlich derzeit etwa 250.000 Menschen einen Herzinfarkt, der in der Hälfte der Fälle tödlich endet. Oftmals führt der Herzinfarkt bei den überlebenden Patienten zu erheblichen Folgeschäden und Behinderungen. Die Häufigkeit des Schlag- anfalls liegt in Deutschland etwa bei der Hälfte der Herzinfarktfälle; es verlaufen etwa ein Viertel aller Fälle tödlich. Die Folgeschäden sind oft verheerender als beim Herzinfarkt.
Bei der Arteriosklerose handelt es sich um ein komplexes Krankheitsbild, das auf multifaktorielle Ursachen zurückgeht. Dabei werden vornehmlich chemische und mechanische Schädigungen der Gefäße beispielsweise durch anhaltenden Nikotinkonsum, Stoffwechselstörungen wie z.B. Diabetes mel- litus oder zu Adrenalin- oder Noradrenalin-Ausschüttungen führende psy- chosomatische Einflüsse als wesentliche Ursachen diskutiert. Daneben spielen ein anhaltender Bluthochdruck und ein hoher Cholesteringehalt im Blut eine maßgebliche Rolle.
Darüber hinaus wurde bereits vor über 100 Jahren erkannt, daß sich innerhalb einiger Familien Herzinfarkte und Schlaganfälle häuften, so daß der Vererbung eine wichtige Rolle bei der Ausbildung der Arteriosklerose beigemessen wurde. Erst in den letzten 10 bis 15 Jahren hat man jedoch begonnen, die Gründe für die familiäre Häufung dieser Erkrankungen auf molekula- rer Basis zu verstehen.
Innerhalb der medizinischen Diagnostik kommt der Erfassung der Risikofaktoren zur Bestimmung des Arterioskleroserisikos ein hoher Stellenwert zu. Dazu werden biochemische Analysen beispielsweise der Cholesterin- bzw. der Fettwerte im Blut durchgeführt und der Patient wird nach Lebensgewohnheiten sowie nach in der Familie häufig vorkommenden Krankheiten befragt. Sofern überhaupt die genetischen Risikofaktoren erfaßt werden, erfolgt dies über eine vollständige Sequenzierung der entsprechenden Nukleotidsequenz des relevanten Gens oder durch eine Darstellung der betroffenen Genabschnitte beispielsweise mittels der allelspezifischen Poly- merasekettenreaktion, Restriktionslängenpolymorphismen oder der Single Strand conformation polymorphism-Mei ode (SSCP).
Nachteilig an diesen Methoden zur Erfassung der genetischen Disposition ist, daß sie in der Regel nur einzelne Sequenzveränderungen, allenfalls einzelne Gene erfassen. Darüber hinaus sind sie oft sehr arbeitsintensiv und erfordern Spezialkenntnisse sowohl bei der Durchführung als auch bei der Interpretation. Daher eignen sie sich nicht für die Untersuchung einer Vielzahl möglicherweise betroffener Personen. Der Erfindung liegt daher das Problem zugrunde, eine Diagnosemöglichkeit bereitzustellen, die eine schnelle und aussagekräftige Diagnose über die genetische Prädisposition zur Erkrankung an der Arteriosklerose erlaubt.
Dieses Problem wird gelöst mit einem Verfahren gemäß dem Hauptanspruch und einem Nukleotidträger gemäß dem nebengeordneten Erzeugnisanspruch. Vorteilhafte Weiterentwicklungen sind Gegenstand entsprechender Unteransprüche.
Der Erfindung liegt dabei der Gedanke zugrunde, eine geeignete Auswahl von für das genetische Arterioskleroserisiko relevanten Nukleotidsequenzen (bzw. die dazu komplementäre Sequenzen) sowie deren funktioneil charakterisierte Mutationen auf einen Träger (nachfolgend auch Genchip) zu bringen, diese Nukleotidsequenzen mit einer Nukleotidsequenzprobe eines Pati- enten zu hybridisieren und die Hybridisierung multifaktoriell auszuwerten. Die Nukleotidsequenzen stellen dabei Sonden für sog. Referenzsequenzen dar, deren indirekter oder direkter funktioneller Zusammenhang mit der Arteriosklerose bekannt ist oder vermutet wird. Sofern eine Sonde auf dem Träger mit Oligonukleotiden aus der Patientenprobe hybridisiert, ist der Nachweis für das Vorhandensein der entsprechenden Referenzsequenz bei dem Patienten erbracht.
