EP1349871A2 - Neue marker für die diagnose und therapie von tumoren - Google Patents

Neue marker für die diagnose und therapie von tumoren

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Publication number
EP1349871A2
EP1349871A2 EP01993706A EP01993706A EP1349871A2 EP 1349871 A2 EP1349871 A2 EP 1349871A2 EP 01993706 A EP01993706 A EP 01993706A EP 01993706 A EP01993706 A EP 01993706A EP 1349871 A2 EP1349871 A2 EP 1349871A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
nucleic acid
acid sequence
tumor
protein
ctcl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01993706A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Stefan EICHMÜLLER
Dirk Schadendorf
Dirk Usener
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Original Assignee
Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ filed Critical Deutsches Krebsforschungszentrum DKFZ
Publication of EP1349871A2 publication Critical patent/EP1349871A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to the use of new markers for the diagnosis or therapy of tumor diseases, preferably CTCL.
  • Cutaneous T-cell lymphomas represent a heterogeneous group of diseases in which CD4-T cells predominate as the malignant cell type. In most cases, the mono- or at least oligoclonal origin of the malignant cells is documented using T-cell receptor rearrangements. In addition to various other subtypes, mycosis fungoides and Sezary syndrome (SS) are the most common forms of CTCL. Both diseases are monoclonal T-helper memory lymphomas that are characterized by cutaneous plaques, tumors or erythroderma. SS is also characterized by generalized lymphadenopathy and the presence of neoplastic T cells in peripheral blood.
  • Therapeutic approaches include the stage-dependent selection of PUVA (psoralen and UV-A), retinoids, interferon ⁇ -2a in combination with acitretin or PUVA, various immunomodulators, electron radiation or extracorporeal photopheresis. These procedures are successful in the early stages of the disease, but not in the aggressive later stages.
  • Possible useful future therapies for CTCL include immunological therapies, e.g. Vaccination with peptides or peptide-loaded dendritic cells as has already been used to treat melanoma.
  • the present invention is therefore essentially based on the technical problem of identifying and providing markers (genes or their products) which are associated with tumors, in particular CTCL, and which may be of diagnostic and / or therapeutic benefit in the context of vaccination therapy ,
  • CTCL-specific antigens were identified by screening a testis cDNA bank or a cDNA bank which had been produced from tumor RNA from various cutaneous lymphomas with sera from tumor patients. About 3 x 10 6 recombinants were screened with sera from patients with Sezary syndrome or mycosis fungoides. The results show that tumor antigens from CTCL tumors can be identified with antibodies derived from tumor patients. It was possible to identify positive clones belonging to 19 different genes / ORFs, including five previously unknown sequences.
  • CTCL-associated antigens (independent of the T cell receptor) could be identified for the first time, which thus represent valuable tumor markers.
  • the identification of such antigens is of interest since the encoded proteins and peptides derived therefrom serve as target structures, for example for cytotoxic cells, and can be used as antigens for the production of diagnostic or therapeutic antibodies.
  • the peptides or fragments thereof encoded by the nucleic acids according to the invention can either be applied directly or loaded onto antigen-presenting cells.
  • the peptides representing antigens can also be expressed with the aid of vectors in different cells (eg dendritic cells as antigen-presenting cells).
  • the identified nucleic acids also form the basis for the development of diagnostic tests in order to ensure a more reliable and early diagnosis of those affected in the future.
  • functional analyzes of the proteins will undoubtedly contribute to an understanding of tumor development.
  • the nucleic acids according to the invention are thus to be regarded as candidate genes for studies of the pathomechanisms which underlie various tumor diseases, such as, for example, CTCL.
  • the present invention thus relates to a diagnostic composition which has at least one
  • Li9-4 (Fig. 19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5
  • the present invention furthermore relates to a medicament which contains a nucleic acid sequence, the altered expression of which is associated with a tumor disease, the nucleic acid sequence se20-10 (FIG. 2), se57-l (FIG. 3), Lgl-2 ( Fig. 5), sel-1 (Fig.
  • the present invention further relates to a diagnostic composition or a medicament defined above, the nucleic acid sequence, the altered expression of which is associated with a malignant tumor disease, comprising a nucleic acid sequence,
  • hybridizing nucleic acid sequence refers to a nucleic acid sequence which hybridizes with a nucleic acid sequence shown in the figures under usual conditions, in particular at 20 ° C. below the melting point of the nucleic acid.
  • hybridize used in the present invention refers to conventional hybridization conditions, preferably to hybridization conditions in which 5xSSPE, 1% SDS, lxDenhar dts solution is used and / or the hybridization temperature between 50 ° C. and 70 ° C, preferably 65 ° C.
  • washing is preferably carried out first with 2xSSC, 1% SDS and then with 0.2xSSC at temperatures between 50 ° C and 70 ° C, preferably at 65 ° C (for the definition of SSPE, SSC and Denhardts solution see Sa brook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).
  • SSPE SSC
  • Denhardts solution see Sa brook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)).
  • Stringent hybridization conditions as described, for example, in Sa brook et al. , supra.
  • variants used in the present invention encompass nucleic acid sequences which differ from the sequences indicated in the figures or the above hybridizing sequences by deletion (s), insertion (s), exchange (s) and / or others Distinguish modifications known in the prior art or comprise a fragment of the original nucleic acid sequence, the protein encoded by these nucleic acid sequences also having one or more of the properties described above or in the examples.
  • This also includes allele variants.
  • the variants have a homology to the claimed sequences of at least 70%, at least 80%, preferably at least 90%, very preferably at least 95%, 96%, 97%, 98% or 99%.
  • fragment refers to a fragment that has a length of at least 12, preferably at least 20 and even more preferably at least 25 nucleotides.
  • the nucleic acid olefin defined above is a cDNA.
  • the nucleic acid sequence is a genomic DNA which is preferably derived from a mammal, for example a human. Screening methods based on nucleic acid hybridization allow the Isolation of the genomic DNA molecules according to the invention from each organism or derived genomic DNA banks, using probes which contain the nucleic acid sequence shown in the figures or a fragment thereof.
  • the nucleic acid sequences can also be inserted into a vector or expression vector.
  • vectors are known to the person skilled in the art.
  • these vectors are e.g. B. pGEMEX, pUC derivatives (e.g. pUC8), pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b and pQE-8.
  • yeast e.g. To name pYlOO and Ycpadl
  • animal cells e.g. pKCR, pEFBOS, cDM8 and pCEV4 must be specified.
  • the baculovirus expression vector pAcSGHisNT-A is particularly suitable for expression in especially insect cells.
  • the nucleic acid sequence in the vector is functionally linked to regulatory elements which allow its expression in prokaryotic or eukaryotic host cells.
  • regulatory elements for example a promoter
  • such vectors typically contain an origin of replication and specific genes which allow the phenotypic selection of a transformed host cell.
  • the regulatory elements for expression in prokaryotes for example E.
  • coli include the lac, trp promoter or T7 promoter, and for expression in eukaryotes the A0X1 or GALl promoter in yeast, and the CMV, SV40 , RVS-40 promoter, CMV or SV40 enhancer for expression in animal cells.
  • suitable promoters are the metallothionein I and the polyhedrin promoter.
  • Suitable vectors include in particular T7-based expression vectors for expression in bacteria
  • Host organisms can be transformed with the vectors described above. These transformants include bacteria, yeast, insect and other animal cells, preferably mammalian cells.
  • the E. coli strains HB101, DHl, xl776, JM101, JM109, BL21, XLlBlue and SG 13009, the yeast strain Saccharomyces cerevisiae and the animal cells L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa and the insect cells sf9 are preferred. Methods for transforming these host cells, for phenotypically selecting transformants, and for expressing the above nucleic acid sequences using the vectors described above are known in the art.
  • nucleic acids are particularly suitable as an antigen-coding structure for therapeutic purposes.
  • the aim is to stimulate the immune system, to eliminate tumor cells that are identified by a nucleic acid.
  • ways e.g. B. Injecting the naked DNA into the patient.
  • a plas id with a very active promoter and at least one nucleic acid according to the invention which in particular se20-10, se57-l, Lgl-2, sel-1, se2-l, se2-2, sel4-3, se20-7, se20-9, se33-l, se37-2, L14-2, L15-7, Li9-1, Li9-4, LÜ5-2, LiilO-6, Liii4-5 or GBP-TA, for example in the muscle or injected intradermally.
  • the nucleic acid sequence can not only be inserted into a vector for the purposes of recombinant production, but also to inject the DNA with the aid of vectors into patients, where it encodes an antigen for therapeutic purposes.
  • the aim is that the cells take up the plasmid, produce antigens, present individual peptides via HLA molecules and thus elicit a cytotoxic T-cell immune response. This should then lead to the defense against tumor cells.
  • this procedure is described in Conry et al. , Clinical Cancer Research 4, pp. 2903-2912 (1998).
  • a an alternative way is the "gene gun” method, which is described in Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Be. USA 90, pp.
  • the nucleic acid is brought to the HLA presentation of the encoded protein with the aid of a vector in vivo antigen-presenting cells (APCs), for example dendritic cells.
  • APCs antigen-presenting cells
  • the vector containing the nucleic acid according to the invention can be injected in various ways: a) Lipid or liposome-packed DNA or RNA, for example generally described by Nabel et al. , Proc. Natl. Acad. Be. USA 93, pp. 15388-15393 (1996). b) With a bacterium as a transport vehicle for the expression vector.
  • Suitable bacteria are, for example, (attenuated) listeria [eg Listeria monocytogenes], Salmonella strains [eg Salmonella spp.].
  • this technique is from Medina et al. , Eur. J. Immuno1. 29., pp. 693-699 (1999) and Guzman et al., Eur. J. Immuno1. 28, pp. 1807-1814 (1998).
  • WO 96/14087 Weiskirch et al., Immunological Reviews 158, pp. 159-169 (1997) and US-A-5, 830, 702.
  • Gene-Gun (Williams et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 / pp. 2726-2730, 1991).
  • the vector containing the above nucleic acid sequences is a virus, for example an adenovirus, vaccinia virus or an AAV virus, which is useful in gene therapy.
  • Retroviruses are particularly preferred. Examples of suitable retroviruses are MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV or GaLV.
  • the aforementioned viruses and fowlpox virus, canarypox virus, influenza virus or Sindbis virus are also suitable as the basis of a vaccine.
  • Such new vaccines which confer anti-tumor immunity after administration to the patient are described, for example, by N. Restifo, Current Opinion in Immunology 8, pp. 658-663 (1996) or Ying et al. , Nature Medicine 5 (7), p.
  • the above nucleic acid sequences can also be transported to the target cells in the form of colloidal dispersions. These include, for example, liposomes or lipoplexes (Mannino et al., Biotechniques 6. (1988), 682). It is further preferred to generate tumor immunity, to transfect a nucleic acid sequence above into antigen presenting cells and to inject them into the patient.
  • a plasmid is placed in vitro in an antigen-presenting cell (APCs), for example dendritic cells, which then produce antigens and present individual peptides via HLA molecules.
  • APCs antigen-presenting cell
  • the plasmid DNA can be brought into the antigen-presenting cells in various ways:
  • the protein encoded by a nucleic acid above that is associated with the presence of a malignant tumor disease can also be produced.
  • the method preferably used for this comprises culturing the host cells described above under conditions which allow expression of the protein (preferably stable expression) and obtaining the protein from the culture.
  • Suitable methods for the recombinant production of the protein are generally known (see, for example, Holmgren, Annu. Rev. Bioche. 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio / Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr.Opin.Biotech . 6 (1995), 517; Romanos, Curr.Opin.Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al., Curr. Opin. Biotech.
  • the exchanges preferably include "conservative" exchanges of amino acid residues, ie exchanges for biologically similar residues, for example the substitution of a hydrophobic residue (for example isoleucine, valine, leucine, methionine) for another hydrophobic residue, or the substitution of one polar residue for another polar residue (eg arginine against lysine, glutamic acid against aspartic acid etc.)
  • a hydrophobic residue for example isoleucine, valine, leucine, methionine
  • one polar residue eg arginine against lysine, glutamic acid against aspartic acid etc.
  • HLA-dependent peptide fragments are determined from the sequence of the protein according to the invention either by means of appropriate computer programs or by means of experiments (e.g. phagocytotic uptake of the total protein, then analysis of the presenting peptides). These are artificially produced using methods known to those skilled in the art and then injected into the patient (possibly with factors stimulating the immune system, e.g. interferons, interleukins, etc.).
  • the aim of this treatment is that the APCs take up the peptides, present them and thus stimulate the production of tumor-specific cytotoxic T cells in vivo. In general, this principle has been described by Melief et al., Current Opinion in Immunology 8, pp. 651-657 (1996).
  • the above protein or fragments thereof can also be loaded onto APCs in vitro.