Mit dieser simultanen Erfassung und multifaktoriellen Analyse einer Vielzahl von für das Arterioskleroserisiko relevanten mutierten Sequenzen geht der besondere Vorteil einher, daß etwaige Synergieeffekte zwischen verschiedenen Mutationen erkannt und dargestellt werden können. So ist es möglich, daß einzelne Mutationen für sich allein genommen kein erhebliches Risiko darstellen, treten sie jedoch in Kombination mit anderen - wiederum für sich allein genommen wenig bedeutsamen - Mutation auf, kann sich daraus ein beachtliches genetisches Risiko ergeben, das deutlich das Risiko aus der Summe der Einzelmutationen übersteigt. Dies gilt insbesondere auch für Mutationen, die im Zusammenhang mit der Arteriosklerose diskutiert werden, ohne daß ihnen jedoch derzeit eine konkrete Funktion zugewiesen werden kann (sog. Kandidatenmutationen).
Diese Vorteile werden nachfolgend an einem Beispiel veranschaulicht:
Es ist seit einiger Zeit bekannt, daß ein hoher Blutspiegel des Fettpartikels Lipoprotein (a) das Herzinfarktrisiko erhöht. Ebenso ist es bekannt, daß ein Faktor V der Gerinnungskaskade teilweise in einer veränderten Form vorliegen kann. Erst die Kombination des mutierten Faktors V mit einem hohen Lipoprotein (a)-Spiegel führt zu einer unerwartet großen Erhöhung des Risikos für eine Blutgerinnung in der Zentralvene des Gehirns und dadurch für einen frühzeitigen schweren Schlaganfall. Diese Synergieeffekte können nur durch eine geeignete Auswahl der Nukleotide und eine simultane Erfassung der genetischen Veränderungen erfaßt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren und der erfindungsgemäße Nukleotidträ- ger erlauben damit eine genauere Diagnose des Arterioskleroserisikos, insbesondere dann, wenn dieses Verfahren mit der Erfassung der konventionellen Risikofaktoren kombiniert wird. Eine genauere Diagnose ist eine wich- tige Voraussetzung für neue Behandlungsmethoden, die eine spezifische Behandlung genetischer Defekte in naher Zukunft erlauben werden, wie zum Beispiel die Gentherapie.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung liegt darin, daß alle relevanten Mutationen der ausgewählten Referenzsequenzen in nur einem Arbeitsgang erfaßt werden können, dessen Durchführung keiner Spezialkenntnisse bedarf. Dieses Verfahren eignet sich darüber hinaus für die Automatisierung und somit für die rasche Bearbeitung umfangreicher Probenserien. Somit wird erfindungsgemäß die gleichzeitige Erfassung relevanter Genveränderungen kosten- günstig, schnell und zuverlässig möglich. Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich aber nicht nur für die klinische Diagnostik sondern insbesondere auch als Hilfsmittel für die wissenschaftliche Forschung. So können damit z.B. Bevölkerungsstudien, die zum Ziel haben, den Zusammenhang zwischen genetischen Veränderung und dem Risiko für Herzinfarkt oder Schlaganfall zu präzisieren, erleichtert werden, da eine im Vergleich zu herkömmlichen Studien sehr viel höhere Anzahl von Studienteilnehmern erfaßt werden kann.
Da der erfindungsgemäße Nukleotidträger die Identifikation von Interaktio- nen zwischen Mutationen bzw. Mutationskombinationen sowie zwischen Mutationen und konventionellen Risikofaktoren beispielsweise aus der Familienanamnese, dem Stoffwechsel oder dem Blutcholesterinspiegel erlaubt, kann er zum besseren Verständnis der Entstehung arteriosklerotischer Erscheinungen beitragen. Er weist somit eine besondere Eignung als For- schungsreagenz auf.
Der Einsatz des erfindungsgemäßen Nukleotidträgers beruht auf der Hybridisierung der auf dem Träger aufgebrachten Nukleotidsequenzen mit komplementären Nukleotidsequenzen aus Probenmaterial des Patienten. Da die ausgewählten Nukleotidsequenzen Sonden für funktioneil für das Ausbilden der Arteriosklerose relevanten Referenzsequenzen bestimmter Gene darstellen, können mittels der Hybridisierung einzelne Gene oder Teile davon in einer Präparation genomischer DNA oder das Transkriptionsprodukt eines Genes (mRNA) nachgewiesen werden. [Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual. 2nd ed., vol. 2, 1989, Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 13.96-97; Constanzi C, Gille- spie D: Fast blots: immobilization of DNA and RNA from cells. In: Guide to molecular cloning techniques. Edited by Berger SR and Kimmel AR, Acade- mic Press Inc., San Diego: Methods in Enzymology 1987, 152: p582-87; Schena M et al.: Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995; 270: p467-470]. Die Hybridisierung kann mit einer Nachweisreaktion und anschließender Identifizierung einer Nukleinsäuresequenz kombiniert werden. Dazu kann ein Nukleinsäurestrang beispielsweise durch Farbstoffe, Radioaktivität oder chemolumineszierende oder fluoreszierende Moleküle markiert werden, wäh- rend der zweite an einem festen Träger beispielsweise aus Kunststoff oder Glas gebunden ist. Die Markierung der Nukleotidsequenz erfolgt dabei vorzugsweise bei der Synthese der Sequenz aus der Patientenprobe. Auf den Träger können mehrere tausend Oligonukleotide als Sonden aufgebracht werden. Die sich anschließende Hybridisierung auf dem Träger kann vorteil- hafterweise über einen Scanner ausgewertet werden, so daß sich die Auswertung weitgehend automatisieren läßt.
Im Kontext dieser Anmeldung werden die nachfolgenden Begriffe wie folgt verwendet:
Der Begriff "Hybridisierung" schließt jede Form der Paarung oder Aneinan- derlagerung von Nukleotidsequenzen ein. Die Hybridisierung kann sowohl unter stringenten als auch unter relaxierten Bedingungen erfolgen.
Der Begriff "Nukleotidsequenz" bezieht sich auf jede oligomere oder poly- mere Sequenz aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden oder aus einer Kombination daraus. Ebenso sind davon Ribonukleotide oder Desoxy- ribonukleotide mit Basenanaloga erfaßt. Nukleotidsequenzen können synthetischen oder natürlichen Ursprungs sein sowie auf rekombinante Verfah- ren zurückgehen.
Der Begriff "Arterioskleroserisiko" bezieht sich auf jede Erhöhung (oder Erniedrigung) der Wahrscheinlichkeit zur Ausbildung einer Arteriosklerose. Die Wahrscheinlichkeit bemißt sich an der Durchschnittswahrscheinlichkeit in der gesamten Bevölkerung. Sofern das Arterioskleroserisiko auf genetische Ursachen zurückzuführen ist, wird der Begriff genetisches Arterioskleroserisiko bzw. genetische Prädisposition oder nur Disposition verwendet. Unter "Mutationen" werden alle Formen der Veränderung der genetischen Informationen einer Nukleotidsequenz im Vergleich mit der Wildtypsequenz - auch native Sequenz - verstanden. Dabei kann es sich beispielsweise um Substitutionen, Insertionen oder Deletionen handeln. Ebenso sind komplexere Mutationen wie Inversionen und Indels möglich.
Der Begriff "Referenzsequenz" bezieht sich auf bestimmte Nukleotidsequenzen ausgewählter Gene, wobei ein Gen eine Vielzahl von Referenzsequen- zen einschließen kann. Die Referenzsequenzen können nativ, d.h. in der Wildtypformung, oder mutiert sein. Ein Zusammenhang zwischen den Mutationen und dem Arterioskleroserisiko ist bekannt oder wird vermutet, d.h. die Mutation ist funktionell charakterisiert bzw. relevant.