  • the loaded cells are then injected into the patient's lymph nodes, for example, and directly stimulate and multiply tumor-specific cytotoxic T cells (Nestle et al., Nature Medicine 4 (3), p. 328 ff. (1998); crizot al., In: Burg, Dummer, Strategies for Immunointerventions in Dermatology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, pp. 399-409, 1997)
  • nucleic acid sequence which contains the nucleic acid sequence se20-10 (FIG. 2), se57-l (FIG. 3), Lgl-2 (FIG. 5), sel-1 (FIG. 6) , se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-7 (Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l ( Fig.13), se37-2 (Fig.14), L14-2 (Fig.16), L15-7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18), Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5 (Fig. 22) or GBP-TA or a protein or a fragment thereof encoded.
  • nucleic acid sequence which contains the nucleic acid sequence se20-10 (FIG. 2), se57-l (FIG. 3), Lgl-2 (FIG. 5), sel-1 (FIG. 6) , se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.
  • the present invention also relates to antibodies which specifically recognize the proteins (tumor antigens) described above.
  • the antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof, for example Fab, Fv or scFv fragments. These are preferably monoclonal antibodies.
  • For the production it is favorable to immunize animals, in particular rabbits or chickens for a polyclonal and mice for a monoclonal antibody, with an above (fusion) protein or fragment (s) thereof. Further "boosters" of the animals can be carried out with the same (fusion) protein or fragments thereof.
  • the polyclonal antibody can then be obtained from the serum or egg yolk of the animals.
  • the antibodies according to the invention can be produced according to standard methods, the protein encoded by the above-mentioned nucleic acid sequences or a synthetic fragment thereof serving as an immunogen.
  • Monoclonal antibodies can be produced, for example, by the method described by Köhler and Milstein (Nature 256 (1975), 495) and Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3), wherein mouse myeloma cells are fused with spleen cells derived from immunized mammals , These antibodies can, for example, for immunoprecipitating the above discussed proteins or used to isolate related proteins from cDNA expression banks.
  • the antibodies can be bound, for example, in liquid phase immunoassays or to a solid support.
  • the antibodies can be labeled in different ways. Suitable markers and labeling methods are known in the art. Examples of immunoassays are ELISA and RIA.
  • the antibodies can also be used therapeutically.
  • a protein encoded by the above nucleic acid sequences as a target for bispecific antibodies.
  • the antibodies of the invention are suitable for. B. to trap overexpressed antigen in tumors and thus inhibit tumor growth, since there are indications that in some cases the presence of tumor antigens not only indicates the presence of malignant tumors, but actively promotes tumor growth.
  • RNA antisense DNA
  • ribozymes can inhibit the translation of the above nucleic acid sequences, the expression of which is increased in tumors, and thus have a therapeutic effect specifically on these nucleic acid sequences or genes.
  • RNA / DNA hybrids form in the corresponding tumor cells, which thus prevent transcription and - in the case of antisense RNA - simultaneously break down the hybrids (and thus the RNA) by RNase H (Scanion et al., The Faseb Journal 9, pp. 1288-1296, 1995)
  • the present invention thus relates to a medicament or a diagnostic composition which contains the nucleic acid sequences, vectors, proteins, antibodies etc. or combinations thereof described above, or to the use thereof for diagnosis and / or therapy. These are preferably used for the diagnosis or treatment of malignant tumor diseases, in particular CTCL. Is preferred the provision of a vaccination agent based on either the nucleic acid sequence or the protein / peptide id as described above.
  • the diagnostic composition is suitable on the one hand to determine a malignant tumor disease, but also to carry out a follow-up, for example to accompany the therapy.
  • the above drugs may also contain a pharmaceutically acceptable carrier.
  • Suitable carriers and the formulation of such medicaments are known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicaments can be administered orally or parenterally. Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial, intramuscular, subcutaneous, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, or intranasal administration.
  • the appropriate dosage is determined by the attending physician and depends on various factors, for example the age, gender, weight of the patient, the stage of the disease, the type of administration etc.
  • a nucleic acid sequence above can also be used as a probe to isolate DNA molecules, for example derived from another species or organism, which encode a protein with the same biological activity.
  • the probe preferably has a length of at least 20, particularly preferably at least 25, bases.
  • Suitable detection methods based on hybridization are known to the person skilled in the art, for example Southern or Northern blot.
  • Suitable labels for the probe are also known to the person skilled in the art and include, for example, labeling with radioisotopes, bioluminescent, chemiluminescent, fluorescent labels, metal chelates, enzymes etc.
  • this can also be done by PCR (Wiedmann et al., PCR Methods Appl. 3, pp. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, pp. 163-166 (1986)) or "Ligase chain reaction "(LCR)
  • primers being derived from the sequence in the figures and suitable primers (in terms of length, complementarity to the matrix, the region to be amplified, etc.) according to the person skilled in the art usual procedures can be designed.
  • the present invention also relates to a method for
  • nucleic acids and / or proteins in the form of an ELISA kit, protein chips, nucleic acid chips or a membrane loaded with DNA, RNA or protein.
  • This diagnostic method is preferably a method which comprises the following steps:
  • Detection of an amplified product or hybridization as an indication of the presence (or Non-existence) of a tumor disease (depending on whether the respective nucleic acid sequence is expressed more or less (or not) in the tumor compared to control tissue.)
  • Primers are used which flank a nucleic acid sequence discussed above or suitable subregions. Amplification products of RNA from the tissue in question are of diagnostic importance, which differ from the amplification products of mRNA from healthy tissue with regard to the occurrence of tumor-specific, in particular CTCL-specific bands.
  • a method which comprises the following steps: isolation of RNA from the patient,
  • RNA or poly (A) + RNA from biological samples
  • size-separating gels for example denaturing agarose gels
  • the production and labeling of the probe and the Detection via "Northern blot” can be applied.
  • a possible tumor disease can also be diagnosed by a method which comprises the following steps:
  • This detection can also be performed using standard techniques known to those skilled in the art. These are also known cell disruption processes which allow the isolation of the antibodies in such a way that they can be brought into contact with the antigen.
  • the detection of the bound antibody is preferably carried out via immunoassays, for example Western blot, ELISA, FACS or RIA or immunohistochemical methods. This is preferably done via ELISA or "dot blot".
  • immunoassays for example Western blot, ELISA, FACS or RIA or immunohistochemical methods. This is preferably done via ELISA or "dot blot".
  • the above nucleic acid sequences or fragments thereof can be cloned into expression plasmids and the corresponding proteins can be produced recombinantly, preferably as fusion proteins with a "His tag", which facilitates their purification.
  • the proteins are then applied to membranes or other suitable surfaces, if necessary fixed and incubated with adequately diluted patient sera. After the usual washing steps, an incubation with a secondary labeled antibody then takes place according to routine procedures for the detection of the bound patient antibodies.
  • the patient sera are preferably incubated with a large number of marker proteins (antigens), since the detection of the presence (or absence) of different antibodies better indicates the underlying tumor disease and may also allow classification according to the stage of the disease.
  • the present invention further relates to a kit for carrying out the diagnostic methods according to the invention, which contains the antibody according to the invention or a fragment thereof, a protruding protein (or peptide derived therefrom), a nucleic acid sequence according to the invention (as a probe) or one which is suitable, for example, for PCR or LCR Sequence of the nucleic acid sequences according to the invention based primer (or a pair of primers) contains, optionally in combination with a suitable detection means.
  • the compounds contained in the kit can be immobilized on a suitable carrier, ie in the form of a chip or bound on a membrane.
  • Fig.l nucleic acid sequence of se2-5 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 2 nucleic acid sequence of se20-10 and an ORF derived therefrom
  • nucleic acid sequence of Lgl-2 and an ORF derived therefrom 6 nucleic acid sequence of sel-1 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 8 Nucleic acid sequence of se2-2 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 9 Nucleic acid sequence of sel4-3 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 13 Nucleic acid sequence of se33-1 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 14 nucleic acid sequence of se37-2 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 15 Nucleic acid sequence of se89-l and an ORF derived therefrom
  • Fig. 16 L14-2 nucleic acid sequence and an ORF derived therefrom
  • Fig. 17 nucleic acid sequence of L15-7 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 18 Nucleic acid sequence of Li9-1 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 19 Nucleic acid sequence of Li9-4 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 20 Nucleic acid sequence of LÜ5-2 and an ORF derived from it
  • Fig. 21 Nucleic acid sequence of LiilO-6 and an ORF derived therefrom
  • Fig. 22 Nucleic acid sequence of Liii4-5 and an ORF derived therefrom
  • FIG. 23 GBP-TA nucleic acid sequence and an ORF derived therefrom
  • Fig. 24 Localization of GBP-TA, GBP-TA short and Lgl-2 on chromosome lp22.3. The primers used to differentiate the splicing variants are shown.
  • Primer set II aga agg aag aaa ctc caa aca cat cc (forward) cca tat cca aat tcc ctt ggt gtg ag (right) Anneal ing temp. 48 ° C
  • Sera and tumor tissue were obtained in routine diagnostic or therapeutic procedures with the patient's consent (and the permission of the responsible ethics committee). The tissues and sera were stored at -20 ° C or -80 ° C.
  • the plates were placed at 37 ° C above sea level. incubated and the proteins transferred to nitrocellulose membranes for 4 hours at 37 ° C. and bound.
  • the membranes were washed with TBS containing Tween-20 TM (0.05%), saturated with 5% dry milk powder in TBS and incubated with sera (either from patients or as a control from healthy subjects) at a final concentration of 1/100.
  • Reactive proteins were detected with an alkaline-phosphatase-coupled secondary antibody (goat anti-hu an-IgC, Fc fragment; Dianova, Hamburg, Germany) and using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate and nitroblue tetrazolium made visible.
  • the sequencing was carried out using an automatic fluorescence sequencer (model 377; Perkin-Elmer / Applied Biosystems, Forster System, CA, USA) and the dye terminator method according to the manufacturer's instructions ("ABI PRISM Big Dye Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit "; Perkin-Elmer) performed. Primers have been chemically synthesized. The sequences of the clones were completely determined on both complementary strands.
  • Tissue samples obtained from 17 CTCL patients served as the source for the production of tumor cDNA 13 mycosis fungoides (Stage Ib to IVb, mainly Ilb), 2 Sezary syndromes (stage III), 1 T-zone lymphoma (stage IVb) and 1 CD30 + CTCL (stage Ilb).
  • cDNAs were produced from the following 4 CTCL cell lines: My-La (Mycosis fungoides; Kaltoft et al., In Vitro Cell Dev. Biol. 28a (1992), 161-167), SeAx (Sezary Syndrome; Kaltoft et al. , Arch. Dermatol. Res.
  • cDNA was produced from six leukemia cell lines (ARA-10, Jurkat, KGl, K562, Nalm-2 and SKW6. And 22 melanoma cell lines.
  • Control cDNAs were used extensively to analyze tissue distribution within normal tissues, including three fields of commercially available cDNAs (all from Clontech, CA, USA): human "multiple tissue" cDNA field I, field II and human fetal MTC -Field. In addition, various commercially available total RNAs for the production of further control cDNAs were generated using the method described above. Finally, cDNAs from three activated CD8 + T cell lines (Möller et al., British Journal of Cancer 77 (1998), 1907-1916) also served as control T cells.
  • RT-PCR was preferred to examine the identified sequences within different normal tissues and tumor tissues. In selected cases, these studies were completed using Northern blot analyzes. RT-PCR was carried out using "MJ Research PCT-200" (Biozym, Oldendorf, Germany) with a one-minute addition at variable temperature with 35 cycles. All RT-PCR were performed in at least two independent experiments. The RNA isolation, RT-PCR and Northern blot analyzes were otherwise carried out in accordance with customary standard procedures and standard conditions. The primer sequences and annealing temperatures for the different clones are given in Table 1 below: (F) Northern blot
  • RNA 10 ⁇ g of total RNA are separated electrophoretically on a MOPS gel and transferred to positively charged nylon membranes.
  • the probes are marked using the Röche High Prime Kit with ⁇ - 32 P-dCTP.
  • the non-incorporated nucleotides are removed using the Qiagen Removal Kit (Qiagen, Hilden).
  • Qiagen Removal Kit Qiagen, Hilden.
  • the pre-hybridization is carried out at 60 ° C for 1-2 hours. Hybridization takes place at 60 ° C., preferably overnight.
  • the pre-hybridization and hybridization solutions have the composition: 10% dextran sulfate, 1% SDS, 10x Denhardt's reagent, 3x SSC.
  • the subsequent washing is carried out for 2 x 30 minutes with 2xSSC / 0.1% SDS at 42 ° C and then 2 x 30 minutes with 0.2xSSC / 0.1% SDS at 65 ° C.
  • a Kodak X-Omat film is applied for an exposure time of 3-10 days.
  • the primary screen of a Testis cDNA bank was carried out successively with 17 individual sera, which came from patients who had tumors in the indicated stage. The number of positive and total plaques analyzed are given in the 3rd column. During the secondary screen, each positive plaque (28) was tested with up to 18 individual sera from different patients in the indicated tumor stage. (1 ⁇ Cumulated over all sera tested. ⁇ Positive clones divided by the total number of clones tested.
  • the table shows the percentage reactivity of the sera (number n) against the tested clones in the secondary screen.
  • Example 4 (A) antigens with a restricted expression pattern and (B) ubiguously expressed antigens
  • RT-PCR analyzes showed that the se-2-5-specific mRNA is expressed almost ubiquitously within normal tissue, but not in activated T cells and only in 55% of the CTCL tissue samples.
  • Northern blot analysis revealed a restricted expression pattern even within normal tissues. Strong signals were detectable in the kidney, trachea and testis, weaker signals in the colon, small intestine, thymus, bone marrow and stomach. While three bands were detectable in all positive normal tissues (5.2, 4.2 and 3.9 kB), the only positive CTCL cell line SeAx showed a signal at 3.9 kb.
  • mRNAs for the clones se20-10 and se57-l were found by RT-PCR in 43% and 21% of the examined control tissues. Interestingly, the expression of the mRNA specific for se57-l was very strongly downregulated in all tumor tissues and cell lines. In contrast, the expression of mRNA from clone se70-2 was upregulated (100%) compared to normal tissues (54%) within the CTCL and leukemia cell lines, while the CTCL tissues and Me 1 anomal z 11 lines showed mean expression levels (33% and 45%). Among the control tissues, all fetal tissues were positive in the RT-PCR.
  • se33-l cDNA is homologous to NP220, a DNA-binding protein
  • se89-l cDNA is homologous to RAP140, a retinoblastoma-associated clone.
  • Clone se33-l showed 99% similarity within an overlapping distance of 3830 bp at the 3 'end of NP220, but this clone is shortened at the 5' end, which leads to a shortened ORF.
  • Clone se89-l cDNA showed 98% similarity to RAP140 within an overlapping region of 3444 bp and a gap of 60 bp which lies within the ORF and leads to an amino acid gap of 20 amino acids.
  • RT-PCR was carried out with different primers: First with the primer combination RAP140 (see Table 1 and Example 1), both RAP140 and se89-l were detected and three bands in Testis cDNA and two bands in different other cDNAs were found. To specify the expression of se89-l, a new reverse primer (see Table 1) was designed that spans the gap within se89-l. Only one band was amplified using this primer together with the forward primer against RAP140, which also detects se89-l.
  • the frequency of positive cDNAs for the se89-l-specific primers did not differ significantly between the control tissues (79%), CTCL tissues (75%) and cell lines (CTCL and leukemia cell lines: 100%, melanoma lines: 73 %).
  • Northern blot analyzes confirmed the presence of mRNA specific for se89-l within mRNA, which originated from the brain, kidney, colon and testis and the CTCL line SeAx.
  • a protein could be derived from GBP-TA, which has certain homologies with the known guanylate-binding proteins GBP-1, GBP-2 and HGBP (US-A-5, 871, 965). However, the sequence of HGBP does not include exon 2.
  • RT-PCR experiments were carried out to analyze the expression of GBP-TA.
  • Two different pairs of primers (see FIG. 24) were used to differentiate the two splicing variants.
  • a large number of control cDNAs were used, each of which was produced from a collection of tissues from different donors. While 11 control tissues were nagative for both primers, GBP-TA was short in 5 tissues and both variants of GBP-TA in only 2 tissues (bone marrow and stomach) (Table 6).
  • Table 6 Evidence of GBP-TA and GBP-TA'S, hoard in adults
  • RT-PCR Since the RT-PCR is extremely sensitive and does not allow any statement about the presence and the amount of protein, the expression was checked by Western blot and a GBP-TA specific antibody.
  • Several of the RT-PCR positive controls could be tested as protein medleys in a Western blot: placenta, small intestine, spleen, fetal liver, stomach, testis, uterus. Like other control protein medleys tested (mammary gland, testis), these proved to be negative, while proteins obtained from tumor (CTLC) cell lines (SeAx, MyLa, Hut-78, HH; isolation via Tristar, AGS, Heidelberg) showed a clear band showed in the appropriate size. This proves the suitability of GBP-TA as a specific target structure for therapy.
  • CTLC tumor
  • GBP-TA-specific antibody To produce a GBP-TA-specific antibody, the insert of a clone comprising bases 539 up to and including 1991 from GBP-TA was cloned into a His vector and expressed in E-coli. The recombinant protein was purified on a nickel column, then separated in an SDS gel for further purification and the corresponding band cut out. A rabbit whose preimmune serum did not react with the antigen was immunized with the excised piece of gel.
  • the rabbit's serum is tested in an immunoblot.
  • the peptide used for the immunization is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al. , Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter is incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody is rabbit serum (1: 10000 in PBS). After several washing steps with PBS, the nitrocellulose filter is incubated with a second antibody.
  • This antibody is an alkaline phosphatase-coupled monoclonal goat anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, there are several washing steps with PBS and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands become visible.
  • developer solution 36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2
  • the same GBP-TA insert used for antibody production (base no. 539 up to and including 1991 from GBP-TA) was cloned into a pGEX vector, expressed recombinantly and used in a GST-ELISA.
  • the ELISA is suitable for all specified marker antigens for diagnostic purposes, for prognostic assessment and for follow-up.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Marker für Tumoren, vorzugsweise CTCL. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner deren Einsatz für die Diagnose bzw. Therapie von Tumorerkrankungen, vorzugsweise CTCL.

Description

Neue Marker für die Diagnose und Therapie von Tumoren
Die vorliegende Erfindung betrifft den Einsatz neuer Marker für die Diagnose bzw. Therapie von Tumorerkrankunge , vorzugsweise CTCL.
Kutane T-Zell-Lymphome (CTCL) stellen eine heterogene Gruppe von Erkrankungen dar, bei denen CD4-T-Zellen als der maligne Zelltyp vorherrschen. In den meisten Fällen wird der mono- oder zumindest oligoklonale Ursprung der malignen Zellen anhand T- Zellrezeptor-Rearrangements dokumentiert . Neben verschiedenen weiteren Untertypen stellen Mycosis fungoides und das Sezary- Syndrom (SS) die häufigsten Formen von CTCL dar. Bei beiden Erkrankungen handelt es sich um monoklonale T-Helfer-Memory- Lymphome, die durch kutane Pla ues, Tumore oder Erythrodermie gekennzeichnet sind, wobei SS zusätzlich durch eine generalisierte Lymphadenopathie und die Gegenwart von neoplastischen T-Zellen im peripheren Blut charakterisiert ist.
Zu den therapeutischen Ansätzen zählen die Stadium-abhängige Auswahl von PUVA (Psoralen und UV-A) , Retinoiden, Interferon α- 2a in Kombination mit Acitretin oder PUVA, verschiedene Immunmodulatoren, Elektronenbestrahlung oder extrakorporale Photopherese. Diese Verfahren sind in frühen Krankheitstadien erfolgreich, nicht jedoch bei den aggressiven späteren Stadien. Zu möglicherweise sinnvollen zukünftigen Therapien für CTCL zählen immunologische Therapien, z.B. Vakzinierung mit Peptiden oder Peptid-beladenen dendritischen Zellen so wie dies bereits auch zur Behandlung von Melanomen verwendet wurde.
Die Gegenwart und Aktivität von CD8+-Zellen bei CTCL wurde mit der Prognose korreliert. Es konnte gezeigt werden, daß CD8+- reaktive Infiltrate CTCL-spezifisch und lytisch sind. Somit mögen zwar Immuntherapien ein vielversprechendes Konzept zur Behandlung CTCL darstellen, eine Voraussetzung für eine solche Strategie ist allerdings die Identifizierung Tumor-spezifischer Antigene. In diesem Zusammenhang wurde der T-Zellrezeptor selbst als ein Antigen vorgeschlagen (ähnlich den Idiotyp- Immunglobulinen als Ziel für B-Zell-spezifische T-Zellen) . In beiden Fällen ist man jedoch mit dem Nachteil konfrontiert, daß der Antigen-T-Zellrezeptor für jeden einzelnen Patienten identifiziert werden müßte. Zusammengefaßt muß allerdings festgestellt werden, daß für Tumorarten wie CTCL zur Zeit keine tumorassoziierten Antigene bekannt sind, somit die Möglichkeiten der spezifischen Diagnose bzw. Therapie stark eingeschränkt sind.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Marker (Gene bzw. deren Produkte) zu identifizieren und bereitzustellen, die mit Tumoren, insbesondere CTCL, in Zusammenhang stehen und gegebenenfalls von diagnostischem und/oder im Rahmen einer Vakzinierungstherapie von therapeutischem Nutzen sind.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen erzielt.
Es wurden überraschenderweise eine Reihe von Genen gefunden, deren Expression mit CTCL korreliert ist. In den zu der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten wurden CTCL- spezifische Antigene durch Screenen einer Testis-cDNA-Bank bzw. einer cDNA-Bank, die aus Tumor-RNA verschiedener kutaner Lymphome hergestellt worden war, mit Seren von Tumorpatienten identifiziert. Etwa 3 x 106 Rekombinante wurden mit Seren von Patienten mit Sezary-Syndrom bzw. Mycosis fungoides gescreent. Die Ergebnisse zeigen, daß Tumor-Antigene von CTCL-Tumoren mit von Tumorpatienten stammenden Antikörpern identifiziert werden können. Es konnten positive Klone identifiziert werden, die zu 19 unterschiedlichen Genen/ORFs gehörten, wozu auch fünf bisher nicht bekannte Sequenzen zählen. Alle gefundenen Tumor-Antigene sind spezifisch, d.h. daß nur Tumorpatienten, jedoch keine gesunden Personen gegen diese gerichtete Antikörper bilden, obwohl 13 von diesen Tumor-Antigenen in mindestens 21% der getesteten Kontrollgewebe exprimiert werden. Es wurde außerdem ein tumorspezifisches Antigen gefunden, das nur in Testis und Tumorgeweben exprimiert wird. Dabei handelt es sich um se2-l, das in einem CTCL-Tumor gefunden wurde. Dieses Gen zeigt Ähnlichkeiten zu SCP-1, ein mit der Mitose in Zusammenhang stehendes Protein. Vier Seren von CTCL-Patienten reagierten mit verschiedenen SCP-1 -ähnlichen Klonen. Somit konnten mittels den zur der vorliegenden Erfindung führenden Experimenten zum ersten Mal CTCL-assoziierte Antigene (unabhängig vom T-Zellrezeptor) identifiziert werden, die somit wertvolle Tumormarker darstellen. Die Identifizierung solcher Antigene ist von Interesse, da die kodierten Proteine und von diesen abgeleitete Peptide als Zielstrukturen, z.B. für zytotoxische Zellen, dienen und als Antigene zur Produktion von diagnostischen oder therapeutischen Antikörpern verwendet werden können. Zur Tumortherapie können die von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuren kodierten Peptide bzw. Fragmente davon entweder direkt appliziert werden oder auf Antigen-präsentierende Zellen geladen werden. Auch können die Antigene darstellenden Peptide mit Hilfe von Vektoren in verschiedenen Zellen (z. B. Dendritischen Zellen als Antigen-präsentierende Zellen) exprimiert werden. Weiter bilden die identifizierten Nukleinsäuren die Grundlage zur Entwicklung diagnostischer Tests, um zukünftig eine zuverlässigere und frühzeitige Diagnose bei Betroffenen zu gewährleisten. Darüber hinaus werden funktioneile Analysen der Proteine zweifellos zum Verständnis der Tumo entwicklung beitragen. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren sind somit als Kandidatengene für Untersuchungen der Pathomechanismen anzusehen, die verschiedenen Tumorerkrankungen, wie z.B. CTCL, zugrunde liegen.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit eine diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eine
Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die
Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig.l), se20-10 (Fig. ), se57-l
(Fig.3), se70-2 (Fig.4), Lgl-2 (Fig. 5), sel-1 (Fig. 6), se2-l
(Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-4 (Fig.10), se20-7
(Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l (Fig.13), se37-2 (Fig.14), se89-l (Fig.15) , L14-2 (Fig.16), L15-7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18),
Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5
(Fig. 22) oder GBP-TA (Fig. 23) umfaßt. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ferner ein Arzneimittel, das eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig.2), se57-l (Fig.3), Lgl-2 (Fig. 5), sel-1 (Fig. 6), se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-4 (Fig.10), se20-7 (Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l (Fig.13), se37-2 (Fig.14), L14-2 (Fig.16), L15- 7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18), Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5 (Fig. 22) oder GBP-TA (Fig. 23) umfaßt .