Der Begriff "Sonde" bezieht sich auf spezifische Oligonukleotidabschnitte einer Referenzsequenz bzw. dazu komplementärer Sequenzen. Damit erlaubt die Hybridisierung einer Oligonukleotidprobe mit einer Sonde den Nachweis der Referenzsequenz in dem Ursprungsgewebe der Probe. Die Sonden werden auf dem Nukleotidträger aufgebracht.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind auf dem Träger Sonden für Referenzsequenzen der in der nachfolgenden Tabelle 1 aufgeführten Gene aufgebracht, deren Mutationen zu einer Erhöhung des genetischen Arterios- kleroserisikos direkt oder indirekt beitragen. Alternativ können auch Sonden von zu den Referenzsequenzen komplementären Sequenzen verwendet werden (nachfolgend auch Komplementärsequenzen). Die Gene werden sowohl über ihre Codenummer aus der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) als auch über das für sie verwendete Symbol spezifiziert. Des weiteren enthält die Tabelle Angaben über die Häu- figkeit genetischer Veränderungen dieser Gene und die Anzahl bekannter Mutationen. Tabelle 1
Gene Symbol Häufigkeit der Anzahl der Krankheitsmerkmale Genveränderun- derzeit gen in der allg. bekannten Bevölkerung Genver- (soweit bekannt) änderungen
Fettstoffwechselgene Apolipoprotien A-I APOA1 Weniger als 28 Erniedrigung des high-density-Lipoproteincholesterinspiegels.
1:1.000
Apolipoprotein B 3500 APOB 1:600 Wie LDL-Rezeptor, etwas milder ausgeprägt.
Apolipoprotein B APOB 1:2 13 Möglicher Schutzfaktor gegen Herzinfarkt und Schlaganfall. Apolipoprotein E APOE ApoE2: 10% der 26 Bei Homozygotie für ApoE2: Hyperlipidämie, Träger eines
Bevölkerung; ApoE4- Alleis haben ein erhöhtes Risiko nicht nur für Herzinfarkt AρoE4: 20% der sondern auch für die Alzheimer-Krankheit.
Bevölkerung
Apolipoprotein H APOH 1:4 2 Hohe Triglyzeride bei Frauen. Mögliche Bedeutung für die Blutgerinnung
Adenosin Triphosphat- ABCA1 Weniger als 14 Starke Erniedrigung des high-density-Lipoproteincholesterin- Bindungskassetten1 :10.000 spiegels. Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt. transporter 1
Cholesterinester-Trans- CETP Weniger als 7 Erhöhte HDL-Cholesterinwerte. Möglicher Schutz gegen Arteferprotein 1:10.000, außer in riosklerose. Japan
Cholesterin 27- CYP27A1 Weniger als 9 Sehr stark erhöhtes Risiko für Arteriosklerose.
Hydroxlase (CTX) 1:10.000
Hepatische Lipase LIPC Weniger als 1 : 5 Hypertriglyzeridämie; mögliches erhöhtes Risiko für eine Arte10.000 riosklerose der Koronararterien.
Lecithinxholesterin LCAT Weniger als 31 Erniedrigung des high-density-Lipoproteincholesterinspiegels.
Acyltransferase 1:10.000 Trübung der Hornhaut und Nierenfunktionsstörungen können auftreten.
Low-density-Lipopro- LDLR 1:500 36 Erhöhung des Blutcholesterinsspiegels. Schwere Arteriosklerose tein-Rezeptor vor dem 40. Lebensjahr bei Männern, vor dem 50. Lebensjahr bei Frauen.
Lysosomale saure Lipase LIPA 1:750 25 Störungen der Leberfunktion, hohes Blutcholesterin, hohe Triglyzeride, niedriges HDL-Cholesterin. Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt.
Lipoprotein Lipase LPL Weniger als 81 Erhöhung des Bluttriglyzeridspiegels. Wahrscheinlich leichte 1:10.000 Erhöhung des Herzinfarktrisikos. Bei sehr hohen Bluttriglyze- ridwerte kann es zu einer schweren, manchmal lebensberohli- chen, Entzündung der Bauchspeicheldrüse kommen.
Microsomales Triglyze- MTP Unbekannt Möglicher Schutzfaktor gegen Herzinfarkt und Schlaganfall. rid Transferprotein
Blutdruck
Alpha-Adducin ADD1 1:10 1 Bluthochdruck.