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine vorstehend definierte diagnostische Zusammensetzung oder ein Arzneimittel, wobei die Nukleinsäuresequenz, deren veränderte Expression mit einer malignen Tumor-Erkrankung in Zusammenhang steht, eine Nukleinsäuresequenz umfaßt,
(a) die sich von einer vorstehenden, in den Figuren 1 bis 23 dargestellten Nukleinsäuresequenz in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
(b) die mit einer Nukleinsäuresequenz nach einer der Figuren 1 bis 23 oder nach (a) hybridisiert; oder
(c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante einer der vorstehend definierten Nukleinsäuresequenz ist.
Der Begriff "hybridisierende Nukleinsäuresequenz" weist auf eine Nukleinsäuresequenz hin, die unter üblichen Bedingungen, insbesondere bei 20°C unter dem Schmelzpunkt der Nukleinsäure, mit einer in den Figuren gezeigten Nukleinsäuresequenz hybridisiert. Der in vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "hybridisieren" bezieht sich auf konventionelle Hyb r i d i s i e r un g s b e d i ngung en , vorzugsweise auf Hybridisierungsbedingungen, bei denen als Lösung 5xSSPE, 1% SDS, lxDenhar d t s - Lö sung verwendet wird und/oder die Hybridisierungstemperatur zwischen 50°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C liegen. Nach der Hybridisierung wird vorzugsweise zuerst mit 2xSSC, 1% SDS und danach mit 0,2xSSC bei Temperaturen zwischen 50°C und 70°C, vorzugsweise bei 65°C gewaschen (zur Definition von SSPE,SSC und Denhardts-Lösung siehe Sa brook et al . , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY (1989)). Besonders bevorzugt sind stringente Hybridisierungsbedingungen, wie sie beispielsweise in Sa brook et al . , supra, beschrieben sind.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Begriffe "andere Variante" oder "Fragment" umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sich gegenüber den in den Figuren angegebenen Sequenzen oder vorstehenden hybridisierenden Sequenzen durch Deletion(en) , Insertion(en) , Austausch(e) und/oder andere im Stand der Technik bekannte Modifikationen unterscheiden bzw. ein Fragment der ursprünglichen Nukleinsäuresequenz umfassen, wobei das durch diese Nukleinsäuresequenzen kodierte Protein noch eine oder mehrere der vorstehend bzw. in den Beispielen beschriebenen Eigenschaften aufweist. Dazu zählen auch Allelvarianten. Die Varianten weisen eine Homologie zu den beanspruchten Sequenzen von mind. 70%, von mindestens 80%, bevorzugt mindestens 90%, ganz bevorzugt mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder 99% auf. Verfahren zur Erzeugung der vorstehenden Änderungen in der Nukleinsäuresequenz sind dem Fachmann bekannt und in Standardwerken der Molekularbiologie beschrieben, beispielsweise in Sambrook et al., supra. Der Fachmann ist auch in der Lage, zu bestimmen, ob ein von einer so veränderten Nukleinsäuresequenz kodiertes Protein noch über die gewünschten biologischen Eigenschaften verfügt. Vor allem in Zusammenhang mit diagnostischen Anwendungen bzw. Zusammensetzungen, in denen eine der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen verwendet wird, bezieht sich der Begriff "Fragment" auf ein Fragment, das eine Länge von mindestens 12, vorzugsweise mindestens 20 und noch mehr bevorzugt mindestens 25 Nukleotiden aufweist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das vorstehend definierte Nukleinsäure olekül eine cDNA.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäurersequenz eine genomische DNA, die vorzugsweise von einem Säuger, beispielsweise einem Menschen stammt. Auf Nuklein- säurehybridisierung basierende Screening-Verfahren erlauben die Isolierung der erfindungsgemäßen genomischen DNA-Moleküle aus jedem Organismus bzw. abgeleiteten genomischen DNA-Banken, wobei Sonden verwendet werden, die die in den Figuren angegebene Nukleinsäuresequenz oder ein Fragment davon enthalten.
Die Nukleinsäuresequenzen können auch in einen Vektor bzw. Expressionsvektor inseriert werden. Beispiele solcher Vektoren sind dem Fachmann bekannt. Im Falle eines Expressionsvektors für E. coli sind dies z. B. pGEMEX, pUC-Derivate (z.B. pUC8) , pBR322, pBlueScript, pGEX-2T, pET3b und pQE-8. Für die Expression in Hefe sind z.B. pYlOO und Ycpadl zu nennen, während für die Expression in tierischen Zellen z.B. pKCR, pEFBOS, cDM8 und pCEV4, anzugeben sind. Für die Expression in speziell Insektenzellen eignet sich besonders der Baculovirus- Expressionsvektor pAcSGHisNT-A . In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäuresequenz im Vektor mit regulatorischen Elementen funktioneil verknüpft, die dessen Expression in prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszellen erlauben. Solche Vektoren enthalten neben den regulatorischen Elementen, beispielsweise einem Promotor, typischerweise einen Replikationsursprung und spezifische Gene, die die phänotypische Selektion einer transformierten Wirtszelle erlauben. Zu den regulatorischen Elementen für die Expression in Prokaryonten, beispielsweise E.coli, zählen der lac-, trp-Promotor oder T7- Promotor, und für die Expression in Eukaryonten der A0X1- oder GALl-Promotor in Hefe, und der CMV-, SV40-, RVS-40-Promotor, CMV- oder SV40-Enhancer für die Expression in tierischen Zellen. Weitere Beispiele für geeignete Promotoren sind der Metallothionein I- und der Polyhedrin-Promotor .
Zu geeigneten Vektoren zählen insbesondere auch auf T7 basierende Expressionsvektoren für die Expression in Bakterien
(Rosenberg et al . , Gene 56.(1987), 125) oder pMSXND für die Expression in Säugerzellen (Lee und Nathans, J.Biol.Chem. 263
(1988) ,3521) .
Allgemeine auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren können zur Konstruktion von Vektoren oder Plasmiden, die die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen und geeignete Kontrollsequenzen enthalten, verwendet werden. Zu diesen Verfahren zählen beispielsweise in vitro-Rekombinationstechniken, synthetische Verfahren, sowie in vivo-Rekombinationsverfahren, wie sie beispielsweise in Sambrook et al . , supra, beschrieben sind.
Wirtsorganismen können mit den vorstehend beschriebenen Vektoren transformiert werden. Zu diesen Transformanten zählen Bakterien, Hefe, Insekten- und weitere Tierzellen, vorzugsweise Säugerzellen. Bevorzugt sind die E. coli Stämme HB101, DHl, xl776, JM101, JM109, BL21, XLlBlue und SG 13009, der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae und die tierischen Zellen L, 3T3, FM3A, CHO, COS, Vero, HeLa sowie die Insektenzellen sf9. Verfahren zur Transformation dieser Wirtszellen, zur phänotypischen Selektion von Transformanten und zur Expression der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Vektoren sind auf dem Fachgebiet bekannt.
Die vorstehend erwähnten Nukleinsäuren eignen sich besonders als Antigen-kodierende Struktur für therapeutische Zwecke. Ziel soll es dabei sein, das Immunsystem zu stimulieren, Tumorzellen zu eliminieren, die über eine Nukleinsäure identifiziert werden. Dabei gibt es verschiedene Wege, z. B. Injektion der nackten DNA in den Patienten. Hierzu wird ein Plas id mit einem sehr aktiven Promotor und mindestens einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure, die insbesondere se20-10, se57-l, Lgl-2, sel-1, se2-l, se2-2, sel4-3, se20-7, se20-9, se33-l, se37-2, L14-2, L15-7, Li9-1, Li9-4, LÜ5-2, LiilO-6, Liii4-5 oder GBP-TA umfaßt, beispielsweise in den Muskel oder intradermal injiziert.
Desweiteren kann die Nukleinsäuresequenz nicht nur zu Zwecken der rekombinanten Herstellung in einen Vektor inseriert sein, sondern auch um die DNA mit Hilfe von Vektoren in Patienten zu injizieren, wo diese ein Antigen für therapeutische Zwecke kodiert. Das Ziel ist, daß die Zellen das Plasmid aufnehmen, Antigene produzieren, über HLA-Moleküle einzelne Peptide präsentieren und somit eine zytotoxische T-Zell-Immunantwort hervorrufen. Diese soll dann zur Abwehr von Tumorzellen führen. Allgemein ist diese Verfahrensweise in Conry et al . , Clinical Cancer Research 4, S. 2903-2912 (1998) beschrieben. Einen alternativen Weg stellt die "Gene-Gun" -Methode dar, die in Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90., S. 11478-11482 (1993) beschreiben ist. Hierbei wird die Nukleinsäure mit Hilfe eines Vektors in vivo Antigen-präsentierende Zellen (APCs) , z.B. Dendritische Zellen, zur HLA-Präsentation des kodierten Proteins gebracht. Dabei kann der die erfindungsgemäße Nukleinsäure enthaltende Vektor über verschiedene Wege injiziert werden: a) Lipid- bzw. Liposomen-verpackte DNA oder RNA, z.B. allgemein beschrieben von Nabel et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93, S. 15388-15393 (1996). b) Mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor. Geeignete Bakterien sind beispielsweise (attenuierte) Listerien [z.B. Listeria monocytogenes] , Salmonellen-Stämme [z.B. Salmonella spp.]. Allgemein ist diese Technik von Medina et al . , Eur. J. Immuno1. 29., S. 693-699 (1999) sowie Guzman et al., Eur. J. Immuno1. 28, S. 1807-1814 (1998) beschrieben worden. Desweiteren wird auf WO 96/14087; Weiskirch et al., Immunological Reviews 158, S. 159-169 (1997) und US-A-5, 830, 702 verwiesen. c) Mittels Gene-Gun (Williams et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88/ S. 2726-2730, 1991).
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen enthaltene Vektor ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV- Virus, der bei einer Gentherapie von Nutzen ist. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Weiter eignen sich vorgenannte Viren sowie Fowlpox-Virus , Canarypox-Virus , Influenza-Virus oder Sindbis-Virus auch als Basis einer Vakzine. Solche neuen Vakzine, die nach Verabreichung an den Patienten anti-Tumor-Immunität verleihen, sind beispielsweise bei N. Restifo, Current Opinion in Immunology 8., S. 658-663 (1996) oder Ying et al . , Nature Medicine 5(7), S. 823 ff., (1999) beschrieben. Für Zwecke der Gentherapie können die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposo en oder Lipoplexe (Mannino et al . , Biotechniques 6. (1988), 682). Weiter ist es bevorzugt, um eine Tumor-Immunität zu erzeugen, eine vorstehende Nukleinsäuresequenz in Antigen-präsentierende Zellen zu transfizieren und diese dem Patienten zu injizieren. Hierbei wird ein Plasmid in vitro in eine Antigen-präsentierende Zelle (APCs) , z.B. Dendritische Zellen, gegeben, die dann Antigene produzieren und über HLA-Moleküle einzelne Peptide präsentieren. Dabei kann die Plasmid-DNA über verschiedene Wege in die Antigen-präsentierenden Zellen gebracht werden:
(a) als nackte DNA, z.B. mittels "Gene Gun" oder Elektroporation;
(b) als Lipid- oder Liposo en-verpackte DNA oder RNA (Nair et al., Nature Biotechnology 16, S. 364 ff. (1998));
(c) mit einem Virus als Vektor (Kim et al., J. of Immunotherapy 20( ), S . 276-286 (1997));
(d) mit einem Bakterium als Transportvehikel für den Expressionsvektor (Medina et al . , Eur. J. Immuno1. 29., S. 693-699 (1999); Guzman et al . , Eur. J. Immuno1. 28, S. 1807-1814 (1998))
Es kann auch das von einer vorstehenden Nukleinsäure kodierte Protein, das im Zusammenhang mit dem Vorhandensein einer malignen Tumorerkrankung steht, hergestellt werden. Das dazu bevorzugt angewendete Verfahren umfaßt die Kultivierung der vorstehend beschriebenen Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Proteins erlauben (vorzugsweise stabile Expression) , und Gewinnung des Proteins aus der Kultur. Geeignete Verfahren zur rekombinanten Herstellung des Proteins sind allgemein bekannt (siehe beispielsweise Holmgren, Annu. Rev.Bioche . 54 (1985), 237; LaVallie et al., Bio/Technology 11 (1993), 187; Wong, Curr.Opin.Biotech. 6 (1995), 517; Romanos, Curr.Opin.Biotech. 6 (1995), 527; Williams et al . , Curr. Opin. Biotech. (1995), 538; und Davies, Curr. Opin.Biotech. 6 (1995), 543. Auch geeignete Reinigungsverfahren (beis ielsweise präparative Chromatogr p ie, Affinitätschromatographie, beispielsweise Immunoaffini- tätschromatographie, HPLC etc.) sind allgemein bekannt. In diesem Zusammenhang soll erwähnt werden, daß das vorstehend erwähnte Protein gemäß üblicher, auf dem Fachgebiet bekannten, Verfahren modifiziert sein kann. Zu diesen Modifikationen zählen Austausche, Insertionen oder Deletionen von Aminosäuren, die die Struktur des Proteins modifizieren, wobei seine biologische Aktivität im wesentlichen erhalten bleibt. Zu den Austauschen zählen vorzugsweise "konservative" Austausche von Aminosäureresten, d.h. Austausche gegen biologisch ähnliche Reste, z.B. die Substitution eines hydrophoben Rests (z.B. Isoleucin, Valin, Leucin, Methionin) gegen einen anderen hydrophoben Rest, oder die Substitution eines polaren Rests gegen einen anderen polaren Rest (z.B. Arginin gegen Lysin, Glutaminsäure gegen Asparaginsäure etc . ) . Deletionen können zur Erzeugung von Molekülen führen, die eine deutlich geringere Größe aufweisen, d.h. , denen beispielsweise Aminosäuren am N- oder C-Terminus fehlen.
Für die gewünschte Anti-Tumor-Vakzinierung eignen sich auch Injektionen mindestens eines der Proteins oder eines oder mehrerer davon abgeleiteter Peptide. Aus der Sequenz des er indungsgemäßen Proteins werden dafür entweder mittels entsprechender Computerprogramme oder mittels Experimente (z.B. phagozytotische Aufnahme des Gesamt-Proteins, danach Analyse der präsentierenden Peptide) HLA-abhängige Peptid-Fragmente ermittelt. Diese werden mittels dem Fachmann bekannter Methoden künstlich hergestellt und dann (ggf. mit Immunsystem stimulierenden Faktoren, z.B. Interferonen, Interleukinen usw.) dem Patienten injiziert. Das hinter dieser Behandlung steckende Ziel ist, daß die APCs die Peptide aufnehmen, sie präsentieren und so in vivo die Produktion von Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Zellen stimulieren. Allgemein ist dieses Prinzip von Melief et al., Current Opinion in Immunology 8., S. 651-657 (1996) beschrieben worden.
Ebenso wie vorstehend beschrieben, können anstelle des Vektors auch das vorstehende Protein bzw. Fragmente davon in vitro auf APCs geladen werden. Die beladenen Zellen werden dann dem Patienten z.B. in die Lymphknoten injiziert und sorgen direkt für die Stimulierung und Vermehrung von Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Zellen (Nestle et al . , Nature Medicine 4 (3) , S. 328 ff. (1998); Schadendorf et al . , in: Burg, Dummer, Strategies for Immunointerventions in Dermatology, Springer Verlag, Berlin Heidelberg, S. 399-409, 1997) Für die Vakzinierung kann es vorteilhaft sein, gegenüber dem Wildtyp-Antigen einzelne Aminosäuren, wie vorstehend beschrieben, zu modifizieren, da damit u.U. eine Erhöhung der Bindung und eine Verbesserung der Wirksamkeit zu erreichen ist (Clay et al . , The Journal of Immunology 162, S. 1749-1755, 1999).
Besonders bevorzugt für die vorstehenden therapeutischen Maßnahmen ist mindestens eine Nukleinsäuresequenz, die die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig.2), se57-l (Fig.3), Lgl-2 (Fig. 5), sel-1 (Fig. 6), se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-7 (Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l (Fig.13), se37-2 (Fig.14), L14-2 (Fig.16), L15-7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18), Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5 (Fig. 22) oder GBP-TA umfaßt bzw. ein davon kodiertes Protein oder ein Fragment davon.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Antikörper, die die vorstehend beschriebenen Proteine (Tumor-Antigene) spezifisch erkennen. Die Antikörper können monoklonale, polyklonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon, beispielsweise Fab-, Fv-oder scFv-Fragmente. Vorzugsweise handelt es sich dabei um monoklonale Antikörper. Für die Herstellung ist es günstig, Tiere, insbesondere Kaninchen oder Hühner für einen polyklonalen und Mäuse für einen monoklonalen Antikörper, mit einem vorstehenden (Fusions)protein oder Fragment (en) davon zu immunisieren. Weitere "Booster" der Tiere können mit dem gleichen (Fusions)protein oder Fragmenten davon erfolgen. Der polyklonale Antikörper kann dann aus dem Serum bzw. Eigelb der Tiere erhalten werden. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei das von den vorstehend erwähnten Nukleinsäuresequenzen kodierte Protein oder ein synthetisches Fragment davon als Immunogen dienen. Monoklonale Antikörper können beispielsweise durch das von Köhler und Milstein (Nature 256 (1975), 495) und Galfre (Meth. Enzymol. 73 (1981), 3) beschriebene Verfahren hergestellt werden, wobei Maus-Myelomzellen mit von immunisierten Säugern stammenden Milzzellen fusioniert werden. Diese Antikörper können beispielsweise zur Immunpräzipi tation der vorstehend diskutierten Proteine oder zur Isolierung verwandter Proteine aus cDNA-Expressionsbanken verwendet werden. Die Antikörper können beispielsweise in Immunoassays in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden. Dabei können die Antikörper auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachgebiet bekannt. Beispiele für Immunassays sind ELISA und RIA.
Weiter können die Antikörper neben ihrer diagnostischen Eignung auch therapeutisch eingesetzt werden. Dabei dient z.B. ein von den vorstehenden Nukleinsäuresequenzen kodiertes Protein als Target für bispezifische Antikörper. Hierzu wird auf Kastenbauer et al., Laryngorhinootologie 78(1) , S. 31-35 (1999) und Cao et al., Bioconj . Chem. 9 (6) , S. 635-644 (1998) verwiesen. Die erfindungsgemäßen Antikörper eignen sich z. B. dafür, um in Tumoren überexprimiertes Antigen abzufangen und so das Tumorwachstum zu hemmen, da es Hinweise darauf gibt, daß in manchen Fällen das Vorkommen von Tumor-Antigenen nicht nur das Vorhandensein von malignen Tumoren indikativ anzeigt, sondern aktiv das Tumorwachstum fördert .
Desweiteren kann durch den Einsatz von Antisense-DNA (RNA) bzw. Ribozymen eine Inhibierung der Translation der vorstehenden Nukleinsäuresequenzen, deren Expression in Tumoren erhöht ist, erreicht werden und somit ein therapeutischer Effekt spezifisch auf diese Nukleinsäuresequenzen bzw. Gene ausgeübt werden. Es bilden sich in den entsprechenden Tumorzellen RNA/DNA-Hybride, die so die Transkription verhindern und - im Fall der Antisense- RNA - gleichzeitig einen Abbau der Hybride (und somit der RNA) durch RNase H bewirken (Scanion et al . , The Faseb Journal 9., S. 1288-1296, 1995)
Die vorliegende Erfindung betrifft somit ein Arzneimittel oder eine diagnostische Zusammensetzung, das (die) die vorstehend beschriebenen Nukleinsäuresequenzen, Vektoren, Proteine, Antikörper etc. oder Kombinationen davon enthält, bzw. deren Verwendung für die Diagnose und/oder Therapie. Vorzugsweise werden diese zur Diagnose oder Behandlung von malignen Tumorerkrankungen, insbesondere CTCL, verwendet. Bevorzugt ist die Bereitstellung eines Vakzinierungsmittels , das wie vorstehend beschrieben, entweder auf der Nukleinsäuresequenz oder dem Pro tein/ Pept id basiert. Die diagnostische Zusammensetzung eignet sich dabei einerseits um eine maligne Tumor erkrankung festzustellen, aber auch um eine Verlaufskontrolle durchzuführen, beispielsweise therapiebegleitend.
Die vorstehenden Arzneimittel enthalten gegebenenfalls zusätzlich einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepuf f erte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Die Verabreichung der Arzneimittel kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle , intramuskuläre, subkutane, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre , intravenöse, intraperitoneale oder intranasale Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Eine vorstehende Nukleinsäuresequenz kann auch als Sonde verwendet werden, um DNA-Moleküle zu isolieren, die beispielsweise von einer anderen Spezies oder einem anderen Organismus stammen und ein Protein mit einer ebensolchen biologischen Aktivität kodieren. Vorzugsweise weist dazu die Sonde eine Länge von mindestens 20, besonders bevorzugt mindestens 25 Basen auf. Geeignete, auf Hybridisierung basierende Nachweisverfahren sind dem Fachmann bekannt, z.B. Southern oder Northern Blot. Geeignete Markierungen für die Sonde sind dem Fachmann ebenfalls bekannt und dazu zählen beispielsweise Markierung mit Radioisotopen, Biolumineszenz-, Chemilumineszenz-, Fluoreszenzmarkern, Metallchelaten, Enzymen etc.. Darüber hinaus kann dies auch durch eine PCR (Wiedmann et al . , PCR Methods Appl . 3, S. 551-564 (1994); Saiki et al., Nature 324, S. 163-166 (1986)) oder "Ligase chain reaction" (LCR)
(Taylor et al . , Curr. Opin. Biotechnol . 6, S. 24-29 (1995);
Rouwendal et al . , Methods Mol. Biol. S. 149-156 (1996)) erfolgen, wobei die Primer von der Sequenz in den Figuren abgeleitet sind und wobei geeignete Primer (hinsichtlich Länge, Komplementarität zur Matritze, dem zu amplifizierenden Bereich etc.) vom Fachmann gemäß üblicher Verfahren entworfen werden können.
Außerdem betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur
Diagnose von malignen Tumorerkrankungen, in vitro, wobei die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon als Sonde verwendet werden.
Für das diagnostische Verfahren ist es bevorzugt die Nukleinsäuren und/oder Proteine in Form eines ELISA-Kits, Protein-Chips, Nukleinsäure-Chips oder einer mit DNA, RNA oder Protein beladener Membran bereitzustellen.
Bei oben genanntem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von DNA oder RNA aus biologischen Proben, des Restriktionsverdaus der DNA, der Auftrennung der Restriktionsfragmente auf nach Größe auftrennenden Gelen, beispielsweise Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises der Hybridisierung, beispielsweise über "Southern-Blot" oder in-situ Hybridisierung, angewandt werden.
Vorzugsweise handelt es sich bei diesem Diagnose-Verfahren um ein Verfahren, das die folgenden Schritte umfaßt:
Isolierung von Nukleinsäure aus dem Patienten, Durchführung einer LCR oder PCR mit geeigneten Primern oder einer Hybridisierungsanalyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden basierend auf einer Nukleinsäuresequenz der Figuren,
Nachweis eines amplifizierten Produkts oder einer Hybridisierung als Indiz auf das Vorliegen (oder Nichtvorliegung) einer Tumorerkrankung (in Abhängigkeit davon, ob die jeweilige Nukleinsäuresequenz im Tumor im Vergleich zu Kontrollgewebe stärker oder schwächer (bzw. nicht) exprimiert wird.)
Dabei werden Primer verwendet, die eine vorstehend diskutierte Nukleinsäursequenz oder geeignete Teilbereiche flankieren. Diagnostisch von Bedeutung sind dabei Amplifikationsprodukte von RNA aus dem fraglichen Gewebe, die sich hinsichtlich des Auftretens von Tumor-spezifischen, insbesondere CTCL- spezifischen Banden von den Amplifikationsprodukten von mRNA aus gesundem Gewebe unterscheiden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann ein Verfahren angewendet werden, das folgende Schritte umfaßt: Isolierung von RNA aus dem Patienten,
Durchführung einer Northern-Analyse mit einer oder mehreren geeigneten Sonden,
Vergleich der Konzentration und/oder Länge der entsprechenden mRNA der Patientenprobe mit einer mRNA einer gesunden Person, wobei eine erhöhte bzw. erniedrigte Konzentration an mRNA (in Abhängigkeit von dem entsprechenden Marker; siehe Tabelle 4) im Vergleich zur Kontroll-mRNA aus Normalgewebe indikativ für eine Tumorerkrankung, insbesondere CTCL ist.
Bei diesem Verfahren können dem Fachmann bekannte Methoden bezüglich der Präparation von Gesamt-RNA bzw. poly(A)+RNA aus biologischen Proben, der Auftrennung der RNAs auf nach Größe au trennenden Gelen, beispielsweise denaturierenden Agarosegelen, der Herstellung und Markierung der Sonde und des Nachweises über "Northern-Blot" angewandt werden.
In einer weiteren alternativen Ausführungsform kann eine mögliche Tumor-Erkrankung auch durch ein Verfahren diagnostiziert werden, das folgende Schritte umfaßt:
Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten,
Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit einem oder mehreren von den erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kodierten Proteinen oder Fragmenten davon als Sonde (n) unter Bedingungen, die die Bindung von Antikörpern erlauben, wobei die Gegenwart von Antikörpern in der Zellprobe indikativ für eine Tumorerkrankung, insbesondere CTCL ist.