Beta2 adrenergic recep- ADRB2 1:5 4 Bluthochdruck. tor
Angiotensinogen AGT 1:3 8 Bluthochdruck.
Angiotensin-Rezeptor 1 AGTR1 1:3 1 Zusammenhang mit hohem Blutdruck. düster of Differentiation CD36 1:300 3 Bluthochdruck, Fettstoffwechselstörung, Arteriosklerose.
36
Cytochrom P450/11 beta CYP11B1 Unbekannt, 1:50 in 25 Bluthochdruck.
Hydoxylase manchen Populationen
Angiotensin-Converting DCP1 1:4 1 Bluthochdruck. Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt
Enzym und Schlaganfall.
Dopamin-Rezeptor DRD2, Variabel, bis 1:10 4 Mögliche Assoziation mit Bluthochdruck. DRD4
Guaninnukleotidbin- GNB3 1:2 1 Bluthochdruck. dendes Protein, Beta 3
Hydroxysteroid-11-beta- HSD11B2 Unbekannt 17 Bluthochdruck.
Dehydrogenase 2
Neurofibromatose-Fak- NF1 1 :3500 22 Neurofibromatose Typ 1, Bluthochdruck. tor 1
Glukocorticoidrezeptor NR3C1 1:20 5 Schwerer Bluthochdruck.
Renin REN Unbekannt 2 Bluthochdruck.
Spannungsunabhängiger SCNN1B Unbekannt 7 Bluthochdruck, Natriumkanal 1 beta Spannungsunabhängiger SCNNIG Unbekannt 2 Bluthochdruck. Natriumkanal 1 gamma Spannungsunabhängiger SCNNIA Unbekannt 2 Bluthochdruck, Natriumkanal 1 alpha
Adhäsionmoleküle
Glykoprotein la GPIBA, 1:2 10 Assoziation mit Arteriosklerose der Koronararterien. GPIBB
Interzellulares AdhäsiICAM1 1:10 2 Mögliche Assoziation mit koronarer Herzkrankheit onsmolekül 1
Endotheliales LeukoITGA2 Unbekannt 3 Assoziation mit Herzinfarkt zytenadhäsionsmolekül 1
Integrin-ß3 ITGB3 Unbekannt 23 Assoziation mit Herzinfarkt.
E-Selektin SELE 1:5 3 Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt.
P-Selektin SELP 1:5 1 Möglicherweise Schutzfaktor gegen die Entwicklung einer Arteriosklerose.
Homocysteine-Stoff- wechsel
Cystathion-beta- CBS 1:10 88 Stark erhöhtes Risiko für Herzinfarkt. Synthase
Methyltetrahydrofolat- MTHFR Variabel, einige 12 Hoher Homocystein-Spiegel, erhöhtes Risiko für Arteriosklerose Homocystein Methyl- Polymorpismen der Koronararterien. transferase Reductase sehr häufig Methionin-Synthase MTR 1:7 1 Wie MTHFR. Methyltetrahydrofolat- MTRR 1:3 20 Wie MTHFR. Reduktase
Gerinnung
Antithrombin 3 AT3 1 :500 116 Verstärkte Gerinnung.
Gerinnungsfaktor II F2 1 :20 17 Verstärkte Gerinnung. Zusammenhang mit Arteriosklerose noch unklar.
Gerinnungsfaktor V F5 1:20 12 Gesicherter Risikofaktor für Thrombophilie und Schlaganfall
(insbes. zusammen mit erhöhtem Lp(a)).
Gerinnungsfaktor NU F7 Unbekannt: 1:50 in 40 B lutungsneigung. manchen Populationen
Gerinnungsfaktor VIII F8 1:10.000 480 Hämophilie A.
Gerinnungsfaktor IX F9 1 :30.000 667 Hämophilie B.
Gerinnungsfaktor X F 10 Weniger als 29 Leichte Blutungsneigung.
1:10.000
Gerinnungsfaktor XI F 11 Unbekannt: 1:10 in 20 Leichte Blutungsneigung. manchen Populationen
Gerinnungsfaktor XII F12 Bis zu 50% 10 Symptomlos bei alleinigem Auftreten, Kombinationswirkung unbekannt.