Dieser Nachweis kann ebenfalls unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die die Isolierung der Antikörper auf eine solche Weise erlauben, daß diese mit dem Antigen in Kontakt gebracht werden kann. Der Nachweis des gebundenen Antikörpers erfolgt vorzugsweise über Immunassays, beispielsweise Western-Blot , ELISA, FACS oder RIA oder immunhistochemische Verfahren. Vorzugsweise erfolgt dieser über ELISA oder "Dot blot" . Zur Etablierung eines ELISA können die vorstehenden Nukleinsäuresequenzen oder Fragmente davon in Expressionsplasmide kloniert und die entspr. Proteine rekombinant hergestellt werden, vorzugsweise als Fusionsproteine mit einem "His-Tag", was deren Aufreinigung erleichtert. Die Proteine werden dann auf Membranen oder andere geeignete Oberflächen aufgetragen, ggf. fixiert und mit adäquat verdünnten Patientenseren inkubiert. Nach den üblichen Waschschritten erfolgt dann eine Inkubation mit einem sekundären markierten Antikörper gemäß Routineverfahren zum Nachweis der gebundenen Patienten-Antikörper . Vorzugsweise werden die Patientenseren mit einer Vielzahl von Markerproteinen (Antigenen) inkubiert, da der Nachweis des Vorhandenseins (oder Fehlens) verschiedener Antikörper besser auf die zugrundeliegende Tumor-Erkrankung schließen läßt und evtl. auch eine Einteilung nach dem ErkrankungsStadium erlaubt.
Weiter betrifft die vorliegende Erfindung einen Kit zur Durchführung der erfindungsgemäßen Diagnoseverfahren, der den erfindungsgemäßen Antikörper oder ein Fragment davon, ein vorstehendes Protein (oder davon abgeleitetes Peptid) , eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz (als Sonde) oder einen z.B. für PCR oder LCR geeigneten, auf der Sequenz der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen basierenden Primer (oder ein Primerpaar) enthält, gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten Nachweismittel. Je nach Ausgestaltung des mit dem erfindungsgemäßen Kit durchzuführenden Diagnoseverfahrens können die in dem Kit enthaltenden Verbindungen (Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Antikörper oder Fragmente davon) an einem geeigneten Träger immobilisiert sein, d.h. in Form eines Chips oder auf einer Membran gebunden vorliegen.
Alle vorstehend erwähnten Proteine werden serologisch nur von Antikörpern aus Seren von Tumorpatienten, nicht aber von Seren aus Kontrollpersonen, erkannt und sind somit serologisch tumorspezifisch. Da sich diese Spezifität nicht auf einen Tumortyp beschränkt, eignen sich diese Proteine und Antikörper sehr gut, um überhaupt eine Unterscheidung zwischen Malignität und "Nicht-Malignität" zu treffen. Es hat sich dabei als vorteilhaft herausgestellt, die Untersuchung mit mehr als einem der vorstehend erwähnten Tumormarker, d.h. einer Kombination von Tumormarkern, durchzuführen und abhängig davon einen therapeutischen Ansatz zu wählen. Dies bedeutet, daß auch das erfindungsgemäße Arzneimittel mehr als eine der vorstehend erwähnten Nukleinsäuren, Proteine oder Antikörper enthalten sollte.
Die Erfindung wird nun weiter anhand der Figuren beschrieben, welche zeigen:
Fig.l: Nukleinsäuresequenz von se2-5 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.2: Nukleinsäuresequenz von se20-10 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.3: Nukleinsäuresequenz von se57-l und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.4: Nukleinsäuresequenz von se70-2 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig. 5: Nukleinsäuresequenz von Lgl-2 und ein davon abgeleiteter ORF Fig.6: Nukleinsäuresequenz von sel-1 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.7: Nukleinsäuresequenz von se2-l und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.8: Nukleinsäuresequenz von se2-2 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.9: Nukleinsäuresequenz von sel4-3 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.10: Nukleinsäuresequenz von se20-4 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.11: Nukleinsäuresequenz von se20-7 und ein davon abgleiteter ORF
Fig.12: Nukleinsäuresequenz von se20-9 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.13: Nukleinsäuresequenz von se33-l und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.14: Nukleinsäuresequenz von se37-2 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.15: Nukleinsäuresequenz von se89-l und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.16: Nukleinsäuresequenz von L14-2 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.17: Nukleinsäuresequenz von L15-7 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.18: Nukleinsäuresequenz von Li9-1 und ein davon abgeleiteter ORF Fig.19: Nukleinsäuresequenz von Li9-4 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.20: Nukleinsäuresequenz von LÜ5-2 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.21: Nukleinsäuresequenz von LiilO-6 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig.22: Nukleinsäuresequenz von Liii4-5 und ein davon abgeleiteter ORF
Fig. 23: Nukleinsäuresequenz von GBP-TA und ein davon abgeleiteter ORF
Fig. 24: Lokalisation von GBP-TA, GBP-TAshort und Lgl-2 auf dem Chromosom lp22.3. Die verwendeten Primer zur Unterscheidung der Splicing-Var ianten sind eingezeichnet .
Pri erset I: tgt tgt aga tca ctt caa ggt gc (forw. ) cca tat cca aat tcc ctt ggt gtg ag (re.) Anneal ing-Tem . 63 °C
Primerset II : aga agg aag aaa ctc caa aca cat cc (forw. ) cca tat cca aat tcc ctt ggt gtg ag (re. ) Anneal ing Temp. 48°C
Die Erfindung wird nun nachfolgend mit Bezug auf die Beispiele beschrieben.
Hinsichtlich der verwendeten Methoden wird neben den in Beispiel 1 angegebenen Verfahren außerdem auf Sambrook, J, Fritsch, E,F. und Maniatis, T. (Molecular cloning; a laboratory manual; second edition; Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989) und Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, 1994-1998) hingewiesen, wobei die nachfolgend erwähnten Techniken, insbesondere Screenen von cDNA-Bibliotheken, Präparation von DNA bzw. RNA, PCR, RT-PCR oder Northern Blot dem Fachmann hinreichend bekannt sind und beherrscht werden.
Beispiel 1: Allgemeine Verfahren
(A) Gewebe und Seren
Seren und Tumorgewebe wurden bei diagnostischen oder therapeutischen Routineverfahren mit Einverständnis der Patienten (und der Erlaubnis des zuständigen Ethikkomitees) erhalten. Die Lagerung der Gewebe und Seren erfolgte bei -20°C bzw. -80°C.
(B) Herstellung der von cDNA-Banken mRNA wurde aus Testis-Proben unter Verwendung eines Kits für RNA-Isolierung("RNeasy midi kit"; Qiagen, Hilden, Deutschland) und danach eines Kits für mRNA-Isolierung ("oligotex mRNA kit"; Qiagen) entsprechend den Empfehlungen des Herstellers extrahiert. Für die Konstruktion der λ-ZAP-Expressionsbank ("UNI-ZAP™ XR custom cDNA library"; Stratagene, La Jolla, CA, USA) wurden insgesamt 10,4 μg mRNA verwendet. Die cDNA-Bank bestand aus 106 primären Rekombinanten mit einer Insertionslänge über 0,4 kbp und wurde zu 1010 Plaque-bildenden Einheiten (pfu) amplifiziert. Für die Konstruktion der CTCL-Bank wurden 4,8 μg mRNA aus verschiedenen Proben von kutanen T- und B-Zell Lymphomen verwendet. Die Zahl der primären Rekombinanten betrug 6 x 107 . Das Vorgehen war analog zum vorbeschriebenen Vorgehen bei der Testis-Bank.
(C) Immunscreeninα
Das Im unscreening wurde wie in Sahin et al . (PNAS USA 92. (1995), 11810-11813) und Türeci et al . (Cancer Res . 56 (1996), 4766-4772) beschrieben durchgeführt. Alle Seren wurden in Tris- gepufferter Saline (TBS mit 0,2% Trockenmilchpulver, pH-Wert 7,5) verdünnt und mit E.coli-Proteinen (mechanisch aufgebrochen oder durch Phagen ohne Insertion lysiert) vorabsorbiert. Mit rekombinanten λ-ZAP-Phagen transduzierte E.coli wurden auf NZY- Agar bei einer Konzentration von 2000 Plaques/Platte ausplattiert und die Expression der rekombinanten Proteine wurde mittels Isopropyl-ß-D-Thiogalactosid induziert. Die Platten wurden bei 37°C ü.N. inkubiert und die Proteine 4 Stunden bei 37°C auf Nitrozellulose-Membranen transferiert und gebunden. Die Membrane wurden mit Tween-20™ (0,05%) enthaltender TBS gewaschen, mit 5% Trockenmilchpulver in TBS abgesättigt und mit Seren (entweder von Patienten oder als Kontrolle von gesunden Personen) bei einer Endkonzentration von 1/100 inkubiert. Reaktive Proteine wurden mit einem Alkalische-Phosphatase- gekoppelten sekundären Antikörper (Ziege-anti-hu an-IgC, Fc- Fragment; Dianova, Hamburg, Deutschland) nachgewiesen und mittels 5-Brom-4-Chlor-3-Indolylphosphat und Nitroblau- Tetrazolium sichtbar gemacht. Positive Phagemids wurden mittels Seren von Patienten mit Mycosis fungoides (n=15) und Sezary Syndrom (n=3) sowie gesunden Personen als Kontrolle (n=10) weiter untersucht. Positive Phagemids wurden zur Monoklonalität subkloniert und einer in vivo-Exzision des "pBluescript"- Plasmids (entsprechend dem Protokoll des Herstellers der Genbank, Stratagene, La Jolla, CA, USA) unterzogen. DNA wurde entsprechend dem Protokoll des Herstellers isoliert ("QIAprep spin miniprep"; Qiagen). Die Größe der Insertionen wurde durch eine Smal/Kpnl-Spaltung und Gelelektrophorese analysiert. Die Sequenzierung wurde mittels eines automatischen Fluoreszenz- Sequenziergeräts (Modell 377; Perkin-Elmer / Applied Biosystems, Forster System, CA, USA) und des Dye-Terminator-Verfahrens entsprechend den Angaben des Herstellers ("ABI PRISM Big Dye Ready Reaction Terminator Cycle Sequencing Kit"; Perkin-Elmer) durchgeführt. Primer wurden chemisch synthetisiert. Die Sequenzen der Klone wurden auf beiden komplementären Strängen vollständig ermittelt.
(D) Tumorσewebe und Zellinien
Von 17 CTCL-Patienten erhaltene Gewebeproben dienten als Quelle für die herstellung von Tumor-cDNA: 13 Mycosis fungoides (Stadium Ib bis IVb, hauptsächlich Ilb) , 2 Sezary Syndrome (Stadium III) , 1 T-Zonen-Lymphom (Stadium IVb) und 1 CD30+ CTCL (Stadium Ilb) . Außerdem wurden cDNAs von den folgenden 4 CTCL- Zellinien hergestellt: My-La (Mycosis fungoides; Kaltoft et al . , In Vitro Cell Dev. Biol. 28a (1992), 161-167), SeAx (Sezary Syndrom; Kaltoft et al . , Arch. Dermatol . Res . 280 (1988), 264- 267), HH (Lymphomatoide Papulose; ATCC-Nr.: CRL-2105) und HuT-78 (Sezary Syndrom; ATCC-Nr.: TIB-161) . Außerdem wurde cDNA von sechs Leukämie-Zellinien (ARA-10, Jurkat, KGl, K562, Nalm-2 und SKW6. und 22 Melanom-Zellinien hergestellt.
Zur Analyse der Gewebeverteilung innerhalb normalen Geweben wurden ausführlich Kontroll-cDNAs verwendet, dazu zählten auch drei Felder von im Handel erhältlichen cDNAs (alle von Clontech, CA, USA): humane "multiple tissue"-cDNA Feld I, Feld II und humanes fötales MTC-Feld. Zusätzlich wurden verschiedene im Handel erhältliche Gesamt-RNAs zur Herstellung weiterer Kontroll-cDNAs mittels des vorstehend beschriebenen Verfahrens erzeugt. Schließlich dienten auch noch cDNAs von drei aktivierten CD8+ T-Zellinien (Möller et al . , British Journal of Cancer 77 (1998), 1907-1916) als Kontroll-T-Zellen.