Gerinnungsfaktor XIIIA F13A Unbekannt, wahr38 Leichte Blutungsneigung. scheinlich weniger 1 :10.000
Gerinnungsfaktor XIIIB F13B 1:5 3 Leichte Blutungsneigung.
Fibrinogen alpha FGA Less than 1 in 9 Statistischer Zusammenhang zw. Polymorphismus und Herzin5.000 farkt.
Fibrinogen beta FGB 1:10 8 Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt.
Fibrinogen gamma FGG Less than 1 in 13 Symptomlos bei alleinigem Auftreten, Kombinationswirkung 5.000 unbekannt.
Heparin-Cofaktor 2 HCF2 Unbekannt 3 Schwere Arteriosklerose.
Lipoprotein (a) LPA 1:5 3 Erhöhter Spiegel führt zur schweren Arteriosklerose mit Herzinfarkt und Schlaganfall.
Plasminogen- Aktivator PAH 1 :8 2 Möglicherweise erhöhtes Risiko für Herzinfarkt.
Inhibitor- 1
Plasminogen PLG 1:3 14 Gerinnungsneigung.
Protein C PROC 1 :30 190 Teilweise schwere Gerinnungsneigung.
Protein S PROS Unbekannt 113 Gerinnungsneigung.
Tissue Factor Pathway TFP1 1:10 2 Gerinnungsneigung.
Inhibitor 1
Thrombomodulin THBD 1 :100 7 Zusammenhang mit Herzinfarkt beschrieben. von Willebrand Faktor VWF 1:50 117 Häufigste Ursache einer klinisch wichtigen Blutungsneigung.
Adipositas
Leptin LEP 1:10 4 Mutation beschrieben, die zu extremer Adipositas führt.
Leptin-Rezeptor LEPR 1:3 1 Kein Zusammenhang mit Übergewicht.
Diabetes mellitus
Glukokinase GCK 1:100 56 Einige Mutationen führen zu Diabetes.
Hepatocyte nuclear HNF1 1:30 67 Wie Glukokinase. factor 1
Hepatocyte nuclear HNF4A Unbekannt Wie Glucokinase. factor 4
Peroxisomen-Prolifera- PPARG 1 :5 Diabetes mellitus, Fettstoffwechselstörungen. tion aktivierender
Rezeptor-gamma
Peroxisomen-Prolifera- PPARA unbekannt Hypertriglyzeridämie. Erniedrigung des HDL-Cholesterins. tion aktivierender
Rezeptor-alpha
Zytokine
Stromelysin MMP3 1:2 1 Mögliche Assoziation mit Arteriosklerose der Koronararterien.
Tumor Necrosis-Faktor TNF Einige sind sehr 6 Mögliche Assoziation mit Arteriosklerose. alpha häufig (1 :3)
Die einzelnen Referenzsequenzen dieser Gene sind Gegenstand der Tabelle 2. Die Referenzsequenzen sind wiederum über ihre Codenummern der GenBank des National Center for Biotechnology Information (NCBI) identifizierbar (nachfolgend auch GenBank).
Im folgenden wird die Erfindung anhand folgender Ausführungsbeispiele des näheren erläutert.
Ausführungsbeispiel 1 :
Feststellung von Veränderungen im Lipoprotein-Lipase-Gen
Sonden der Komplementärsequenzen der in der nachfolgenden Tabelle 3 aufgelisteten Referenzsequenzen werden als Oligonukleotide mit Hilfe von Standardtechniken (DE 19612356; US5837832) auf einen geeigneten Träger, beispielsweise mit Gold beschichtetes Glas, aufgebracht. Dabei werden 10- bis 25-mere Nukleotidsequenzen, vorzugsweise 15-mere, verwendet. Die Sequenzen werden dabei so gewählt, daß sie die funktioneilen Mutationen einschließen und die mutierte Komplementärsequenz (i.e. Komplementärsequenz zu der mutierten Referenzsequenz) relativ zu der nativen Komplementärsequenz (i.e. Komplementärsequenz zu der nativen Referenzsequenz) etwa in der Mitte liegt.