(E) RT-PCR
Aufgrund der eingeschränkten Menge an RNA wurde bevorzugt RT-PCR zur Untersuchung der identifizierten Sequenzen innerhalb verschiedener normaler Gewebe und Tumor-Gewebe verwendet. In ausgewählten Fällen wurden diese Untersuchungen mittels Northern-Blot-Analysen vervollständigt. RT-PCR wurde mittels "MJ Research PCT-200" (Biozym, Oldendorf, Deutschland) mit einer einminütigen Anlagerung bei variabler Temperatur mit 35 Zyklen durchgeführt. Alle RT-PCR wurden in mindestens zwei unabhängigen Experimenten durchgeführt. Die RNA-Isolierung, RT-PCR und die Northern-Blot-Analysen wurden ansonsten gemäß üblicher Standardverfahren und Standardbedingungen durchgeführt. Die Primersequenzen und Annealing-Temperaturen für die verschiedenen Klone sind in der nachfolgenden Tabelle 1 angegeben: (F) Northern Blot
10 μg Gesa t-RNA werden auf einem MOPS-Gel elektrophoretisch aufgetrennt und auf positiv geladene Nylon-Membranen übertragen. Die Sondenmarkierung erfolgt mittels des Röche High Prime Kits mit α-32P-dCTP. Die Entfernung der nicht eingebauten Nukleotide erfolgt mittels des Qiagen Removal Kits (Fa. Qiagen, Hilden) . Die Prähybridisierung wird bei 60°C für 1-2 Stunden durchgeführt. Die Hybridisierung erfolgt bei 60°C vorzugsweise über Nacht. Die Prähybridisierungs- und die Hybridisierungs-Lösungen haben die Zusammensetzung: 10% Dextransulfat, 1% SDS, lOx Denhardts Reagenz, 3x SSC. Das nachfolgende Waschen erfolgt für 2 x 30 Minuten mit 2xSSC/0,l% SDS bei 42°C und dann 2 x 30 Minuten mit 0,2xSSC/0,l% SDS bei 65°C. Es wird ein Kodak X-Omat-Film für eine Expositionszeit von 3-10 Tagen aufgelegt.
Beispiel 2 : Screenen nach positiven Klonen
Ungefähr 1,9 x 106 rekombinante Klone einer von normalem Testis- Gewebe erhaltenen cDNA-Bank wurden mit Seren von Patienten mit kutanen T-Zeil-Lymphomen (CTCL) einschließlich Mycosis fungoides (MF) und Sezary Syndrom gescreent. Es konnten 28 Klone, die 22 verschiedene ORFs bzw. Gene repräsentieren, nachgewiesen werden und diese wurden hinsichtlich serologischer Reaktivität und molekularer Verteilung weiter untersucht. Eine sekundäre Bestätigung wurde durch die Verwendung zusätzlicher Seren von Patienten mit einer positiven Diagnose für Mycosis fungoides (MF) (n=15) oder Sezary Syndrom (n=3) und 10 Kontrollseren von gesunden Freiwilligen durchgeführt. Die Reaktivität der Seren der Patienten war mit den Tumorstadium (höchstens Stadium III) assoziiert (Tabelle 2) . Dies war jedoch nicht statistisch signifikant (X2-Test und Mann-Whitney U-Test) , vermutlich aufgrund der niedrigen Anzahl von Seren mit hohen Tumorstadien. Die Reaktivität der Patienten-Seren war im Bereich von 11% bis 71% von rekombinante Klone identifizierenden Seren. Tabelle 2: Anzahl positiver Klone in Korrelation mit dem Tumorstadium des Serum-Spenders
Primär Screen einer Testis cDNA Bank wurde nacheinander mit 17 einzelnen Seren durchgeführt, die von Patienten stammten, die Tumoren im angegebenen Stadium aufwiesen. Die Anzahl der positiven und gesamten analysierten Plaques sind in der 3. Spalte angegeben. Während des Sekundär Screens wurde jeder positive Plaque (28) mit bis zu 18 individuellen Seren verschiedener Patienten im angegebenen Tumorstadium nachgetestet. (1^ Kumuliert über alle getesteten Seren. ^ Positive Klone dividiert durch Gesamtzahl der getesteten Klone.
Die Anzahl und Wahrscheinlichkeit aller serologischen Antworten sind hinsichtlich des TumorStadiums der Patienten zusammengefaßt, von denen Serum für das Screenen einer Testis- cDNA-Bank genommen wurde. Obwohl die Daten eine höhere Wahrscheinlichkeit für das Vorhandensein von Antikörpern gegen Tumor-Antigene (mit dem Gipfel bei Stadium III) anzeigen, sind diese Unterschiede nicht statistisch signifikant. Tabelle 3: Serologische Analysen der identifizierten Klone
Die Tabelle gibt die prozentuale Reaktivität der Seren (Anzahl n) gegen die getesteten Klone im sekundären Screen an.
Der Prozentsatz der reagierenden und die Gesamtzahl der getesteten Seren (n) während des sekundären Screenens sind angegeben. Bei den Klonen se2-l und se20-4 ist zusätzlich jeweils einer der homologen Klone angegeben, da diese sich in ihrem Reaktionsmuster unterschieden, vermutlich aufgrund von Sequenzunterschieden. Fünf Antigene repräsentieren bisher noch nicht bekannte Sequenzen (se2-5, se20-10, se57-l, se70-2 und Lgl-2) . Das mittels RT-PCR analysierte RNA-Express ionsmus ter der identifizierten Antigene variierte zwischen hocheingeschränkter und ubiquitärer Expression in 28 normalen, 17 CTCL -Tumor geweben und 33 Tumorzellinien unterschiedlichen Ursprungs (Tabellen 4 und 5) .
Tabelle 4: Expressxonsanalyse mittels RT-PCR mit Antigen- spezifischen Primern und cDNA von verschiedenen Geweben und
Zeil-Linien
nach RT-PCR-Analyse an (Anzahl der Gewebe ist in Klammern; nt: nicht getestet). (1) RT-PCRs an Testis cDNA ergab immer positive Ergebnisse. Im Falle von Klonse2-l war Testis cDNA die einzige positive Probe. Zusammensetzung der Kontroll-Palette siehe Table 5. (2) Aktivierte zytotoxische T- Zellen. {3) Details zu diesen Ergebnissen siehe Table 5. (4) GBP-TAshort mit 7%.
Tabelle 5: RT-PCR-Analysen mittels spezifischen Primern gegen differentiell exprimierte Sequenzen und "multiple tissue"
(MTC) -cDNA
Paletten hergestellt (Clontech). Jede Probe enthielt cDNA aus Proben mehrerer Individuen. Die Haut cDNA wurde aus einer einzelnen Probe hergestellt. RT-PCR gegen GBP-TA / GBP- TAshort unterscheidet die beiden Varianten.
Beispiel 3: Tumorspezifische Antigene
Sechs Klone (die durch mindestens vier verschiedene Rekombinanten repräsentiert werden) waren zu SCP-1 homolog, einem mit der Meiose in Zusammenhang stehenden Protein (Türeci et al., PNAS USA 95. (1998), 5211-5216). Interessanterweise unterschied sich die serologische Reaktivität verschiedener Seren zwischen den unterschiedlichen SCP-1-Klonen: Klon se2-l wurde durch Seren von 2/15 MF-Patienten und 2/3 von Patienten mit Sezary Syndrom nachgewiesen. Mittels RT-PCR wurde nachgewiesen, daß se2-l tumorspezifisch ist. Ein weiterer zu SCP-1 homologer Klon (se37-l) wurde durch 3/9 MF-Seren und 1/3 Sezary Syndrom-Seren nachgewiesen. Dies könnte verschiedene Epitope von SCP-1 widerspiegeln, da die Klone sich in ihrer Länge unterschieden. Klon se33-2 reagierte außerdem auch mit 1/5 Kontrollseren. Interessanterweise kodierte dieser Klon eine weitere Peptidsequenz innerhalb des ersten Leserahmens, die innerhalb der anderen zu SCP-1 homologen Klone nicht vorhanden war und somit ein Autoantigen darstellen könnte, das für die Reaktivität des Kontrollserums verantwortlich ist. Die PCR- Analysen wurden mit den gleichen Primern wie von Türeci et al . (1998) veröffentlicht durchgeführt, die auch zu den SCP-1 homologen Klonen perfekt paßten. Innerhalb aller getesteten normalen Geweben sowie den Tumorproben und Zellinien konnten nur eine Testis-Probe und eine MF-Probe (Patient H.S.) gefunden werden, die SCP-1 mRNA exprimierte. Das positive Ergebnis der MF-cDNA konnte durch Northern-Blot bestätigt werden, der eine Bande von etwa 4,3 kb ergab. Außerdem reagierte das Serum des Patienten H.S. auch mit se2-l und einem der anderen zu SPC-1 homologen Klone. Desweiteren sind gemäß Northern Blot Analyse die Klone se57-l und L15-7 Tumor-spezifisch.
Beispiel 4: (A) Antigene mit eingeschränktem Expressionsmuster und (B) ubiguitär exprimierte Antigene
Nachfolgend werden 13 Antigene mit differentieller oder ubiquitärer Expression (nachgewiesen über RT-PCR) beschrieben (siehe Tabellen 4 und 5) .
(A)
Für fünf neue Antigene (se2-5, se20-10, se57-l, se70-2 und Lgl- 2) und zwei Antigene mit Homologien zu bekannten Genen (se33-l: NP220; se89-l: mit Retinoblastom in Zusammenhang stehendes Protein RAP140) zeigte sich eine differentielle Expression auf molekularer Ebene. Die serologische Reaktivität gegen diese Klone (definiert als Prozentsatz reaktiver Seren während des sekundären Screenens) betrug im Durchschnitt 31%. Eine geringe Reaktivitätsrate zeigte sich gegenüber den Klonen se20-10 und se70-2 (2/18 bzw. 1/18 reaktive Seren), während 71% der Seren von CTCL-Patienten (n=14) mit dem Klon se89-l positiv reagierten. Alle 6 Klone zeigten mit bis zu 10 Kontrollseren keine Reaktion.
Es wurde begonnen, die RT-PCR-Ergebnisse mittels Northern Analysen zu quantifizieren. Solche Antigene, die sich in Normal- Geweben im Vergleich zu Tumorproben nicht als gleich stark exprimiert erweisen, werden als potentielle Therapeutika eingestuft. Mittels RT-PCR-Analysen konnte gezeigt werden, daß die se-2-5- spezifische mRNA beinahe ubiquitär innerhalb normaler Gewebe exprimiert wird, jedoch nicht in aktivierten T-Zellen und nur in lediglich 55% der CTCL-Gewebeproben. Im Gegensatz dazu ergab die Northern-Blot-Analyse selbst innerhalb normaler Gewebe ein eingeschränktes Expressionsmuster. Starke Signale waren in Niere, Luftröhre und Testis nachweisbar, schwächere in Kolon, Dünndarm, Thymus, Knochenmark und Magen. Während in allen positiven normalen Geweben drei Banden nachweisbar waren (5,2, 4,2 und 3,9 kB) zeigte die einzige positive CTCL-Zellinie SeAx ein Signal bei 3,9 kb.
Spezifische mRNAs für die Klone se20-10 und se57-l wurden mittels RT-PCR in 43% bzw. 21% der untersuchten Kontrollgewebe gefunden. Interessanterweise war die Expression der für se57-l spezifischen mRNA in allen Tumorgeweben und Zellinien sehr stark herunterreguliert. Im Gegensatz dazu war die Expression der mRNA von Klon se70-2 im Vergleich zu normalen Geweben (54%) innerhalb der CTCL- und Leukämie-Zellinien hochreguliert (100%) , während die CTCL-Gewebe und Me 1 anom- Z e 11 i n i e n mittlere Expressionsspiegel zeigten (33% bzw. 45%) . Unter den Kontrollgeweben waren alle fötalen Gewebe in der RT-PCR positiv.