Die Oligonukleotidsonden werden so auf den Träger aufgebracht, daß sich auf den Feldern des Trägers jeweils nur eine Variante der Oligonukleotide befindet. Bezüglich der bekannten Mutationen im Lipoprotein-Lipase Gen (LPL-Gen) ergeben sich 164 Felder, wobei z.B. das Feld 1.1 die Sequenz 5'-CTGGAGCCACACGGC-3' (komplementär zu der Referenzsequenz 5'- GCCGTGTGGCTCCAG-3'; Tabelle 2, Zeile 1 , Spalte 2, angegebene Sequenz unterstrichen) und das Feld 1.2 die mutierte Komplemetärsequenz 5'-CTGGAGICACACGGC-3' (komplementär zu der mutierten Referenzsequenz 5'-GCCGTGTGACTCCAG-3'; Tabelle 2, Zeile 1 , Spalte 3; Mutation unterstrichen) trägt. Für die Belegung der Felder 2.1 und 2.2 wird die Sequenzinformation der Zeile 2 der Tabelle 2 entsprechend benutzt usw.
Die Tabelle 3 A) bis H) enthält Angaben über die Nukleinsäuresequenzen, deren komplementäre Sequenzen als Sonden auf den Genchip aufgebracht werden (zwecks besserer Übersichtlichkeit wird nur der zentrale Bereich der 10- bis 25-mere gezeigt, die Position mit Bezug auf die native Referenzsequenz wird durch Angabe der Kodon-Nummer spezifiziert). Zu jeder Referenzsequenz wird an genau definierter Stelle auf dem Träger die komplementäre Sequenz der aus der dritten Spalte ersichtlichen nativen Referenzsequenz aufgebracht. Die angegebenen Kodon-Nummern beziehen sich auf die native Gensequenz mit der GenBank-Nummer der NCBINM_000237.
Tabelle 3:
A) Missense- oder Nonsense-Mutationen
Spalte 1 kennzeichnet die Kodon-Nummer. In der letzten Spalte ist der die
B) Spleißvarianten
Die Lage der nativen Referenzsequenzen (abgeleitet aus der Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221 , M15856, M76722, M94222) ergibt sich aus den Spalten 1-3. Die Spalte 4 spezifiziert die Mutation.
C) Kleine Deletionen
Die deletierten Nukleotide sind unterstrichen.
*Abgeleitet aus der normalen Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221 , M15856, M76722, M94222.
D) Kleine Insertionen
E) Indels (Insertionen/Deletionen)
Kodon-Nr.* Deletion Insertion 69 AAACTTGTGGccgcCCTGT GG ACAAG
Die deletierten Basen sind in Kleinbuchstaben angegeben.
Die Mutationen sind abgeleitet aus der normalen Gensequenz mit den GenBank-Nummern M29549, M94221 , M15856, M76722, M94222.
F) Größere Deletionen
Die größere Deletion besteht in der Deletion von 2.100 Nukleotiden inklusive des Exons 9. Die Mutation wurde auf Ebene der genomischen DNA von Benlian beschrieben (Journal of Lipid Research 1995, 36, Seite 356).
G) Komplexe Rearrangierungen
Die Rearrangierung besteht in der Insertion von ca. 2.000 Nukleotiden in das 6. Exon bzw. 6. Intron. Die Mutation wurde auf Ebene der genomischen DNA von Devlin et al. beschrieben (American Journal of Human Genetics 1990, 46, Seite 112 ff).
H) Regulatorische Defekte
*Relativ zu der Startstelle der Transkription des LPL- Gens mit den GenBank-Nummern M29549, M94221 , M15856, M76722, M94222.
Beispiel 2: Ermittlung des genetischen Arterioskleroserisikos
Analog zu dem Ausführungsbeispiel 1 wird ein Genchip mit vorzugsweise 15- bis 18-mere Oligonukleotidsonden hergestellt. Die Sonden sind dabei komplementär zu den bekannten mutierten bzw. nativen in der Tabelle 4 aufgeführten Referenzsequenzen der folgenden Gene:
Tabelle 4:
Die Anzahl der benötigten Hybridisierungsstellen und diagnostizierbaren Erkrankungen ist aus Tabelle 5 ersichtlich. Die bekannten funktionell relevanten Mutationen sind im Anhang aufgeführt.
Tabelle 5: Erfassung der genetischen Prädisposition zur Entwicklung einer
Insgesamt werden in diesem Ausführungsbeispiel 6.298 Hybridisierungsstellen für die Ermittlung der genetischen Prädisposition für die Arteriosklerose auf einem DNA-Chip verwendet. Die gemeinsame Präsenz dieser Oligonukleotidsonden auf einem Träger erlaubt die simultane Erfassung dieser Sequenzvariationen aus einer Patientenprobe. Deshalb eignet sich dieser DNA-Chip insbesondere für den Einsatz in epidemiologischen Studien, die das Ziel verfolgen, die relative Wertigkeit genetischer Faktoren für das Herzinfarktrisiko zu erforschen.
Die funktionell relevanten Mutationen der in Tabelle 5 aufgeführten Gene sind in der Tabelle 6 enthalten. Diese oder auch ihre Komplementarsequenzen werden auf einen Nukleotidträger aufgebracht.
Liste 3
Punktmutationen
Spleißdefekte
Kleine Deletionen
1544 |ACTCCΛTACATgGTGACCGTGG VWF
Sonstige Mutationen

Claims

Patentansprüche:
1. Verfahren zur Ermittlung des genetischen Arteriosklerosehsikos umfassend folgende Schritte:
Auswahl von für das Arterioskleroserisiko relevanter Referenznu- kleotidsequenzen einschließlich ihrer funktionell charakterisierten Mutationen;
Aufbringen von Sonden dieser Nukleotidsequenzen bzw. derer Komplementärsequenzen auf einen Träger;
Hybridisieren der Sonden mit Nukleotidsequenzen aus einer Patienten-Probe bzw. mit aus einer Patienten-Probe synthetisierten Nukleotidsequenzen;
Nachweis der Hybridisierung und
Auswerten der Hybridisierung.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , gekennzeichnet durch eine Markierung der aus einer Patienten-Probe synthetisierten Nukleotidsequenz.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch eine multifaktorielle Auswertung der Hybridisierung.
4. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch Sonden aus 10- bis 25-meren Oligonukleotiden.
5. Verfahren nach Anspruch 4, gekennzeichnet durch 15- bis 18-mere Oligonukleotidsonden.
6. Verfahren nach Anspruch 5, gekennzeichnet durch 15-mere Oligonukleotidsonden.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, gekennzeichnet durch eine oder mehrere der in Tabelle 2 angegebenen Referenzsequenzen bzw. deren Komplementärsequenzen.
8. Verfahren nach Anspruch 7, gekennzeichnet durch eine Auswahl der in den Tabellen 3 und 6 angegebenen funktioneilen Mutationen.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, gekennzeichnet durch Oligonukleotidsonden, die zu mindestens 90% identisch oder komplementär zu einer Auswahl der in Tabelle 3 und 6 angegebenen funktioneilen Mutationen sind.
10. Nukleotidträger mit einer Auswahl von Oligonukleotidsonden, die identisch oder komplementär zu Abschnitten von für das genetische Arterioskleroserisiko relevanten Referenzsequenzen sind.
11. Nukleotidträger nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Referenzsequenzen eine Auswahl der in der Tabelle 2 aufgeführten Referenzsequenzen darstellen.
12. Nukleotidträger nach Anspruch 11 gekennzeichnet durch eine Auswahl der in den Tabellen 3 und 6 dargestellten Oligonukleotidsonden.
13. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 10 bis 12, gekennzeichnet durch 10- bis 25-mere Oligonukleotidsonden.
14. Oligonukleotidträger nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch 15- bis 18-mere Oligonukleotidsonden.
15. Nukleotidträger nach Anspruch 14, gekennzeichnet durch 15-mere Oli- gonukleotidträger.
16. Nukleotidträger nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Träger aus mit Gold beschichtetem Glas besteht.
17. Verwendung des Oligonukleotidträgers nach einem der Ansprüche 10 bis 16 zur simultanen Diagnose mindestens zweier für das genetische Arterioskleroserisiko relevanter Gene.
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