Für zwei Antigene mit Homologien zu bekannten Sequenzen zeigte sich eine differentielle Expression: se33-l cDNA ist homolog zu NP220, einem DNA-bindenden Protein, und se89-l cDNA ist homolog zu RAP140, einem Retinoblastom-assoziierten Klon. Klon se33-l zeigte innerhalb einer überlappender Strecke von 3830 bp am 3'- Ende von NP220 99% Ähnlichkeit, dieser Klon ist jedoch am 5'- Ende verkürzt, was zu einem verkürzten ORF führt. Die RT-PCR
(unter Verwendung se33-l-spezifischer Primer) erbrachte den Nachweis von mRNA in 6/8 fötalen und 16/20 normalen Geweben
(Tabelle 5) sowie innerhalb von CTCL-Geweben (12/16), aktivierten zytotoxischen T-Zellen und in den meisten Zellinien
(Tabelle 4) .
cDNA des Klons se89-l zeigte 98% Ähnlichkeit zu RAP140 innerhalb eines überlappenden Bereichs von 3444 bp und eine Lücke von 60 bp, die innerhalb des ORF liegt und zu einer Aminosäure-Lücke von 20 Aminosäuren führt. RT-PCR wurde mit verschiedenen Primern durchgeführt: Zuerst mit der Primerkombination RAP140 (siehe Tabelle 1 sowie Beispiel 1) , wobei sowohl RAP140 als auch se89-l nachgewiesen wurden und sich drei Banden in Testis-cDNA und zwei Banden in verschiedenen anderen cDNAs zeigten. Zur Spezifizierung der Expression von se89-l wurde ein neuer reverser Primer (s. Tabelle 1) entworfen, der die Lücke innerhalb se89-l überspannt. Unter Verwendung dieses Primers zusammen mit dem Vorwärts-Primer gegen RAP140, der ebenfalls se89-l nachweist, wurde nur eine Bande amplifiziert. Die Häufigkeit der positiven cDNAs zu den se89-l-spezifischen Primer unterschied sich nicht wesentlich zwischen den Kontrollgeweben (79%), CTCL-Geweben (75%) und Zellinien (CTCL- und Leukämie- Zellinien: 100%, Melanom-Linien: 73%) . Mittels Northern-Blot- Analysen konnte die Gegenwart von für se89-l spezifischer mRNA innerhalb von mRNA bestätigt werden, die von Hirn, Niere, Kolon und Testis und der CTCL-Linie SeAx stammte.
(B)
Sechs zu bekannten Sequenzen homologe Antigene (sel-1, se2-2, sel4-3, se20-4, se20-9 und se37-2) erwiesen sich als ubiquitär exprimiert. In allen Kontrollgeweben (n=28) war für diese Klone spezifische mRNA über RT-PCR nachweisbar. In den zwei Klonen sel4-3 und se20-4 waren alle Tumorgewebe und Zellinien ebenfalls in der RT-PCR positiv. Im Gegensatz dazu wurden die Klone se2-2, se20-7, se20-9 und se37-2 nur in einer Untergruppe der Melanom- und Leukämie-Zellinien exprimiert, während CTCL-Gewebe und CTCL- Zellinien einen höheren Prozentsatz von in der RT-PCR positiven cDNAs zeigten.
Die Reaktivität von Patientenseren mit diesen Klonen lag im Durchschnitt bei etwa 29%, wobei auch zwei Extreme zu beobachten waren: Die Reaktivität gegen den Klon sel4-3 zeigte sich in 11% (1/9) und gegen den Klon sel-1 in 50% (5/10) CTCL-Seren. Zwei Kontrollseren (n=10) reagierten mit Klon se20-6, der zu Klon se20-4 homolog ist. Für se20-6 konnte gezeigt werden, daß dieser für ein unterschiedliches Peptid (72 aa) im ersten Leserahmen kodiert, das weder in se20-4 noch seinem homologen Gen HRIHFB2216 vorhanden war. Die Sequenzanalyse dieser Klone und ein Vergleich mit den homologen Gegenstücken offenbarte in einigen Fällen Insertionen, Deletionen oder Elongationen.
Es muß betont werden, daß alle getesteten Klone serologisch spezifisch sind.
Beispiel 6: Sequenzanalysen hinsichtlich Lgl-2
Es konnten eine Reihe weiterer Klone mit großer Übereinstimmung zu Lgl-2 isoliert werden, die in 3 ' -Richtung komplettiert waren (Stop-Codon und 3 ' -untranslatierte Region vorhanden). Dies ist in Fig. 24 dargestellt. Diese Klone ließen sich in einem Gen (GBP-TA) zusammenfassen, das sich dem Chromosom lp22.3 zuorden ließ. Dabei konnten zwei Splicing-Varianten unterschieden werden: GBP-TA wurden 12 Exons zugeordnet, während bei GBP-TAshor Exon Nummer 2 fehlte.
Aus GBP-TA ließ sich ein Protein ableiten, das gewisse Homologien zu den bekannten Guanylat-bindenden Proteinen GBP-1, GBP-2 und HGBP (US-A-5 , 871, 965) aufweist. Die Sequenz von HGBP beinhaltet aber nicht Exon 2.
Beispiel 7: Expressionsanalysen hinsichtlich GBP-TA
Zur Analyse der Expression von GBP-TA wurden RT-PCR Experimente durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Primerpaare (s. Fig. 24) zur Unterscheidung der beiden Splicing-Varianten verwendet. Dabei wurde eine große Zahl von Kontroll-cDNas verwendet, die jeweils aus einer Sammlung von Geweben verschiedener Spender hergestellt wurden. Während 11 Kontroll-Gewebe für beide Primer nagativ waren, wurden in 5 Geweben GBP-TAshort , und in nur 2 Geweben (Knochenmark und Magen) beide Varianten von GBP-TA nachgewiesen (Tabelle 6) . Tabelle 6: Nachweis von GBP-TA und GBP-TA'S,hort in adulten
Kontro11geweben
Kontro11gewebe Ergebnis Primerset I Primersetll
Hirn, Colon, Herz, Niere, Leber, Ovar, Lunge, PMNC, Prostata Testis, Thymus, Trachea
Plazenta, Dünndarm, Milz, aktiv. CD8 T-Zellen, Uterus
Knochenmark, Magen
Im Gegensatz zu den Kontrollgeweben wurde GBP-TA in verschiedenen Tumorgeweben mittels RT-PCR nachgewiesen: Kutane T-Zell-Lymphome (26%, n=19) , Tumore aus dem HNO-Bereich (21%, n=14) . GBP-TAshort wurde in 20% der HNO-Tumore (n=15) und 9% der Kolon-Karzinome (n=35) gefunden. Se57-1 wurde in 20% der Colonkarzinome (n=35) und 57% der HNO-Tumore (n=28) nachgewiesen.
Da die RT-PCR äußerst sensitiv ist und keine Aussage über das Vorhandensein und die Menge an Protein zuläßt, wurde die Expression mittels Western Blot und eines GBP-TA spezifischen Antikörpers überprüft. Von den RT-PCR positiven Kontrollen konnten mehrere als Protein-Medleys im Western Blot getestet werden: Plazenta, Dünndarm, Milz, fötale Leber, Magen, Testis, Uterus. Diese erwiesen sich ebenso wie andere getestete Kontrollprotein-Medleys (Brustdrüse, Testis) als negativ, während Proteine gewonnen aus Tumor (CTLC) -Zellinien (SeAx, MyLa, Hut-78, HH; Isolierung über Tristar, AGS, Heidelberg) eine deutliche Bande in der entsprechenden Größe zeigten. Dies beweist eine Eignung von GBP-TA als spezifische Zielstruktur zur Therapie.
Beispiel 8: Herstellung von Antikörpern gegen GBP-TA
Zur Herstellung eines GBP-TA-spezifischen Antikörpers wurde das Insert eines Klons, das die Basen 539 bis einschließlich 1991 von GBP-TA umfaßt, in einen His-Vektor kloniert und in E-coli exprimiert. Das rekombinante Protein wurde über eine Nickel- Säule aufgereinigt, anschließend zur weiteren Reinigung in einem SDS-Gel aufgetrennt und die entsprechende Bande ausgeschnitten. Mit dem ausgeschnittenen Gelstück wurde ein Kaninchen immmunisiert, dessen Präimmunserum nicht mit dem Antigen reagierte.
I munisierunαsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung werden 600 μg gereinigtes KLH-gekoppeltes Peptid in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund1 s Adjuvans eingesetzt.
Tag O: 1. Immunisierung
(komplettes Freund1 s Adjuvans)
Tag 14: 2 . I m m u n i s i e r u n g ( inkomplettes Freund ' s
Adjuvans; icFA)
Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wird im Immunoblot getestet. Hierzu wird das zur Immunisierung eingesetzte Peptid einer SDS- Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocel- lulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wird das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wird das Nitrocellulosefil- ter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper ist ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgen mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat, 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar werden.
Es zeigt sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können.
Beispiel 9: ELISA
Das gleiche GBP-TA Insert, das zur Antikörpergewinnung verwendet wurde (Basen-Nr. 539 bis einschl. 1991 von GBP-TA) wurde in einen pGEX-Vektor kloniert, rekombinant exprimiert und in einem GST-ELISA eingesetzt. Das verwendete ELISA-System lehnt sich an Sehr et al . (J. of Immunol. Meth. 2001, 253. 153-162) an. Hierfür wurden Glutathion-Casein beschichtete ELISA-Platten mit dem Fusionsprotein beladen und anschließend Seren von CTCL Patienten und Kontrollpersonen auf das Vorhandensein von spezifischen Antikörpern getestet. Dabei zeigte sich, daß 17% der CTCL-Seren (n=60) , aber nur 2% der Kontrollseren (n=99) mit dem Fusionsprotein GST-GBP-TA reagierten.
Der ELISA eignet sich für alle angegebenen Markerantigene für diagnostische Zwecke, zur Prognose-Abschätzung und zur Verlaufskontrolle .

Claims

Patentansprüche
1. Diagnostische Zusammensetzung, die mindestens eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se2-5 (Fig.l), se20-10 (Fig.2), se57-l
(Fig.3), se70-2 (Fig.4), Lgl-2 (Fig. 5), sel-1 (Fig. 6), se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-4 (Fig.10), se20-7 (Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l (Fig.13), se37-2 (Fig.14), se89-l (Fig.15), L14-2 (Fig.16), L15-7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18), Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5 (Fig. 22) oder GPB-TA (Fig. 23) umfaßt.
2. Arzneimittel, das mindestens eine Nukleinsäuresequenz enthält, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung assoziiert ist, wobei die Nukleinsäuresequenz se20-10 (Fig.2) , se57-l (Fig.3), Lgl-2 (Fig. 5), sel-1 (Fig. 6), se2-l (Fig.7), se2-2 (Fig.8), sel4-3 (Fig.9), se20-7 (Fig.11), se20-9 (Fig.12), se33-l (Fig.13), se37-2 (Fig.14), L14-2 (Fig.16), L15-7 (Fig.17), Li9-1 (Fig.18), Li9-4 (Fig.19), LÜ5-2 (Fig. 20), LiilO-6 (Fig. 21), Liii4-5 (Fig. 22) oder GBP-TA (Fig. 23) umfaßt .
3. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder Arzneimittel nach Anspruch 2, wobei die mindestens eine Nukleinsäuresequenz, deren veränderte Expression mit einer Tumor-Erkrankung in Zusammenhang steht, eine Nukleinsäuresequenz umfaßt,
(a) die sich von einer in Anspruch 1 oder 2 definierten Nukleinsäuresequenz in der Codonsequenz aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheidet;
(b) die mit einer in einem der Ansprüche 1, 2 oder 3(a) definierten Nukleinsäuresequenz hybridisiert; oder
(c) die ein Fragment, eine allelische Variante oder eine andere Variante einer in einem der Ansprüche 1, 2, 3 (a) oder 3 (b) definierten Nukleinsäuresequenz ist.
4. Nukleinsäuresequenz entsprechend der Definition nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine cDNA oder genomische DNA ist.
5. Protein, dessen veränderte Konzentration mit einer Tumor- Erkrankung in Zusammenhang steht und das von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodiert ist .
6. Diagnostische Zusammensetzung, die mindestens einen Vektor enthaltend eine der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 1 oder 3 , mindestens ein von einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 1 oder 3 kodiertes Protein oder mindestens einen gegen dieses Protein gerichteten Antikörper enthält.
7. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 6 zur Diagnose oder Verlaufskontrolle einer Tumorerkrankung.
8. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei diese in Form eines ELISA, Protein-Chips, Nukleinsäure-Chips oder einer mit DNA, RNA oder Protein beladener Membran bereitgestellt wird.
9. Arzneimittel, das mindestens einen Vektor enthaltend eine der Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 2 oder 3 , mindestens ein von einer Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 2 oder 3 kodiertes Protein oder mindestens einen gegen dieses Protein gerichteten Antikörper enthält.
10. Arzneimittel nach Anspruch 9 zur Therapie von Tumorerkrankungen.
11. Verwendung einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.
12. Verwendung mindestens eines von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodierten Proteins zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.
13. Verwendung mindestens eines gegen ein von einer Nukleinsäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 kodierten Proteins gerichteten Antikörpers zur Diagnose und/oder Therapie einer Tumorerkrankung.
14. Verwendung nach Anspruch 12 oder 13 als Vakzinierungsmittel .
15. Verwendung nach Anspruch 12 zur Erzeugung Peptid-beladener Antigen-präsentierender Zellen (APC) .
16. Verwendung nach Anspruch 12 zur Erzeugung tumorspezifischer T- Zellen.
17. Diagnostische Zusammensetzung nach Anspruch 1, 3 oder 6, Arzneimittel nach Anspruch 2, 3 oder 9, Verwendung nach einem der Ansprüche 11 bis 17, wobei der Tumor CTCL ist.
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